ES2613532T3 - Dominios de unión a proteína que estabilizan estados conformacionales funcionales de GPCR y usos de los mismos - Google Patents

Dominios de unión a proteína que estabilizan estados conformacionales funcionales de GPCR y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Un procedimiento de identificación de compuestos que se pueden unir a un estado conformacional activo de un GPCR, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: (i) proporcionar un GPCR y un nanocuerpo que se pueda unir específicamente a un estado conformacional activo de dicho GPCR, en el que dicho nanocuerpo puede estabilizar y/o inducir un estado conformacional activo del GPCR tras la unión, y (ii) proporcionar un compuesto de prueba o una colección de compuestos de prueba, y (iii) evaluar si un compuesto de prueba se une al estado conformacional activo del GPCR, y (iv) seleccionar un compuesto que se una al estado conformacional activo del GPCR.

Description

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Las modificaciones postraduccionales y otras con respecto a una cadena polipeptídica, tales como unión al ligando, fosforilación, sulfatación, glucosilación o uniones de grupos hidrófobos, entre otras, pueden influir en la conformación de una proteína. Además, los factores ambientales, tales como el pH, concentración salina, fuerza iónica y osmolalidad de la solución circundante e interacción con otras proteínas y cofactores, entre otros, pueden afectar la conformación de la proteína. El estado conformacional de una proteína se puede determinar mediante ensayo funcional por actividad o unión a otra molécula o bien por medio de procedimientos físicos, tales como cristalografía de rayos X, RMN o marcaje de espín, entre otros procedimientos. Para un análisis general de la conformación de la proteína y estados conformacionales, consúltese Cantor and Schimmel, Biophysical Chemistry, Part I: The Conformation of Biological. Macromolecules. W.H. Freeman and Company, 1980, and Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties, W.H. Freeman and Company, 1993. Un "estado conformacional específico" es cualquier subconjunto del intervalo de conformaciones o estados conformacionales que puede adoptar una proteína.
Una "conformación funcional" o un "estado conformacional funcional", como se usa en el presente documento, se refiere al hecho de que las proteínas poseen diferentes estados conformacionales que tienen un intervalo dinámico de actividad, en particular, que varían desde ninguna actividad a una actividad máxima. Debe quedar claro que "un estado conformacional funcional" pretende cubrir cualquier estado conformacional de un GPCR, que tiene cualquier actividad, incluyendo ninguna actividad; y no pretende cubrir los estados desnaturalizados de proteínas.
Como se usa en el presente documento, los términos "región determinante de la complementariedad" o "CDR" en el contexto de los anticuerpos se refieren a regiones variables de las cadenas H (pesadas) o bien L (ligeras) (también abreviadas como VH y VL, respectivamente) y contiene las secuencias de aminoácidos que se pueden unir específicamente a dianas antigénicas. Estas regiones CDR explican la especificidad básica del anticuerpo para una estructura determinante antigénica particular. Dichas regiones también se denominan "regiones hipervariables". Las CDR representan tramos no contiguos de aminoácidos en las regiones variables pero, independientemente de la especie, se ha encontrado que las localizaciones posicionales de estas secuencias de aminoácidos críticas en las regiones variables de la cadena pesada y ligera tienen localizaciones similares en las secuencias de aminoácidos de las cadenas variables. Las cadenas variables pesada y ligera de todos los anticuerpos canónicos tienen cada una 3 regiones CDR, cada una no contigua con las demás (denominadas L1, L2, L3, H1, H2, H3) para las cadenas ligera
(L) y pesada (H) respectivas. En particular, los nanocuerpos comprenden generalmente una única cadena de aminoácidos que se puede considerar que comprende 4 "regiones o secuencias estructurales" o FR y 3 "regiones determinantes de la complementariedad" o CDR. Los nanocuerpos tienen 3 regiones CDR, cada una no contigua con las demás (denominadas CDR1, CDR2, CDR3). La delimitación de las secuencias de CDR y FR se basa en el sistema de numeración única IMGT para dominios V y dominios similares a V (Lefranc et al. 2003).
Un "epítopo", como se usa en el presente documento, se refiere a un determinante antigénico de un polipéptido. Un epítopo puede comprender 3 aminoácidos en una conformación espacial, que es única para el epítopo. Generalmente un epítopo consiste en al menos 4, 5, 6, 7 de dichos aminoácidos, y más normalmente, consiste en al menos 8, 9, 10 de dichos aminoácidos. Los procedimientos de determinación de la conformación espacial de los aminoácidos son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear en 2 dimensiones.
Un "epítopo conformacional", como se usa en el presente documento, se refiere a un epítopo que comprende aminoácidos en una conformación espacial que es única para una conformación plegada en 3 dimensiones del polipéptido. Generalmente, un epítopo conformacional consiste en aminoácidos que son discontinuos en la secuencia lineal que se juntan en la estructura plegada de la proteína. Sin embargo, un epítopo conformacional también puede consistir en una secuencia lineal de aminoácidos que adopta una conformación que es única para una conformación plegada en 3 dimensiones del polipéptido (y no presente en un estado desnaturalizado). En complejos multiproteicos, los epítopos conformacionales consisten en aminoácidos que son discontinuos en las secuencias lineales de uno o más polipéptidos que juntan tras el plegamiento de los diferentes polipéptidos plegados y su asociación en una estructura cuaternaria única. De manera similar, los epítopos conformacionales también pueden consistir aquí en una secuencia lineal de aminoácidos de uno o más polipéptidos que se juntan y adoptan una conformación que es única para la estructura cuaternaria.
El término "especificidad", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de un dominio de unión a proteína, en particular, una inmunoglobulina o un fragmento de inmunoglobulina, tal como un nanocuerpo, de unirse preferentemente a un antígeno, frente a un antígeno diferente, y no necesariamente implica alta afinidad. El término "afinidad", como se usa en el presente documento, se refiere al grado en que un dominio de unión a proteína, en particular, una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo, o un fragmento de inmunoglobulina, tal como un nanocuerpo, se une a un antígeno a fin de desplazar el equilibrio del dominio de unión a proteína y antígeno hacia la presencia de un complejo formado por su unión. De esta manera, por ejemplo, si se combinan un antígeno y anticuerpo (fragmento) en concentración relativamente igual, un anticuerpo (fragmento) de alta afinidad se unirá al antígeno disponible para desplazar el equilibrio hacia una alta concentración del complejo resultante. Se usa comúnmente la constante de disociación para describir la afinidad entre el dominio de unión a proteína y la diana antigénica. Típicamente, la constante de disociación es más baja que 10-5 M. Preferentemente, la constante de disociación es más baja que 10-6 M, más preferentemente, más baja que 10-7 M. Más preferentemente, la constante de disociación es más baja que 10-8 M.
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Los términos "se une específicamente" y "unión específica", como se usan en el presente documento, se refieren generalmente a la capacidad de un dominio de unión a proteína, en particular, una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo, o un fragmento de inmunoglobulina, tal como un nanocuerpo, de unirse preferentemente a un antígeno particular que está presente en una mezcla homogénea de diferentes antígenos. En determinados modos de realización, una interacción de unión específica discriminará entre antígenos deseables e indeseables en una muestra, en algunos modos de realización más de aproximadamente 10 a 100 veces o más (por ejemplo, más de aproximadamente 1000 o 10.000 veces). En el contexto del espectro de estados conformacionales de los GPCR, los términos se refieren particularmente a la capacidad de un dominio de unión a proteína (como se define en el presente documento) de reconocer preferentemente y/o unirse a un estado conformacional particular de un GPCR en comparación con otro estado conformacional. Por ejemplo, un dominio de unión a proteína selectivo de estado activo se unirá preferentemente a un GPCR en un estado conformacional activo y no se unirá o en un menor grado a un GPCR en un estado conformacional inactivo, y, de esta manera, tendrá una afinidad más alta por dicho estado conformacional activo. Los términos "se une específicamente", "se une selectivamente", "se une preferentemente" y los equivalentes gramaticales de los mismos se usan indistintamente en el presente documento. Los términos "específicos conformacionales" o "selectivos conformacionales" también se usan indistintamente en el presente documento.
Un "antígeno", como se usa en el presente documento, significa una molécula que puede desencadenar una respuesta inmunitaria en un animal. En el contexto del espectro de estados conformacionales de los GPCR, dicha molécula comprende un epítopo conformacional de un GPCR en un estado conformacional particular que no se forma o es menos accesible en otro estado conformacional de dicho GPCR.
Una "deleción" se define aquí como un cambio en una secuencia de nucleótidos o bien aminoácidos en la que uno o más residuos de nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, están ausentes en comparación con una secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico o polipéptido original. En el contexto de una proteína, una deleción puede implicar la deleción de aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 10, hasta aproximadamente 20, hasta aproximadamente 30 o hasta aproximadamente 50 o más aminoácidos. Una proteína o un fragmento de la misma puede contener más de una deleción. En el contexto de un GPCR, una deleción también puede ser una deleción de bucle, o una deleción terminal del extremo C y/o N.
Una "inserción" o "adición" es ese cambio en secuencias de nucleótidos o aminoácidos que ha dado como resultado la adición de uno o más residuos de nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, en comparación con una secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos de una proteína original. "Inserción" se refiere generalmente a la adición de uno o más residuos de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de un polipéptido, mientras que "adición" puede ser una inserción o hacer referencia a residuos de aminoácidos añadidos en un extremo N o C o ambos extremos. En el contexto de una proteína o un fragmento de la misma, una inserción o adición es normalmente de aproximadamente 1, aproximadamente 3, aproximadamente 5, aproximadamente 10, hasta aproximadamente 20, hasta aproximadamente 30 o hasta aproximadamente 50 o más aminoácidos. Una proteína o fragmento de la misma puede contener más de una inserción.
Una "sustitución", como se usa en el presente documento, resulta del reemplazo de uno o más aminoácidos o nucleótidos por diferentes aminoácidos o nucleótidos, respectivamente, en comparación con una secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos de una proteína original o un fragmento de la misma. Se entiende que una proteína o un fragmento de la misma puede tener sustituciones de aminoácidos conservadoras que no tienen sustancialmente ningún efecto sobre la actividad de la proteína. Por sustituciones conservativas se entiende combinaciones tales como gly, ala; val, ile, leu, met; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; cys, met; y phe, tyr, trp.
"Cristal" o "estructura cristalina", como se usa en el presente documento, se refiere a un material sólido, cuyos iones, moléculas o átomos constituyentes están dispuestos en un patrón de repetición de manera ordenada que se extiende en las tres dimensiones espaciales. El proceso de formación de una estructura cristalina a partir de un fluido o a partir de materiales disueltos en el fluido a menudo se denomina "cristalización" o "cristalogénesis". Los cristales de proteína casi siempre se hacen crecer en solución. El enfoque más común es disminuir gradualmente la solubilidad de sus moléculas componentes. El crecimiento de los cristales en solución está caracterizado por dos etapas: nucleación de un cristalito microscópico (que tiene posiblemente 100 moléculas únicamente), seguido del crecimiento de ese cristalito, idealmente hasta un cristal de calidad de difracción.
La "cristalografía de rayos X", como se usa en el presente documento, es un procedimiento de determinación de la disposición de los átomos en un cristal, en el que un haz de rayos X choca contra un cristal y se difracta en muchas direcciones específicas. A partir de los ángulos e intensidades de estos haces difractados, un cristalógrafo puede producir una imagen tridimensional de la densidad de electrones en el cristal. A partir de esta densidad de electrones, se pueden determinar las posiciones medias de los átomos en el cristal, así como sus enlaces químicos, su desordenación y otra información.
El término "coordenadas atómicas", como se usa en el presente documento, se refiere a un conjunto de coordenadas tridimensionales para los átomos en una estructura molecular. En un modo de realización, las coordenadas atómicas se obtienen usando cristalografía de rayos X de acuerdo con procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica de la biofísica. Descrito brevemente, se pueden obtener los patrones de difracción de
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rayos X mediante difracción de rayos X de un cristal. Se usan los datos de difracción para calcular un mapa de densidad de electrones de la celda unitaria que comprende el cristal; se usan dichos mapas para establecer las posiciones de los átomos (es decir, las coordenadas atómicas) en la celda unitaria. Los expertos en la técnica entienden que un conjunto de coordenadas de estructura determinadas por cristalografía de rayos X contiene errores estándar. En otros modos de realización, se pueden obtener las coordenadas atómicas usando otros procedimientos de determinación de la estructura biofísicos experimentales que pueden incluir procedimientos de difracción de electrones (también conocida como cristalografía de electrones) y resonancia magnética nuclear (RMN). Aún en otros modos de realización, se pueden obtener las coordenadas atómicas usando herramientas de modelado molecular que se pueden basar en uno o más de algoritmos de plegamiento de proteínas desde el principio, minimización de la energía y el modelado basado en homología. Estas técnicas son bien conocidas por los expertos en las técnicas biofísicas y bioinformáticas.
La "resolución de la estructura" como se usa en el presente documento se refiere a determinar la disposición de los átomos o las coordenadas atómicas de una proteína, y a menudo se hace mediante un procedimiento biofísico, tal como cristalografía de rayos X. El término "compuesto" o "compuesto de prueba" o "compuesto candidato" o "compuesto candidato a fármaco" como se usa en el presente documento describe cualquier molécula, natural o bien sintética que se somete a prueba en un ensayo, tal como un ensayo de cribado o ensayo de descubrimiento de fármacos. Como tales, estos compuestos comprenden compuestos orgánicos o inorgánicos. Los compuestos incluyen análogos de hormonas, lípidos o polinucleótidos que están caracterizados por bajos pesos moleculares. Otros compuestos de prueba orgánicos biopoliméricos incluyen péptidos pequeños o moléculas similares a péptido (peptidomiméticos) que comprenden desde aproximadamente 2 a aproximadamente 40 aminoácidos y polipéptidos más grandes que comprenden desde aproximadamente 40 a aproximadamente 500 aminoácidos, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o conjugados de anticuerpos. Los compuestos de prueba también pueden ser andamiajes de proteína. Para propósitos de alto rendimiento, se pueden usar colecciones de compuestos de prueba, tales como colecciones combinatorias o aleatorias que proporcionan un intervalo suficiente de diversidad. Los ejemplos incluyen, pero están limitados a, colecciones de compuestos naturales, colecciones de compuestos alostéricos, colecciones de péptidos, colecciones de fragmentos de anticuerpos, colecciones de compuestos sintéticos, colecciones basadas en fragmentos, colecciones de expresión en fago y similares. Se puede encontrar adicionalmente una descripción más detallada en la memoria descriptiva.
Como se usa en el presente documento, los términos "determinar", "medir", "evaluar", "supervisar" y "someter a ensayo" se usan indistintamente e incluyen tanto determinaciones cuantitativas como cualitativas.
El término "biológicamente activo", con respecto a un GPCR, se refiere a un GPCR que tiene una función bioquímica (por ejemplo, una función de unión, una función de transducción de señales o una capacidad de cambio de conformación como resultado de la unión al ligando) de un GPCR natural.
Los términos "cantidad terapéuticamente eficaz", "dosis terapéuticamente eficaz" y "cantidad eficaz", como se usa en el presente documento, significan la cantidad necesaria para lograr el resultado o resultados deseados.
El término "farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, significa un material que no es biológicamente o de otro modo indeseable, es decir, se puede administrar el material a un individuo junto con el compuesto sin provocar ningún efecto biológico indeseable o interaccionar de una manera perniciosa con cualquiera de los demás componentes de la composición farmacéutica en la que está contenido.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La información estructural de los GPCR proporcionará información sobre los cambios estructurales, funcionales y bioquímicos implicados en la transferencia de señales desde el receptor a las proteínas que interaccionan intracelularmente (proteínas G, β-arrestinas, etc.) y delimitará las formas de interferir en estas interacciones farmacológicamente pertinentes. Por lo tanto, los esfuerzos para obtener y cristalizar los GPCR son de gran importancia. Sin embargo, esta es una misión particularmente difícil debido a los desafíos bioquímicos en el trabajo con los GPCR y la inestabilidad inherente de estos complejos en soluciones de detergente. Además, la flexibilidad conformacional intrínseca de los GPCR complica el análisis estructural de alta resolución de los GPCR solos porque hacer crecer los cristales de calidad de difracción requiere proteínas conformacionalmente homogéneas estables (Kobilka et al. 2007). La presente solicitud proporciona nuevas herramientas experimentales y analíticas para capturar o "congelar" estados de conformación funcionales de un GPCR de interés, en particular, su estado conformacional activo, lo que permite el análisis estructural y funcional del GPCR, incluyendo el análisis estructural de alta resolución y muchas aplicaciones derivadas del mismo.
En el presente documento se divulga un dominio de unión a proteína que se puede unir específicamente a un estado conformacional funcional de un GPCR.
El dominio de unión a proteína puede ser cualquier molécula no natural o parte de la misma (como se define anteriormente en el presente documento) que se pueda unir específicamente a un estado conformacional funcional de un GPCR diana. Preferentemente, los dominios de unión a proteína como se describe en el presente documento son andamiajes de proteína. El término "andamiaje de proteína" se refiere generalmente a las unidades de
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plegamiento que forman estructuras, particularmente estructuras de péptidos o proteínas, que comprenden estructuras para la unión de otra molécula, por ejemplo, una proteína (véase, por ejemplo, Skerra, J. 2000, para revisión). Un dominio de unión a proteína puede derivar de una molécula natural, por ejemplo, de componentes del sistema inmunitario innato o adaptativo o se puede diseñar artificialmente por completo. Un dominio de unión a proteína se puede basar en inmunoglobulina o se puede basar en dominios presentes en proteínas, incluyendo pero no limitadas a proteínas microbianas, inhibidores de la proteasa, toxinas, fibronectina, lipocalinas, proteínas con superhélice antiparalela monocatenaria o proteínas con motivos de repetición. Los ejemplos de dominios de unión a proteína que se son conocidos en la técnica incluyen, pero no están limitados a: anticuerpos, anticuerpos de cadena pesada (hcAb), anticuerpos de dominio único (sdAb), minicuerpos, el dominio variable derivado de anticuerpos de cadena pesada de camélido (VHH o nanocuerpos), el dominio variable de los receptores de antígeno nuevos derivado de anticuerpos de tiburón (VNAR), alfacuerpos, proteína A, proteína G, dominios de repetición de anquirina diseñados (DARPins), repeticiones de fibronectina tipo III, anticalinas, knottinas, dominios CH2 genotecnológicos (nanoanticuerpos), péptidos y proteínas, lipopéptidos (por ejemplo, pepducinas), ADN y ARN (véase, por ejemplo, Gebauer & Skerra, 2009; Skerra, 2000; Starovasnik et al., 1997; Binz et al., 2004; Koide et al., 1998; Dimitrov, 2009; Nygren et al. 2008; documento WO2010066740). Con frecuencia, cuando se genera un tipo particular de dominio de unión a proteína usando procedimientos de selección, se usan colecciones combinatorias que comprenden una secuencia consenso o estructural que contiene residuos de interacción potencial aleatoria para cribar para determinar la unión a una molécula de interés, tal como una proteína.
Los receptores acoplados a proteína G o "GPCR", como se usa en el presente documento, son polipéptidos que comparten un motivo estructural común, que tienen siete regiones de entre 22 a 24 aminoácidos hidrófobos que forman siete hélices alfa, cada una de las cuales cruza la membrana. Cada cruzamiento se identifica mediante un número, es decir, transmembrana-1 (TM1), transmembrana-2 (TM2), etc. Las hélices transmembranarias están unidas por regiones de aminoácidos entre la transmembrana-2 y la transmembrana-3, la transmembrana-4 y la transmembrana-5, y la transmembrana-6 y la transmembrana-7 en el exterior, o lado "extracelular", de la membrana celular, denominadas regiones "extracelulares" 1, 2 y 3 (EC1, EC2 y EC3), respectivamente. Las hélices transmembranarias también se unen mediante regiones de aminoácidos entre la transmembrana-1 y la transmembrana-2, la transmembrana-3 y la transmembrana-4 y la transmembrana-5 y la transmembrana-6 en el interior, o lado "intracelular", de la membrana celular, denominadas regiones "intracelulares" 1, 2 y 3 (IC1, IC2 e IC3), respectivamente. El extremo "carboxi" ("C") del receptor se encuentra en el espacio intracelular en la célula y el extremo "amino" ("N") del receptor se encuentra en el espacio extracelular fuera de la célula. Cualquiera de estas regiones es fácilmente identificable mediante análisis de la secuencia de aminoácidos primaria de un GPCR.
La clasificación y estructura del GPCR es generalmente bien conocida en la técnica y se puede encontrar un análisis adicional de los GPCR en Probst et al. 1992; Marchese et al. 1994; Lagerström & Schiöth, 2008; Rosenbaum et al. 2009; y los siguientes libros: Jurgen Wess (Ed) Structure-Function Analysis of G Protein-Coupled Receptors publicado por Wiley-Liss (1.º edición; 15 de octubre de 1999); Kevin R. Lynch (Ed) Identification and Expression of G Protein-Coupled Receptors publicado por John Wiley & Sons (marzo de 1998) y Tatsuya Haga (Ed), G Protein-Coupled Receptors, publicado por CRC Press (21 de septiembre de 1999); y Steve Watson (Ed) G-Protein Linked Receptor Factsbook, publicado por Academic Press (1.º edición; 1994).
Los GPCR se pueden agrupar basándose en la homología de secuencia en varias familias distintas. Aunque todos los GPCR tienen una arquitectura similar de siete hélices alfa que cruzan la membrana, las diferentes familias en esta clase de receptor no muestran homología de secuencia entre sí, sugiriendo de esta manera que la similaridad de su estructura de dominio transmembranario podría definir los requisitos funcionales comunes. Fue posible una visión integral del repertorio de GPCR cuando estuvo disponible el primer borrador del genoma humano. Fredriksson y sus compañeros dividieron 802 GPCR humanos en familias basándose en criterios filogenéticos. Esto demostró que la mayoría de los GPCR humanos se pueden encontrar en cinco familias principales, denominado glutamato, rodopsina, adhesión, Frizzled/Taste2 y secretina (Fredriksson et al., 2003).
El dominio de unión a proteína descrito en el presente documento se dirige preferentemente frente a o se puede unir específicamente a un estado conformacional funcional de un GPCR, en el que dicho GPCR se elige del grupo que comprende un GPCR de la familia del glutamato de los GPCR, un GPCR de la familia de la rodopsina de los GPCR, un GPCR de la familia de la adhesión de los GPCR, un GPCR de la familia de Frizzled/Taste2 de los GPCR y un GPCR de la familia de la secretina de los GPCR. Preferentemente, el GPCR es una proteína de mamífero, o una proteína vegetal, o una proteína microbiana, o una proteína vírica, o una proteína de insecto. Incluso más preferentemente, el GPCR es una proteína humana.
Los miembros de la familia de la rodopsina (correspondiente a la clase A (Kolakowski, 1994) o clase 1 (Foord et al (2005) en sistemas de clasificación más antiguos) tienen únicamente pequeños bucles extracelulares y la interacción de los ligandos se produce con residuos en la hendidura transmembranaria. Esto es con mucho el grupo más grande (>90 % de los GPCR) y contiene receptores para odorantes, moléculas pequeñas, tales como catecolaminas y aminas (neuro)péptidos y hormonas de glucoproteína. La rodopsina, un representante de esta familia, es el primer GPCR para el que se ha resuelto la estructura (Palczewski et al., 2000). β2AR, el primer receptor que interacciona con un ligando difusible para el que se ha resuelto la estructura (Rosenbaum et al, 2007) también pertenece a esta familia. Basándose en el análisis filogenético, los GPCR de clase B o los receptores de clase 2 (Foord et al, 2005) se han subdividido recientemente en dos familias: adhesión y secretina (Fredriksson et al., 2003). Los receptores de
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adhesión y secretina están caracterizados por un dominio extracelular en el extremo amínico relativamente largo implicado en la unión al ligando. Se sabe poco acerca de la orientación de los dominios transmembranarios, pero probablemente sea bastante diferente de los de rodopsina. Los ligandos para estos GPCR son hormonas, tales como glucagón, secretina, hormona liberadora de gonadotropinas y hormona paratiroidea. Los receptores de la familia del glutamato (receptores de clase C o clase 3) también tienen un dominio extracelular grande, que funciona como una "venus atrapamoscas", puesto que se puede abrir y cerrar con el agonista unido dentro. Los miembros de la familia son los receptores de glutamato metabotrópicos, sensores de Ca2+ y ácido γ-aminobutírico (GABA)-B.
Los GPCR incluyen, sin limitación, receptores olfativos de serotonina, receptores de hormonas de glucoproteína, receptores de quimiocinas, receptores de adenosina, receptores de aminas biógenas, receptores de melanocortinas, receptores de neuropéptidos, receptores quimiotácticos, receptores de somatostatina, receptores opioides, receptores de melatonina, receptores de calcitonina, receptores de PTH/PTHrP, receptores de glucagón, receptores de secretina, receptores de latrotoxina, receptores de glutamato metabotrópicos, receptores de calcio, receptores GABA-B, receptores de feromonas, los receptores activados por proteasas, las rodopsinas y otros receptores de siete segmentos transmembranarios acoplados a proteína G. Los GPCR también incluyen estos receptores GPCR asociados entre sí como dímeros homoméricos o heteroméricos o como oligómeros de orden superior. Las secuencias de aminoácidos (y las secuencias de nucleótidos de los ADNc que los codifican) de los GPCR están fácilmente disponibles, por ejemplo, por referencia a GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez).
El GPCR se puede elegir del grupo que comprende los receptores adrenérgicos, preferentemente los receptores adrenérgicos α, tales como los receptores adrenérgicos α1 y los receptores adrenérgicos α2, y los receptores adrenérgicos β, tales como los receptores adrenérgicos β1, los receptores adrenérgicos β2 y los receptores adrenérgicos β3; o del grupo que comprende los receptores muscarínicos, preferentemente los receptores muscarínicos M1, los receptores muscarínicos M2, los receptores muscarínicos M3, los receptores muscarínicos M4 y los receptores muscarínicos M5; o del grupo de los receptores de angiotensina, preferentemente el receptor de angiotensina II tipo 1, el receptor de angiotensina II tipo 2 y otros receptores de angiotensina II atípicos; todos los cuales son bien conocidos en la técnica.
Un GPCR, como se usa en el presente documento, puede ser cualquier polipéptido natural o no natural (es decir, alterado por el hombre). El término "natural", en referencia a un GPCR significa un GPCR que se produce naturalmente (por ejemplo, y sin limitación, por un mamífero, más específicamente por un humano, o por un virus, o por una planta, o por un insecto, entre otros). Dichos GPCR se encuentran en la naturaleza. El término "no natural" en referencia a un GPCR significa un GPCR que no es natural. Los GPCR naturales que se han hecho constitutivamente activos a través de mutación y variantes de GPCR naturales son ejemplos de GPCR no naturales. El GPCR no natural puede tener una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 % idéntica a, al menos un 90 % idéntica a, al menos un 95 % idéntica a o al menos un 99 % idéntica a un GPCR natural. Tomando el receptor adrenérgico β2 como un ejemplo particular no limitante de un GPCR dentro del alcance de la presente invención, debe quedar claro a partir de lo anterior que además del receptor adrenérgico β2 humano (por ejemplo, la secuencia descrita por el número de acceso de GenBank NP_000015), también se puede emplear el receptor adrenérgico β2 murino (por ejemplo, como se describe por el n.º de acceso de GenBank NM 007420) u otro receptor adrenérgico β2 de mamífero. Además, se pretende que el término englobe variantes polimórficas naturales y determinadas otras variantes activas del receptor adrenérgico β2 de una especie particular. Por ejemplo, un "receptor adrenérgico β2 humano" tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica al (por ejemplo, al menos un 95 %
o al menos un 98 % idéntica a) "adrenoreceptor β2 humano" natural de número de acceso a Genbank NP_000015. Adicionalmente, se apreciará que la presente invención también contempla GPCR con una deleción de bucle, o una deleción terminal del extremo C y/o N, o una sustitución, o una inserción o adición en relación con su secuencia de nucleótidos o aminoácidos, o cualquier combinación de los mismos (como se define anteriormente en el presente documento, y véase también la sección de ejemplos). Se espera adicionalmente que los dominios de unión a proteína descritos en el presente documento se puedan unir generalmente a todos los análogos, variantes, mutantes, alelos naturales o sintéticos de dicho GPCR.
Se pueden usar diversos procedimientos para determinar la unión específica entre el dominio de unión a proteína y un GPCR diana, incluyendo, por ejemplo, ensayos de inmunoadsorción enzimática (ELISA), ensayos de resonancia de plasmón superficial, expresión en fago y similares, que son práctica común en la técnica, por ejemplo, como se analiza en Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Tercera edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Se apreciará que para este propósito a menudo se usa un marcador o marca única, tal como un marcador de péptido, un marcador de ácido nucleico, un marcador químico, un marcador fluorescente, o una marca de radiofrecuencia, como se describe adicionalmente en el presente documento.
Debe quedar claro que los GPCR son proteínas de membrana conformacionalmente complejas que presentan un comportamiento funcional de espectro en respuesta a ligandos naturales y sintéticos. Definir la vía desde la unión al agonista hasta la activación de la proteína requiere una combinación de estructuras cristalinas de diferentes estados conformacionales del receptor en investigación en complejo con diversos ligandos naturales o sintéticos (incluyendo las estructuras de los estados unidos a agonista activos y complejos GPCR-proteína G), que proporcionará instantáneas junto con la vía de activación.
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Preferentemente, el dominio de unión a proteína descrito en el presente documento puede incrementar la termoestabilidad de un estado conformacional funcional de un GPCR, preferentemente, un estado conformacional activo de un GPCR. En relación con una estabilidad incrementada al calor, esto se puede determinar fácilmente midiendo la unión al ligando o usando procedimientos espectroscópicos, tales como fluorescencia, DC o dispersión de la luz que son sensibles al desplegamiento a temperaturas en incremento (véase también la sección de ejemplos). Es preferente que el dominio de unión a proteína pueda incrementar la estabilidad medida por un incremento en la estabilidad térmica de un GPCR en un estado conformacional funcional con al menos 2 °C, al menos 5 °C, al menos 8 °C y más preferentemente al menos 10 °C o 15 °C o 20 °C. También preferentemente el dominio de unión a proteína puede incrementar la estabilidad térmica de una conformación funcional de un GPCR en el complejo con un ligando, tal como, pero no restringido a un agonista, un agonista inverso, un antagonista y/o un modulador o un inhibidor del GPCR o la vía de señalización dependiente del GPCR. También preferentemente, el dominio de unión a proteína puede incrementar la estabilidad en presencia de un detergente o un caotrópico de un estado conformacional funcional de un GPCR. Preferentemente, el dominio de unión a proteína puede incrementar la estabilidad con respecto a la desnaturalización inducida por enfoques térmicos o químicos del estado conformacional activo de un GPCR. En relación con una estabilidad incrementada al calor, un detergente o a un caotrópico, se incuba típicamente el GPCR durante un tiempo definido, en presencia de un detergente de prueba o un agente caotrópico de prueba y la estabilidad se determina usando, por ejemplo, unión al ligando o un procedimiento espectroscópico, opcionalmente a temperaturas en incremento como se analiza anteriormente. Todavía preferentemente, el dominio de unión a proteína puede incrementar la estabilidad con respecto a un pH extremo de un estado conformacional funcional de un GPCR. Preferentemente, el dominio de unión a proteína puede incrementar la estabilidad con respecto a un pH extremo el estado conformacional activo de un GPCR. En relación con un extremo de pH, se elige un pH de prueba típico, por ejemplo, en el intervalo de 6 a 8, el intervalo de 5,5 a 8,5, el intervalo de 5 a 9, el intervalo de 4,5 a 9,5, más específicamente en el intervalo de 4,5 a 5,5 (pH bajo) o en el intervalo de 8,5 a 9,5 (pH alto).
Los dominios de unión a proteína descritos en el presente documento se pueden dirigir generalmente frente a cualquier GPCR deseado y se pueden dirigir en particular frente a cualquier epítopo conformacional de cualquier GPCR, preferentemente un estado conformacional funcional de cualquier GPCR, más preferentemente un estado conformacional activo de un GPCR (todos como se define anteriormente en el presente documento). Más particularmente, dicho epítopo conformacional puede ser parte de una región intracelular o extracelular, o una región intramembranosa, o una estructura de bucle o dominio de cualquier GPCR deseado. Los dominios de unión a proteína se pueden dirigir frente a cualquier región extracelular adecuada, dominio, bucle u otro epítopo conformacional extracelular de un GPCR, pero se dirigen preferentemente frente a una de las partes extracelulares de los dominios transmembranarios o más preferentemente frente a uno de los bucles extracelulares que enlazan los dominios transmembranarios. De forma alternativa, los dominios de unión a proteína se pueden dirigir frente a cualquier región intracelular adecuada, dominio, bucle u otro epítopo conformacional intracelular de un GPCR, pero se dirigen preferentemente frente a una de las partes intracelulares de los dominios transmembranarios o más preferentemente frente a uno de los bucles intracelulares que enlazan los dominios transmembranarios. Un dominio de unión a proteína que se une específicamente a un epítopo "tridimensional" o "conformacional" se une específicamente a una estructura terciaria (es decir, tridimensional) de una proteína plegada, y se une a una afinidad mucho más reducida (es decir, en un factor de al menos 2, 5, 10, 50 o 100) a la forma lineal (es decir, desplegada, desnaturalizada) de la proteína. Se espera adicionalmente que los dominios de unión a proteína descritos en el presente documento se unan generalmente a todos los análogos, variantes, mutantes, alelos naturales o sintéticos de dicho GPCR.
En un ejemplo específico, el dominio de unión a proteína descrito en el presente documento se puede unir específicamente a un epítopo conformacional intracelular de un GPCR. Preferentemente, el dominio de unión a proteína se puede unir específicamente a un epítopo conformacional que está comprendido en, localizado en o se solapa con el sitio de unión a proteína G de un GPCR. Más preferentemente, dichos dominios de unión a proteína pueden ocupar el sitio de unión a proteína G de un estado conformacional funcional de un GPCR, más preferentemente de un estado conformacional activo de un GPCR. Lo más preferentemente, dichos dominios de unión a proteína muestran un comportamiento similar a proteína G. El término "comportamiento similar a proteína G" como se usa en el presente documento se refiere a la propiedad de los dominios de unión a proteína de unirse preferentemente a un receptor unido a un agonista frente a, por ejemplo, un receptor unido a un agonista inverso. Los dominios de unión a proteína que muestran comportamiento similar a proteína G también potencian la afinidad del receptor por los agonistas, que se atribuye a la interacción cooperativa entre receptor ocupado por agonista y la proteína G (véase también la sección de ejemplos).
Preferentemente, el dominio de unión a proteína deriva de un sistema inmunitario innato o adaptativo. Preferentemente, dicho dominio de unión a proteína deriva de una inmunoglobulina. Preferentemente, el dominio de unión a proteína es un anticuerpo o un derivado del mismo. El término "anticuerpo" (Ab) se refiere generalmente a un polipéptido codificado por un gen de inmunoglobulina, o fragmento funcional de la misma, que se une específicamente a y reconoce un antígeno, y es conocido por el experto en la técnica. Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) convencional comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipétidos, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). El extremo N-terminal de cada cadena define una región variable
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células huésped de animales adecuadas incluyen HEK 293, COS, S2, CHO, NSO, DT40 y similares. La clonación, expresión y/o purificación de los nanocuerpos se puede hacer de acuerdo con las técnicas conocidas por el experto en la técnica.
Se debe advertir que el término nanocuerpo como se usa en el presente documento en su sentido más amplio no está limitado a una fuente biológica específica o a un procedimiento específico de preparación. Por ejemplo, se pueden obtener generalmente los nanocuerpos usados en los procedimientos descritos en el presente documento:
(1)
aislando el dominio VHH de un anticuerpo de cadena pesada natural; (2) mediante expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio VHH natural; (3) mediante "humanización" de un dominio VHH natural o mediante expresión de un ácido nucleico que codifica dicho dominio VHH humanizado; (4) mediante "camelización" de un dominio VH natural de cualquier especie animal, y, en particular, de una especie de mamífero, tal como de un ser humano o mediante expresión de un ácido nucleico que codifica dicho dominio VH camelizado; (5) mediante "camelización" de un "anticuerpo de dominio" o "Dab" como se describe en la técnica o mediante expresión de un ácido nucleico que codifica dicho dominio VH camelizado; (6) usando técnicas sintéticas o semisintéticas para preparar proteínas, polipéptidos u otras secuencias de aminoácidos conocidas de por sí; (7) preparando un ácido nucleico que codifica un nanocuerpo usando técnicas para la síntesis de ácidos nucleicos conocidas de por sí, seguido de la expresión del ácido nucleico obtenido de esta manera; y/o (8) mediante cualquier combinación de uno
o más de los anteriores.
Una clase preferente de nanocuerpos corresponde con los dominios VHH de anticuerpos de cadena pesada naturales dirigidos frente a un estado conformacional funcional de un GPCR. Aunque las colecciones vírgenes o sintéticas de nanocuerpos (para los ejemplos de dichas colecciones, véanse los documentos WO9937681, WO0043507, WO0190190, WO03025020 y WO03035694) pueden contener aglutinantes conformacionales frente a un GPCR en un estado conformacional funcional, un ejemplo preferente incluye la inmunización de un Camelidae con un GPCR en un estado conformacional funcional, opcionalmente unido a un ligando de receptor, para exponer el sistema inmunitario del animal con los epítopos conformacionales que son únicos para el GPCR (por ejemplo, GPCR unido a un agonista para producir anticuerpos dirigidos frente a un GPCR en su estado conformacional activo). De esta manera, como se describe adicionalmente en el presente documento, se pueden generar u obtener preferentemente dichas secuencias de VHH inmunizando adecuadamente una especie de camélido con un GPCR, preferentemente un GPCR en un estado conformacional funcional, más preferentemente un estado conformacional activo (es decir, para producir una respuesta inmunitaria y/o anticuerpos de cadena pesada dirigidos frente a dicho GPCR), obteniendo una muestra biológica adecuada a partir de dicho camélido (tal como una muestra de sangre o cualquier muestra de linfocitos B) y generando secuencias de VHH dirigidas frente a dicho GPCR, partiendo de dicha muestra. Dichas técnicas serán evidentes para el experto. Aún otra técnica para obtener las secuencias de VHH deseadas implica adecuadamente inmunizar un mamífero transgénico que pueda expresar anticuerpos de cadena pesada (es decir, para producir una respuesta inmunitaria y/o anticuerpos de cadena pesada dirigidos frente a un GPCR en un estado conformacional funcional), obtener una muestra biológica adecuada de dicho mamífero transgénico (tal como una muestra de sangre o cualquier muestra de linfocitos B) y luego generando secuencias de VHH dirigidas frente a dicho GPCR partiendo de dicha muestra, usando cualquier técnica adecuada conocida de por sí. Por ejemplo, para este propósito, se pueden usar los ratones que expresan anticuerpos de cadena pesada y los procedimientos y técnicas adicionales descritos en el documento WO02085945 y en el documento WO04049794.
Por consiguiente, la aplicación engloba procedimientos de generación de dominios de unión a proteína descritos en el presente documento. Como un ejemplo no limitante, se proporciona un procedimiento de generación de nanocuerpos que se unen específicamente a un epítopo conformacional de un estado conformacional funcional de un GPCR, que comprende
(i)
inmunizar a un animal con un GPCR, y
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cribar para determinar nanocuerpos que se unen específicamente a un epítopo conformacional de un estado conformacional funcional de dicho GPCR.
Preferentemente, la inmunización de un animal se hace con un GPCR en presencia de un ligando de receptor, en la que dicho ligando induce un estado conformacional funcional particular de dicho GPCR. Por ejemplo, se pueden generar nanocuerpos que se unen específicamente a un epítopo conformacional de un estado conformacional activo de un GPCR inmunizando a un animal con un GPCR en presencia de un agonista que induce la formación de un estado conformacional activo de dicho GPCR (véase también la sección de ejemplos).
Para la inmunización de un animal con un GPCR, se puede producir y purificar el GPCR usando procedimientos convencionales que pueden emplear expresar una forma recombinante del GPCR en una célula huésped y purificar el GPCR usando cromatografía de afinidad y/o procedimientos basados en anticuerpos. Por ejemplo, se puede emplear el sistema baculovirus/Sf-9 para la expresión, aunque también se pueden usar otros sistemas de expresión (por ejemplo, sistemas bacterianos, de levaduras o de células de mamífero). Los procedimientos ejemplares para expresar y purificar los GCPR se describen, por ejemplo, en Kobilka (1995), Eroglu et al (2002), Chelikani et al (2006) y el libro "Identification and Expression of G Protein-Coupled Receptors" (Kevin R. Lynch (Ed.), 1998), entre muchos otros. También se puede reconstituir un GPCR en vesículas de fosfolípidos. Asimismo, se conocen procedimientos para reconstituir un GPCR activo en vesículas de fosfolípidos y se describen en: Luca et al (2003),
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conocida de por sí, uno o más codones en dicha secuencia de nucleótidos de tal manera que la nueva secuencia de nucleótidos codifique un nanocuerpo "humanizado" o "camelizado", respectivamente. Este ácido nucleico se puede expresar de una manera conocida de por sí para proporcionar el nanocuerpo deseado. De forma alternativa, basándose en la secuencia de aminoácidos de un dominio VH o dominio VHH natural, respectivamente, se puede diseñar la secuencia de aminoácidos del nanocuerpo humanizado o camelizado deseado, respectivamente, y luego sintetizar de novo usando técnicas para la síntesis de péptidos conocida de por sí. Además, basándose en la secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos de un dominio VH o dominio VHH natural, respectivamente, se puede diseñar una secuencia de nucleótidos que codifique el nanocuerpo humanizado o camelizado deseado, respectivamente y luego sintetizar de novo usando técnicas para la síntesis de ácidos nucleicos conocidas de por sí, después de lo cual el ácido nucleico obtenido de esta manera se puede expresar de una manera conocida de por sí, para proporcionar el nanocuerpo deseado. Otros procedimientos y técnicas adecuados para obtener nanocuerpos y/o ácidos nucleicos que codifican los mismos, partiendo de secuencias de VH naturales o preferentemente secuencias de VHH, serán evidentes para el experto, y, por ejemplo, pueden comprender combinar una o más partes de una o más secuencias de VH naturales (tales como una o más secuencias de FR y/o secuencias de CDR), una o más partes de una o más secuencias de VHH naturales (tales como una o más secuencias de FR o secuencias de CDR), y/o una o más secuencias sintéticas o semisintéticas, de una manera adecuada, para proporcionar un nanocuerpo o una secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos que codifique la misma.
También está en el alcance de la invención usar análogos, mutantes, variantes, alelos, homólogos y ortólogos naturales o sintéticos (denominados colectivamente en el presente documento "análogos") de los nanocuerpos, y, en particular, análogos de los nanocuerpos de las SEQ ID NO: 1-29 (véase la tabla 1, fig. 12). Generalmente, en dichos análogos, uno o más residuos de aminoácidos pueden haber sido reemplazados, eliminados y/o añadidos, en comparación con los nanocuerpos como se define en el presente documento. Se pueden hacer dichas sustituciones, inserciones, deleciones o adiciones en una o más de las regiones estructurales y/o en una o más de las CDR, y, en particular, análogos de las CDR de los nanocuerpos de las SEQ ID NO: 1-29, correspondiéndose dicha CDR con las SEQ ID NO: 30-70 (véase la tabla 2, fig. 12). Los análogos, como se usa en el presente documento, son secuencias en las que cada o cualquier región estructural y cada o cualquier región determinante de la complementariedad muestra al menos un 80 % de identidad, preferentemente al menos un 85 % de identidad, más preferentemente un 90 % de identidad, incluso más preferentemente un 95 % de identidad con la región correspondiente en la secuencia de referencia (es decir FR1_análogo frente a FR1_referencia, CDR1_análogo frente a CDR1_referencia, FR2_análogo frente a FR2_referencia, CDR2_análogo frente a CDR2_referencia, FR3_análogo frente a FR3_referencia, CDR3_análogo frente a CDR3_referencia, FR4_análogo frente a FR4_referencia) medida en una alineación de BLASTp (Altschul et al; 1987; FR and CDR definitions according to IMGT unique numbering system for V-domains and V-like domains (Lefranc et al. 2003)).
Por medio de ejemplos no limitantes, una sustitución puede ser, por ejemplo, una sustitución conservadora (como se describe en el presente documento) y/o un residuo de aminoácido se puede reemplazar por otro residuo de aminoácido que se produce de manera natural en la misma posición en otro dominio VHH. De esta manera, se incluyen en el alcance de la invención una cualquiera o más de sustituciones, deleciones o inserciones, o cualquier combinación de las mismas, que mejoren las propiedades del nanocuerpo o bien que al menos no se alejen demasiado de las propiedades deseadas o del equilibrio o combinación de las propiedades deseadas del nanocuerpo (es decir, en la medida en que el nanocuerpo ya no es adecuado para su uso previsto). Un experto en la técnica podrá generalmente determinar y seleccionar sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones adecuadas, o combinaciones adecuadas de las mismas, basándose en la divulgación en el presente documento y, opcionalmente, después de un grado limitado de experimentación rutinaria, que, por ejemplo, puede implicar introducir un número limitado de posibles sustituciones y determinar su influencia sobre las propiedades de los nanocuerpos obtenidos de esta manera.
Por ejemplo, y dependiendo del organismo huésped usado para expresar el dominio de unión a proteína descrito en el presente documento, preferentemente dichas deleciones y/o sustituciones en el nanocuerpo se pueden diseñar de tal manera que se elimine uno o más sitios para la modificación postraduccional (tal como uno o más sitios de glucosilación), como está en la capacidad del experto en la técnica. De forma alternativa, se pueden diseñar las sustituciones o inserciones para introducir uno o más sitios para la unión de grupos funcionales (como se describe en el presente documento), por ejemplo, para permitir la pegilación específica de sitio.
Los ejemplos de modificaciones, así como los ejemplos de residuos de aminoácidos en la secuencia de dominio de unión a proteína, preferentemente la secuencia de nanocuerpo, que se pueden modificar (es decir, bien en la cadena principal de proteína, pero preferentemente en una cadena lateral), procedimientos y técnicas que se pueden usar para introducir dichas modificaciones y las ventajas y usos potenciales de dichas modificaciones serán evidentes para el experto. Por ejemplo, dicha modificación puede implicar la introducción (por ejemplo, mediante unión covalente o de otra manera adecuada) de uno o más grupos funcionales, residuos o restos en o sobre el nanocuerpo, y en particular de uno o más grupos funcionales, residuos o restos que confieren una o más propiedades o funcionalidades deseadas a los nanocuerpos. Los ejemplos de dichos grupos funcionales y de técnicas para introducirlos serán evidentes para el experto en la técnica y pueden comprender generalmente todos los grupos funcionales y técnicas mencionados en la técnica anterior general citada anteriormente en el presente documento, así como los grupos funcionales y técnicas conocidos de por sí para la modificación de proteínas farmacéuticas, y, en particular, para la modificación de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (incluyendo ScFv y
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anticuerpos de dominio único), para los que se hace referencia, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16.º ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980). Dichos grupos funcionales, por ejemplo, se pueden unir directamente (por ejemplo, covalentemente) a un nanocuerpo u opcionalmente por medio de un enlazador o espaciador adecuado, como será evidente de nuevo para el experto en la técnica. Una de las técnicas más ampliamente usados para incrementar la semivida y/o reducir la inmunogenia de proteínas farmacéuticas comprende la unión de un polímero farmacológicamente aceptable adecuado, tal como poli(etilenglicol) (PEG) o derivados del mismo (tales como metoxipoli(etilenglicol) o mPEG). Generalmente, se puede usar cualquier forma adecuada de pegilación, tal como la pegilación usada en la técnica de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (incluyendo, pero no limitados a anticuerpos de dominio (único) y ScFv); se hace referencia a, por ejemplo, Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); por Veronese y Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003), por Harris y Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003) y en el documento WO04060965. También están disponibles comercialmente diversos reactivos para la pegilación de proteínas, por ejemplo, de Nektar Therapeutics, EE. UU. Preferentemente, se usa pegilación dirigida a sitio, en particular por medio de un residuo de cisteína (véase, por ejemplo, Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003). Por ejemplo, para este propósito, se puede unir PEG a un residuo de cisteína que se produce de manera natural en un nanocuerpo, se puede modificar un nanocuerpo para introducir adecuadamente uno o más residuos de cisteína para la unión de PEG, o se puede fusionar una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más residuos de cisteína para la unión de PEG a los extremos N y/o C de un nanocuerpo, todo usando técnicas de ingeniería de proteínas conocidas de por sí por el experto. Preferentemente, para los nanocuerpos y proteínas usados en los procedimientos descritos en el presente documento, se usa un PEG con un peso molecular de más de 5000, tal como más de 10.000 y menos de 200.000, tal como menos de 100.000; por ejemplo, en el intervalo de 20.000-80.000. Otra modificación normalmente menos preferente comprende glucosilación por enlace N o por enlace O, normalmente como parte de la modificación cotraduccional y/o postraduccional, dependiendo de la célula huésped usada para expresar el nanocuerpos o polipéptido. Otra técnica para incrementar la semivida de un nanocuerpo puede comprender la genotecnología en nanocuerpos bifuncionales (por ejemplo, uno nanocuerpos frente al GPCR diana y uno frente a una proteína sérica, tal como albúmina) o en fusiones de nanocuerpos con péptidos (por ejemplo, un péptido frente a una proteína sérica, tal como albúmina).
Aún otra modificación puede comprender la introducción de uno o más marcadores detectables u otros restos o grupos generadores de señales, dependiendo del uso previsto del dominio de unión a proteína marcado, en particular, el nanocuerpo. Los marcadores adecuados y técnicas para su unión, uso y detección serán evidentes para el experto, y, por ejemplo, incluyen, pero no están limitados a, marcadores fluorescentes (tales como fluoresceína, isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina y metales fluorescentes, tales como Eu u otros metales de la serie de los lantánidos), marcadores fosforescentes, marcadores quimioluminiscentes o marcadores bioluminiscentes (tales como luminal, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sales de acridinio, éster de oxalato, dioxetano o GFP y su análogos), radioisótopos, metales, quelatos de metales o cationes de metales u otros metales o cationes metálicos que son particularmente adecuados para su uso en el diagnóstico in vivo, in vitro o in situ y la formación de imágenes, así como cromóforos y enzimas (tales como malato deshidrogenasa, nucleasa estafilocócica, delta-V-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfa-glicero-fosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, biotina-vidin-peroxidasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-VIfosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa). Otros marcadores adecuados serán evidentes para el experto, y, por ejemplo, incluyen restos que se pueden detectar usando RMN o espectroscopia ESR. Dichos polipéptidos y nanocuerpos marcados, se pueden usar, por ejemplo, para ensayos in vitro, in vivo o in situ (incluyendo inmunoensayos conocidos de por sí, tales como ELISA, RIA, EIA y otros "ensayos sándwich", etc.), así como en propósitos de formación de imágenes y diagnóstico in vivo, dependiendo de la elección del marcador específico. Como será evidente para el experto, otra modificación puede implicar la introducción de un grupo quelante, por ejemplo, para quelar uno de los metales o cationes metálicos a los que se hace referencia anteriormente. Los grupos quelantes adecuados incluyen, por ejemplo, sin limitación, ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Aún otra modificación puede comprender la introducción de un grupo funcional que sea una parte de un par de unión específico, tal como el par de unión biotina (estrept)avidina. Se puede usar dicho grupo funcional para enlazar el nanocuerpo a otra proteína, polipéptido o compuesto químico que esté unido a la otra mitad del par de unión, es decir, a través de la formación del par de unión. Por ejemplo, se puede conjugar un nanocuerpo con biotina y enlazar a otra proteína, polipéptido, compuesto o vehículo conjugado a avidina o estreptavidina. Por ejemplo, se puede usar dicho nanocuerpo conjugado como un indicador, por ejemplo, en un sistema de diagnóstico donde se conjuga un agente que produce señales detectables con avidina o estreptavidina. Por ejemplo, también se pueden usar dichos pares de unión para unir el nanocuerpo a un vehículo, incluyendo vehículos adecuados para propósitos farmacéuticos. Un ejemplo no limitante son las formulaciones liposomales descritas por Cao y Suresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257 (2000). También se pueden usar dichos pares de unión para enlazar un agente terapéuticamente activo al nanocuerpo descrito en el presente documento.
En un modo de realización particular, el nanocuerpo usado en los procedimientos descritos en el presente documento es bivalente y se forma uniendo, químicamente o mediante técnicas de ADN recombinante, entre sí dos dominios únicos monovalentes de las cadenas pesadas. En otro modo de realización particular, el nanocuerpo es biespecífico y se forma uniendo entre sí dos dominios variables de las cadenas pesadas, cada uno con una
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efecto no se observó en β2AR unido al agonista inverso ICI-118.551. El efecto de Nb80 se incrementó en presencia de 10 µM de isoproterenol. Estos resultados muestran que Nb80 no reconoce la conformación inactiva del β2AR, pero se une eficazmente al β2AR ocupado por agonista y produce un cambio en la fluorescencia con bimano que es indistinguible de la observada en presencia de Gs e isoprotererenol.
Las figuras 6D y 6E muestran el efecto de Gs y Nb80 en la afinidad del agonista por β2AR. Se reconstituyó β2AR en partículas de HDL y se realizaron experimentos de unión por competición al agonista en ausencia o presencia de Nb80 y Gs. En ausencia de cualquiera de las proteínas, isoproterenol tiene una constante de inhibición (Ki) de 107 nM. En presencia de Gs se observan dos estados de afinidad, porque no todo el β2AR se acopla a Gs. En el estado acoplado a Gs, la afinidad de isoproterenol se incrementa en 100 veces (Ki = 1,07 nM) (fig 6D y tabla 4). De manera similar, en presencia de Nb80 la afinidad de isoproterenol se incrementa en 95 veces (Ki = 1,13 nM) (fig. 6E y tabla 4). Estos datos de unión sugieren que Nb80 estabiliza una conformación en el β2AR WT que es muy similar a la estabilizada por Gs, de tal manera que el acoplamiento energético del agonista y unión a Gs se imita fielmente por Nb80.
Se obtuvo el análisis estructural de alta resolución del estado inactivo del β2AR con una proteína de fusión β2AR-T4L. Se mostró previamente que β2AR-T4L tiene una afinidad más alta por isoproterenol que β2AR WT (Rosenbaum et al. 2007). Sin embargo, en presencia de Nb80 la afinidad se incrementó 60 veces, lo que da como resultado una afinidad (Ki = 0,56 nM) comparable a la de β2AR WT unido a Nb80 (fig 6F y tabla 4). Aunque no se puede estudiar el acoplamiento de la proteína G en β2AR-T4L debido al impedimento estérico por T4L, los resultados muestran que T4L no previenen la unión de Nb80, y los valores de Ki prácticamente idénticos por la unión al agonista a β2AR natural y β2AR-T4L en presencia de Nb80 sugieren que Nb80 estabiliza una conformación similar en estas dos proteínas.
Ejemplo 9. Los nanocuerpos facilitan la cristalización de β2AR unido a agonista.
El β2AR se cristalizó originalmente unido al agonista inverso carazolol usando dos enfoques diferentes. Los primeros cristales se obtuvieron a partir de β2AR unido a un fragmento Fab que reconoce un epítopo compuesto de los extremos carboxílico y amínico del tercer bucle intracelular que conecta las TM 5 y 6 (Rasmussen et al. 2007). En el segundo enfoque, el tercer bucle intracelular se reemplazó por lisozima T4 β2AR-T4L) (Rosenbaum et al. 2007). Los esfuerzos para cristalizar el complejo β2AR-Fab y β2AR-T4L unidos a diferentes agonistas no produjeron cristales de calidad suficiente para la determinación estructural.
Por lo tanto, se intentó cristalizar β2AR-T4L y β2AR unido a agonista en el complejo con Nb80. Aunque se obtuvieron cristales de ambos complejos en bicelas lipídicas y fase cúbica lipídica (LCP), se obtuvo difracción de alta resolución a partir de cristales de β2AR-T4L-Nb80 que se hicieron crecer en LCP. Estos cristales se hicieron crecer a pH 8,0 en PEG400 al 39-44 %, Tris 100 mM, DMSO al 4 % y 1,2,3-heptanotriol al 1 %.
Ejemplo 10. Nb80 contribuye al empaquetamiento de β2AR en una red cristalina.
Se obtuvo difracción de alta resolución a partir de cristales de β2AR-T4L-Nb80 que se hicieron crecer en LCP. Estos cristales se hicieron crecer a pH 8,0 en PEG400 al 39-44 %, Tris 100 mM, DMSO al 4 % y 1,2,3-heptanotriol al 1 %.
Se obtuvo un conjunto de datos combinados establecidos a 3,5 Å a partir de 23 cristales (tabla 5). La estructura se resolvió mediante reemplazo molecular usando la estructura de β2AR unido a carazolol y un nanocuerpo como modelos de búsqueda. La figura 7 muestra el empaquetamiento del complejo β2AR-T4L-Nb80 en la red cristalina. Nb80 se une al extremo citoplásmico del β2AR, con el bucle de la tercera región determinante de la complementariedad (CDR) que se proyecta hacia el núcleo del receptor. Los complejos β2AR-nanocuerpo se disponen con las bicapas lipídicas aproximadamente paralelas al plano bc del cristal. Dos moléculas de nanocuerpo relacionadas con simetría interaccionan dos veces a lo largo del eje a para generar una red estrechamente empaquetada en esta dirección. En la bicapa, las moléculas de receptor interaccionan en una disposición antiparalela con TM1,2,3 y 4 de una molécula de β2AR que se empaqueta frente a TM4 y 5 de la molécula adyacente. También se realizan contactos entre la hélice 8 y TM5 del vecino de la red paralelo a lo largo del eje b, y entre la porción extracelular de TM1 y el extremo citoplásmico de TM6 de un tercer vecino antiparalelo. El empaquetamiento es más débil a lo largo del eje c, que se puede deber en parte a las interacciones no específicas del T4L con moléculas de receptor y/o nanocuerpo vecinas. No existe densidad de electrones interpretable para el T4L, pero dados los extremos visibles de TM5 y TM6, la posición de T4L está altamente limitada. Presumiblemente T4L adopta un número de orientaciones con respecto al receptor, y tal vez una gama de conformaciones internas debido a su movimiento de bisagra (Zhang et al. 1995), que promedia su densidad. No obstante, T4L probablemente contribuye a la estructura del cristal puesto que no se han podido producir cristales del complejo β2AR-nanocuerpo natural en estas condiciones, aunque es posible que el bucle flexible que conecta TM5 y TM6 en el receptor natural prevenga la formación de la red.
Ejemplo 11. Estructura de un estado activo estabilizado con nanocuerpo de β2AR.
La figura 8 compara la estructura de β2AR inactiva (de la estructura β2AR-T4L unida a carazolol) con el estado activo de β2AR. Las mayores diferencias se encuentran en la cara citoplásmica del receptor, con el desplazamiento hacia el exterior de TM5 y TM6 y un movimiento hacia el interior de TM7 y TM3 en el complejo β2AR-T4L-Nb80
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NB69 26
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NB84 29
Tabla 2. CDR de nanocuerpos específicos de β2AR
Número de referencia de nanocuerpo
Abreviatura de nanocuerpo CDR1 CDR2 CDR3
CA2764
NB64 GSIFSINT (SEQ ID NO 30) IHSGGST (SEQ ID NO 43) NVKDYGAVLYEYDY(SEQ ID NO 57)
CA3431
NB31 GSIFSINT (SEQ ID NO 30) IHSGGST (SEQ ID NO 43) NVKDYGAVLYEYDY (SEQ ID NO 57)
CA3413
NB13 GSIFSINT (SEQ ID NO 30) IHSGGST (SEQ ID NO 43) NVKDYGAVLYEYDY (SEQ ID NO 57)
CA2780
NB80 GSIFSINT (SEQ ID NO 30) IHSGGST (SEQ ID NO 43) NVKDYGAVLYEYDY (SEQ ID NO 57)
CA2765
NB65 GSIFSINT (SEQ ID NO 30) IHSGGST (SEQ ID NO 43) NVKDYGAVLYEYDY (SEQ ID NO 57)
CA2761
NB61 GSIFSLND (SEQ ID NO 31) ITSGGST (SEQ ID NO 44) NAVVAGTFSTYDY (SEQID NO 58)
CA3475
NB75 GSIFSLND (SEQ ID NO 31) ITSGGST (SEQ ID NO 44) NAVVAGTFSTYDY (SEQID NO 58)
CA2770
NB70 GSIFSLND (SEQ ID NO 31) ISSGGRL (SEQ ID NO 45) NAVVAGTFSTYDY (SEQID NO 58)
CA3472
NB72 GSIFSLND (SEQ ID NO 31) ISSGGRL (SEQ ID NO 45) NAVVAGTFSTYDY (SEQID NO 58)
CA3420
NB20 GSIFSLND (SEQ ID NO 31) ITSGGST (SEQ ID NO 44) NAKVAGTFSIYDY (SEQ ID NO 59)
CA3433
NB33 GSIFSLND (SEQ ID NO 31) VTSGGST (SEQ ID NO 46) NAKVAGTFSIYDY (SEQ ID NO 59)
CA3434
NB34 GSIFSLND (SEQ ID NO 31) ITSGGST (SEQ ID NO 44) NAKVAGTFSIYDY (SEQ ID NO 59)
CA3484
NB84 GSIFSLND (SEQ ID NO 31) ITSGGST (SEQ ID NO 44) NAKVAGTFSIYDY (SEQ ID NO 59)
CA2760
NB60 GSIFSLND (SEQ ID NO 31) ITSGGST (SEQ ID NO 44) NAKVAGTFSIYDY (SEQ ID NO 59)
CA2773
NB73 GSIFSLND (SEQ ID NO 31) ITSGRST (SEQ ID NO 47) NAKVAGTFSIYDY (SEQ ID NO 59)
CA3477
NB77 GSIFSLND (SEQ ID NO 31) ITSGGST (SEQ ID NO 44) NAKVAGTFSIYDY (SEQ ID NO 59)
CA2774
NB74 GSIFSIND (SEQ ID NO 32) ITSGGSV (SEQ ID NO 48) NAKVAGTFSIYDY (SEQ ID NO 59)
CA2768
NB68 GTIFSNNA (SEQ ID NO 33) ITSGGST (SEQ ID NO 44) NAKVPGTFSIYDY (SEQ ID NO 60)
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CA3424
NB24 GSVFSLPT(SEQ ID NO 34) ITGSGST (SEQ ID NO 49) YYRSTFTEY (SEQ ID NO 61)
CA2767
NB67 GTISSFIA (SEQ ID NO 35) ITSGGET (SEQ ID NO 50) NAQVFADIFNLINY (SEQ ID NO 62)
CA2786
NB86 GTIFSPNT (SEQ ID NO 36) ITSGGSR (SEQ ID NO 51) NYQTVFFGNAEA (SEQ ID NO 63)
CA3422
NB22 GSIFSINA (SEQ ID NO 37) STSGDIT (SEQ ID NO 52) NARGIYSDYAFADFNS (SEQ ID NO 64)
CA2763
NB63 GSRFSFIT (SEQ ID NO 38) LSGDNT (SEQ ID NO 53) RGTSVLYDV (SEQ ID NO 65)
CA2772
NB72 GFTFSGYA(SEQ ID NO 39) INSGGGST (SEQ ID NO 54) HARDIYSDFLGQYEYDY (SEQ ID NO 66)
CA2771
NB71 GFAFSSYE(SEQ ID NO 40) ITTGGNT (SEQ ID NO 55) NANWDLLSDY (SEQ ID NO 67)
CA2769
NB69 GSIFSINA (SEQ ID NO 37) ITSGGST (SEQ ID NO 44) NVQGTGPSSWLFNEYDY (SEQ ID NO 68)
CA2782
NB82 GSIFSINS (SEQ ID NO 41) ITSDGST (SEQ ID NO 56) NADSVYSDFLGKYEYDY (SEQ ID NO 69)
CA2783
NB83 GSIFSLNA (SEQ ID NO 42) ITSDGST (SEQ ID NO 56) NADSVYSDFLGKYEYDY (SEQ ID NO 69)
CA2784
NB84 GSIFSINA (SEQ ID NO 37) ITSGGST (SEQ ID NO 44) HVRDIYSDFLGQYEYDY (SEQ ID NO 70)
Tabla 3 Propiedades de unión al agonista completo de membranas que expresan β2AR en presencia y ausencia de nanocuerpos.
Se realizó una unión por competición de [3H]-DHA en membranas de células de insecto Sf9 que expresan β2AR, en
5 presencia o ausencia de nanocuerpos 1 µM. Los datos representan la media ± EE de dos experimentos independientes realizados por triplicado. Los valores de CI50 usados para los cálculos de los valores de Ki se obtuvieron de las medias de los valores de pIC50 determinados por análisis de regresión no lineal usando Prism (GraphPad Software, San Diego, CA) y el intervalo EE de pCI50 ± EE
Ki isoproterenol [intervalo EE] (nm)
β2AR 295 [211-412]
+
NB65 13,8 [6,98 -27,3]
+
NB67 19,4 [11,3 -33,1]
+
NB69 53,5 [34,3 -83,1]
+
NB71 10,6 [3,68 -30,4]
+
NB72 145 [93,3 -226]
+
NB80 10,0 [4,74 -21,0]
+
NB84 75,4 [35,9 -158]
Tabla 4 Caracterización farmacológica de β2AR reconstituido en partículas de HDL en complejo con Gs y Nb80
Unión de saturación [3H]-DHA
Unión de competición [3H]-DHA/(-)-isoproterenol
Kd ± E.E. nM
Estado de baja afinidad Ki[intervalo E.E.] nM Estado de alta afinidad Ki[intervalo E.E.] nM
β2AR
0,55 ± 0,09 (n=3) 107,5 [103,8 -111,3] (n=3)
β2AR + Gs
95,3 [82,8 -109,7] 1,07 [0,96-1,19] (n=4)
β2AR + Gs + GTPγS
95,2 [92,2 -98,3] (n=3)
β2AR + NB80
1,13 [1,09 -1,18] (n=3)
β2AR-T4L
0,42 ± 0,01 (n=3) 33,5 [31,6-35,5] (n=3)
β2AR-T4L + NB80
0,56 [0,54 -0,57] (n=4)
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