JP2022531246A - 免疫センサー - Google Patents

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Abstract

本発明は、試料中の分析物を検出するための方法に関する。方法は、試料中の分析物の量を決定するためにも使用することができる。本発明はまた、これらの方法に使用するための抗体または抗体様分子及び標識された抗原にも関する。【選択図】図６

Description

本発明は、試料中の分析物を検出するための方法に関する。方法は、試料中の分析物の量を決定するためにも使用することができる。本発明はまた、これらの方法に使用するための抗体または抗体様分子及び標識された抗原にも関する。
分析物を検出するための方法は、食品、環境及び医療業界を含む多くの産業で極めて重要である。例えば、病的な状態を早期検出することで、治療が成功する可能性がより高い段階で、これらの状態を特定することが可能となる。加えて、微量の食品タンパク質の検出により、汚染された食品に対する重篤なアレルギー反応を防ぐことができる。現在、試料中の分析物を検出するための方法は、多くの方法が利用可能である。例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラテラルフローイムノアッセイ及びウェスタンブロットイムノアッセイが広く使用されている。これらのアッセイは全て不均一系アッセイフォーマットを使用して実施されており、抗体または抗原を固体表面上に固定する必要がある。これらのアッセイは、複数の洗浄サイクル及び／またはインキュベーション／洗浄ステップを必要とするため、時間や手間がかかり、オペレーターのミスが発生しやすい。
試料中の分析物を検出するために、バイオセンサーが開発されている。バイオセンサー及び生物学的アッセイは、幅広い分子に迅速かつ特異的に反応することができるため、臨床診断／モニタリング、環境及び食品の安全性、防衛及びバイオセキュリティの用途に極めて適している。バイオセンサーは、分析物の検出のために生物学的な認識要素を必要とし、ペプチド、酵素、受容体、核酸及び抗体を含み得る（Ｂｈａｌｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。しかしながら、特定の分析物を低濃度で検出するのに必要とされる感度及び選択性を備えた生物学的な認識要素を特定することは、バイオセンサーの開発の根本的な課題として残っている。したがって、試料中の分析物の量を検出及び定量する改善された方法、好ましくは、リアルタイムで実施でき、複数の分析物に適用でき、及び／または分析のために試料を外部に送る必要のない方法が必要とされている。
本発明者らは、試料中の分析物を検出するために使用することができる免疫センサーを特定した。本発明者らは、更に、これらの免疫センサーを使用して、試料中の分析物の存在を検出する方法も明らかにした。いくつかの実施形態において、これらの免疫センサー及び方法は、試料中の分析物の濃度を測定するために使用することができる。
一態様において、試料中の分析物を検出するための方法であって、
ｉ）試料を、
化学発光共鳴エネルギー転移（ＣＲＥＴ）ペアの第１の構成成分に結合している、分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子、及び
ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原と接触させることであって、
標識された抗原が抗体または抗体様分子に結合した場合、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が１０～７５％の範囲内である、接触させることと、
ｉｉ）ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が試料の存在下で変化したかどうかを決定することであって、
ＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率の低下は、分析物が試料中に存在することを示す、決定することと、を含む、方法が提供される。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｉ）は、試料を基質と接触させることを更に含む。
いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分はポリペプチドであり、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分はポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分はＢＲＥＴドナードメインを含み、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分はＢＲＥＴアクセプタードメインを含む。代替的な実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分はＢＲＥＴアクセプタードメインを含み、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分はＢＲＥＴドナードメインを含む。
いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子は、リンカーを介して、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している。好適なリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖、炭化水素鎖、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、リンカーはＰＥＧ8～ＰＥＧ60を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＰＥＧn－Ｌ－ＰＥＧmを含み、式中、ｍ及びｎは独立して０～４０の整数であり、Ｌはコンジュゲーション要素である。
いくつかの実施形態において、第１の構成成分から第２の構成成分へのエネルギー転移の効率は、標識された抗原が抗体または抗体様分子に結合した場合、１５～６５％の範囲内である。
いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子とＣＲＥＴペアの第１の構成成分との間の結合は、部位特異的である。いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分は、抗体または抗体様分子の抗原結合部位に結合していない。
いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分は、抗体または抗体様分子の残基の側鎖に結合している。いくつかの実施形態において、残基は、システインである。いくつかの実施形態において、残基は、鎖間ジスルフィド結合に関与するシステインである。いくつかの実施形態において、残基は、抗体または抗体様分子のヒンジ領域内のシステインであるか、あるいは、残基は、重鎖－軽鎖ジスルフィド結合に関与するシステインであるか、あるいは、両方の組み合わせである。
いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分は、炭水化物部分を介して、抗体または抗体様分子に結合している。
いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子は、２つの結合しているＣＲＥＴペアの第１の構成成分を有し、それらは同じである。
いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、モノクローナル抗体、Ｆａｂ’、ｒＩｇＧ（半抗体）、ｆ（ａｂ’）2、ナノボディ、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、モノボディ、アビマー、マイクロボディ、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖマルチマー、単一ドメイン抗体または単一ドメイン融合抗体である。いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子は、ＩｇＧ、Ｆａｂ’、ｒＩｇＧ（半抗体）またはｆ（ａｂ’）2である。いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子は、ＩｇＧである。いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子は、ナノボディである。
いくつかの実施形態において、分析物は、有機低分子、薬物、薬物代謝物、抗生物質、ホルモン、アレルゲン、天然に存在する毒素、不純物、微生物、ペプチド、タンパク質、天然に存在する抗体、グアル、脂質または核酸である。いくつかの実施形態において、分析物は、アレルゲンである。いくつかの実施形態において、分析物は、抗生物質である。いくつかの実施形態において、分析物は、抗菌性物質である。いくつかの実施形態において、分析物は、抗真菌性物質である。いくつかの実施形態において、分析物は、天然に存在する毒素である。いくつかの実施形態において、分析物は、不純物である。いくつかの実施形態において、分析物は、微生物である。いくつかの実施形態において、分析物は、有機低分子である。
いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１または第２の構成成分は、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－グルクロニダーゼまたはβ－グルコシダーゼからなる群から選択される生物発光タンパク質である。いくつかの実施形態において、生物発光タンパク質は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｔｅルシフェラーゼ、北アメリカグローワームルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、鉄道虫ルシフェラーゼ、バクテリアルシフェラーゼ、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、イクオリン、Ａｒａｃｈｎｏｃａｍｐａルシフェラーゼ、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓルシフェラーゼ、またはこれらのいずれか１つの生物学的に活性なバリアントもしくは断片、またはこれらの２つ以上のキメラからなる群から選択されるルシフェラーゼである。いくつかの実施形態において、生物発光タンパク質は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼまたはその生物学的に活性なバリアントもしくは断片である。いくつかの実施形態において、生物発光タンパク質は、ＲＬｕｃ８である。
いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１または第２の構成成分は、基質を修飾することが可能である。好適な基質には、ルシフェリン、カルシウム、セレンテラジン、フリマジン、またはセレンテラジン、ルシフェリンもしくはフリマジンの誘導体、類似体もしくは安定化された誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１または第２の構成成分は、蛍光アクセプタードメインである。いくつかの実施形態において、蛍光アクセプタードメインは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの青色蛍光バリアント（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光バリアント（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光バリアント（ＹＦＰ）、改良されたＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、スーパーファルダーＧＦＰ、Ａｚａｍｉ ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、ＴａｇＧＦＰ、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、改良されたＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、ＣｙＰＥＴ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ－Ｉｓｈｉ ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１（Ｔｅａｌ）、改良されたＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＯｒａｎｇｅ、Ｔｏｐａｚ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＴａｇＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ｄＫｅｉｍａ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｔ－ＨｃＲｅｄ、ＡＱ１４３、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ｔ－ダイマー２、ｔダイマー２（１２）、ｍＲＦＰ１、ｍＴａｎｇａｒｉｎｅ、ポシロポリン、Ｒｅｎｉｌｌａ ＧＦＰ、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ ＧＦＰ、Ｍｏｎｓｔｅｒ ＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅタンパク質、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲｕｂｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ＪＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ＴａｇＲＦＰ、ＴｕｒＢｏＦＰ、及びＲ－フィコエリトリン（Ｒ－ＰＥ）、Ｂ－フィコエリトリン（Ｂ－ＰＥ）、Ｃ－フィコシアニン（ＣＰＣ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）及びＲ－フィコシアニン（ＲＰＣ）を含むフィコビリタンパク質、ならびにこれらのいずれか１つの生物学的に活性なバリアントまたは断片からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、蛍光アクセプタードメインは、ＧＦＰまたはその生物学的に活性なバリアントもしくは断片である。いくつかの実施形態において、蛍光アクセプタードメインは、ＧＦＰ2である。
いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分はＲＬｕｃ８であり、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分はＧＦＰ2である。
いくつかの実施形態において、標識された抗原が抗体または抗体様分子に特異的に結合した場合、ドナードメイン及びアクセプタードメインの距離及び相対配向は、ＢＲＥＴペアのフェルスター距離の±５０％以内である。いくつかの実施形態において、ＢＲＥＴペアのフェルスター距離は、約４ｎｍ～約１８ｎｍであるか、または約６ｎｍ～約１２ｎｍであるか、または約７．５ｎｍ～１０．５ｎｍである。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｉｉ）は、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が試料の存在下で低下したかどうかを決定することを含む。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｉ）は、
（ａ）最初に、試料を抗体もしくは抗体様分子と接触させ、次いで、得られた混合物を標識された抗原と接触させること、
（ｂ）最初に、試料を標識された抗原と接触させ、次いで、得られた混合物を抗体もしくは抗体様分子と接触させること、または
（ｃ）試料を抗体もしくは抗体様分子及び標識された抗原と同時に接触させることを含む。
いくつかの実施形態において、方法は、二次抗体を必要としない。いくつかの実施形態において、方法は、試料中の分析物の濃度を決定することを更に含む。
別の態様において、ＣＲＥＴペアであって、
ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している、分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子と、
ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原と、を含み、
標識された抗原が抗体または抗体様分子に結合した場合、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が１０～７５％の範囲内である、ＣＲＥＴペアが提供される。
更に別の態様において、抗体または抗体様分子であって、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合しており、
ｉ）分析物、及び
ｉｉ）ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原に、結合することが可能であり、
標識された抗原が抗体または抗体様分子に結合した場合、第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が１０～７５％の範囲内である、抗体または抗体様分子が提供される。
更に別の態様において、試料中の分析物を検出するためのマイクロ流体システムであって、
ｉ）ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している、分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子を含むのに好適な少なくとも１つのリザーバーと、
ｉｉ）ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原を含むのに好適な少なくとも１つのリザーバーと、
ｉｉｉ）１つ以上のマイクロチャネルを含むマイクロ流体デバイスと、
ｉｖ）抗体または抗体様分子、標識された抗原、試料及びＣＲＥＴペアの第１または第２の構成成分の基質をデバイス内で混合するための手段と、
ｖ）抗体または抗体様分子に対する分析物の結合を検出するための反応チャンバーと、
ｖｉ）電気光学センシングデバイスと、を含み、
標識された抗原が抗体または抗体様分子に結合した場合、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が１０～７５％の範囲内であり、
ＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率の低下は、分析物が試料中に存在することを示す、システムが提供される。
いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子は、デバイスに固定されていない。いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子、標識された抗原及び基質は、異なるマイクロチャネルを通ってデバイスに入る。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、少なくとも２つの入力マイクロチャネルを備え、入力マイクロチャネルの１つは、抗体または抗体様分子をデバイスに流すためのものである。
いくつかの実施形態において、マイクロ流体システムは、リアルタイムで分析物を検出するために使用することができる。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、２つ以上の分析物の検出ができるように設計される。
いくつかの実施形態において、電気光学センシングデバイスは、少なくとも２つの異なる波長チャネルを備える。いくつかの実施形態において、電気光学センシングデバイスは、２つの異なる波長チャネルを同時にまたは迅速に連続して検出することが可能である。いくつかの実施形態において、電気光学センシングデバイスは、２つの異なる波長チャネルを１秒未満で検出することが可能である。
更に別の態様において、分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子を特定する方法であって、
ｉ）抗体または抗体様分子をＣＲＥＴペアの第１の構成成分に連結する異なるリンカーを有する２つ以上の抗体または抗体様分子を得ることと、
ｉｉ）２つ以上の抗体または抗体様分子を、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原と接触させることと、
ｉｉｉ）ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率を測定することと、
ｉｖ）標識された抗原に結合した場合、１０～７５％の範囲内であるＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率を有する、少なくとも１つの抗体または抗体様分子を選択することと、を含む、方法が提供される。
いくつかの実施形態において、ステップｉｖ）は、標識された抗原に結合した場合、２つ以上の抗体または抗体様分子のうち、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率がより高い抗体または抗体様分子を選択することを含む。
いくつかの実施形態において、選択された抗体または抗体様分子のＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率は、標識された抗原に結合した場合、５０～７５％の範囲内である。
いくつかの実施形態において、方法は、
ｖ）２つ以上の標識された抗原を得ることであって、それぞれの標識された抗原は、任意選択のリンカーを介してＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、選択された抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含み、２つ以上の標識された抗原は、（ｉ）異なるリンカー、及び／または（ｉｉ）異なる長さの抗原を含む、得ることと、
ｖｉ）２つ以上の標識された抗原を、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している、分析物に結合することが可能な選択された抗体または抗体様分子と接触させることと、
ｖｉｉ）ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率を測定することと、
ｖｉｉｉ）選択された抗体または抗体様分子に結合した場合、１０～７５％の範囲内であるＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率を有する、少なくとも１つの標識された抗原を選択することと、を更に含む。
更に別の態様において、標識された抗原を特定する方法であって、
ｉ）２つ以上の標識された抗原を得ることであって、それぞれの標識された抗原は、任意選択のリンカーを介してＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含み、２つ以上の標識された抗原は、（ｉ）異なるリンカー、及び／または（ｉｉ）異なる長さの抗原を含む、得ることと、
ｉｉ）２つ以上の標識された抗原を、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している、分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子と接触させることと、
ｉｉｉ）ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率を測定することと、
ｉｖ）抗体または抗体様分子に結合した場合、１０～７５％の範囲内であるＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率を有する、少なくとも１つの標識された抗原を選択することと、を含む、方法が提供される。
いくつかの実施形態において、ステップｉｖ）は、抗体または抗体様分子に結合した場合、２つ以上の標識された抗原のうち、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率がより高い標識された抗原を選択することを含む。
いくつかの実施形態において、選択された標識された抗原のＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率は、抗体または抗体様分子に結合した場合、５０～７５％の範囲内である。
いくつかの実施形態において、方法は、
ｖ）抗体または抗体様分子をＣＲＥＴペアの第１の構成成分に連結する異なるリンカーを有する２つ以上の抗体または抗体様分子を得ることと、
ｖｉ）２つ以上の抗体または抗体様分子を、選択された標識された抗原と接触させることと、
ｖｉｉ）ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率を測定することと、
ｖｉｉｉ）選択された標識された抗原に結合した場合、１０～７５％の範囲内であるＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率を有する、少なくとも１つの抗体または抗体様分子を選択することと、を更に含む。
更に別の態様において、ＣＲＥＴペアを特定する方法であって、
ｉ）抗体または抗体様分子をＣＲＥＴペアの第１の構成成分に連結する異なるリンカーを有する２つ以上の抗体または抗体様分子を得ることと、
ｉｉ）２つ以上の標識された抗原を得ることであって、それぞれの標識された抗原は、任意選択のリンカーを介してＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含み、２つ以上の標識された抗原は、（ｉ）異なるリンカー、及び／または（ｉｉ）異なる長さの抗原を含む、得ることと、
ｉｉｉ）２つ以上の抗体または抗体様分子を、２つ以上の標識された抗原と接触させることと、
ｉｖ）ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率を測定することと、
ｖ）少なくとも１つのＣＲＥＴペアを選択することであって、選択されたＣＲＥＴペアは、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している１つの抗体または抗体様分子及びＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している標識された抗原を含み、選択された抗体または抗体様分子が選択された標識された抗原に結合した場合、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率は、１０～７５％の範囲内である、選択することと、を含む、方法が提供される。
更に別の態様において、試料を分類する方法であって、ｉ）試料を、
ａ）ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している、分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子、及び
ｂ）ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原と接触させることであって、
標識された抗原が抗体または抗体様分子に結合した場合、第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が１０～７５％の範囲内であり、
１つ以上の分析物が抗体または抗体様分子に結合する場合、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が変化する、接触させることと、
ｉｉ）エネルギー転移の効率の変化に基づいて試料を分類することと、を含む、方法が提供される。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｉｉ）は、次の１つ以上または全て：
Ａ）電気光学センシングデバイスを使用して、ＣＲＥＴペアの第１または第２の構成成分による基質の修飾を検出すること、
Ｂ）電気光学センシングデバイスから少なくとも１つのシグナルを処理し、電気光学応答のパターンを１つ以上の目的の試料の１つ以上の所定の特徴と相関させること、
Ｃ）応答パターンの相関に基づいて試料を分類すること、を含む。
いくつかの実施形態において、試料を分類する方法であって、
ｉ）試料を、
ａ）ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している、分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子、
ｂ）ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原、
ｃ）ＣＲＥＴペアの第１または第２の構成成分の一方の基質と接触させることであって、
標識された抗原が抗体または抗体様分子に結合した場合、第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が１０～７５％の範囲内である、接触させることと、
ｉｉ）電気光学センシングデバイスを使用して、ＣＲＥＴペアの第１または第２の構成成分による基質の修飾を検出することと、
ｉｉｉ）電気光学センシングデバイスから少なくとも１つのシグナルを処理し、電気光学応答のパターンを１つ以上の目的の試料の１つ以上の所定の特徴と相関させることと、
ｉｖ）応答パターンの相関に基づいて試料を分類することであって、１つ以上の分析物が抗体または抗体様分子に結合する場合、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が変化する、分類することと、を含む、方法が提供される。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｉ）は、
Ａ）１つ以上のマイクロチャネルを備えるマイクロ流体デバイスに、
ａ）試料、
ｂ）抗体または抗体様分子、
ｃ）標識された抗原、及び
ｄ）ＣＲＥＴペアの第１または第２の構成成分の基質を流すことと、
Ｂ）抗体または抗体様分子、標識された抗原、試料及び基質をデバイス内で混合することと、を含む。
いくつかの実施形態において、方法は、２つ以上の異なる抗体様分子を含み、そのそれぞれは、異なる分析物または様々な分析物及び２つ以上の異なる標識された抗原に結合し、ステップｖ）は、分析物のそれぞれまたは様々な分析物の存在、非存在または濃度に基づいて試料を分類することを含む。
いくつかの実施形態において、方法は、リアルタイムで試料を分類するために使用することができる。
いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子は、デバイスに固定されていない。いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子及び基質は、異なるマイクロチャネルを通ってデバイスに入る。
更に別の態様において、試料を分類するためのマイクロ流体システムであって、
ｉ）ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している、分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子を含むのに好適な少なくとも１つのリザーバーと、
ｉｉ）ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原を含むのに好適な少なくとも１つのリザーバーと、
ｉｉｉ）１つ以上のマイクロチャネルを含むマイクロ流体デバイスと、
ｉｖ）抗体または抗体様分子、標識された抗原、試料及びＣＲＥＴペアの第１または第２の構成成分の基質をデバイス内で混合するための手段と、
ｖ）抗体または抗体様分子に対する分析物の結合を検出するための反応チャンバーと、
ｖｉ）電気光学センシングデバイスと、を含み、
標識された抗原が抗体または抗体様分子に結合した場合、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が１０～７５％の範囲内であり、
ＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率の低下は、分析物が試料中に存在することを示す、システムが提供される。
いくつかの実施形態において、マイクロ流体システムは、２つ以上の異なる抗体または抗体様分子を含み、そのそれぞれは、異なる分析物または様々な分析物及び２つ以上の異なる標識された抗原に結合する。いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子は、デバイスに固定されていない。いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子、標識された抗原及び基質は、異なるマイクロチャネルを通ってデバイスに入る。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、少なくとも２つの入力マイクロチャネルを備え、入力マイクロチャネルの１つは、抗体または抗体様分子をデバイスに流すためのものである。
いくつかの実施形態において、マイクロ流体システムは、リアルタイムで試料を分類するために使用することができる。
更に別の態様において、試料中の分析物を検出する方法であって、
ｉ）試料を、セレンテラジンの存在下で、
ａ）Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼまたはそのバリアントに結合している、分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子、及び
ｂ）緑色蛍光タンパク質２に結合している、抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原に接触させることと、
ｉｉ）生物発光タンパク質とアクセプター分子との間の生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）が変更されるかどうかを決定することであって、生物発光タンパク質とアクセプター分子との間のエネルギー転移の効率の低下は、分析物が試料中に存在することを示す、決定することと、を含む、方法が提供される。
本主題の発明者らは、本明細書に記載されるＣＲＥＴベースの方法が、これまでに記載されている方法に対して、感度の向上及び／またはアッセイ時間の短縮を含む、多数の利点を提供することを見出した。本明細書に記載される方法はまた、広範囲の分析物に適用することができる。
本明細書のいかなる実施形態も、特に明記されない限り、任意の他の実施形態に準用されるものとみなされる。
本発明は、本明細書に記載の具体的な実施形態により範囲を制限されることはなく、それらの実施形態は、例示のみを目的とする。本明細書に記載されるように、機能的に同等の製品、組成物及び方法は明らかに本発明の範囲内である。
本明細書全体を通じて、特に明記されない限り、または文脈から特に必要とされない限り、単一のステップ、物質の組成、ステップの群または物質の組成の群への言及は、これらのステップ、物質の組成、ステップの群、または物質の組成の群の１つ及び複数（すなわち、１つ以上）を包含すると解釈されるものとする。
本発明は、以下の非限定的な実施例を用いて、及び添付を参照して以下に記載される。
本明細書に定義される分析物を検出するための例示的な免疫センサーを示す。（Ａ）図示される実施形態において、抗体は生物発光タンパク質に結合しており、抗原は蛍光タンパク質に結合している。（Ｂ）図示される実施形態において、Ｆａｂ’は生物発光タンパク質に結合しており、抗原は蛍光タンパク質に結合している。いずれの実施形態においても、分析物（これらの実施形態では、標識されていない抗原）が抗体に結合すると、生物発光タンパク質に対する基質の存在下で、生物発光タンパク質と蛍光タンパク質との間のエネルギー転移の効率が低下する。 例示された免疫センサーのＢＲＥＴ比に対するＦＬＡＧペプチドの影響を示す。ＦＬＡＧ－ＧＦＰ2（６１ｎＭ）単独とのインキュベート（濃い灰色のバー）または０．８５ｍＭの遊離ＦＬＡＧペプチド（薄い灰色のバー）の存在でのコンジュゲートされていないＲＬｕｃ８、及びＲＬｕｃ８コンジュゲートのＢＲＥＴ比を決定した。アッセイにおけるＲＬｕｃ８の濃度は５ｎＭであり、Ｆａｂ’－ＣＬＩＣＫ－ＲＬｕｃ８の濃度は３３ｎＭ、Ｆａｂ’－Ｓｏｌｕｌｉｎｋ－ＲＬｕｃ８は４６ｎＭ、抗体－ＣＬＩＣＫ－ＲＬｕｃ８は６６ｎＭ、抗体－Ｓｏｌｕｌｉｎｋ－ＲＬｕｃ８は１５ｎＭと推定された。 ＦＬＡＧペプチド添加への反応に対するＦＬＡＧペプチドの添加順序の影響を示す。抗体－ＣＬＩＣＫ－ＲＬｕｃ８コンジュゲートを含む組成物に、ＦＬＡＧ－ＧＦＰ2の前、後、または同時に、ＦＬＡＧペプチドを加え、ＢＲＥＴ比を記録した。抗体－ＣＬＩＣＫ－ＲＬｕｃ８（ｍＡＢ４／８ＲＬｕｃ８）の濃度は５ｎＭ、ＦＬＡＧ－ＧＦＰ2は１５０ｎＭ、ＦＬＡＧペプチドは１００ｎＭであった。 Ａは、Ｃｌｉｃｋ－ＰＥＧ－連結の５０ｎＭの抗体：ＲＬｕｃ８コンジュゲート単独（白色のバー）または１００ｎＭのＦＬＡＧ－ＧＦＰ2（薄い灰色のバー）、２００ｎＭのＦＬＡＧ－ＧＦＰ2（濃い灰色のバー）または２００ｎＭのＦＬＡＧ－ＧＦＰ2及び１μＭのＦＬＡＧ（黒色のバー）の存在下で得られたＢＲＥＴ比を示す。コンジュゲートを調製するために使用したＰＥＧリンカーは、その名称で示されており、例えば、ｍＡｂ－４／８－Ｌｕｃは、抗体－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯとアジド－ＰＥＧ８－ＲＬｕｃ８のコンジュゲートを指す。Ｂは、５０ｎＭのＦａｂ’：ＲＬｕｃ８コンジュゲート単独（薄い灰色のバー）または２００ｎＭのＦＬＡＧ－ＧＦＰ2（中間の灰色のバー）または２００ｎＭのＦＬＡＧ－ＧＦＰ2及び１μＭのＦＬＡＧペプチド（濃い灰色のバー）のＢＲＥＴ比を示す。 ＦＬＡＧペプチドの濃度（０．０００４８８～２５６μＭ）に対してプロットした、ＦＬＡＧ－ＧＦＰ2（２００ｎＭ）及び遊離ＦＬＡＧペプチドとの抗体－１２／３６－ＲＬｕｃ８コンジュゲート（５０ｎＭ）のＢＲＥＴ比を示す。ＢＲＥＴ比は、Ｆｌｕｏｒｏｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａにより記録した。 ５分のインキュベーションで１０ｎＭのＦＬＡＧ－ＧＦＰ2及び５ｎＭのｍＡｂ－２４／３６－ＲＬｕｃ８を用いた、ＦＬＡＧペプチド（平均±ＳＤ、ｎ＝３）のキャリブレーションを示す。ＢＲＥＴ比は、Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒにより記録した。 免疫センサーに結合する低分子を検出するための競合アッセイの模式図を示す。図示される実施形態において、ナノボディは、生物発光タンパク質のＲＬｕｃ８にコンジュゲートされ、抗原のＴＣＣ類似体は、ＧＦＰ2にコンジュゲートされている。コンジュゲートされていない分析物（標識されていない抗原ＴＣＣ）を加えると、生物発光タンパク質に対する基質の存在下で、生物発光タンパク質と蛍光タンパク質との間のエネルギー転移の効率が低下し、ＢＲＥＴ2比の低下が観察される。 ２％ＤＭＳＯ／ＰＢＳ中におけるナノボディセンサーＴ９ＮＢ１－ＲＬｕｃ８／ＴＣＣ－４’－Ｓ－（ＣＨ2）2－ＣＯ－ＧＦＰ2反応のＴＣＣ濃度依存性（平均±ＳＤ、ｎ＝３）を、２２℃で５分インキュベーションした後に１０μＭのセレンテラジン４００ａ（ＥｔＯＨ中１μＬ）を１０ｎＭのＴ９ＮＢ１－ＲＬｕｃ８／ＴＣＣ－４’－Ｓ－（ＣＨ2）2－ＣＯ－ＧＦＰ2ナノボディセンサーに加えた場合の最大ＢＲＥＴ2比のパーセンテージとして表す。ＥＣ50＝１７ｎＭ。 ２％ＤＭＳＯ／ＰＢＳ中の１０ｎＭの精製Ｔ９ＮＢ１－ＲＬｕｃ８ナノボディ融合体、精製Ｔ９ＮＢ１－ＲＬｕｃ８ナノボディ融合体及びＧＦＰ2ならびに精製Ｔ９ＮＢ１－ＲＬｕｃ８ナノボディ融合体及びＴＣＣ－４’－Ｓ－（ＣＨ2）2－ＣＯ－ＧＦＰ2融合体のＢＲＥＴ2比（平均±ＳＤ、ｎ＝３）を示す。発光強度は、２２℃で５分インキュベーションした後に１０μＭのセレンテラジン４００ａ基質を加えた後に記録した。
配列表の説明
配列番号１～３－リンカー配列。
配列番号４－ＦＬＡＧ－ＧＦＰ2。
配列番号５－Ｎ－Ｈｉｓ－ＲＬｕｃ８。
配列番号６－ＦＬＡＧ－ＲＬｕｃ８。
配列番号７－ＦＬＡＧペプチド。
配列番号８－Ｎ－Ｈｉｓ－Ｔ９ＮＢ１－ＲＬｕｃ８。
一般的な技術及び定義
特に具体的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者（例えば、ＣＲＥＴベースのセンサー技術、特にＢＲＥＴベースのセンサー技術、分子生物学、タンパク質化学、バイオコンジュゲーション技術、生化学など）によって一般に理解されるのと同じ意味を有するものとする。
特に指示がない限り、本発明で利用される組み換えタンパク質、細胞培養、バイオコンジュゲーション、及び免疫学的技術は、当業者によく知られている標準的な手順である。そのような技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５ ａｎｄ １９９６）、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの全てのアップデートを含む）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、及びＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（現在までの全てのアップデートを含む），Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｉｎｃ．（２０１３）などの出典の文献を通じて記載され、説明されている。
「及び／または」、例えば、「Ｘ及び／またはＹ」という用語は、「Ｘ及びＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味すると理解され、両方の意味またはいずれかの意味に明確なサポートを提供するものとみなされる。
文脈で特に示唆されない限り、センサー及び基質などの単数形での用語の言及は、同様に複数形を明確に意味する。例えば、論理的に、多くの個々の分子は、単一の分子というよりも、デバイスを通って流れるか、またはウェル内に含まれる。
本明細書で使用されるとき、約という用語は、反対の記載がない限り、指定された値の＋／－１０％、より好ましくは＋／－５％、更により好ましくは＋／－１％を指す。
本明細書全体を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記載される要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を含むことを意味するが、任意の他の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を排除するものではないことを理解されたい。
特に指示がない限り、または文脈から別に示されない限り、％濃度は、重量／体積（％ｗ／ｖ）である。
本明細書で使用されるとき、「結合している」という用語は、広義に定義され、限定するものではないが、共有結合的及び非共有結合的な相互作用を含むことが意図される。共有結合的な相互作用は、１つの電子対（すなわち、単結合）、２つの電子対（すなわち、二重結合）または３つの電子対（すなわち、三重結合）の共有によって形成される、２つの原子またはラジカルの間の化学的連結である。共有結合的な相互作用は、当該技術分野において、電子対相互作用または電子対結合としても知られている。共有結合的な結合の例としては、ジスルフィド結合、アミド結合、チオエーテル結合などが挙げられる。非共有結合的な相互作用は、共有結合的な相互作用よりもかなり弱いが、高分子構造の三次元構造を決定する上で大きな役割を担う。非共有結合的な相互作用には、ファンデルワールス相互作用、水素結合、弱い化学結合（すなわち、短距離の非共有結合的な力を介したもの）、疎水性相互作用、イオン結合などが含まれるが、これらに限定されない。非共有結合的な相互作用の総説は、Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９４に見出すことができる。非共有結合的な結合の例としては、アビジン／ストレプトアビジン－ビオチン複合体、抗体／抗原複合体、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖、核酸－タンパク質複合体などが挙げられる。いくつかの実施形態において、「結合している」は、好ましくは、共有結合的に結合している。
本明細書で使用されるとき、「結合する」、「結合すること」、「相互作用する」、「相互作用すること」、「会合する」という用語は、限定するものではないが、非共有結合的な相互作用を含むことが意図される。
本明細書で使用されるとき、「接触すること」という用語は、２つ以上の化学分子を極めて近接させることにより、２つ以上の化学分子間の反応及び／または相互作用が起こり得るようにすることを指す。いくつかの実施形態において、「接触すること」という用語は、２つ以上の化学分子を極めて近接させることにより、２つ以上の化学分子が複合体を形成できるようにすることを指す。
抗体または抗体様分子
本明細書で使用されるとき、抗体は、広義に定義され、抗体及びその抗原結合断片を含む。本明細書で使用される「抗体」という用語は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを含む、免疫グロブリンの全てのアイソタイプを指す。本明細書で使用されるとき、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域の遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。「免疫グロブリン」という用語は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃなどのこれらの免疫グロブリンのサブタイプを含む。これらの免疫グロブリンのうち、ＩｇＧが好ましい。抗体は、任意の種の起源であり得、（例えば）マウス、ラット、ウサギ、ウマ、またはヒトを含み、あるいは、キメラ抗体であってもよい（例えば、Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。好適な抗体には、任意の生物由来の天然抗体、操作された抗体、または実験、治療もしくは他の目的のために組み換え的に産生された抗体が含まれる。本明細書で使用される「抗体」という用語は、標的抗原に結合する能力を保持する抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ断片、抗体の他の抗原結合サブ配列を含み、全抗体の修飾によって産生されたもの、または組み換えＤＮＡ技術を使用してｄｅ ｎｏｖｏ合成されたもの及びＩｇＧ以外の抗体から得られる対応する断片を含み得る。これらの抗体断片は、Ｊ．Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ ９８－１１８（Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８３）に記載されているようなタンパク質分解断片化手順などの従来の手順を使用して、及び当業者に知られている他の技術によって得られる。断片は、インタクト抗体と同じ様式で、有用性についてスクリーニングされる。
好適な抗体または抗原結合断片には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、モノクローナル抗体、Ｆａｂ’、ｒＩｇＧ（半抗体）、ｆ（ａｂ’）２、ナノボディ、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖマルチマー、単一ドメイン抗体または単一ドメイン融合抗体が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、単一の分子組成を持つ抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を呈する。
本明細書で使用されるとき、「特異的結合」（ならびに「特異的に結合している」及び「特異的に結合する」という用語）は、所定の抗原に優先的に結合する抗体または抗体様分子を指し、これにより、本明細書に記載されるアッセイを可能にする程度に、抗原と他のものと区別するために当該抗体を使用することができる。典型的に、抗体は、所定の抗原以外の抗原に結合する親和性よりも少なくとも２倍の親和性で結合する。いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子は、１００μＭ以下、１０μＭ以下、１μＭ以下、５００ｍＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、５００ｐＭ以下または１００ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）を有する抗原と複合体を形成する。特に指示がない限り、解離定数は、当業者に知られている技術、例えば、ＳＰＲ、水晶振動子マイクロバランス法またはＩＴＣを使用して、中性ｐＨ及び温度で測定される。
本開示において有用な抗体または抗体様分子は、当該技術分野において知られている様々な技術によって産生することができる。モノクローナル抗体産生は、当該技術分野において知られている技術によって実施され得る。
他の実施形態において、抗体は、組み換え抗体であり得る。「組み換え抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、組み換え手段によって調製、発現、生成または単離された抗体、例えば、別の種の免疫グロブリン遺伝子を導入した動物（例えば、マウス）から単離された抗体、宿主細胞にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組み換えから単離された抗体、コンビナトリアル抗体ライブラリー、または免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、生成、もしくは単離された抗体を含むことが意図される。
いくつかの実施形態において、抗体は、既知の技術に従って産生されたキメラ抗体であり得る。例えば、キメラモノクローナル抗体は、既知の技術に従って産生された相補性決定領域グラフト抗体（または「ＣＤＲグラフト抗体」）であり得る。モノクローナルＦａｂ断片は、当業者に知られている組み換え技術によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで産生され得る（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。
本明細書で使用されるとき、「抗体様」分子は、抗体のように抗原に特異的に結合することができるが、構造的には抗体に関連しない分子を指す。本明細書で使用されるとき、抗体様分子は、抗体またはその断片ではない。好適な抗体様分子には、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、モノボディ、アビマー、マイクロボディが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、モノクローナル抗体、Ｆａｂ’、ｒＩｇＧ（半抗体）、ｆ（ａｂ’）2、ナノボディ、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、モノボディ、アビマー、マイクロボディ、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖマルチマー、単一ドメイン抗体または単一ドメイン融合抗体である。いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子は、ＩｇＧ、Ｆａｂ’、ｒＩｇＧ（半抗体）またはｆ（ａｂ’）2である。本明細書で使用されるとき、ｆ（ａｂ’）2はまた、Ｆａｂ’２及びその変形形態とも呼ばれる。いくつかの好ましい実施形態において、抗体または抗体様分子は、ＩｇＧまたはその抗原結合断片である。いくつかの好ましい実施形態において、抗体または抗体様分子は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子は、ナノボディである。ナノボディは、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはＶＨＨとも呼ばれることがあり、重鎖抗体（ＶＨＨ）または一般的なＩｇＧの可変ドメインを１つ含有する。
本開示の実施形態に抗体を使用することで、いくつかの利点が得られる。第一に、全ての抗体は、共通の三次元構造を持っていることから、それぞれ個々の免疫センサーについて、その形状を最適化する必要が減ると考えられる。第二に、抗体は、対応する抗原に対して高い特異性及び親和性を有し、第三に、実質的にあらゆる抗原に対して抗体を作製することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書において有用な抗体及び抗体様分子には、操作された抗体及び抗体様分子が含まれる。本明細書で使用されるとき、「操作された抗体または抗体様分子」は、親の抗体または抗体様分子の１つ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸で置換されている抗体または抗体様分子を指す。そのような置換は、当業者に知られている技術、例えば、部位特異的変異導入によって行うことができる。異なるアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸（例えば、システイン、リシン、グルタミン酸、セリンまたはチロシン）または天然に存在しないアミノ酸であり得る。天然に存在しないアミノ酸は、オルソゴナルな化学反応を可能にすることができる。いくつかの実施形態において、天然に存在しないアミノ酸は、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分を翻訳後修飾によって部位特異的に結合させるために使用することができる、オルソゴナル官能基（アジドまたはアルキンなど）を持つ。天然に存在しないアミノ酸の例としては、４－アセチルフェニルアラニン、ベンゾイルフェニルアラニン、アセチルリシン、４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、アジドホモアラニン、ホモプロパルギルグリシン、歪みのあるシクロオクチン－リシン（ＳＣＯ－Ｌｙｓ）、ｔｒａｎｓ－シクロオクタ－２－エン－リシン（ＴＣＯ－Ｌｙｓ）、４－（６－メチル－ｓ－テトラジン－３－イル）アミノフェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な例としては、Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｅｃｉｅｎｃｅ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ 及びＢａｓｅ Ｃｌｉｃｋから入手可能なものなどの任意の市販の非天然アミノ酸が挙げられる。天然に存在しないアミノ酸は、当業者に知られている技術、例えば、アンバーコドン抑制系によって、抗体または抗体様分子に部位特異的に組み込まれ得る（Ｌａｎｇ ａｎｄ Ｃｈｉｎ，２０１４；Ｌｉｕ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，２０１０）。非天然アミノ酸は、例えば、クリックケミストリーにより、非天然アミノ酸の部位にＣＲＥＴペアの第１の構成成分を部位特異的に結合させるのに有用であり得る。一例において、抗体または抗体様分子は、ＷＯ２００６／０３４４８８に開示されているように、親抗体の１つ以上のアミノ酸が遊離システインアミノ酸で置き換えられた、システイン操作された抗体または抗体様分子である。システイン操作された抗体は、１つ以上の遊離システインアミノ酸を含み、好ましくは、０．６～１．０の範囲内のチオール反応性値を有する。遊離システインアミノ酸は、親抗体に操作されたシステイン残基であり、ジスルフィド架橋の一部ではない。システイン操作された抗体は、例えば、マレイミドまたはハロアセチルを介して、操作されたシステインの部位にＣＲＥＴペアの第１の構成成分を部位特異的に結合させるのに有用である。操作された抗体または抗体様分子は、好ましくは、その野生型の親抗体対応物の抗原結合能力を保持している。したがって、操作された抗体または抗原様分子は、抗原に、好ましくは特異的に結合することが可能である。
本明細書で使用されるとき、「結合することが可能」という用語は、抗体または抗体様分子が、１００μＭ以下、１０μＭ以下、１μＭ以下、５００ｍＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、５００ｐＭ以下または１００ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）を有する抗原と複合体を形成することを意味する。
本開示において有用な抗体または抗体様分子は、抗原及び分析物に結合することが可能である。本明細書で使用されるとき、「抗原」及び「分析物」は両方とも同じ抗体または抗体様分子、好ましくは、同じ結合部位に結合することが可能である。抗原及び分析物の抗体または抗体様分子への結合は、競合的であるため、抗原及び分析物は、抗体または抗体様分子上の同じ部位または重複する部位に結合し、一度に結合することができるのは抗原または分析物の１つのみである。いくつかの実施形態において、抗原及び分析物は、標識以外、同一である。他の実施形態において、抗原は、分析物の抗体結合断片である。代替的な実施形態において、分析物は、抗原の抗体結合断片である。
いくつかの実施形態において、本開示において有用な抗体または抗体様分子は、セロコンバージョンを誘発する病原体からの抗原を指向する抗体または抗体様分子である。
一例において、抗体または抗体様分子は、抗体または抗体様分子及びＣＲＥＴペアの第１の構成成分を含む、融合タンパク質である。例えば、抗体または抗体様分子は、ナノボディ及びＣＲＥＴペアの第１の構成成分を含む融合タンパク質である（すなわち、ナノボディ及びＣＲＥＴペアの第１の構成成分は、同じポリペプチドの一部を形成する）。
代替的な実施形態において、抗体または抗体様分子は、抗体または抗体様分子及びＣＲＥＴペアの第１の構成成分を含む、融合タンパク質ではない。一例において、抗体または抗体様分子は、リンカーを介して、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に共有結合的に結合している。好適なリンカー及び結合化学は、本明細書に記載されるとおりである。別の例において、抗体または抗体様分子は、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に非共有結合的に結合している。
いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子であって、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合しており、
ｉ）分析物；及び
ｉｉ）ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原に、結合することが可能であり、
標識された抗原が抗体または抗体様分子に結合した場合、第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が１０～７５％の範囲内である、抗体または抗体様分子が提供される。抗体または抗体様分子、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分、分析物、及び標識された抗原は、本明細書に定義されるとおりである。
いくつかの実施形態において、分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子を特定する方法であって、
ｉ）抗体または抗体様分子をＣＲＥＴペアの第１の構成成分に連結する異なるリンカーを有する２つ以上の抗体または抗体様分子を得ることと、
ｉｉ）２つ以上の抗体または抗体様分子を、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原と接触させることと、
ｉｉｉ）ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率を測定することと、
ｉｖ）標識された抗原に結合した場合、１０～７５％の範囲内であるＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率を有する、少なくとも１つの抗体または抗体様分子を選択することと、を含む、方法が提供される。好ましくは、ステップｉｖ）は、標識された抗原に結合した場合、２つ以上の抗体または抗体様分子のうち、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率がより高い抗体または抗体様分子を選択することを含む。好ましい例において、選択された抗体または抗体様分子のＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率は、標識された抗原に結合している場合、５０～７５％の範囲内である。
本明細書で使用されるとき、「異なるリンカー」という用語は、異なる長さのリンカーもしくは異なる組成のリンカー（例えば、ＰＥＧベースのリンカー対ペプチドベースのリンカー）またはこれらの組み合わせを含む。
標識された抗原
本明細書で定義される抗体または抗体様分子は、標識された抗原に結合することが可能である。本明細書で使用されるとき、「抗原」という用語は、抗体または抗体様分子上の認識部位に結合することができる分子または分子の部分を指す。本明細書で使用されるとき、「標識された抗原」という用語は、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合されている抗原を指す。結合は、共有結合的な結合または非共有結合的な結合であり得る。標識された抗原は、抗体または抗体様分子上の認識部位に結合する能力を保持している。
抗原は、生体高分子または低分子の生体活性物質などの、診断検査が実施される目的の任意の化合物または分子であり得る。抗原は、限定するものではないが、例えば、細胞、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗体、ウイルス、基質、代謝産物、遷移状態アナログ、補助因子、阻害物質、薬物、色素、栄養素、成長因子、核酸または脂質であり得る。いくつかの実施形態において、抗原は、有機低分子、薬物、薬物代謝物、抗生物質、ホルモン、アレルゲン、ペプチド、タンパク質、天然に存在する抗体、糖、脂質または核酸からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗原は、有機低分子、薬物、薬物代謝物、抗生物質、ホルモン、アレルゲン、ペプチド、タンパク質、糖、脂質または核酸からなる群から選択される。一例において、抗原は、ペプチドまたはタンパク質である。別の例において、抗原は、抗生物質、薬物または薬物代謝物である。別の例において、抗原は、抗菌性物質である。別の例において、抗原は、抗真菌性物質である。別の例において、抗原は、セロコンバージョンを誘発する病原体からの抗原と類似または同一の合成抗原である。いくつかの実施形態において、抗原は、有機低分子である。当業者によって理解されるように、抗原は、２つ以上のカテゴリーに分類することができる。
好ましくは、抗原は、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に共有結合的に結合している。一例において、標識された抗原は、抗原及びＣＲＥＴペアの第２の構成成分を含む融合タンパク質であり、すなわち、抗原とＣＲＥＴペアの第２の構成成分の両方は、同じポリペプチドの一部を形成している。いくつかの実施形態において、標識された抗原は、抗原及びＢＲＥＴアクセプタードメインを含む、融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、標識された抗原は、抗原及び蛍光アクセプタードメインを含む、融合タンパク質である。一実施形態において、標識された抗原は、抗原及びＧＦＰ、好ましくは、ＧＦＰ2を含む、融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、標識された抗原は、抗原及びＢＲＥＴドナードメインを含む、融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、標識された抗原は、抗原及び生物発光タンパク質を含む、融合タンパク質である。一例において、標識された抗原は、抗原及びＲＬｕｃ８を含む、融合タンパク質である。
別の例において、標識された抗原は、リンカーを介して、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に共有結合的に結合されている抗原である。任意の好適なリンカーが使用され得る。リンカー及び結合化学の非限定的な例は、本明細書に記載されるとおりである。
いくつかの実施形態において、標識された抗原は、リンカーを介して、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に共有結合的に結合されている有機低分子である。いくつかの実施形態において、標識された抗原は、リンカーを介して、ＢＲＥＴペアの第２の構成成分に共有結合的に結合されている有機低分子である。いくつかの実施形態において、標識された抗原は、リンカーを介して、蛍光アクセプタードメインに結合されている有機低分子である。いくつかの実施形態において、標識された抗原は、リンカーを介して、蛍光タンパク質に共有結合的に結合されている有機低分子である。いくつかの実施形態において、標識された抗原は、リンカーを介して、ＧＦＰ、例えば、ＧＦＰ2に共有結合的に結合されている有機低分子である。いくつかの実施形態において、標識された抗原は、リンカーを介して、ＢＲＥＴドナードメインに共有結合的に結合されている有機低分子である。いくつかの実施形態において、標識された抗原は、リンカーを介して、生物発光タンパク質に共有結合的に結合されている有機低分子である。一例において、標識された抗原は、リンカーを介して、ＲＬｕｃ８に結合されている有機低分子である。代替的な実施形態において、標識された抗原は、リンカーを介して、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に共有結合的に結合されているペプチドまたはポリペプチドである。いくつかの実施形態において、標識された抗原は、リンカーを介して、ＢＲＥＴペアの第２の構成成分に共有結合的に結合されているペプチドまたはポリペプチドである。いくつかの実施形態において、標識された抗原は、リンカーを介して、蛍光アクセプタードメインに結合されているペプチドまたはポリペプチドである。いくつかの実施形態において、標識された抗原は、リンカーを介して、蛍光タンパク質に共有結合的に結合されているペプチドまたはポリペプチドである。いくつかの実施形態において、標識された抗原は、リンカーを介して、ＧＦＰ、例えば、ＧＦＰ2に共有結合的に結合されているペプチドまたはポリペプチドである。いくつかの実施形態において、標識された抗原は、リンカーを介して、ＢＲＥＴドナードメインに共有結合的に結合されているペプチドまたはポリペプチドである。いくつかの実施形態において、標識された抗原は、リンカーを介して、生物発光タンパク質に共有結合的に結合されているペプチドまたはポリペプチドである。一例において、標識された抗原は、リンカーを介して、ＲＬｕｃ８に共有結合的に結合されているペプチドまたはポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、標識された抗原を特定する方法であって、
ｉ）２つ以上の標識された抗原を得ることであって、それぞれの標識された抗原は、任意選択のリンカーを介してＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含み、２つ以上の標識された抗原は、（ｉ）異なるリンカー、及び／または（ｉｉ）異なる長さの抗原を含む、得ることと、
ｉｉ）２つ以上の標識された抗原を、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している、分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子と接触させることと、
ｉｉｉ）ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率を測定することと、
ｉｖ）抗体または抗体様分子に結合した場合、１０～７５％の範囲内であるＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率を有する、少なくとも１つの標識された抗原を選択することと、を含む、方法が提供される。好ましくは、ステップｉｖ）は、標識された抗原に結合した場合、２つ以上の抗体または抗体様分子のうち、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率がより高い抗体または抗体様分子を選択することを含む。好ましい例において、選択された標識された抗原のＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率は、抗体または抗体様分子に結合した場合、５０～７５％の範囲内である。
本明細書で使用されるとき、「異なる長さの抗原」という文言は、分子量、大きさ、アミノ酸の数が異なる抗原を指す。例えば、異なる長さの抗原は、抗体または抗体様分子結合エピトープを含有する異なる長さのポリペプチドであり得る。
本明細書で使用されるとき、「異なるリンカー」という文言は、異なる長さのリンカーもしくは異なる組成のリンカー（例えば、ＰＥＧベースのリンカー対ペプチドベースのリンカー）またはこれらの組み合わせを含む。
リンカー
本明細書で使用されるとき、「リンカー」は、ある化学種（例えば、抗体、抗体様分子または抗原）を別の化学種（例えば、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分または第２の構成成分）に連結する部分を指す。リンカーは、１つ以上の反応性官能基、または１つ以上の化学種への結合のために官能化され得る基を含有する、任意の生体適合性分子であり得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、反応性官能基またはＣＲＥＴペアの第１の構成成分を抗体または抗体連結分子に結合する。いくつかの実施形態において、リンカーは、反応性官能基またはＣＲＥＴペアの第２の構成成分に抗原を結合する。リンカーは、限定するものではないが、０次のリンカー（すなわち、結合）、アシル、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロシクロアルキル、置換または非置換のアリール、及び置換または非置換のヘテロアリールを含む、任意の有用な構造であり得る。更なる例示的なリンカーは、置換もしくは非置換の分枝状または直鎖状のＣ－Ｃ置換もしくは非置換のアルキル及び置換または非置換のヘテロアルキルを含む。他のリンカーには、核酸、ペプチド及び糖が含まれる。
本明細書で使用されるとき、「反応性官能基」は、合成化学、特に、バイオコンジュゲート化学の分野で一般に認識されている意味を有する。例示的な反応性官能基には、限定するものではないが、オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、オキシド、ハロゲン化物、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル、メルカプタン、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、無水物、硫酸塩、スルフェン酸 イソニトリル、アミジン、イミド、イミデート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、亜硫酸塩、エナミン、イナミン、尿素、プソイド尿素、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバメート、イミン、アジド、アゾ化合物、アゾキシ化合物、及びニトロソ化合物が含まれる。これらの官能基のそれぞれを調製する方法は、当該技術分野においてよく知られており、特定の目的のための適用または変更は、当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｓａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｏ，ｅｄｓ．ＯＲＧＡＮＩＣ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＧＲＯＵＰ ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９８９参照）。
上記の機能を達成する任意の好適なリンカーを利用することができる。好適なリンカーの例としては、炭化水素鎖（例えば、非分枝状アルキレン部分）、ペプチド鎖、ＰＥＧタイプまたは他のポリエーテルタイプの基、及び他のポリマー基（ポリヒドロキシ酸など）を含むものが挙げられる。一例では、リンカーは、２つの化学種を連結する原子の鎖からなり、鎖は、５０～５００、１００～５００、１５０～５００、２００～５００、２５０～５００、３００～５００、３５０～５００、４００～５００個の原子からなる。一例では、リンカーは、２つの化学種を連結する原子の鎖からなり、鎖は、２～５００、２～４５０、２～４００、２～３５０、２～３００、２～２５０、２～２００、２～１５０、２～１００、２～５０、２～４０、２～３０、２～２０、２～１０個の原子からなる。
いくつかの実施形態において、リンカーには、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレングリコール鎖の少なくとも１つの酸素が窒素で置換されたポリアルキレングリコール、ポリアミン（Ｈｅｒｖｅ ｅｔ ａｌ．，２００８）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，２００５）、ロックド核酸（ＬＮＡ）（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、トリアゾール、ピペラジン、オキシム、チアゾリジン、芳香環系、アルカン、アルケン、アルキン、環状アルカン、環状アルケン、アミド、チオアミド、エーテル、及びヒドラゾンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、連結要素は、アルキル鎖、グリコール、ポリグリコール、エーテル、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを含むか、またはこれらからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、連結要素は、ペプチドまたはポリペプチドである。いくつかの実施形態において、連結要素は、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールである。
一例において、リンカーは、炭化水素（例えば、中央スペーサー基はアルキレン基であり得る）を含み、分枝状または非分枝状であってよく、当該炭化水素は、Ｃ2－Ｃ250、Ｃ20－Ｃ250、Ｃ40－Ｃ250、Ｃ60－Ｃ250、Ｃ80－Ｃ250、Ｃ100－Ｃ250、Ｃ120－Ｃ250、Ｃ140－Ｃ250、Ｃ160－Ｃ250、Ｃ180－Ｃ250、Ｃ200－Ｃ250、Ｃ220－Ｃ250の範囲、または少なくともＣ2、少なくともＣ20、少なくともＣ40、少なくともＣ50、少なくともＣ60、少なくともＣ70、少なくともＣ80、少なくともＣ90、少なくともＣ100の鎖長である。一例において、リンカーは、分枝状または非分枝状のＣ180－Ｃ250、Ｃ200－Ｃ240、またはＣ210－Ｃ230の炭化水素基を含む。一例において、リンカーは、分枝状または非分枝状のＣ150－Ｃ250、またはＣ180－Ｃ220の炭化水素基を含む。いくつかの例において、リンカーは、分枝状または非分枝状のＣ180－Ｃ220の炭化水素基を含む。いくつかの例において、リンカーは、Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3、Ｃ4、Ｃ5、Ｃ6、Ｃ7、Ｃ8、Ｃ9、Ｃ10、Ｃ12、Ｃ14、Ｃ16、Ｃ18、またはＣ20アルキレン基を含み、すなわち、リンカーは、（ＣＨ2）nを含み、式中、ｎは、１～２０の整数である。一例では、リンカーは、Ｃ2アルキレン基（すなわち、－ＣＨ2－ＣＨ2－）を含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは、ポリアルキレングリコールを含み得る。好適なポリアルキレングリコールには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールまたはメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）及びその誘導体、例えば、Ｏ，Ｏ’－ビス（２－アミノプロピル）－ポリエチレングリコール５００及び２，２’－（エチレンジオキシド）ジエチルアミンなどが含まれる。ＰＥＧは、エチレングリコールのポリマーであり、置換に応じて、化学式Ｃ2n+2Ｈ4n+6Ｏn+2を有し得る。本明細書で言及されるように、ＰＥＧ基は、サブ単位－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）－に基づく基であり、すなわち、ＰＥＧｎという用語は、式－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n－の基を指す。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＰＥＧｎを含み得、式中、ｎは、ＰＥＧ単位の数である。例えば、リンカーは、最大約７２のエチレングリコール部分、最大約６０のエチレングリコール部分、最大約４８のエチレングリコール部分、最大約３６のエチレングリコール部分、最大約３２のエチレングリコール部分、最大約２８のエチレングリコール部分、最大約２０のエチレングリコール部分、最大約１２のエチレングリコール部分、または最大約８のエチレングリコール部分を有するＰＥＧを含む。例えば、リンカーは、８以上のエチレングリコール部分、１２以上のエチレングリコール部分、２０以上のエチレングリコール部分、２８以上のエチレングリコール部分、３２以上のエチレングリコール部分、３６以上のエチレングリコール部分、４０以上のエチレングリコール部分、４８以上のエチレングリコール部分、６０以上のエチレングリコール部分、または７０以上のエチレングリコール部分を有するＰＥＧを含む。例えば、リンカーは、ＰＥＧ２～ＰＥＧ１００、ＰＥＧ１０～ＰＥＧ９０、ＰＥＧ２０～ＰＥＧ８０、ＰＥＧ３０～ＰＥＧ７０、ＰＥＧ４０～ＰＥＧ６０、ＰＥＧ４５～ＰＥＧ５５、または、少なくともＰＥＧ２、少なくともＰＥＧ５、少なくともＰＥＧ１０、少なくともＰＥＧ１５、少なくともＰＥＧ２０、少なくともＰＥＧ２５、少なくともＰＥＧ３０、少なくともＰＥＧ３５、少なくともＰＥＧ４０、少なくともＰＥＧ４５、少なくともＰＥＧ５０の鎖長を有するＰＥＧｎを含み得る。他の有用なポリアルキレングリコールは、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、ＰＥＧ－グリシジルエーテル、及びＰＥＧ－オキシカルボニルイミダゾールである。
当業者によって理解されるように、リンカーを形成するエチレングリコール部分は、連続的なストレッチを形成する必要はなく、すなわち、ＰＥＧ鎖は、ＰＥＧ鎖を連結する１つ以上のコンジュゲーション要素によって中断されてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、リンカーは、ＰＥＧn－Ｌ－ＰＥＧmを含み、式中、ｍ及びｎは独立して０～１００の整数であり、Ｌはコンジュゲーション要素である。いくつかの実施形態において、ｎ及びｍは、４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６または４０から独立して選択される。本明細書で使用されるとき、「コンジュゲーション要素」という用語は、２つの反応性官能基の反応によって形成される任意の化学種を指す。いくつかの実施形態において、コンジュゲーション要素は、ＤＢＣＯとアジドの反応によって形成される。例えば、いくつかの実施形態において、コンジュゲーション要素は、アジド含有分子及びＤＢＣＯ含有分子の反応から形成される。
別の例において、リンカーは、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１０～６０、２０～６０、３０～６０、４０～６０、または少なくとも４、少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１６、少なくとも２０、少なくとも２４、少なくとも２８、少なくとも３２、少なくとも３６、少なくとも４０、少なくとも４４、少なくとも４８、少なくとも５２、少なくとも５６、少なくとも６０、または６０未満、５６未満、５２未満、４８未満、４４未満、４０未満、３６未満、３２未満、２８未満、２４未満、２０未満、１６未満、１２未満、８未満、４未満のモノマー単位を含む、ポリウレタン、ポリヒドロキシ酸、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリアミド、ポリエステル、ポリスルホンである。
代替的な実施形態において、リンカーは、オリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド塩基もしくは修飾ヌクレオシド塩基またはその両方を含み得る。連結要素は、最大約１００個のヌクレオシド塩基及び／または修飾ヌクレオシド塩基を有し得る。一実施形態において、連結要素は、最大約１００、最大約９０、最大約８０、最大約７０、最大約６０、最大約５０、最大約４０、最大約３０、最大約２０、最大約１０、最大約５、または最大約２個のヌクレオシド塩基及び／または修飾ヌクレオシド塩基を有し得る。いくつかの実施形態において、核酸リンカーは、１～１００、２０～８０、４０～６０、４５～５５、または、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも．３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００個のヌクレオシド塩基及び／または修飾ヌクレオシド塩基の長さを有し得る。
他の実施形態において、リンカーは、アミノ酸またはアミノ酸の鎖またはペプチドを含む。例えば、リンカーは、１～１００、２０～８０、４０～６０、４５～５５の範囲、または少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００個のアミノ酸残基の配列を含み得る。一例において、リンカーは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチドなどを含み得る。アミノ酸は、天然もしくは非天然に存在するアミノ酸またはこれらの組み合わせであり得る。ペプチドまたはポリペプチドは、修飾アミノ酸を含み得る。
他の例において、リンカーは、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸またはβ－アミノ酸から選択されるアミノ酸を含み得る。一例において、リンカーは、β－ペプチドを含み得る。一例において、アミノ酸リンカーの構成要素は、Ｌアミノ酸である。例えば、リンカーは、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＬｙｓアミノ酸残基を含み得る。一例において、リンカーは、Ｇｌｙ及びＳｅｒを含む。例えば、リンカーは、ＧｌｙＳｅｒＳｅｒまたはＧｌｙＳｅｒＳｅｒのリピート（ＧｌｙＳｅｒＳｅｒ）nを含み得、例えば、リンカーは、（ＧｌｙＳｅｒＳｅｒ）nを含み得、式中、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５、ｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９、ｎ＝１０、ｎ＝１１、ｎ＝１２、ｎ＝１３、ｎ＝１４、ｎ＝１５、ｎ＝１６、ｎ＝１７、ｎ＝１８、ｎ＝１９、ｎ＝２０、ｎ＝２１、ｎ＝２２、ｎ＝２３、ｎ＝２４、ｎ＝２５、ｎ＝２６、ｎ＝２７、ｎ＝２８、ｎ＝２９、ｎ＝３０である。別の例において、リンカーは、（ＧｌｙＳｅｒＳｅｒ）n－Ｘ－（ＧｌｙＳｅｒＳｅｒ）mを含み得、式中、ｎ及びｍは独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、３０であり、Ｘはコンジュゲーション要素、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＬｙｓである。
別の例において、リンカーは、（ＧｌｙＳｅｒＳｅｒ）n－ＸＹ－（ＧｌｙＳｅｒＳｅｒ）mを含み得、式中、ｎ及びｍは独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０であり、Ｘはコンジュゲーション要素、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＬｙｓであり、Ｙは任意のアミノ酸である。別の例において、リンカーは、（ＧｌｙＳｅｒＳｅｒ）n－Ｘ（Ｙ）a－（ＧｌｙＳｅｒＳｅｒ）mを含み得、式中、ｎ及びｍは独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０であり、Ｘはコンジュゲーション要素、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＬｙｓであり、Ｙは任意のアミノ酸またはアミノ酸の組み合わせであり、ａは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０である。
一例において、リンカーは、ＧｌｙＳｅｒまたはＧｌｙＳｅｒリピート（（ＧｌｙＳｅｒ）n）を含み得る。例えば、リンカーは、（ＧｌｙＳｅｒ）nを含み得、式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０である。別の例において、リンカーは、（ＧｌｙＳｅｒ）n－Ｘa－（ＧｌｙＳｅｒ）mを含み得、式中、ｎ及びｍは独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０であり、Ｘはコンジュゲーション要素、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＬｙｓであり、Ｙは任意のアミノ酸またはアミノ酸の組み合わせであり、ａは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０である。
いくつかの実施形態において、リンカーは、微生物トランスグルタミナーゼの高親和性Ｇｌｎ基質を含む（Ｏｔｅｎｇ－Ｐａｂｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。例えば、連結要素は、ＷＡＬＱＲＰＨ（配列番号１）及びＷＥＬＱＲＰＹ（配列番号２）からなる群から選択される配列を有するペプチドを含む。いくつかの実施形態において、連結要素は、ソルターゼ認識配列を含む（Ｔｈｅｉｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。例えば、連結要素は、配列ＬＰＸＴを有するペプチドを含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸（配列番号３）である。当業者であれば理解できるように、ソルターゼ媒介反応は、ＣＲＥＴペアの第１または第２の構成成分のＮ末端を標識するために使用することができる。いくつかの実施形態において、リンカーは、スペーサー配列を更に含む。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、例えば、上で定義されたように、１つ以上のグリシン、セリン及び／またはトレオニン残基を含む。
一例において、リンカーは、チオキソ－アミノ酸、ヒドロキシ酸、メルカプト酸、二炭酸、ジアミン、ジチオキソカーボン酸、及びアミンからなる群から選択される分子を含み得る。別の例において、リンカーまたはテザーは、誘導体化されたアミノ酸配列またはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
一例において、リンカーは、上に言及される構成成分の組み合わせである。
一例において、抗体または抗体様分子は、ペプチドリンカーを介して、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合しており、それにより、抗体または抗体様分子及びＣＲＥＴペアの第１の構成成分は、単一のポリペプチドを形成する。一例において、抗原は、ペプチドリンカーを介して、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合しており、それにより、抗原及びＣＲＥＴペアの第２の構成成分は、単一のポリペプチドを形成する。
上に言及される「リンカー」を調製し、それを抗体、抗体様分子、抗原、ＣＲＥＴペアの第１または第２の構成成分などのポリペプチドに結合させるための多数の方法は、当該技術分野において知られており、本開示の使用に好適である。一例において、抗体または抗体様分子は、反応性官能基を介して、リンカーに結合しており、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分は、反応性官能基を介して、リンカーに結合している。一例において、抗原は、反応性官能基を介して、リンカーに結合しており、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分は、反応性官能基を介して、リンカーに結合している。
いくつかの実施形態において、リンカーは、１つ以上の反応性官能基を含む。反応性官能基は、任意の化学反応手段によって、抗体、抗体様分子、抗原、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分またはＣＲＥＴペアの第２の構成成分中の化学基と反応して、本明細書に記載される分子を形成することができる。抗体、抗体様分子、抗原、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分またはＣＲＥＴペアの第２の構成成分への結合部位は、第一級アミン（－ＮＨ2）、カルボキシル（－ＣＯＯＨまたはＣＯ）、スルフヒドリル（－ＳＨ）、カルボニル（ＣＨＯ）及び炭水化物を含む。任意の好適な反応性官能基が使用され得る。いくつかの実施形態において、反応性官能基は、スルフヒドリル反応性部分、アミン反応性部分及びカルボニル反応性部分からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、反応性官能基は、スルフヒドリル反応性部分、アミン反応性部分及び／またはカルボニル反応性部分と反応する基である。例えば、反応性部分は、遊離システイン残基、遊離リシン残基またはカルボニル基を含み得る。
例えば、いくつかの実施形態において、リンカーは、抗体、抗体様分子、抗原、ＢＲＥＴペアの第１の構成成分またはＢＲＥＴペアの第２の構成成分中の遊離システイン（例えば、天然に存在するシステインまたは変異によって導入されたシステイン）と反応してその間に共有結合的な連結を形成するスルフヒドリル反応性部分を備える。他の実施形態において、連結要素は、抗体、抗体様分子、抗原、ＢＲＥＴペアの第１の構成成分またはＢＲＥＴペアの第２の構成成分中のリシン残基（例えば、天然に存在するリシンまたは変異によって導入されたリシン）と反応してその間に共有結合的な連結を形成するアミン反応性部分を備える。他の実施形態において、連結要素は、抗体、抗体様分子、抗原、ＢＲＥＴペアの第１の構成成分またはＢＲＥＴペアの第２の構成成分中のカルボニル基と反応してその間に共有結合的な連結を形成するカルボニル反応性部分を備える。更に別の実施形態において、連結要素は、抗体、抗体様分子、抗原、ＢＲＥＴペアの第１の構成成分またはＢＲＥＴペアの第２の構成成分中のスルフヒドリル反応性部分と反応してその間に共有結合的な連結を形成する遊離システインまたは遊離リシンを備える。更に別の実施形態において、連結要素は、抗体、抗体様分子、抗原、ＢＲＥＴペアの第１の構成成分またはＢＲＥＴペアの第２の構成成分中のアミン反応性部分と反応してその間に共有結合的な連結を形成する遊離リシンを備える。別の実施形態において、連結要素は、抗体、抗体様分子、抗原、ＢＲＥＴペアの第１の構成成分またはＢＲＥＴペアの第２の構成成分中のカルボニル反応性部分と反応してその間に共有結合的な連結を形成するカルボニル基を備える。
スルフヒドリル反応性部分には、チオール、トリフラート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、Ｓ－ピリジル、ハロアセチル（ブロモ－またはヨード－）、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、チオスルホネートイソシアネート及びエポキシド基またはマレイミド部分が含まれる。好ましいスルフヒドリル反応性部分には、マレイミド、アクリルアミド、フェニルカルボニルアクリルアミド及びヨードアセトアミドが含まれる。アミン反応性部分には、活性エステル（限定するものではないが、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、及びスルホジクロロフェノールエステルを含む）、イソチオシアネート、ジクロロトリアジン、アリールハライド、アシルアジド及びスルホニルクロリドが含まれる。これらのアミン反応性部分のうち、活性エステルは、安定したカルボキサミド結合を生成するため、好ましい試薬である（例えば、Ｂａｎｋｓ ａｎｄ Ｐａｑｕｅｔｔｅ，１９９５参照）。カルボニル反応性部分には、ヒドラジド及びアルコキシアミンなど第一級アミンが含まれる。カルボニル含有部分には、アルデヒド（ＲＣＨＯ）及びケトン（ＲＣＯＲ’）が含まれる。いくつかの例において、アルデヒドは、連結要素中の糖基の過ヨウ素酸酸化によって生成される。アルデヒド基と反応することが可能な好適な反応性官能基の例としては、アミン、ヒドラジド及びアルコキシアミンが挙げられる。
反応性官能基の他の例としては、ジアジリン、アリールアジド及びイソシアネートが挙げられる。
一例において、リンカーがＰＥＧを含む場合、マレイミド（Ｍａｌ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）及びアジドからなる群から選択される１つ以上の反応性官能基を含み得、これを使用して、ＰＥＧリンカーを抗体、抗体様分子、抗原、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分または追加のリンカーに結合させることができる。一例において、リンカーは、アジド－（ＰＥＧ）ｎ－ＮＨＳエステル、ＤＢＣＯ－（ＰＥＧ）ｎ－Ｍａｌ、ｍａｌ－（ＰＥＧ）ｎ－ＮＨＳまたはＭａｌ－（ＰＥＧ）ｎ－Ｍａｌを含み、式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０である。
一例において、リンカーがペプチドを含む場合、システイン残基及び／またはリシン残基も含み得る。
一例において、リンカーは、カルボジイミド化合物（例えば、ＥＤＣ）の使用により、官能化され、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分または第２の構成成分に結合される。一例において、リンカーは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド化合物（例えば、スルホ－ＮＨＳ）の存在下で、カルボジイミド化合物（例えば、ＥＤＣ）の使用により、官能化され、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分または第２の構成成分に結合される。
別の例において、リンカーは、Ｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．（２００１）、ＷＯ２００３／１０１９７２及びＭａｌｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００５）に開示されているものなどの様々な「クリックケミストリー」戦略を使用して官能化され結合される。
別の例において、リンカーは、Ｓｏｌｕｌｉｎｋバイオコンジュゲーション化学（Ｈｙｄｒａｌｉｎｋとも呼ぶ）（Ｄｉｒｋｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）を使用して官能化され結合される。簡潔に述べると、Ｓｏｌｕｌｉｎｋバイオコンジュゲーション化学は、以下に示されるように、芳香族ヒドラジンと芳香族アルデヒドの反応に基づいて、安定したビス－アリールヒドラゾンコンジュゲートイオンエレメントを形成するものである：
Figure 2022531246000002
別の例において、リンカーは、４－ホルミルベンズアミドと６－ヒドラジノニコチンアミドの反応から形成されるアルデヒド－芳香族ヒドラジンリンカーを含む。
更なる例において、「リンカー」は、上述のようなトランスグルタミナーゼ反応を介して結合させることができる。更なる例において、「リンカー」は、上述のようなソルターゼ反応を介して結合させることができる。
いくつかの例において、抗体または抗体様分子は、リンカーを介して、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に共有結合的に結合している。いくつかの実施形態において、リンカー（またはその部分）は、抗体または抗体様分子の一体化された部分である（例えば、抗体または抗体様分子及びＣＲＥＴペアの第１の構成成分が、天然に存在するシステインの側鎖を介して直接結合されているような抗体または抗体様分子中に天然に存在するシステイン）。いくつかの実施形態において、リンカー（またはその部分）は、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分の一体化された部分である（例えば、天然に存在するシステイン、ヒスチジン、セリン、チロシンまたはリシンまたは酵素認識配列、好ましくはリシンまたはシステインの側鎖）。いくつかの実施形態において、リンカーは、抗体または抗体様分子をＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合させる別個の化学実体である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される分子（例えば、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している抗体もしくは抗体様分子またはＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している抗原）は、１つ以上のリンカーを含み得る。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１のリンカー。例えば、抗体または抗体様分子は、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分、ドナーまたはアクセプタードメインを結合するための第１、第２、第３、第４または第５のリンカーを有し得る。好ましくは、本明細書に記載される分子は、１つのリンカーを含む。いくつかの実施形態において、リンカーの数は、抗体のヒンジ領域またはその断片中に存在するシステイン残基の数に依存する。
一例において、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分を抗体または抗体様分子に結合するリンカーの長さは、抗原が抗体に結合している場合に、抗体または抗体様分子に結合しているＣＲＥＴペアの第１の構成成分がＣＲＥＴペアの第２の構成成分から好適な距離を取ることができるようにする。当業者であれば、リンカーの長さがＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のＣＲＥＴ（例えば、ＢＲＥＴ）に影響を与え得ることを認識するであろう。したがって、リンカーの好ましい長さは、ＣＲＥＴペアの第１及び第２の構成成分の選択に応じて変わり得る。リンカーの好ましい長さは、本明細書に定義される方法及び当業者に知られている技術を使用して決定することができる。
いくつかの例において、抗原は、リンカーを介して、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に共有結合的に結合している。いくつかの実施形態において、リンカー（またはその部分）は、抗原の一体化された部分である（例えば、天然に存在するシステイン、リシンまたは糖部分）。いくつかの実施形態において、リンカー（またはその部分）は、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分の一体化された部分である（例えば、天然に存在するシステインまたはリシンの側鎖）。いくつかの実施形態において、リンカーは、抗原をＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合させる別個の化学部分である。
一例において、抗体、抗体様分子、抗原、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分またはＣＲＥＴペアの第２の構成成分は、リンカーへの結合のために官能化される。言い換えれば、これらの分子は、抗体、抗体様分子、抗原、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分またはＣＲＥＴペアの第２の構成成分のリンカーへの結合を容易にする化学部分と反応することができる。タンパク質をリンカーに結合させる方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、Ｓｐｉｃｅｒ ＆ Ｄａｖｉｓ（２０１４）及びＢｏｕｔｕｒｅｉｒａ ＆ Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ（２０１５）を参照されたい。
結合部位
当業者によって理解されるように、抗体または抗体様分子のＣＲＥＴペアの第１の構成成分への結合部位及び抗原のＣＲＥＴペアの第２の構成成分への結合部位は、抗原の抗体または抗体様分子への結合を著しく阻害しないものである。いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分及び／または第２の構成成分の結合は、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分及び／または第２の構成成分に結合していない場合の抗原の抗体または抗体様分子への結合と比較した場合、抗原の抗体または抗体様分子への結合を５０％未満、６０％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、９５％未満、９８％未満、または９９％未満減少させる。言い換えれば、標識された抗原は、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している抗体または抗体様分子に結合することが可能である。いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している抗体または抗体様分子からなる複合体が形成され、標識された抗原は、１００μＭ以下、１０μＭ以下、１μＭ以下、５００ｍＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、５００ｐＭ以下または１００ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）を有する。結合は、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分及び／または第２の構成成分の活性を著しく阻害しないものである。いくつかの実施形態において、結合は、抗原、抗体または抗体様分子に結合していない場合のＣＲＥＴペアの第１及び／または第２の構成成分の活性と比較した場合、ＣＲＥＴペアの第１及び／または第２の構成成分の活性を５０％未満、６０％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、９５％未満、９８％未満、または９９％未満減少させる。
いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分は、抗体または抗体様分子の抗原結合部位に結合していない。いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子とＣＲＥＴペアの第１の構成成分との間の結合は、部位特異的である。いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分は、抗体または抗体様分子の残基の側鎖に結合している。残基は、システイン、リシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり得る。好ましくは、残基は、システインである。いくつかの実施形態において、システインは、天然に存在するシステイン、例えば、天然配列中に存在するものである。代替的な実施形態において、システインは、天然抗体または抗体様分子の配列中に存在しない操作されたシステインである。いくつかの実施形態において、システインは、鎖間ジスルフィド結合に関与するものである。結合前に、鎖間ジスルフィド結合は、還元剤、例えば、ＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、ＭＥＡ（２－メルカプトエチルアミン、システアミン）または２－メルカプトエタノールで処理することによって還元される。好ましくは、還元剤は、ＭＥＡまたはＴＣＥＰなどの穏やかな還元剤である（例えば、Ｋｉｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６参照）。反応条件は、部分的に還元された抗体の収率を最適化するために、変えることができる（例えば、還元剤の濃度、ｐＨ、温度、還元剤、時間）。いくつかの実施形態において、部分的に還元された抗体または抗体様分子は、穏やかな酸化に供され、例えば、極めて近接して位置するシステイン残基の間のジスルフィド結合の再形成を促進する。例えば、いくつかの実施形態において、部分的に還元された抗体は、デヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）で処理される。いくつかの実施形態において、残基は、抗体または抗体様分子のヒンジ領域内のシステインであるか、あるいは、残基は、重鎖－軽鎖ジスルフィド結合に関与するシステインであるか、あるいは、両方の組み合わせである。いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子はヒンジ領域を有する抗体であり、結合点は抗体のヒンジ領域内のシステインである。
いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分は、抗体または抗体様分子のＮ末端またはＣ末端に結合している。一例において、結合は、ペプチド結合を介する。
抗体または抗体様分子は、翻訳後修飾され得る（例えば、グリコシル化）。いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分は、翻訳後修飾を介して、抗体または抗体様分子に結合している。例えば、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分は、炭水化物部分を介して、抗体または抗体様分子に結合することができる。本明細書で使用されるとき、「炭水化物部分」という用語は、糖質、多糖、オリゴ糖、及び糖を含み、その定義は、炭水化物化学の分野ではよく知られている。抗体または抗体様分子の炭水化物部分にポリペプチドを結合させる方法は、当業者に知られている。抗体の炭水化物部分にポリペプチドを結合させる方法は、例えば、ＵＳ６，２１８，１６０に記載されている。
いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分は、抗原に部位特異的に結合している。いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分は、抗原の残基の側鎖に結合している。残基は、システイン、リシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり得る。好ましくは、残基は、システインまたはリシンである。いくつかの実施形態において、残基は、天然に存在する残基、例えば、ポリペプチドの天然配列中に存在するものである。代替的な実施形態において、残基は、ポリペプチドの天然配列中に存在しない操作された残基である。いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分は、抗原のＮ末端またはＣ末端に結合している。一例において、結合は、ペプチド結合を介する。例えば、単一ポリペプチドのＣＲＥＴペアの第２の構成成分及び抗原。
いくつかの実施形態において、抗原は、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分の残基の側鎖に結合している。残基は、システイン、リシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり得る。好ましくは、残基は、システインまたはリシンである。一例において、残基は、リシンである。いくつかの実施形態において、残基は、天然に存在する残基、例えば、ポリペプチドの天然配列中に存在するものである。代替的な実施形態において、残基は、ポリペプチドの天然配列中に存在しない操作された残基である。
化学発光共鳴エネルギー転移
本開示の抗体または抗体様分子に分析物が結合すると、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が低下する。エネルギー転移の効率の低下は、分析物が試料中に存在することを示す（図１参照）。
化学発光は、触媒の存在下での有機色素と酸化剤との間の化学反応の結果である。化学発光の放出は、化学的に誘導された有機色素の励起状態からのエネルギーが基底状態に減衰することで生じる。化学発光の放出の持続時間及び強度は、反応溶液中に存在する化学試薬の程度に主に依存する。「化学発光」という用語は、本明細書において、酵素の活性に依存する生物発光を包含するように使用される。本明細書で使用されるとき、化学発光共鳴エネルギー転移（ＣＲＥＴ）とは、化学発光ドナーとアクセプター分子との間のエネルギーの非放射性移動に基づく近接アッセイである。本明細書で使用されるとき、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）とは、生物発光タンパク質ドナーとアクセプター分子との間のエネルギーの非放射性移動に基づく近接アッセイである。
Ａ．ドナードメイン
ＣＲＥＴペアの第１の構成成分または第２の構成成分の一方は、ドナードメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴの第１の構成成分は、ドナードメインである。代替的な実施形態において、ＣＲＥＴの第２の構成成分は、ドナードメインである。
本明細書で使用されるとき、「ドナードメイン」という用語は、光を発する分子、例えば、ある特定の波長の光を照射すると光を発する分子、または化学反応の結果として発光が生じる分子を意味する。ドナードメインは、化学発光共鳴エネルギー転移ペア（例えば、ＢＲＥＴペア）のドナードメインとして機能することが可能であり、文脈に応じて、本明細書中において「化学発光共鳴エネルギー転移ドナードメイン」または「ＣＲＥＴドナードメイン」とも呼ばれる。好ましい実施形態において、ＣＲＥＴペアは、ＢＲＥＴペアであり、ドナードメインは、「生物発光共鳴エネルギー転移ドナードメイン」または「ＢＲＥＴドナードメイン」と呼ばれる。
好適なドナードメインには、ＢＲＥＴペアのドナードメインとして機能することが可能な化学発光ドメインが含まれる。例えば、ドナードメインは、化学発光ドナードメインであり得る。好ましい実施形態において、化学発光ドナードメインは、生物発光タンパク質である。本明細書で使用されるとき、「生物発光タンパク質」という用語は、好適な基質に作用して発光を生成することが可能な任意のタンパク質を指す。当該技術分野において、生物発光タンパク質は、基質を活性化された生成物に変換する酵素であり、活性化された生成物は、次いで、緩和するときにエネルギーを放出すると理解される。活性化された生成物（生物発光タンパク質の基質に対する活性によって生成される）は、アクセプター分子に転移する生物発光タンパク質生成発光の源である。
任意の好適な生物発光タンパク質が本開示のセンサーに使用され得る。多種多様な生物発光タンパク質を本発明に採用することができる（例えば、表１参照）。発光系は、細菌、原生生物、腔腸動物、軟体動物、魚類、多足類、ハエ目、真菌、蠕虫、甲殻類、及び甲虫、特に、Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ属のコメツキムシ、ならびにＰｈｏｔｉｎｕｓ、Ｐｈｏｔｕｒｉｓ、及びＬｕｃｉｏｌａ属のホタルを含む、多くの発光生物が知られており、これらから単離されている。生物発光を呈する追加の生物は、ＷＯ００／０２４８７８、ＷＯ９９／０４９０１９及びＶｉｖｉａｎｉ（２００２）に列挙されている。
Figure 2022531246000003
Figure 2022531246000004
Figure 2022531246000005
極めてよく知られた１つの例は、ルシフェラーゼとして知られるタンパク質のクラスであり、ルシフェラーゼ活性を有する酵素によって特定の生化学物質ルシフェリン（天然に存在するフルオロフォア）が酸化されることでエネルギーを生み出す化学反応を触媒するタンパク質である（Ｈａｓｔｉｎｇｓ，１９９６）。細菌、藻類、真菌、昆虫、魚類及び他の海洋生物形態の種を含む、原核生物及び真核生物を問わない、多種多様な生物は、この様式で光エネルギーを放出することができ、そのそれぞれが他の生物とは化学的に異なる特定のルシフェラーゼ活性及びルシフェリンを有する。ルシフェリン／ルシフェラーゼ系は、形態、化学及び機能において非常に多様である。そのため、ルシフェラーゼ活性を有する生物発光タンパク質は、様々な供給源または様々な手段から入手可能である。ルシフェラーゼ活性を有する生物発光タンパク質の例は、ＵＳ５，２２９，２８５、５，２１９，７３７、５，８４３，７４６、５，１９６，５２４、及び５，６７０，３５６に見出すことができる。最も広く使用されているルシフェラーゼのうちの２つは、（ｉ）３５ｋＤａのタンパク質であり、基質としてセレンテラジンを使用し、４８０ｎｍの光を放出する、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（Ｒ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来）（Ｌｏｒｅｎｚ ｅｔ ａｌ．，１９９１）；及び（ｉｉ）６１ｋＤａのタンパク質であり、基質としてルシフェリンを使用し、５６０ｎｍの光を放出する、ホタルルシフェラーゼ（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ由来）（ｄｅ Ｗｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７）である。
Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来）は、生化学アッセイに使用されている（Ｖｅｒｈａｅｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼは、２０ｋＤａのタンパク質であり、迅速な反応でセレンテラジンを酸化し、それにより４７０ｎｍの明るい光を放出する。
本発明に有用なルシフェラーゼは、Ａｎａｃｈｎｏｃａｍｐａ ｓｐからも特徴付けられている（ＷＯ２００７／０１９６３４）。これらの酵素は、約５９ｋＤａの大きさであり、スペクトルの青色部分内に発光スペクトルを持つ発光反応を触媒する、ＡＴＰ依存性ルシフェラーゼである。
天然に存在する生物発光タンパク質の生物学的に活性なバリアントまたは断片は、当業者によって容易に作製され得る。本発明に有用なそのようなバリアントの３つの例は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼのそれぞれバリアントである、ＲＬｕｃ２（Ｌｏｅｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６）、ＲＬｕｃ８（Ｌｏｅｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６）及びＲＬｕｃ８．６－５３５（Ｌｏｅｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）である。更に好ましい実施形態において、ドナードメインの配列は、天然Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを組み込んでいる分子よりも熱安定性が高くなるように選択される。ＲＬｕｃ２またはＲＬｕｃ８は、好適な選択の簡便な例であり、天然Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ配列を組み込んでいるセンサーよりも５倍以上または１０倍以上高い発光を呈する。そのような増強された発光は、任意の所与の時間分解能で試薬をより経済的に使用できることになることから、大きな利点を有する。
本発明に採用することができる代替的な非ルシフェラーゼの生物発光タンパク質は、好適な基質に作用して発光シグナルを生成することができる任意の酵素である。そのような酵素の具体例は、β－ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－グルクロニダーゼ及びβ－グルコシダーゼである。これらの酵素の合成発光基質は、当該技術分野においてよく知られており、Ｔｒｏｐｉｘ Ｉｎｃ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）などの企業から市販されている。
本発明に有用なペルオキシダーゼの例は、Ｈｕｓｈｐｕｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００７）に記載されている。
いくつかの実施形態において、生物発光タンパク質は、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－グルクロニダーゼまたはβ－グルコシダーゼである。いくつかの実施形態において、生物発光タンパク質は、ルシフェラーゼである。好適なルシフェラーゼには、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ（例えば、ＰｐｙＲＥ８、ＰｐｙＲＥ１０）、Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｔｅルシフェラーゼ、北アメリカグローワームルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、鉄道虫ルシフェラーゼ、バクテリアルシフェラーゼ、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、イクオリン、Ａｒａｃｈｎｏｃａｍｐａルシフェラーゼ、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓルシフェラーゼ、またはこれらのいずれか１つの生物学的に活性なバリアントもしくは断片、またはこれらの２つ以上のキメラが含まれるが、これらに限定されない。一例において、好ましいルシフェラーゼは、ＲＬｕｃ８またはそのバリアントである。
本明細書で使用されるとき、「生物学的に活性な断片」は、本明細書に記載されるポリペプチドの一部であり、完全長ポリペプチドの定義された活性を維持しているものである。本明細書で使用されるとき、「生物学的に活性なバリアント」は、天然に存在する及び／または定義された分子とは１つ以上のアミノ酸が異なるが、生物学的に活性な断片に関して上に定義するような定義された活性を維持する分子である。生物学的に活性なバリアントは、典型的に、天然に存在する及び／または定義された分子に対して、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、更により好ましくは少なくとも９９％同一である。
一実施形態において、立体障害による相互作用の阻害を防ぐために、分子量の小さい生物発光タンパク質が使用される。生物発光タンパク質は、好ましくは、単一のポリペプチド鎖からなる。また、生物発光タンパク質は、好ましくは、オリゴマーまたはアグリゲートを形成しない。生物発光タンパク質のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ及びホタルルシフェラーゼは、これらの基準の全てまたは大部分を満たす。
いくつかの実施形態において、化学発光ドナードメインは、基質を修飾することが可能である。本明細書で使用されるとき、「基質」という用語は、化学発光ドナーとともに使用して、発光を発生または吸収することができる任意の分子を指す。基質の選択は、化学発光ドナーによって生成される光の波長及び強度に影響を与え得る。いくつかの実施形態において、生物発光タンパク質は、ルシフェリン、カルシウム、セレンテラジン、フリマジン、またはセレンテラジン、ルシフェリンもしくはフリマジンの誘導体、類似体もしくは安定化された誘導体から選択される基質を有する。
セレンテラジンは、広く知られた基質であり、刺胞動物、橈脚類、毛顎動物、有櫛動物、十脚目エビ、アミ目エビ、放散虫及び一部の魚分類群に存在する（Ｇｒｅｅｒ ａｎｄ Ｓｚａｌａｙ，２００２）。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼについては、例えば、セレンテラジン類似体／誘導体が利用可能であり、４１８～５４７ｎｍの発光を生じる（Ｉｎｏｕｙｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｌｏｅｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）。セレンテラジン類似体／誘導体（４００Ａ、ＤｅｅｐＢｌｕｅＣ）は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを用いると４００ｎｍで発光することが記載されている（ＷＯ０１／４６６９１）。セレンテラジン類似体／誘導体の他の例は、ＥｎｄｕＲｅｎ、Ｐｒｏｌｕｍｅ ｐｕｒｐｌｅ、Ｐｒｏｌｕｍｅ ｐｕｒｐｌｅ ＩＩ、Ｐｒｏｌｕｍｅ ｐｕｒｐｌｅ ＩＩＩ、ＶｉｖｉＲｅｎ及びフリマジンである。セレンテラジン類似体／誘導体の他の例としては、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３０５７６６０及びＵＳ２０１４０３０２５３９に開示されている化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「ルシフェリン」という用語は、広義に定義され、生物発光が可能な生物に見られる一群の発光性の生物学的色素、更には、酵素のルシフェラーゼの存在下で酸化されるとオキシルシフェリン及び光の形態のエネルギーを生成する合成類似体または機能的に等価な化学物質を指す。Ｄ－ルシフェリン、または２－（６－ヒドロキシベンゾチアゾール－２－イル）－２－チアゾリン－４－カルボン酸がＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのホタルから最初に単離された。それ以降、化学的に異なるルシフェリンの様々な形態が多種多様な生物、主に海洋生物、例えば、魚及びイカから発見され、研究されているが、陸上生物、例えば、蠕虫、甲虫及び様々な他の昆虫においても多く特定されている（Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｖｉｖｉａｎｉ，２００２）。本明細書で使用されるとき、ルシフェリンは、ルシフェリンの誘導体または類似体も含む。
環状アルキルアミノルシフェリン（ＣｙｃＬｕｃ１）などの完全に合成のルシフェリンに加えて、生物学的に進化したルシフェリンには少なくとも５つの一般的な種類があり、そのそれぞれは、化学的に異なり、化学的及び構造的に異なるルシフェラーゼによって触媒され、広範な異なる補助因子を採用する。１つ目は、ホタルルシフェラーゼの基質であるホタルルシフェリンであり、触媒作用にはＡＴＰを必要とする（ＥＣ１．１３．１２．７）。２つ目は、一部のイカ及び魚類にも見られるバクテリアルシフェリンであり、長鎖アルデヒド及び還元型リン酸リボフラビンからなる。バクテリアルシフェラーゼは、ＦＭＮＨ依存性である。３つ目は、渦鞭毛藻類ルシフェリンであり、夜の海のリン光に関与する生物である渦鞭毛藻類（海洋性プランクトン）に見られるテトラピロールクロロフィル誘導体である。渦鞭毛藻類ルシフェラーゼは、渦鞭毛藻類ルシフェリンの酸化を触媒し、３つの同一の触媒活性ドメインからなる。４つ目は、イミダゾロピラジンヴァルグリンであり、ある特定の貝虫及び深海魚、例えば、Ｐｏｒｉｃｈｔｈｙｓに見られる。最後は、セレンテラジン（イミダゾールピラジン）であり、放散虫、有櫛動物、刺胞動物、イカ、橈脚類、毛顎動物、魚類及びエビに見られるタンパク質イクオリンの発光体である。
いくつかの実施形態において、生物発光タンパク質は、補助因子を必要とする。補助因子の例としては、ＡＴＰ、マグネシウム、酸素、ＦＭＮＨ2、カルシウム、またはその任意の２つ以上の組み合わせが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。
Ｂ．アクセプタードメイン
ＣＲＥＴペアの第１の構成成分または第２の構成成分の一方は、アクセプタードメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴの第１の構成成分は、アクセプタードメインである。代替的な実施形態において、ＣＲＥＴの第２の構成成分は、アクセプタードメインである。
アクセプタードメインは、化学発光共鳴エネルギー転移ペア（例えば、ＢＲＥＴペア）のアクセプタードメインとして機能することが可能であり、文脈に応じて、本明細書において「化学発光共鳴エネルギー転移アクセプタードメイン」または「ＣＲＥＴアクセプタードメイン」とも呼ばれる。好ましい実施形態において、ＣＲＥＴペアは、ＢＲＥＴペアであり、アクセプタードメインは、「生物発光共鳴エネルギー転移ドナードメイン」または「ＢＲＥＴドナードメイン」と呼ばれる。本明細書で使用されるとき、「アクセプタードメイン」は、ドナードメインの活性の結果として放出されるエネルギーを受け入れることが可能な任意の分子である。アクセプタードメインは、タンパク質または非タンパク質のアクセプタードメインであり得る。
いくつかの実施形態において、アクセプタードメイン（本明細書において「アクセプター分子」とも呼ばれる）は、蛍光アクセプタードメインである。本明細書で使用されるとき、「蛍光アクセプタードメイン」（本明細書において「蛍光アクセプター分子」とも呼ばれる）という用語は、ドナードメインの活性の結果として放出されるエネルギーを受け入れ、それを光エネルギーとして再放出することができる任意の化合物を指す。蛍光アクセプタードメインは、タンパク質または非タンパク質の蛍光アクセプタードメインであり得る。
多種多様なアクセプタードメインを本発明に採用することができる。いくつかの実施形態において、アクセプタードメインは、タンパク質、有機低分子、希土類元素キレート及び量子ドットからなる群から選択される。好ましいアクセプタードメインは、タンパク質である。いくつかの実施形態において、アクセプタードメインは、有機低分子、希土類元素キレートまたは量子ドットではない。いくつかの実施形態において、アクセプタードメインは、有機低分子ではない。いくつかの実施形態において、アクセプタードメインは、希土類元素キレートではない。いくつかの実施形態において、アクセプタードメインは、量子ドットではない。
いくつかの実施形態において、蛍光アクセプタードメインは、蛍光タンパク質である。非常によく知られている１つの例は、フルオロフォア群であり、クラゲのＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａに由来する緑色蛍光タンパク質、ならびに分子生物学の応用、例えば、変異導入及びキメラタンパク質技術（Ｔｓｉｅｎ，１９９８）から生じる多数の他のバリアント（ＧＦＰ）を含む。ＧＦＰは、その蛍光団の特徴的な構成成分に基づいて分類され、各クラスは、明確な励起波長及び蛍光波長を有する：クラス１は、中性フェノールとアニオン性フェノレートの野生型混合物、クラス２は、フェノレートアニオン、クラス３は、中性フェノール、クラス４は、スタック型ｓ電子系のフェノレートアニオン、クラス５は、インドール、クラス６は、イミダゾール、クラス７は、フェニルである。
変異した天然に存在するアクセプター分子（バリアント）もまた本発明に有用であり得る。ＢＲＥＴに好適な操作された系の一例は、媒介タンパク質（複数可）（この場合、Ｇタンパク質共役受容体）が存在しない場合で、単独では有意な程度に互いに直接相互作用しないＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼと改良されたＧＦＰの黄色変異体（ＥＹＦＰ）のペアリングである（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの青色蛍光バリアント（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光バリアント（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光バリアント（ＹＦＰ）、改良されたＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、スーパーファルダーＧＦＰ、Ａｚａｍｉ ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、ＴａｇＧＦＰ、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、改良されたＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、ＣｙＰＥＴ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ－Ｉｓｈｉ ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１（Ｔｅａｌ）、改良されたＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＯｒａｎｇｅ、Ｔｏｐａｚ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＴａｇＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ｄＫｅｉｍａ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｔ－ＨｃＲｅｄ、ＡＱ１４３、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ｔ－ダイマー２、ｔダイマー２（１２）、ｍＲＦＰ１、ｍＴａｎｇａｒｉｎｅ、ポシロポリン、Ｒｅｎｉｌｌａ ＧＦＰ、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ ＧＦＰ、Ｍｏｎｓｔｅｒ ＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅタンパク質、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲｕｂｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ＪＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ＴａｇＲＦＰ、ＴｕｒＢｏＦＰ、及びＲ－フィコエリトリン（Ｒ－ＰＥ）、Ｂ－フィコエリトリン（Ｂ－ＰＥ）、Ｃ－フィコシアニン（ＣＰＣ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）及びＲ－フィコシアニン（ＲＰＣ）を含むフィコビリタンパク質、ならびにこれらのいずれか１つの生物学的に活性なバリアントまたは断片が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、好ましい蛍光アクセプタードメインは、ＧＦＰである。いくつかの実施形態において、好ましい蛍光アクセプタードメインは、ＧＦＰ2である。
代替的な実施形態において、アクセプタードメインは、非タンパク質のアクセプタードメインである。いくつかの実施形態において、非タンパク質のアクセプタードメインは、蛍光アクセプタードメインまたはクエンチャーであり得る。本明細書で使用されるとき、「クエンチャー」という用語は、ドナードメインの活性の結果として放出されるエネルギーを受け入れることができ、それを光エネルギーとして再放出しない任意の化合物を指す。非蛍光アクセプターは、クエンチャーであり得る。
任意の好適な非タンパク質の蛍光アクセプタードメインを使用することができる。いくつかの実施形態において、アクセプタードメインは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ色素、Ｃｙ色素、フルオレセイン、ダンシル、ウンベリフェロン、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、テトラメチルローダミン、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、クマリン、ホウ素ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）、レゾルフィン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、希土類元素キレート、またはこれらの任意の組み合わせもしくは誘導体からなる群から選択される。誘導体の例としては、アミン反応性誘導体、アルデヒド／ケトン反応性誘導体、シトシン反応性またはスルフヒドリル反応性誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、アクセプタードメインは、フルオレセインまたはその誘導体である。好適な誘導体には、アミン反応性フルオレセイン誘導体、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＮＨＳ－フルオレセイン、ＮＨＳ－ＬＣ－フルオレセイン、スルフヒドリル反応性フルオレセイン誘導体、５－（及び６）－ヨードアセトアミド－フルオレセイン、フルオレセイン－５－マレイミド、フルオレセイン－６－マレイミド、ＳＡＭＳＡ－フルオレセイン、アルデヒド／ケトン及びシトシン反応性フルオレセイン誘導体、フルオレセイン－５－チオセミカルバジドならびに５－（（（２－（カルボヒドラジン）メチル）チオ）アセチル）－アミノフルオレセインが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、フルオレセイン－５－マレイミド誘導体である。いくつかの実施形態において、アクセプタードメインは、ローダミンまたはその誘導体である。好適な誘導体には、アミン反応性ローダミン誘導体、テトラメチルローダミン－５－（及び６）－イソチオシアネート、ＮＨＳ－ローダミン、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ（商標）ローダミンＢスルホニルクロリド、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ（商標）ローダミンＢスルホニルヒドラジン、スルフヒドリル反応性ローダミン誘導体、テトラメチルローダミン－５－（及び６）－ヨードアセトアミド、アルデヒド／ケトン及びシトシン反応性ローダミン誘導体、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄヒドラジンならびにｔｅｘａｓ ｒｅｄスルホニルクロリドが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、クマリンまたはその誘導体である。好適な誘導体には、アミン反応性クマリン誘導体、ＡＭＣＡ、ＡＭＣＡ－ＮＨＳ、ＡＭＣＡ－スルホ－ＮＨＳ、スルフヒドリル反応性クマリン誘導体、ＡＭＣＡ－ＨＰＤＰ、ＤＣＩＡ、アルデヒド及びケトン反応性クマリン誘導体及びＡＭＣＡ－ヒドラジドが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、アクセプタードメインは、ホウ素ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）またはその誘導体である。好適な誘導体には、アミン反応性ホウ素ジピロメテン色素、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ Ｃ３－ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０ Ｃ３、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０ Ｃ３－ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０ Ｃ３－ヒドラジド、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３ Ｃ３－ヒドラジド、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ Ｃ３－ヒドラジド、スルフヒドリル反応性ホウ素ジピロメテン色素、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ １Ａ、ＢＯＰＤＩＹ ５３０／５５０ １Ａ、Ｂｒ－ＢＯＰＤＩＰＹ ４９３／５０３ならびにアルデヒド及びケトン反応性ホウ素ジピロメテン色素が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、アクセプタードメインは、Ｃｙ（シアニン）色素またはその誘導体である。好適な誘導体には、アミン反応性シアニン色素、チオール反応性シアニン色素及びカルボニル反応性シアニン色素が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、アクセプタードメインは、クエンチャーである。任意の好適なクエンチャーを使用することができる。いくつかの実施形態において、アクセプタードメインは、ＤＡＢＣＹＬ［４－（（４－（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸］、ＤＡＢＳＹＬ（ジメチルアミノアゾスルホン酸）、金及び銀などの金属ナノ粒子、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ）、ＱＳＹ色素ならびにＱＸＬクエンチャーからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ2は、ＤＡＢＣＹＬ［４－（（４－（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸］、ＤＡＢＳＹＬ（ジメチルアミノアゾスルホン酸）、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ）、ＱＳＹ色素及びＱＸＬクエンチャーからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、アクセプタードメインは、量子ドットである。本明細書全体を通じて、量子ドット及びナノクリスタルは、区別なく使用される。本明細書で使用されるとき、「量子ドット」は、周期表のＩＩ－ＶＩ族またはＩＩＩ－Ｖ族の元素の原子で構成される半導体である（例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ及びＩｎＰ）。材料が同じであるが、大きさが異なる量子ドットは、異なる色の光を発することができる。その発光強度は、電子が三次元空間全てで閉じ込められていることによるエネルギー準位の量子化に起因する。バルク半導体では、電子－正孔ペアは、励起子ボーア半径内に束縛されるが、これは半導体の種類ごとに特徴的である。量子ドットは、励起子ボーア半径よりも小さいことから、離散的なエネルギー準位が生じる。半導体の価電子帯と伝導帯の間のバンドギャップΔＥは、ナノクリスタルの大きさと形状に応じて決まる。従来の有機フルオロフォアと比較して、量子ドットは、発光量子収率がわずかに低いが、吸収断面積が非常に大きく、光退色率が極めて低い。量子ドットのモル吸光係数は、約１０５～１０６Ｍ－１ｃｍ－１であり、これは、色素の１０～１００倍の大きさである。本明細書で使用されるとき、「量子収率」は、元のエネルギー供与に対する最終的な発光の尺度を指す。
目的に好適な任意の量子ドットが使用され得る。いくつかの実施形態において、量子ドットの光学特性は、シェルを合成するよって操作することができる。典型的には、シェルは、安定化シェルである。そのような量子ドットは、コア－シェル型量子ドットとして知られており、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＣｄＳｅが含まれるが、これらに限定されない。コア／シェル型量子ドットは、バンドギャップの小さいコアの周りにバンドギャップの大きいシェルを有し、シェルによるいかなる吸収もなく発光する。シェルは、コアからの表面の非放射性発光を不活性化し、それにより、フォトルミネセンス量子収率が向上し、自然劣化が防止される。タイプＩの量子ドット（ＣｄＳｅ／ＺｎＳなど）のシェルは、コアに比べて伝導帯のエネルギーが高く、価電子帯のエネルギーが低いため、電子と正孔の両方がコアに閉じ込められている。タイプＩＩの量子ドット（ＣｄＴｅ／ＣｄＳｅ及びＣｄＳｅ／ＺｎＴｅなど）のシェルの伝導帯及び価電子帯は、コアよりもエネルギーがともに低いか、またはともに高いかのいずれかである。そのため、電子と正孔の動きは、一次元に制限される。コア－シェル界面での励起子の発光再結合は、タイプＩＩの発光を引き起こす。タイプＩＩの量子ドットは、バンドエッジ近くでは間接型半導体として挙動するため、赤及び近赤外にまで及ぶ吸収テールを有する。タイプＩ及びＩＩが好ましいが、合金化半導体量子ドット（ＣｄＳｅＴｅ）を使用することもできる。合金組成物及び内部構造を変化させることができ、それにより、粒子サイズを変えることなく光学特性を調整することができる。
いくつかの実施形態において、量子ドットは、ＣｄＳｅ／ＺｎＳコア／シェル型量子ドット、ＣｄＴｅ／ＣｄＳｅコア／シェル型量子ドット、ＣｄＳｅ／ＺｎＴｅコア／シェル型量子ドット、及び合金化半導体量子ドット（例えば、ＣｄＳｅＴｅ）からなる群から選択される。
多重センサー（多重検出）を作製するために異なる色の発光が必要とされる場合、これは、量子ドットコアの大きさを変えて、異なる発光波長を得ることによって達成することができる。量子ドットは、当業者に知られている技術によって安定化または不安定化することができる。
Ｃ．ドナードメインとアクセプタードメインのペア（ＣＲＥＴペア）
ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分が一緒になって、ＣＲＥＴペアを形成する。本明細書で使用されるとき、「ＣＲＥＴペア」は、エネルギー転移に参加する分子群を指すために使用される。いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分はＢＲＥＴドナードメインを含み、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分はＢＲＥＴアクセプタードメインを含む。代替的な実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分はＢＲＥＴアクセプタードメインを含み、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分はＢＲＥＴドナードメインを含む。任意数のドナー－アクセプターの組み合わせを使用することができる。ドナー－アクセプターの組み合わせは、ＣＲＥＴペア（例えば、ＢＲＥＴペア）として機能することが可能である必要がある。
当業者であれば、効率的なエネルギー転移を可能にするドナーとアクセプターのペアを選択することができる。好ましい実施形態において、標識された抗原が抗体または抗体様ドメインに結合した場合のドナードメインとアクセプタードメインの距離及び相対配向は、フェルスター距離の±５０％内である。本明細書で使用されるとき、「標識された抗原が抗体または抗体様ドメインに結合した場合のドナードメインとアクセプタードメインの距離及び相対配向」という用語は、Ｒ0の±５０％の範囲内で実施することができる定常状態のＣＲＥＴ測定を指す。この文言は、１０～９０％の範囲内でのドナードメインからアクセプタードメインへの発光エネルギー転移の効率（本明細書において「エネルギー転移の効率」とも呼ばれる）を包含する。本明細書で使用されるとき、「エネルギー転移の効率」という用語は、ドナーの励起イベントごとに励起状態のドナーから基底状態のアクセプターに非放射的に移動するエネルギーの割合を意味する。いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率は、標識された抗原が抗体または抗体様分子に結合した場合、１０～７５％の範囲内である。いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率は、標識された抗原が抗体または抗体様分子に結合した場合、１５～７５％、２０～７５％、２５～７５％、３０～７５％、３５～７５％、４０～７５％、４５～７５％、４５～７５％、５０～７５％、５５～７５％、６０～７５％、６５％～７５％または７０～７５％の範囲内である。他の実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率は、標識された抗原が抗体または抗体様分子に結合した場合、１０～７０％、１０～６５％、１０～６０％、１０～５５％、１０～５０％、１０～４５％、１０～４０％、１０～３５％、１０～３０％、１０～２５％、１０～２０％または１０～１５％の範囲内である。
いくつかの実施形態において、化学発光ドナードメインとアクセプタードメインのフェルスター距離は、少なくとも４ｎｍ、少なくとも５．６ｎｍ、または少なくとも６ｎｍである。いくつかの実施形態において、フェルスター距離は、１２ｎｍ未満、１１ｎｍ未満、１０ｎｍ未満、または９ｎｍ未満である。いくつかの実施形態において、ドナードメインとアクセプタードメインのフェルスター距離は、約４ｎｍ～約１１ｎｍ、約５．６ｎｍ～約１１ｎｍ、または約７ｎｍ～約１１ｎｍである。いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアのフェルスター距離は、約４ｎｍ～約１８ｎｍであるか、または約６ｎｍ～約１２ｎｍであるか、または約７．５ｎｍ～１０．５ｎｍである。
好適なペアリングを決定する際に考慮されるべき基準は、ドナー分子と比較したアクセプター分子の相対的な発光／蛍光スペクトルである。ドナーの発光スペクトルは、アクセプター分子の吸光スペクトルと重なっている必要があり、それにより、ドナーの発光からの光エネルギーがアクセプター分子を励起し、２つの分子が互いに適切な近接性及び配向であるときにアクセプター分子の蛍光が促進することが可能な波長となる。例えば、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ／ＥＧＦＰペアリングは、観察可能な発光スペクトルピークに基づくと、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ／ＥＹＥＦペアリングほど良好ではないことが実証されている（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７ ｉｎ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｐｈｏｔｏｎｓ，ｅｄｓ．Ｈａｓｔｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．，（Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．４１９－４２２）。潜在的なペアリングを研究するには、タンパク質融合体（例えば）を、選択されたドナー及びアクセプタードメインを含有するように調製し、必要に応じて、適切な基質の存在下で試験を行う。
また、ドナーとアクセプタードメインが互いに偽りなく会合するかどうかを確認する必要がある。例えば、これは、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分を同じ細胞内で別個に共発現させ、次いで、エネルギー転移が生じるかどうかを決定するために、発光スペクトルをモニタリングすることで達成することができる。これは、例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９）の方法を使用して、達成され得る。選択されたＣＲＥＴペアの第１の構成成分及びＣＲＥＴペアの第２の構成成分は、ＣＲＥＴがほとんどまたは全く観察されない場合、好適なＣＲＥＴペアを形成する。
いくつかの実施形態において、ドナーの発光は、基質への修飾によって操作することができる。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの場合、基質は、セレンテラジンである。ドナーの発光を変更させる根本的な理由は、ドナーの発光とアクセプターの発光の間の分解能を向上することである。元来のＢＲＥＴ系は、ドナーとしてＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを使用し、アクセプターとしてＥＹＦＰ（またはＴｏｐａｚ）を使用し、基質としてセレンテラジンｈ誘導体を使用する。これらの構成成分は、ＢＲＥＴアッセイにおいて組み合わさったとき、生物発光タンパク質は４７５～４８０ｎｍの範囲、アクセプター分子は５２５～５３０ｎｍの範囲の光を生成し、４５～５５ｎｍのスペクトル分解能をもたらす。
残念ながら、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは、ＧＦＰの発光と実質的に重なる幅広い発光ピークを発生することから、系のシグナル対ノイズを低下させる要因となる。本発明に使用される１つのＢＲＥＴ系は、ｃｏｅｌ４００ａをＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの基質としており、ドナーとアクセプターの発光波長に幅広いスペクトル分解能を提供する（約１０５ｎｍ）。ｃｏｅｌ４００ａを用いたＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは３９０～４００ｎｍの光を生成し、この範囲の光を吸収して５０５～５０８ｎｍの光を再放出するＧＦＰ誘導体（ＧＦＰ2）が調製された。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発光とＧＦＰ発光の間のスペクトル分解能が増加することで、このＢＲＥＴ系は、本出願のセンサーへの炭水化物の結合をモニターするための優れた生物学的ツールを提供する。しかしながら、より小さなストークシフトＢＲＥＴ系も炭水化物の高感度測定を可能にするだろう。
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性の結果として様々な波長の光（野生型セレンテラジンによって生成されるものとは異なる）を生成する様々なセレンテラジン誘導体が、ｃｏｅｌ４００ａを含め、当該技術分野において知られている。当業者であれば、ドナーの発光ピークが変更されているので、この波長の光を吸収するアクセプター分子を選択することが必要であり、それにより、効率的なエネルギー転移が可能になることを理解するであろう。これは、例えば、クラス４のＧＦＰをクラス３または１のＧＦＰになるように改変することによって行うことができる。ドナーの発光とアクセプターの光吸収ピークの間で重複するスペクトルは、特に、効率的なエネルギー転移の１つの条件である。クラス３及び１のＧＦＰは、４００ｎｍの光を吸収し、５０５～５１１ｎｍで再放出することが知られている。これにより、ドナー発光とアクセプター発光の間の波長差は、およそ１１１ｎｍとなる。
更なる生物発光タンパク質とアクセプター分子ペアの例は、表２に記載される。


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いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペア（本明細書において免疫センサーとも呼ばれる）であって、
ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している、分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子と、
ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原と、を含み、
標識された抗原が抗体または抗体様分子に結合した場合、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が１０～７５％の範囲内である、ＣＲＥＴペアが提供される。ＣＲＥＴペアの構成成分は、本明細書に定義されるとおりである。
いくつかの実施形態において、好ましいＣＲＥＴペアは、ＲＬｕｃ８及びＧＦＰ2を含む。一例において、抗体または抗体様分子はＲＬｕｃ８に結合しており、標識された抗原はＧＦＰ2に結合している。別の例において、抗体または抗体様分子はＧＦＰ2に結合しており、標識された抗原はＲＬｕｃ８に結合している。
分析物の検出
図１に示されるように、分析物が存在しない場合、標識された抗原は、抗体または抗体様分子に結合することができ、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分及び第２の構成成分が一緒になり、その結果、基質の存在下で２つの構成成分の間でＣＲＥＴが生じる。分析物が存在する場合、分析物は、抗体または抗体様分子への結合に対して、標識された抗原と競合し、その結果、基質の存在下で、２つの構成成分の間のＣＲＥＴが低下する。言い換えれば、本開示の抗体または抗体様分子に分析物が結合すると、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に対するＣＲＥＴペアの第１の構成成分の空間的位置及び／または双極子配向が変化する。本明細書で使用されるとき、「空間的位置」という用語は、アクセプター分子に対するドナーの三次元的な位置関係を指し、これは、分析物の抗体または抗体様分子への結合または放出の結果として変化する。
本明細書で使用されるとき、「双極子配向」という用語は、ドナー分子及び／またはアクセプター分子のいずれかに関連する双極子モーメントの三次元空間の配向に相対的な三次元空間における配向を指す。双極子モーメントは、分子全体の電荷の変動の結果である。
エネルギー転移の効率は、レシオメトリックに決定することができる（例えば、ＣＲＥＴ比、好ましくは、ＢＲＥＴ比）。ＢＲＥＴを一例に取ると、いくつかの実施形態において、本開示の抗体または抗体様分子に対する分析物の結合は、ＢＲＥＴ比の低下によって示される。言い換えれば、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率の低下は、ＢＲＥＴ比の低下によって示される。
一実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分（例えば、生物発光タンパク質）とＣＲＥＴペアの第２の構成成分（例えば、アクセプター分子）の間に生じるエネルギー転移は、特定の波長を選択する光学フィルター（１つはアクセプター分子の発光に対するものであり、もう１つは生物発光タンパク質の発光に対するもの）を使用して測定された発光から算出された比として表される（式１参照）。
Ｅa／Ｅd＝ＢＲＥＴ比（１）
式中、Ｅaは、アクセプター分子の発光強度と定義され（発光は、アクセプターの発光に適合する特定のフィルターを使用して選択される）、Ｅdは、生物発光タンパク質の発光強度と定義される（発光は、生物発光タンパク質の発光に適合する特定のフィルターを使用して選択される）。
光学フィルターは、ＢＲＥＴに好適な波長識別を可能にする任意の種類のフィルターであってよいことは、当業者には容易に認識されるはずである。例えば、本発明に従って使用される光学フィルターは、干渉フィルター、ロングパスフィルター、ショートパスフィルターなどであり得る。フィルターを通過する波長の強度（通常、１秒あたりのカウント（ＣＰＳ）または相対発光量（ＲＬＵ））は、光電子増倍管（ＰＭＴ）、カスケードフォトダイオード、フォトダイオードアレイを含むフォトダイオード、または電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラなどの高感度カメラのいずれかを使用して定量化することができる。その後、定量化されたシグナルを、ＢＲＥＴ比を算出するために使用し、エネルギー転移効率を表す。ＢＲＥＴ比は、アクセプターの発光強度が増加するにつれて、大きくなる。
一般に、アクセプターの発光強度のドナーの発光強度に対する比が決定され（式１参照）、これは、エネルギー転移効率を反映する任意の単位で表される数である。比は、エネルギー転移効率が増加するにつれて、大きくなる（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９参照）。
エネルギー転移効率はまた、ドナーの発光強度のアクセプターの発光強度に対する逆の比を使用して表すこともできる（式２参照）。この場合、比は、エネルギー転移効率が増加するにつれて、小さくなる。この算出を行う前に、発光強度は、バックグラウンドの発光及び基質の自家発光の存在を考慮して補正される。この補正は、一般に、基質を含有するが、本発明の生物発光タンパク質、アクセプター分子またはポリペプチドを含有しない対照試料から、適切な波長で測定された発光強度を差し引くことによってなされる。
Ｅd／Ｅa＝ＢＲＥＴ比（２）
式中、Ｅa及びＥdは、上に定義されるとおりである。
生物発光タンパク質及びアクセプター分子の発光強度はまた、分光蛍光光度計、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラまたはダイオードアレイ検出器などのモノクロメーターに基づく機器を使用して定量することができる。分光蛍光光度計を使用して、基質の添加時に生物発光タンパク質とアクセプター分子の両方の発光ピークが検出されるように発光スキャンを実施する。ピーク下面積は、相対光強度を表し、上述したように、これを使用して比を算出する。本発明のＢＲＥＴ系をモニターするには、同じ試料からの生物発光タンパク質及びアクセプター分子の光を測定することが可能な任意の機器を使用することができる。
代替的な実施形態において、ＢＲＥＴの効果的な検出及び／または定量には、アクセプター分子の発光のみが好適である。この場合、エネルギー転移効率は、アクセプターの発光強度のみを使用して表される。エネルギー転移を測定するためには、いかなる比も算出することなく、アクセプターの発光強度を使用することができることは、当業者には容易に認識されるであろう。これは、理想的には、アクセプター分子が、生物発光タンパク質から転移される光を吸収する場合に限り、発光するという事実による。この場合、光フィルターは１つのみ必要である。
関連する実施形態において、ＢＲＥＴの効果的な検出及び／または定量には、生物発光タンパク質の発光のみが好適である。この場合、エネルギー転移効率は、生物発光タンパク質の発光強度のみを使用して算出される。エネルギー転移を測定するためには、いかなる比も算出することなく、ドナーの発光強度を使用することができることは、当業者には容易に認識されるであろう。これは、生物発光タンパク質から転移される光をアクセプター分子が吸収し、それに応じて、生物発光タンパク質からの検出可能な発光が減少するという事実による。この場合、光フィルターは１つのみ必要である。
代替的な実施形態において、エネルギー転移効率は、測定のための光学フィルターを１つのみ必要とするレシオメトリック測定を使用して表される。この場合、ドナーまたはアクセプターの光強度は、適切な光学フィルターを使用して決定され、試料の別の測定は、いかなるフィルターも使用することなくなされる（オープンスペクトルの強度）。この後者の測定の場合、全ての光出力（全ての波長）が定量される。次いで、式３または４のいずれかを使用して比の算出が行われる。式３の場合、アクセプターに対する光学フィルターのみが必要とされる。式４の場合、ドナーに対する光学フィルターのみが必要とされる。
Ｅa／Ｅo－Ｅa＝ＢＲＥＴ比または＝Ｅo－Ｅa／Ｅa（３）
Ｅo－Ｅd／Ｅd＝ＢＲＥＴ比または＝Ｅd／Ｅo－Ｅd（４）
式中、Ｅa及びＥdは、上に定義されるとおりであり、Ｅoは、全ての波長を合わせた発光強度と定義される（オープンスペクトル）。
式１～４から更なる式を導き出すことができることは、当業者には容易に認識されるはずである。例えば、そのような１つの導出は、生物発光タンパク質及び／またはアクセプター分子の発光波長で存在するバックグラウンド発光を補正することを伴う。
ＢＲＥＴアッセイの実施において、ＢＲＥＴＣｏｕｎｔを使用して、各ウェルからの発光を決定することができる。ＢＲＥＴＣｏｕｎｔ機器は、ＴｏｐＣｏｕｎｔを改良したものであり、ＴｏｐＣｏｕｎｔは、Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）によって販売されているマイクロタイタープレートシンチレーション及びルミネセンスカウンターである。２つの光電子増倍管（ＰＭＴ）を同時に利用してバックグラウンドノイズを除去する従来のカウンターとは異なり、ＴｏｐＣｏｕｎｔは、単一のＰＭＴ技術及びノイズ低減のための時間分解型パルス計数を採用することで、標準的な不透明なマイクロタイタープレートでのカウントを可能にしている。不透明なマイクロタイタープレートを使用することで、光学的なクロストークを無視できるレベルにまで低減することができる。ＴｏｐＣｏｕｎｔは、１、２、６及び１２の検出器（ＰＭＴ）を備える様々なフォーマットがあり、それぞれ１、２、６または１２の試料を同時に読み取ることが可能である。ＢＲＥＴＣｏｕｎｔ以外にも、Ｖｉｃｔｏｒ２（Ｗａｌｌａｃ，Ｆｉｎｌａｎｄ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））及びＦｕｓｉｏｎ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｍｅｒｉｄｅｎ）の他の市販の機器でもＢＲＥＴを実施することが可能である。ＢＲＥＴは、少なくともアクセプター分子の発光、好ましくは２つ以上の波長（アクセプター分子及び生物発光タンパク質）を検出することができるリーダーを使用して実施することができる。
ＢＲＥＴは、レシオメトリック技術であり、プレート中の異なるウェルにわたるアッセイ量、アッセイ条件及びシグナル減衰の変化に起因する光出力の揺らぎによって生じるデータ変動性を排除することができる。ＲＥＴをベースにした反応は、均一であり、一般に、固相の結合を伴うことなく溶液中でなされる。これにより、液体、気体、更には微粒子などの様々な形態の分析物を分離することなく検出することが可能である。
ポリペプチド
当業者によって理解されるように、本出願に有用な様々な化学実体は、ポリペプチドを含み得る。例えば、抗体、抗体様分子、抗原、標識された抗原、リンカー、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分及び／またはＣＲＥＴペアの第２の構成成分は、ポリペプチドからなるか、またはそれらを含み得る。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、一般に、区別なく使用され、非アミノ酸基または糖部分などの他の構成成分の付加によって修飾されていてもいなくてもよい単一のポリペプチド鎖を指す。本明細書で使用される「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語はまた、本明細書に記載される本開示のポリペプチドのバリアント、変異体、修飾体、類似体及び／または誘導体を含む。例えば、本明細書に定義される抗体または抗体様分子は、その機能性バリアント、変異体、修飾体、類似体及び／または誘導体を含み得る。バリアント、変異体、修飾体、類似体及び／またはその誘導体は、抗原に特異的に結合する能力を保持している。
ポリペプチド構成成分は、天然ポリペプチドの産生及び回収、組み換えポリペプチドの産生及び回収、ならびにポリペプチドの化学合成を含む、様々な手段で作製することができる。一例において、単離されたポリペプチド構成成分（例えば、抗体）は、ポリペプチドの発現が可能な細胞を、ポリペプチドの産生に効果的な条件下で培養し、ポリペプチドを回収することによって、産生される。有利には、本出願の特定の実施形態において、ポリペプチド構成成分のうちの１つ以上は、市販の業者から購入することができる。例えば、抗体または抗体様分子は、市販の業者から購入し、本開示の免疫センサーを形成するために使用することができる。したがって、任意の市販の抗体または抗体様分子が本開示の使用に好適である。一例において、抗体または抗体様分子は、市販の業者から購入または入手し、次いで、任意選択によりリンカーを介して、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に共有結合的に結合させて、抗体コンジュゲートを形成することができる。
抗体または酵素などのポリペプチドを発現することが可能な様々な例示的な細胞は、以下で考察される。一例において、可能な細胞は、ポリペプチド構成成分をコードするポリヌクレオチドで形質転換されている。本明細書で使用されるとき、「形質転換された」または「形質転換」は、ポリヌクレオチドの組み込みによる、細胞における新しい遺伝子の獲得である。
「ポリヌクレオチド」という用語は、「核酸」という用語と本明細書中で区別なく使用される。「ポリヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチド、核酸分子または任意のその断片を指す。ゲノム起源または合成起源である二本鎖または一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。好適なポリヌクレオチドはまた、発現されたポリペプチドがポリペプチドを産生する細胞から分泌されるように、シグナルペプチド（すなわち、シグナルセグメント核酸配列）などの分泌シグナルをコードしてもよい。好適なシグナルセグメントの例としては、天然シグナル配列だけでなく、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、ウイルスエンベロープ糖タンパク質シグナルセグメント、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｎｅｃｔａｒｉｎシグナルペプチド（ＵＳ５，９３９，２８８）、タバコ延長シグナル、大豆オレオシンオイルボディ結合タンパク質シグナル、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ空胞系キチナーゼシグナルペプチドが挙げられる。加えて、ポリヌクレオチドは、介在配列及び／または非翻訳配列をコードし得る。好適なポリヌクレオチドはまた、発現されたポリペプチドの精製及び／または特定を容易にするポリペプチド配列をコードしてもよい。好適な精製タグの例は、当該技術分野において知られており、ヘキサヒスチジン、ＧＳＴ、Ｔｒｘ、カルモジュリン結合ペプチド、インテイン－キチン結合ドメイン、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ、ＮｕｓＡ、ＳＵＭＯ及びＭＢＰならびにＨＡ、ｃ－ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｈａｌｏｔａｇ及びビオチンなどのエピトープタグが挙げられるが、これらに限定されない。好適なポリヌクレオチドはまた、精製タグ及び／または識別タグの除去を容易にするプロテアーゼ切断部位を含むポリペプチド配列をコードし得る。好適なプロテアーゼ切断部位は、当該技術分野において知られており、ＴＥＶ、トロンビン及びＳＵＭＯのプロテアーゼ切断部位を含む。
変異（改変）ポリペプチドは、当該技術分野において知られている任意の技術を使用して調製することができる。例えば、本開示によって包含される酵素をコードするポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ変異導入に供することができる。そのようなｉｎ ｖｉｔｒｏ変異導入技術は、ポリヌクレオチドを好適なベクターにサブクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ－１レッド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの「変異体」株にベクターを形質転換し、形質転換された細菌を好適な世代数にわたって増殖させることを含む。別の例において、本開示のポリヌクレオチドは、Ｈａｒａｙａｍａ（１９９８）によって広く記載されているようなＤＮＡシャッフリング技術に供される。変異／改変されたＤＮＡに由来する生産物は、本明細書に記載される技術を使用して容易にスクリーニングすることができ、それらを本開示の抗体コンジュゲート／標識された分析物に使用することができるかどうかを決定することができる。
アミノ酸配列の変異体を設計する際、変異部位の位置及び変異の性質は、修飾される特徴（複数可）に依存する。変異の部位は、例えば、（１）最初は保存的アミノ酸の選択で置換し、次いで、得られた結果に応じて、よりラジカルな選択で置換すること、
（２）標的残基を欠失させること、または（３）他の残基を配置された部位に隣接して挿入することによって、個々にまたは連続で修飾することができる。
アミノ酸配列の欠失は、一般に、約１～１５残基、より好ましくは約１～１０残基、典型的には約１～５残基の連続した残基の範囲である。
置換変異体は、ポリペプチド分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されている。置換変異導入で最も関心の高い部位には、機能に重要であると特定される部位が含まれる。他の関心部位は、様々な株または種から得られた特定の残基が同一であるものである。これらの位置は、生物活性に重要であり得る。これらの部位、特に同一に保存された他の少なくとも３つの部位の配列内にある部位は、好ましくは、比較的保存的な様式で置換される。そのような保存的置換は、当業者に知られている。
ポリヌクレオチドは、好適な組み換え発現ベクターを使用して発現することができる。例えば、上に参照されるポリペプチド構成成分をコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターに作動可能に連結することができる。「作動可能に連結する」という文言は、ポリヌクレオチド分子を、当該分子が宿主細胞に形質転換されたときに発現可能なように発現ベクターに挿入することを指す。典型的に、この文言は、転写制御要素と転写される配列の機能的関係を指す。例えば、プロモーターは、適切な宿主細胞におけるコード配列の転写を刺激または調節する場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写される配列に作動可能に連結されたプロモーター転写制御要素は、転写される配列に物理的に連続しているものであり、すなわち、シス作用性である。しかしながら、エンハンサーなどのいくつかの転写制御要素は、物理的に連続している必要はなく、または転写が増強されるコード配列に極めて近接して配置される必要もない。
本明細書で使用されるとき、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換し、指定されたポリヌクレオチド分子の発現をもたらすことが可能なＤＮＡまたはＲＮＡベクターである。好ましくは、発現ベクターはまた、宿主細胞内で複製することが可能である。発現ベクターは、原核生物または真核生物のいずれかであってよく、典型的にはウイルスまたはプラスミドである。好適な発現ベクターには、細菌、真菌、内部寄生虫、節足動物、動物、及び植物の細胞を含む組み換え細胞内で機能する（すなわち、遺伝子発現を誘導する）任意のベクターが含まれる。本開示のベクターはまた、無細胞発現系においてポリペプチド構成成分（複数可）を産生するために使用することができ、そのような系は、当該技術分野においてよく知られている。
好適なベクターは、異種ポリヌクレオチド配列、すなわち、上に参照されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに近接して自然には見られないポリヌクレオチド配列を含有し得る。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか、原核生物または真核生物のいずれかであってよく、典型的に、トランスポゾン（ＵＳ５，７９２，２９４に記載されているものなど）、ウイルスまたはプラスミドである。
好適な発現ベクターはまた、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点、及び組み換え細胞に適合し、特定のポリヌクレオチド分子の発現を調節する他の調節配列などの調節配列を含有し得る。転写制御配列は、転写の開始、伸長、及び終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター及びリプレッサー配列などの転写開始を制御するものである。種々の好適な転写制御配列は、当業者に知られている。例としては、細菌、酵母、節足動物、植物または哺乳動物の細胞で機能する転写制御配列であって、限定するものではないが、ｔａｃ、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔｒｃ、ｏｘｙ－ｐｒｏ、ｏｍｐ／ｌｐｐ、ｒｒｎＢ、バクテリオファージラムダ、バクテリオファージＴ７、Ｔ７ｌａｃ、バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＳＰ６、バクテリオファージＳＰＯ１、メタロチオネイン、アルファ接合因子、Ｐｉｃｈｉａアルコールオキシダーゼ、アルファウイルスサブゲノムプロモーター（Ｓｉｎｄｂｉｓウイルスサブゲノムプロモーターなど）、抗生物質耐性遺伝子、バキュロウイルス、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅａ昆虫ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、ラクーンポックスウイルス、他のポックスウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス（前初期プロモーターなど）、シミアンウイルス４０、レトロウイルス、アクチン、レトロウイルス長末端リピート、ラウス肉腫ウイルス、熱ショック、リン酸及び硝酸転写制御配列、ならびに原核生物または真核生物の細胞において遺伝子発現を制御することが可能な他の配列などが挙げられる。
本開示の抗体、抗体様分子、リンカー、抗原、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分及び／またはＣＲＥＴペアの第２の構成成分を調製するのに好適な宿主細胞は、抗体、抗体様分子、リンカー、抗原、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分及び／またはＣＲＥＴペアの第２の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチドにより形質変換された組み換え細胞、またはその子孫細胞を含む。ポリヌクレオチド分子の細胞への形質転換は、ポリヌクレオチド分子を細胞に挿入することができる任意の方法によって達成することができる。形質転換技術には、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、及び原形質融合が含まれるが、これらに限定されない。形質転換されたポリヌクレオチド分子は、染色体外に留まることができるか、または形質転換された（すなわち、組み換え）細胞の染色体内の１つ以上の部位に発現能力が維持されるような様式で統合され得る。
形質転換に好適な宿主細胞には、抗体、抗体様分子、リンカー、抗原、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分及び／またはＣＲＥＴペアの第２の構成成分をコードするポリヌクレオチドを用いて形質転換することができる任意の細胞が含まれる。好適な宿主細胞は、抗体、抗体様分子、リンカー、抗原、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分及び／またはＣＲＥＴペアの第２の構成成分を内因的に（すなわち、自然に）産生することが可能であるか、または構成成分（複数可）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド分子で形質転換された後に、そのようなポリペプチドを産生することが可能である。好適な宿主細胞には、細菌、真菌（酵母を含む）、寄生生物、節足動物、動物及び植物の細胞が含まれる。宿主細胞の例としては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）細胞、ＣＨＯ細胞及びＶｅｒｏ細胞が挙げられる。宿主細胞の更なる例は、Ｅ．ｃｏｌｉＫ－１２誘導体を含むＥ．ｃｏｌｉ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ；弱毒株を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ；及び非腫瘍形成性マウス筋芽細胞ＧＳ細胞（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １２４６）である。好適な哺乳動物の宿主細胞には、他の腎臓細胞株、他の線維芽細胞株（例えば、ヒト、マウスまたはニワトリ胚線維芽細胞株）、骨髄腫細胞株、チャイニーズハムスター卵巣細胞、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＬＭＴＫ細胞及び／またはＨｅＬａ細胞が含まれる。
本開示のポリヌクレオチド分子の発現を増加させるのに有用な組み換え技術には、ポリヌクレオチド分子を高コピー数プラスミドに作動可能に連結すること、ポリヌクレオチド分子を１つ以上の宿主細胞染色体に統合させること、ベクター安定性配列をプラスミドに付加すること、転写制御シグナルの置換または修飾（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）、翻訳制御シグナルの置換または修飾（例えば、リボソーム結合部位；Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ配列）、宿主細胞のコドン使用頻度に対応した本開示のポリヌクレオチド分子の修飾、及び転写物を不安定にする配列の欠失が含まれるが、これらに限定されない。
効果的な培養条件には、ポリペプチドの産生を可能にする効果的な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨ及び酸素条件が含まれるが、これらに限定されない。効果的な培地は、本開示のポリペプチドを産生するように細胞が培養される任意の培地を指す。そのような培地は、典型的に、同化性炭素、窒素及びリン酸の供給源、ならびに適切な塩、ミネラル、金属及びビタミンなどの他の栄養素を有する水性培地を含む。細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、及びペトリプレートで培養することができる。培養は、組み換え細胞に適切な温度、ｐＨ及び酸素含量で実施され得る。そのような培養条件は、当業者の専門的知識の範囲内である。
分析物
本明細書に定義される抗体／抗体様分子、標識された抗原、方法、キット及び組成物は、試料中の分析物を検出するために使用することができる。したがって、本明細書に記載されるものなどの抗体／抗体様分子、標識された抗原は、ＰＯＣ診断、治療薬モニタリング及びコンパニオン診断、臨床薬物動態、獣医診断、食品分析、環境モニタリング、防御及びセキュリティのための疾患バイオマーカー、病原体、薬物、環境汚染物質、アレルゲン及び食品混入物を含む、多数の抗原を検出することが可能である。
当業者によって理解されるように、いくつかの実施形態において、分析物は、抗体もしくは抗体様分子が結合することができるか、またはその抗体または抗体様分子が開発され得る、任意の分子であり得る。いくつかの実施形態において、分析物は、有機低分子、薬物、薬物代謝物、抗生物質、ホルモン、アレルゲン、ペプチド、タンパク質、天然に存在する抗体、糖、脂質または核酸からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、「分析物」という用語は、体液及び身体の組織に含まれる、血清タンパク質、コレステロール、多糖、核酸、薬物及び薬物代謝産物などを指す。別の実施形態において、分析物は、物理的な状態または条件を決定するための分析に望ましい生物学的状態を示す、任意の生物学的分析物、マーカー、遺伝子、タンパク質、代謝産物、もしくはホルモンまたはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、分析物は、天然に存在する抗体である。
本明細書で使用されるとき、「有機低分子」という用語は、天然または合成のいずれかの有機分子であり、分子量が約２５ダルトンを超え、かつ約３０００ダルトン未満、好ましくは約２５００ダルトン未満、より好ましくは約２０００ダルトン未満、好ましくは約１００～約１０００ダルトン、より好ましくは約２００～約５００ダルトンのものを指す。いくつかの例において、有機低分子は、抗菌剤、抗生物質、鎮痛薬、または他の生物活性のある有機低分子である。一例において、有機低分子は、トリクロカルバン（ＴＣＣ）である。別の例において、有機低分子は、アンピシリンである。
本明細書に定義される抗体／抗体様分子、標識された抗原、方法、キット及び組成物は、食品分析で使用され得る。いくつかの実施形態において、分析物は、食品に含まれるアレルゲンである。アレルゲンには、タマゴ、乳製品、肉、魚、甲殻類、例えば、エビ、カニ、ロブスター、ザリガニ、グルテンを含有する穀物（例えば、小麦（スペルト小麦及びホラサン小麦など）、ライ麦、大麦及びオート麦）、大豆、豆、ピーナッツ、ナッツ、例えば、アーモンド、ヘーゼルナッツ、クルミ、カシューナッツ、ペカンナッツ、ブラジルナッツ、ピスタチオのナッツ、マカダミア（またはクイーンズランド）ナッツ、セロリ（セロリアックを含む）、マスタード、ゴマ、二酸化硫黄／亜硫酸塩、ルピナス、ムール貝、エゾバイ、カキ、カタツムリ及びイカなどの軟体動物、種子、果物が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、分析物は、カゼイン、アルファ－ラクトグロブリン、アルファ－ラクトグロブリン、オボアルブミン、オボムコイド、グリアジン、Ａｒａｈ１、Ａｒａｈ２である。いくつかの実施形態において、抗原は、“Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃ ｆｏｏｄｓ ａｎｄ ｆｏｏｄ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｐｕｒｐｏｓｅｓ”に特定されているエピトープ及び／またはタンパク質のいずれかであり得る。ＥＦＳＡ Ｐａｎｅｌ ｏｎ Ｄｉｅｔｅｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｌｌｅｒｇｉｅｓ． ＥＦＳＡ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１４；１２（１１）：３８９４で特定されているエピトープ及び／またはタンパク質のいずれかであり得る。例えば、抗原は、表３に列挙されるエピトープ及び／またはタンパク質のいずれかであり得る。
Figure 2022531246000029
食品は、アレルゲンの含有が疑われる摂取を目的とした任意の製品であり得る。食品分析の他の例としては、食品中の汚染物質及び不純物、例えば、アフラトキシン、他のマイコトキシン、天然または人工ホルモン（成長促進ホルモンを含む）、抗生物質、農薬、海洋毒素及び細菌の検出が挙げられる。
別の実施形態において、分析物は、メラミン、シアヌル酸または乳製品の窒素含量を不正に増加させるために使用される任意の他の窒素含有化合物であり、抗体または抗体様分子は、メラミン、シアヌル酸または乳製品の窒素含量を不正に増加させるために使用される他の窒素含有化合物に特異的な抗体である。また更なる実施形態において、分析物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕ由来のコアグラーゼ酵素であり、抗体または抗体様分子は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のコアグラーゼ酵素に特異的な抗体である。
代替的な実施形態において、分析物は、標識された抗原への結合について、本明細書に定義される抗体または抗体様分子と競合する、天然に存在する抗体であり得る。本明細書で使用されるとき、「天然に存在する抗体」は、対象において、例えば、細菌、ウイルス、真菌、マイコプラズマもしくは寄生生物などの微生物による感染または免疫化に対する免疫応答の際に生成される抗体を指す。これらの実施形態において、標識された抗原が天然に存在する抗体に結合すると、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が低下する。いくつかの実施形態において、分析物は、免疫化に応答して対象において生じる天然に存在する抗体である。いくつかの実施形態において、分析物は、微生物による感染に応答して対象において生じる天然に存在する抗体である。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトまたは他の動物である。例えば、対象は、ヒト、肉牛、乳牛、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、バッファロー及びラクダ科動物（例えば、ラクダ及びラマ）からなる群から選択することができる。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、家畜である。本明細書で使用されるとき、「家畜」という用語は、肉牛、乳牛、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、バッファロー及びラクダなどの動物で、家庭用または大規模生産用及びまたは営利目的で食用または食品生産のために、特に農場で飼育されているものを指す。
本明細書に定義される抗体／抗体様分子、標識された抗原、方法、キット及び組成物は、分析物を定性的及び／または定量的に「検出する」ために使用することができる。一実施形態において、分析物は、マイクロモルからナノモルの濃度で存在する。
本明細書に記載される方法、キット、抗体または抗体様分子及び標識された抗原は、試料中の分析物を検出及び定量するために使用することができる。「試料」は、目的の分析物を含有する可能性がある任意の物質または組成物であり得る。いくつかの実施形態において、試料は、空気、液体、生体物質または土壌である。いくつかの実施形態において、試料は、食品またはその抽出物、土壌またはその抽出物、生体物質またはその抽出物などからなる群から選択される。試料は、環境もしくは源から直接取得してもよいし、または本発明の方法を実施する前に好適な手順によって抽出及び／または少なくとも部分的に精製されてもよい。
いくつかの例において、試料は、生体物質を含む。本明細書で使用されるとき、「生体物質」は、広義に定義され、生物の全体または一部に由来する任意の物質を含む。生体物質には、体液、細胞、軟組織（結合組織及び非結合組織など）及び硬組織（骨及び軟骨など）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、体液は、血液、血清、痰、粘液、膿、腹腔液、尿または他の体液である。いくつかの実施形態において、そのような物質は、生体から採取され、次いで、更なる処理及び／または化学処理に供されていてもよい。一実施形態において、センサーは、生細胞内の分析物の検出には使用されない。いくつかの実施形態において、センサーは、ｅｘ ｖｉｖｏで使用される。
いくつかの例において、試料は、食品を含む。本明細書で使用されるとき、食品は、広義に定義され、食べるか飲むかに関わらず、栄養上、哺乳動物を含む動物によって摂取されることが意図された組成物を含む。いくつかの実施形態において、試料は、毒素、アレルゲン、不純物などで汚染されている、またはその可能性のある食品である。
いくつかの実施形態において、試料は、水性液体である。例えば、試料は、牛乳、果汁、他の飲料及び血清を含む体液を含むが、これらに限定されない。
当業者であれば認識するように、本発明の免疫センサーは、マルチプレックス化することもできる。本明細書で使用されるとき、「免疫センサー」という用語は、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している抗体または抗体様分子と、ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している対応する標識された抗原の組み合わせを指す。当業者であれば理解できるように、「免疫センサー」は、「ＣＲＥＴペア」と呼ぶこともできる。例えば、異なる分析物を検出する、対応する標識された抗原を有する２つ以上の異なる抗体または抗体様分子が提供され得る。例えば、あるアレルゲンを検出する本発明の抗体または抗体様分子は、もう１つのアレルゲンを検出する抗体または抗体様分子とマルチプレックス化することができる。いくつかの実施形態において、それぞれ異なる免疫センサーは、異なる分析物の検出及び定量化することを可能にするために、異なる波長で発光するような異なるドナードメイン及び／またはアクセプタードメインを含み得る。いくつかの実施形態において、それぞれ異なる免疫センサーは、同じドナー分子及び／またはアクセプター分子を含み得る。いくつかの実施形態において、単一の流体検出チャンバーが使用される。いくつかの実施形態において、マルチチャネル検出デバイスが使用され得る。
組成物、キット、方法及び使用
本明細書に記載される抗体もしくは抗体様分子及び／または標識された分析物は、分析物の検出に使用するための組成物中に含まれ得る。例えば、本明細書に記載される抗体もしくは抗体様分子及び／または標識された分析物は、分析物の検出に使用するための組成物中に含まれ得る。いくつかの実施形態において、本発明に従った抗体または抗体様分子と、許容される担体と、を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、本発明に従った抗体または抗体様分子及び標識された分析物と、許容される担体と、を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、本発明に従った標識された分析物と、許容される担体と、を含む組成物が提供される。本明細書で使用されるとき、「許容される担体」という用語は、本発明の方法及び使用に適合する、任意及び全ての固体または溶媒（リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、水、生理食塩水など）分散媒、コーティング剤などを含む。許容される担体は、組成物の他の成分と適合性があり、試験される分析物に損傷を与えず、抗体またはその断片に対する分析物の特異的結合を阻害しないという意味で、「許容される」ものでなければならない。一般に、好適な許容される担体は、当該技術分野において知られており、最終用途に応じて選択される。
当業者であれば認識するように、本出願の抗体もしくは抗体様分子及び／または標識された抗原は、試料中の分析物の存在または非存在を検出するために使用することができ、存在する場合には、試料中に存在する分析物の量を決定するために使用することもできる。したがって、いくつかの実施形態において、試料中の分析物を検出するための方法であって、
ｉ）試料を、
化学発光共鳴エネルギー転移（ＣＲＥＴ）ペアの第１の構成成分に結合している、分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子、及び
ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原と接触させることであって、
標識された抗原が抗体または抗体様分子に結合した場合、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が１０～７５％の範囲内である、接触させることと、
ｉｉ）ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が試料の存在下で変化したかどうかを決定することであって、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率における低下が試料中に分析物が存在することを示す、決定することと、を含む、方法が提供される。
いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率の低下は、リアルタイムで観察される。代替的な実施形態において、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率の低下は、試料がない場合（例えば、緩衝液対照の存在下）におけるＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率に対するものである。
いくつかの実施形態において、第１の構成成分から第２の構成成分へのエネルギー転移の効率は、標識された抗原が抗体または抗体様分子に結合した場合、１５～７５％、２０～７５％、２５～７５％、３０～７５％、３５～７５％、４０～７５％、４５～７５％、５０～７５％、５５～７５％、６０～７５％の範囲内、または１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超もしくは５０％超である。いくつかの実施形態において、第１の構成成分から第２の構成成分へのエネルギー転移の効率は、標識された抗原が抗体または抗体様分子に結合した場合、１５～６５％の範囲内である。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｉ）は、
（ａ）最初に、試料を抗体もしくは抗体様分子と接触させ、次いで、得られた混合物を標識された抗原と接触させること、
（ｂ）最初に、試料を標識された抗原と接触させ、次いで、得られた混合物を抗体もしくは抗体様分子と接触させること、または
（ｃ）試料を抗体もしくは抗体様分子及び標識された抗原と同時に接触させることを含む。
当業者によって理解されるように、（ｉ）（ａ）、（ｉ）（ｂ）及び（ｉ）（ｃ）のそれぞれにおいて、試料中に目的の分析物が存在すると、試料が添加されていない対照と比べて、例えば、試料の代わりに緩衝液ブランクが使用される場合と比べて、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が低下する。例えば、方法が、最初に、試料を抗体または抗体様分子と接触させ、次いで、得られた混合物を標識された抗原と接触させることによって実施される場合（すなわち、ステップ（ｉ）（ａ））、得られた混合物を標識された抗原と接触させた後に、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が増加することになる（すなわち、リアルタイムで観察される）。一方、目的の分析物が試料中に存在する場合、試料がない状態のＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率と比べて、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が低下することになる。同様に、方法が、試料を抗体または抗体様分子及び標識された抗原と同時に接触させることによって実施される場合（すなわち、ステップ（ｉ）（ｃ））、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率は、リアルタイムでは変化しない場合がある。一方、目的の分析物が試料中に存在する場合、試料がない状態のＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率と比べて、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が低下することになる。ステップ（ｉ）が、最初に、試料を標識された抗原と接触させ、次いで、得られた混合物を抗体または抗体様分子と接触させることによって実施される場合（すなわち、ステップ（ｉ）（ｂ））、目的の分析物が試料中に存在すれば、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率の低下がリアルタイムで観察される。
いくつかの実施形態において、ステップｉｉ）は、試料の存在下でのＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率を、試料がない状態でのＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率を比較することを含み、ここで、試料の存在下でのＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率の低下は、分析物が試料中に存在することを示す。いくつかの実施形態において、ステップｉｉ）は、試料が添加される前のＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率を、試料が添加された後のＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率と比較することを含み、ここで、試料の存在下でのＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率の低下は、分析物が試料中に存在することを示す。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｉ）は、試料を基質と接触させることを更に含む。
好ましい実施形態において、方法は、二次抗体を必要としない。これらの実施形態は、二次抗体を必要としないため、多くの当該技術分野において知られている技術（ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリーなど）に比べて有利である。これにより、アッセイで必要とされるステップ数が減少し、方法の実施に必要な時間を短縮することができる。いくつかの実施形態において、方法は、リアルタイムで実施される。
いくつかの実施形態において、アクセプタードメインに対するＢＲＥＴドナードメインの空間的位置及び／または双極子配向が試料の存在下で変化したかどうかを決定することは、試料の添加前及び添加後のＢＲＥＴ比を測定することを含む。
いくつかの実施形態において、方法は、試料中の分析物の濃度を決定することを更に含む。いくつかの実施形態において、試料中の分析物の濃度は、試料の存在下でのエネルギー転移の効率（例えば、ＢＲＥＴ比によって表される）を、分析物の既知の濃度でのエネルギー転移の効率と、例えば、標準曲線を作成することによって比較することによって決定することができる。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、試料中の分析物の濃度をナノモルまたはピコモルレベルで測定するために使用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、少なくとも１ｐＭ、少なくとも５ｐＭ、少なくとも１０ｐＭ、少なくとも２５ｐＭ、少なくとも５０ｐＭ、少なくとも７５ｐＭ、少なくとも１００ｐＭ、少なくとも２００ｐＭ、少なくとも３００ｐＭ、少なくとも４００ｐＭ、少なくとも５００ｐＭ、少なくとも６００ｐＭ、少なくとも７００ｐＭ、少なくとも８００ｐＭ、少なくとも９００ｐＭ、少なくとも１ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも２５ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも７５ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも３００ｎＭ、少なくとも４００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも６００ｎＭ、少なくとも７００ｎＭ、少なくとも８００ｎＭ、少なくとも９００ｎＭの分析物を検出することができる。
一例において、試料中の分析物を検出する方法であって、
ｉ）試料を、セレンテラジンの存在下で、
ａ）Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼまたはそのバリアントに結合している、分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子、及び
緑色蛍光タンパク質２に結合している抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原に接触させることと、
ｉｉ）Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼと緑色蛍光タンパク質２との間の生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）が変更されるかどうかを決定することであって、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼと緑色蛍光タンパク質２との間のエネルギー転移の効率の低下は、分析物が試料中に存在することを示す、決定することと、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、ステップ（ｉ）は、試料を基質と接触させることを更に含む。
いくつかの実施形態において、試料を分類する方法であって、
ｉ）１つ以上のマイクロチャネルを備えるマイクロ流体デバイスに、
ａ）試料、
ｂ）ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している、分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子、
ｃ）ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原、
ｄ）ＣＲＥＴペアの第１または第２の構成成分の一方の基質を流すことであって、
標識された抗原が抗体または抗体様分子に結合した場合、第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が１０～７５％の範囲内である、流すことと、
ｉｉ）抗体または抗体様分子、標識された抗原、試料及び基質をデバイス内で混合することと、
ｉｉｉ）電気光学センシングデバイスを使用して、ＣＲＥＴペアの第１または第２の構成成分による基質の修飾を検出することと、
ｉｖ）電気光学センシングデバイスから少なくとも１つのシグナルを処理し、電気光学応答のパターンを１つ以上の目的の試料の１つ以上の所定の特徴と相関させることと、
ｖ）応答パターンの相関に基づいて試料を分類することであって、１つ以上の分析物が抗体または抗体様分子に結合する場合、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が変化する、分類することと、を含む、方法が提供される。
上記方法は、試料に含有される分析物に基づいて試料を分類するために使用することができる。いくつかの実施形態において、上記方法は、１つ以上の分析物の存在、非存在または分析物の濃度に基づいて試料を分類するために使用することができる。いくつかの実施形態において、上記方法は、２つ以上の異なる抗体または抗体様分子を含み、そのそれぞれは、異なる分析物または様々な分析物及び２つ以上の異なる標識された抗原に結合し、ステップｖ）は、分析物のそれぞれまたは様々な分析物の存在、非存在または濃度に基づいて試料を分類することを含む。いくつかの実施形態において、試料は、２つ以上のクラス、例えば、安全もしくは危険、汚染ありもしくは汚染なし、真正もしくは不正、または低価値／中価値／高価値に分類される。いくつかの実施形態において、方法は、リアルタイムで試料を分類するために使用することができる。いくつかの実施形態において、センサー分子は、デバイスに固定されていない。いくつかの実施形態において、センサー分子及び基質は、異なるマイクロチャネルを通ってデバイスに入る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体または抗体様分子及び標識された抗原はまた、天然に存在する抗体を検出するための方法に使用することもできる。したがって、いくつかの実施形態において、試料中の天然に存在する抗体を検出する方法であって、
ｉ）試料を、
化学発光共鳴エネルギー転移（ＣＲＥＴ）ペアの第１の構成成分に結合している抗体または抗体様分子、及び
ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、天然に存在する抗体に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原と接触させることであって、
ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している抗体または抗体様分子及び天然に存在する抗体は、標識された抗原に結合することが可能であり、
標識された抗原が、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している抗体または抗体様分子に結合した場合、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が１０～７５％の範囲内である、接触させることと、
ｉｉ）ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が試料の存在下で変化したかどうかを決定することであって、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率における低下が試料中に天然に存在する抗体が存在することを示す、決定することと、を含む、方法が提供される。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｉ）は、試料を基質と接触させることを更に含む。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｉｉ）は、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が試料の存在下で低下したかどうかを決定することを含む。例えば、ＣＲＥＴ比は、試料の存在下で、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％．４５％、５０％、５５％．６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％低下し得る。いくつかの実施形態において、ＣＲＥＴ比は、試料の存在下で、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低下する。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｉｉ）は、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が試料の存在下で増加したかどうかを決定することを含む。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｉ）は、
（ａ）最初に、試料を抗体もしくは抗体様分子と接触させ、次いで、得られた混合物を標識された抗原と接触させること、
（ｂ）最初に、試料を標識された抗原と接触させ、次いで、得られた混合物を抗体もしくは抗体様分子と接触させること、または
（ｃ）試料を抗体もしくは抗体様分子及び標識された抗原と同時に接触させることを含む。
上に説明されるように、（ｉ）（ａ）、（ｉ）（ｂ）及び（ｉ）（ｃ）のそれぞれにおいて、試料中に目的の分析物が存在すると、試料が添加されていない対照と比べて、例えば、試料の代わりに緩衝液ブランクが使用される場合と比べて、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が低下する。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｉ）は、試料を基質と接触させることを更に含む。
いくつかの実施形態において、第１の構成成分から第２の構成成分へのエネルギー転移の効率は、標識された抗原が抗体または抗体様分子に結合した場合、１５～７５％、２０～７５％、２５～７５％、３０～７５％、３５～７５％、４０～７５％、４５～７５％、５０～７５％、５５～７５％、６０～７５％の範囲内、または１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超もしくは５０％超である。いくつかの実施形態において、第１の構成成分から第２の構成成分へのエネルギー転移の効率は、標識された抗原が抗体または抗体様分子に結合した場合、１５～６５％の範囲内である。
いくつかの実施形態において、方法は、試料中に天然に存在する抗体の濃度を決定することを更に含む。いくつかの実施形態において、試料中に天然に存在する抗体の濃度は、試料の存在下でのエネルギー転移の効率（例えば、ＢＲＥＴ比によって表される）を、天然に存在する抗体の既知の濃度でのエネルギー転移の効率と、例えば、標準曲線を作成することによって比較することによって決定することができる。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、試料中の分析物の濃度をナノモルまたはピコモルレベルで測定するために使用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、少なくとも１ｐＭ、少なくとも５ｐＭ、少なくとも１０ｐＭ、少なくとも２５ｐＭ、少なくとも５０ｐＭ、少なくとも７５ｐＭ、少なくとも１００ｐＭ、少なくとも２００ｐＭ、少なくとも３００ｐＭ、少なくとも４００ｐＭ、少なくとも５００ｐＭ、少なくとも６００ｐＭ、少なくとも７００ｐＭ、少なくとも８００ｐＭ、少なくとも９００ｐＭ、少なくとも１ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも２５ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも７５ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも３００ｎＭ、少なくとも４００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも６００ｎＭ、少なくとも７００ｎＭ、少なくとも８００ｎＭ、少なくとも９００ｎＭの分析物を検出することができる。
これらの実施形態において、方法は、対象におけるセロコンバージョンを検出及び定量するために使用することができる。本明細書で使用されるとき、「セロコンバージョン」は、細菌、ウイルス、真菌、マイコプラズマもしくは寄生生物などの微生物による感染または免疫化により、対象に免疫応答が生じる状況を指すことが意図される。免疫応答の測定である「血清学」は、対象の感染状態、免疫状態または合併症への感受性を決定するために頻繁に使用される。例示的な実施形態において、試料は、天然抗体を含有することが疑われる血清または他の生体液である。
本開示は、限定するものではないが、次の１つ以上：ＣＲＥＴシステムの第１の構成成分に結合している抗体または抗体様分子、ＣＲＥＴシステムの第２の構成成分に結合している標識された抗原、基質、試験標準、及び指示書（書面による使用のための説明書）を含み得る、キットを包含する。上に列挙される構成成分は、モニターすべき特定の分析物に合わせることができる。キットは、本明細書に記載される方法を実施する、当該技術分野において知られている適切な緩衝液及び試薬を更に含むことができる。
システム
本発明の方法は、ＣＲＥＴペアの間のエネルギー転移を測定するのに好適な任意のシステムで実施することができる。
当業者であれば認識するように、本発明の方法は、バッチ（例えば、プレートリーダーを使用するバッチフォーマット）またはフローフォーマットで実施することができる。例えば、本発明の方法は、適切なフィルターを備えたマイクロプレートリーダーを使用する、マイクロプレートフォーマットで実施することができる。本発明の方法は、ＷＯ２０１３／１５５５５３に記載されているものなどのマイクロ流体デバイスでも実施することができる。本発明の方法はまた、ＷＯ２０１３／１５５５５３に記載されているものなどのマイクロ流体デバイスでも実施することができる。マイクロ流体デバイス（ＣＹＢＥＲＴＯＮＧＵＥデバイス）で実施されるＢＲＥＴベースアッセイの一例は、ＰＣＴ／ＡＵ２０１８／０５０８２４に記載されている。
いくつかの実施形態において、試料中の分析物を検出するためのマイクロ流体システムであって、
ｉ）ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している、分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子を含むのに好適な少なくとも１つのリザーバーと、
ｉｉ）ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原を含むのに好適な少なくとも１つのリザーバーと、
ｉｉｉ）１つ以上のマイクロチャネルを含むマイクロ流体デバイスと、
ｉｖ）抗体または抗体様分子、標識された抗原、試料及びＣＲＥＴペアの第１または第２の構成成分の基質をデバイス内で混合するための手段と、
ｖ）抗体または抗体様分子に対する分析物の結合を検出するための反応チャンバーと、
ｖｉ）電気光学センシングデバイスと、を含み、
標識された抗原が抗体または抗体様分子に結合した場合、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分とＣＲＥＴペアの第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が１０～７５％の範囲内であり、
ＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率の低下は、分析物が試料中に存在することを示す、システムが提供される。一例において、システムは、リアルタイムで分析物を検出するために使用することができる。
いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子は、デバイスに固定されていない。一例において、抗体または抗体様分子、標識された抗原及び基質は、異なるマイクロチャネルを通ってデバイスに入る。一例において、マイクロ流体デバイスは、少なくとも２つの入力マイクロチャネルを備え、入力マイクロチャネルの１つは、抗体または抗体様分子をデバイスに流すためのものである。
いくつかの実施形態において、電気光学センシングデバイスは、少なくとも２つの異なる波長チャネルを備える。いくつかの例において、電気光学センシングデバイスは、２つの異なる波長チャネルを同時にまたは迅速に連続して検出することが可能である。いくつかの例において、電気光学センシングデバイスは、２つの異なる波長チャネルを１秒未満で検出することが可能である。
いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、２つ以上の分析物の検出ができるように設計される。
他の実施形態において、試料を分類する方法であって、
（ｉ）試料を、
ａ）ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している、分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子、
ｂ）ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原、
ｃ）ＣＲＥＴペアの第１または第２の構成成分の一方の基質と接触させることであって、
標識された抗原が抗体または抗体様分子に結合した場合、第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が１０～７５％の範囲内である、接触させることと、
ｉｉ）電気光学センシングデバイスを使用して、ＣＲＥＴペアの第１または第２の構成成分による基質の修飾を検出することと、
ｉｖ）電気光学センシングデバイスから少なくとも１つのシグナルを処理し、電気光学応答のパターンを１つ以上の目的の試料の１つ以上の所定の特徴と相関させることと、
ｖ）応答パターンの相関に基づいて試料を分類することであって、１つ以上の分析物が抗体または抗体様分子に結合する場合、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分と第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が変化する、分類することと、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、ステップ（ｉ）は、
Ａ）１つ以上のマイクロチャネルを備えるマイクロ流体デバイスに、
ａ）試料、
ｂ）抗体または抗体様分子、
ｃ）標識された抗原、及び
ｄ）基質を流すことと、
Ｂ）抗体または抗体様分子、標識された抗原、試料及び基質をデバイス内で混合することと、を含む。
いくつかの実施形態において、方法は、２つ以上の異なる抗体または抗体様分子を含み、そのそれぞれは、異なる分析物または様々な分析物及び２つ以上の異なる標識された抗原に結合する。いくつかの実施形態において、方法は、リアルタイムで試料を分類するために使用することができる。いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子は、デバイスに固定されていない。いくつかの実施形態において、抗体または抗体様分子、標識された抗原及び基質は、異なるマイクロチャネルを通ってデバイスに入る。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、少なくとも２つの入力マイクロチャネルを備え、入力マイクロチャネルの１つは、抗体または抗体様分子をデバイスに流すためのものである。いくつかの実施形態において、試料を分類する方法は、１つ以上の分析物の存在もしくは非存在または分析物の濃度に基づいて試料を分類するために使用することができる。例えば、方法は、予め決定されたレベル未満でアレルゲンが存在する場合及び／またはアレルゲンが検出されない場合、アレルゲンを含まないものとして試料を分類するために使用され得る。
以下の実施例は、本発明に従った、好ましい抗体、標識された抗原及び方法を記載する。しかしながら、これらの実施例は例示として提供されるものであり、いずれも本発明の全体的な範囲を限定するものと解釈されるべきではないことを理解されたい。
実施例１．ＦＬＡＧ－ＧＦＰ2の調製
分子生物学：ＧＦＰ2のアミノ酸残基２～２３９をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅した。これを、Ｎ末端ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、続いて、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）切断部位、ＳＵＭＯ可溶性タグ、ＳＵＭＯプロテアーゼ切断部位及びＦＬＡＧエピトープ、続いて、ＧＦＰ2配列をコードするように設計された改変ｐＥＴ４３ａ Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターにライゲーションした。得られたタンパク質配列を配列番号４に列挙する。
タンパク質発現：組み換えＨｉｓ－ＴＥＶ－ＳＵＭＯ－ＦＬＡＧ－ＧＦＰ2タンパク質を生産するために、発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３株に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＴｅｒｒｉｆｉｃブロス（ＴＢ）中で、ＯＤ６００が０．７に到達するまで、振盪しながら３７℃で成長させた。培養液を１６℃に移し、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．５ｍＭになるように添加することによってタンパク質発現を誘導し、培養液を更に１６時間一晩かけて振盪した。発現後、細胞培養物を５０００×ｇで２０分間遠心分離にかけ、得られた細胞ペレットを－２０℃で凍結保存した。
タンパク質精製：タンパク質精製は、細胞ペレットを溶解緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ イミダゾール、０．５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、５Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼエンドヌクレアーゼ［ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ＥＤＴＡ不含完全プロテアーゼ阻害錠［Ｒｏｃｈｅ］）中、細胞１ｇあたり５ｍｌの緩衝液の比を使用して、解凍することによって開始した。氷冷したＡｖｅｓｔｉｎ Ｃ５セルクラッシャーに細胞を３回通すことによって更に溶解し、４８，０００×ｇ、４℃で遠心分離にかけた。上清（細胞溶解物）を５μｍフィルターに通して濾過し、Ｐｒｏｆｉｎｉａアフィニティークロマトグラフィー精製システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、ＩＭＡＣ洗浄緩衝液１（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール）で予め平衡化した５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＩＭＡＣ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。ＩＭＡＣカラムをＩＭＡＣ洗浄緩衝液１及びＩＭＡＣ洗浄緩衝液２（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール）で順次洗浄し、結合したＨｉｓ－ＴＥＶ－ＳＵＭＯ－ＦＬＡＧ－ＧＦＰ2タンパク質をＩＭＡＣ溶出緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３５０ｍＭ イミダゾール）で溶出した。ＩＭＡＣ溶出タンパク質を、ゲル濾過緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で予め平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによって更に精製した。
精製したＨｉｓ－ＴＥＶ－ＳＵＭＯ－ＦＬＡＧ－ＧＦＰ2タンパク質とＳＵＭＯプロテアーゼを、タンパク質とプロテアーゼの比を５０：１にして１６℃で一晩インキュベートし、Ｎ末端のＨｉｓタグ及びＳＵＭＯタグを除去した。翌朝、イミダゾールを最終濃度２０ｍＭになるように反応物に加え、反応混合物を５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＩＭＡＣカラムにもう一度通してプロテアーゼ及び切断されたタグを除去した。その後、ＩＭＡＣ洗浄緩衝液２で２回洗浄し、タグのないＦＬＡＧ－ＧＦＰ2タンパク質を、結合していない画分及び第１のＩＭＡＣ洗浄液から回収した。次いで、切断されたＦＬＡＧ－ＧＦＰ2タンパク質を含有する画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心フィルターユニット（Ｕｌｔｒａ－１５ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ）を使用して濃縮し、ゲル濾過緩衝液で予め平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。適切なピークを収集し、タンパク質を１．７ｍｇ／ｍｌに濃縮してから、５００μｌのアリコートを液体窒素で急速凍結し、－７０℃で保存した。全ての融合タンパク質におけるＦＬＡＧエピトープの存在をウェスタンブロット分析によって確認した（データ示さず）。
実施例２．ＲＬｕｃ８の調製
分子生物学：Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ８）の残基２～３１１をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列（Ｅ．ｃｏｌｉでの発現用）、それに続く、ソルターゼＡバイオコンジュゲーション配列（ＬＰＥＴＧＧ）は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）が合成した。これを、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグ、続いて、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）切断部位、及びＲＬｕｃ８－ＬＰＥＴＧＧ配列をコードするように設計された改変ｐＥＴ４３ａ Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターにライゲーションした。得られたタンパク質配列を配列番号５に列挙する。
タンパク質発現：組み換えＮ－Ｈｉｓ－ＲＬｕｃ８タンパク質を生産するために、発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３株に形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加したＴｅｒｒｉｆｉｃブロス（ＴＢ）中で、ＯＤ６００が０．７に到達するまで、振盪しながら３７℃で成長させた。培養液を１６℃に移し、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭになるように添加することによってタンパク質発現を誘導した。ＩＰＴＧの添加後、培養液を更に１６時間一晩かけて振盪した。発現後、細胞培養物を５０００×ｇで２０分間遠心分離にかけ、細胞ペレットを－２０℃で凍結保存した。
タンパク質精製：タンパク質精製は、細胞ペレットを溶解緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ イミダゾール、０．５ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、５Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼエンドヌクレアーゼ［ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ＥＤＴＡ不含完全プロテアーゼ阻害錠［Ｒｏｃｈｅ］）中、細胞１ｇあたり５ｍＬの緩衝液の比を使用して、解凍することによって開始した。氷冷したＡｖｅｓｔｉｎ Ｃ５セルクラッシャーに細胞を３回通すことによって更に溶解し、４８，０００×ｇ、４℃で遠心分離にかけた。上清（細胞溶解物）を５μｍフィルターに通して濾過し、Ｐｒｏｆｉｎｉａアフィニティークロマトグラフィー精製システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、ＩＭＡＣ洗浄緩衝液１（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール）で予め平衡化した５ｍＬ ＨｉＴｒａｐ ＩＭＡＣ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。次いで、ＩＭＡＣカラムをＩＭＡＣ洗浄緩衝液１及びＩＭＡＣ洗浄緩衝液２（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール）で順次洗浄し、次いで、結合したＮ末端ＨＩＳタグ付きＲＬｕｃ８タンパク質をＩＭＡＣ溶出緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３５０ｍＭ イミダゾール）で溶出した。ＩＭＡＣ溶出タンパク質を１×ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、４．３ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．４７ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 ｐＨ７．４）で予め平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムに通すことによって、更に精製した。単量体及び二量体を含有する画分を個別にプールした後、５００μＬのアリコートを急速凍結し、－７０℃で保存した。
精製全体において、ＲＬｕｃ８を含有する画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析及び抗Ｈｉｓ抗体－ＨＲＰコンジュゲートを使用するウェスタンブロット分析、ならびにα－クロロナフトールによる検出によって特定した。最終的にプールされた画分をマススペクトロメトリー分析にかけると、タンパク質の質量は、３８９８１．２Ｄａであることがわかり、予測質量３８９８１．３７Ｄａ（Ｎ末端メチオニンの欠失を伴う）と良好に一致する。
ルシフェラーゼ活性：セレンテラジン４００ａ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（６－フェニル－２，８－ビス（フェニルメチル）－イミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３（７Ｈ）－オン）（１ｍｇ）を１０．２ｍＬのエタノール中に溶解し、２００μＬのアリコートに分割し、乾燥させ（Ｓｐｅｅｄｉｖａｃ）、使用するまで－２０℃で保存した。
セレンテラジン４００ａ（５０ｎｍｏｌ）を５０μＬのエタノール中に溶解し、４５０μＬの水を加えた。ＲＬｕｃ８の単量体（２．４ｍｇ／ｍＬ）及びＲＬｕｃ８の二量体（４．８ｍｇ／ｍＬ）を１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含む緩衝液中に希釈した。白色９６ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）のウェルにＴＢＳ、ＰＢＳまたは１００ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ７．０、２μＬ ルシフェラーゼ酵素（１／１０または１／１００希釈）及び５μＬの０．１ｍＭ セレンテラジン４００ａ溶液を加えた。各ウェルの最終体積は１００μＬであった。生成された光は、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）で発光光学系を使用し、フィルターなしで測定した。ルシフェラーゼ活性アッセイの結果により、Ｎ－Ｈｉｓ－ＲＬｕｃ８のルシフェラーゼ活性は、非常に急速に（数秒にわたって）低下することが示されたので、最初の読み取りを記録した（データ示さず）。Ｎ－Ｈｉｓ－ＲＬｕｃ８の単量体のほうが二量体の形態よりも活性が高いことがわかったので、コンジュゲーション実験は全て単量体の形態のタンパク質で実施した。
実施例３．ＦＬＡＧ－ＲＬｕｃ８の調製
分子生物学：Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ８）の残基２～３１１をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列（Ｅ．ｃｏｌｉでの発現用）、それに続く、ソルターゼＡバイオコンジュゲーション配列（ＬＰＥＴＧＧ）は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）が合成した。これを、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグ、続いて、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）切断部位、ＳＵＭＯ可溶性タグ、ＳＵＭＯプロテアーゼ切断部位及びＦＬＡＧエピトープ、続いて、ＲＬｕｃ８－ＬＰＥＴＧＧ配列をコードするように設計された改変ｐＥＴ４３ａ Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターにライゲーションした。得られたタンパク質配列を配列番号６に列挙する。
タンパク質発現：組み換えＦＬＡＧ－ＲＬｕｃ８タンパク質を生産するために、発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３株に形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加したＴｅｒｒｉｆｉｃブロス（ＴＢ）中で、ＯＤ６００が０．７に到達するまで、振盪しながら３７℃で成長させた。培養液を１６℃に移し、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭになるように添加することによってタンパク質発現を誘導した。ＩＰＴＧの添加後、培養液を更に１６時間一晩かけて振盪した。発現後、細胞培養物を５０００×ｇで２０分間遠心分離にかけ、細胞ペレットを－２０℃で凍結保存した。
タンパク質精製：タンパク質精製は、細胞ペレットを溶解緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ イミダゾール、０．５ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、５Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼエンドヌクレアーゼ［ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ＥＤＴＡ不含完全プロテアーゼ阻害錠［Ｒｏｃｈｅ］）中、細胞１ｇあたり５ｍＬの緩衝液の比を使用して、解凍することによって開始した。氷冷したＡｖｅｓｔｉｎ Ｃ５セルクラッシャーに細胞を３回通すことによって更に溶解し、４８，０００×ｇ、４℃で遠心分離にかけた。上清（細胞溶解物）を５μｍフィルターに通して濾過し、Ｐｒｏｆｉｎｉａアフィニティークロマトグラフィー精製システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、ＩＭＡＣ洗浄緩衝液１（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール）で予め平衡化した１ｍＬ ＨｉＴｒａｐ ＩＭＡＣ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。ＩＭＡＣカラムをＩＭＡＣ洗浄緩衝液１及びＩＭＡＣ洗浄緩衝液２（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール）で順次洗浄し、結合したＨＩＳ－ＴＥＶ－ＳＵＭＯ－ＦＬＡＧ－ＲＬｕｃ８タンパク質をＩＭＡＣ溶出緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３５０ｍＭ イミダゾール）で溶出した。ＩＭＡＣ溶出タンパク質を１×ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、４．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４７ ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４ ｐＨ７．４）で予め平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムに通すことによって、更に精製した。
精製したタンパク質とＳＵＭＯプロテアーゼを、タンパク質とプロテアーゼの比を２０：１にして１６℃で一晩インキュベートし、Ｎ末端のＨＩＳタグ及びＳＵＭＯタグを除去した。翌朝、イミダゾールを最終濃度２０ｍＭになるように反応物に加え、反応混合物を１ｍＬ ＨｉＴｒａｐ ＩＭＡＣカラムにもう一度通してプロテアーゼ及び切断されたタグを除去した。その後、ＩＭＡＣ洗浄緩衝液２で２回洗浄し、タグのないタンパク質を、結合していない画分及び第１のＩＭＡＣ洗浄液から回収した。切断されたＦＬＡＧ－ＲＬｕｃ８タンパク質をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心フィルターユニット（Ｕｌｔｒａ－１５ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ）を使用して濃縮し、１×ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、４．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４ ｐＨ７．４）で予め平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムにロードした。単量体及び二量体を別々に回収し、タンパク質を＞１．２ｍｇ／ｍＬに濃縮した。タンパク質を１００μＬのアリコートにして液体窒素で急速凍結し、－７０℃で保存した。
精製全体において、ＲＬｕｃ８を含有する画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析及び／または抗Ｈｉｓ抗体－ＨＲＰコンジュゲートを使用するウェスタンブロット分析、ならびにα－クロロナフトールによる検出によって特定した。
実施例４．抗ＦＬＡＧ抗体及び抗ＦＬＡＧ Ｆａｂ’２断片の調製
抗ＦＬＡＧ抗体の産生：抗ＦＬＡＧ抗体を抗ＦＬＡＧ Ｍ２ハイブリドーマから産生し（Ｂｒｉｚｚａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、Ａｂ－Ｃａｐｃｈｅｒ樹脂（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ）で精製した。抗ＦＬＡＧ（８ｍＬ、３．５ｍｇ／ｍＬ）をＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でｐＨ６．４に調整したＰＢＳに脱塩した。カットされていない抗ＦＬＡＧ抗体をゲル濾過によって単離した（データ示さず）。
抗ＦＬＡＧ Ｆａｂ’２断片の産生：パパイン（ＢＤＨ）１０．３ｍｇを１．０３ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁し、システインを最終濃度１０ｍＭになるように加えた。得られた混合物を室温で約２０分間インキュベートした後、遠心分離にかけた（２１，０００×ｇ、５分、４℃）。パパインの濃度は、２８０ｎｍの吸光度から１．０２ｍｇ／ｍＬであることが決定された。還元されたパパインを、ｐＨ６．４に調整したＰＢＳで平衡化したＨｉＴｒａｐ脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して脱塩した。
パパインと抗体の最適比を決定するために、２０μｇの抗ＦＬＡＧ抗体及び酵素／抗体比１：５～１：２５６０のパパイン添加により、一連の切断反応を設定した。反応混合物を０または１０ｍＭのシステインの存在下、３７℃で一晩インキュベートした後、５μＬの０．５Ｍヨードアセトアミドを反応混合物に加えて反応をクエンチした。次いで、切断の程度をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価した。
コンジュゲーション反応に使用するために、７．６ｍｇの抗ＦＬＡＧ抗体を０．３８ｍｇのパパイン（酵素／抗体比１：２０）に非還元条件（０ｍＭ システイン）下で加え、反応を３７℃で１５時間進行させた後、ＰＢＳで平衡化したＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのゲル濾過によってＦａｂ’２を単離した。次いで、単離したＦａｂ’２の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価した。
実施例５．遊離スルフヒドリルを露出するための抗ＦＬＡＧ抗体及びＦａｂ’２の部分的還元
抗ＦＬＡＧ抗体の部分的還元：抗ＦＬＡＧ抗体をトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（最終濃度５０μＭ）で２５℃で４時間処理した後、ＮＡＰ Ｇ－２５脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＰＢＳに脱塩した。還元した抗体を更に精製することなく次のコンジュゲーション反応に使用した。
抗ＦＬＡＧ Ｆａｂ’２断片の部分的還元：抗ＦＬＡＧ Ｆａｂ’２をＴＣＥＰ（最終濃度１００μＭ）で２５℃で２時間還元した後、ＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ６）で希釈し、同じ緩衝液で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカチオン交換カラム（１ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。カラムを緩衝液Ａ（ＰＢＳ）で洗浄し、結合したタンパク質を０～１００％緩衝液Ｂ（０．８５Ｍ ＮａＣｌを加えたＰＢＳ）の直線グラジエントで溶出した。次いで、溶出した物質をデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）（２５０当量）で２５℃で１時間、穏やかに再酸化した後、ＰＢＳで平衡化したＨｉＴｒａｐ ５ｍＬ脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＰＢＳに脱塩することによってＤＨＡＡを除去した。得られたＦａｂ’を更に精製することなく次のコンジュゲーション反応に使用した。
実施例６．Ｓｏｌｕｌｉｎｋリンカーを介したＲＬｕｃ８の抗ＦＬＡＧ抗体及び抗ＦＬＡＧ Ｆａｂ’へのコンジュゲーション
ホルミルベンズアミド－ＲＬｕｃ８誘導体の調製：ＰＢＳ（７００μＬ）中のＮ－Ｈｉｓ－ＲＬｕｃ８（２５ｎｍｏｌ）を１２５ｎｍｏｌのスルホ－Ｓ－４ＦＢ（Ｎ－スクシンイミジル－４－ホルミルベンズアミド、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；無水ＤＭＳＯ中２．４９μｌの５０ｍＭ スルホ－Ｓ－４ＦＢ）と反応させ、混合物を室温で９０分間反応させた。ＨｉＴｒａｐ脱塩カラムでＰＢＳに脱塩することによって、過剰のＳｕｌｆｏ－Ｓ－４ＦＢを除去した。ホルミルベンズアミド誘導体化タンパク質の少量のアリコートを質量分析にかけたところ、ホルミルベンズアミド－ＲＬｕｃ８誘導体は、おそらく質量分析計では効率的に飛行することができないため、この誘導体は微量しか検出されなかった。
ヒドラジノニコチンアミド抗ＦＬＡＧ抗体誘導体の調製：ＰＢＳ（７００μＬ）中の還元抗ＦＬＡＧ抗体（１６．４ｎｍｏｌ）を１６４ｎｍｏｌ ＭＨＰＨ（マレイミドＨｙＮｉｃ、マレイミジル－６－ヒドラジン－ニコチンアミド、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；無水ＤＭＳＯ中３．２９μｌの５０ｍＭ ＭＨＰＨ））で処理し、混合物を室温で９０分間反応させた。ＨｉＴｒａｐ脱塩カラムでＰＢＳに脱塩することによって、過剰のＭＨＰＨを除去した。ヒドラジノニコチンアミド誘導体化抗ＦＬＡＧ抗体の少量のアリコートを質量分析にかけた。
ヒドラジノニコチンアミドによる還元抗ＦＬＡＧ抗体の誘導体化は、マススペクトロメトリー分析から推測することができる。誘導体化されていない還元抗体のマススペクトルは、２４１１０．８Ｄａのピーク（軽鎖）と、５０２８２．８Ｄａ以上に複数のピーク（重鎖、グリコシル化のバリエーション）を示した。ヒドラジノニコチンアミド誘導体化抗体のマススペクトルは、５０４７５．６Ｄａに小さいピーク（重鎖＋１９２．８Ｄａ）を示し、これはヒドラジノニコチンアミドの付加（予想されるＭＷ＋１９１．０Ｄａ）に対応することから、コンジュゲーションが生じたことを示唆している。このスペクトルにおける対応するピークの相対的な大きさから判断すると、軽鎖に対して重鎖の量が減少しており、これは、おそらく、重鎖がヒドラジノニコチンアミドで誘導体化されたものの、得られたコンジュゲートは質量分析計で効率的に飛行することができなかったことを示唆している。
ヒドラジノニコチンアミド－Ｆａｂ’誘導体の調製：ＰＢＳ（６００μＬ）中の抗ＦＬＡＧ Ｆａｂ’（７．２ｎｍｏｌ）を７２ｎｍｏｌ ＭＨＰＨ（無水ＤＭＳＯ中の１．４４μｌの５０ｍＭ ＭＨＰＨ）で処理し、混合物を室温で９０分間反応させた。ＨｉＴｒａｐ脱塩カラムでＰＢＳに脱塩することによって、過剰のリンカーを除去した。ヒドラジノニコチンアミド誘導体化抗ＦＬＡＧ Ｆａｂ’の少量のアリコートを質量分析にかけた。
ヒドラジノニコチンアミドによる抗ＦＬＡＧ Ｆａｂ’の誘導体化は、マススペクトロメトリー分析から推測することができる。誘導体化されていない抗ＦＬＡＧ Ｆａｂ’のマススペクトルは、２４１１２．３Ｄａ（軽鎖）及び２４５７４．５Ｄａ（パパイン切断重鎖）のピークを示した。抗体誘導体のスペクトルと同様に、ヒドラジノニコチンアミド誘導体化Ｆａｂ’のマススペクトルは、軽鎖に対して重鎖の量が減少しており、これは、重鎖がＭＨＰＨ試薬と反応したものの、得られた誘導体は質量分析計で飛行することができなかったことを示唆している。更に、２４７８１（＋２０７．９Ｄａ）にブロードなピークが観察された。これは、予測（予想では＋１９１．０Ｄａ）よりもわずかに高いＭＷに相当するが、ピークがあまりにもブロードであるため、質量を決めるのは困難であった。
ＲＬｕｃ８－抗ＦＬＡＧ抗体コンジュゲートの調製：ホルミルベンズアミド誘導体化ＲＬｕｃ８の３分の２をヒドラジノニコチンアミド誘導体化抗ＦＬＡＧ抗体に加えた。アニリン（最終濃度１０ｍＭ）を加え、コンジュゲーション反応を４℃で約５４時間進行させた後、一部（４００μＬ）をＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ Ｉｎｃｒｅａｓｅゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのゲル濾過によって精製した。ホルミルベンズアミド誘導体化ＲＬｕｃ８及びヒドラジノニコチンアミド誘導体化抗体の反応混合物の溶出クロマトグラム（データ示さず）は、約１３．５ｍＬでのブロードなピークが支配的であることから、誘導体化されていない抗体は同じ条件下で１３．５ｍＬでシャープなピークで溶出し、ＲＬｕｃ８は約１６．５ｍＬでブロードなピークで溶出する（データ示さず）。約１２．５～１３ｍＬで溶出する小さなショルダーが、コンジュゲートで予想される溶出量に対応した。少量のコンジュゲートが約１１．５～１２．５ｍＬのショルダーとして回収されたが、これは、誘導体化されていない抗ＦＬＡＧ抗体のクロマトグラムには存在しない（データ示さず）。
Ａｍｉｃｏｎ １０ｋＤａ ＭＷＣＯスピンコンセントレーター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、残りの反応混合物を２０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．０に緩衝液交換した。アニリンを最終濃度１０ｍＭになるように加え、一方を４℃で、もう一方を室温で１６時間静置した後、上記のようにゲル濾過精製にかけた。両方の反応物のゲル濾過プロファイルは、ＰＢＳでの反応で観察されたプロファイルと非常に類似していた。
ヒドラジノニコチンアミド：ホルミルベンズアミド結合は３５４ｎｍで吸収され、モル減衰係数は２９０００であるが（ＴｒｉＬｉｎｋ製品資料）、コンジュゲートの吸光度が低すぎて、３５４ｎｍの吸光度を使用して濃度を推定することはできなかった。
ＲＬｕｃ８－抗Ｆａｂ’コンジュゲートの調製：ホルミルベンズアミド誘導体化ＲＬｕｃ８ＲＬｕｃ８の３分の１をヒドラジノニコチンアミド誘導体化抗ＦＬＡＧＦａｂ’２に加えた。アニリンを最終濃度１０ｍＭになるように加え、コンジュゲーション反応を４℃で約５４時間進行させた後、一部（４００μＬ）をＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ Ｉｎｃｒｅａｓｅゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのゲル濾過によって精製した。コンジュゲーション反応混合物の溶出プロファイルは、ＲＬｕｃ８（約１６．５ｍＬでの溶出ピーク）及びＦａｂ’（同様に約１６．５ｍＬでの溶出ピーク）のいずれよりも早い、１４．５ｍＬで溶出するタンパク質の新しいピークを示した。
残りの反応混合物を濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ １０ｋＤａ ＭＷＣＯスピンコンセントレーター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、２０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．０に緩衝液交換した。アニリンを最終濃度１０ｍＭになるように加え、一方を４℃で、もう一方を室温で１６時間静置した後、上記のようにゲル濾過精製にかけた。両方の反応物のゲル濾過プロファイルは、ＰＢＳでの反応で観察されたプロファイルと非常に類似していた。
コンジュゲートタンパク質に対応するピークを回収した。ヒドラジノニコチンアミド：ホルミルベンズアミド結合は３５４ｎｍで吸収され、モル減衰係数は２９０００である（ＴｒｉＬｉｎｋ製品資料）。最終プールにおけるヒドラジノニコチンアミド：ホルミルベンズアミド結合の濃度は、５０ｎＭであると推定された（３５４ｎｍでのクロマトグラムを積分することによって決定）。
実施例７．クリックケミストリーを使用したＰＥＧリンカーを介したＲＬｕｃ８の抗ＦＬＡＧ抗体及び抗ＦＬＡＧ Ｆａｂ’へのコンジュゲーション
アジド－ＰＥＧn－ＲＬｕｃ８誘導体の調製：Ｎ－Ｈｉｓ－ＲＬｕｃ８（２４０μＬ ＰＢＳ中２５ｎｍｏｌ））をアジド－ｄＰＥＧ（登録商標）８－ＮＨＳエステル（１２５ｎｍｏｌ）（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）と室温で９０分反応させた。ＨｉＴｒａｐ脱塩カラムでＰＢＳに脱塩することによって、過剰のアジド－ｄＰＥＧ（登録商標）８－ＮＨＳエステルを除去した。得られたアジド－ＰＥＧ８－誘導体化タンパク質を更に精製することなく次のコンジュゲーション反応に使用した。物質の少量のアリコートをマススペクトロメトリーによって分析した。
コンジュゲートされていないＮ－Ｈｉｓ－ＲＬｕｃ８のマススペクトルは、３８９８２Ｄａに予想されるピークを示した。これは、Ｎ末端メチオニンが失われたことと一致し、３９１６０での小さなピークは、Ｈｉｓタグにα－Ｎ－グルコノイル基（＋１７８ｋＤａ）が付加されたことに対応すると思われる（データ示さず）。誘導体化タンパク質のスペクトルは、０～７個のアジド－ＰＥＧ８基（それぞれ＋４４９．５Ｄａ）が付加されたことを示す（データ示さず）。
ＤＢＣＯ－ＰＥＧm－抗ＦＬＡＧ抗体誘導体の調製：ＰＢＳ（７００μＬ）中の部分的還元抗ＦＬＡＧ抗体（１６．４ｎｍｏｌ）をＤＢＣＯ－ｄＰＥＧ（登録商標）４－Ｍａｌ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）（１６４ｎｍｏｌ；無水ＤＭＳＯ中３．２９μｌの５０ｍＭ ＤＢＣＯ－ｄＰＥＧ（登録商標）４－Ｍａｌ）で処理し、混合物を２５℃で９０分間反応させた。ＨｉＴｒａｐカラムを使用してＰＢＳに脱塩することによって、過剰なＤＢＣＯ－ｄＰＥＧ（登録商標）４－Ｍａｌを除去した。得られたタンパク質の少量のアリコートをマススペクトロメトリーによる分析にかけた。
還元抗ＦＬＡＧ抗体のＤＢＣＯ－ＰＥＧへのコンジュゲーションは、マススペクトロメトリー分析から推測することができる。還元抗体のマススペクトル（データ示さず）は、２４１１０．８Ｄａのピーク（軽鎖）と、５０２８２．８Ｄａ以上に複数のピーク（重鎖、グリコシル化のバリエーション）を示した。ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４：抗体コンジュゲートのマススペクトルは、軽鎖または重鎖のいずれへのコンジュゲーション（予想ではＭＷ＋６７４．７Ｄａ）も示さなかったが、このスペクトルにおける対応するピークの相対的な大きさから判断すると、軽鎖に対して重鎖の量が減少しており、これは、おそらく、重鎖がＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－Ｍａｌと反応したものの、得られたコンジュゲートは質量分析計で飛行することができなかったことを示唆している。
ＤＢＣＯ－ＰＥＧm－Ｆａｂ’誘導体の調製：ＰＢＳ（６００μＬ）中の部分的還元抗ＦＬＡＧ Ｆａｂ’２（７．２ｎｍｏｌ）をＤＢＣＯ－ｄＰＥＧ（登録商標）４－Ｍａｌ（７２ｎｍｏｌ；無水ＤＭＳＯ中１．４４μＬの５０ｍＭ ＤＢＣＯ－ｄＰＥＧ（登録商標）４－Ｍａｌ）で処理し、混合物を２５℃で９０分間反応させた。ＨｉＴｒａｐカラムを使用してＰＢＳに脱塩することによって、過剰なＤＢＣＯ－ｄＰＥＧ（登録商標）４－Ｍａｌを除去した。得られたタンパク質の少量のアリコートをマススペクトロメトリーによる分析にかけた。
抗ＦＬＡＧ Ｆａｂ’断片のＤＢＣＯ－ＰＥＧ４へのコンジュゲーションは、マススペクトロメトリー分析から推測することができる。抗ＦＬＡＧ Ｆａｂ’のマススペクトル（データ示さず）は、２４１１２．３Ｄａ（軽鎖）及び２４５７４．５Ｄａ（パパイン切断重鎖）のピークを示した。抗体コンジュゲートのスペクトルと同様に、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４：Ｆａｂ’コンジュゲートのマススペクトル（データ示さず）は、軽鎖に対して重鎖の量が減少しており、この鎖に対応するピークがスペクトルでは見えないことから、これは、重鎖がＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－Ｍａｌと反応したものの、得られたコンジュゲートは質量分析計で飛行することができなかったことを示唆している。抗体コンジュゲートとは対照的に、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４：Ｆａｂ’のスペクトルは、２４７８５．４（＋６７４．１Ｄａ、予想ではＭＷ＋６７４．７Ｄａ）に小さなピークが存在することから、軽鎖へのいくらかのコンジュゲーションが生じたことを示した。
ＲＬｕｃ８－抗ＦＬＡＧ抗体コンジュゲートの調製：アジド－ＰＥＧ８－誘導体化のおよそ３分の２をＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－誘導体化抗ＦＬＡＧ抗体に加えた。得られた各混合物を４℃で５４時間反応させた後、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ Ｉｎｃｒｅａｓｅゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのゲル濾過によって精製した。
アジド－ＰＥＧ８－誘導体化ＲＬｕｃ８及びＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－誘導体化抗体の反応混合物の溶出クロマトグラムの分析（データ示さず）は、所望のコンジュゲートが約１２ｍＬでの小さなショルダーとして溶出したことを示した。このピークは、同じ条件下で得られた抗体（約１３．５ｍＬでの溶出ピーク）、またはＲＬｕｃ８（約１６．５ｍＬでの溶出ピーク）のクロマトグラムには存在しない。
ＲＬｕｃ８－抗Ｆａｂ’コンジュゲートの調製：残りのアジド－ＰＥＧ８－誘導体化ＲＬｕｃ８をＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－Ｆａｂ’に加えた。得られた各混合物を４℃で５４時間反応させた後、ゲル濾過によって精製した。
アジド－ＰＥＧ８－誘導体化ＲＬｕｃ８及びＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－誘導体化Ｆａｂ’の反応混合物の溶出プロファイルの分析（データ示さず）は、ＲＬｕｃ８（約１６．５ｍＬでの溶出ピーク）またはＦａｂ’（同様に約１６．５ｍＬでの溶出ピーク）のいずれよりも早い、１４．５ｍＬで溶出するタンパク質のピークを示した。
実施例８．抗体：ＲＬｕｃ８及びＦａｂ’：ＲＬｕｃ８コンジュゲートのＢＲＥＴ分析
抗体：Ｓｏｌｕｌｉｎｋ及びＣｌｉｃｋ－ＰＥＧリンカーを含むＲＬｕｃ８及びＦａｂ’：ＲＬｕｃ８コンジュゲートを試験して、ＢＲＥＴ構成成分である、抗体またはＦａｂ’にコンジュゲートされたまたはコンジュゲートされていないＲＬｕｃ８と、ＦＬＡＧペプチドにコンジュゲートされたＧＦＰ2との間のエネルギー転移の効率を決定した。
材料及び方法
ＦＬＡＧペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号７））をＰｅｐｔｉｄｅ ２．０ Ｉｎｃ，ＵＳから入手した。白色Ｏｐｔｉｐｌａｔｅに、ＦＬＡＧ－ＧＦＰ2及びＦＬＡＧペプチド（様々な濃度）を含むまたは含まないＲＬｕｃ８またはＲＬｕｃ８コンジュゲートをＰＢＳで最終体積９５μＬにし、５分間インキュベートした。インキュベーション後、エタノール（０．５ｎｍｏｌ）中の５μＬの０．１ｍＭ セレンテラジン４００ａ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を加え、発光／蛍光を決定した。ＢＲＥＴ転移は、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ蛍光光度計（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用し、最初の位置に４１０ｎｍの発光フィルター及び２番目の位置に５１５ｎｍのフィルターを備えた二波長同時測定光学系で分析した。
反応成分の添加順序がＢＲＥＴ比に影響を与えるかどうかを調べるために、次の添加順序で試験した：（ｉ）ＲＬｕｃ８コンジュゲート単独；（ｉｉ）ＲＬｕｃ８コンジュゲート＋ＦＬＡＧ－ＧＦＰ2；（ｉｉｉ）ＲＬｕｃ８コンジュゲート＋ＦＬＡＧ－ＧＦＰ2（５分間インキュベート）及びＦＬＡＧペプチドの添加；（ｉｖ）ＲＬｕｃ８コンジュゲート＋ＦＬＡＧペプチド（５分間インキュベート）、次いでＦＬＡＧ－ＧＦＰ2の添加；（ｖ）全ての試薬（セレンテラジン４００ａを除く）を同時に加えた。得られた混合物を更に５分間インキュベートし、エタノール（０．５ｎｍｏｌ）中の５μＬの０．１ｍＭ セレンテラジン４００ａ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を加えた。発光／蛍光を決定した。ＢＲＥＴ転移は、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ蛍光光度計（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用し、最初の位置に４１０ｎｍの発光フィルター及び２番目の位置に５１５ｎｍのフィルターを備えた二波長同時測定光学系で分析した。測定には０．５秒の積分時間を使用した。
ＢＲＥＴ比は、５２０ｎｍの光強度と４２０ｎｍの光強度の比として定義する。ＧＦＰ2強度（平均０～５秒）をＲＬｕｃ８強度（平均０～５秒）で割ることによって、ＢＲＥＴ比を算出した。
結果
最初の実験では、抗体：ＲＬｕｃ８及びＦａｂ’：ＲＬｕｃ８コンジュゲートのルシフェラーゼ活性を特徴付けた。抗ＦＬＡＧ Ｆａｂ’－ヒドラジノニコチンアミド：ＲＬｕｃ８－ホルミルベンズアミドコンジュゲート、抗ＦＬＡＧ ｍＡｂ－ｄＰＥＧ４－ＤＢＣＯ：ＲＬｕｃ８：ｄＰＥＧ８アジドコンジュゲート及び抗ＦＬＡＧ Ｆａｂ’－ｄＰＥＧ４－ＤＢＣＯ：ＲＬｕｃ８：ｄＰＥＧ８アジドコンジュゲートは、セレンテラジン４００ａを加えると、ルシフェラーゼ活性を有することがわかった（データ示さず）。抗ＦＬＡＧ Ｆａｂ’－ヒドラジノニコチンアミド：ＲＬｕｃ８－ホルミルベンズアミドコンジュゲートは、ＦＬＡＧ－ＧＦＰ2を加えないと試験できなかった。
抗ＦＬＡＧコンジュゲートをＦＬＡＧ－ＧＦＰ2とインキュベーションした後に遊離ＦＬＡＧペプチドを添加すると、ＢＲＥＴ比は、Ｓｏｌｕｌｉｎｋリンカーでは０．４２であり、Ｃｌｉｃｋ／ＰＥＧ連結コンジュゲートでは０．３２であった。抗Ｆａｂ’コンジュゲートをＦＬＡＧ－ＧＦＰ2とインキュベーションした後に遊離ＦＬＡＧペプチドを添加すると、ＢＲＥＴ比は、Ｓｏｌｕｌｉｎｋリンカーでは０．１７であり、Ｃｌｉｃｋ／ＰＥＧ連結コンジュゲートでは０．１１であった。抗体ベースのコンジュゲートは、対応するＦａｂ’ベースの同等物よりもはるかに高いＢＲＥＴ比であった（図２）。セレンテラジン４００ａの添加前に、反応混合物中に遊離ＦＬＡＧペプチド（８５０μＭ）を含めると、Ｃｌｉｃｋ／ＰＥＧ連結コンジュゲート及びｍＡｂ－Ｓｏｌｕｌｉｎｋ－ＲＬｕｃコンジュゲートのＢＲＥＴ比が低下した（図２）。Ｃｌｉｃｋ／ＰＥＧ連結コンジュゲートについて更に調べた。
図３に示されるように、試薬の添加順序を変えても、標識されていないＦＬＡＧペプチドの添加後のＢＲＥＴ比にはほとんど影響しなかった。全ての場合において、ＢＲＥＴ比におよそ２２％の低下があった。インキュベーション時間を１０分に増やしても、１００ｎＭ ＦＬＡＧペプチドに対する反応（％）に影響はなかった（データ示さず）。ＦＬＡＧ－ＧＦＰ2と５分間プレインキュベートして複合体を予め形成させた抗体－Ｃｌｉｃｋ／ＰＥＧ－ＲＬｕｃ８に、遊離ＦＬＡＧペプチドを添加した直後にＢＲＥＴ比を測定した場合、そのＢＲＥＴ比は、ＦＬＡＧペプチドを添加しない複合体の場合と同じであることがわかった。しかしながら、この同じ予め形成された複合体を遊離ＦＬＡＧペプチドと５分間インキュベートした後にＢＲＥＴ比を決定した場合、その比は、抗体－Ｃｌｉｃｋ／ＰＥＧ－ＲＬｕｃ８：遊離ＦＬＡＧペプチド複合体を予め形成させた後にＦＬＡＧ－ＧＦＰ2を添加した場合と同じであることがわかった。これは、抗体：ＦＬＡＧペプチド：ＦＬＡＧ－ＧＦＰ2複合体の形成には５分間で十分であることを示唆している。更なるアッセイは全て、試薬を同時に加え、５分間インキュベートすることによって実施した。
実施例９．ＢＲＥＴ比に対するリンカー長の影響
材料及び方法
１２～６０ＰＥＧ単位からなるリンカーを含む一連の抗体：ＲＬｕｃ８及びＦａｂ’：ＲＬｕｃ８コンジュゲートを作製した。簡潔に述べると、ＲＬｕｃ８（３ｍＬのＰＢＳ中１６５ｎｍｏｌ）を、２当量のアジド－ｄＰＥＧ８－ＮＨＳエステル、アジド－ｄＰＥＧ２４－ＴＦＰエステルまたはアジド－ｄＰＥＧ３６－ＴＦＰエステル（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）と４℃で６４時間、攪拌せずに反応させた後、タンパク質及びコンジュゲートを、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ １６／６０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのゲル濾過によって低ＭＷの未反応Ｃｌｉｃｋ試薬から分離した。
部分的還元抗ＦＬＡＧ抗体（３ｍＬのＰＢＳ中８４ｎｍｏｌ）またはＦａｂ’（３ｍＬのＰＢＳ中１６ｎｍｏｌ）を、２当量のＤＢＣＯ－ｄＰＥＧ４－Ｍａｌ、ＤＢＣＯ－ｄＰＥＧ１２－ＭａｌまたはＤＢＣＯ－ｄＰＥＧ２４－Ｍａｌ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）と４℃で６４時間、攪拌せずに反応させた後、タンパク質及びコンジュゲートを、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ １６／６０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのゲル濾過によって過剰の低ＭＷのＣｌｉｃｋ試薬から分離した。抗体または抗体断片へのＤＢＣＯの組み込みの程度は、コンジュゲートの３０９ｎｍでの吸光度（ε309nm＝１２０００Ｍ-1ｃｍ-1）から、ｍＡｂでは０．９～１．０及びＦａｂ’では１．５～１．６と推定された。
コンジュゲーション反応は、アジド－ＰＥＧn－誘導体化ＲＬｕｃ８と、ほぼ等モル量のＤＢＣＯ－ＰＥＧm－誘導体化抗体で設定するか、またはその利用可能性が限定されているため、０．２５～０．４モル当量のＤＢＣＯ－ＰＥＧm－誘導体化Ｆａｂ’で設定した。反応物を４℃で４０時間インキュベートした後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。多量の出発物質が未反応のままであったので、反応混合物を濃縮し、更に１週間進行させた後、コンジュゲートをゲル濾過によって単離し、次いで、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、コンジュゲーションが重鎖でのみ生じたことを示した（データ示さず）。精製したコンジュゲートの濃度を分光学的に推定した。
精製したコンジュゲートを実施例８に記載されているＢＲＥＴアッセイに使用した。ＢＲＥＴ転移は、５０μＬのエタノール中の１ｍＭ セレンテラジン４００ａの溶液を調製し、０．５μＬを最終アッセイに加えた以外は、先のとおりに決定した。ＢＲＥＴ比は、５０ｎＭの抗体－またはＦａｂ’－ＲＬｕｃ８コンジュゲート、１００または２００ｎＭのＦＬＡＧ－ＧＦＰ2及びＦＬＡＧペプチドを適宜使用して決定した。反応混合物の体積をＰＢＳにより増やした。セレンテラジン４００ａを添加した後の最終反応体積は、１００μＬであった。
ＢＲＥＴアッセイは、１ｍＭのセレンテラジン４００ａの溶液を５０μＬのエタノール中で調製し、０．５μＬを最終アッセイに加えた以外は、実施例８に記載されているとおりに実施した。
結果
様々な長さのＰＥＧリンカーの影響を調べるために、ＢＲＥＴ比を、抗体－Ｃｌｉｃｋ／ＰＥＧ－ＲＬｕｃ８コンジュゲート単独（５０ｎＭ）または１００もしくは２００ｎＭのＦＬＡＧ－ＧＦＰ2との組み合わせ、または２００ｎＭのＦＬＡＧ－ＧＦＰ2及び１μＭのＦＬＡＧペプチドとの組み合わせのそれぞれについて決定した。抗体－Ｃｌｉｃｋ／ＰＥＧ－ＲＬｕｃ８コンジュゲートのＢＲＥＴ比は、ＦＬＡＧ－ＧＦＰ2が存在しない場合の０．０５から、１００ｎＭのＦＬＡＧ－ＧＦＰ2の存在下ではおよそ０．２に増加し、２００ｎＭのＦＬＡＧ－ＧＦＰ2の存在下では０．２５に更に増加した（図４Ａ）。１μＭのＦＬＡＧペプチドの存在下では、比がおよそ半分に低下し、これは、ＦＬＡＧペプチドが、抗体：ＲＬｕｃ８コンジュゲートに対してＦＬＡＧ－ＧＦＰ2と競合可能であることを示している。
図４に示されるように、ＰＥＧリンカーの長さが異なると、ＢＲＥＴ比にいくらかの変化があった。このように、２００ｎＭのＦＬＡＧ－ＧＦＰ2の存在下では、ＢＲＥＴ比がわずかに増加し、ＰＥＧリンカー長が１２～６０の場合、ＢＲＥＴ比はそれぞれ０．２３から０．２７に増加した。これに伴って、１μＭのＦＬＡＧペプチドに対する反応も増加し、１２－ＰＥＧリンカーの４５％から６０－ＰＥＧリンカーの５１％に反応が増加した。
同様の影響がＦａｂ’－ＰＥＧ－ＲＬｕｃ８コンジュゲートについても見られ、Ｆａｂ’－ＲＬｕｃ８とＦＬＡＧ－ＧＦＰ2のＢＲＥＴ比は、抗体ベースの同等物よりも小さかったが、ＦＬＡＧペプチドの存在下ではＢＲＥＴ比の低下が観察された（図４Ｂ）。これは、Ｆａｂ’－ＲＬｕｃ８コンジュゲート及びＦＬＡＧ－ＧＦＰ2もＦＬＡＧペプチドのセンサーとして使用することができることを示している。
実施例１０．免疫センサーを使用して分析物濃度を決定する競合結合アッセイ
材料及び方法
本発明の免疫センサーを使用して分析物の濃度を検出及び測定できるかどうかを決定するために、抗体－１２／３６－ＲＬｕｃ８コンジュゲートを２００ｎＭのＦＬＡＧ－ＧＦＰ2及び様々な濃度のＦＬＡＧペプチド（２５６μＭから０．５ｎＭ未満）と５分間インキュベートした後、セレンテラジン４００ａを加え、実施例９に記載されるようにＦｌｕｏｒｏｓｔａｒプレートリーダーを使用してＢＲＥＴ比を決定した。ＢＲＥＴ比をＬｏｇ［ＦＬＡＧ］値に対してプロットした。
Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ）及び抗体－２４／３６－ＲＬｕｃ８コンジュゲートを使用してキャリブレーションも実施した。測定は生物発光モードで行い、デュアルリニアバリアブルフィルターをＲＬｕｃ８発光には４１０－８０（ゲイン：３３００）及びＧＦＰ2発光には５１５－３０（ゲイン：４０９５）に設定した。１．５４秒の積分時間を使用した。セレンテラジン４００ａは、乾燥したアリコート（０．５ｍＭ）に１００μＬのエタノールを加えることによって調製し、１μＬを最終アッセイに加えて最終濃度を５μＭにした。最終濃度５ｎＭのＲＬｕｃ８－コンジュゲート及び１０ｎＭのＧＦＰ2－ＦＬＡＧをアッセイに使用した。最終アッセイの体積は、ＰＢＳ（ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）含有）を使用して体積を増やして１００μＬとした。
Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒを使用して標準曲線を作成するために、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳ中の１０ｎＭのＦＬＡＧ－ＧＦＰ2に５ｎＭのｍＡｂ－２４／３６－ＲＬｕｃ８コンジュゲートを加え、この混合物を標識されていないＦＬＡＧペプチド（様々な濃度）と２８℃で５分間インキュベートした。セレンテラジン４００ａを加え、ＢＲＥＴ反応を決定した。ＧＦＰ2強度（平均０～１３．８６秒）をＲＬｕｃ８強度（平均０～１３．８６秒）で割ることによって、ＢＲＥＴ比を算出した。ＢＲＥＴ比は、Ｗｉｎｄｏｗｓ版Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７の正規化機能を使用して正規化し、Ｌｏｇ［ＦＬＡＧ］値に対してプロットし、Ｌｏｇ［アゴニスト］ｖｓ正規化反応－可変傾斜モデルでフィッティングした。
結果
Ｆｌｕｏｒｏｓｔａｒプレートリーダーによる測定について図５に示されるように、ＢＲＥＴ比は、ＦＬＡＧペプチドの濃度に依存した。これは、抗体－１２／３６－ＲＬｕｃ８をＦＬＡＧ－ＧＦＰ2の存在下で使用して試料中のＦＬＡＧペプチドの量を決定することができることを示唆している。曲線の変曲点は、抗体：ＦＬＡＧ相互作用のＫｄにほぼ一致している（１８０ｎＭ，Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。
Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒプレートリーダーと抗体２４／３６－ＲＬｕｃ８コンジュゲートを使用して決定した検量線を図６に示す。ＥＣ50を算出すると、１．４１ｎＭのＦＬＡＧペプチドであった。反応は、５．４１ｐＭ（９０％）と０．３７μＭ（１０％）の間で線形であり、５分のインキュベーションで検出限界は４．１６ｐＭ（ブランク±ＳＤ*３）であった。比較すると，Ｆｉｒｅｆｌｙ／Ｃｙ３．５ ＢＲＥＴシステムに基づくＢＲＥＴアッセイの検出限界は、０．２μＭであり（Ｙａｍａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００２）、ＧｒｅｅｎＬｕｃ／ＡＦ６１０ ＢＲＥＴシステムに基づくＢＲＥＴアッセイの検出限界は、１．７ｎＭであった（Ｓｍｉｒｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。これを表４にまとめる。
以前の研究（Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１）］から、ＦＬＡＧ－抗ＦＬＡＧ相互作用のＫｄは、全抗体で１８０ｎＭ、ＰＥＧ化Ｆａｂ’で約３９０ｎＭであることがわかっている。Ｆｌｕｏｒｏｓｔａｒプレートリーダー、異なるコンジュゲート（ｍＡｂ－１２／３６－ＲＬｕｃ８）及び高濃度（２０×）のｍＡｂ－ＰＥＧ－ＲＬｕｃ８コンジュゲートを使用して実施したアッセイでは、ＥＣ５０は２７４ｎＭとなり、この場合、反応は３２．４ｎＭ～２．３μＭ（最大反応の９０％～１０％）で線形であった（図５）。
結論として、本明細書に記載される免疫センサー及び方法は、低分子量の抗原アッセイの感度を３００倍に高め、以前に公開されたデータ（２０～６０分）と比較してアッセイ時間を５分に短縮した。
Figure 2022531246000030
実施例１１．ＦＬＡＧ－ＧＦＰ2－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯ－アジド－ＰＥＧ８－アンピシリンの合成
材料及び方法
アンピシリン－ＰＥＧ８－Ｎ3の合成：ＰＢＳ（ｐＨ８．０、１ｍＬ）中のアンピシリンのナトリウム塩（４．８ｍｇ、０．０１２８ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ＰＢＳ（ｐＨ８．０、１ｍＬ）中のＮＨＳ－ＰＥＧ８－Ｎ３（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ ＃１０５０３；Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ポリエチレングリコール８）アジド）の溶液を加え、これを２５℃で１６時間攪拌し、遮光した。反応混合物を０．２２μＭアクロディスクフィルターに通して濾過し、次いで、分取ＨＰＬＣによって精製した（逆相Ｃ１８カラム（Ｇｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣ）、１６分かけて０～８０％Ｂで溶出（溶出溶媒：Ａ＝０．１％ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ；Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル）、２１４ｎｍで検出）。１７分での画分を合わせ、真空下で乾燥させた。合わせた画分（８ｍｇ、収率６８．８％）を分析ＬＣ－ＭＳによって分析した（（Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ａＨＰＬＣ、Ｃ１８逆相、ＱＤａ質量検出器）グラジエント溶出０～８０％Ｂ、２１４ｎｍで検出）。ａＨＰＬＣにおける４．０９分での主要ピークは、ＥＳＩ－ｖｅイオンモードでＭＳ７９７．４０（Ｍ＝７９８．９１）であった。
ＦＬＡＧ－ＧＦＰ2－アンピシリンの合成：ＦＬＡＧ－ＧＦＰ2（実施例１）をＰＢＳに脱塩した。２０、３０または４０ｎｍｏｌのＤＢＣＯ－ｄＰＥＧ４－ＴＦＰエステル（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）を２０ｎｍｏｌのタンパク質に加え、混合物を４℃で一晩反応させた。反応混合物をマススペクトロメトリーによって分析し、次いで、プールした。極めて過剰（１．９μｍｏｌ）のアンピシリン－ＰＥＧ８－Ｎ3を５６ｎｍｏｌのＧＦＰ2－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯ反応混合物に加えた。反応を４℃で一晩進行させた後、ゲル濾過によって精製し、タンパク質プールをマススペクトロメトリーによって分析した。
結果
ＦＬＡＧ－ＧＦＰ2とＤＢＣＯ－ｄＰＥＧ４－ＴＦＰエステルを反応させると、コンジュゲートしていないタンパク質と、１、１．５または２当量のＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＴＦＰエステルとの反応におけるＤＢＣＯ－ＰＥＧ４の１つまたは２つの付加物とのコンジュゲートの混合物が生成されることがわかった（データ示さず）。３つの反応の生成物は類似していたので、それらを合わせ、アンピシリン－ＰＥＧ８－Ｎ3と反応させた。質量分析は、未反応のＦＬＡＧ－ＧＦＰ2の混合物、及び１つまたは２つの付加物の混合物（＋１３６５．８、予測では＋１３４８．６）を示した。
実施例１２．ナノボディ－Ｒｌｕｃ８の調製
分子生物学：単一ドメインラクダナノボディＶＨＨ Ｔ９（Ｔ９－ＮＢ１；Ｔａｂａｒｅｓ－ｄａ Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１１）をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列（Ｅ．ｃｏｌｉ発現用）は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）が合成した。これを、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグ、続いて、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）切断部位、Ｔ９－ＮＢ１配列、ＲＬｕｃ８配列及びソルターゼＡバイオコンジュゲーション配列（ＬＰＥＴＧＧ）をコードするように設計された改変ｐＥＴ４３ａＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターにライゲーションした。得られたタンパク質配列を配列番号８に記載する。
タンパク質発現：組み換えＮ－Ｈｉｓ－Ｔ９－ＮＢ１－ＲＬｕｃ８タンパク質を生産するために、発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３株に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した１Ｌ体積のＴＢ中で、ＯＤ６００が０．７に到達するまで、振盪しながら３７℃で成長させた。培養液を１６℃に移し、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭになるように添加することによってタンパク質発現を誘導し、培養液を更に１６時間振盪しながらインキュベートした。発現後、細胞培養物を５０００×ｇで２０分間遠心分離にかけ、細胞ペレットを－２０℃で凍結保存した。
タンパク質精製：タンパク質精製は、細胞ペレットを溶解緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ イミダゾール、０．５ｍｇ／ｍｌ リゾチーム、ベンゾナーゼエンドヌクレアーゼ［ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ＥＤＴＡ不含完全プロテアーゼ阻害錠［Ｒｏｃｈｅ］）中、細胞１ｇあたり５ｍＬの緩衝液の比を使用して、解凍することによって開始した。氷冷したＡｖｅｓｔｉｎ Ｃ５セルクラッシャーに細胞を３回通すことによって更に溶解し、次いで、４８，０００×ｇ、４℃で遠心分離にかけた。上清（細胞溶解物）を５μｍフィルターに通して濾過し、Ｐｒｏｆｉｎｉａアフィニティークロマトグラフィー精製システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、ＩＭＡＣ洗浄緩衝液１（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール）で予め平衡化した１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＩＭＡＣ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。次いで、ＩＭＡＣカラムをＩＭＡＣ洗浄緩衝液１及びＩＭＡＣ洗浄緩衝液２（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール）で順次洗浄した。洗浄後、結合したタンパク質をＩＭＡＣ溶出緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３５０ｍＭ イミダゾール）で溶出した。
Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグを除去し、更にイミダゾール濃度を２０ｍＭまで下げるために、溶出したタンパク質とＴＥＶプロテアーゼを、タンパク質とプロテアーゼのモル比が２０：１になるようにＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ透析膜（ＭＷＣＯ ３５００Ｄａ）で４℃で一晩インキュベートし、１ｍＭ ＤＴＴを添加したＩＭＡＣ洗浄緩衝液２に対して透析した。次いで、透析した消化反応物を１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＩＭＡＣ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムに通し、ｈｉｓタグ付きのＴＥＶプロテアーゼ及び切断されたヘキサヒスチジンタグを捕捉した。その後、カラムをＩＭＡＣ洗浄緩衝液２で２回洗浄し、結合していない画分及び第１のＩＭＡＣ洗浄液（タグのないＴ９－ＮＢ１－ｒＬｕｃ８を含有）をプールした。プールした画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心フィルターユニット（Ｕｌｔｒａ－１５ ＭＷＣＯ１０）を使用して濃縮し、１×ＰＢＳで予め平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムにロードした。適切なピークを回収し、次いで、タンパク質を０．２８ｍｇ／ｍｌに濃縮してから、液体窒素で急速凍結し、－７０℃で保存した。
実施例１３．ＴＣＣ－４’－Ｓ－（ＣＨ2）2－ＣＯ－ＧＦＰ2の合成
一般：特に記載のない限り、全ての試薬及び溶媒は、市販の業者から購入し、受け取ったままの状態で使用した。メチル３－［（４－アミノフェニル）スルファニル］プロパノエートは、ＣｈｅｍＳｐａｃｅがカスタム合成したものであり、受け取ったままの状態で使用した。分析ＬＣ－ＭＳは、ＱＤａ ＥＳＩ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣで、溶媒（溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ／水；溶媒Ｂ：アセトニトリル；実施時間１１分、グラジエント２０～８０％Ｂ）により実施した。
ＴＣＣ－４’－Ｓ－（ＣＨ2）2－ＣＯ2Ｈの合成：
Figure 2022531246000031
 無水テトラヒドロフラン（８ｍＬ）中の３，４－ジクロロフェニルイソシアネート（１２４．１ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）及びメチル３－［（４－アミノフェニル）スルファニル］プロパノエート（１３９．５ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）の混合物を窒素の雰囲気下にて室温で１６時間攪拌した。揮発性物質を減圧下で除去し、残渣をヘキサン／酢酸エチル（１：１、１０ｍＬ）で洗浄し、残った白色固体を減圧下で乾燥させた。分析ＬＣ－ＭＳは、７．１３２分に明確な単一のピークを示し（ＥＳＩ－ＭＳ ＋ｖｅモード、Ａ＝２１４ｎｍ）、ＭＳ予想値はＭＷ３９９．２９であり、実測値は３９９．０８であった。
Figure 2022531246000032
 メチル４－［３－（３，４－ジクロロフェニル）ウレイド］フェニルチオプロピオネート（２６４ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）にメタノール（１５ｍＬ）、続いて、１Ｍ ＮａＯＨ（水溶液）（１５ｍＬ）を加えた。懸濁液を６０℃に１６時間攪拌した。室温まで冷却した後、混合物を０℃で６Ｍ ＨＣｌによりｐＨ４．０まで酸性化した。懸濁液を酢酸エチル／ヘキサン（１：１、５０ｍＬ）で２回抽出し、合わせた有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、続いて、減圧下で揮発性物質を除去して、４｛３－（３，４－ジクロロフェニル）ウレイド］フェニルチオプロピオン酸［ＴＣＣ－４’－Ｓ－（ＣＨ2）2－ＣＯ2Ｈ］を白色固体として得た。分析ＬＣ－ＭＳは、６．４３４分に明確な単一のピークを示し（ＥＳＩ－ＭＳ ＋ｖｅモード、Ａ＝２１４ｎｍ）、ＭＳ予想はＭＷ３８５．２６であり、実測は３８５．０１であった。
ＴＣＣ－４’－Ｓ－（ＣＨ2）2－ＣＯ－ＧＦＰ2の合成：ＴＣＣ－４’－Ｓ－（ＣＨ2）2－ＣＯ2Ｈ（２ｍｇ）をＰＢＳ（ｐＨ７．４、７００μＬ）及び１３５μＬのＤＭＳＯの混合物中に溶解した。次いで、この溶液を室温でＦＬＡＧ－ＧＦＰ2のＰＢＳ中溶液（ｐＨ７．４、１．４０ｍｇ／ｍＬ、１．２５ｍＬ、１．７５ｍｇ）に加えた。個別に、ＥＤＣ（１０ｍｇ）を１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に溶解し、スルホ－ＮＨＳ（１０ｍｇ）を１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に溶解した。１００μＬのＥＤＣ溶液及び１００μＬのｓＮＨＳ溶液をＧＦＰ2／ＴＣＣ－４’－Ｓ－（ＣＨ2）2－ＣＯ2Ｈ混合物に加えた。得られた混合物を室温で穏やかに回転させながら１６時間攪拌した。ＴＣＣ－４’－Ｓ－（ＣＨ2）2－ＣＯ－ＧＦＰ2コンジュゲートを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅプロトコルに従ってＰＤ－１０カラムを使用することによって精製して、３．５ｍＬのＴＣＣ－４’－Ｓ－（ＣＨ2）2－ＣＯ－ＧＦＰ2コンジュゲートを２．８４ｍｇ／ｍＬで得た。
実施例１４：ＢＲＥＴセンサーを使用した低分子の検出
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法及び免疫センサーは、ＴＣＣなどの低分子を検出するために使用することができる。図７は、本明細書に記載される例示の免疫センサーに低分子を加えると、標識された抗原の代わりに標識されていない抗原がナノボディに競合的に結合するため、ＢＲＥＴ比が低下する、競合アッセイの模式図を示す。
機器：二波長同時測定ＢＲＥＴでの測定をＣＬＡＲＩＯｓｔａｒマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ ＬａｂＴｅｃｈ）を用いて実施した。ＢＲＥＴ2の測定には、ＲＬｕｃ／ＣＬＺ４００ａ発光フィルター（４１０ｎｍバンドパス、８０ｎｍ）及びＧＦＰ2発光フィルター（５１５ｎｍバンドパス、３０ｎｍ）を含むＢＲＥＴ2発光フィルターセットを使用した。ＢＲＥＴ2比は、積分アクセプター発光チャネル強度と積分ドナー発光チャネル強度の比として算出した。
ＢＲＥＴ2アッセイ：全ての反応を白色９６ウェルプレートで実施した（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。最終体積１００μＬの２％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ中、最終濃度１０ｎＭのＴ９ＮＢ１－ＲＬｕｃ８及び１０ｎＭのＴＣＣ－４’－Ｓ－（ＣＨ2）2－ＣＯ－ＧＦＰ2を全てのアッセイに使用した。
検量線を作成するために、１０ｎＭのＴ９ＮＢ１－ＲＬｕｃ８及び１０ｎＭのＴＣＣ－４’－Ｓ－（ＣＨ2）2－ＣＯ－ＧＦＰ2を２２℃で５分間インキュベートした。ＴＣＣは、異なる最終濃度範囲、すなわち１、３、６．３、１２．５、２５、５０、１００及び２００ｎＭを用い、ＤＭＳＯ中のＴＣＣストックまたはＤＭＳＯのみ（ＰＢＳ中２％最終濃度）から添加した。インキュベーション時間の終了時に、ＥｔＯＨ中の１μＬのセレンテラジン４００ａ（１ｍＭストック）を反応混合物（最終［ＣＬＺ４００ａ］＝１０μＭ）に加え、直ちに発光強度を記録した。ＢＲＥＴ2比を算出し、ＴＣＣの濃度の関数として図８に示す。標的ＴＣＣ抗原の存在下におけるセンサーコンストラクトのＢＲＥＴ2比は、用量依存的な変化が観察され、ＥＣ50値は１７．３ｎＭであった。
最終体積１００μＬの２％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ中、最終濃度１０ｎＭのＴ９ＮＢ１－ＲＬｕｃ８単独、１０ｎＭのＴＣＣ－４’－Ｓ－（ＣＨ2）2－ＣＯ－ＧＦＰ2を含む１０ｎＭのＴ９ＮＢ１－ＲＬｕｃ８または１０ｎＭのＧＦＰ2を含む１０ｎＭのＴ９ＮＢ１－ＲＬｕｃ８を対照アッセイに使用した。対照アッセイのために、精製したタンパク質を２２℃で５分間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、ＥｔＯＨ中の１μＬのセレンテラジン４００ａ（１ｍＭストック）を反応混合物（最終［ＣＬＺ４００ａ］＝１０μＭ）に加え、直ちに発光強度を記録した。ＢＲＥＴ2比を算出し、これを図９に示す。
本出願は、２０１９年５月１日に出願されたオーストラリア特許出願第２０１９９０１４８３号及び２０１９年５月８日に出願されたオーストラリア特許出願第２０１９９０１５６６号の優先権を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
当業者であれば、広く記載される本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、具体的な実施形態で示された本発明に多くの変形形態及び／または改変がなされ得ることを認識するであろう。したがって、本実施形態は、全ての点において例示的なものであり、限定的ではないとみなされるべきである。
本明細書で議論及び／または参照される全ての公開物は、その全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に含まれている文書、行為、材料、デバイス、物品などのいかなる説明も、本発明の文脈を提供する目的のためだけのものである。これらの事項の一部または全ては、本出願の各請求項の優先日前に存在していた本発明に関連する分野における先行技術の基礎の一部または共通の一般的知識であったことが承認されたものとはみなさない。
参考文献
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Claims (69)

  1. 試料中の分析物を検出するための方法であって、
    ｉ）前記試料を、
    化学発光共鳴エネルギー転移（ＣＲＥＴ）ペアの第１の構成成分に結合している、前記分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子、及び
    前記ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、前記抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原と接触させることであって、
    前記標識された抗原が前記抗体または抗体様分子に結合した場合、前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分と前記ＣＲＥＴペアの前記第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が１０～７５％の範囲内である、前記接触させることと、
    ｉｉ）前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分と前記ＣＲＥＴペアの前記第２の構成成分との間の前記エネルギー転移の効率が前記試料の存在下で変化したかどうかを決定することであって、
    前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分と前記第２の構成成分との間の前記エネルギー転移の効率の低下は、前記分析物が前記試料中に存在することを示す、前記決定することと、を含む、前記方法。
  2. 前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分がポリペプチドであり、前記ＣＲＥＴペアの前記第２の構成成分がポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分がＢＲＥＴドナードメインを含み、前記ＣＲＥＴペアの前記第２の構成成分がＢＲＥＴアクセプタードメインを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分がＢＲＥＴアクセプタードメインを含み、前記ＣＲＥＴペアの前記第２の構成成分がＢＲＥＴドナードメインを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
  5. 前記抗体または抗体様分子が、リンカーを介して、前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分に結合している、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記リンカーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖、炭化水素鎖、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記リンカーが、ＰＥＧ10～ＰＥＧ60を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記リンカーがＰＥＧn－Ｌ－ＰＥＧmを含み、式中、ｍ及びｎは独立して０～４０の整数であり、Ｌはコンジュゲーション要素である、請求項６に記載の方法。
  9. 前記標識された抗原が前記抗体または抗体様分子に結合した場合、前記第１の構成成分から前記第２の構成成分への前記エネルギー転移の効率が１５～６５％の範囲内である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分が、前記抗体または抗体様分子の抗原結合部位に結合していない、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記抗体または抗体様分子と前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分との間の前記結合が、部位特異的である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分が、前記抗体または抗体様分子の残基の側鎖に結合している、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記残基がシステインである、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記残基が、鎖間ジスルフィド結合に関与するシステインである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記残基が、前記抗体または抗体様分子のヒンジ領域内のシステインであるか、あるいは、前記残基が、重鎖－軽鎖ジスルフィド結合に関与するシステインであるか、あるいは、両方の組み合わせである、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分が、炭水化物部分を介して、前記抗体または抗体様分子に結合している、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記抗体または抗体様分子が、２つの結合している前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分を有し、それらは同じである、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記抗体または抗体様分子が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、モノクローナル抗体、Ｆａｂ’、ｒＩｇＧ（半抗体）、ｆ（ａｂ’）2、ナノボディ、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、モノボディ、アビマー、マイクロボディ、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖマルチマー、単一ドメイン抗体または単一ドメイン融合抗体である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記抗体または抗体様分子が、ＩｇＧ、Ｆａｂ’、ｒＩｇＧ（半抗体）またはｆ（ａｂ’）2である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記抗体または抗体様分子がＩｇＧである、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記抗体または抗体様分子がモノクローナル抗体である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記抗体または抗体様分子がナノボディである、請求項１８に記載の方法。
  23. 前記分析物が、有機低分子、薬物、薬物代謝産物、抗生物質、ホルモン、アレルゲン、ペプチド、タンパク質、天然に存在する抗体、糖、脂質または核酸である、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記ＣＲＥＴペアの前記第１または第２の構成成分が、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－グルクロニダーゼまたはβ－グルコシダーゼからなる群から選択される生物発光タンパク質である、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記生物発光タンパク質が、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｔｅルシフェラーゼ、北アメリカグローワームルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、鉄道虫ルシフェラーゼ、バクテリアルシフェラーゼ、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、イクオリン、Ａｒａｃｈｎｏｃａｍｐａルシフェラーゼ、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓルシフェラーゼ、またはこれらのいずれか１つの生物学的に活性なバリアントもしくは断片、またはこれらの２つ以上のキメラからなる群から選択されるルシフェラーゼである、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記ＣＲＥＴペアの前記第１または第２の構成成分が、基質を修飾することが可能である、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記基質が、ルシフェリン、カルシウム、セレンテラジン、フリマジン、またはセレンテラジン、ルシフェリンもしくはフリマジンの誘導体、類似体もしくは安定化された誘導体である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記ＣＲＥＴペアの前記第１または第２の構成成分が、蛍光アクセプタードメインである、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記蛍光アクセプタードメインが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの青色蛍光バリアント（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光バリアント（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光バリアント（ＹＦＰ）、改良されたＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、スーパーファルダーＧＦＰ、Ａｚａｍｉ ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、ＴａｇＧＦＰ、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、改良されたＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、ＣｙＰＥＴ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ－Ｉｓｈｉ ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１（Ｔｅａｌ）、改良されたＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＯｒａｎｇｅ、Ｔｏｐａｚ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＴａｇＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ｄＫｅｉｍａ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｔ－ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＡＱ１４３、ＤｓＲｅｄ２、ｔ－ダイマー２、ｔダイマー２（１２）、ｍＲＦＰ１、ｍＴａｎｇａｒｉｎｅ、ポシロポリン、Ｒｅｎｉｌｌａ ＧＦＰ、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ ＧＦＰ、Ｍｏｎｓｔｅｒ ＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅタンパク質、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲｕｂｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ＪＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ＴａｇＲＦＰ、ＴｕｒＢｏＦＢ、及びＲ－フィコエリトリン（Ｒ－ＰＥ）、Ｂ－フィコエリトリン（Ｂ－ＰＥ）、Ｃ－フィコシアニン（ＣＰＣ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）及びＲ－フィコシアニン（ＲＰＣ）を含むフィコビリタンパク質、ならびにこれらのいずれか１つの生物学的に活性なバリアントまたは断片からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分がＲＬｕｃ８であり、前記ＣＲＥＴペアの前記第２の構成成分がＧＦＰ2である、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記標識された抗原が前記抗体または抗体様分子に特異的に結合した場合、前記ドナードメイン及び前記アクセプタードメインの距離及び相対配向は、前記ＢＲＥＴペアのフェルスター距離の±５０％以内である、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記ＢＲＥＴペアの前記フェルスター距離が、約４ｎｍ～約１８ｎｍであるか、または約６ｎｍ～約１２ｎｍであるか、または約７．５ｎｍ～１０．５ｎｍである、請求項３１に記載の方法。
  33. ステップ（ｉｉ）が、前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分と前記ＣＲＥＴペアの前記第２の構成成分との間の前記エネルギー転移の効率が前記試料の存在下で低下したかどうかを決定することを含む、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. ステップ（ｉ）が、
    （ａ）最初に、前記試料を前記抗体もしくは抗体様分子と接触させ、次いで、得られた混合物を前記標識された抗原と接触させること、
    （ｂ）最初に、前記試料を前記標識された抗原と接触させ、次いで、得られた混合物を前記抗体もしくは抗体様分子と接触させること、または
    （ｃ）前記試料を前記抗体もしくは抗体様分子及び前記標識された抗原と同時に接触させることを含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記方法が、二次抗体を必要としない、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記試料中の前記分析物の濃度を決定することを更に含む、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. ＣＲＥＴペアであって、
    ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している、分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子と、
    ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、前記抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原と、を含み、
    前記標識された抗原が前記抗体または抗体様分子に結合した場合、前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分と前記ＣＲＥＴペアの前記第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が１０～７５％の範囲内である、前記ＣＲＥＴペア。
  38. 抗体または抗体様分子であって、ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合しており、
    ｉ）分析物、及び
    ｉｉ）ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、前記抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原に、結合することが可能であり、
    前記標識された抗原が前記抗体または抗体様分子に結合した場合、前記第１の構成成分と前記第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が１０～７５％の範囲内である、前記抗体または抗体様分子。
  39. 試料中の分析物を検出するためのマイクロ流体システムであって、
    ｉ）ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している、前記分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子を含むのに好適な少なくとも１つのリザーバーと、
    ｉｉ）ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、前記抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原を含むのに好適な少なくとも１つのリザーバーと、
    ｉｉｉ）１つ以上のマイクロチャネルを含むマイクロ流体デバイスと、
    ｉｖ）前記抗体または抗体様分子、前記標識された抗原、前記試料及び前記ＣＲＥＴペアの前記第１または第２の構成成分の基質を前記デバイス内で混合するための手段と、
    ｖ）前記抗体または抗体様分子に対する前記分析物の結合を検出するための反応チャンバーと、
    ｖｉ）電気光学センシングデバイスと、を含み、
    前記標識された抗原が前記抗体または抗体様分子に結合した場合、前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分と前記ＣＲＥＴペアの前記第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が１０～７５％の範囲内であり、
    前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分と前記第２の構成成分との間の前記エネルギー転移の効率の低下は、前記分析物が前記試料中に存在することを示す、前記システム。
  40. 前記抗体または抗体様分子が、前記デバイスに固定されていない、請求項３９に記載のシステム。
  41. リアルタイムで前記分析物を検出するために使用することができる、請求項３９または請求項４０に記載のシステム。
  42. 前記抗体または抗体様分子、標識された抗原及び基質が、異なるマイクロチャネルを通って前記デバイスに入る、請求項３９～４１のいずれか１項に記載のシステム。
  43. 前記マイクロ流体デバイスが、少なくとも２つの入力マイクロチャネルを備え、前記入力マイクロチャネルの１つは、前記抗体または抗体様分子を前記デバイスに流すためのものである、請求項３９～４２のいずれか１項に記載のシステム。
  44. 前記電気光学センシングデバイスが、少なくとも２つの異なる波長チャネルを備える、請求項３９～４３のいずれか１項に記載のシステム。
  45. 前記電気光学センシングデバイスが、２つの異なる波長チャネルを同時にまたは迅速に連続して検出することが可能である、請求項４４に記載のシステム。
  46. 前記電気光学センシングデバイスが、２つの異なる波長チャネルを１秒未満で検出することが可能である、請求項４５に記載のシステム。
  47. 前記マイクロ流体デバイスが、２つ以上の分析物の検出ができるように設計される、請求項３９～４６のいずれか１項に記載のシステム。
  48. 分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子を特定する方法であって、
    ｉ）前記抗体または抗体様分子をＣＲＥＴペアの第１の構成成分に連結する異なるリンカーを有する２つ以上の抗体または抗体様分子を得ることと、
    ｉｉ）前記２つ以上の抗体または抗体様分子を、前記ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、前記抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原と接触させることと、
    ｉｉｉ）前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分と前記ＣＲＥＴペアの前記第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率を測定することと、
    ｉｖ）前記標識された抗原に結合した場合、１０～７５％の範囲内である前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分と前記ＣＲＥＴペアの前記第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率を有する、少なくとも１つの抗体または抗体様分子を選択することと、を含む、前記方法。
  49. ステップｉｖ）が、前記標識された抗原に結合した場合、前記２つ以上の抗体または抗体様分子のうち、前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分と前記ＣＲＥＴペアの前記第２の構成成分との間の前記エネルギー転移の効率がより高い前記抗体または抗体様分子を選択することを含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記選択された抗体または抗体様分子の前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分と前記ＣＲＥＴペアの前記第２の構成成分との間の前記エネルギー転移の効率が、前記標識された抗原に結合している場合、５０～７５％の範囲内である、請求項４８または請求項４９に記載の方法。
  51. ｖ）２つ以上の標識された抗原を得ることであって、それぞれの標識された抗原は、任意選択のリンカーを介してＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、前記選択された抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含み、前記２つ以上の標識された抗原は、（ｉ）異なるリンカー、及び／または（ｉｉ）異なる長さの抗原を含む、前記得ることと、
    ｖｉ）前記２つ以上の標識された抗原を、前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分に結合している、分析物に結合することが可能な前記選択された抗体または抗体様分子と接触させることと、
    ｖｉｉ）前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分と前記ＣＲＥＴペアの前記第２の構成成分との間の前記エネルギー転移の効率を測定することと、
    ｖｉｉｉ）前記選択された抗体または抗体様分子に結合した場合、１０～７５％の範囲内である前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分と前記ＣＲＥＴペアの前記第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率を有する、少なくとも１つの標識された抗原を選択することと、を更に含む、請求項４８～５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 標識された抗原を特定する方法であって、
    ｉ）２つ以上の標識された抗原を得ることであって、それぞれの標識された抗原は、任意選択のリンカーを介してＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含み、前記２つ以上の標識された抗原は、（ｉ）異なるリンカー、及び／または（ｉｉ）異なる長さの抗原を含む、前記得ることと、
    ｉｉ）前記２つ以上の標識された抗原を、前記ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している、分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子と接触させることと、
    ｉｉｉ）前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分と前記ＣＲＥＴペアの前記第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率を測定することと、
    ｉｖ）前記抗体または抗体様分子に結合した場合、１０～７５％の範囲内である前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分と前記ＣＲＥＴペアの前記第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率を有する、少なくとも１つの標識された抗原を選択することと、を含む、前記方法。
  53. ステップｉｖ）が、前記抗体または抗体様分子に結合した場合、前記２つ以上の標識された抗原のうち、前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分と前記ＣＲＥＴペアの前記第２の構成成分との間の前記エネルギー転移の効率がより高い前記標識された抗原を選択することを含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記選択された標識された抗原の前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分と前記ＣＲＥＴペアの前記第２の構成成分との間の前記エネルギー転移の効率が、前記抗体または抗体様分子に結合した場合、５０～７５％の範囲内である、請求項５２または請求項５３に記載の方法。
  55. ｖ）前記抗体または抗体様分子をＣＲＥＴペアの第１の構成成分に連結する異なるリンカーを有する２つ以上の抗体または抗体様分子を得ることと、
    ｖｉ）前記２つ以上の抗体または抗体様分子を、前記選択された標識された抗原と接触させることと、
    ｖｉｉ）前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分と前記ＣＲＥＴペアの前記第２の構成成分との間の前記エネルギー転移の効率を測定することと、
    ｖｉｉｉ）前記選択された標識された抗原に結合した場合、１０～７５％の範囲内である前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分と前記ＣＲＥＴペアの前記第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率を有する、少なくとも１つの抗体または抗体様分子を選択することと、を更に含む、請求項５２～５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 試料を分類する方法であって、
    ｉ）試料を、
    ａ）ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している、分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子、及び
    ｂ）ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、前記抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原と接触させることであって、
    前記標識された抗原が前記抗体または抗体様分子に結合した場合、前記第１の構成成分と前記第２の構成成分との間の前記エネルギー転移の効率が１０～７５％の範囲内であり、
    １つ以上の分析物が前記抗体または抗体様分子に結合する場合、前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分と前記第２の構成成分との間の前記エネルギー転移の効率が変化する、前記接触させることと、
    ｉｉ）前記エネルギー転移の効率の前記変化に基づいて前記試料を分類することと、を含む、前記方法。
  57. ステップ（ｉｉ）が、次の１つ以上または全て：
    Ａ）電気光学センシングデバイスを使用して、前記ＣＲＥＴペアの前記第１または前記第２の構成成分による基質の修飾を検出すること、
    Ｂ）前記電気光学センシングデバイスから少なくとも１つのシグナルを処理し、電気光学応答のパターンを１つ以上の目的の試料の１つ以上の所定の特徴と相関させること、
    Ｃ）前記応答パターンの前記相関に基づいて前記試料を分類すること、を含む、請求項５６に記載の方法。
  58. ステップ（ｉ）が、
    Ａ）１つ以上のマイクロチャネルを備えるマイクロ流体デバイスに、
    ａ）前記試料、
    ｂ）前記抗体または抗体様分子、
    ｃ）前記標識された抗原、及び
    ｄ）前記ＣＲＥＴペアの前記第１または第２の構成成分の基質を流すことと、
    Ｂ）前記抗体または抗体様分子、標識された抗原、試料及び基質を前記デバイス内で混合することと、を含む、請求項５６または請求項５７に記載の方法。
  59. ２つ以上の異なる抗体または抗体様分子を含み、そのそれぞれは、異なる分析物及び２つ以上の異なる標識された抗原に結合し、ステップｉｉ）は、前記分析物のそれぞれまたは様々な分析物の存在、非存在または濃度に基づいて前記試料を分類することを含む、請求項５６～５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. リアルタイムで前記試料を分類するために使用することができる、請求項５６～５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記抗体または抗体様分子が、前記デバイスに固定されていない、請求項５８～６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記抗体または抗体様分子及び基質が、異なるマイクロチャネルを通ってデバイスに入る、請求項５８～６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. 試料を分類するためのマイクロ流体システムであって、
    ｉ）ＣＲＥＴペアの第１の構成成分に結合している、前記分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子を含むのに好適な少なくとも１つのリザーバーと、
    ｉｉ）前記ＣＲＥＴペアの第２の構成成分に結合している、前記抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原を含むのに好適な少なくとも１つのリザーバーと、
    ｉｉｉ）１つ以上のマイクロチャネルを含むマイクロ流体デバイスと、
    ｉｖ）前記抗体または抗体様分子、前記標識された抗原、前記試料及び前記ＣＲＥＴペアの前記第１または第２の構成成分の基質を前記デバイス内で混合するための手段と、
    ｖ）前記抗体または抗体様分子に対する前記分析物の結合を検出するための反応チャンバーと、
    ｖｉ）電気光学センシングデバイスと、を含み、
    前記標識された抗原が前記抗体または抗体様分子に結合した場合、前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分と前記ＣＲＥＴペアの前記第２の構成成分との間のエネルギー転移の効率が１０～７５％の範囲内であり、
    前記ＣＲＥＴペアの前記第１の構成成分と前記第２の構成成分との間の前記エネルギー転移の効率の低下は、前記分析物が前記試料中に存在することを示す、前記システム。
  64. ２つ以上の異なる抗体または抗体様分子を含み、そのそれぞれは、異なる分析物または様々な分析物及び２つ以上の異なる標識された抗原に結合する、請求項６３に記載のシステム。
  65. リアルタイムで試料を分類するために使用することができる、請求項６３または請求項６４に記載のシステム。
  66. 前記抗体または抗体様分子が、前記デバイスに固定されていない、請求項６３～６５のいずれか１項に記載のシステム。
  67. 前記抗体または抗体様分子、標識された抗原及び基質が、異なるマイクロチャネルを通って前記デバイスに入る、請求項６３～６６のいずれか１項に記載のシステム。
  68. 前記マイクロ流体デバイスが、少なくとも２つの入力マイクロチャネルを備え、前記入力マイクロチャネルの１つは、前記抗体または抗体様分子を前記デバイスに流すためのものである、請求項６３～６７のいずれか１項に記載のシステム。
  69. 試料中の分析物を検出する方法であって、
    ｉ）前記試料を、セレンテラジンの存在下で、
    ａ）Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼまたはそのバリアントに結合している、前記分析物に結合することが可能な抗体または抗体様分子、及び
    ｂ）緑色蛍光タンパク質２に結合している、前記抗体または抗体様分子に結合することが可能な抗原を含む、標識された抗原に接触させることと、
    ｉｉ）前記Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼと前記緑色蛍光タンパク質２との間の生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）が変更されるかどうかを決定することであって、前記Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼと前記緑色蛍光タンパク質２との間の前記エネルギー転移の効率の低下は、前記分析物が前記試料中に存在することを示す、前記決定することと、を含む、前記方法。
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