CN104838015A - 在等位基因特异性pcr中具有经修饰的磷酸酯和碱基的引物 - Google Patents

在等位基因特异性pcr中具有经修饰的磷酸酯和碱基的引物 Download PDF

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Abstract

本发明包括等位基因特异性扩增的方法，所述方法使用等位基因特异性的寡核苷酸，所述寡核苷酸至少部分地与靶序列的多于一个变体互补，但具有与靶序列的仅一个变体互补的至少一个选择性核苷酸，并且掺有具有在环外氨基处共价修饰的碱基的核苷酸和经修饰的磷酸酯两者。

Description

在等位基因特异性PCR中具有经修饰的磷酸酯和碱基的引物
发明领域
本发明涉及核酸扩增的领域并且具体地涉及等位基因特异性扩增的领域。
发明背景
核酸的等位基因特异性扩增允许对靶序列同时的扩增和分析。等位基因特异性扩增通常在当怀疑靶核酸在其序列中具有一个或多个具有变化的亚群（多态性）时使用。DNA多态性被用于DNA概况分析（取证、亲子鉴定、用于器官移植的组织分型）、遗传作图以及稀有突变（诸如在具有正常DNA的细胞背景下出现在癌细胞中的那些）的检测。
在成功的等位基因特异性扩增中，扩增了靶核酸期望的变体，而没有扩增其他的变体，至少没有达到可检测的水平。通常的等位基因特异性扩增测定涉及聚合酶链式反应（PCR），其中至少一条引物与具有怀疑的多态性的区域互补。等位基因特异性引物的设计使得只有当多态性的某一变体存在时引物延伸才会发生。在其最简单的形式中，等位基因特异性引物具有与在靶中多态性核苷酸的期望的变体互补的3'-端核苷酸。通常在引物的3'-端的单一错配足够排除靶序列的不期望的变体的扩增。然而，在不同的3'-端序列中扩增的特异性变化巨大：一些错配通过聚合酶有效地阻断延伸，而其他则没有，见美国专利号 5,639,611。
等位基因辨别（allelic discrimination）的成功取决于DNA聚合酶对延伸错配引物的无能。DNA聚合酶的这种无能可以通过调节反应条件而调整，以实现最大选择性。然而，等位基因特异性PCR的差选择性对于许多多态性序列存在问题。
一种增加特异性的方法涉及工程化具有一个或多个内部错配的核苷酸的扩增引物。该方法在一些系统中被证明是成功的，见美国专利5,137,806。
另一个增加特异性的方法涉及引物的化学修饰。例如，发现在引物中一些核苷酸的脱氧核糖的某些2'-C和4'-C修饰提高了通过聚合酶的等位基因辨别。见Gaster, J.和Marx, A., Chem. Eur. J. 2005, 11:1861-1870。在另一个研究中，发现通过在引物的核苷酸之一中使用非天然嘧啶碱基提高了等位基因辨别，具体地，在嘧啶环的6-位置具有多种取代基的假异胞苷（pseudoisocytidine），见美国专利号7,408,051。
在实时等位基因特异性PCR的背景下，测定的选择性可以测量为在匹配的和错配的模板之间的阈值循环数（Ct）中的差异。更大的差异指示了错配的模板扩增的更大延迟，和因此在等位基因之间更高的辨别。修饰的脱氧核糖已经显示出导致1至14个循环的Ct差异。假异胞苷的使用导致了在错配模板的扩增中7个循环的延迟。这种程度的辨别对许多应用（其中样品含有模板的数个变体，均对扩增竞争）是不足的。通常，错配的模板以相比匹配的模板大得多的量存在。例如，在组织样品中，只有一小部分的细胞可能是恶性的并且携带有突变（“错配模板”），其由等位基因特异性扩增测定所靶向。在正常细胞中存在的模板可能被以较低效率扩增，但是正常细胞的压倒性数目会克服扩增中的任何延迟，并且消除突变体模板的任何优势。为了在野生型模板存在的情况下检测稀有突变，需要改进等位基因特异性扩增测定的特异性。
已经提出了许多提高引物的等位基因特异性的途径。然而，对于许多临床相关的核酸靶，PCR特异性的缺乏仍是问题。因此，需要设计等位基因特异性引物的新方法。
含有经修饰的磷酸酯残基的核苷酸和寡核苷酸已经在美国专利号7,741,472中描述。该经修饰的磷酸酯的关键特征是用三价磷原子开始，并且以这样的方式将其与试剂反应，所述方式使得形成稳定的磷酸酯模拟物（phosphate mimetic）。将含有至少一个提供有保护基团的羟基残基的磷原子与具有结构N=N=N-Acc的叠氮化物反应，其中Acc是电子受体或被残基R取代的电子受体且R是任何有机取代基。这导致形成五价磷原子，强吸电子的电子受体基团(a strongly electron-attracting electron acceptor group)经N原子与其共价结合。该基团确保与氨基磷酸酯化合物相反，以该方式产生的寡核苷酸是共振稳定的（resonance-stabilized）并且不易于水解。
发明概述
在第一个方面中，本发明涉及靶序列变体的等位基因特异性扩增的方法，靶以数个变体序列的形式存在，方法包括，（a）将第一寡核苷酸和第二寡核苷酸与靶序列的至少一个变体杂交；其中第一寡核苷酸至少部分地与靶序列的一个或多个变体互补，并且第二寡核苷酸至少部分地与靶序列的一个或多个变体互补，并且具有与靶序列的仅一个变体互补的至少一个选择性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸包含具有在环外氨基处共价修饰的碱基的核苷酸和经修饰的磷酸酯两者，所述磷酸酯具有结构：
其中A和B代表核苷酸链，D是OH或CH3，并且Acc是电子受体或被残基R取代的电子受体，其中R是有机取代基，其中Acc选自CN、SO2-R'，其中R' 包括至少一个氨基取代的烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂环、和在邻位或对位具有至少一个烷基化N-原子的六元N+ 杂环，所述杂环选自吡啶鎓、嘧啶鎓和喹啉鎓；（b）提供适合用于通过核酸聚合酶的寡核苷酸延伸的条件；（c）通过所述核酸聚合酶延伸所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸，其中当所述第二寡核苷酸与和所述至少一个选择性核苷酸互补的靶序列的变体杂交时，所述核酸聚合酶能够有效地延伸所述寡核苷酸，并且当所述第二寡核苷酸与不和所述至少一个选择性核苷酸互补的靶序列的变体杂交时，所述核酸聚合酶延伸所述寡核苷酸的效率实质上较低。
在第二个方面中，本发明涉及检测靶序列变体的方法，靶以数个变体序列的形式存在，方法包括，（a）将第一寡核苷酸和第二寡核苷酸与靶序列的至少一个变体杂交；其中第一寡核苷酸至少部分地与靶序列的一个或多个变体互补，并且第二寡核苷酸至少部分地与靶序列的一个或多个变体互补，并且具有与靶序列的仅一个变体互补的至少一个选择性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸包含具有在环外氨基处共价修饰的碱基的核苷酸和经修饰的磷酸酯两者，所述磷酸酯具有结构：
其中A和B代表核苷酸链，D是OH或CH3，并且Acc是电子受体或被残基R取代的电子受体，其中R是有机取代基，其中Acc选自CN、SO2-R'，其中R' 包括至少一个氨基取代的烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂环、和在邻位或对位具有至少一个烷基化N-原子的六元N+ 杂环，所述杂环选自吡啶鎓、嘧啶鎓和喹啉鎓；（b）提供适合用于通过核酸聚合酶的寡核苷酸延伸的条件；（c）通过所述核酸聚合酶延伸所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸，其中当所述第二寡核苷酸与和所述至少一个选择性核苷酸互补的靶序列的变体杂交时，所述核酸聚合酶能够有效地延伸所述寡核苷酸，并且当所述第二寡核苷酸与不和所述至少一个选择性核苷酸互补的靶序列的变体杂交时，所述核酸聚合酶延伸所述寡核苷酸的效率实质上较低；（d）检测所述寡核苷酸延伸的产物，其中所述延伸表示所述靶序列的变体的存在，所述第二寡核苷酸对于所述靶序列的变体具有互补的选择性核苷酸。
在第三个方面中，本发明涉及用于靶序列的等位基因特异性扩增的试剂盒，靶以数个变体序列的形式存在，试剂盒包括，（a）第一寡核苷酸，其至少部分地与靶序列的一个或多个变体互补；和（b）第二寡核苷酸，其至少部分地与靶序列的一个或多个变体互补，并且具有与靶序列的仅一个变体互补的至少一个选择性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸包含具有在环外氨基处共价修饰的碱基的核苷酸和经修饰的磷酸酯两者，所述磷酸酯具有结构：
其中A和B代表核苷酸链，D是OH或CH3，并且Acc是电子受体或被残基R取代的电子受体，其中R是有机取代基，其中Acc选自CN、SO2-R'，其中R' 包括至少一个氨基取代的烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂环、和在邻位或对位具有至少一个烷基化N-原子的六元N+ 杂环，所述杂环选自吡啶鎓、嘧啶鎓和喹啉鎓。
在第四个方面中，本发明涉及用于进行靶序列的等位基因特异性扩增的寡核苷酸，靶以数个变体序列的形式存在，寡核苷酸包含，（a）至少部分地与所述靶序列的一个或多个变体的部分互补的序列；（b）与靶序列的仅一个变体互补的至少一个选择性核苷酸；（c）具有在环外氨基处共价修饰的碱基的核苷酸；（d）经修饰的磷酸酯，其具有结构：
其中A和B代表核苷酸链，D是OH或CH3，并且Acc是电子受体或被残基R取代的电子受体，其中R是有机取代基，其中Acc选自CN、SO2-R'，其中R' 包括至少一个氨基取代的烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂环、和在邻位或对位具有至少一个烷基化N-原子的六元N+ 杂环，所述杂环选自吡啶鎓、嘧啶鎓和喹啉鎓。
在第五个方面中，本发明涉及用于靶序列的等位基因特异性扩增的反应混合物，靶以数个变体序列的形式存在，混合物包含，（a）第一寡核苷酸，其至少部分地与靶序列的一个或多个变体互补；和（b）第二寡核苷酸，其至少部分地与靶序列的一个或多个变体互补，并且具有与靶序列的仅一个变体互补的至少一个选择性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸包含具有在环外氨基处共价修饰的碱基的核苷酸和经修饰的磷酸酯两者，所述磷酸酯具有结构：
其中A和B代表核苷酸链，D是OH或CH3，并且Acc是电子受体或被残基R取代的电子受体，其中R是有机取代基，其中Acc选自CN、SO2-R'，其中R' 包括至少一个氨基取代的烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂环、和在邻位或对位具有至少一个烷基化N-原子的六元N+ 杂环，所述杂环选自吡啶鎓、嘧啶鎓和喹啉鎓；（c）核酸聚合酶；（d）核苷三磷酸；和（e）适合用于通过核酸聚合酶的核酸延伸的缓冲液。
发明详述
定义
除非另有定义，在本文中使用的全部技术和科学术语具有该发明所属领域中普通技术人员通常理解的相同含义。在描述和要求保护本发明中，将使用以下定义。
术语“核酸”指的是核苷酸（例如，核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物等）的聚合物并且包括脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）、DNA-RNA杂交物、寡核苷酸、多核苷酸、适配子、肽核酸（PNAs）、PNA-DNA缀合物、PNA-RNA缀合物等，其包括共价连接在一起的核苷酸，可以是直链或支链的形式。核酸通常是单链的或双链的，并且通常含有磷酸二酯键，虽然在一些情况中，包括这样的核酸类似物，所述核酸类似物可以具有可替代的主链，包括例如，磷酰胺（Beaucage 等 (1993) Tetrahedron 49(10):1925); 硫代磷酸酯(phosphorothioate) (Mag等(1991) Nucleic Acids Res. 19:1437; 和美国专利号 5,644,048）；二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)（Briu 等 (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321）；O-甲基亚磷酰胺键(O-methylphophoroamidite linkages)（见 Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press (1992)），和肽核酸主链和键（见，Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895）。其他类似物核酸包括具有带正电荷的主链的那些（Denpcy 等 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097）；具有非离子主链的那些（美国专利号5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141和4,469,863）和具有非核糖主链的那些，包括在美国专利号5,235,033和5,034,506中描述的那些。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义内（见Jenkins等(1995) Chem. Soc. Rev. 第169-176页），并且类似物还在例如，Rawls, C & E News 1997年6月2日 第35页中描述。可以完成对核糖-磷酸主链的这些修饰以利于额外部分（诸如标记）的添加，或改变这样的分子在生理环境中的稳定性和半衰期。
除了通常在核酸中发现的天然存在的杂环碱基（例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶）之外，核苷酸类似物还可以包括非天然存在的杂环碱基，诸如在例如，Seela 等(1999) Helv. Chim. Acta 82:1640中描述的那些。在核苷酸类似物中使用的某些碱基充当解链温度（Tm）调节物。例如，这些中的一些包括7-脱氮嘌呤(deazapurine)（例如，7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤等）、吡唑并[3,4-d]嘧啶、丙炔基-dN (例如丙炔基-dU、丙炔基-dC等)，等等。见例如，美国专利号5,990,303。其他代表性的杂环碱基包括，例如，次黄嘌呤、肌苷、黄嘌呤；2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和黄嘌呤的8-氮杂衍生物；腺嘌呤、鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和黄嘌呤的7-脱氮-8-氮杂衍生物；6-氮杂胞苷；5-氟胞苷；5-氯胞苷；5-碘胞苷；5-溴胞苷；5-甲基胞苷；5-丙炔基胞苷；5-溴乙烯基尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶等。
“核苷”指的是核酸组分，其包括共价连接至糖部分（核糖或脱氧核糖）、糖部分的衍生物或糖部分的功能等价物（例如，碳环）的碱基或碱性基团(base or basic group)（包括至少一个同素环、至少一个杂环、至少一个芳基，等等）。例如，当核苷包括糖部分时，碱基通常连接至糖部分的1'-位置。如上文描述的，碱基可以是天然存在的碱基或非天然存在的碱基。示例性的核苷包括核糖核苷、脱氧核糖核苷、双脱氧核糖核苷和碳环核苷。
“核苷酸”指的是核苷的酯，例如，核苷的磷酸酯，其有一个、两个、三个或更多个共价连接至核苷的糖部分的5'位置的磷酸基。
“嘌呤核苷酸”指的是包括嘌呤碱基的核苷酸，而“嘧啶核苷酸”指的是包括嘧啶碱基的核苷酸。
“寡核苷酸”指的是包括至少两个，但通常5-50个核苷酸且更通常15-35个核苷酸的核酸聚合物。寡核苷酸的精确大小通常取决于多个因素，包括寡核苷酸的根本功能(ultimate function)或用途。寡核苷酸可以通过本领域已知的任何合适的方法制备，包括，例如，合适序列的克隆和限制性酶切，或直接的化学合成，其通过以下方法，诸如Narang 等(1979) Meth. Enzymol. 68:90-99的磷酸三酯法；Brown 等(1979) Meth. Enzymol. 68:109-151的磷酸二酯法；Beaucage 等(1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862的二乙基亚磷酰胺法；Matteucci 等(1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191的三酯法；自动合成法；美国专利号4,458,066的固体支持物法或本领域已知的任何其他化学方法。
“引物核酸”或“引物”是可以与模板核酸杂交并且允许使用核苷酸掺入生物催化剂的链延伸或延长的寡核苷酸。虽然有时使用其他引物长度，但是引物通常范围为15至35个核苷酸。短引物核酸通常使用较低温度以与模板核酸形成足够稳定的杂交复合体。至少部分地与模板核酸的子序列互补的引物核酸通常足以与模板核酸杂交，使延伸发生。然而，延伸的成功通常需要在引物3'-端更大的互补性（即，与模板更少的错配）。如果期望，可以通过掺入由放射学、光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学技术可检测的标记，将引物核酸标记。
“延伸的引物”指的是对其已经添加一个或多个额外的核苷酸的引物。“引物延伸”是经其将额外的核苷酸添加至引物的酶的作用。
“模板核酸”、“模板”或“靶”指的是引物核酸可以与之杂交并且在合适的条件下将其延伸的核酸。在核酸扩增的背景下，“靶”优选是双链核酸的区域，其由至少部分地与至少两条引物序列互补的序列和间插序列组成。靶还可以是单链核酸，其由至少部分地与一条引物互补的序列和部分地与第二条引物相同的序列组成。模板核酸可以作为分离的核酸片段或较大的核酸片段的部分存在。靶核酸可以来源自或分离自基本上任何来源，诸如培养的微生物、未培养的微生物、复杂的生物混合物、组织、血清、古老的或保存的组织或样品、环境分离物等。进一步，模板核酸任选包括或来源于cDNA、RNA、基因组DNA、克隆的基因组DNA、基因组DNA文库、酶促片段化的DNA或RNA、化学片段化的DNA或RNA、物理片段化的DNA或RNA等。模板核酸还可以使用本领域已知的技术化学合成。
如本文使用的，“基因”指的是与生物功能相关的DNA的任何区段。因此，基因包括编码序列和任选地，编码序列的表达所需的调控序列。
当在核酸的3'端例如通过掺入核苷酸的生物催化剂将额外的核苷酸掺入至核酸中时，将核酸“延伸”或“延长”。
“部分”或“基团”指的是一些物质诸如分子分成的部分之一（例如，官能团、取代基团等）。例如，核苷酸通常包含碱基基团（例如，腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶或类似物）、糖部分和一个或多个磷酸基团。
“烷基”指的是直链的、支链的或环状的饱和的烃部分，并且包括全部位置异构体，例如，甲基、乙基、丙基、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1,1-二甲基乙基、戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、己基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基和1-乙基-2-甲基丙基、正己基, 环己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、正壬基、正癸基等。烷基通常包含约1-20个碳原子且更通常包括约2-15个碳原子。烷基可以是取代的或未取代的。
“烷氧基”指的是包含氧原子的烷基，并且包括，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、庚氧基、辛氧基等。
“芳基”指的是来源于芳香族化合物的原子或部分的取代基团。示例性的芳香基团包括，例如，苯基等。芳基任选包括多个芳香环（例如，二苯基等）。此外，芳基可以是取代的或未取代的。
“芳氧基”指的是包含氧原子的芳基，并且包括，例如苯氧基、氯苯氧基、甲基苯氧基、甲氧基苯氧基、丁基苯氧基、戊基苯氧基、苄氧基等。
“烷基-芳基”指的是包含烷基和芳基部分的基团。烷基-芳基的实例包括苯甲基、甲苯基和二甲苯基。
“等位基因特异性引物”是这样的引物，其可以与模板核酸的数个变体杂交，但是当与模板核酸的仅一些变体杂交时允许通过聚合酶的延长。对于与模板核酸的其他变体，引物-模板杂交物可能无法由聚合酶延伸或延伸效率较低。
当在核酸的3'端例如通过掺入核苷酸的生物催化剂将额外的核苷酸掺入至核酸中时，将核酸“延伸”或“延长”。
如果扩增测定使得一个产物比其他可能的产物占有优势（即，绝大部分但是小于100%），则扩增测定是“选择性的”或“等位基因选择性的”。只要靶序列不期望的（错配的）变体的扩增是可检测的，则将测定描述为“等位基因选择性的”。如果可能的产物之一是唯一形成的，则关于扩增测定使用术语“特异性的”或“等位基因特异性的”。将其中不期望的靶的扩增是不可检测的测定称为“等位基因特异性的”。然而，应当理解因为检测方法变得更加灵敏，一些先前已知是等位基因特异性的测定变为是等位基因选择性的，即靶的不期望的变体的一些扩增变为可检测的。因此，在该发明的背景下，术语“等位基因特异性的”意指涵盖严格地等位基因特异性扩增以及等位基因选择性扩增两者。
“基因型”指的是细胞或主体，或细胞或主体的组的遗传组成的全部或部分。例如，基因型包括在给定的基因座上存在的或在基因组中分布的特定突变和/或等位基因（例如，多态性，诸如单核苷酸多态性（SNP）等）。
“核酸聚合酶”指的是催化核苷酸掺入至核酸中的酶。示例性的核酸聚合酶包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、末端转移酶、反转录酶、端粒酶等。
“热稳定酶”指的是当在选择的时间期间经历提升的温度时，稳定的（即，抵抗分解或变性）并且保持足够的催化活性的酶。例如，当在使双链核酸变性所需要的时间内经历提升的温度时，热稳定的聚合酶保持足够的活性以作用于随后的引物延伸反应。核酸变性所需要的加热条件是本领域中熟知的并且在美国专利号4,683,202和4,683,195中示例。如在本文中使用的，热稳定的聚合酶通常适合用于在温度循环反应，诸如聚合酶链式反应（“PRC”）。热稳定的核酸聚合酶的实例包括水生栖热菌（Thermus aquaticus）Taq DNA聚合酶、栖热菌属种（Thermus sp.）Z05 聚合酶、黄栖热菌（Thermus flavus）聚合酶、海栖热袍菌（Thermotoga maritima）聚合酶，诸如TMA-25和TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶等。
“修饰的”酶指的是包含氨基酸聚合物的酶，其中至少一个单体与参考序列（诸如酶的天然或野生型形式或所述酶的另一种修饰形式）不同。示例性的修饰包括单体插入、缺失和替换。修饰的酶还包括嵌合酶，其具有来源于两个或多个亲本的可识别的组件序列(component sequences)（例如，结构域或功能域等）。在修饰的酶的定义中还包括包含参考序列的化学修饰的那些。修饰的聚合酶的实例包括G46E E678G CS5 DNA 聚合酶、G46E L329A E678G CS5 DNA 聚合酶、G46E L329A D640G S671F CS5 DNA 聚合酶、G46E L329A D640G S671F E678G CS5 DNA 聚合酶、G46E E678G CS6 DNA 聚合酶、Z05 DNA 聚合酶、△Z05 聚合酶、△Z05-Gold 聚合酶、△Z05R 聚合酶、E615G Taq DNA 聚合酶、E678G TMA-25 聚合酶、E678G TMA-30 聚合酶等。
术语“5' 至 3'核酸酶活性”或“5'-3'核酸酶活性”指的是核酸聚合酶的活性，通常与核酸链合成有关，借此将核苷酸从核酸链5'端移除，例如，大肠杆菌（E. coli）DNA聚合酶I具有该活性，而克列诺片段（Klenow fragment）则没有。
“基本上缺少5'-3'核酸酶活性”的聚合酶指的是具有Taq DNA聚合酶的50%或更少（例如，<25%、<20%、<15%、10%）的5'-3'核酸酶活性的聚合酶。测量5'-3'核酸酶活性的方法和用于测量的条件是本领域熟知的。见，例如，美国专利号5,466,591。实质上缺少5'-3'核酸酶活性的DNA聚合酶的实例包括大肠杆菌DNA聚合酶 I的克列诺片段；缺少N-端的 235个氨基酸的水生栖热菌DNA聚合酶（Taq）（例如，在美国专利号5,616,494中描述的并且在本领域中通常称为“Stoffel 片段”）。其他实例包括具有足够缺失（例如，N-端缺失）、突变或修饰，从而将负责5'-3'核酸酶活性的结构域域消除或失活的热稳定DNA聚合酶。见，例如，美国专利号5,795,762。
术语“3'至5'核酸酶活性”或“3'-5'核酸酶活性”或“校正活性”指的是核酸聚合酶的活性，由此将核苷酸从核酸链的3'端移除。例如，大肠杆菌DNA聚合酶III具有该活性，而水生栖热菌（Taq）DNA聚合酶则没有。
“保真度”或“复制保真度”是核酸聚合酶在模板依赖性聚合期间掺入正确核苷酸的能力。在复制保真度的背景下，在新生核苷酸链上的“正确核苷酸”是通过Watson-Crick碱基配对与模板核苷酸配对的核苷酸。特定聚合酶的复制保真度由将正确的核苷酸掺入和通过聚合酶的3'-5'核酸酶活性从新生核苷酸链的3'-端将错误核苷酸移除的组合产生。测量核苷酸聚合酶的保真度的多个方法在Tindall 等(1988) Fidelity of DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase. Biochemistry, 27:6008-6013中进行综述。通常，具有3'-5'核酸酶（校正）能力的聚合酶比没有校正活性的聚合酶具有更高的保真度。
“标记”指的是连接（共价地或非共价地）至分子并且能够提供关于分子的信息的部分。示例性的标记包括荧光标记、比色标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记、质量修饰基团（mass modifying group）、抗体、抗原、生物素、半抗原和酶（包括过氧化物酶、磷酸酶等）。
在核酸扩增反应的背景下，“热启动”指的是这样的方案，其中将至少一种关键试剂从反应混合物中扣除(withheld)（或，如果在反应混合物中存在，则所述试剂保持失活）直到将温度提升至足够提供一个或多个引物所需要的杂交特异性。“热启动酶”是这样的酶，其通常为核酸聚合酶，能够在热启动方案中作为“扣除的”或无活性的试剂。
“Watson-Crick碱基配对”或简单地“碱基配对”指的是在双链核酸分子中“常规的”氢键键合。Watson-Crick碱基配对是在腺嘌呤和胸腺嘧啶之间、在鸟嘌呤和胞嘧啶之间、在腺嘌呤和尿嘧啶和在这些碱基的类似物之间的氢键键合。
“选择性核苷酸”是在等位基因特异性引物中赋予引物等位基因选择性的核苷酸。选择性核苷酸与在靶核酸期望的变体中对应的核苷酸互补，但是不与在靶核酸不期望的变体中的对应的核苷酸互补。在引物中，多于一个核苷酸可以与靶核酸期望的变体中的核苷酸互补，但是不与靶核酸不期望的变体中对应的核苷酸互补。然而，选择性核酸位于在引物中影响引物特异性的位置。选择性核苷酸允许靶核酸的有效的或无效的扩增，取决于其在靶核酸中是否发现互补的配偶体(partner)。引物可以含有多于一个选择性核苷酸。
表达“其中当所述第二寡核苷酸与和至少一个选择性核苷酸互补的靶序列的变体杂交时，所述聚合酶能够有效地延伸所述第二寡核苷酸，并且当所述第二寡核苷酸与不和至少一个选择性核苷酸互补的靶序列的变体杂交时，所述聚合酶延伸所述第二寡核苷酸的效率实质上较低。”意为当选择性核苷酸与靶形成碱基对时，通过聚合酶的第二寡核苷酸的延伸比当所述选择性核苷酸不与靶形成碱基对时效率更高。
如上文提及的，在一个方面中，本发明涉及等位基因特异性扩增的方法，其包括（a）提供样品，其可能含有靶序列的至少一个变体；（b）提供第一寡核苷酸，其至少部分地与靶序列的多于一个变体互补；（c）提供第二寡核苷酸，其至少部分地与靶序列的一个或多个变体互补，具有与靶序列的仅一个变体互补的选择性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸包含具有在环外氨基处共价修饰的碱基的核苷酸和经修饰的磷酸酯两者；（d）提供适合用于所述第一和第二寡核苷酸与靶序列的至少一个变体杂交的条件；（e）提供适合用于通过核酸聚合酶的寡核苷酸延伸的条件；其中当第二寡核苷酸与对其具有所述互补的选择性核苷酸的靶序列的变体杂交时，所述聚合酶能够延伸所述第二寡核苷酸，并且当所述第二寡核苷酸与对其具有不互补的选择性核苷酸的靶序列的变体杂交时，所述延伸实质上较少。
将至少部分地与靶序列的一个或多个变体互补，具有与靶序列的仅一个变体互补的选择性核苷酸的第二寡核苷酸称为“选择性寡核苷酸”、“选择性引物”或“等位基因选择性引物”。本发明的选择性寡核苷酸包含10-50个，更优选地15-35个核苷酸，所述核苷酸中的大多数与靶序列的多于一个变体中的序列互补。寡核苷酸的选择性核苷酸与待扩增的靶序列的变体互补并且不与其他变体互补。在一个实施方案中，选择性核苷酸是3`-端核苷酸。本发明的选择性寡核苷酸包含具有在环外氨基处共价修饰的碱基的一个或多个核苷酸。在一些实施方案中，碱基修饰的核苷酸出现在3`-端核苷酸上游的1至5个核苷酸（在本文中也指定为 -1、-2、-3、-4、-5或N-1、N-2、N-3、N-4、N-5位置）。在其他实施方案中，碱基修饰的核苷酸在3'-端。在一些实施方案中，碱基修饰的核苷酸出现在3'-端且至少再一次出现在寡核苷酸中的其他位置。
具有环外氨基的共价修饰的核苷酸已经在美国专利号6,001,611, ('611)中描述。这样的核苷酸的合成，和掺入这样的核苷酸的寡核苷酸同样在所述‘611专利中描述。
环外氨基的实例包括在腺苷第6-位、鸟苷第2-位和胞苷第4-位的氨基。参与和互补核酸链碱基配对的环外氨基还可以在核苷酸的多种非常规含氮碱基中出现。具有非常规碱基的核苷酸的实例包括，但不限于，3-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、3-甲基鸟苷、5-甲基胞苷和5-羟甲基胞苷。这样的非常规碱基的环外氨基的合适修饰还可以根据本发明的经验法来选择。
下文显示分别含有经修饰的腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶碱基的经修饰的核苷酸的结构，
其中S代表糖部分，并且R代表修饰物基团(modifier group)。考虑具有上文概述的四种特性的各种修饰物基团。在某些实施方案中，修饰物基团具有结构：
其中R1和R2 独立地选自氢、烷基、烷氧基、未取代的或取代的芳基和苯氧基。
烷基可以是支化的或未支化的。
烷基可以是 C1-C20烷基，例如C1-C10烷基。
烷氧基可以是C1-C20烷氧基，例如C1-C10烷氧基。
芳基可以是未取代的或取代的苯基或萘基(naphtyl)。
在一个实施方案中，R是苯甲基或取代的苯甲基。在某些实施方案中，取代的苯甲基可以具有以下结构：
其中R3代表C1-C6支化的或未支化的烷基，更优选为C1-C4支化的或未支化的烷基、烷氧基、或硝基。优选地，R3连接在对位。
在一些实施方案中，通过下文显示的结构表示修饰物基团：
通常，对来自本文描述的化合物类别的特定的合适的修饰物基团的经验选择可以通过本领域技术人员基于上文列举的四种特性的存在常规地实施。优选地，特定基团的适合性通过使用在等位基因特异性扩增反应中具有经修饰的核苷酸的引物来经验性地确定。当与使用未修饰的引物的相同反应比较时，通过使用具有碱基修饰的引物的反应的选择性增加指示修饰的适合性。
经修饰的磷酸酯残基的合成和使用已经在美国专利号7,741,472 (‘472)中描述。将含有至少一个羟基残基的磷原子与具有N=N-N-Acc结构的叠氮化物反应，其中Acc是电子受体或被残基R取代的电子受体，并且R是任何有机取代基。经修饰的磷酸酯的一个实例具有结构：
其中，A和B代表核苷酸链，D是OH或CH3，并且Acc选自CN、SO2-R'，其中R'包括至少一个氨基取代的烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂环、和在邻位或对位具有至少一个的烷基化N-原子的六元 N+ 杂环，所述杂环选自吡啶鎓、嘧啶鎓和喹啉鎓。
含有这样的经修饰的磷酸酯残基的寡核苷酸可以用于与天然DNA和RNA杂交，并且作为探针或引物在扩增反应（诸如实时PCR）中行使功能。经修饰的磷酸酯的一个实施方案具有结构：
并且在‘472专利中称为P(=NSO2PhNHAc)或pABSA。在‘472专利中描述的经修饰的磷酸酯的其他实施方案包括P=pPh-NAc、P(=N-SO2-Ph-p-N=N-Ph-p-NMe2)和P=NS(O)2-罗丹明-B。对使用掺入这些经修饰的磷酸酯的寡核苷酸引物的实时PCR和解链曲线分析也已经在‘472专利中描述。
本发明的等位基因特异性引物可以并入本领域已知的引物设计的多个方面。例如，引物可以采用称为“蝎形物（scorpion）”并且在Whitcombe 等, (1999) Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence, Nature Biotech. 17:804-807中描述的单分子引物-探针组合的形式。根据本发明设计的蝎形引物掺入了蝎形物的典型元素，即探针部分、茎环部分和引物部分。进一步，在根据本发明设计的蝎形物中，引物部分具有与变体位置互补的3'端。根据本发明设计的蝎形物中的引物部分含有如本文描述的一个或多个碱基修饰的核苷酸和一个或多个经修饰的磷酸酯。
在本发明的一些实施方案中，扩增涉及聚合酶链式反应，即，模板变性、寡核苷酸引物退火（杂交）至模板和通过核酸聚合酶的引物延伸的重复循环。在一些实施方案中，退火和延伸在相同温度的步骤中发生。
在一些实施方案中，扩增反应涉及热启动方案。在等位基因特异性扩增的背景下，对于错配靶的等位基因特异性引物的选择性可以通过使用热启动方案提高。在本领域中已知许多热启动方案，例如，蜡的使用，将关键试剂与反应混合物的其余部分分开（美国专利号5,411,876），使用通过抗体可逆失活的核酸聚合酶（美国专利号5,338,671），使用通过被设计为特异性结合其活性位点的寡核苷酸可逆失活的核酸聚合酶（美国专利号5,840,867）或使用具有可逆化学修饰的核酸聚合酶，如在例如美国专利号5,677,152和5,773,528中描述的。
在本发明的一些实施方案中，等位基因特异性扩增测定是实时PCR测定。在实时PCR测定中，扩增的量度是“达到阈值的循环”或Ct值。较早的Ct值反映了阈值水平的快速实现，并且因此是更有效的扩增。较晚的Ct值可以反映无效的或受抑制的扩增。在等位基因特异性的实时PCR测定背景下，在匹配的和错配的模板之间的Ct值的差异是等位基因之间的辨别或测定的选择性的量度。
等位基因特异性扩增测定可以使用本领域已知的任何合适的核酸聚合酶。对于等位基因特异性PCR测定，可以使用任何热稳定的核酸聚合酶。有时期望使用没有校正（3'-5'核酸外切酶）活性的酶，诸如例如，Taq DNA聚合酶。其还可以期望使用基本上或完全缺乏5'-3'核酸酶活性的酶，诸如在美国专利号5,795,762中描述的。这样的酶的一个实例是△Z05聚合酶。有时可以期望拥有具有“热启动”能力的酶，诸如在美国专利号5,677,152和5,773,528中描述的可逆修饰的酶。热启动酶的一个实例是△Z05-Gold聚合酶。
扩增产物的检测可以通过本领域已知任何方法完成。这些方法包括使用标记的引物和探针以及多种核酸结合染料。检测的方法可以对靶序列的一个变体是特异性的，或者可以对靶序列的所有变体或者甚至对所有双链DNA是通用的。可以在靶不期望的变体的扩增是最低的并且预期落入方法的检测限值之下时使用非特异性的检测方法。
可以在扩增已完成后检测扩增产物，例如，通过未标记的产物的凝胶电泳和使用核酸结合染料将凝胶染色。可选地，扩增产物可以携带放射性或化学标记，或者借助于在合成期间掺入或者借助于作为经标记的引物的延伸产物。在电泳之后或期间，可以使用本领域已知的合适的放射学或化学工具检测标记的扩增产物。在电泳后，还可以使用通过本领域已知的任一方法标记的靶特异性探针检测产物。标记的探针还可以在没有电泳的情况下施加至靶，即，在“斑点印迹”测定等中。
在其他实施方案中，扩增产物的存在可以在均相测定（homogeneous assay）中检测，所述均相测定即其中新生产物在扩增循环期间或至少在同一未打开的管中检测，并且不需要扩增后操作的测定。均相扩增测定已经在例如美国专利号5,210,015中描述。使用核酸嵌入染料的均相扩增测定已经在例如美国专利号5,871,908和6,569,627中描述。均相测定还可以使用用两个相互作用的荧光团标记的荧光探针，诸如“分子信标”探针(Tyagi 等, (1996) Nat. Biotechnol., 14:303-308)或荧光标记的核酸酶探针(Livak 等, (1995) PCR Meth. Appl., 4:357-362)。在这些技术的某些变化中，扩增产物还可以借助于其特有的解链温度鉴定，见美国专利号5,871,908和6,569,627。扩增产物还可以使用被称为“蝎形物”的单分子引物-探针组合检测。Whitcombe 等, (1999) Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence, Nature Biotech. 17:804-807。蝎形寡核苷酸的引物部分可以是根据本发明设计的等位基因特异性引物。
在另一个方面中，本发明提供了用于特异性或选择性扩增靶序列的所选变体的反应混合物，所述反应混合物包含第一寡核苷酸，其至少部分地与靶序列的多于一个变体互补；第二寡核苷酸，其至少部分地与靶序列的多于一个变体互补，但具有与靶序列的仅一个变体互补的选择性核苷酸，其中所述第二寡核苷酸包含至少一个具有在环外氨基处共价修饰的碱基的核苷酸和至少一个经修饰的磷酸酯；以及靶核酸，其已知以多于一个序列变体存在。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含对于核酸扩增通常需要的试剂和溶液，包括核酸聚合酶、核酸前体，即核苷三磷酸，以及适合于支持核酸聚合酶活性的有机离子和无机离子。
在另一个方面中，本发明提供了用于进行根据本发明的等位基因特异性扩增的试剂盒。试剂盒通常包括测定特定的组分以及对进行DNA扩增测定通常需要的组分。作为测定特定的组分，本发明的等位基因特异性扩增试剂盒通常包括第一寡核苷酸，其至少部分地与靶序列的一个或多个变体互补；和第二寡核苷酸，其至少部分地与靶序列的多于一个变体互补，具有与靶序列的仅一个变体互补的选择性核苷酸，并且还具有至少一个具有在环外氨基处共价修饰的碱基的核苷酸和至少一个经修饰的磷酸酯两者；和任选地，包含一定量的对照靶序列的至少一个变体的对照核酸序列，其至少部分地与试剂盒中装有的寡核苷酸互补。在一些实施方案中，可以装有对照核酸序列的多于一个变体。在某些实施方案中，在装在试剂盒中的对照核酸序列的数个变体之中，至少一个变体是与等位基因选择性寡核苷酸的选择性核苷酸互补的。作为核酸扩增通常需要的组分，本发明的试剂盒通常包括一种或多种核酸聚合酶，核酸前体，诸如核苷三磷酸（脱氧核糖核苷三磷酸或核糖核苷三磷酸），任选地，焦磷酸酶（用于最小化核酸的焦磷酸解作用），尿嘧啶 N-糖基化酶（UNG）（用于保护免于扩增反应的遗留污染（carry-over contamination）），扩增反应和检测必需的预制试剂和缓冲液，和用于进行本发明的等位基因特异性扩增的一套说明书。
在还另一个方面中，本发明提供了在等位基因特异性PCR中使用的寡核苷酸。在本发明的等位基因特异性PCR中使用的典型寡核苷酸包含10-50个，更优选15-35个核苷酸，它们的大多数与靶序列的多于一个变体中的序列互补。然而，寡核苷酸的选择性核苷酸与靶序列的一个变体互补并且不与其他变体互补。进一步，本发明的寡核苷酸包含至少一个具有在环外氨基处共价修饰的碱基的核苷酸和经修饰的磷酸酯两者。在一些实施方案中，碱基修饰的核苷酸出现在3`-端核苷酸。在其他实施方案中，碱基修饰的核苷酸出现在3`-端核苷酸上游的1至5个，或例如1、2或3个核苷酸处。在一些实施方案中，碱基修饰的核苷酸出现在3`-端以及寡核苷酸内的其他位置。
提供以下的实施例和附图以帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求中陈述。应当理解可以在陈述的程序中进行修改，而不偏离本发明的精神。
实施例
实施例1
用于在人EGFR基因中检测突变G719S的引物
下文显示的扩增反应使用对野生型和突变体靶通用的检测探针（SEQ ID NO: 2）和正向引物（SEQ ID NO:1）实施。每个反应中的反向引物在表1中显示为：SEQ ID NO:3，对突变体和野生型靶通用的引物；或SEQ ID NO:4、5、6、7、8，在3'端碱基位置与G719S 突变体靶序列匹配并且与野生型靶错配的引物。
在这些反应中使用的靶或者是合并的人WT基因组DNA（由Clontech提供），或者是含有在pUC19质粒载体内的500bp G719S序列插入片段的突变体质粒构建体（由IDT作为小基因(minigene)提供）。
突变体或野生型DNA在反应物中扩增，所述反应物由50mM Tris-HCl (pH 8.0)、80mM氯化钾、160μM dATP、160μM dCTP、160μM dGTP、320μM dUTP、0.1μM每种选择性和通用引物、0.05μM探针、200nM NTQ21-46A适配子、40nM Z05-D突变体聚合酶、10单位Z05和0.1mM EDTA、1.25% DMSO、2.11% 甘油和2.5mM醋酸镁组成。突变体或野生型靶以每反应约40,000个拷贝的起始浓度存在。
使用LightCycler 480仪器完成扩增和分析。使用以下概况对反应物进行热循环：开始在50℃保持5分钟，随后为95℃（10秒）至62℃（30秒）的循环的2个循环和93℃（10秒）至62℃（30秒）的80个循环。在80个循环PCR期间的每次62℃退火步骤起始时收集荧光数据。
证明了pABSA 修饰的引物SEQ ID NO: 5、6、7、8比非-pABSA 修饰的引物（SEQ ID NO: 4）更具有辨别力。此外，含有N4-对-叔丁基-苯甲基胞嘧啶（tbbdC）和pABSA两者的引物SEQ ID NO:7显示出最高的辨别。将辨别测量为等量输入(equal input)（40,000c）的突变体靶相对于野生型靶的扩增之间的ΔCt的函数。将更大的 ΔCt解释为突变体和野生型等位基因之间扩增的更高辨别。
表 1
实施例2
用于在人EGFR 基因中检测突变L858R的引物
在下文显示的扩增反应使用对野生型和突变体靶通用的检测探针（SEQ ID NO: 10）和正向引物（SEQ ID NO: 9）实施。在每个反应中的反向引物是：SEQ ID NO: 11，对应突变体型和野生型靶通用的引物，或SEQ ID NO: 12、13、14、15、16、17，在3'端碱基位置与L858R 突变体靶序列匹配并且与野生型靶错配的引物。
在这些反应中使用的靶或者是合并的人WT基因组DNA（由Clontech提供），或者是含有pUC19质粒载体内的500bp L858R序列插入片段的突变体质粒构建体（由IDT作为小基因提供）。
突变体或野生型DNA在反应物中扩增，所述反应物由50mM Tris-HCl (pH 8.0)、80mM氯化钾、160μM dATP、160μM dCTP、160μM dGTP、320μM dUTP、0.1μM每种选择性和通用引物、0.05μM探针、200nM NTQ21-46A适配子、40nM Z05-D突变体聚合酶、10单位Z05和0.1mM EDTA、1.25% DMSO、2.11% 甘油和2.5mM醋酸镁组成。突变体或野生型靶以每反应约40,000个拷贝的起始浓度存在。
使用LightCycler 480仪器完成扩增和分析。使用以下概况对反应物进行热循环：开始在50℃保持5分钟，随后为95℃（10秒）至62℃（30秒）的循环的2个循环和93℃（10秒）至62℃（30秒）的80个循环。在80个循环PCR期间的每次62℃退火步骤起始时收集荧光数据。
证明了pABSA 修饰的引物SEQ ID NO: 13、14、15、16、17比非-pABSA 修饰的引物（SEQ ID NO: 12）更具有辨别力。此外，含有N4-乙基-胞嘧啶和pABSA两者的引物（SEQ ID NO:13, 14）显示出最高的辨别。将辨别测量为等量输入（40,000c）的突变体靶相对于野生型靶的扩增之间的ΔCt的函数。将更大的ΔCt解释为突变体和野生型等位基因之间更高的辨别。
表 2
实施例3
用于在人EGFR基因中检测突变T790M的引物
在下文显示的扩增反应使用对野生型和突变体靶通用的检测探针（SEQ ID NO:19）和正向引物（SEQ ID NO: 18）实施。每个反应中的反向引物是：SEQ ID NO: 20，对突变体和野生型靶通用的引物，或SEQ ID NO: 21、22、23、24、25，在3'端碱基位置与T790M突变体靶序列匹配并且与野生型靶错配的引物。
在这些反应中使用的靶或者是合并的人WT基因组DNA（由Clontech提供），或者是含有pUC19质粒载体内的500bp T790M 序列插入片段的突变体质粒构建体（由IDT作为小基因提供）。
突变体或野生型DNA在反应物中扩增，所述反应物由50mM Tris-HCl (pH 8.0)、80mM氯化钾、160μM dATP、160μM dCTP、160μM dGTP、320μM dUTP、0.1μM每种选择性和通用引物、0.05μM探针、200nM NTQ21-46A适配子、40nM Z05-D突变体聚合酶、10单位Z05和0.1mM EDTA、1.25% DMSO、2.11% 甘油和2.5mM醋酸镁组成。突变体或野生型靶以每反应约40,000个拷贝的起始浓度存在。
使用LightCycler 480仪器完成扩增和分析。使用以下概况对反应物进行热循环：开始在50℃保持5分钟，随后为95℃（10秒）至62℃（30秒）的循环的2个循环和93℃（10秒）至62℃（30秒）的80个循环。在80个循环PCR期间的每次62℃退火步骤起始时收集荧光数据。
证明了pABSA 修饰的引物SEQ ID NO: 22、23、24、25比非-pABSA 修饰的引物（SEQ ID NO: 21）更具有辨别力。此外，含有tbbdC和pABSA两者的引物（SEQ ID NO:22）显示出最高的辨别。将辨别测量为等量输入（40,000c）的突变体靶相对于野生型靶的扩增之间的ΔCt的函数。将更大的ΔCt解释为突变体和野生型等位基因之间更高的辨别。
表 3

Claims (16)

1.靶序列变体的等位基因特异性扩增的方法，所述靶以数个变体序列的形式存在，所述方法包括：
（a）将第一寡核苷酸和第二寡核苷酸与靶序列的至少一个变体杂交；其中所述第一寡核苷酸至少部分地与靶序列的一个或多个变体互补，并且所述第二寡核苷酸至少部分地与靶序列的一个或多个变体互补，并且具有与靶序列的仅一个变体互补的至少一个选择性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸包含具有在环外氨基处共价修饰的碱基的核苷酸和经修饰的磷酸酯两者，所述磷酸酯具有结构：
其中A和B代表核苷酸链，D是OH或CH3，并且Acc是电子受体或被残基R取代的电子受体，其中R是有机取代基，其中Acc选自CN、SO2-R'，其中R' 包括至少一个氨基取代的烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂环、和在邻位或对位具有至少一个烷基化N-原子的六元N+ 杂环，所述杂环选自吡啶鎓、嘧啶鎓和喹啉鎓；
（b）提供适合用于通过核酸聚合酶的寡核苷酸延伸的条件；
（c）通过所述核酸聚合酶延伸所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸，其中当所述第二寡核苷酸与和所述至少一个选择性核苷酸互补的靶序列的变体杂交时，所述核酸聚合酶能够有效地延伸所述寡核苷酸，并且当所述第二寡核苷酸与不和所述至少一个选择性核苷酸互补的靶序列的变体杂交时，所述核酸聚合酶延伸所述寡核苷酸的效率实质上较低。
2.权利要求1的所述方法，其中所述至少一个选择性核苷酸位于3`端核苷酸。
3.权利要求1的所述方法，其中具有在环外氨基处共价修饰的所述碱基的所述核苷酸出现在相对于3`-端核苷酸-5、-4、-3、-2或-1位置。
4.权利要求3的所述方法，其中在环外氨基处共价修饰的所述碱基选自N6-苯甲基-腺嘌呤、N6-对-叔丁基-苯甲基腺嘌呤、N4-对-叔丁基-苯甲基胞嘧啶、N4-乙基-胞嘧啶和N4-苯甲基-胞嘧啶。
5.权利要求1的所述方法，其中所述经修饰的磷酸酯出现在相对于3`-端核苷酸的-5和-4位置的核苷酸之间、相对于3`-端核苷酸的-4和-3位置的核苷酸之间、相对于3`-端核苷酸的-3和-2位置的核苷酸之间、相对于3`-端核苷酸的-2和-1位置的核苷酸之间、以及相对于3`-端核苷酸的-1位置的核苷酸和3`-端核苷酸之间。
6.权利要求5的所述方法，其中所述经修饰的磷酸酯选自P(=NSO2PhNHAc)、P=pPh-NAc、P(=N-SO2-Ph-p-N=N-Ph-p-NMe2)和P=NS(O)2-罗丹明-B。
7.权利要求6的所述方法，其中所述经修饰的磷酸酯是P(=NSO2PhNHAc)。
8.权利要求1的所述方法，其中所述靶序列变体是人EGFR 基因的突变。
9.权利要求8的所述方法，其中所述第二寡核苷酸选自SEQ ID NO: 7、13、14、22。
10.检测靶序列变体的方法，所述靶以数个变体序列的形式存在，所述方法包括：
（a）将第一寡核苷酸和第二寡核苷酸与靶序列的至少一个变体杂交；其中所述第一寡核苷酸至少部分地与靶序列的一个或多个变体互补，并且所述第二寡核苷酸至少部分地与靶序列的一个或多个变体互补，并且具有与靶序列的仅一个变体互补的至少一个选择性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸包含具有在环外氨基处共价修饰的碱基的核苷酸和经修饰的磷酸酯两者，所述磷酸酯具有结构：
其中A和B代表核苷酸链，D是OH或CH3，并且Acc是电子受体或被残基R取代的电子受体，其中R是有机取代基，其中Acc选自CN、SO2-R'，其中R' 包括至少一个氨基取代的烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂环、和在邻位或对位具有至少一个烷基化N-原子的六元N+ 杂环，所述杂环选自吡啶鎓、嘧啶鎓和喹啉鎓；
（b）提供适合用于通过核酸聚合酶的寡核苷酸延伸的条件；
（c）通过所述核酸聚合酶延伸所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸，其中当所述第二寡核苷酸与和所述至少一个选择性核苷酸互补的靶序列的变体杂交时，所述核酸聚合酶能够有效地延伸所述寡核苷酸，并且当所述第二寡核苷酸与不和所述至少一个选择性核苷酸互补的靶序列的变体杂交时，所述核酸聚合酶延伸所述寡核苷酸的效率实质上较低；
（d）检测所述寡核苷酸延伸的产物，其中所述延伸表明所述靶序列的变体的存在，所述第二寡核苷酸对所述靶序列的变体具有互补的选择性核苷酸。
11.权利要求10的所述方法，其中所述经修饰的磷酸酯选自P(=NSO2PhNHAc)、P=pPh-NAc、P(=N-SO2-Ph-p-N=N-Ph-p-NMe2)和P=NS(O)2-罗丹明-B。
12.用于靶序列的等位基因特异性扩增的试剂盒，所述靶以数个变体序列的形式存在，所述试剂盒包括：
（a）第一寡核苷酸，其至少部分地与靶序列的一个或多个变体互补；和
（b）第二寡核苷酸，其至少部分地与靶序列的一个或多个变体互补，并且具有与靶序列的仅一个变体互补的至少一个选择性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸包含具有在环外氨基处共价修饰的碱基的核苷酸和经修饰的磷酸酯两者，所述磷酸酯具有结构：
其中A和B代表核苷酸链，D是OH或CH3，并且Acc是电子受体或被残基R取代的电子受体，其中R是有机取代基，其中Acc选自CN、SO2-R'，其中R' 包括至少一个氨基取代的烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂环、和在邻位或对位具有至少一个烷基化N-原子的六元N+ 杂环，所述杂环选自吡啶鎓、嘧啶鎓和喹啉鎓。
13.权利要求12的所述试剂盒，其进一步包括核酸聚合酶、核苷三磷酸、适合用于通过所述核酸聚合酶的核酸延伸的缓冲液和用于进行等位基因特异性扩增的一套说明书。
14.用于进行靶序列的等位基因特异性扩增的寡核苷酸，所述靶以数个变体序列的形式存在，所述寡核苷酸包含：
（a）至少部分地与所述靶序列的一个或多个变体的部分互补的序列；
（b）与靶序列的仅一个变体互补的至少一个选择性核苷酸；
（c）具有在环外氨基处共价修饰的碱基的核苷酸；
（d）经修饰的磷酸酯，其具有结构：
其中A和B代表核苷酸链，D是OH或CH3，并且Acc是电子受体或被残基R取代的电子受体，其中R是有机取代基，其中Acc选自CN、SO2-R'，其中R' 包括至少一个氨基取代的烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂环、和在邻位或对位具有至少一个烷基化N-原子的六元N+ 杂环，所述杂环选自吡啶鎓、嘧啶鎓和喹啉鎓。
15.权利要求14的所述寡核苷酸，其具有选自SEQ ID NO: 7、13、14、22的序列。
16.用于靶序列的等位基因特异性扩增的反应混合物，所述靶以数个变体序列的形式存在，所述反应混合物包含：
（a）第一寡核苷酸，其至少部分地与靶序列的一个或多个变体互补；和
（b）第二寡核苷酸，其至少部分地与靶序列的一个或多个变体互补，并且具有与靶序列的仅一个变体互补的至少一个选择性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸包含具有在环外氨基处共价修饰的碱基的核苷酸和经修饰的磷酸酯两者，所述磷酸酯具有结构：
其中A和B代表核苷酸链，D是OH或CH3，并且Acc是电子受体或被残基R取代的电子受体，其中R是有机取代基，其中Acc选自CN、SO2-R'，其中R' 包括至少一个氨基取代的烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂环、和在邻位或对位具有至少一个烷基化N-原子的六元N+ 杂环，所述杂环选自吡啶鎓、嘧啶鎓和喹啉鎓；
（c）核酸聚合酶；
（d）核苷三磷酸；和
（e）适合用于通过所述核酸聚合酶的核酸延伸的缓冲液。
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