KR20220034034A - 면역센서 - Google Patents

면역센서 Download PDF

Info

Publication number
KR20220034034A
KR20220034034A KR1020217039177A KR20217039177A KR20220034034A KR 20220034034 A KR20220034034 A KR 20220034034A KR 1020217039177 A KR1020217039177 A KR 1020217039177A KR 20217039177 A KR20217039177 A KR 20217039177A KR 20220034034 A KR20220034034 A KR 20220034034A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
cret
pair
component
molecule
Prior art date
Application number
KR1020217039177A
Other languages
English (en)
Inventor
주디스 스코블
샬롯 윌리엄스
스튜어트 너톨
레지나 수르자디
헬렌 다크레스
스티븐 트로웰
Original Assignee
커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2019901483A external-priority patent/AU2019901483A0/en
Application filed by 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 filed Critical 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션
Publication of KR20220034034A publication Critical patent/KR20220034034A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
    • G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 시료에서 분석물을 검출하는 방법에 관한 것이다. 방법은 또한 시료에서 분석물의 양을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 이 방법에서 사용하기 위한 항체 또는 항체 유사 분자 및 표지된 항원에 관한 것이다.

Description

면역센서
본 발명은 시료에서 분석물을 검출하는 방법에 관한 것이다. 방법은 또한 시료에서 분석물의 양을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 사용하기 위한 항체 또는 항체-유사 분자 및 표지된 항원에 관한 것이다.
분석물 검출 방법은 식품, 환경 및 의료 산업을 포함하는, 많은 산업에서 매우 중요하다. 예를 들어, 병리학적 상태를 조기에 발견하면 성공적인 치료 가능성이 더 높은 단계에서 이러한 상태를 식별할 수 있다. 또한, 미량의 식품 단백질 검출은 오염된 식품에 대한 심각한 알레르기 반응을 예방하는 데 도움이 될 수 있다. 현재 시료에서 분석물을 검출하는 데 사용할 수 있는 많은 방법이 있다. 예를 들어, 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA), 측면 유동 면역분석법 및 웨스턴 블롯 면역분석법이 널리 사용된다. 이러한 모든 분석법은 이종 분석 형식을 사용하여 수행되고 고체 표면에 항체 또는 항원의 고정이 필요하다. 이러한 분석법은 시간이 많이 걸리고 필요한 여러 세척 주기 및/또는 배양/세척 단계로 인해 작업자 오류가 발생하기 쉽다.
바이오센서는 시료에서 분석물을 검출하기 위해 개발되었다. 광범위한 분자에 신속하고 특이적으로 반응하는 바이오센서, 및 생물학적 분석의 능력은 임상 진단/모니터링, 환경 및 식품 안전, 국방 및 생물보안 적용과 매우 관련성이 있다. 바이오센서는 분석물 검출을 위한 생물학적 인식 요소를 필요로 하고 펩티드, 효소, 수용체, 핵산 및 항체를 포함할 수 있다 (Bhalla 등, 2016). 그러나, 낮은 농도에서 특정 분석물을 검출하기 위해 필요한 감도와 선택성을 가진 생물학적 인식 요소를 식별하는 것은 바이오센서 개발의 근본적인 과제로 남아 있다. 따라서, 시료에서 분석물의 양을 검출하고 정량화하는　개선된 방법, 바람직하게는 다중 분석물에 적용되고/되거나 분석을 위해 시료를 원격지로 보낼 필요가 없는, 실시간으로 수행될 수 있는 방법이 필요하다.
발명의 요약
본 발명자는 시료에서 분석물을 검출하는데 사용될 수 있는 면역센서를 확인하였다. 본 발명자는 또한 이들 면역센서를 사용하여 시료에서 분석물의 존재를 검출하는 방법을 확인하였다. 일부 구현예에서, 이러한 면역센서 및 방법은 시료에서 분석물의 농도를 측정하는데 사용될 수 있다.
한 양태에서, 하기 단계를 포함하는, 시료에서 분석물을 검출하는 방법이 제공된다:
i) 시료를
화학발광 공명 에너지 전달 (CRET) 쌍의 제1 구성성분에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자; 및
CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원와 접촉시키는 단계로,
여기서, 표지된 항원이 상기 항체 또는 항체 유사 분자와 결합될 때, CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 10 내지 75%의 범위인 단계; 및
ii) CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율이 시료의 존재하에 변경되었지를 결정하는 단계로,
여기서 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율의 감소는 분석물이 시료에 존재함을 나타내는 단계.
일부 구현예에서, 단계 (i)는 시료를 기질과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 CRET 쌍의 제1 구성성분은 폴리펩티드이고 상기 CRET 쌍의 제2 구성성분은 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, 상기 CRET 쌍의 제1 구성성분은 BRET 공여자 도메인을 포함하고 CRET 쌍의 제2 구성성분은 BRET 수용자 도메인을 포함한다. 대안적인 구현예에서, 상기 CRET 쌍의 제1 구성성분은 BRET 수용자 도메인을 포함하고 CRET 쌍의 제2 구성성분은 BRET 공여자 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자는 링커를 통해 CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된다. 적합한 링커는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 사슬, 탄화수소 사슬, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 PEG8 내지 PEG60를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 PEGn-L-PEGm을 포함하고, 여기서 m 및 n은 독립적으로 0 내지 40의 정수이고 L은 접합 요소이다.
일부 구현예에서, 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때 제1구성성분에서 제2 구성성분으로의 에너지 전달의 효율은 15 내지 65%의 범위이다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자와 CRET 쌍의 제1 구성성분 사이의 부착은 부위 특이적이다. 일부 구현예에서, 상기 CRET 쌍의 제1 구성성분은 항체 또는 항체 유사 분자의 항원 결합 부위에 부착되지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 CRET 쌍의 제1 구성성분은 항체 또는 항체 유사 분자의 잔기의 측쇄에 부착된다. 일부 구현예에서, 상기 잔기는 시스테인이다. 일부 구현예에서, 상기 잔기는 사슬 내 이황화 결합에 관여하는 시스테인이다. 일부 구현예에서, 상기 잔기는 항체 또는 항체 유사 분자의 힌지 영역 내의 시스테인이거나 상기 잔기는 중쇄-경쇄 이황화 결합 또는 이의 조합에 관여하는 시스테인이다.
일부 구현예에서, 상기 CRET 쌍의 제1 구성성분은 탄수화물 모이어티를 통해 항체 또는 항체 유사 분자에 부착된다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자는 동일한 CRET 쌍의 2개의 부착된 제1 성분을 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자는 IgG, IgA, IgM, IgE, 단일클론 항체, Fab', rIgG (반항체), f(ab')2, 나노바디, 아피바디, 안티칼린, DARPin, 모노바디, 아비머, 마이크로바디, 키메라 항체, scFv, scFv 다량체, 단일 도메인 항체 또는 단일 도메인 융합 항체이다. 일부 구현예에서 상기 항체 또는 항체 유사 분자는 IgG, Fab', rIgG (반항체) 또는 f(ab')2이다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자는 IgG이다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자는 단일클론 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자는 나노바디이다.
일부 구현예에서, 상기 분석물은 작은 유기 분자, 약물, 약물 대사산물, 항생제, 호르몬, 알레르겐, 자연 발생 독소, 불순물, 미생물, 펩티드, 단백질, 자연 발생 항체, 구아, 지질 또는 핵산이다. 일부 구현예에서, 상기 분석물은 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 상기 분석물은 항생제이다. 일부 구현예에서, 상기 분석물은 항균제이다. 일부 구현예에서, 상기 분석물은 항진균제이다. 일부 구현예에서 상기 분석물은 자연 발생 독소이다. 일부 구현예에서 상기 분석물은 불순물이다. 일부 구현예에서 상기 분석물은 미생물이다. 일부 구현예에서 상기 분석물은 작은 유기 분자이다.
일부 구현예에서, 상기 CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분은 루시퍼라제, β-갈락토시다제, 락타마제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-글루쿠로니다제 또는 β-글루코시다제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생물발광 단백질이다. 일부 구현예에서, 상기 생물발광 단백질은 레닐라 루시퍼라제, 반딧불이 루시퍼라제, 코엘렌테레이트 루시퍼라제, 북미 개똥벌레 루시퍼라제, 방아벌레 루시퍼라제, 딱정벌레 루시퍼라제, 박테리아 루시퍼라제, 가우시아 루시퍼라제, 에쿼린, 아라크노캄파 루시퍼라제, 오플로포러스 크라실리로스트리스 루시퍼라제 또는 이들 중 어느 하나의 생물학적 활성 변이체 또는 단편, 둘 이상의 키메라로 이루어진 그룹으로부터 선택된 루시퍼라제이다. 일부 구현예에서, 상기 생물발광 단백질은 레닐라 루시퍼라제 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 생물발광 단백질은 RLuc8이다.
일부 구현예에서, 상기 CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분은 기질을 변형할 수 있다. 적합한 기질은 루시페린, 칼슘, 코엘레테라진, 푸리마진 또는 코엘레테라진, 루시페린 또는 푸리마진의 유도체, 유사체 또는 안정화된 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분은 형광 수용자 도메인이다. 일부 구현예에서, 상기 형광 수용자 도메인은 녹색 형광 단백질 (GFP), GFP의 청색 형광 변이체 (BFP), GFP의 청록색 형광 변이체 (CFP), GFP의 황색 형광 변이체 (YFP), 강화 GFP (EGFP), 슈퍼폴더 GFP, 아자미 그린, mWasabi, TagGFP, 터보 GFP, AcGFP, ZsGreen, T-Sapphire, 강화 CFP (ECFP), CyPET, AmCyan1, 미도리-이시 그린, TagCFP, mTFP1 (Teal), 강화 YFP (EYFP), GFPS65T, 에메랄드, 비너스, mOrange, 토파즈, mCitrine, YPet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow, mBanana, 쿠사비라 오렌지, 쿠사비라 오렌지2, mOrange, mOrange2, GFPuv, 불안정화 EGFP (dEGFP), 불안정화 ECFP (dECFP), 불안정화 EYFP (dEYFP), dKeima-탠덤, HcRed, HcRed-탠덤, t-HcRed, AQ143, DsRed, DsRed2, t-dimer2, tdimer2(12), mRFP1, mTangarine, 포실로포린, 레닐라 GFP, 에쿼리아 빅토리아 GFP, 몬스터 GFP, paGFP, 카에데 단백질, tdTomato, mCherry, mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2, JRed, HcRed1, mRaspberry, mPlum, TagRFP, 터보FP 및 R-피코에리트린 (R-PE), B-피코에리트린 (B-PE), C-피코시아닌 (CPC) 알로피코시아닌 (APC) 및 R-피코시아닌 (RPC)을 포함하는 피코빌리단백질 및 이들 중 어느 하나의 생물학적 활성 변이체 또는 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 형광 수용자 도메인은 GFP 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 형광 수용자 도메인은 GFP2이다.
일부 구현예에서, 상기 CRET 쌍의 제1 구성성분은 RLuc8이고 CRET 쌍의 제2 구성성분은 GFP2이다.
일부 구현예에서, 상기 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 특이적으로 결합될 때, 상기 공여자 도메인 및 수용자 도메인의 분리 및 상대적 배향은 BRET 쌍의 푀르스터 거리의 ±50% 이내이다. 일부 구현예에서, 상기 BRET 쌍의 푀르스터 거리는 약 4 nm 내지 약 18 nm, 또는 약 6 nm 내지 약 12 nm, 또는 약 7.5 nm 내지 10.5 nm이다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)는 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율이 시료의 존재하에 감소되었는지를 결정하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (i)는
(a) 먼저 시료를 항체 또는 항체 유사 분자와 접촉시킨 다음 생성된 혼합물을 표지된 항원과 접촉시키는 단계;
(b) 먼저 시료를 표지된 항원과 접촉시킨 다음 생성된 혼합물을 항체 또는 항체 유사 분자와 접촉시키는 단계; 또는
(c) 시료를 항체 또는 항체 유사 분자 및 표지된 항원과 동시에 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 2차 항체가 필요하지 않다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 시료에서 분석물의 농도를 결정하는 것을 추가로 포함한다.
다른 양태에서,
CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자; 및
CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원;
를 포함하는 CRET 쌍이 제공되고,
상기 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 10 내지 75%의 범위이다.
또 다른 양태에서, CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착되고
i) 분석물; 및
ii) CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원
에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자가 제공되고,
상기 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때 제1 구성성분과 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 10 내지 75%의 범위이다.
또 다른 양태에서, 시료에서 분석물을 검출하기 위한 미세유체 시스템이 제공되고, 상기 시스템은
i) CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자를 함유하기에 적합한 적어도 하나의 저장소,
ii) CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원을 함유하기에 적합한 적어도 하나의 저장소;
iii) 하나 이상의 마이크로채널을 포함하는 미세유체 장치,
iv) 장치에서 항체 또는 항체 유사 분자, 표지된 항원, 시료 및 CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분의 기질을 혼합하기 위한 수단,
v) 항체 또는 항체 유사 분자에 대한 분석물의 결합을 검출하기 위한 반응 챔버, 및
vi) 전기 광학 감지 장치를 포함하고
여기서, 상기 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자가 결합될 때, CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 10 내지 75%의 범위이고; 그리고
여기서 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율의 감소는 분석물이 시료에 존재함을 표시한다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자는 장치에 고정되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자, 표지된 항원 및 기질은 상이한 마이크로채널을 통해 장치로 들어간다. 일부 구현예에서, 상기 미세유체 장치는 적어도 2개의 입력 마이크로채널을 포함하고, 여기서 입력 마이크로채널 중 하나는 항체 또는 항체 유사 분자를 장치 내로 흐르게 하기 위한 것이다.
일부 구현예에서, 상기 미세유체 시스템은 실시간으로 분석물을 검출하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 미세유체 장치는 둘 이상의 분석물의 검출을 가능하게 하도록 설계된다.
일부 구현예에서, 상기 전기 광학 감지 장치는 적어도 2개의 상이한 파장 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 전기 광학 감지 장치는 동시에, 또는 빠르게 연속적으로, 2개의 상이한 파장 채널을 검출할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 전기 광학 감지 장치는 1초 미만으로 2개의 상이한 파장 채널을 검출할 수 있다.
또 다른 양태에서, 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자를 확인하는 방법이 제공되고, 상기 방법은
i) 항체 또는 항체 유사 분자를 CRET 쌍의 제1 구성성분에 연결하는 상이한 링커를 갖는 둘 이상의 항체 또는 항체 유사 분자를 수득하는 단계,
ii) 둘 이상의 항체 또는 항체 유사 분자를 CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원과 접촉시키는 단계,
iii) CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율을 측정하는 단계, 및
iv) 표지된 항원에 결합될 때, CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달 효율이 10 내지 75%의 범위인, 적어도 하나의 항체 또는 항체 유사 분자를 선택하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 iv)는 표지된 항원에 결합될 때, 둘 이상의 항체 또는 항체 유사 분자의 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 더 높은 효율의 에너지 전달을 갖는 항체 또는 항체 유사 분자를 선택하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 표지된 항원에 결합될 때, 선택된 항체 또는 항체 유사 분자의 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 50 내지 75%의 범위이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:
v) 둘 이상의 표지된 항원을 수득하는 단계, 각각 표지된 항원은 선택적 링커를 통해 CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 선택된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하고; 여기서 둘 이상의 표지된 항원은 (i) 상이한 링커, 및/또는 (ii) 상이한 길이의 항원을 포함하고,
vi) 상기 둘 이상의 표지된 항원을 CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 선택된 항체 또는 항체 유사 분자와 접촉시키는 단계,
vii) CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율을 측정하는 단계, 및
viii) 선택된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때, 10 내지 75%의 범위인 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율을 갖는 적어도 하나의 표지된 항원을 선택하는 단계.
또 다른 양태에서, 하기 단계를 포함하는, 표지된 항원을 확인하는 방법이 제공된다:
i) 둘 이상의 표지된 항원을 수득하는 단계로, 각각 표지된 항원은 선택적 링커를 통해 CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하고; 여기서 둘 이상의 표지된 항원은 (i) 상이한 링커; 및/또는 (ii) 상이한 길이의 항원을 포함하는 것인 단계,
ii) 둘 이상의 표지된 항원을 CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자와 접촉시키는 단계,
iii) CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율을 측정하는 단계, 및
iv) 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때, 10 내지 75%의 범위인 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달 효율을 갖는 적어도 하나의 표지된 항원을 선택하는 단계.
일부 구현예에서, 단계 iv)는 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때, 둘 이상의 표지된 항원의 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 더 높은 효율의 에너지 전달을 갖는 표지된 항원을 선택하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때 선택된 표지된 항원의 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율 50 내지 75%의 범위이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:
v) 항체 또는 항체 유사 분자를 CRET 쌍의 제1 구성성분에 연결하는 상이한 링커를 갖는 둘 이상의 항체 또는 항체 유사 분자를 수득하는 단계,
vi) 상기 둘 이상의 항체 또는 항체 유사 분자를 선택된 표지된 항원과 접촉시키는 단계,
vii) 상기 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율을 측정하는 단계, 및
viii) 선택된 표지된 항원에 결합될 때, 10 내지 75%의 범위인 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달 효율을 갖는 적어도 하나의 항체 또는 항체 유사 분자를 선택하는 단계.
또 다른 양태에서, 하기 단계를 포함하는, CRET 쌍을 확인하는 방법이 제공된다:
i) 항체 또는 항체 유사 분자를 CRET 쌍의 제1 구성성분에 연결하는 상이한 링커를 갖는 둘 이상의 항체 또는 항체 유사 분자를 수득하는 단계,
ii) 둘 이상의 표지된 항원을 수득하는 단계로, 각각 표지된 항원은 선택적 링커를 통해 CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하고; 여기서 둘 이상의 표지된 항원은 (i) 상이한 링커; 및/또는 (ii) 상이한 길이의 항원을 포함하는 것인 단계,
iii) 둘 이상의 항체 또는 항체 유사 분자를 둘 이상의 표지된 항원과 접촉시키는 단계,
iv) CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율을 측정하는 단계, 및
v) 적어도 하나의 CRET 쌍을 선택하는 단계로, 상기 선택된 CRET 쌍은 CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 하나의 항체 또는 항체 유사 분자 및 CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 표지된 항원을 포함하고, 여기서, 선택된 항체 또는 항체 유사 분자가 선택된 표지된 항원에 결합될 때, CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 10 내지 75%의 범위인 단계.
또 다른 양태에서, 시료를 분류하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 i) 시료를
a) CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자, 및
b) CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원에 접촉시키는 단계로,
여기서, 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때, 제1 구성성분과 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 10 내지 75%의 범위이고,
여기서 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 하나 이상의 분석물이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 때 변경되는 것인 단계; 및
ii) 에너지 전달의 효율의 변경을 기반으로 시료를 분류하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)는 다음 중 하나 이상 또는 모두를 포함한다:
A) 전기 광학 감지 장치를 사용하여 CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분에 의한 기질의 변형을 검출하는 단계,
B) 전기 광학 감지 장치로부터의 적어도 하나의 신호를 처리하고 전기 광학 응답의 패턴을 하나 이상의 관심 시료의 하나 이상의 미리 결정된 특성과 상관시키는 단계, 및
C) 응답 패턴의 상관관계를 기반으로 시료를 분류하는 단계.
일부 구현예에서, 시료를 분류하는 방법으로, 상기 방법은
i) 시료를
a) CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자,
b) CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원,
c) CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분 중 하나의 기질과 접촉시키는 단계로,
여기서, 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때, 제1 구성성분과 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 10 내지 75%의 범위인 단계,
ii) 전기 광학 감지 장치를 사용하여 CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분에 의한 기질의 변형을 검출하는 단계,
iii) 전기 광학 감지 장치로부터의 적어도 하나의 신호를 처리하고 전기 광학 응답의 패턴을 하나 이상의 관심 시료의 하나 이상의 미리 결정된 특성과 상관시키는 단계, 및
iv) 응답 패턴의 상관관계를 기반으로 시료를 분류하는 단계를 포함하고, 여기서 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 하나 이상의 분석물이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 때 변경된다.
일부 구현예에서, 단계 (i)는
A) 하나 이상의 마이크로채널을 포함하는 미세유체 장치를 통해,
a) 시료,
b) 항체 또는 항체 유사 분자,
c) 표지된 항원, 및
d) 기질 또는 제1 또는 CRET 쌍의 제2 구성성분의 기질을 흐르게 하는 단계; 및
B) 장치에서 항체 또는 항체 유사 분자, 표지된 항원, 시료 및 기질을 혼합하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 각각 상이한 분석물 또는 분석물의 범위 및 둘 이상의 상이한 표지된 항원에 결합하는 둘 이상의 상이한 항체 유사 분자를 포함하고, 단계 v)는 분석물 각각의 존재, 부재 또는 농도 또는 분석물의 범위를 기반으로 시료를 분석하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 실시간으로 시료를 분류하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자는 장치에 고정되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자 및 기질은 상이한 마이크로채널을 통해 장치에 들어간다.
또 다른 양태에서, 시료를 분리하기 위한 미세유체 시스템이 제공되고, 상기 시스템은
i) CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자를 함유하기에 적합한 적어도 하나의 저장소,
ii) CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원을 함유하기에 적합한 적어도 하나의 저장소;
iii) 하나 이상의 마이크로채널을 포함하는 미세유체 장치,
iv) 장치에서 상기 항체 또는 항체 유사 분자, 상기 표지된 항원, 상기 시료 및 CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분의 기질을 혼합하기 위한 수단,
v) 항체 또는 항체 유사 분자에 대한 분석물의 결합을 검출하기 위한 반응 챔버, 및
vi) 전기 광학 감지 장치를 포함하고,
여기서, 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때, CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 10 내지 75%의 범위이고; 그리고
여기서 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율의 감소는 분석물이 시료에 존재함을 표시한다.
일부 구현예에서, 상기 미세유체 시스템은 각각 상이한 분석물 또는 분석물의 범위 및 둘 이상의 상이한 표지된 항원에 결합하는 둘 이상의 상이한 항체 또는 항체 유사 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자는 장치에 고정되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자, 표지된 항원 및 기질은 상이한 마이크로채널을 통해 장치에 들어간다. 일부 구현예에서, 상기 미세유체 장치는 적어도 2개의 입력 마이크로채널을 포함하고, 여기서 입력 마이크로채널 중 하나는 항체 또는 항체 유사 분자가 장치 내로 흐르게 하기 위한 것이다.
일부 구현예에서, 상기 미세유체 시스템은 실시간으로 시료를 분류하는데 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서 시료에서 분석물을 검출하는 방법이 제공되고, 상기 방법은
i) 코엘레테라진의 존재하에, 시료를 하기와 접촉시키는 단계:
a) 레닐라 루시퍼라제 또는 이의 변이체에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자; 및
b) 녹색 형광 단백질 2에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원; 및
ii) 생물발광 단백질과 수용자 분자 사이의 생물발광 공명 에너지 전달 (BRET)이 변경되었는지 여부를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 생물발광 단백질과 수용자 분자 사이의 에너지 전달의 효율의 감소는 분석물이 시료에 존재함을 표시한다.
본 청구 대상의 발명자는 여기에 기술된 CRET 기반 방법이 증가된 감도 및/또는 더 짧은 분석 시간을 포함하여 이전에 기술된 방법에 많은 이점을 제공한다는 것을 발견하였다. 본원에 기술된 방법은 또한 광범위한 분석물에 적용될 수 있다.
본원의 모든 구현예는 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 준용하여 다른 구현예에 적용되어야 한다.
본 발명은 단지 예시의 목적으로 의도된 본원에 기술된 특정 구현예에 의해 범위가 제한되지 않는다. 기능적으로 동등한 제품, 조성물 및 방법은 본원에 기술된 바와 같이 분명히 본 발명의 범위 내에 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 달리 구체적으로 언급되거나 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단일 단계, 물질의 조성, 단계의 그룹 또는 물질의 조성 그룹에 대한 언급은 이들 단계의 하나 및 복수 (즉 하나 이상), 물질의 조성, 단계의 그룹 또는 물질의 조성 그룹을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예 및 첨부된 참고 문헌을 참조하여 이하에 기술된다.
도 1 -본원에 정의된 바와 같이 분석물을 검출하기 위한 예시적인 면역센서. (A) 예시된 구현예에서, 항체는 생물발광 단백질에 부착되고 항원은 형광 단백질에 부착된다. (B) 예시된 구현예에서, Fab'는 생물발광 단백질에 부착되고 항원은 형광 단백질에 부착된다. 두 구현예에서, 항체에 대한 분석물 (이러한 구현예에서, 비표지 항원)의 결합은 생물발광 단백질에 대한 기질의 존재하에 생물발광 단백질과 형광 단백질 사이의 에너지 전달의 효율을 감소시킨다.
도 2 - 예시된 면역센서의 BRET 비율에 대한 FLAG 펩티드의 효과. 비접합 RLuc8, 및 FLAG-GFP2 (61 nM) 단독 (진한 회색 막대) 또는 0.85 mM 유리 FLAG 펩티드의 존재 (연한 회색 막대)와 함께 배양된 RLuc8 접합체에 대해 BRET 비율이 결정되었다. 분석에서 RLuc8의 농도는 5 nM이었고, Fab'-CLICK-RLuc8의 농도는 33 nM, Fab'-Solulink-RLuc8 46 nM, 항체-CLICK-RLuc8 66 nM 및 항체-Solulink-RLuc8 15 nM으로 추정되었다.
도 3 - FLAG 펩티드 첨가에 대한 반응 상의 FLAG 펩티드 첨가 순서의 효과. FLAG 펩티드를 FLAG-GFP2 이전, 이후 또는 동시에 항체-CLICK-RLuc8 접합체를 포함하는 조성물에 첨가하였고 BRET 비율을 기록하였다. 항체-CLICK-RLuc8 (mAB4/8 RLuc8)의 농도는 5　nM, FLAG-GFP2 150　nM, 및 FLAG 펩티드 100　nM이었다.
도 4 - (A) Click-PEG-연결된 50 nM 항체:RLuc8 접합체 단독 (흰색 막대) 또는 100 nM FLAG-GFP2 (연한 회색 막대), 200 nM FLAG-GFP2 (진한 회색 막대) 또는 200 nM FLAG-GFP2 및 1 μM FLAG (검은색 막대) 존재에 대해 얻은 BRET 비율. 접합체를 제조하기 위해 사용된 PEG 링커는 이들의 이름을 표시하도록, 예를 들어, mAb-4/8-Luc이 항체-PEG4-DBCO 및 아지도-PEG8-RLuc8의 접합체를 지칭한다. (B) 50 nM Fab':RLuc8 접합체 단독 (연한 회색 막대) 또는 200 nM FLAG-GFP2 (중간 회색 막대) 또는 200 nM FLAG-GFP2 및 1 μM FLAG 펩티드 (진한 회색 막대) 존재의 BRET 비율.
도 5 - FLAG-GFP2 (200 nM) 및 유리 FLAG 펩티드를 갖는 항체-12/36-RLuc8 접합체 (50 nM)에 대해 결정된 BRET 비율, FLAG 펩티드의 농도에 대해 플롯팅됨 (0.000488 - 256 μM). BRET 비율은 Fluorostar Optima로 기록되었다.
도 6 - 5분 배양한 10 nM FLAG-GFP2 및 5 nM mAb-24/36-RLuc8을 갖는 FLAG 펩티드 (평균 ± SD, n=3)의 보정. BRET 비율은 Clariostar로 기록되었다.
도 7 -면역센서에 결합하는 소분자를 검출하기 위한 경쟁 분석의 개략도. 예시된 구현예에서, 나노바디는 생물발광 단백질, RLuc8에 접합되고 항원, TCC 유사체는 GFP2에 접합된다. 비접합 분석물 (비표지 항원 TCC)의 첨가는 생물발광 단백질에 대한 기질의 존재하에 생물발광 단백질과 형광 단백질 사이의 에너지 전달의 효율을 감소시키고 BRET2 비율의 감소가 관찰된다.
도 8 - 22℃에서 5분 배양 후 T9NB1-RLuc8/TCC-4'-S-(CH2)2-CO-GFP2 나노바디 센서 10 nM에 10 μM 코엘레테라진 400a (EtOH 중 1 μL)의 첨가 시 최대 BRET2 비율의 백분율로 표시된 2% DMSO/PBS에서 나노바디 센서 T9NB1-RLuc8/TCC-4'-S-(CH2)2-CO-GFP2 반응의 TCC 농도 의존성 (평균 ± SD, n = 3). EC50 = 17 nM.
도 9 - 2% DMSO/PBS 중 10 nM의 정제된 T9NB1-RLuc8 나노바디 융합, 정제된 T9NB1-RLuc8 나노바디 융합 및 GFP2 및 정제된 T9NB1-RLuc8 나노바디 융합 및 TCC-4'-S-(CH2)2-CO-GFP2 융합의 BRET2 비율 (평균 ± SD, n　= 3). 22℃에서 5분 배양 후 10　μM 코엘레테라진 400a 기질을 첨가한 후 발광 강도를 기록하였다.
서열 목록의 핵심
서열 번호 1 내지 3 - 링커 서열.
서열 번호 4 - FLAG-GFP2.
서열 번호 5 - N-His-RLuc8.
서열 번호 6 - FLAG-RLuc8.
서열 번호 7 - FLAG 펩티드.
서열 번호 8 - N-His-T9NB1-RLuc8.
일반 기술 및 정의
달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 간주되어야 한다 (예를 들어, CRET 기반 센서 기술 - 특히 BRET 기반 센서 기술, 분자 생물학, 단백질 화학, 생체접합 기술, 생화학 등).
달리 명시되지 않는 한, 본 발명에서 이용된 재조합 단백질, 세포 배양, 생체접합, 및 면역학적 기술은 당업자에게 잘 알려진 표준 절차이다. 이러한 기술은 J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 및 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 및 1996), 및 F.M. Ausubel 등, (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 현재까지의 모든 업데이트 포함), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), 및 J.E. Coligan 등, (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (현재까지의 모든 업데이트 포함), Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques. Elsevier Inc. (2013)과 같은 출처에서 문헌 전체에 걸쳐 기술되고 설명된다.
용어 "및/또는", 예를 들어, "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해되어야 하고 두 가지 의미 또는 어느 한 의미에 대한 명시적 지원을 제공하는 것으로 간주되어야 한다.
　문맥이 달리 암시하지 않는 한, 센서 및 기질과 같은 단수 용어의 언급은 분명히 복수도 의미한다. 예를 들어, 논리적으로 많은 개별 분자는 장치를 통해 흐르거나 단일 분자가 아닌 웰에 함유될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 달리 언급되지 않는 한, 용어 약은 지정된 값의 +/- 10%, 더욱 바람직하게는 +/- 5%, 훨씬 더 바람직하게는 +/- 1%를 지칭한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 단어 "포함하다", 또는 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소의 그룹, 정수 또는 단계를 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이지만 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소의 그룹, 정수 또는 단계를 배제하지 않는다.
명시되지 않거나 문맥에서 달리 나타내지 않는 한, % 농도는 중량/부피 (%w/v)이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "부착된"은 광범위하게 정의되고 이에 제한되지 않고, 공유 및 비공유 상호작용을 포함하는 것으로 의도된다. 공유 상호작용은 한 쌍의 전자 (즉, 단일 결합), 두 쌍의 전자 (즉, 이중 결합) 또는 세 쌍의 전자 (즉, 삼중 결합)의 공유에 의해 형성된 두 원자 또는 라디칼 사이의 화학적 연결이다. 공유 상호작용은 또한 전자쌍 상호작용 또는 전자쌍 결합으로서 당업계에 공지되어 있다. 공유 부착의 예는 이황화 결합, 아미드 결합, 티오에테르 결합 등을 포함한다. 비공유 상호작용은 공유 상호작용보다 훨씬 약하지만, 거대 분자 구조의 3차원 구조를 결정하는 데 중요한 역할을 한다. 비공유 상호작용은 반 데르 발스 상호작용, 수소 결합, 약한 화학 결합 (즉, 단거리 비공유 힘을 통해), 소수성 상호작용, 이온 결합 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 비공유 상호작용에 대한 검토는 Alberts 등, Molecular Biology of the Cell, 3rd edition, Garland Publishing, 1994에서 찾을 수 있다. 비공유 부착의 예는 아비딘/스트렙타비딘-비오틴 복합체, 항체/항원 복합체, DNA 이중체, RNA/DNA 이중체, 핵산-단백질 복합체 등을 포함한다. 일부 구현예에서, "부착된"은 바람직하게는 공유적으로 부착된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "결합하다," "결합하는," "상호작용하다," "상호작용하는," "연관된"은 비공유 상호작용을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "접촉하는"은 둘 이상의 화학 분자 사이의 반응 및/또는 상호작용이 일어날 수 있도록 둘 이상의 화학 분자를 근접하게 하는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 "접촉하는"은 둘 이상의 화학 분자가 복합체를 형성할 수 있도록 둘 이상의 화학 분자를 근접하게 하는 것을 지칭한다.
항체 또는 항체 유사 분자
본원에 사용된 바와 같이, 항체는 광범위하게 정의되고 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "항체"는 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE를 포함하는, 면역글로불린의 모든 동형을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "동형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화되는 항체 부류 (예를 들어 IgM 또는 IgG1)를 지칭한다. 용어 "면역글로불린"은 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec 등과 같은 이들 면역글로불린의 하위유형을 포함한다. 이러한 면역글로불린 중에서, IgG가 바람직하다. 항체는 (예를 들어) 마우스, 랫트, 토끼, 말, 또는 인간을 포함하는 기원의 임의의 종의 것일 수 있거나, 키메라 항체일 수 있다 (예를 들어, M. Walker 등, 1989). 적합한 항체는 임의의 유기체로부터의 천연 항체, 조작된 항체 또는 실험, 치료 또는 기타 목적을 위해 재조합적으로 생성된 항체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "항체"는 표적 항원, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv 단편, 항체의 다른 항원-결합 하위서열에 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편을 포함하고 전체 항체의 변형에 의해 생성된 항체 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여　새로　합성된 항체, 및 IgG 이외의 항체로부터 얻은 상응하는 단편을 포함할 수 있다. 이들 항체 단편은 통상적인 절차, 예를 들어 J. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp 98-118 (N.Y. Academic Press 1983)에 기술된, 단백질 분해 단편화 절차를 사용하는 것, 뿐만 아니라 당업자에게 알려진 다른 기술에 의해 수득된다. 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성을 위해 선별된다.
적합한 항체 또는 항원 결합 단편은 IgG, IgA, IgM, IgE, 단일클론 항체, Fab', rIgG (반항체), f(ab')2, 나노바디, 키메라 항체, scFv, scFv 다량체, 단일 도메인 항체 또는 단일 도메인 융합 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 유사 분자는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 단일클론 항체는 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, "특이적 결합" (뿐만 아니라 용어 "특이적으로 결합된" 및 "특이적으로 결합")은 본원에 기술된 분석을 허용하는 정도로 다른 것으로부터 항원을 구별하기 위해 사용되도록 하는 선호도를 갖는 미리 결정된 항원에 결합하는 항체 또는 항체 유사 분자를 지칭한다. 전형적으로, 항체는 미리 결정된 항원 이외의 항원에 대한 결합의 친화도보다 적어도 2배 더 큰 친화도로 결합한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 유사 분자는 100 μM 이하, 10 μM 이하, 1 μM 이하, 500 mM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 500 pM 이하 또는 100 pM 이하의 해리 상수 (KD)를 갖는 항원과 복합체를 형성한다. 달리 명시되지 않는 한, 해리 상수는 당업자에게 공지된 기술, 예를 들어 SPR, 석영 지각 미세천칭 또는 ITC를 사용하여 중성 pH 및 실온에서 측정된다.
본 개시내용에 유용한 항체 또는 항체 유사 분자는 당 업계에 공지된 다양한 기술에 의해 생성될 수 있다. 단일클론 항체 생산은 당 업계에 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다.
다른 구현예에서, 항체는 재조합 항체일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체, 예를 들어 다른 종의 면역글로불린 유전자에 대해 형질전환된 동물 (예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체, 숙주 세포로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합, 조합 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 또는 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함하는 것으로 의도된다.
일부 구현예에서, 항체는 공지된 기술에 따라 생성된 키메라 항체일 수 있다. 예를 들어, 키메라 단일클론 항체는 공지된 기술에 따라 생산된 상보성으로 결정 영역-이식된 항체 (또는 "CDR-이식된 항체")일 수 있다. 단일클론 Fab 단편은 당업자에게 공지된 재조합 기술에 의해 대장균에서 생산될 수 있다 (Huse 등, 1989).
본원에 사용된 바와 같이, "항체 유사" 분자는 항체와 같이 항원에 특이적으로 결합할 수 있지만 항체와 구조적으로 관련이 없는 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 항체 유사 분자는 항체 또는 이의 단편이 아니다. 적합한 항체 유사 분자는 아피바디, 안티칼린, DARPin, 모노바디, 아비머, 마이크로바디를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항체 유사 분자는 IgG, IgA, IgM, IgE, 단일클론 항체, Fab', rIgG (반항체), f(ab')2, 나노바디, 아피바디, 안티칼린, DARPin, 모노바디, 아비머, 마이크로바디, 키메라 항체, scFv, scFv 다량체, 단일 도메인 항체 또는 단일 도메인 융합 항체이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 유사 분자는 IgG, Fab', rIgG (반항체) 또는 f(ab')2이다. 본원에 사용된 바와 같이, f(ab')2는 Fab'2 및 이의 변형으로도 지칭된다. 일부 바람직한 구현예에서, 항체 또는 항체 유사 분자는 IgG 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 바람직한 구현예에서, 항체 또는 항체 유사 분자는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 유사 분자는 나노바디이다. 나노바디는 또한 단일 도메인 항체 (sdAb) 또는 VHH로 지칭될 수 있고 중쇄 항체 (VHH), 또는 공통 IgG의 가변 도메인 하나를 함유한다.
본 개시내용의 구현예에서 항체를 사용하는 것은 다수의 이점을 제공한다. 첫째, 모든 항체는 각 개별 면역센서에 대한 기하학을 최적화할 필요성을 줄이는 것으로 생각되는 공통 3차원 구조를 공유한다. 둘째, 항체는 이들의 상응하는 항원에 대해 높은 특이성과 친화성을 가지고 셋째 항체는 거의 모든 항원에 대해 생산될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 유용한 항체 및 항체 유사 분자는 조작된 항체 및 항체 유사 분자를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "조작된 항체 또는 항체 유사 분자"는 모 항체 또는 항체 유사 분자의 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산으로 치환된 항체 또는 항체 유사 분자를 지칭한다. 이러한 치환은 당업자에게 공지된 기술, 예를 들어 부위 지정 돌연변이유발에 의해 이루어질 수 있다. 상이한 아미노산은 자연 발생 아미노산 (예를 들어, 시스테인, 리신, 글루탐산, 세린 또는 티로신) 또는 비자연 발생 아미노산일 수 있다. 비자연 발생 아미노산은 직교 화학 반응성을 허용할 수 있다. 일부 구현예에서, 비자연 발생 아미노산은 번역후 변형에 의해 CRET 쌍의 제1 구성성분을 부위-특이적으로 부착하는 데 사용될 수 있는 직교 작용기 (예를 들어 아지드 또는 알킨)를 보유한다. 비자연 발생 아미노산의 예는 4-아세틸페닐알라닌, 벤조일페닐알라닌, 아세틸리신, 4-아지도-L-페닐알라닌, 아지도호모알라닌, 호모프로파길글리신, 변형된 시클로옥틴-리신 (SCO-Lys), 트랜스-시클로옥트-2-엔-리신 (TCO-Lys), 4-(6-메틸-s-테트라진-3-일)아미노페닐알라닌을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 적합한 예는 Jena Biosecience, Sigma Aldrich, Iris Biotech, Thermo Fisher 및 Base Click에서 입수 가능한 것과 같은 임의의 상업적으로 입수 가능한 비천연 아미노산을 포함한다. 비자연 발생 아미노산은 당업자에게 공지된 기술, 예를 들어, 앰버 코돈 억제 시스템에 의해 항체 또는 항체 유사 분자 내로 부위-특이적으로 혼입될 수 있다 (Lang and Chin, 2014; Liu and Schultz, 2010). 비천연 아미노산은 예를 들어, Click 화학반응을 통해 비천연 아미노산 부위에서 CRET 쌍의 제1 구성성분의 부위 특이적 부착에 유용할 수 있다. 한 예에서, 항체 또는 항체 유사 분자는 WO2006/034488에 개시된 바와 같이 모 항체의 하나 이상의 아미노산이 유리 시스테인 아미노산으로 대체된 시스테인 조작된 항체 또는 항체 유사 분자이다. 시스테인 조작된 항체는 바람직하게는 0.6 내지 1.0의 범위에서 티올 반응성 값을 갖는, 하나 이상의 유리 시스테인 아미노산을 포함한다. 유리 시스테인 아미노산은 모 항체 내로 조작된 시스테인 잔기이고 이황화 가교의 일부가 아니다. 시스테인 조작된 항체는 예를 들어, 말레이미드 또는 할로아세틸을 통해 조작된 시스테인에서 CRET 쌍의 제1 구성성분의 부위 특이적 부착에 유용하다. 조작된 항체 또는 항체 유사 분자는 바람직하게는 이들의 야생형, 모 항체 대응물의 항원 결합 능력을 보유한다. 따라서, 조작된 항체 또는 항원 유사 분자는 바람직하게는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "결합할 수 있는"은 100 μM 이하, 10 μM 이하, 1 μM 이하, 500 mM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 500 pM 이하 또는 100 pM 이하의 해리 상수 (KD)를 갖는 항원과 복합체를 형성하는 항체 또는 항체 유사 분자를 의미한다.
본 개시내용에 유용한 항체 또는 항체 유사 분자는 항원 및 분석물에 결합할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "항원" 및 "분석물" 모두 바람직하게는 동일한 결합 부위에서 동일한 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있다. 항체 또는 항체 유사 분자에 대한 항원 및 분석물의 결합은 경쟁적이어서, 항원 및 분석물은 항체 또는 항체 유사 분자의 동일한 또는 중첩 부위에 결합하고 한 번에 항원 또는 분석물 중 하나만 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 및 분석물은 표지를 제외하고는 동일하다. 다른 구현예에서, 항원은 분석물의 항체 결합 단편이다. 대안적인 구현예에서, 분석물은 항원의 항체 결합 단편이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에 유용한 항체 또는 항체 유사 분자는 혈청전환을 유발하는 병원체로부터의 항원을 지시하는 항체 또는 항체 유사 분자이다.
한 예에서, 항체 또는 항체 유사 분자는 항체 또는 항체 유사 분자 및 CRET 쌍의 제1 구성성분을 포함하는 융합 단백질이다. 예를 들어, 항체 또는 항체 유사 분자는 나노바디 및 CRET 쌍의 제1 구성성분을 포함하는 융합 단백질이다 (즉, 나노바디 및 CRET 쌍의 제1 구성성분은 동일한 폴리펩티드의 일부를 형성함).
대안적인 구현예에서, 항체 또는 항체 유사 분자는 항체 또는 항체 유사 분자 및 CRET 쌍의 제1 구성성분을 포함하는 융합 단백질이 아니다. 한 예에서, 항체 또는 항체 유사 분자는 링커를 통해 CRET 쌍의 제1 구성성분에 공유적으로 부착된다. 적합한 링커 및 부착 화학은 본원에 기술된 바와 같다. 다른 예에서, 항체 또는 항체 유사 분자는 CRET 쌍의 제1 구성성분에 비공유적으로 부착된다.
일부 구현예에서, CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착되고
i) 분석물; 및
ii) CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원
에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자가 제공되고, 여기서 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때 제1 구성성분과 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 10 내지 75%의 범위이다. 항체 또는 항체 유사 분자, CRET 쌍의 제1 구성성분, 분석물; 및 표지된 항원은 본원에 정의된 바와 같다.
일부 구현예에서, 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자를 확인하는 방법이 제공되고, 방법은
i) 항체 또는 항체 유사 분자를 CRET 쌍의 제1 구성성분에 연결하는 상이한 링커를 갖는 둘 이상의 항체 또는 항체 유사 분자를 수득하는 단계,
ii) 둘 이상의 항체 또는 항체 유사 분자를 CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원과 접촉시키는 단계,
iii) CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율을 측정하는 단계, 및
iv) 표지된 항원에 결합될 때, 10 내지 75%의 범위인 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율을 갖는 적어도 하나의 항체 또는 항체 유사 분자를 선택하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 단계 iv)는 표지된 항원에 결합될 때, 둘 이상의 항체 또는 항체 유사 분자의 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 더 높은 효율의 에너지 전달을 갖는 항체 또는 항체 유사 분자를 선택하는 것을 포함한다. 바람직한 예에서, 표지된 항원에 결합될 때, 선택된 항체 또는 항체 유사 분자의 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 50 내지 75%의 범위이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상이한 링커"는 상이한 길이의 링커 또는 상이한 조성의 링커 (예를 들어, PEG 기반 링커 대 펩티드 기반 링커) 또는 이들의 조합을 포함한다.
표지된 항원
본원에 정의된 항체 또는 항체 유사 분자는 표지된 항원에 결합할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원"은 항체 또는 항체 유사 분자 상의 인식 부위에 결합할 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표지된 항원"은 CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항원을 지칭한다. 부착은 공유 부착 또는 비공유 부착일 수 있다. 표지된 항원은 항체 또는 항체 유사 분자 상의 인식 부위에 결합하는 능력을 보유한다.
항원은 진단 검사가 수행되는 임의의 화합물 또는 관심 분자, 예를 들어 생체고분자 또는 소분자 생체활성 물질일 수 있다. 항원은 제한 없이, 예를 들어, 세포, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항체, 바이러스, 기질, 대사산물, 전이 상태 유사체, 보조인자, 억제제, 약물, 염료, 영양소, 성장 인자, 핵산 또는 지질일 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 작은 유기 분자, 약물, 약물 대사산물, 항생제, 호르몬, 알레르겐, 펩티드, 단백질, 자연 발생 항체, 당, 지질 또는 핵산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항원은 작은 유기 분자, 약물, 약물 대사산물, 항생제, 호르몬, 알레르겐, 펩티드, 단백질, 당, 지질 또는 핵산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 예에서, 항원은 펩티드 또는 단백질이다. 다른 예에서, 항원은 항생제, 약물 또는 약물 대사산물이다. 다른 예에서, 항원은 항균제이다. 다른 예에서, 항원은 항진균제이다. 다른 예에서, 항원은 혈청전환을 유발하는 병원체로부터의 항원과 유사하거나 동일한 합성 항원이다. 일부 구현예에서, 항원은 작은 유기 분자이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 항원은 하나 이상의 범주에 속할 수 있다.
바람직하게는, 항원은 CRET 쌍의 제2 구성성분에 공유적으로 부착된다. 한 예에서, 표지된 항원은 항원 및 CRET 쌍의 제2 구성성분을 포함하는 융합 단백질이고, 즉, 항원 및 CRET 쌍의 제2 구성성분 모두 동일한 폴리펩티드의 일부를 형성한다. 일부 구현예에서, 표지된 항원은 항원 및 BRET 수용자 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 표지된 항원은 항원 및 형광 수용자 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 한 구현예에서, 표지된 항원은 항원 및 GFP, 바람직하게는 GFP2를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 표지된 항원은 항원 및 BRET 공여자 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 표지된 항원은 항원 및 생물발광 단백질을 포함하는 융합 단백질이다. 한 예에서, 표지된 항원은 항원 및 RLuc8을 포함하는 융합 단백질이다.
다른 예에서, 표지된 항원은 링커를 통해 CRET 쌍의 제2 구성성분에 공유적으로 부착된 항원이다. 임의의 적합한 링커가 사용될 수 있다. 링커 및 부착 화학의 비제한적 예시는 본원에 기술된 바와 같다.
일부 구현예에서, 표지된 항원은 링커를 통해 CRET 쌍의 제2 구성성분에 공유적으로 부착된 작은 유기 분자이다. 일부 구현예에서, 표지된 항원은 링커를 통해 BRET 쌍의 제2 구성성분에 공유적으로 부착된 작은 유기 분자이다. 일부 구현예에서, 표지된 항원은 링커를 통해 형광 수용자 도메인에 부착된 작은 유기 분자이다. 일부 구현예에서, 표지된 항원은 링커를 통해, 형광 단백질에 공유적으로 부착된 작은 유기 분자이다. 일부 구현예에서, 표지된 항원은 링커를 통해 GFP, 예를 들어 GFP2에 공유적으로 부착된 작은 유기 분자이다. 일부 구현예에서, 표지된 항원은 링커를 통해 BRET 공여자 도메인에 공유적으로 부착된 작은 유기 분자이다. 일부 구현예에서, 표지된 항원은 링커를 통해 생물발광 단백질에 공유적으로 부착된 작은 유기 분자이다. 한 예에서, 표지된 항원은 링커를 통해 RLuc8에 부착된 작은 유기 분자이다. 대안적인 구현예에서, 표지된 항원은 링커를 통해 CRET 쌍의 제2 구성성분에 공유적으로 부착된 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 표지된 항원은 링커를 통해 BRET 쌍의 제2 구성성분에 공유적으로 부착된 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 표지된 항원은 링커를 통해 형광 수용자 도메인에 부착된 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 표지된 항원은 링커를 통해, 형광 단백질에 공유적으로 부착된 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 표지된 항원은 링커를 통해, GFP, 예를 들어 GFP2에 공유적으로 부착된 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 표지된 항원은 링커를 통해 BRET 공여자 도메인에 공유적으로 부착된 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 표지된 항원은 링커를 통해 생물발광 단백질에 공유적으로 부착된 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 한 예에서, 표지된 항원은 링커를 통해 RLuc8에 공유적으로 부착된 펩티드 또는 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, 표지된 항원을 확인하는 방법이 제공되고, 방법은
i) 둘 이상의 표지된 항원을 수득하는 단계로, 각각 표지된 항원은 선택적 링커를 통해 CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하고; 여기서 둘 이상의 표지된 항원은 (i) 상이한 링커; 및/또는 (ii) 상이한 길이의 항원을 포함하는 것인 단계,
ii) 둘 이상의 표지된 항원을 CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자와 접촉시키는 단계,
iii) CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율을 측정하는 단계, 및
iv) 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때, 10 내지 75%의 범위인 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율을 갖는 적어도 하나의 표지된 항원을 선택하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 단계 iv)는 표지된 항원에 결합될 때, 둘 이상의 항체 또는 항체 유사 분자의 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 더 높은 효율의 에너지 전달을 갖는 항체 또는 항체 유사 분자를 선택하는 것을 포함한다. 바람직한 예에서, 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때 선택된 표지된 항원의 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 50 내지 75%의 범위이다.
본원에 사용된 바와 같이, 구절 "상이한 길이의 항원"은 상이한 분자량, 크기, 아미노산 수의 항원을 지칭한다. 예를 들어, 상이한 길이의 항원은 항체 또는 항체 유사 분자 결합 에피토프를 함유하는 상이한 길이의 폴리펩티드일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 구절 "상이한 링커"는 상이한 길이의 링커 또는 상이한 조성의 링커 (예를 들어, PEG 기반 링커 대 펩티드 기반 링커) 또는 이들의 조합을 포함한다.
링커
본원에 사용된 바와 같이, "링커"는 하나의 화학종 (예를 들어, 항체, 항체 유사 분자 또는 항원)을 다른 화학종 (예를 들어, CRET 쌍의 제1 구성성분 또는 제2 구성성분)에 연결하는 모이어티를 지칭한다. 링커는 하나 이상의 화학종에 대한 부착을 위해 기능화될 수 있는 하나 이상의 반응성 작용기 또는 작용기들을 함유하는 임의의 생체적합성 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 반응성 작용기 또는 CRET 쌍의 제1 구성성분을 항체 또는 항체-연결 분자에 결합시킨다. 일부 구현예에서, 링커는 반응성 작용기 또는 CRET 쌍의 제2 구성성분을 항원에 결합시킨다. 링커는 0차 링커 (즉, 결합), 아실, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 및 치환 또는 비치환 헤테로아릴을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 유용한 구조일 수 있다. 추가의 예시적인 링커는 치환 또는 비치환 분지형 또는 선형 C-C 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬을 포함한다. 다른 링커는 핵산, 펩티드 및 당류를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "반응성 작용기"는 합성 화학, 특히 생체접합체 화학 분야에서 일반적으로 인식되는 의미를 갖는다. 예시적인 반응성 작용기는 올레핀, 아세틸렌, 알코올, 페놀, 에테르, 산화물, 할라이드, 알데히드, 케톤, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 시아네이트, 이소시아네이트, 티오시아네이트, 이소티오시아네이트, 아민, 히드라진, 히드라존, 히드라지드, 디아조, 디아조늄, 니트로, 니트릴, 메르캅틴, 황화물, 이황화물, 설폭사이드, 설폰, 설폰산, 설핀산, 아세탈, 케탈, 무수물, 설페이트, 설펜산 이소니트릴, 아미딘, 이미드, 이미데이트, 니트론, 히드록실아민, 옥심, 히드록삼산, 티오히드록삼산, 알렌, 오르토 에스테르, 술파이트, 에나민, 이나민, 우레아, 슈도우레아, 세미카르바지드, 카르보디이미드, 카르바메이트, 이민, 아지드, 아조 화합물, 아족시 화합물, 및 니트로소 화합물을 제한없이, 포함하였다. 이들 작용기 각각을 제조하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있고 특정 목적에 대한 이들의 적용 또는 변형은 당업자의 능력 내에 있다 (예를 들어, Sandler and Karo, eds. ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS, Academic Press, San Diego, 1989 참조).
상기 기능을 달성하는 임의의 적합한 링커가 이용될 수 있다. 적합한 링커의 예는 탄화수소 사슬 (예를 들어 비분지형 알킬렌 모이어티), 펩티드 사슬, PEG-유형 또는 다른 폴리에테르-유형 기, 및 다른 중합체성 기 (예를 들어 폴리히드록시산)를 포함하는 것을 포함한다. 한 예에서, 링커는 2개의 화학종을 연결하는 원자 사슬로 이루어지고, 사슬은 50 내지 500, 100 내지 500, 150 내지 500, 200 내지 500, 250 내지 500, 300 내지 500, 350 내지 500, 400 내지 500개의 원자로 이루어진다. 한 예에서, 링커는 2개의 화학종을 연결하는 원자 사슬로 이루어지고, 사슬은 2 내지 500, 2 내지 450, 2 내지 400, 2 내지 350, 2 내지 300, 2 내지 250, 2 내지 200, 2 내지 150, 2 내지 100, 2 내지 50, 2 내지 40, 2 내지 30, 2 내지 20, 2 내지 10개의 원자로 이루어진다.
일부 구현예에서, 링커는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 글리콜 사슬의 적어도 하나의 산소가 질소로 치환된 폴리알킬렌 글리콜, 폴리아민 (Herve 등, 2008), 펩티드 핵산 (PNA) (Egholm 등, 2005), 잠금 핵산 (LNA) (Singh 등, 1998), 트리아졸, 피페라진, 옥심, 티아졸리딘, 방향족 고리 시스템, 알칸, 알켄, 알킨, 고리형 알칸, 고리형 알켄, 아미드, 티오아미드, 에테르, 및 히드라존을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 알킬 사슬, 글리콜, 폴리글리콜, 에테르, 폴리에테르, 폴리아미드, 폴리에스테르, 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜이다.
한 예에서, 링커는 탄화수소 (예를 들어 중앙 스페이서 기는 알킬렌 기일 수 있음), 분지형 또는 비분지형을 포함하고, 상기 탄화수소는 C2 - C250, C20- C250, C40 - C250, C60 -C250, C80 - C250, C100 - C250, C120 - C250, C140 - C250, C160 - C250, C180 - C250, C200 - C250, C220 - C250, 또는, 적어도 C2, 적어도 C20, 적어도 C40, 적어도 C50, 적어도 C60, 적어도 C70, 적어도 C80, 적어도 C90, 적어도 C100 범위의 사슬 길이를 갖는다. 한 예에서, 링커는 분지형 또는 비분지형 C180- C250, C200- C240, 또는 C210 - C230 탄화수소 기를 포함한다. 한 예에서, 링커는 분지형 또는 비분지형 C150 - C250, 또는 C180 - C220 탄화수소 기를 포함한다. 일부 예에서, 링커는 분지형 또는 비분지형 C180 - C220 탄화수소 기를 포함한다. 일부 예에서, 링커는 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C12, C14, C16, C18, 또는 C20 알킬렌 기를 포함하고, 즉 링커는 n이 1 내지 20의 정수인 (CH2)n을 포함한다. 한 예에서, 링커는 C2 알킬렌 기 (즉 -CH2-CH2-)를 포함한다.
일부 구현예에서, 링커는 폴리알킬렌 글리콜을 포함할 수 있다. 적합한 폴리알킬렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (mPEG) 및, 예를 들어 O,O'-비스(2-아미노프로필)-폴리에틸렌 글리콜 500 및 2,2'-(에틸렌 디옥사이드) 디에틸 아민과 같은 이의 유도체를 포함한다. PEG는 에틸렌 글리콜의 중합체이고, 치환에 따라, 화학식 C2n + 2H4n + 6On +2를 가질 수 있다. 본원에 언급된 바와 같이, PEG 기는 서브유닛 -(CH2CH2O)-에 기초한 기이고, 즉 용어 PEGn은 식 -(CH2CH2O)n-의 기를 지칭한다. 일부 구현예에서, 링커는 PEGn을 포함할 수 있고, 여기서 n은 PEG 단위의 수이다. 예를 들어, 링커는 최대 약 72개 에틸렌 글리콜 모이어티, 최대 약 60개 에틸렌 글리콜 모이어티, 최대 약 48개 에틸렌 글리콜 모이어티, 최대 약 36개 에틸렌 글리콜 모이어티, 최대 약 32개 에틸렌 글리콜 모이어티, 최대 약 28개 에틸렌 글리콜 모이어티, 최대 약 20개 에틸렌 글리콜 모이어티, 최대 약 12개 에틸렌 글리콜 모이어티, 또는 최대 약 8개 에틸렌 글리콜 모이어티를 갖는 PEG를 포함한다. 예를 들어, 링커는 8개 이상의 에틸렌 글리콜 모이어티, 12개 이상의 에틸렌 글리콜 모이어티, 20개 이상의 에틸렌 글리콜 모이어티, 28개 이상의 에틸렌 글리콜 모이어티, 32개 이상의 에틸렌 글리콜 모이어티, 36개 이상의 에틸렌 글리콜 모이어티, 40개 이상의 에틸렌 글리콜 모이어티, 48개 이상의 에틸렌 글리콜 모이어티, 60개 이상의 에틸렌 글리콜 모이어티, 또는 70개 이상의 에틸렌 글리콜 모이어티를 갖는 PEG를 포함한다. 예를 들어, 링커는 PEG2 - PEG100, PEG10 - PEG90, PEG20 - PEG80, PEG30 - PEG70, PEG40 - PEG60, PEG45 - PEG55, 또는, 적어도 PEG2, 적어도 PEG5, 적어도 PEG10, 적어도 PEG15, 적어도 PEG20, 적어도 PEG25, 적어도 PEG30, 적어도 PEG35, 적어도 PEG40, 적어도 PEG45, 적어도 PEG50의 사슬 길이를 갖는 PEGn을 포함할 수 있다. 다른 유용한 폴리알킬렌 글리콜은 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜, PEG-글리시딜 에테르, 및 PEG-옥시카르보닐이미다졸이다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 링커를 형성하는 에틸렌 글리콜 모이어티는 연속 신장을 형성할 필요가 없고, 즉, PEG 사슬은 PEG 사슬을 연결하는 하나 이상의 접합 요소에 의해 단절될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서 링커는 PEGn-L-PEGm을 포함하고, 여기서 m 및 n은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고 L은 접합 요소이다. 일부 구현예에서, n 및 m은 독립적으로 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36 또는 40으로부터 선택된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "접합 요소"는 2개의 반응성 작용기의 반응에 의해 형성된 임의의 화학종을 지칭한다. 일부 구현예에서, 접합 요소는 DBCO와 아지드의 반응에 의해 형성된다. 예를 들어, 일부 구현예에서 접합 요소는 아지드 함유 분자와 DBCO 함유 분자의 반응으로부터 형성된다.
다른 예에서, 링커는 1-100, 1 - 90, 1 - 80, 1 - 70, 1 - 60, 10 - 60, 20 - 60, 30 - 60, 40 - 60, 또는, 적어도 4, 적어도 8, 적어도 12, 적어도 16, 적어도 20, 적어도 24, 적어도 28, 적어도 32, 적어도 36, 적어도 40, 적어도 44, 적어도 48, 적어도 52, 적어도 56, 적어도 60, 또는 60 미만, 56 미만, 52 미만, 48 미만, 44 미만, 40 미만, 36 미만, 32 미만, 28 미만, 24 미만, 20 미만, 16 미만, 12 미만, 8 미만, 4 미만의 단량체 단위를 포함하는 폴리우레탄, 폴리히드록시산, 폴리카보네이트, 폴리이미드, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리술폰이다.
대안적인 구현예에서, 링커는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오시드 염기 또는 변형된 뉴클레오시드 염기 둘 다를 포함하거나 둘 다를 포함할 수 있다. 연결 요소는 최대 약 100개의 뉴클레오시드 염기 및/또는 변형된 뉴클레오시드 염기를 가질 수 있다. 한 구현예에서, 연결 요소는 최대 약 100개, 최대 약 90개, 최대 약 80개, 최대 약 70개, 최대 약 60개, 최대 약 50개, 최대 약 40개, 최대 약 30개, 최대 약 20개, 최대 약 10개, 최대 약 5개, 또는 최대 약 2개의 뉴클레오시드 염기 및/또는 변형된 뉴클레오시드 염기를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 링커는 1 - 100, 20 - 80, 40 - 60, 45 - 55, 또는, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 적어도 95, 적어도 100개 뉴클레오시드 염기 및/또는 변형된 뉴클레오시드 염기의 길이를 가질 수 있다.
다른 구현예에서, 링커는 아미노산 또는 아미노산 또는 펩티드의 사슬을 포함한다. 예를 들어, 링커는 1 - 100, 20 - 80, 40 - 60, 45 - 55, 또는, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 적어도 95, 적어도 100개 아미노산 잔기 범위인 서열을 포함할 수 있다. 한 예에서, 링커는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펩타펩티드 등을 포함할 수 있다. 아미노산은 자연 또는 비자연 발생 아미노산 또는 이의 조합일 수 있다. 펩티드 또는 폴리펩티드는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
다른 예에서, 링커는 L-아미노산, D-아미노산 또는 β-아미노산으로부터 선택된 아미노산을 포함할 수 있다. 한 예에서, 링커는 β-펩티드를 포함할 수 있다. 한 예에서, 아미노산 링커의 구성요소는 L 아미노산이다. 예를 들어, 링커는 Cys, Thr, Glu, Gly, Ser 또는 Lys 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 한 예에서, 링커는 Gly 및 Ser을 포함한다. 예를 들어, 링커는 GlySerSer 또는 GlySerSer 반복 (GlySerSer)n을 포함할 수 있고, 예를 들어, 링커는 (GlySerSer)n을 포함할 수 있고 여기서 n = 1, n = 2, n = 3, n = 4, n = 5, n = 6, n = 7, n = 8, n = 9, n = 10, n = 11, n = 12, n = 13, n = 14, n = 15, n = 16, n = 17, n = 18, n = 19, n = 20, n = 21, n = 22, n = 23, n = 24, n = 25, n = 26, n = 27, n = 28, n = 29, n = 30이다. 다른 예에서, 링커는 (GlySerSer)n-X-(GlySerSer)m을 포함할 수 있고, 여기서 n 및 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 30이고 X는 접합 요소, Cys, Thr, Glu 또는 Lys이다.
다른 예에서, 링커는 (GlySerSer)n-XY-(GlySerSer)m을 포함할 수 있고, 여기서 n 및 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40이고 X는 접합 요소, Cys, Thr, Glu 또는 Lys이고 Y는 임의의 아미노산이다. 다른 예에서, 링커는 (GlySerSer)n-X(Y)a-(GlySerSer)m을 포함할 수 있고, 여기서 n 및 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40이고 X는 접합 요소, Cys, Thr, Glu 또는 Lys이고, Y는 임의의 아미노산 또는 아미노산의 조합이고 a는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40이다.
한 예에서, 링커는 GlySer 또는 GlySer 반복 ((GlySer)n)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커는 (GlySer)n을 포함할 수 있고 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40이다. 다른 예에서, 링커는 (GlySer)n-Xa-(GlySer)m을 포함할 수 있고, 여기서 n 및 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40이고, X는 접합 요소, Cys, Thr, Glu 또는 Lys이고, Y는 임의의 아미노산 또는 아미노산의 조합이고 a는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40이다.
일부 구현예에서, 링커는 미생물 트랜스글루타미나제에 대한 고친화성 Gln 기질을 포함한다 (Oteng-Pabi 등, 2014). 예를 들어, 연결 요소는 WALQRPH (서열 번호 1) 및 WELQRPY (서열 번호 2)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 갖는 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 연결 요소는 소르타제 인식 서열을 포함한다 (Theile 등, 2013). 예를 들어, 연결 요소는 LPXT를 갖는 펩티드를 포함하고, 여기서 X는 임의의 아미노산 (서열 번호 3)이다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 소르타제 매개 반응은 CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분의 N-말단을 표지하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 스페이서 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 서열은 예를 들어, 상기 정의된 바와 같은, 하나 이상의 글리신, 세린 및/또는 트레오닌 잔기를 포함한다.
한 예에서, 링커는 티옥소-아미노산, 히드록시산, 메르캅토산, 디카보네이트, 디아민, 디티옥소탄산, 산 및 아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분자를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 링커 또는 테더는 유도체화된 아미노산 서열 또는 펩티드 핵산 (PNA)을 포함한다.
한 예에서, 링커는 상기 언급한 구성성분의 조합이다.
한 예에서, 항체 또는 항체 유사 분자는 펩티드 링커를 통해 CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착되어 항체 또는 항체 유사 분자와 CRET 쌍의 제1 구성성분이 단일 폴리펩티드를 형성한다. 한 예에서, 항원은 펩티드 링커를 통해 CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착되어 항원과 CRET 쌍의 제2 구성성분이 단일 폴리펩티드를 형성한다.
상기 언급된 "링커"를 제조하고 이들을 폴리펩티드, 예를 들어 항체, 항체 유사 분자, 항원, CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분에 부착시키는 수많은 방법이 당 업계에 공지되어 있고 본 개시내용에서 사용하기에 적합하다. 한 예에서, 항체 또는 항체 유사 분자는 반응성 작용기를 통해 링커에 부착되고 CRET 쌍의 제1 구성성분은 반응성 작용기를 통해 링커에 부착된다. 한 예에서, 항원은 반응성 작용기를 통해 링커에 부착되고 CRET 쌍의 제2 구성성분은 반응성 작용기를 통해 링커에 부착된다.
일부 구현예에서, 링커는 하나 이상의 반응성 작용기를 포함한다. 반응성 작용기는 항체, 항체 유사 분자, 항원, CRET 쌍의 제1 구성성분 또는 CRET 쌍의 제2 구성성분의 화학기와 본원에 기술된 분자를 형성하는 임의의 수단의 화학 반응에 의해 반응할 수 있다. 항체, 항체 유사 분자, 항원, CRET 쌍의 제1 구성성분 또는 CRET 쌍의 제2 구성성분에 대한 부착 부위는 1차 아민 (-NH2), 카르복실 (-COOH 또는 CO), 설프히드릴 (-SH), 카르보닐 (CHO) 및 탄수화물을 포함한다. 임의의 적합한 반응성 작용기가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 반응성 작용기는 설프히드릴 반응성 모이어티, 아민 반응성 모이어티 및 카르보닐 반응성 모이어티로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 반응성 작용기는 설프히드릴 반응성 모이어티, 아민 반응성 모이어티 및/또는 카르보닐 반응성 모이어티와 반응하는 기이다. 예를 들어, 반응성 모이어티는 유리 시스테인 잔기, 유리 리신 잔기 또는 카르보닐 기를 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 링커는 이들 사이에 공유 결합을 형성하기 위해 항체, 항체 유사 분자, 항원, BRET 쌍의 제1 구성성분 또는 BRET 쌍의 제2 구성성분에서 유리 시스테인 (예를 들어, 자연 발생 시스테인 또는 돌연변이에 의해 도입된 시스테인)과 반응성인 설프히드릴 반응성 모이어티와 함께 제공된다. 다른 구현예에서, 연결 요소는 이들 사이에 공유 결합을 형성하기 위해 항체, 항체 유사 분자, 항원, BRET 쌍의 제1 구성성분 또는 BRET 쌍의 제2 구성성분에서 리신 잔기 (예를 들어, 자연 발생 리신 또는 돌연변이에 의해 도입된 리신)와 반응성인 아민 반응성 모이어티와 함께 제공된다. 다른 구현예에서, 연결 요소는 이들 사이에 공유 결합을 형성하기 위해 항체, 항체 유사 분자, 항원, BRET 쌍의 제1 구성성분 또는 BRET 쌍의 제2 구성성분에서 카르보닐기와 반응성인 카르보닐 반응성 모이어티와 함께 제공된다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 이들 사이에 공유 결합을 형성하기 위해 항체, 항체 유사 분자, 항원, BRET 쌍의 제1 구성성분 또는 BRET 쌍의 제2 구성성분에서 설프히드릴 반응성 모이어티와 반응성인 유리 시스테인 또는 유리 리신과 함께 제공된다. 또 다른 구현예에서, 연결 요소는 이들 사이에 공유 결합을 형성하기 위해 항체, 항체 유사 분자, 항원, BRET 쌍의 제1 구성성분 또는 BRET 쌍의 제2 구성성분에서 아민 반응성 모이어티와 반응성인 유리 리신과 함께 제공된다. 다른 구현예에서, 연결 요소는 이들 사이에 공유 결합을 형성하기 위해 항체, 항체 유사 분자, 항원, BRET 쌍의 제1 구성성분 또는 BRET 쌍의 제2 구성성분에서 카르보닐 반응성 모이어티와 반응성인 카르보닐기과 함께 제공된다.
설프히드릴 반응성 모이어티는 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지리딘, 옥시란, S-피리딜, 할로아세틸 (브로모- 또는 요오도-), 말레이미도벤조일 설포숙신이미드 에스테르, 비닐 술폰, 피리딜디설파이드, 티오설포네이트 이소시아네이트 및 에폭사이드 기 또는 말레이미드 모이어티를 포함한다. 바람직한 설프히드릴 반응성 모이어티는 말레이미드, 아크릴아미드, 페닐카르보닐 아크릴아미드 및 요오도아세트아미드를 포함한다. 아민 반응성 모이어티는 활성 에스테르 (숙신이미딜 에스테르, 술포숙신이미딜 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 술포디클로로페놀 에스테르를 포함하지만, 이에 제한되지 않음), 이소티오시아네이트, 디클로로트리아진, 아릴 할라이드, 아실 아지드 및 술포닐 클로라이드를 포함한다. 이러한 아민 반응성 모이어티 중에서, 활성 에스테르는 안정한 카르복사미드 결합을 생성하므로 바람직한 시약이다 (예를 들어, Banks and Paquette, 1995 참조). 카르보닐 반응성 모이어티 히드라지드 및 알콕시아민과 같은 1차 아민을 포함한다. 카르보닐 함유 모이어티는 알데히드 (RCHO) 및 케톤 (RCOR')을 포함한다. 일부 예에서, 알데히드는 연결 요소에서 당 기의 과옥소산염 산화에 의해 생성된다. 알데히드기와 반응할 수 있는 적합한 반응성 작용기의 예는 아민, 히드라지드 및 알콕시아민을 포함한다.
반응성 작용기의 다른 예는 디아지린, 아릴 아지드 및 이소시아네이트를 포함한다.
한 예에서, 링커가 PEG를 포함하는 경우 이는 또한 PEG 링커를 항체, 항체 유사 분자, 항원, CRET 쌍의 제1 구성성분, CRET 쌍의 제2 구성성분 또는 추가 링커에 부착시키는데 사용될 수 있는 말레이미드 (Mal), N-히드록시숙신이미드, 디벤조시클로옥틴 (DBCO) 및 아지드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 반응성 작용기를 포함할 수 있다. 한 예에서, 링커는 아지도-(PEG)n-NHS 에스테르, DBCO-(PEG)n-Mal, mal-(PEG)n-NHS 또는 Mal-(PEG)n-Mal을 포함하고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40이다.
한 예에서, 링커가 펩티드를 포함하는 경우 이는 또한 시스테인 잔기 및/또는 리신 잔기를 포함할 수 있다.
한 예에서, 링커는 기능화되고 카르보이미드 화합물 (예를 들어 EDC)을 사용하여 CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분에 부착된다. 한 예에서, 링커는 기능화되고 N-히드록시숙신이미드 화합물 (예를 들어 술포-NHS)의 존재하에 카르보이미드 화합물 (예를 들어 EDC)을 사용하여 CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분에 부착된다.
다른 예에서, 링커는 Kolb 등 (2001), WO 2003/101972 및 Malkoch 등 (2005)에서 개시된 것과 같은 다양한 "Click 화학반응" 전략을 사용하여 기능화되고 부착될 수 있다.
다른 예에서, 링커는 생체접합 화학 (Hydralink로도 지칭됨)을 사용하여 기능화되고 부착될 수 있다 (Dirksen 등, 2006). 간단하게, Solulink 생체접합 화학은 방향족 히드라진과 방향족 알데히드의 반응을 기반으로 하여, 하기에 나타낸 안정한 비스-아릴히드라존 접합체 이온 원소를 형성한다:
Figure pct00001
다른 예에서, 링커는 4-포르밀벤즈아미드와 6-히드라지노니코틴아미드의 반응으로부터 형성된 알데히드-방향족 히드라진 링커를 포함한다.
추가 예에서, "링커"는 상기 논의된 바와 같이 트랜스글루타미나제 반응을 통해 부착될 수 있다. 추가 예에서, "링커"는 상기 논의된 바와 같이 소르타제 반응을 통해 부착될 수 있다.
일부 예에서, 항체 또는 항체 유사 분자는 링커를 통해 CRET 쌍의 제1 구성성분에 공유적으로 부착된다. 일부 구현예에서, 링커 (또는 이의 부분)는 항체 또는 항체 유사 분자의 필수 부분이다 (예를 들어, 항체 또는 항체 유사 분자 및 CRET 쌍의 제1 구성성분이 자연 발생 시스테인의 측쇄를 통해 직접 결합된 항체 또는 항체 유사 분자의 자연 발생 시스테인). 일부 구현예에서, 링커 (또는 이의 부분)는 CRET 쌍의 제1 구성성분의 필수 부분이다 (예를 들어, 자연 발생 시스테인, 히스티딘, 세린, 티로신 또는 리신 또는 효모 인식 서열, 바람직하게는 리신 또는 시스테인의 측쇄). 일부 구현예에서 링커는 항체 또는 항체 유사 분자를 CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착시키는 개별 화학적 개체이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 분자 (예를 들어, CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자 또는 CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항원)는 하나 이상의 링커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 링커. 예를 들어, 항체 또는 항체 유사 분자는 CRET 쌍의 제1 구성성분 공여자 또는 수용자 도메인을 부착시키기 위한 제1, 제2, 제3, 제4 또는 제5 링커를 가질 수 있다. 바람직하게는, 본원에 기술된 분자는 하나의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커의 수는 항체 또는 이의 단편의 힌지 영역에 존재하는 시스테인 잔기의 수에 좌우된다.
한 예에서, CRET 쌍의 제1 구성성분을 항체 또는 항체 유사 분자에 부착시키는 링커의 거리는 항체 또는 항체 유사 분자에 부착된 CRET 쌍의 제1 구성성분이 항원이 항체에 결합할 때 CRET 쌍의 제2 구성성분으로부터 적합한 거리가 되도록 허용한다. 당업자는 링커의 길이가 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 CRET (예를 들어, BRET)에 영향을 미칠 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 링커의 바람직한 길이는 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분의 선택에 따라 달라질 수 있다. 링커의 바람직한 길이는 본원에 정의된 방법 및 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
일부 예에서, 항원은 링커를 통해 CRET 쌍의 제2 구성성분에 공유적으로 부착된다. 일부 구현예에서, 링커 (또는 이의 부분)는 항원의 필수 부분이다 (예를 들어, 자연 발생 시스테인, 리신 또는 당 모이어티). 일부 구현예에서, 링커 (또는 이의 부분)는 CRET 쌍의 제2 구성성분의 필수 부분이다 (예를 들어, 자연 발생 시스테인 또는 리신의 측쇄). 일부 구현예에서 링커는 항원을 CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착시키는 개별 화학 모이어티이다.
한 예에서, 항체, 항체 유사 분자, 항원, CRET 쌍의 제1 구성성분 또는 CRET 쌍의 제2 구성성분은 링커에 대한 부착을 위해 기능화된다. 다시 말해서, 이들 분자는 링커에 대한 항체, 항체 유사 분자, 항원, CRET 쌍의 제1 구성성분 또는 CRET 쌍의 제2 구성성분의 부착을 용이하게 하는 화학 모이어티와 반응할 수 있다. 단백질을 링커에 부착시키는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Spicer & Davis (2014) 및 Boutureira & Bernardes (2015) 참조.
부착 부위
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, CRET 쌍의 제1 구성성분에 대한 항체 또는 항체 유사 분자 및 CRET 쌍의 제2 구성성분에 대한 항원의 부착 부위는 항체 또는 항체 유사 분자에 대한 항원의 결합을 유의하게 방해하지 않아야 한다. 일부 구현예에서, CRET 쌍의 제1 및/또는 제2 구성성분의 부착은 CRET 쌍의 제1 및/또는 제2 구성성분에 부착되지 않았을 때 항체 또는 항체 유사 분자에 대한 항원의 결합과 비교할 때 항체 또는 항체 유사 분자에 대한 항원의 결합을 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만, 75% 미만, 80% 미만, 85% 미만, 90% 미만 95% 미만, 98% 미만 또는 99% 미만으로 감소시킨다. 다시 말해서, 표지된 항원은 CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자로 이루어진 복합체를 형성하고 표지된 항원은 100 μM 이하, 10 μM 이하, 1 μM 이하, 500 mM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 500 pM 이하 또는 100 pM 이하의 해리 상수 (KD)를 갖는다. 부착은 또한 CRET 쌍의 제1 및/또는 제2 구성성분의 활성을 유의하게 방해하지 않아야 한다. 일부 구현예에서, 부착은 항원, 항체 또는 항체 유사 분자에 부착되지 않았을 때 CRET 쌍의 제1 및/또는 제2 구성성분의 활성과 비교할 때 CRET 쌍의 제1 및/또는 제2 구성성분의 활성을 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만, 75% 미만, 80% 미만, 85% 미만, 90% 미만 95% 미만, 98% 미만 또는 99% 미만으로 감소시킨다.
일부 구현예에서, CRET 쌍의 제1 구성성분은 항체 또는 항체 유사 분자의 항원 결합 부위에 부착되지 않는다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 유사 분자와 CRET 쌍의 제1 구성성분 사이의 부착은 부위 특이적이다. 일부 구현예에서, CRET 쌍의 제1 구성성분은 항체 또는 항체 유사 분자의 잔기의 측쇄에 부착된다. 잔기는 시스테인, 리신, 글루탐산 또는 아스파르트산일 수 있다. 바람직하게는, 잔기는 시스테인이다. 일부 구현예에서, 시스테인은 자연 발생 시스테인, 예를 들어 천연 서열에 존재하는 것이다. 대안적인 구현예에서, 시스테인은 천연 항체 또는 항체 유사 분자의 서열에 존재하지 않는 조작된 시스테인이다. 일부 구현예에서, 시스테인은 사슬 내 이황화 결합에 관련된 것이다. 부착 전에, 사슬 내 이황화 결합은 환원제, 예를 들어, TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀), DTT (디티오트레이톨), MEA (2-메르캅토에틸아민, 시스테아민) 또는 2-메르캅토에탄올로 처리하여 환원된다. 바람직하게는, 환원제는 약한 환원제, 예를 들어 MEA 또는 TCEP이다 (예를 들어, Kirley 등, 2016 참조). 환원 조건은 부분적으로 환원된 항체의 수율을 최적화하기 위해 달라질 수 있다 (예를 들어, 환원제의 농도, pH, 온도, 환원제, 시간). 일부 구현예에서, 부분적으로 환원된 항체 또는 항체 유사 분자는 예를 들어 근접하여 위치하는 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합의 재형성을 촉진하기 위해 약한 산화에 적용된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 부분적으로 환원된 항체는 디히드로아스코르브산 (DHAA)으로 처리된다. 일부 구현예에서, 잔기는 항체 또는 항체 유사 분자의 힌지 영역의 시스테인이거나 잔기는 중쇄-경쇄 이황화 결합 또는 이의 조합에 관련된 시스테인이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 유사 분자는 힌지 영역을 갖는 항체이고 부착점은 항체의 힌지 영역의 시스테인이다.
일부 구현예에서, CRET 쌍의 제1 구성성분은 항체 또는 항체 유사 분자의 N- 또는 C-말단에 부착된다. 한 예에서, 부착은 펩티드 결합을 통한다.
항체 또는 항체 유사 분자는 번역 후 변형될 수 있다 (예를 들어, 글리코실화). 일부 구현예에서, CRET 쌍의 제1 구성성분은 번역후 변형을 통해 항체 또는 항체 유사 분자에 부착된다. 예를 들어, CRET 쌍의 제1 구성성분은 탄수화물 모이어티를 통해 항체 또는 항체 유사 분자에 부착될 수 있다. 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "탄수화물 모이어티"는 당류, 다당류, 올리고당, 및 당을 포함하고 이의 정의는 탄수화물 화학 분야에서 잘 알려져 있다. 폴리펩티드를 항체 또는 항체 유사 분자의 탄수화물 모이어티에 부착시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리펩티드를 항체의 탄수화물 모이어티에 부착시키는 방법은 예를 들어, US 6,218,160에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, CRET 쌍의 제2 구성성분은 항원에 부위 특이적으로 부착된다. 일부 구현예에서, CRET 쌍의 제2 구성성분은 항원의 잔기의 측쇄에 부착된다. 잔기는 시스테인, 리신, 글루탐산 또는 아스파르트산일 수 있다. 바람직하게는, 잔기는 시스테인 또는 리신이다. 일부 구현예에서, 잔기는 자연 발생 잔기, 예를 들어 폴리펩티드의 천연 서열에 존재하는 것이다. 대안적인 구현예에서, 잔기는 폴리펩티드의 천연 서열에 존재하지 않는 조작된 잔기이다. 일부 구현예에서, CRET 쌍의 제2 구성성분은 항원의 N- 또는 C-말단에 부착된다. 한 예에서, 부착은 펩티드 결합을 통한다. 예를 들어, CRET 쌍의 제2 구성성분 및 단일 폴리펩티드에 대한 항원.
일부 구현예에서, 항원은 CRET 쌍의 제2 구성성분의 잔기의 측쇄에 부착된다. 잔기는 시스테인, 리신, 글루탐산 또는 아스파르트산일 수 있다. 바람직하게는, 잔기는 시스테인 또는 리신이다. 한 예에서, 잔기는 리신이다. 일부 구현예에서, 잔기는 자연 발생 잔기, 예를 들어 폴리펩티드의 천연 서열에 존재하는 것이다. 대안적인 구현예에서, 잔기는 폴리펩티드의 천연 서열에 존재하지 않는 조작된 잔기이다.
화학발광 공명 에너지 전달
본 개시내용의 항체 또는 항체 유사 분자에 대한 분석물의 결합은 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율의 감소를 초래한다. 에너지 전달의 효율의 감소는 분석물이 시료에 존재함을 표시한다 (도 1 참조).
화학발광은 촉매의 존재하에 유기 염료와 산화제 사이의 화학 반응의 결과이다. 화학발광 방출은 화학적으로 유도된, 유기 염료의 여기 상태에서의 에너지가 바닥 상태로 붕괴될 때 발생한다. 화학발광 방출의 지속 시간 및 강도는 대부분 반응 용액에 존재하는 화학 시약의 정도에 따라 다르다. 용어 "화학발광"은 효소의 활성에 의존하는, 생물발광을 포함하기 위해 본원에서 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 화학발광 공명 에너지 전달 (CRET)은 화학발광 공여자와 수용자 분자 사이의 비방사성 에너지 전달에 기초한 근접 분석이다. 본원에 사용된 바와 같이, 생물발광 공명 에너지 전달 (BRET)은 생물발광 단백질 공여자와 수용자 분자 사의의 비방사성 에너지 전달에 기초한 근접 분석이다.
A. 공여자 도메인
CRET 쌍의 제1 구성성분 또는 제2 구성성분 중 하나는 공여자 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CRET의 제1 구성성분은 공여자 도메인이다. 대안적인 구현예에서, CRET의 제2 구성성분은 공여자 도메인이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "공여자 도메인"은 광을 방출하는 분자, 예를 들어 특정 파장의 광으로 조사될 때, 광 또는 화학 반응의 결과로 광 방출을 야기하는 분자를 방출하는 분자를 의미한다. 공여자 도메인은 화학발광 공명 에너지 전달 쌍 (예를 들어, BRET 쌍)에서 공여자 도메인으로 작용할 수 있고, 문맥에 따라, 본원에서 "화학발광 공명 에너지 전달 공여자 도메인" 또는 "CRET 공여자 도메인"으로도 지칭된다. 바람직한 구현예에서, CRET 쌍은 BRET 쌍이고 공여자 도메인은 "생물발광 공명 에너지 전달 공여자 도메인" 또는 "BRET 공여자 도메인"으로 지칭된다.
적합한 공여자 도메인은 BRET 쌍에서 공여자 도메인으로 작용할 수 있는 화학발광 도메인을 포함한다. 예를 들어, 공여자 도메인은 화학발광 공여자 도메인일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 화학발광 공여자 도메인은 생물발광 단백질이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물발광 단백질"은 발광을 생성하기 위해 적합한 기질에 작용할 수 있는 임의의 단백질을 지칭한다. 생물발광 단백질은 기질을 활성화된 생성물로 전환시킨 다음 이완될 때 에너지를 방출하는 효소인 것으로 당업계에서 이해된다. 활성화된 생성물 (기질에서 생물발광 단백질의 활성에 의해 생성됨)은 수용자 분자로 전달되는 생물발광 단백질-생성 발광의 공급원이다.
임의의 적합한 생물발광 단백질은 본 개시내용의 센서에 사용될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 다수의 상이한 생물발광 단백질이 있다 (예를 들어, 표 1 참조). 발광 시스템은 박테리아, 원생동물, 코엘렌테레이트, 연체동물, 물고기, 노래기, 파리, 곰팡이, 벌레, 갑각류, 및 딱정벌레, 특히 피로포러스 속의 방아벌레 및 포티누스 , 포투리스, 및 루시올라 속의 개똥벌레를 포함하는 많은 발광 유기체로부터 알려졌고 단리되었다. 생물발광을 나타내는 추가 유기체는 WO 00/024878, WO 99/049019 및 Viviani (2002)에 나열되어 있다.
표 1. 예시적인 생물발광 단백질.
Figure pct00002
Figure pct00003
한 가지 매우 잘 알려진 예는 특정 생화학 물질인, 루시페린 (자연 발생 형광단)이 루시퍼라제 활성을 갖는 효소에 의해 산화되는 에너지 생성 화학 반응을 촉매하는 루시퍼라제로 알려진 단백질 부류이다 (Hastings, 1996). 박테리아, 조류, 균류, 곤충, 및 기타 해양 형태의 종을 포함하는, 원핵 및 진핵 생물의 매우 다양한 유기체는 이러한 방식으로 빛 에너지를 방출할 수 있고 각각은 특정 루시퍼라제 활성 및 다른 유기체와 화학적으로 구별되는 루시페린을 갖는다. 루시페린/루시퍼라제 시스템은 형태, 화학 및 기능이 매우 다양하다. 따라서 루시퍼라제 활성을 갖는 생물발광 단백질은 다양한 공급원 또는 다양한 수단에 의해 입수 가능하다. 루시퍼라제 활성을 갖는 생물발광 단백질의 예는 US 5,229,285, 5,219,737, 5,843,746, 5,196,524, 및 5,670,356에서 찾을 수 있다. 가장 널리 사용되는 루시퍼라제 중 두 가지는 다음과 같다: (i) 레닐라 루시퍼라제 (R. 레니포르미스에서 유래), 35 kDa 단백질, 이는 코엘레테라진을 기질로서 사용하고 480 nm에서 빛을 방출하고 (Lorenz 등, 1991); 그리고 (ii) 반딧불이 루시퍼라제 (포티누스 피랄리스에서 유래), 61 kDa 단백질, 이는 루시페린을 기질로서 사용하고 560 nm에서 빛을 방출한다 (de Wet 등, 1987).
가우시아 루시퍼라제 (가우시아 프린셉스에서 유래)는 생화학적 분석에 사용되었다 (Verhaegen 등, 2002). 가우시아 루시퍼라제는 20 kDa 단백질이고 코엘레테라진을 빠른 반응으로 산화시켜 470 nm에서 밝은 빛을 방출한다.
본 발명에 유용한 루시퍼라제는 또한 아나크노캄파 종으로부터 특성화되었다 (WO 2007/019634). 이들 효소는 약 59 kDa 크기이고 스펙트럼의 파란색 부분 내에서 방출 스펙트럼으로 발광 반응을 촉매하는 ATP-의존성 루시퍼라제이다.
자연 발생 생물발광 단백질의 생물학적 활성 변이체 또는 단편은 당업자에 의해 용이하게 생성될 수 있다. 본 발명에 유용한 이러한 변이체의 세 가지 예는 RLuc2 (Loening 등, 2006), RLuc8 (Loening 등, 2006) 및 RLuc8.6-535 (Loening 등, 2007)이고 이들은 각각 레닐라 루시퍼라제의 변이체이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 공여자 도메인의 서열은 천연 레닐라 루시퍼라제를 포함하는 분자보다 더 큰 열 안정성을 갖도록 선택된다. RLuc2 또는 RLuc8은 적합한 선택의 편리한 예이고, 이는 결과적으로 천연 레닐라 루시퍼라제 서열을 포함하는 센서보다 ≥5x 또는 ≥10x 더 높은 휘도를 나타낸다. 이러한 향상된 휘도는 주어진 시간 분해능에 대해 시약을 보다 경제적으로 사용할 수 있으므로 상당한 이점이 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 대안적인, 비-루시퍼라제, 생물발광 단백질은 발광 신호를 생성하기 위해 적합한 기질에서 작용할 수 있는 임의의 효소이다. 이러한 효소의 특정 예는 β-갈락토시다제, 락타마제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-글루쿠로니다제 및 β-글루코시다제이다. 이들 효소에 대한 합성 발광 기질은 당업계에 잘 알려져 있고 Tropix Inc. (Bedford, MA, USA)와 같은 회사로부터 상업적으로 입수 가능하다.
본 발명에 유용한 퍼옥시다제의 예는 Hushpulian 등, (2007)에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 생물발광 단백질은 루시퍼라제, β-갈락토시다제, 락타마제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-글루쿠로니다제 또는 β-글루코시다제이다. 일부 구현예에서, 생물발광 단백질은 루시퍼라제이다. 적합한 루시퍼라제는 레닐라 루시퍼라제, 반딧불이 루시퍼라제 (예를 들어 PpyRE8, PpyRE10), 코엘렌테레이트 루시퍼라제, 북미 개똥벌레 루시퍼라제, 방아벌레 루시퍼라제, 딱정벌레 루시퍼라제, 박테리아 루시퍼라제, 가우시아 루시퍼라제, 에쿼린, 아라크노캄파 루시퍼라제, 오플로포러스 크라실리로스트리스루시퍼라제 또는 이들 중 어느 하나의 생물학적 활성 변이체 또는 단편, 또는 둘 이상의 키메라를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 한 예에서, 바람직한 루시퍼라제는 RLuc8 또는 이의 변이체이다.
본원에 사용된 바와 같이, "생물학적 활성 단편"은 전장 폴리펩티드의 정의된 활성을 유지하는 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩티드의 일부이다. 본원에 사용된 바와 같이, "생물학적 활성 변이체"는 하나 이상의 아미노산에 의해 자연 발생 및/또는 정의된 분자와 다르지만 생물학적 활성 단편에 대해 상기 정의된 바와 같은, 정의된 활성을 유지하는 분자이다. 생물학적 활성 변이체는 자연 발생 및/또는 정의된 분자에 대해 일반적으로 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 99% 동일하다.
한 구현예에서, 입체 장애로 인한 상호작용의 억제를 방지하기 위해 분자량이 작은 생물발광 단백질이 사용된다. 생물발광 단백질은 바람직하게는 단일 폴리펩티드 사슬로 이루어진다. 또한 생물발광 단백질은 바람직하게는 올리고머 또는 응집체를 형성하지 않는다. 생물발광 단백질 레닐라 루시퍼라제, 가우시아 루시퍼라제 및 반딧불이 루시퍼라제는 이러한 기준의 전부 또는 대부분을 충족한다.
일부 구현예에서, 화학발광 공여자 도메인은 기질을 변형할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기질"은 발광을 생성하거나 흡수하기 위해 화학발광 공여자와 함께 사용될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 기질의 선택은 화학발광 공여자에 의해 발생된 빛의 파장 및 강도에 영향을 미칠 수 있다. 일부 구현예에서, 생물발광 단백질은 루시페린, 칼슘, 코엘레테라진, 푸리마진 또는 유도체, 유사체 또는 코엘레테라진, 루시페린 또는 푸리마진의 안정화된 유도체로부터 선택된 기질을 갖는다.
코엘레테라진은 자포동물, 요각류, 모악동물, 빗해파리, 십각새우, 보리새우, 방사충 및 일부 어류 분류군에서 발생하는 널리 알려진 기질이다 (Greer and Szalay, 2002). 레닐라 루시퍼라제의 경우 예를 들어, 코엘레테라진 유사체/유도체를 사용할 수 있어 418과 547 nm 사이에서 빛 방출을 초래한다 (Inouye 등, 1997, Loening 등, 2007). 코엘레테라진 유사체/유도체 (400A, DeepBlueC)는 레닐라 루시퍼라제를 사용하여 400 nm에서 빛을 방출하는 것으로 기술되어 있다 (WO 01/46691). 코엘레테라진 유사체/유도체의 다른 예는 EnduRen, 프롤룸 퍼플, 프롤룸 퍼플 II, 프롤룸 퍼플 III, ViviRen 및 푸리마진이다. 코엘레테라진 유사체/유도체의 다른 예는 PCT/US2013057660 및 US20140302539에 기술된 화합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "루시페린"은 광범위하게 정의되고 생물발광이 가능한 유기체에서 발견되는 발광 생물학적 안료의 부류뿐만 아니라 합성 유사체 또는 기능적으로 동등한 화학물질을 지칭하고, 이는 옥시루시페린 및 빛의 형태로 에너지를 생산하기 위해 효소 루시퍼라제의 존재하에 산화된다. D-루시페린, 또는 2-(6-히드록시벤조티아졸-2-일)-2-티아졸린-4-카르복실산은 반딧불이 포티누스 피랄리스로부터 처음 단리되었다. 그 이후로, 다양한 화학적으로 다른 형태의 루시페린이 발견되었고 주로 바다의 다양한 유기체, 예를 들어 물고기 및 오징어에서 연구되었지만, 그러나, 육상 거주 유기체, 예를 들어, 벌레, 딱정벌레 및 다양한 다른 곤충에서 다수 확인되었다 (Day 등, 2004; Viviani, 2002). 본원에 사용된 바와 같이, 루시페린은 또한 루시페린의 유도체 또는 유사체를 포함한다.
완전 합성 루시페린, 예를 들어 고리형 알킬아미노루시페린 (CycLuc1) 외에도, 적어도 5가지의 일반적인 유형의 생물학적으로 진화된 루시페린이 있고, 이들은 각각 화학적으로 상이하고 다양한 보조인자를 사용하는 화학적 및 구조적으로 다른 루시페라제에 의해 촉매된다. 첫째, 반딧불이 루시퍼라제의 기질, 반딧불이 루시페린으로, 촉매 작용을 위해 ATP가 필요하다 (EC 1.13.12.7). 둘째, 박테리아 루시페린으로, 일부 오징어 및 물고기에서도 발견되고, 장쇄 알데히드 및 환원된 리보플라빈 인산염으로 이루어진다. 박테리아 루시퍼라제는 FMNH-의존성이다. 셋째, 와편모충 루시페린으로, 야간 해양 인광을 담당하는 유기체인 와편모충 (해양 플랑크톤)에서 발견되는 테트라피롤산 엽록소 유도체이다. 와편모충 루시퍼라제는 와편모충 루시페린의 산화를 촉매하고 3개의 동일하고 촉매 활성인 도메인으로 이루어진다. 넷째, 이미다졸로피라진 바르굴린으로, 특정 패충류 및 심해어류, 예를 들어, 포리피시스에서 발견된다. 마지막으로, 단백질 에쿼린의 발광체, 코엘레테라진 (이미다졸로피라진)으로, 방사충, 빗해파리, 자포동물, 오징어, 요각류, 모악동물, 물고기 및 새우에서 발견된다.
일부 구현예에서, 생물발광 단백질은 보조인자를 필요로 한다. 보조 인자의 예는 ATP, 마그네슘, 산소, FMNH2, 칼슘, 또는 이들 중 임의의 둘 이상의 조합을　포함하지만, 이에 반드시 제한되지는 않는다.
B.수용자 도메인
CRET 쌍의 제1 구성성분 또는 제2 구성성분 중 하나는 수용자 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CRET의 제1 구성성분은 수용자 도메인이다. 대안적인 구현예에서, CRET의 제2 구성성분은 수용자 도메인이다.
수용자 도메인은 화학발광 공명 에너지 전달 쌍 (예를 들어, BRET 쌍)에서 수용자 도메인으로 작용할 수 있고, 문맥에 따라, 또한 "화학발광 공명 에너지 전달 수용자 도메인" 또는 "CRET 수용자 도메인"으로 본원에서 지칭된다. 바람직한 구현예에서, CRET 쌍은 BRET 쌍이고 수용자 도메인은 "생물발광 공명 에너지 전달 공여자 도메인" 또는 "BRET 공여자 도메인"으로 지칭된다. 본원에 사용된 바와 같이, "수용자 도메인"은 공여자 도메인의 활성의 결과로서 방출된 에너지를 수용할 수 있는 임의의 분자이다. 수용자 도메인은 단백질 또는 비-단백질 수용자 도메인일 수 있다.
일부 구현예에서, 수용자 도메인 ("수용자 분자"로도 본원에서 지칭됨)은 형광 수용자 도메인이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "형광 수용자 도메인" ("형광 수용자 분자"로도 본원에서 지칭됨)은 공여자 도메인의 활성의 결과로서 방출된 에너지를 수용하고, 빛 에너지로서 재방출할 수 있는 임의의 화합물을 지칭한다. 형광 수용자 도메인은 단백질 또는 비-단백질 형광 수용자 도메인일 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 다수의 상이한 수용자 도메인이 있다. 일부 구현예에서, 수용자 도메인은 단백질, 작은 유기 분자, 희토류 원소 킬레이트 및 양자점으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 수용자 도메인은 단백질이다. 일부 구현예에서, 수용자 도메인은 작은 유기 분자, 희토류 원소 킬레이트 또는 양자점이 아니다. 일부 구현예에서, 수용자 도메인은 작은 유기 분자가 아니다. 일부 구현예에서, 수용자 도메인은 희토류 원소 킬레이트가 아니다. 일부 구현예에서, 수용자 도메인은 양자점이 아니다.
일부 구현예에서, 형광 수용자 도메인은 형광 단백질이다. 매우 잘 알려진 한 가지 예는 해파리 에쿼리아 빅토리아의 녹색 형광 단백질 및 분자 생물학의 적용, 예를 들어 돌연변이 유발 및 키메라 단백질 기술로 발생하는 수많은 다른 변이체 GFP)를 포함하는 형광단 그룹이다 (Tsien, 1998). GFP는 이들의 발색단의 독특한 성분에 따라 분류되고, 각 클래스는 뚜렷한 여기 및 방출 파장을 갖는다: 클래스 1, 중성 페놀 및 음이온성 페놀레이트의 야생형 혼합물: 클래스 2, 페놀레이트 음이온: 클래스 3, 중성 페놀: 클래스 4, 적층 s-전자 시스템을 갖는 페놀레이트 음이온: 클래스 5, 인돌: 클래스 6, 이미다졸: 및 클래스 7, 페닐.
　돌연변이된 자연 발생 수용자 분자 (변이체)가 또한 본 발명에 유용할 수 있다. BRET에 적합한 조작된 시스템의 한 예는 매개 단백질(들)이 없는 상태에서 서로 상당한 정도로 직접적으로 상호작용하지 않는　레닐라 루시퍼라제 및 GFP (EYFP) 페어링의 강화 황색 돌연변이이다 (이 경우, G 단백질 결합 수용체) (Xu 등, 1999).
예는 녹색 형광 단백질 (GFP), GFP의 청색 형광 변이체 (BFP), GFP의 청록색 형광 변이체 (CFP), GFP의 황색 형광 변이체 (YFP), 강화 GFP (EGFP), 슈퍼폴더 GFP, 아자미 그린, mWasabi, TagGFP, 터보 GFP, AcGFP, ZsGreen, T-Sapphire, 강화 CFP (ECFP), CyPET, AmCyan1, 미도리-이시 그린, TagCFP, mTFP1 (Teal), 강화 YFP (EYFP), GFPS65T, 에메랄드, 비너스, mOrange, 토파즈, mCitrine, YPet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow, mBanana, 쿠사비라 오렌지, 쿠사비라 오렌지2, mOrange, mOrange2, GFPuv, 불안정화 EGFP (dEGFP), 불안정화 ECFP (dECFP), 불안정화 EYFP (dEYFP), dKeima-탠덤, HcRed, HcRed-탠덤, t-HcRed, AQ143, DsRed, DsRed2, t-dimer2, tdimer2(12), mRFP1, mTangarine, 포실로포린, 레닐라 GFP, 에쿼리아 빅토리아 GFP, 몬스터 GFP, paGFP, 카에데 단백질, tdTomato, mCherry, mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2, JRed, HcRed1, mRaspberry, mPlum, TagRFP, 터보FP 및 R-피코에리트린 (R-PE), B-피코에리트린 (B-PE), C-피코시아닌 (CPC), 알로피코시아닌 (APC) 및 R-피코시아닌 (RPC)을 포함하는 피코빌리단백질 및 이들 중 어느 하나의 생물학적 활성 변이체 또는 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 바람직한 형광 수용자 도메인은 GFP이다. 일부 구현예에서, 바람직한 형광 수용자 도메인은 GFP2이다.
대안적인 구현예에서, 수용자 도메인은 비-단백질 수용자 도메인이다. 일부 구현예에서, 비-단백질 수용자 도메인은 형광 수용자 도메인 또는 소광제일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "소광제"는 공여자 도메인의 활성의 결과로서 방출된 에너지를 빛 에너지로 재방출하지 않고, 수용할 수 있는 임의의 화합물을 지칭한다. 비-형광 수용자는 소광제일 수 있다.
임의의 적합한 비-단백질 형광 수용자 도메인이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 수용자 도메인은 Alexa Fluor 염료, Bodipy 염료, Cy 염료, 풀로오레세인, 단실, 움벨리페론, 마리나 블루, 캐스케이드 블루, 캐스케이드 옐로우, 퍼시픽 블루, 오레곤 그린, 테트라메틸로다민, 로다민, 쿠마린, 붕소-디피로메텐 (BODIPY), 레소루핀, 텍사스 레드, 희토류 원소 킬레이트, 또는 이들의 임의의 조합 또는 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 유도체의 예는 아민 반응성 유도체, 알데히드/케톤 반응성 유도체, 시토신 반응성 또는 설프히드릴 반응성 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 수용자 도메인은 풀로오레세인 또는 이의 유도체이다. 적합한 유도체는 아민-반응성 풀로오레세인 유도체, 풀로오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), NHS-풀로오레세인, NHS-LC-풀로오레세인, 설프히드릴-반응성 풀로오레세인 유도체, 5-(및 6)-요오도아세타아미도-풀로오레세인, 풀로오레세인-5-말레이미드, 풀로오레세인-6-말레이미드, SAMSA-풀로오레세인, 알데히드/케톤 및 시토신 반응성 풀로오레세인 유도체, 풀로오레세인-5-티오세미카르바지드 및 5-(((2-(카르보히드라진)메틸)티오)아세틸)-아미노풀로오레세인을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, R2는 풀로오레세인-5-말레이미드 유도체이다. 일부 구현예에서, 수용자 도메인은 로다민 또는 이의 유도체이다. 적합한 유도체는 아민-반응성 로다민 유도체, 테트라메틸로다민-5-(및 6)-이소티오시아네이트, NHS-로다민, Lissamine™ 로다민 B 설포닐 클로라이드, Lissamine™ 로다민 B 설포닐히드라진, 설프히드릴-반응성 로다민 유도체, 테트라메틸로다민-5-(및 6)-요오도아세트아미드, 알데히드/케톤 및 시토신 반응성 로다민 유도체, 텍사스 레드 히드라진 및 텍사스 레드 설포닐 클로라이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, R2는 쿠마린 또는 이의 유도체이다. 적합한 유도체는 아민-반응성 쿠마린 유도체, AMCA, AMCA-NHS, AMCA-술포-NHS, 설프히드릴-반응성 쿠마린 유도체, AMCA-HPDP, DCIA, 알데히드 및 케톤 반응성 쿠마린 유도체 및 AMCA-히드라지드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 수용자 도메인은 붕소-디피로메텐 (BODIPY) 또는 이의 유도체이다. 적합한 유도체는 아민-반응성 붕소-디피로메텐 염료, BODIPY FL C3-SE, BODIPY 530/550 C3, BODIPY 530/550 C3-SE, BODIPY 530/550 C3-히드라지드, BODIPY 493/503 C3-히드라지드, BODIPY FL C3-히드라지드, 설프히드릴-반응성 붕소-디피로메텐 염료, BODIPY FL 1A, BOPDIY 530/550 1A, Br-BOPDIPY 493/503 및 알데히드 및 케톤 반응성 붕소-디피로메텐 염료를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 수용자 도메인은 Cy (시아닌) 염료 또는 이의 유도체이다. 적합한 유도체는 아민 반응성 시아닌 염료, 티올-반응성 시아닌 염료 및 카르보닐-반응성 시아닌 염료를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 수용자 도메인은 소광제이다. 임의의 적합한 소광제가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 수용자 도메인은 DABCYL [4-((4-(디메틸아미노) 페닐)아조)벤조산], DABSYL (디메틸아미노아조술폰산), 금 및 은과 같은 금속 나노입자, 블랙 홀 소광제 (BHQ), QSY 염료 및 QXL 소광제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, R2는 DABCYL [4-((4-(디메틸아미노)페닐)아조)벤조산], DABSYL (디메틸아미노아조술폰산), 블랙 홀 소광제 (BHQ), QSY 염료 및 QXL 소광제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 수용자 도메인은 양자점이다. 본 명세서 전반에 걸쳐 양자점 및 나노결정은 상호 교환적으로 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, "양자점"은 주기율표의 II-VI 족 또는 III-V 족 원소의 원자로 구성된 반도체이다 (예를 들어, CdSe, CdTe 및 InP). 동일한 물질이지만, 크기가 다른 양자점은 다른 색상의 빛을 방출할 수 있다. 이들의 밝기는 세 공간 차원 모두에서 전자의 구속으로 인한 에너지 준위의 양자화에 기인한다. 벌크 반도체에서, 전자-정공 쌍은 각 반도체 유형의 특징인, 보어 엑시톤 반경 내에서 결합된다. 양자점은 보어 엑시톤 반경보다 작기 때문에, 이산 에너지 준위가 나타난다. 반도체의 원자가와 전도대 사이의 밴드 갭, △E는 나노결정의 크기와 모양의 함수이다. 기존의 유기 형광단과 비교하여, 양자점은 발광 양자 수율이 약간 낮지만 흡수 단면적이 훨씬 크고 광표백 속도가 매우 낮다. 양자점의 몰 흡광계수는 약 105 - 106 M-1 cm-1이고, 이는 염료보다 10-100배 크다. 본원에 사용된 바와 같이, "양자 수율"은 원래 에너지 기부의 최종 방출의 척도를 지칭한다.
목적에 적합한 임의의 양자점이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 양자점의 광학 특성은 쉘을 합성함으로써 조작될 수 있다. 전형적으로, 쉘은 안정화 쉘이다. 이러한 양자점은 코어-쉘 양자점으로 알려져 있고 CdSe/ZnS, InP/ZnS, InP/CdSe을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 코어/쉘 양자점은 더 낮은 밴드 갭 코어 주위에 더 높은 밴드 갭 쉘을 갖고, 쉘에 의해 흡수되지 않고 빛을 방출한다. 쉘은 코어로부터의 표면 비방사 방출을 보호함으로써 광발광 양자 수율을 향상시키고 자연 분해를 방지한다. 유형 I 양자점 (예를 들어, CdSe/ZnS)의 쉘은 코어보다 높은 에너지 전도 밴드 및 낮은 에너지 원자가 밴드를 가지므로, 코어에 전자와 정공이 모두 구속된다. 유형 II 양자점 (예를 들어 CdTe/CdSe 및 CdSe/ZnTe)의 쉘의 전도대 및 원자가 밴드는 코어보다 둘 다 에너지가 더 낮거나 더 높다. 따라서, 전자와 정공의 운동은 1차원으로 제한된다. 코어-쉘 인터페이스에서 여기자의 복사 재결합은 유형-II 방출을 발생시킨다. 유형 II 양자점은 밴드 가장자리 근처에서 간접 반도체로 동작하므로, 적색 및 근적외선에 흡수 꼬리를 갖는다. 유형 I 및 II가 선호되지만, 합금 반도체 양자점 (CdSeTe)이 또한 사용될 수 있다. 합금 조성 및 내부 구조는 다양할 수 있어, 입자 크기를 변경하지 않고도 광학 특성을 조정할 수 있도록 한다.
일부 구현예에서, 양자점은 CdSe/ZnS 코어/쉘 양자점, CdTe/CdSe 코어/쉘 양자점, CdSe/ZnTe 코어/쉘 양자점, 및 합금 반도체 양자점 (예를 들어, CdSeTe)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
다중 센서를 만들기 위해 상이한 색상 방출이 필요한 경우 (다중 검출), 이는 상이한 방출 파장을 생성하는 양자점 코어의 크기를 변경하여 달성할 수 있다. 양자점은 당업자에게 공지된 기술에 의해 안정화되거나 안정화되지 않을 수 있다.
C.공여자 도메인 및 수용자 도메인 쌍 (CRET 쌍)
CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분은 함께 CRET 쌍을 형성한다. 본원에 사용된 바와 같이, "CRET 쌍"은 에너지 전달에 참여하는 분자 그룹을 지칭하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, CRET 쌍의 제1 구성성분은 BRET 공여자 도메인을 포함하고 CRET 쌍의 제2 구성성분은 BRET 수용자 도메인을 포함한다. 대안적인 구현예에서, CRET 쌍의 제1 구성성분은 BRET 수용자 도메인을 포함하고 CRET 쌍의 제2 구성성분은 BRET 공여자 도메인을 포함한다. 임의의 수의 공여자-수용자 조합이 사용될 수 있다. 공여자-수용자 조합은 CRET 쌍 (예를 들어, BRET 쌍)으로 작용할 수 있어야 한다.
당업자는 효율적인 에너지 전달을 허용하는 공여자 및 수용자 쌍을 선택할 수 있을 것이다. 바람직한 구현예에서, 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 도메인에 결합될 때, 공여자 도메인 및 수용자 도메인의 분리 및 상대적 배향은 푀르스트 거리의 ±50% 이내이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 도메인에 결합될 때, 공여자 도메인 및 수용자 도메인의 분리 및 상대적 배향"은 50%의 R0 범위 내에서 수행될 수 있는 정상 상태 CRET 측정을 지칭한다. 이 문구는 10-90% 범위인 공여자 도메인으로부터 수용자 도메인으로의 발광 에너지 전달의 효율 ("에너지 전달의 효율"로도 본원에서 지칭됨)을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "에너지 전달의 효율"은 공여자 여기 이벤트당 여기 상태 공여자로부터 기저 상태 수용자로 비방사적으로 전달되는 에너지의 분율을 의미한다. 일부 구현예에서, 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 10 내지 75%의 범위이다. 일부 구현예에서, 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 15 내지 75%, 20 내지 75%, 25 내지 75%, 30 내지 75%, 35 내지 75%, 40 내지 75%, 45 내지 75%, 45 내지 75%, 50 내지 75%, 55 내지 75%, 60 내지 75%, 65% 내지 75% 또는 70 내지 75%의 범위이다. 다른 구현예에서, 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 10 내지 70%, 10 내지 65%, 10 내지 60%, 10 내지 55%, 10 내지 50%, 10 내지 45%, 10 내지 40%, 10 내지 35%, 10 내지 30%, 10 내지 25%, 10 내지 20% 또는 10 내지 15%의 범위이다.
일부 구현예에서, 화학발광 공여자 도메인과 수용자 도메인의 푀르스터 거리는 적어도 4　nm이거나, 적어도 5.6　nm이거나, 적어도 6　nm이다. 일부 구현예에서, 푀르스터 거리는 12 nm 미만, 11 nm 미만, 10 nm 미만 또는 9 nm 미만이다. 일부 구현예에서, 공여자 도메인과 수용자 도메인의 푀르스터 거리는 약 4　nm 내지 약 11 nm이거나, 약 5.6　nm 내지 약 11　nm이거나 약 7　nm 내지 약 11　nm이다. 일부 구현예에서, CRET 쌍의 푀르스터 거리는 약 4 nm 내지 약 18 nm이거나, 약 6 nm 내지 약 12 nm이거나, 약 7.5 nm 내지 10.5 nm이다.
적합한 페어링을 결정할 때 고려해야 하는 기준은 공여자의 스펙트럼과 비교한 수용자 분자의 상대 방출/형광 스펙트럼이다. 2개의 분자가 서로에 대해 적절한 근접 및 방향에 있을 때 공여자 방출의 빛 에너지가 수용자 분자를 여기시킬 수 있는 파장에 있도록 하여 수용자 분자 형광을 촉진하도록 공여자의 방출 스펙트럼은 수용자 분자의 흡광도 스펙트럼과 중첩되어야 한다. 예를 들어, 레닐라 루시퍼라제/EGFP 페어링은 관찰 가능한 방출 스펙트럼 피크를 기반으로 하는 레닐라 루시퍼라제/EYEF 페어링만큼 좋지 않다는　것이 입증되었다　(Xu 등, 1999; Bioluminescence and Chemiluminescence: Molecular Reporting with Photons, eds. Hastings 등, (Wiley, New York)의 Wang 등, 1997, pp. 419-422). 잠재적 페어링을 연구하기 위해, 선택된 공여자 및 수용자 도메인을 함유하는 단백질 융합 (예를 들어)이 준비되고, 필요한 경우 적절한 기질의 존재 하에 검사된다.
또한 공여자 및 수용자 도메인이 서로 가짜로 연관되지 않는지 확인해야 한다. 예를 들어, 이는 동일한 세포에서 CRET 쌍의 제1 구성성분 및 CRET 쌍의 제2 구성성분의 개별 공동 발현한 다음 에너지 전달이 발생하는지 측정하기 위해 발광 스펙트럼을 모니터링하여 수행할 수 있다. 이는 예를 들어, Xu 등 (1999)의 방법을 사용하여 달성할 수 있다. CRET가 거의 또는 전혀 관찰되지 않는 경우 선택된 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분은 적합한 CRET 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, 공여자 방출은 기질에 변형으로 조작될 수 있다. 레닐라 루시퍼라제의 경우 기질은 코엘레테라진이다. 공여자 방출을 변경하는 공여자 방출과 수용자 방출 사이의 개선하기 위한 것이다. 원래 BRET 시스템은 공여자로서 레닐라 루시퍼라제, 수용자로서 EYFP (또는 토파즈) 및 기질로서 코엘레테라진 h 유도체를 사용한다. 이러한 구성성분을 BRET 분석에서 결합하면, 생물발광 단백질에 대해 475-480 nm 범위 및 수용자 분자에 대해 525-530 nm 범위에서 빛을 생성하여, 45-55 nm의 스펙트럼 분해능을 제공한다.
불행하게도, 레닐라 루시퍼라제는 실질적으로 GFP 방출과 중첩되는 넓은 방출 피크를 생성하고, 이는 차례로 시스템의 신호 대 잡음을 줄이는 데 기여한다. 본 발명에서 사용하기 위한 하나의 BRET 시스템은 레닐라 루시퍼라제 기질로서 coel400a를 가지고 공여자와 수용자 방출 파장 (~105nm) 사이에 넓은 스펙트럼 분해능을 제공한다. coel400a가 있는 레닐라 루시퍼라제는 390-400 nm 사이의 빛을 생성하고 이 범위의 빛을 흡수하고 505-508 nm에서 빛을 다시 방출하는 GFP 유도체 (GFP2)가 제조되었다. 레닐라 루시퍼라제와 GFP 방출 사이의 이러한 스펙트럼 분해능 증가때문에, 이 BRET 시스템은 본 출원의 센서에 대한 탄수화물의 결합을 모니터링하는 우수한 생물학적 도구를 제공한다. 그러나, 더 작은 스톡시 이동 BRET 시스템이 또한 탄수화물의 민감한 측정을 허용할 것이다.
coel400a를 비롯하여, 레닐라 루시퍼라제 활성의 결과로서 다양한 파장에서 빛을 생성하는 (야생형 코엘레테라진에 의해 생성되는 것과 구별됨) 것을 포함하는 다양한 코엘레테라진 유도체가 당업계에 알려져 있다. 당업자는 공여자의 빛 방출 피크가 변경되었기 때문에, 이 파장에서 빛을 흡수하여 효율적인 에너지 전달을 허용할 수용자 분자를 선택하는 것이 필요하다는 것을 이해할 것이다. 이는 예를 들어 GFP 클래스 4를 클래스 3 또는 1 GFP가 되도록 변경함으로써 수행할 수 있다. 공여자의 빛 방출과 수용자의 빛 흡수 피크 사이의 스펙트럼 중첩은 효율적인 에너지 전달을 위한 조건 중 하나이다. 클래스 3 및 1 GFP는 400 nm에서 빛을 흡수하고 505-511 nm 사이에서 재방출하는 것으로 알려져 있다. 이는 공여자와 수용자 방출 사이 대략 111 nm의 파장 차이를 초래한다.
추가 생물발광 단백질 및 수용자 분자 쌍의 예는 표 2에 제공된다.
표 2. 예시적인 공여자 도메인 및 수용자 도메인 쌍.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
일부 구현예에서, 하기를 포함하는 CRET 쌍 (면역센서로도 본원에서 지칭됨)이 제공되고:
CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자; 및
CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원;
여기서 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 10 내지 75%의 범위이다. CRET 쌍의 구성성분은 본원에 정의된 바와 같다.
일부 구현예에서, 바람직한 CRET 쌍은 RLuc8 및 GFP2를 포함한다. 한 예에서, 항체 또는 항체 유사 분자는 RLuc8에 부착되고 표지된 항원은 GFP2에 부착된다. 다른 예에서, 항체 또는 항체 유사 분자는 GFP2에 부착되고 표지된 항원은 RLuc8에 부착된다.
분석물 검출
도 1에 도시된 바와 같이, 분석물의 부재시, 표지된 항원은 항체 또는 항체 유사 분자에 결합하여 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분을 결합시켜 기질의 존재하에 2개의 구성성분 사이의 CRET를 생성할 수 있다. 분석물의 존재하에, 분석물은 항체 또는 항체 유사 분자와 결합하기 위해 표지된 항원과 결합하여 기질의 존재하에 2개의 구성성분 사이의 CRET의 감소를 초래한다. 다시 말해서, 본 개시내용의 항체 또는 항체 유사 분자에 대한 분석물의 결합은 CRET 쌍의 제2 구성성분에 대한 CRET 쌍의 제1 구성성분의 공간적 위치 및/또는 쌍극자 배향을 변경시킨다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "공간적 위치"는 항체 또는 항체 유사 분자로부터 분석물 결합 또는 방출의 결과로서 변화하는 수용자 분자에 대한 공여자의 3차원 위치를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "쌍극자 배향"은 3차원 공간에서 이들의 배향에 대한 공여자 및/또는 수용자 분자와 관련된 쌍극자 모멘트의 3차원 공간에서의 방향을 지칭한다. 쌍극자 모멘트는 분자에 대한 전하 변화의 변이의 결과이다.
에너지 전달의 효율은 비율계량적으로 결정될 수 있다 (예를 들어, CRET 비율, 바람직하게는 BRET 비율). 예로서 BRET를 사용하여, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체 또는 항체 유사 분자에 대한 분석물의 결합은 BRET 비율의 감소로 표시된다. 다시 말해서, CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율의 감소는 BRET 비율의 감소로 표시된다.
한 구현예에서 CRET 쌍의 제1 구성성분 (예를 들어, 생물발광 단백질)과 CRET 쌍의 제2 구성성분 (예를 들어, 수용자 분자) 사이에 발생하는 에너지 전달은 특정 파장을 선택하는 광학 필터 (수용자 분자 방출을 위한 필터 및 생물발광 단백질 방출을 위한 다른 필터)를 사용하여 측정된 방출로부터 계산된 비율로서 제시된다 (방정식 1 참조).
Ea/Ed = BRET 비율 (1)
여기서 Ea는 수용자 분자 방출 강도로서 정의되고 (방출 광은 수용자의 방출에 대해 조정된 특정 필터를 사용하여 선택됨) Ed는 생물발광 단백질 방출 강도로서 정의된다 (방출 광은 생물발광 단백질의 방출에 대해 조정된 특정 필터를 사용하여 선택됨).
광학 필터는 BRET에 적합한 파장 식별을 허용하는 임의의 유형의 필터일 수 있다는 것이 당업자에 의해 용이하게 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 광학 필터는 간섭 필터, 긴 통과 필터, 짧은 통과 필터 등일 수 있다. 필터를 통해 통과하는 파장의 강도 (일반적으로 초당 카운트 (CPS) 또는 상대 발광 단위 (RLU))는 광-증배관 (PMT), 캐스케이드 포토다이오드를 포함하는 포토다이오드, 포토다이오드 어레이 또는 전하결합소자 (CCD) 카메라와 같은 민감한 카메라를 사용하여 정량화될 수 있다. 정량화된 신호는 이후 BRET 비율을 계산하고 에너지 전달 효율을 나타내는데 사용된다. BRET 비율은 수용자 방출의 강도가 증가함에 따라 증가한다.
일반적으로, 공여자 방출 강도에 대한 수용자 방출 강도의 비율이 결정되고 (방정식 1 참조), 이는 에너지 전달 효율을 반영하는 임의의 단위로 표현되는 숫자이다. 비율은 에너지 전달 효율이 증가함에 따라 증가한다 (Xu 등, 1999 참조).
에너지 전달 효율은 또한 수용자 방출 강도에 대한 공여자 방출 강도의 역 비율을 사용하여 나타낼 수 있다 (방정식 2 참조). 이 경우, 비율은 에너지 전달 효율이 증가함에 따라 감소한다. 이 계산을 수행하기 전에 방출 강도는 배경광의 존재 및 기질의 자동 발광에 대해 보정된다. 이 보정은 일반적으로 본 발명의 생물발광 단백질, 수용자 분자 또는 폴리펩티드가 아닌 기질을 함유하는 대조군 시료로부터 적절한 파장에서 측정된, 방출 강도를 뺌으로써 이루어진다.
Ed/Ea = BRET 비율 (2)
여기서 Ea 및 Ed는 상기 정의된 바와 같다.
생물발광 단백질 및 수용자 분자 방출의 광도는 분광형광계, 전하 결합 소자 (CCD) 카메라 또는 다이오드 어레이 검출기와 같은 단색광기 기반 기기를 사용하여 정량화할 수도 있다. 분광형광계를 사용하여, 방출 스캔을 수행하여 기질 첨가 시 생물발광 단백질 및 수용자 분자 방출 피크가 모두 검출된다. 피크 아래 영역은 상대적인 광도를 나타내고 위에서 설명한 대로 비율을 계산하는 데 사용된다. 동일한 시료로부터 생물발광 단백질 및 수용자 분자에 대한 빛을 측정할 수 있는 모든 기기는 본 발명의 BRET 시스템을 모니터링하는데 사용될 수 있다.
대안적인 구현예에서, 수용자 분자 방출 단독은 BRET의 효율적인 검출 및/또는 정량화에 적합하다. 이 경우, 에너지 전달 효율은 수용자 방출 강도만을 이용하여 나타낸다. 에너지 전달을 측정하기 위해, 임의의 비율 계산 없이 수용자 방출 강도를 사용할 수 있다는 것은 당업자에게 쉽게 명백할 것이다. 이는 이상적으로 수용자 분자가 생물발광 단백질로부터 전달된 빛을 흡수하는 경우에만 빛을 방출한다는 사실 때문이다. 이 경우 하나의 광 필터만 필요하다.
관련된 구현예에서, 생물발광 단백질 방출 단독은 BRET의 효율적인 검출 및/또는 정량화에 적합하다. 이 경우, 에너지 전달 효율은 생물발광 단백질 방출 강도만을 사용하여 계산된다. 에너지 전달을 측정하기 위해, 임의의 비율 계산 없이 공여자 방출 강도를 사용할 수 있다는 것은 당업자에게 쉽게 명백할 것이다. 이는 수용자 분자가 생물발광 단백질로부터 전달된 빛을 흡수함에 따라 생물발광 단백질로부터 검출 가능한 방출의 상응하는 감소가 있다는 사실 때문이다. 이 경우 하나의 광 필터만 필요하다.
대안적인 구현예에서, 에너지 전달 효율은 측정을 위한 하나의 광학 필터만을 필요로 하는 비율 양 측정을 사용하여 표현된다. 이 경우, 공여자 또는 수용자에 대한 광도는 적절한 광학 필터를 사용하여 측정하고 필터를 사용하지 않고 시료를 다시 측정한다 (개방스펙트럼의 강도). 이러한 후자의 측정에서, (모든 파장에 대한) 전체 광 출력이 정량화된다. 그런 다음 비율 계산은 방정식 3 또는 4를 사용하여 이루어진다. 방정식 3의 경우, 수용자에 대한 공학 필터만 필요하다. 방정식 4의 경우, 공여자에 대한 공학 필터만 필요하다.
Ea/Eo-Ea = BRET 비율 또는 = Eo-Ea/Ea (3)
Eo-Ed/Ed = BRET 비율 또는 = Ed/Eo-Ed (4)
여기서 Ea 및 Ed는 상기 정의된 바와 같고 Eo는 결합된 모든 파장에 대한 방출 강도로서 정의된다 (개방 스펙트럼).
추가 방정식이 방정식 1 내지 4로부터 유도될 수 있다는 것은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 예를 들어, 하나의 이러한 도함수는 생물발광 단백질 및/또는 수용자 분자에 대한 방출 파장에 존재하는 배경광을 보정하는 것을 포함한다.
BRET 분석을 수행할 때, 빛 방출은 BRETCount를 사용하여 각 웰에서 결정할 수 있다. BRETCount 기기는 변형된 TopCount이고, 여기서 TopCount는 Packard Instrument (Meriden, CT)에 의해 판매되는 미세역가판 섬광 및 발광 계수기이다. 배경 노이즈를 제거하기 위해 2개의 광증배관 (PMT)을 동시에 사용하는 기존 계수기와 달리, TopCount는 단일- PMT 기술 및 노이즈 감소를 위한 시간 분해 펄스 카운팅을 사용하여 표준 불투명 미세역가 플레이트에서 카운팅할 수 있다. 불투명 미세역가 플레이트를 사용하면 광학적 누화를 무시할 수 있는 수준으로 줄일 수 있다. TopCount는 1, 2, 6 및 12개 검출기 (PMT)를 포함하는 다양한 형식으로 제공되고, 이는 각각, 1, 2, 6 또는 12개의 시료를 동시에 읽을 수 있도록 한다. BRETCount외에도, 상업적으로 이용 가능한 다른 기기가 BRET를 수행할 수 있다: Victor 2 (Wallac, Finland (Perkin Elmer Life Sciences)) 및 Fusion (Packard Instrument, Meriden). BRET는 적어도 수용자 분자 방출 및 바람직하게는 2개 이상의 파장 (수용자 분자 및 생물발광 단백질의 경우)을 검출할 수 있는 판독기를 사용하여 수행할 수 있다.
BRET는 플레이트의 여러 웰에서 분석 볼륨, 분석 조건 및 신호 감쇠의 변화로 인한 광 출력의 변동에 의한 데이터 변동성을 제거할 수 있는 비율 측정 기법이다. RET-기반 반응은 균일하고, 일반적으로 고체상 부착 없이 용액에서 발생한다. 이는 액체, 기체 및 심지어 미립자와 같은 상이한 형태에서 분리 없이 분석물 검출을 허용한다.
폴리펩티드
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 출원에 유용한 다양한 화학적 실체는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체, 항체 유사 분자, 항원, 표지된 항원, 링커, CRET 쌍의 제1 구성성분 및/또는 CRET 쌍의 제2 구성성분은 폴리펩티드로 이루어지거나 이를 포함할 수 있다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 일반적으로 상호 교환적으로 사용되고 비-아미노산 기 또는 당 모이어티와 같은 다른 구성성분의 첨가에 의해 변형되거나 변형되지 않을 수 있는 단일 폴리펩티드 사슬을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에 기술된 본 개시내용의 폴리펩티드의 변이체, 돌연변이체, 변형, 유사체 및/또는 유도체를 또한 포함한다. 예를 들어, 본원에 정의된 항체 또는 항체 유사 분자는 이의 기능적 변이체, 돌연변이체, 변형, 유사체 및/또는 유도체를 포함할 수 있다. 이의 변이체, 돌연변이체, 변형, 유사체 및/또는 유도체는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한다.
폴리펩티드 성분은 천연 폴리펩티드의 생성 및 회수, 재조합 폴리펩티드의 생성 및 회수, 및 폴리펩티드의 화학적 합성을 포함하는 다양한 방식으로 생성될 수 있다. 한 예에서, 단리된 폴리펩티드 성분 (예를 들어 항체)은 폴리펩티드를 생성하기에 효과적인 조건하에서 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포를 배양하고, 폴리펩티드를 회수함으로써 생성된다. 유리하게는, 본 출원의 특정 구현예에서, 폴리펩티드 성분 중 하나 이상은 상업적 공급자로부터 구입할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항체 유사 분자는 상업적 공급자로부터 구입하여 본 개시내용의 면역센서를 형성하기 위해 사용할 수 있다. 따라서, 임의의 상업적으로 입수 가능한 항체 또는 항체 유사 분자는 본 개시내용에서 사용하기에 적합하다. 한 예에서, 항체 또는 항체 유사 분자는 상업적 공급자로부터 생산되거나 수득될 수 있고 그런 다음 선택적으로 링커를 통해, 항체 접합체를 형성하기 위해 CRET 쌍의 제1 구성성분에 공유적으로 부착될 수 있다.
폴리펩티드를 발현할 수 있는 다양한 예시적인 세포, 예를 들어 항체 또는 효소가 하기에 논의된다. 한 예에서, 가능 세포는 폴리펩티드 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환되었다. 본원에 사용된 바와 같이, "형질전환된" 또는 "형질전환"은 폴리뉴클레오티드의 혼입에 의한 세포에서 새로운 유전자의 획득이다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 용어 "핵산"과 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. "폴리뉴클레오티드"는 올리고뉴클레오티드, 핵산 분자 또는 이의 임의의 단편을 지칭한다. 이는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 적합한 폴리뉴클레오티드 또한 발현된 폴리펩티드를 폴리펩티드를 생산하는 세포로부터 분비될 수 있도록 하는 신호 펩티드 (즉, 신호 세그먼트 핵산 서열)와 같은 분비 신호를 암호화할 수 있다. 적합한 신호 세그먼트의 예는 조직 플라스미노겐 활성제 (t-PA), 인터페론, 인터류킨, 성장 호르몬, 바이러스 외피 당단백질 신호 세그먼트, 니코티아나 넥타린 신호 펩티드 (US 5,939,288), 담배 엑스텐신 신호, 대두 올레오신 오일 바디 결합 단백질 신호, 아라비돕시스 탈리아나 액포 염기성 키티나제 신호 펩티드, 뿐만 아니라 천연 신호 서열을 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 개재 및/또는 비번역 서열을 암호화할 수 있다. 적합한 폴리뉴클레오티드는 발현된 폴리펩티드의 정제 및/또는 식별을 용이하게 하는 폴리펩티드 서열을 암호화할 수 있다. 적합한 정제 태그의 예는 당업계에 알려져 있고 헥사히스티딘, GST, Trx, 칼모듈린 결합 펩티드, 인테인-키틴 결합 도메인, Strep-태그, NusA, SUMO 및 MBP 및 에피토프 태그 예를 들어 HA, c-myc, FLAG, 할로태그 및 비오틴을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적합한 폴리뉴클레오티드는 정제 및/또는 식별 태그의 제거를 용이하게 하기 위해 프로테아제 절단 부위를 포함하는 폴리펩티드 서열을 암호화할 수 있다. 적합한 프로테아제 절단 부위는 당 업계에 공지되어 있고 TEV, 트롬빈 및 SUMO 프로테아제 절단 부위를 포함한다.
돌연변이 (변경된) 폴리펩티드는 당 업계에 공지된 임의의 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용에 포함되는 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 시험관 내 돌연변이 유발에 적용될 수 있다. 이러한 시험관 내 돌연변이 유발 기법은 폴리뉴클레오티드를 적합한 벡터로 서브클로닝하고, 벡터를 대장균 XL-1 레드 (Stratagene)와 같은 "돌연변이자" 균주로 형질전환시키고 형질전환된 박테리아를 적합한 세대 수 동안 증식시키는 것을 포함한다. 다른 예에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 Harayama (1998)에 의해 광범위하게 기술된 바와 같은 DNA 셔플링 기술에 적용된다. 돌연변이된/변경된 DNA로부터 유래된 생성물은 본 개시내용의 항체 접합체/표지된 분석물에 사용될 수 있는지 결정하기 위해 본원에 기술된 기법을 사용하여 용이하게 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 돌연변이체를 설계함에 있어서, 돌연변이 부위의 위치 및 돌연변이의 성질은 변형될 특성(들)에 의존할 것이다. 돌연변이 부위는 개별적으로 또는 연속적으로 예를 들어, (1) 먼저 아미노산 선택으로 치환하고 그 다음 달성된 결과에 따라 더 급진적인 선택으로 치환되거나, (2) 표적 잔기를 삭제하거나, (3) 위치한 부위에 인접한 다른 잔기를 삽입함으로써 변형될 수 있다.
아미노산 서열 결실은 일반적으로 약 1 내지 15개의 잔기, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 10개의 잔기 및 전형적으로 약 1 내지 5개의 연속 잔기 범위이다.
치환 돌연변이체는 폴리펩티드 분자에서 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고 그 자리에 상이한 잔기가 삽입된다. 치환 돌연변이 유발에 대한 가장 큰 관심 부위는 기능에 중요한 것으로 확인된 부위를 포함한다. 다른 관심 부위는 다양한 균주 또는 종에서 얻은 특정 잔기가 동일한 부위이다. 이러한 위치는 생물학적　활성에　중요할 수 있다. 이들 부위, 특히 적어도 3개의 상이한 동일하게 보존된 부위의 서열 내에 속하는 부위는 바람직하게는 비교적 보존적인 방식으로 치환된다. 이러한 보존적 치환은 당업자에게 공지되어 있다.
폴리뉴클레오티드는 적합한 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현될 수 있다. 예를 들어, 상기 언급된 폴리펩티드 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 구절 "작동 가능하게 연결된"은 분자가 숙주 세포로 형질전환될 때 발현될 수 있도록 하는 방식으로 폴리뉴클레오티드 분자를 발현 벡터에 삽입하는 것을 지칭한다. 전형적으로, 구절은 전사된 서열에 대한 전사 조절 요소의 기능적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 적절한 숙주 세포에서 코딩 서열의 전사를 자극하거나 조절하는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, 전사된 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 전사 조절 요소는 전사된 서열에 물리적으로 인접하며, 즉, 시스-작용한다. 그러나, 일부 전사 조절 요소, 예를 들어 인핸서는 물리적으로 인접할 필요가 없거나 이들이 전사를 향상시키는 코딩 서열에 매우 근접하게 위치할 필요가 없다.
본원에 사용된 바와 같이, 발현 벡터는 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있고 특정 폴리뉴클레오티드 분자의 발현에 영향을 미칠 수 있는 DNA 또는 RNA 벡터이다. 바람직하게는, 발현 벡터는 또한 숙주 세포 내에서 복제할 수 있다. 발현 벡터는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있고, 일반적으로 바이러스 또는 플라스미드이다. 적합한 발현 벡터는 박테리아, 진균, 내부기생충, 절지동물, 동물, 및 식물 세포를 포함하는, 재조합 세포에서 기능하는 (즉, 직접 유전자 발현) 임의의 벡터를 포함한다. 본 개시내용의 벡터는 또한 무세포 발현 시스템에서 폴리펩티드 성분(들)을 생산하기 위해 사용될　수 있고, 이러한 시스템은 당 업계에 잘 알려져 있다.
적합한 벡터는 이종 폴리뉴클레오티드 서열, 즉 상기 언급된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 인접하여 자연적으로 발견되지 않는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 벡터는 RNA 또는 DNA, 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있고, 일반적으로 트랜스포존 (예를 들어 US 5,792,294에 기술됨), 바이러스 또는 플라스미드이다.
적합한, 발현 벡터는 또한 전사 제어 서열, 번역 제어 서열, 복제 기점, 및 재조합 세포와 양립 가능하고 발현 특정 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 제어하는 다른 조절 서열과 같은 조절 서열을 함유할 수 있다. 전사 제어 서열은 전사의 개시, 연장 및 종결을 조절하는 서열이다. 특히 중요한 전사 제어 서열은 프로모터, 인핸서, 작동자 및 억제자 서열과 같은 전사 개시를 조절하는 것이다. 다양한 적합한 전사 제어 서열이 당업자에게 공지되어 있다. 예는 효모, 절지동물, 식물 또는 포유동물 세포에서 기능하는 전사 제어 서열을 포함하지만, tac, lac, trp, trc, oxy-pro, omp/lpp, rrnB, 박테리오파지 람다, 박테리오파지 T7, T7lac, 박테리오파지 T3, 박테리오파지 SP6, 박테리오파지 SP0l, 메탈로티오네인, 알파메이팅 인자, 피치아 알코올 산화효소, 알파바이러스 서브게놈 프로모터 (예를 들어 신드비스 바이러스 서브게놈 프로모터), 항생제 내성 유전자, 바큘로바이러스, 헬리오티드 제아 곤충 바이러스, 백시니아 바이러스, 헤르페스바이러스, 너구리 폭스바이러스, 다른 폭스바이러스, 아데노바이러스, 시토메갈로바이러스 (예를 들어 중간 초기 프로모터), 시미안 바이러스 40, 레트로바이러스, 액틴, 레트로바이러스 장말단 반복체, 라우스 육종 바이러스, 열 충격, 인산염 및 질산염 전사 제어 서열뿐만 아니라 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열에 제한되지 않는다.
본 개시내용의 항체, 항체 유사 분자, 링커, 항원, CRET 쌍의 제1 구성성분 및/또는 CRET 쌍의 제2 구성성분을 제조하기 위해 적합한 숙주 세포는 항체, 항체 유사 분자, 링커, 항원, CRET 쌍의 제1 구성성분 및/또는 CRET 쌍의 제2 구성성분, 또는 그의 자손 세포를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 재조합 세포를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 분자의 세포로의 형질전환은 폴리뉴클레오티드 분자가 세포 내로 삽입될 수 있는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 형질전환 기법은 형질감염, 전기천공, 미세주입, 리포펙션, 흡착, 및 원형질체 융합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체 외로 남을 수 있거나 발현되는 능력이 유지되는 방식으로 형질전환된 (즉, 재조합) 세포의 염색체 내의 하나 이상의 부위로 통합될 수 있다.
형질전환에 적합한 숙주 세포는 항체, 항체 유사 분자, 링커, 항원, CRET 쌍의 제1 구성성분 및/또는 CRET 쌍의 제2 구성성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환될 수 있는 임의의 세포를 포함한다. 적합한 숙주 세포는 내인성으로 (즉, 자연적으로) 항체, 항체 유사 분자, 링커, 항원, CRET 쌍의 제1 구성성분 및/또는 CRET 쌍의 제2 구성성분을 생산할 수 있거나 구성성분(들)을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 분자로 형질전환된 후 이러한 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 적합한 숙주 세포는 박테리아, 진균 (효모 포함), 기생충, 절지동물, 동물 및 식물 세포를 포함한다. 숙주 세포의 예는 살모넬라, 에스케리키아, 바실러스, 리스테리아, 사카로마이세스, 스포도프테라 , 마이코박테리아, 트리초플러시아, BHK (베이비 햄스터 신장) 세포, MDCK 세포, CRFK 세포, CV-1 세포, COS (예를 들어, COS-7) 세포, CHO 세포 및 Vero 세포를 포함한다. 숙주 세포의 추가 예는 대장균 K-12 유도체를 포함하는 대장균; 살모넬라 티피; 살모넬라 티피무리움, 약독화된 균주를 포함; 스포도프테라 프루기페르다; 트리초플러시아 니; 및 비종양형성 마우스 근모세포 GS 세포 (예를 들어, ATCC CRL 1246)이다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 다른 신장 세포주, 다른 섬유아세포 세포주 (예를 들어, 인간, 쥐 또는 닭 배아 섬유아세포 세포주), 골수종 세포주, 차이니즈 햄스터 난소 세포, 마우스 NIH/3T3 세포, LMTK 세포 및/또는 HeLa 세포를 포함한다.
본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 증가시키는데 유용한 재조합 기법은 폴리뉴클레오티드 분자를 고카피 수 플라스미드에 작동적으로 연결, 폴리뉴클레오티드 분자를 하나 이상의 숙주 세포 염색체로 통합, 플라스미드에 대한 벡터 안정성 서열의 첨가, 전사 제어 신호 (예를 들어, 프로모터, 작동자, 인핸서)의 치환 또는 변형, 번역 제어 신호 (예를 들어, 리보솜 결합 부위; 샤인-달가노 서열)의 치환 또는 변형, 숙주 세포의 코돈 사용에 해당하는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 분자의 변형, 및 전사체를 불안정하게 만드는 서열의 삭제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
효과적인 배양 조건은 폴리펩티드 생산을 허용하는 효과적인 배지, 생물반응기, 온도, pH 및 산소 조건을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 효과적인 배지는 본 개시내용의 폴리펩티드를 생산하기 위해 배양되는 임의의 배지를 지칭한다. 이러한 배지는 일반적으로 동화 가능한 탄소, 질소 및 인산염 공급원, 및 적절한 염, 미네랄, 금속 및 비타민과 같은 다른 영양소를 갖는 수성 배지를 포함한다. 세포는 기존의 발효 생물반응기, 진탕 플라스크, 시험관, 미세역가 접시 및 페트리 플레이트에서 배양될 수 있다. 배양은 재조합 세포에 적합한 온도, pH 및 산소 함량에서 수행될 수 있다. 이러한 배양 조건은 당업자의 전문 지식 범위 내에 있다.
분석물
본원에 정의된 항체/항체 유사 분자, 표지된 항원, 방법, 키트 및 조성물은 시료에서 분석물을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 것과 같은 항체/항체 유사 분자, 표지된 항원은 POC 진단, 치료 약물 모니터링 및 동반 진단, 임상 약동학, 수의학 진단, 식품 분석, 환경 모니터링, 방어 및 보안을 위해, 질환 바이오마커, 병원체, 약물, 환경 오염 물질, 알레르겐 및 식품 불순물을 포함하는 과다한 항원의 검출을 가능하게 한다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 일부 구현예에서 분석물은 항체 또는 항체 유사 분자에 의해 결합될 수 있거나 항체 또는 항체 유사 분자가 개발될 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 분석물은 작은 유기 분자, 약물, 약물 대사산물, 항생제, 호르몬, 알레르겐, 펩티드, 단백질, 자연 발생 항체, 당, 지질 또는 핵산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 용어 "분석물"은 체액 및 신체 조직에서 발견되는 혈청 단백질, 콜레스테롤, 다당류, 핵산, 약물 및 약물 대사산물 등을 지칭한다. 다른 구현예에서, 분석물은 물리적 상태 또는 병태를 결정하기 위한 분석에 바람직한 생물학적 상태를 나타내는 임의의 생물학적 분석물, 마커, 유전자, 단백질, 대사산물, 또는 호르몬 또는 그 안의 조합이다. 일부 구현예에서, 분석물은 자연 발생 항체이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "작은 유기 분자"는 약 25 달톤 초과 및 약 3000 달톤 미만, 바람직하게는 약 2500 달톤 미만, 더욱 바람직하게는 약 2000 달톤 미만, 바람직하게는 약 100 내지 약 1000 달톤, 더욱 바람직하게는 약 200 내지 약 500 달톤의 분자량을 갖는, 자연 발생 또는 합성, 유기 분자를 지칭한다. 일부 예에서, 작은 유기 분자는 항균, 항생, 진통, 또는 다른 생물학적 활성을 갖는 작은 유기 분자이다. 한 예에서, 작은 유기 분자는 트리클로카반 (TCC)이다. 다른 예에서, 작은 유기 분자는 암피실린이다.
본원에 정의된 항체/항체 유사 분자, 표지된 항원, 방법, 키트 및 조성물은 식품 분석에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 분석물은 식품에 함유된 알레르겐이다. 알레르겐은 계란, 유제품, 고기, 어류, 갑각류 예를 들어 새우, 게, 랍스터, 가재, 글루텐이 함유된 곡류 (예를 들어 밀 (예를 들어 스펠트 밀 및 호라산 밀), 호밀, 보리 및 귀리), 대두, 콩, 땅콩, 견과류 예를 들어 아몬드, 헤이즐넛, 호두, 캐슈, 피칸 견과류, 브라질 견과류, 피스타치오 견과류, 마카다미아 (또는 퀸즐랜드) 견과류, 셀러리 (셀러리악을 포함), 겨자, 참깨, 이산화황/아황산염, 루핀, 홍합과 같은 연체동물, 고사리, 굴, 달팽이 및 오징어, 씨앗, 과일을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 분석물은 카제인, 알파-락토글로불린, 알파-락토글로불린, 오발부민, 오보뮤코이드, 글리아딘, Arah1, Arah2이다. 일부 구현예에서, 항원은 "Scientific Opinion on the evaluation of allergenic foods and food ingredients for labelling purposes". EFSA Panel on Dietetic Products, Nutrition and Allergies. EFSA Journal 2014; 12(11): 3894에서 확인된 에피토프 및/또는 단백질 중 하나일 수 있다. 예를 들어, 항원은 표 3에 나열된 에피토프 및/또는 단백질 중 하나일 수 있다.
표 3. 예시적인 에피토프 및/또는 단백질.
Figure pct00023
식품은 알레르겐을 함유하는 것으로 의심되는 소비를 위한 임의의 제품일 수 있다. 식품 분석의 다른 예는 식품에서 오염 물질 및 불순물의 검출, 예를 들어, 아플라톡신, 다른 마이코톡신, 천연 또는 인공 호르몬 (성장 촉진 호르몬을 포함), 항생제, 살충제, 해양 독소 및 박테리아를 포함한다.
다른 구현예에서, 분석물은 멜라민, 시아누르산 또는 유제품의 질소 함량을 부정하게 증가시키는 데 사용되는 임의의 다른 질소 화합물이고 항체 또는 항체 유사 분자는 멜라민, 시아누르산 또는 유제품의 질소 함량을 부정하게 증가시키는 데 사용되는 다른 질소 화합물에 대해 특이적인 항체이다. 추가 구현예에서, 분석물은 스타필로코커스 아우레우스로부터의 코아굴레제 효소이고 항체 또는 항체 유사 분자는 S. 아우레우스로부터의 코아굴레제 효소에 특이적인 항체이다.
대안적인 구현예에서 분석물은 표지된 항원에 대한 결합에 대해 본원에 정의된 항체 또는 항체 유사 분자와 경쟁하는 자연 발생 항체일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "자연 발생 항체"는, 예를 들어, 미생물, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 진균, 마이코플라스마 또는 기생충에 의한 감염 또는 면역화에 대한 면역 반응 동안 대상체에서 생성된 항체를 지칭한다. 이러한 구현예에서, 자연 발생 항체에 대한 표지된 항원의 결합은 CRET 쌍의 제1 구성성분 및 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율의 감소를 초래한다. 일부 구현예에서, 분석물은 면역화에 대한 반응으로 대상체에서 생성된 자연 발생 항체이다. 일부 구현예에서, 분석물은 미생물 감염에 대한 반응으로 대상체에서 생성된 자연 발생 항체이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간 또는 다른 동물이다. 예를 들어, 대상체는 인간, 육우, 젖소, 양, 염소, 말, 돼지, 버팔로 및 낙타과 (예를 들어, 낙타 및 라마)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 가축이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "가축"은 특히 농장에서, 식용 또는 가정용 또는 대규모 생산을 위한 식품 생산을 위해 또는 이익을 위해 사육되는 육우, 젖소, 양, 염소, 말, 돼지, 버팔로 및 낙타와 같은 동물을 지칭한다.
본원에 정의된 항체/항체 유사 분자, 표지된 항원, 방법, 키트 및 조성물은 분석물을 정성적으로 및/또는 정량적으로 "검출"하기 위해 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 분석물은 마이크로몰 내지 나노몰 농도로 존재한다.
본원에 기술된 방법, 키트, 항체 또는 항체 유사 분자 및 표지된 항원은 시료에서 분석물을 검출하고 정량화하기 위해 사용될 수 있다. "시료"는 관심 분석물을 함유할 가능성이 있는 임의의 물질 또는 조성물이 될 수 있다. 일부 구현예에서, 시료는 공기, 액체, 생물학적 물질 또는 토양이다. 일부 구현예에서, 시료는 식품 또는 그의 추출물, 토양 또는 그의 추출물, 생물학적 물질 또는 그의 추출물 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 시료는 환경 또는 출처로부터 직접 얻을 수 있거나 본 발명의 방법이 수행되기 전에 적합한 절차에 의해 추출되고/거나 적어도 부분적으로 정제될 수 있다.
일부 예에서, 시료는 생물학적 물질을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "생물학적 물질"은 광범위하게 정의되고 유기체로부터 전체 또는 부분적으로 유래된 임의의 물질을 포함한다. 생물학적 물질은 체액, 세포, 연조직 (예를 들어 결합 및 비결합 조직) 및 경조직 (예를 들어 뼈 및 연골)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 체액은 혈액, 혈청, 가래, 점액, 고름, 복막액, 소변 또는 기타 체액이다. 일부 구현예에서, 이러한 물질은 살아있는 유기체로부터 채취된 후 추가 공정 및/또는 화학적 처리를 받을 수 있다. 한 구현예에서, 센서는 살아있는 세포 내의 분석물을 검출하는 데 사용되지 않는다. 일부 구현예에서, 센서는 생체 외에서 사용된다.
일부 예에서, 시료는 식품을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 식품은 광범위하게 정의되고 먹든 마시든 영양 목적으로 포유동물을 비롯한 동물이 섭취하도록 의도된 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 시료는 독소, 알레르겐, 불순물 등으로 오염되거나 오염될 가능성이 있는 식품이다.
일부 구현예에서, 시료는 수성 액체이다. 예를 들어, 시료는 우유, 과일 주스, 기타 음료 및 혈청을 포함하는 체액을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
　당업자가 알고 있는 바와 같이, 본 발명의 면역센서는 또한 다중화될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역센서"는 CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자 및 CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 상응하는 표지된 항원의 조합을 지칭한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, "면역센서"는 또한 "CRET 쌍"으로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 상이한 분석물을 검출하는 상응하는 표지된 항원을 갖는 둘 이상의 상이한 항체 또는 항체 유사 분자가 제공될 수 있다. 예를 들어, 하나의 알레르겐을 검출하는 본 발명의 항체 또는 항체 유사 분자는 다른 알레르겐을 검출하는 항체 또는 항체 유사 분자와 다중화될 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 상이한 면역센서는 상이한 분석물의 검출 및 정량을 가능하게 하기 위해 상이한 파장에서 방출하는 상이한 공여자 및/또는 수용자 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 상이한 면역센서는 동일한 공여자 및/또는 수용자 분자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 유체 검출 챔버가 사용된다. 일부 구현예에서, 다중채널 검출 장치가 사용될 수 있다.
조성물, 키트, 방법 및 용도
본원에 기술된 항체 또는 항체 유사 분자 및/또는 표지된 분석물은 분석물을 검출하는데 사용하기 위한 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 항체 또는 항체 유사 분자 및/또는 표지된 분석물은 분석물을 검출하는데 사용하기 위한 조성물에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 항체 유사 분자 및 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 항체 유사 분자 및 표지된 분석물 및 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 표지된 분석물 및 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물이 제공된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "허용 가능한 담체"는 본 발명의 방법 및 용법과 양립되는, 임의의 및 모든 고체 또는 용매 (예를 들어 인산염 완충 식염수 완충액, 물, 식염수) 분산 매질, 코팅 등을 포함한다. 허용 가능한 담체는 조성물의 다른 성분과 양립할 수 있다는 의미에서 "허용 가능"해야 하고, 시험되는 분석물을 손상시키지 않고 항체 또는 이의 단편에 대한 분석물의 특이적 결합을 억제하지 않아야 한다. 일반적으로, 적합한 허용 가능한 담체는 당 업계에 공지되어 있고 최종 사용 용도에 기초하여 선택된다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 본 출원의 항체 또는 항체 유사 분자 및/또는 표지된 항원은 시료에서 분석물의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용될 수 있고, 존재하는 경우 또한 시료에 존재하는 분석물의 양을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서 시료에서 분석물을 검출하는 방법이 제공되고, 방법은
i) 시료를
화학발광 공명 에너지 전달 (CRET) 쌍의 제1 구성성분에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자; 및
CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원와 접촉시키는 단계로,
여기서, 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때, CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 10 내지 75%의 범위인 단계; 및
ii) CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율이 시료의 존재하에 변경되었는지 여부를 결정하는 단계로, 여기서 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율의 감소는 분석물이 시료에 존재함을 표시하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율의 감소는 실시간으로 관찰된다. 대안적인 구현예에서, CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율의 감소는 시료의 부재하에 (예를 들어, 완충액 대조군의 존재하에) CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율에 상대적이다.
일부 구현예에서, 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때, 제1 구성성분에서 제2 구성성분으로의 에너지 전달의 효율은 15 내지 75%, 20 내지 75%, 25 내지 75%, 30 내지 75%, 35 내지 75%, 40 내지 75%, 45 내지 75%, 50 내지 75%, 55 내지 75%, 60 내지 75%, 또는 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 또는 50% 초과의 범위이다. 일부 구현예에서, 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때 제1 구성성분에서 제2 구성성분으로의 에너지 전달의 효율은 15 내지 65%의 범위이다.
일부 구현예에서, 단계 (i)는
(a) 먼저 시료를 항체 또는 항체 유사 분자와 접촉시킨 다음 생성된 혼합물을 표지된 항원과 접촉시키는 단계;
(b) 먼저 시료를 다음 표지된 항원과 접촉시킨 생성된 혼합물을 항체 또는 항체 유사 분자와 접촉시키는 단계; 또는
(c) 시료를 동시에 항체 또는 항체 유사 분자 및 표지된 항원과 접촉시키는 단계를 포함한다.
당업자가 이해하는 바와 같이, (i)(a), (i)(b) 및 (i)(c) 각각에서, 시료에 관심 분석물의 존재는 예를 들어 완충액 블랭크가 시료 대신 사용되는 경우 시료가 첨가되지 않는 대조군에 비해 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율의 감소를 초래할 것이다. 예를 들어, 방법이 먼저 시료를 항체 또는 항체 유사 분자와 접촉시킨 다음 생성된 혼합물을 표지된 항원과 접촉시키는 단계 (즉 단계 (i)(a))에 의해 수행되는 경우 생성된 혼합물을 표지된 항원과 접촉시킨 후 (즉 실시간으로 관찰된) CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 증가할 것이다. 그러나, 관심 분석물이 시료에 존재하는 경우, 시료가 없는 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율에 비해 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 감소할 것이다. 유사하게, 방법이 시료를 동시에 항체 또는 항체 유사 분자 및 표지된 항원과 접촉시키는 단계 (즉 단계 (i)(c))에 의해 수행되는 경우 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 실시간으로 변경되지 않을 수 있다. 그러나, 관심 분석물이 시료에 존재하는 경우, 시료가 없는 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율에 비해 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 감소할 것이다. 단계 (i)가 먼저 시료를 표지된 항원과 접촉시킨 다음 생성된 혼합물을 항체 또는 항체 유사 분자와 접촉시키는 단계 (즉 단계 (i)(b))에 의해 수행되는 경우, 관심 분석물이 시료에 존재하면 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율의 감소가 실시간으로 관찰될 것이다.
일부 구현예에서, 단계 ii)는 시료의 존재하에 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율을 시료의 부재하에 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율과 비교하는 것을 포함하고, 여기서 시료의 존재하에 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율의 감소는 분석물이 시료에 존재한다는 것을 표시한다. 일부 구현예에서, 단계 ii)는 시료가 첨가되기 전 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율을 시료가 첨가된 후 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율과 비교하는 것을 포함하고, 여기서 시료의 존재하에 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율의 감소는 분석물이 시료에 존재한다는 것을 표시한다.
일부 구현예에서, 단계 (i)는 시료를 기질과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
바람직한 구현예에서, 방법은 2차 항체가 필요하지 않다. 이들 구현예는 2차 항체가 필요하지 않기 때문에 당 업계에 공지된 다수의 기술 (예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯, 면역조직화학, 면역세포화학, 유세포 분석)에 비해 이점을 제공한다. 이는 분석에 필요한 단계 수를 줄이고 방법을 수행하는 데 필요한 시간을 줄일 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 실시간으로 수행된다.
일부 구현예에서, 시료의 존재하에 수용자 도메인에 대한 BRET 공여자 도메인의 공간적 위치 및/또는 쌍극자 배향이 변경되었는지 결정하는 것은 시료의 첨가 전 후 BRET 비율을 측정하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 시료에서 분석물의 농도를 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 시료에서 분석물의 농도는 시료의 존재하에 에너지 전달의 효율 (예를 들어, BRET 비율로 표시됨)을 분석물의 알려진 농도에서 에너지 전달의 효율과 비교함으로써, 예를 들어 표준 곡선을 구성하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 나노몰 또는 피코몰 수준에서 시료에서 분석물의 농도를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 적어도 1　pM, 적어도 5　pM, 적어도 10　pM, 적어도 25 pM, 적어도 50　pM, 적어도 75 pM, 적어도 100 pM, 적어도 200 pM, 적어도 300 pM, 적어도 400 pM, 적어도 500 pM, 적어도 600 pM, 적어도 700 pM, 적어도 800 pM, 적어도 900 pM, 적어도 1 nM, 적어도 5 nM, 적어도 10 nM, 적어도 25 nM, 적어도 50 nM, 적어도 75 nM, 적어도 100 nM, 적어도 200 nM, 적어도 300 nM, 적어도 400 nM, 적어도 500 nM, 적어도 600 nM, 적어도 700 nM, 적어도 800 nM, 적어도 900 nM의 분석물을 검출할 수 있다.
한 예에서, 시료에서 분석물을 검출하는 방법이 제공되고, 방법은
i) 코엘레테라진의 존재하에, 시료를 하기와 접촉시키는 단계:
a) 레닐라 루시퍼라제 또는 이의 변이체에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자; 및
녹색 형광 단백질 2에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원; 및
ii) 레닐라 루시퍼라제와 녹색 형광 단백질 2 사이의 생물발광 공명 에너지 전달 (BRET)가 변형되었는지를 결정하는 단계로, 여기서 레닐라 루시퍼라제와 녹색 형광 단백질 2 사이의 에너지 전달의 효율의 감소는 분석물이 시료에 존재함을 표시하는 것인 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (i)는 시료를 기질과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 시료를 분류하는 방법이 제공되고, 방법은
i) 하나 이상의 마이크로채널을 포함하는 미세유체 장치를 통해 하기:
a) 시료,
b) CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자,
c) CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원,
d) CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분 중 하나의 기질
을 흐르게 하는 단계로, 여기서, 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때, 제1 구성성분과 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 10 내지 75%의 범위인 단계,
ii) 장치에서 항체 또는 항체 유사 분자, 표지된 항원, 시료 및 기질을 혼합하는 단계,
iii) 전기 광학 감지 장치를 사용하여 CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분에 의한 기질의 변형을 검출하는 단계,
iv) 전기 광학 감지 장치로부터의 적어도 하나의 신호를 처리하고 하나 이상의 관심 시료의 하나 이상의 미리 결정된 특성의 전기 광학 응답의 패턴과 상관시키는 단계, 및
v) 응답 패턴의 상관관계에 기초하여 시료를 분류하는 단계를 포함하고,
여기서 하나 이상의 분석물이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 때 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 변경된다.
상기 방법을 이들이 함유하는 분석물을 기반으로 시료를 분류하기 위해 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법을 하나 이상의 분석물의 존재, 부재 또는 농도를 기반으로 시료를 분류하기 위해 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 이들 각각이 상이한 분석물 또는 분석물의 범위 및 둘 이상의 상이한 표지된 항원에 결합하는 둘 이상의 상이한 항체 또는 항체 유사 분자를 포함하고, 단계 v)는 각각의 분석물 또는 분석물의 범위의 존재, 부재 또는 농도를 기반으로 시료를 분류하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 시료는 둘 이상의 부류, 예를 들어 안전하거나 위험한, 오염되거나 오염되지 않은, 정품 또는 사기 또는 낮은 가치/중간 가치/높은 가치로 분류된다. 일부 구현예에서, 방법은 시료를 실시간으로 분류하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 센서 분자는 장치에 고정되지 않는다. 일부 구현예에서, 센서 분자 및 기질은 상이한 마이크로채널을 통해 장치에 들어간다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항체 또는 항체 유사 분자 및 표지된 항원은 또한 자연 발생 항체를 검출하는 방법에 사용될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서 시료에서 자연 발생 항체를 검출하는 방법이 제공되고, 방법은
i) 시료를
화학발광 공명 에너지 전달 (CRET) 쌍의 제1 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자; 및
CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 자연 발생 항체에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원와 접촉시키는 단계로,
여기서 CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자 및 자연 발생 항체는 표지된 항원에 결합할 수 있고; 그리고
여기서, 표지된 항원이 CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때, CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 10 내지 75%의 범위인 단계; 그리고
ii) CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율이 시료의 존재하에 변경되었는지 여부를 결정하는 단계로, 여기서 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율의 감소는 자연 발생 항체가 시료에 존재한다는 것을 표시하는 것인 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (i)는 시료를 기질과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)는 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율이 시료의 존재하에 감소되었는지를 결정하는 것을 포함한다. 예를 들어, CRET 비율은 시료의 존재하에 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%. 45%, 50%, 55%. 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 감소될 수 있다. 일부 구현예에서, CRET 비율은 시료의 존재하에 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 감소된다.
일부 구현예에서, 단계 (ii)는 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율이 시료의 존재하에 증가되었는지 여부를 결정하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (i)는
(a) 먼저 시료를 항체 또는 항체 유사 분자와 접촉시킨 다음 생성된 혼합물을 표지된 항원과 접촉시키는 단계;
(b) 먼저 시료를 표지된 항원과 접촉시킨 다음 생성된 혼합물을 항체 또는 항체 유사 분자와 접촉시키는 단계; 또는
(c) 시료를 동시에 항체 또는 항체 유사 분자 및 표지된 항원과 접촉시키는 단계를 포함한다.
위에서 설명한 바와 같이, (i)(a), (i)(b) 및 (i)(c) 각각에서, 시료에서 관심 분석물의 존재는 예를 들어 완충액 블랭크가 시료 대신 사용된, 시료가 첨가되지 않는 대조군에 비해 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율의 감소를 초래할 것이다.
일부 구현예에서, 단계 (i)는 시료를 기질과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때 제1 구성성분에서 제2 구성성분으로의 에너지 전달의 효율은 15 내지 75%, 20 내지 75%, 25 내지 75%, 30 내지 75%, 35 내지 75%, 40 내지 75%, 45 내지 75%, 50 내지 75%, 55 내지 75%, 60 내지 75%, 또는 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과 또는 50% 초과의 범위이다. 일부 구현예에서, 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때 제1 구성성분에서 제2 구성성분으로의 에너지 전달의 효율은 15 내지 65%의 범위이다.
일부 구현예에서, 방법은 시료에서 자연 발생 항체의 농도를 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 시료에서 자연 발생 항체의 농도는 시료의 존재하에 에너지 전달의 효율 (예를 들어, BRET 비율로 표시됨)을 자연 발생 항체의 알려진 농도에서 에너지 전달의 효율과 비교함으로써, 예를 들어 표준 곡선을 구성하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 나노몰 또는 피코몰 수준에서 시료에서 분석물의 농도를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 적어도 1　pM, 적어도 5　pM, 적어도 10　pM, 적어도 25 pM, 적어도 50　pM, 적어도 75 pM, 적어도 100 pM, 적어도 200 pM, 적어도 300 pM, 적어도 400 pM, 적어도 500 pM, 적어도 600 pM, 적어도 700 pM, 적어도 800 pM, 적어도 900 pM, 적어도 1 nM, 적어도 5 nM, 적어도 10 nM, 적어도 25 nM, 적어도 50 nM, 적어도 75 nM, 적어도 100 nM, 적어도 200 nM, 적어도 300 nM, 적어도 400 nM, 적어도 500 nM, 적어도 600 nM, 적어도 700 nM, 적어도 800 nM, 적어도 900 nM의 분석물이 검출될 수 있다.
이러한 구현예에서, 방법은 대상체에서 혈청전환을 검출하고 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "혈청전환"은 미생물, 예를 들어 세균, 바이러스, 진균, 마이코플라스마 또는 기생충에 의한 감염 또는 면역화가 대상체에서 면역 반응을 생성하는 상황을 지칭하는 것으로 의도된다. 면역 반응의 측정, "혈청학"은 감염 상태, 면역 상태 또는 대상체의 합병증에 대한 감수성을 결정하는 데 자주 사용된다. 예시적 구현예에서, 시료는 천연 항체를 함유하는 것으로 의심되는 혈청 또는 다른 생물학적 유체이다.
　본 개시내용은 키트를 포함하고, 이는 다음 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않을 수 있다: CRET 시스템의 제1 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자, CRET 시스템의 제2 구성성분에 부착된 표지된 항원, 기질, 테스트 표준, 및 지침 (사용 설명서). 상기 나열된 구성 요소는 모니터링할 특정 분석물에 맞게 조정할 수 있다. 키트는 본원에 기술된 방법을 수행하는 당 업계에 공지된 적절한 완충제 및 시약을 추가로 포함할 수 있다.
시스템
본 발명의 방법은 CRET 쌍 사이의 에너지 전달을 측정하기에 적합한 임의의 시스템에서 수행될 수 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이 본 발명의 방법은 배치 (예를 들어 플레이트 판독기를 사용하는 배치 형식) 또는 흐름 형식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 적절한 필터가 장착된 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 마이크로플레이트 형식으로 수행될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 WO2013/155553에 기술된 바와 같은, 미세유체 장치 상에서 수행될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 WO 2013/155553에 기술된 바와 같은, 미세유체 장치 상에서 수행될 수 있다. 미세유체 장치 (CYBERTONGUE 장치) 상에서 수행된 BRET 기반 분석의 예는 PCT/AU2018/050824에 제공된다.
일부 구현예에서, 시료에서 분석물을 검출하는 미세유체 시스템이 제공되고, 시스템은
i) CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자를 함유하기에 적합한 적어도 하나의 저장소,
ii) CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원을 함유하기에 적합한 적어도 하나의 저장소;
iii) 하나 이상의 마이크로채널을 포함하는 미세유체 장치,
iv) 장치에서 항체 또는 항체 유사 분자, 표지된 항원, 시료 및 CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분의 기질을 혼합하기 위한 수단,
v) 항체 또는 항체 유사 분자에 대한 분석물의 결합을 검출하기 위한 반응 챔버, 및
vi) 전기 광학 감지 장치를 포함하고,
여기서, 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때, 에너지 전달의 효율 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 10 내지 75%의 범위이고; 그리고
여기서 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율의 감소는 분석물이 시료에서 존재함을 표시한다. 한 예에서, 시스템은 실시간으로 분석물을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항체 유사 분자는 장치에 고정되지 않는다. 한 예에서, 항체 또는 항체 유사 분자, 표지된 항원 및 기질은 상이한 마이크로채널을 통해 장치로 들어간다. 한 예에서, 미세유체 장치는 적어도 2개의 입력 마이크로채널을 포함하고, 여기서 입력 마이크로채널 중 하나는 항체 또는 항체 유사 분자를 장치 내로 흐르게 하기 위한 것이다.
일부 구현예에서, 전기 광학 감지 장치는 적어도 2개의 상이한 파장 채널을 포함한다. 일부 예에서, 전기 광학 감지 장치는 2개의 상이한 파장 채널을 동시에 또는 빠르게 연속적으로 검출할 수 있다. 일부 예에서, 전기 광학 감지 장치는 1초 미만에 2개의 상이한 파장 채널을 검출할 수 있다.
일부 구현예에서, 미세유체 장치는 둘 이상의 분석물의 검출을 가능하게 하도록 설계된다.
다른 구현예에서, 시료를 분류하는 방법이 제공되고, 방법은
(i) 시료를
a) CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자,
b) CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원,
c) CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분 중 하나의 기질과 접촉시키는 단계로,
여기서, 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때, 제1 구성성분과 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 10 내지 75%의 범위인 단계,
ii) 전기 광학 감지 장치를 사용하여 CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분에 의한 기질의 변형을 검출하는 단계,
iv) 전기 광학 감지 장치로부터의 적어도 하나의 신호를 처리하고 전기 광학 응답의 패턴을 하나 이상의 관심 시료의 하나 이상의 미리 결정된 특성과 상관시키는 단계, 및
v) 응답 패턴의 상관관계를 기반으로 시료를 분석하는 단계를 포함하고, 여기서 하나 이상의 분석물이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 때 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 변경된다. 일부 구현예에서, 단계 (i)는 하기를 포함한다:
A) 하나 이상의 마이크로채널을 포함하는 미세유체 장치를 통해 하기를 흐르게 하는 단계,
a) 시료,
b) 항체 또는 항체 유사 분자,
c) 표지된 항원, 및
d) 기질; 및
B) 장치에서 항체 또는 항체 유사 분자, 표지된 항원, 시료 및 기질을 혼합하는 단계.
일부 구현예에서, 방법은 이들 각각이 상이한 분석물 또는 분석물의 범위 및 둘 이상의 상이한 표지된 항원에 결합하는 둘 이상의 상이한 항체 또는 항체 유사 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 실시간으로 시료를 분류하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 유사 분자는 장치에 고정되지 않는다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 유사 분자, 표지된 항원 및 기질은 상이한 마이크로채널을 통해 장치에 들어간다. 일부 구현예에서, 미세유체 장치는 적어도 2개의 입력 마이크로채널을 포함하고, 여기서 입력 마이크로채널 중 하나는 항체 또는 항체 유사 분자를 장치 내로 흐르게 하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 시료를 분류하는 방법은 하나 이상의 분석물의 존재 또는 부재 또는 분석물의 농도에 기반한 시료로서 분류하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 방법은 알레르겐이 미리 결정된 수준 미만으로 존재하고/거나 검출할 수 없을 때 알레르겐이 없는 것으로 시료를 분류하기 위해 사용될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명에 따른 바람직한 항체, 표지된 항원 및 방법을 제시한다. 그러나, 이들 실시예는 예시의 목적으로 제공되고 그 안의 어떤 것도 본 발명의 전체　범위에　대한 제한으로 간주되어서는 안 된다는　것을 이해해야 한다.
실시예 1. FLAG- GFP 2 의 제조
분자 생물학 : GFP2의 아미노산 잔기 2 내지 239을 암호화하는 DNA 서열을 PCR로 증폭시켰다. 이는 N-말단 헥사히스티딘 (His) 태그에 이어서 담배 식각 바이러스 프로테아제 (TEV) 절단 부위, SUMO 용해도 태그, SUMO 프로테아제 절단 부위 및 FLAG 에피토프에 이어서 GFP2 서열을 암호화하도록 설계된 변형된 pET43a 대장균 발현 벡터에 결찰되었다. 생성된 단백질 서열은 서열 번호 4에 나열되어 있다.
단백질 발현: 재조합 His-TEV-SUMO-FLAG-GFP2 단백질을 생산하기 위해, 발현 플라스미드를 대장균 BL21 DE3 균주로 형질전환하고 0.7의 OD600에 도달할 때까지 100 μg/ml 암피실린이 보충된 Terrific broth (TB)에서 37℃에서 진탕하며 성장시켰다. 배양물을 16℃로 옮기고, 단백질 발현을 최종 농도 0.5 mM로 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 첨가하여 유도하고 배양물을 밤새 추가 16 h 동안 진탕시켰다. 발현 후, 세포 배양물을 20분 동안 5000 x g에서 원심분리하고 생성된 세포 펠렛을 -20℃에서 냉동 보관하였다.
단백질 정제: 단백질 정제를 세포 1 g 당 완충액 5 ml의 비율을 사용하여 용해 완충액 (25 mM 트리스-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10 mM 이미다졸, 0.5 mg/ml 리소자임, 5 U/ml 벤조나제 엔드뉴클레아제 [EMD Millipore], 1 mM PMSF, EDTA가 없는 완전 프로테아제 억제제 정제 [Roche])에서 세포 펠렛을 해동하여 개시하였다. 세포를 얼음 냉각된 Avestin C5 세포 분쇄기를 통해 3회 통과시켜 추가로 용해시키고 4℃에서 48,000 x g에서 원심분리하였다. 상청액 (세포 용해물)을 5 μm 필터를 통해 여과하고 Profinia 친화도 크로마토그래피 정제 시스템 (Bio-Rad)을 사용하여 IMAC 세척 완충액 1 (25 mM 트리스-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸)로 미리 평형화된 5 ml HiTrap IMAC 세파로스 FF 컬럼 (GE Healthcare)에 적용하였다. IMAC 컬럼을 IMAC 세척 완충액 1 및 IMAC 세척 완충액 2 (25 mM 트리스-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸)로 순차적으로 세척하고 결합된 His-TEV-SUMO-FLAG-GFP2 단백질을 IMAC 용리 완충액 (25 mM 트리스-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 350 mM 이미다졸)으로 용리하였다. IMAC-용리된 단백질을 겔 여과 완충액 (25 mM 트리스-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl)으로 미리 평형화된 HiLoad 16/60 Superdex 75 컬럼 (GE Healthcare)을 통과시켜 추가로 정제하였다.
정제된 His-TEV-SUMO-FLAG-GFP2 단백질을 N-말단 His 및 SUMO 태그를 제거하기 위해 50:1의 단백질 대 프로테아제 비율로 16℃에서 밤새 SUMO 프로테아제와 함께 배양하였다. 다음날 아침, 이미다졸을 최종 농도 20 mM로 반응물에 첨가하고, 반응 혼합물을 프로테아제 및 절단된 태그를 제거하기 위해 5 ml HiTrap IMAC 컬럼에 한 번 더 통과시켰다. IMAC 세척 완충액 2로 2회 세척하고, 태그되지 않은 FLAG-GFP2 단백질을 비결합 분획 및 제1 IMAC 세척에서 수집하였다. 그런 다음 절단된 FLAG-GFP2 단백질을 함유하는 분획을 Amicon Ultra 원심분리 필터 유닛 (Ultra-15 MWCO 10kDa)을 사용하여 농축하고 겔 여과 완충액으로 미리 평형화된 HiLoad 16/60 Superdex 75 컬럼 (GE Healthcare)에 로딩하였다. 적절한 피크를 수집하고 단백질을 1.7 mg/ml로 농축한 후 500 μl 분취량으로 액체 질소에서 급속 동결하고 -70℃에서 보관하였다. 모든 융합 단백질에서 FLAG 에피토프의 존재는 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다 (데이터는 나타내지 않음).
실시예 2. RLuc8의 제조
분자 생물학: 레닐라 레니포르미스 루시퍼라제 (RLuc8)의 잔기 2 내지 311을 암호화하는 코돈 최적화된 DNA 서열 (대장균에서의 발현용)에 이어서 SortaseA 생체접합 서열 (LPETGG)은 GenScript USA Inc (Piscataway, New Jersey, USA)에 의해 합성하였다. 이는 N-말단 헥사히스티딘 태그에 이어 담배 식각 바이러스 프로테아제 (TEV) 절단 부위 및 RLuc8-LPETGG 서열을 암호화하도록 설계된 변형된 pET43a 대장균 발현 벡터에 결찰되었다. 생성된 단백질 서열은 서열 번호 5에 나열되어 있다.
단백질 발현: 재조합 N-His-RLuc8 단백질을 생산하기 위해, 발현 플라스미드를 대장균 BL21 DE3 균주로 형질전환하고 0.7의 OD600에 도달할 때까지 100 μg/mL 암피실린으로 보충된 Terrific broth (TB)에서 37℃에서 진탕하여 성장시켰다. 배양물을 16℃로 옮기고 단백질 발현을 최종 농도 0.5 mM로 IPTG를 첨가하여 유도하였다. IPTG의 첨가 후, 배양물을 밤새 추가 16시간 동안 진탕시켰다. 발현 후, 세포 배양물을 20분 동안 5000 x g에서 원심분리하고 세포 펠렛을 -20℃에서 냉동 보관하였다.
단백질 정제: 단백질 정제는 세포 1 g 당 완충액 5 ml의 비율을 사용하여 용해 완충액 (25 mM 트리스-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10 mM 이미다졸, 0.5 mg/mL 리소자임, 5 U/mL 벤조나제 엔드뉴클레아제 [EMD Millipore], 1 mM PMSF, EDTA가 없는 완전 프로테아제 억제제 정제 [Roche])에서 세포 펠렛을 해동하여 개시하였다. 세포 얼음 냉각된 Avestin C5 세포 분쇄기를 통해 3회 통과시켜 추가로 용해시키고 4℃에서 48,000 x g에서 원심분리하였다. 상청액 (세포 용해물)을 5 μm 필터를 통해 여과시키고 Profinia 친화도 크로마토그래피 정제 시스템 (Bio-Rad)을 사용하여 IMAC 세척 완충액 1 (25 mM 트리스-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸)로 미리 평형화된 5 mL HiTrap IMAC 세파로스 FF 컬럼 (GE Healthcare)에 적용하였다. 그런 다음 IMAC 컬럼을 IMAC 세척 완충액 1 및 IMAC 세척 완충액 2 (25 mM 트리스-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸)로 순차적으로 세척한 다음 결합된 N-말단 HIS 태그된 RLuc8 단백질을 IMAC 용리 완충액 (25 mM 트리스-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 350 mM 이미다졸)으로 용리하였다. IMAC 용리된 단백질을 1 x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4 pH 7.4)에서 미리 평형화된 HiLoad 16/60 Superdex 75 컬럼을 통과시켜 추가로 정제하였다. 단량체 및 이량체를 함유하는 분획을 별도로 풀링한 후 500 μL 분취량으로 급속 동결하고 -70℃에서 보관하였다.
정제 전반에 걸쳐, RLuc8을 함유하는 분획을 항-His 항체-HRP 접합체를 사용하는 SDS-PAGE 분석 및 웨스턴 블롯 분석 및 α-클로로나프톨에 의한 검출에 의해 확인되었다. 최종 풀링된 분획의 질량 분석은 단백질의 질량이 38981.2 Da인 것으로 밝혀졌고, 38981.37 Da의 예측된 질량 (N-말단 메티오닌의 손실을 포함)과 매우 잘 일치한다.
루시퍼라제 활성: 코엘레테라진 400a (Cayman Chemicals) (6-페닐-2,8-비스(페닐메틸)-이미다조[1,2-a]피라진-3(7H)-온) (1 mg)를 10.2 mL 에탄올에 용해시키고 200 μL 분취량으로 분할하여 건조하고 (Speedivac) 사용할 때까지 - 20℃에서 보관하였다.
코엘레테라진 400a (50 nmol)를 50 μL 에탄올에 용해시키고 450 μL 물을 첨가하였다. RLuc8 단량체 (2.4 mg/mL) 및 RLuc8 이량체 (4.8 mg/mL)를 완충액 중 1 mg/mL BSA에서 희석하였다. 흰색 96-웰 Optiplate (Perkin Elmer)의 웰에 TBS, PBS 또는 100 mM 인산나트륨 pH 7.0, 2 μL 루시퍼라제 효소 (1/10 또는 1/100 희석) 및 5 μL의 0.1 mM 코엘레테라진 400a 용액을 첨가하였다. 각 웰의 최종 부피는 100 μL이었다. 생성된 빛을 필터 없이 발광 광학 장치를 사용하는 FLUOstar Optima (BMG Labtech)에서 측정하였다. 루시퍼라제 활성 분석의 결과는 N-His-RLuc8의 루시퍼라제 활성이 매우 빠르게 (몇 초에 걸쳐) 감소하여, 초기 판독값이 기록되었음을 나타내었다 (데이터는 나타내지 않음). N-His-RLuc8 단량체는 이량체 형태보다 더 활성이 있는 것으로 밝혀져, 모든 접합 실험은 단백질의 단량체 형태로 수행되었다.
실시예 3. FLAG- RLuc8의 제조
분자 생물학: 레닐라 레니포르미스 루시퍼라제 (RLuc8)의 잔기 2 내지 311에 이어서 SortaseA 생체접합 서열 (LPETGG)을 암호화하는 코돈 최적화된 DNA 서열 (대장균에서의 발현용)은 GenScript USA Inc (Piscataway, New Jersey, USA)에 의해 합성되었다. 이는 N-말단 헥사히스티딘 태그에 이어서 담배 식각 바이러스 프로테아제 (TEV) 절단 부위, SUMO 용해도 태그, SUMO 프로테아제 절단 부위 및 FLAG 에피토프에 이어서 RLuc8-LPETGG 서열을 암호화도록 설계된 변형된 pET43a 대장균 발현 벡터에 결찰되었다. 생성된 단백질 서열은 서열 번호 6에 나열되어 있다.
단백질 발현: 재조합 FLAG-RLuc8 단백질을 생산하기 위해, 발현 플라스미드를 대장균 BL21 DE3 균주로 형질전환하고 0.7의 OD600에 도달할 때까지 100 μg/mL 암피실린이 보충된 Terrific broth (TB)에서 37℃에서 진탕하며 성장시켰다. 배양물을 16℃로 옮기고 단백질 발현을 최종 농도 0.5 mM로 IPTG를 첨가하여 유도하였다. IPTG의 첨가 후 배양물을 밤새 추가 16시간 동안 진탕시켰다. 발현 후, 세포 배양물을 20분 동안 5000 x g에서 원심분리하고 세포 펠렛을 -20℃에서 냉동 보관하였다.
단백질 정제: 단백질 정제를 세포 1 g 당 완충액 5 ml의 비율을 사용하여 용해 완충액 (25 mM 트리스-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10 mM 이미다졸, 0.5 mg/mL 리소자임, 5 U/mL 벤조나제 엔드뉴클레아제 [EMD Millipore], 1 mM PMSF, EDTA가 없는 완전 프로테아제 억제제 정제 [Roche])에서 세포 펠렛을 해동하여 개시하였다. 세포를 통해 3회 통과시켜 추가로 용해시키고 얼음 냉각된 Avestin C5 세포 분쇄기에서 4℃에서 48,000 x g에서 원심분리하였다. 상청액 (세포 용해물)을 5 μm 필터를 통해 여과하고 Profinia 친화도 크로마토그래피 정제 시스템 (Bio-Rad)을 사용하여 IMAC 세척 완충액 1 (25 mM 트리스-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸)로 미리 평형화된 1 mL HiTrap IMAC 세파로스 FF 컬럼 (GE Healthcare)에 적용하였다. IMAC 컬럼을 IMAC 세척 완충액 1 및 IMAC 세척 완충액 2 (25 mM 트리스-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸)로 순차적으로 세척하고 결합된 HIS-TEV-SUMO-FLAG-RLuc8 단백질을 IMAC 용리 완충액 (25 mM 트리스-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 350 mM 이미다졸)으로 용리하였다. IMAC-용리된 단백질을 1 x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4 pH 7.4)에서 미리 평형화된 HiLoad 16/60 Superdex 75 컬럼을 통과시켜 추가로 정제하였다.
정제된 단백질을 N-말단 HIS 및 SUMO 태그를 제거하기 위해 20:1의 단백질 대 프로테아제 비율로 16℃에서, 밤새 SUMO 프로테아제와 함께 배양하였다. 다음날 아침, 이미다졸을 최종 농도 20 mM로 반응물에 첨가하고 반응 혼합물을 프로테아제 및 절단된 태그를 제거하기 위해 1 mL HiTrap IMAC 컬럼에 한 번 더 통과시켰다. IMAC 세척 완충액 2로 2회 세척한 후 태그되지 않은 단백질을 비결합 분획 및 제1 IMAC 세척에서 수집하였다. 절단된 FLAG-RLuc8 단백질을 Amicon Ultra 원심분리 필터 유닛 (Ultra-15 MWCO 10kDa)을 사용하여 농축하고 1 x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4 pH 7.4)에서 미리 평형화된 HiLoad 16/60 Superdex 200 컬럼에 로딩하였다. 단량체 및 이량체를 별도로 수집하고 단백질을 >1.2 mg/mL로 농축하였다. 단백질을 100 μL 분취량으로 액체 질소에서 급속 동결하고 -70℃에서 보관하였다.
정제 전반에 걸쳐, RLuc8을 함유하는 분획은 항-His 항체-HRP 접합체를 사용하는 SDS-PAGE 분석 및/또는 웨스턴 블롯 분석 및 α-클로로나프톨에 의한 검출에 의해 확인되었다.
실시예 4. 항-FLAG 항체 및 항-FLAG Fab'2 단편의 제조
항-FLAG 항체의 생산: 항-FLAG 항체는 항-FLAG M2 하이브리도마로부터 생산되었고 (Brizzard 등, 1994) Ab-Capcher 수지 (Cosmo Bio) 상에서 정제되었다. 항-FLAG (8 mL, 3.5 mg/mL)를 HiPrep 탈염 컬럼 (GE Healthcare)에서 pH 6.4로 조정된 PBS로 탈염하였다. 비절단 항-FLAG 항체를 겔 여과로 단리하였다 (데이터는 나타내지 않음).
항-FLAG Fab'2 단편의 생산: 파파인 (BDH) 10.3 mg을 1.03 mL PBS에 재현탁시키고, 시스테인을 10 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 생성된 혼합물을 ~ 20분 동안 실온에서 배양한 후 원심분리하였다 (21,000 x g, 4℃에서 5분). 파파인의 농도는 280 nm에서 흡광도로부터 1.02 mg/mL인 것으로 측정되었다. 환원된 파파인을 pH 6.4로 조정된 PBS로 평형화된 HiTrap 탈염 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하여 탈염하였다.
파파인 대 항체의 최적 비율을 결정하기 위해, 일련의 절단 반응을 1:5 내지 1:2560의 효소/항체 비율로 첨가된 20 μg 항-FLAG 항체 및 파파인으로 설정하였다. 반응 혼합물을 0 또는 10 mM 시스테인의 존재하에, 밤새 37℃에서 배양한 후, 5 μL 0.5 M 요오도아세트아미드를 반응 혼합물에 첨가하여 반응을 소광시켰다. 그런 다음 절단 정도를 SDS-PAGE로 평가하였다.
접합 반응에 사용하기 위해, 7.6 mg 항-FLAG 항체를 비-환원 조건 (0 mM 시스테인) 하에 0.38 mg 파파인 (1:20의 효소/항체 비율)에 첨가하고 15 h 동안 37℃에서 반응을 진행시킨 후 Fab'2를 PBS로 평형화된 HiLoad 26/60 Superdex 200 컬럼 (GE Healthcare) 상의 겔 여과로 단리하였다. 그런 다음 단리된 Fab'2의 순도를 SDS-PAGE로 평가하였다.
실시예 5. 유리 설프히드릴을 노출시키기 위한 항-FLAG 항체 및 Fab'2의 부분 환원
항-FLAG 항체의 부분 환원: 항-FLAG 항체를 25℃에서 4 h 동안 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP) (최종 농도 50 μM)으로 처리한 후 NAP G-25 탈염 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하는 PBS로 탈염시켰다. 환원된 항체를 후속 접합 반응에서 추가 정제 없이 사용하였다.
항-FLAG Fab'2 단편의 부분 환원: 항-FLAG Fab'2를 25℃에서 2 h 동안 TCEP (최종 농도 100 μM)로 환원시킨 후 MES 완충액 (20 mM, pH 6)으로 희석하고 동일한 완충액으로 평형화된 HiTrap SP HP 양이온 교환 컬럼 (1 mL, GE Healthcare)에 적용하였다. 컬럼을 완충액 A (PBS)로 세척하였고 결합된 단백질을 0 - 100% 완충액 B (0.85 M NaCl이 첨가된 PBS)의 선형 구배로 용리하였다. 그런 다음 용리된 물질을 25℃에서 1 h 동안 디히드로아스코르브산 (DHAA) (250 당량)로 온화한 재산화시킨 후 DHAA를 PBS로 평형화된 HiTrap 5 mL 탈염 컬럼 (GE Healthcare) 상의 PBS로 탈염하여 제거하였다. 생성된 Fab'를 후속 접합 반응에서 추가 정제 없이 사용하였다.
실시예 6. Solulink 링커를 통한 항-FLAG 항체 및 항-FLAG Fab'에 대한 RLuc8의 접합
포르밀벤즈아미드 - RLuc8 유도체의 제조: PBS (700 μL) 중 N-His-RLuc8 (25 nmol)을 125 nmol 술포-S-4FB (N-숙신이미딜-4-포르밀벤즈아미드, TriLink Biotechnologies; 무수 DMSO 중 50 mM 술포-S-4FB 2.49 μl)와 반응시키고 혼합물을 실온에서 90분 동안 반응시켰다. 과량의 술포-S-4FB를 HiTrap 탈염 컬럼에서 PBS로 탈염시켜 제거하였다. 포르밀벤즈아미드-유도체화 단백질의 적은 분취량을 질량 분광계 분석을 적용하였고, 미량의 포르밀벤즈아미드-RLuc8 유도체만이 질량분석기에서 효율적으로 비행할 수 없는 이 유도체로 인해 가능한 검출되었다.
히드라지노니코틴아미드 - 항FLAG 항체 유도체의 제조: PBS (700 μL) 중 환원된 항-FLAG 항체 (16.4 nmol)를 164 nmol MHPH (말레이미드 HyNic, 말레이미딜-6-히드라진-니코틴아미드, TriLink Biotechnologies; 무수 DMSO 중 50 mM MHPH 3.29 μl))로 처리하고 혼합물을 실온에서 90분 동안 반응시켰다. 과량의 MHPH를 HiTrap 탈염 컬럼에서 PBS로 탈염시켜 제거하였다. 히드라지노니코틴아미드-유도체화 항-FLAG 항체의 적은 분취량을 질량 분광계 분석에 적용하였다.
히드라지노니코틴아미드를 사용한 환원된 항-FLAG 항체의 유도체화는 질량 분광계 분석으로부터 추론될 수 있다. 비-유도체화 환원된 항체의 질량 스펙트럼은 24110.8 Da (경쇄)에서 피크 및 50282.8 Da 이상에서 다중 피크 (중쇄, 글리코실화 변형)를 나타냈다. 히드라지노니코틴아미드-유도체화 항체의 질량 스펙트럼은 히드라지노니코틴아미드의 첨가에 상응하는 (예상된 MW + 191.0 Da), 50475.6 Da (중쇄 + 192.8 Da)에서 작은 피크를 나타내어, 접합이 발생했음을 시사하였다. 경쇄에 대한 중쇄의 양은 이 스펙트럼에서 해당 피크의 상대적 크기로 판단할 때 감소하여, 아마도 중쇄가 히드라지노니코틴아미드-유도체화되었지만 생성된 접합체가 질량 분광계에서 효율적으로 비행할 수 없음을 시사하였다.
히드라지노니코틴아미드 -Fab' 유도체의 제조: PBS (600 μL) 중 항-FLAG Fab' (7.2 nmol)를 72 nmol MHPH (무수 DMSO 중 50 mM MHPH 1.44 μl)으로 처리하고 혼합물을 실온에서 90분 동안 반응시켰다. 과량의 링커를 HiTrap 탈염 컬럼에서 PBS로 탈염시켜 제거하였다. 히드라지노니코틴아미드-유도체화 항-FLAG Fab'의 적은 분취량을 질량 분광계 분석에 적용하였다.
히드라지노니코틴아미드로서의 항-FLAG Fab'의 유도체화는 질량 분광계 분석으로부터 추론될 수 있다. 비-유도체화 항-FLAG Fab'의 질량 스펙트럼은 24112.3 Da (경쇄) 및 24574.5 Da (파파인-절단된 중쇄)에서 피크를 나타냈다. 항체 유도체의 스펙트럼과 유사하게, 히드라지노니코틴아미드-유도체화 Fab'의 질량 스펙트럼은 경쇄에 비해 중쇄의 양이 감소하였음을 나타냈고, 중쇄가 MHPH 시약과 반응하였지만 생성된 유도체가 질량 분광계에서 날아갈 수 없음을 시사하였다. 또한, 24781 (+207.9 Da)에서 넓은 피크가 관찰되었고, 이는 예측된 것 (예상된 +191.0 Da)보다 약간 높은 MW에 해당하지만, 피크가 너무 넓어 질량을 결정하기 어려웠다.
RLuc8 - 항FLAG 항체 접합체의 제조: 포르밀벤즈아미드-유도체화 RLuc8의 2/3을 히드라지노니코틴아미드-유도체화 항-FLAG 항체에 첨가하였다. 아닐린 (최종 농도 10 mM)을 첨가하고 접합 반응을 4℃에서 54 h 동안 진행시킨 후 일부 (400 μL)를 PBS로 평형화된 Superdex 200 10/300 증가 겔 여과 컬럼 (GE Healthcare) 상에서 겔 여과로 정제하였다. 포르밀벤즈아미드-유도체화 RLuc8 및 히드라지노니코틴아미드-유도체화 항체 반응 혼합물의 용리 크로마토그램 (데이터는 나타내지 않음)은 약 13.5 mL에서 넓은 피크에 의해 지배되어, 비-유도체화 항체는 13.5 mL에서 날카로운 피크와 동일한 조건에서 용리되고, RLuc8은 약 16.5 mL에서 넓은 피크로 용리된다 (데이터는 나타내지 않음). 약 12.5 - 13 mL에서 용리되는 작은 숄더는 접합체의 예상 용리 부피에 해당한다. 소량의 접합체가 약 11.5 - 12.5 mL에서 숄더로 수집되고, 이는 비-유도체화 항-FLAG 항체의 크로마토그램에 존재하지 않는다 (데이터는 나타내지 않음).
남은 반응 혼합물을 Amicon 10 kDa MWCO 스핀 농축기 (Merck Millipore)를 사용하여 20 mM MES, 150 mM NaCl pH 6.0으로 완충제 교환하였다. 아닐린을 최종 농도 10 mM로 첨가하고 한 부분은 4℃에 두 번째 부분은 실온에 16 h 동안 방치한 후 상기와 같이 겔 여과 정제를 실시하였다. 두 반응에 대한 겔 여과 프로파일은 PBS 중 반응에서 관찰된 프로파일과 매우 유사하였다.
히드라지노니코틴아미드: 포르밀벤즈아미드 결합은 29000의 몰 흡광계수로 354 nm에서 흡수하지만 (TriLink 제품 문헌), 접합체의 흡광도가 너무 낮아 354 nm에서 흡광도를 사용하여 농도를 추정할 수 없다.
RLuc8 - 항Fab ' 접합체의 제조: 포르밀벤즈아미드-유도체화 RLuc8의 1/3을 히드라지노니코틴아미드-유도체화 항-FLAG Fab'2에 첨가하였다. 아닐린을 최종 농도 10 mM로 첨가하였고 접합 반응을 4℃에서 약 54 h 동안 진행한 후 일부 (400 μL)를 PBS로 평형화된 Superdex 200 10/300 증가 겔 여과 컬럼 (GE Healthcare) 상에서 겔 여과로 정제하였다. 접합 반응 혼합물의 용리 프로파일은 RLuc8 (~16.5 mL의 용리 피크) 및 Fab' (또한 ~16.5 mL의 용리 피크)보다 먼저, 14.5 mL에서 용리되는 단백질의 용리의 새로운 피크를 나타냈다.
남은 반응 혼합물을 농축하고 Amicon 10 kDa MWCO 스핀 농축기 (Merck Millipore)를 사용하여 20 mM MES, 150 mM NaCl pH 6.0으로 완충제 교환하였다. 아닐린을 최종 농도 10 mM로 첨가하고 한 부분을 4℃에서 두 번째 부분을 실온에서 16 h 동안 방치한 후 상기와 같이 겔 여과 정제를 실시하였다. 두 반응에 대한 겔 여과 프로파일은 PBS 중 반응에서 관찰된 프로파일과 매우 유사하였다.
접합된 단백질에 상응하는 피크를 수집하였다. 히드라지노니코틴아미드: 포르밀벤즈아미드 결합은 29000의 몰 흡광계수로 354 nm에서 흡수하였다 (TriLink 제품 문헌). 최종 풀에서 히드라지노니코틴아미드: 포르밀벤즈아미드 결합의 농도는 50 nM로 추정되었다 (354 nm에서 크로마토그램의 적분에 의해 결정됨).
실시예 7. Click 화학반응을 사용하는 PEG 링커를 통한 항-FLAG 항체 및 항-FLAG Fab'에 대한 RLuc8의 접합
아지도 - PEG n - RLuc8 유도체의 제조: N-His-RLuc8 (240 μL PBS 중 25 nmol))을 아지도-dPEG®8-NHS 에스테르 (125 nmol) (Quanta Biodesign)와 실온에서 90분 동안 반응시켰다. 과량의 아지도-dPEG®8-NHS 에스테르를 HiTrap 탈염 컬럼 상에서 PBS로 탈염에 의해 제거하였다. 생성된 아지도-PEG8-유도체화 단백질을 후속 접합 반응에서 추가 정제 없이 사용하였다. 물질의 작은 분취량을 질량 분광분석법으로 분석하였다.
비접합 N-His-RLuc8의 질량 스펙트럼은 38982 Da에서 예상된 피크를 나타냈고, 이는 N-말단 메티오닌의 손실과 일치하고, 39160에서 더 작은 피크는 His 태그에 대한 글루코노일 기 첨가 (+178 kDa)에 해당할 가능성이 있다 (데이터는 나타내지 않음). 유도체화 단백질의 스펙트럼은 0 - 7 아지도-PEG8 기 (+ 449.5 Da 각각)가 첨부되었음을 표시하였다 (데이터는 나타내지 않음).
DBCO - PEG m - 항FLAG 항체 유도체의 제조: PBS (700 μL) 중 부분적으로 환원된 항-FLAG 항체 (16.4 nmol)를 DBCO-dPEG®4-Mal (Quanta Biodesign) (164 nmol; 무수 DMSO 중 50 mM DBCO-dPEG®4-Mal 3.29 μl)로 처리하고 혼합물을 25℃에서 90분 동안 반응시켰다. 과량의 DBCO-dPEG®4-Mal을 HiTrap 컬럼을 사용하여 PBS로 탈염하여 제거하였다. 생성된 단백질의 작은 분취량을 질량 분광분석법으로 분석하였다.
DBCO-PEG에 대한 환원된 항-FLAG 항체의 접합은 질량 분광계 분석으로부터 추론될 수 있다. 환원된 항체의 질량 스펙트럼 (데이터는 나타내지 않음)은 24110.8 Da (경쇄) 피크 및 50282.8 Da 이상에서 다중 피크 (중쇄, 글리코실화 변형)를 나타냈다. DBCO-PEG4:항체 접합체의 질량 스펙트럼은 경쇄 또는 중쇄에 대한 접합을 나타내지 않았지만 (예측된 MW + 674.7 Da), 경쇄에 대한 중쇄의 양은 이 스펙트럼에서 해당 피크의 상대적 크기로 판단할 때 감소하여, 아마도 중쇄가 DBCO-PEG4-Mal과 반응하였지만 생성된 접합체가 질량 분광계에서 날아갈 수 없었음을 시사하였다.
DBCO - PEG m -Fab' 유도체의 제조: PBS (600 μL) 중 부분적으로 환원된 항-FLAG Fab'2 (7.2 nmol)를 DBCO-dPEG®4-Mal (72 nmol; 무수 DMSO 중 50 mM DBCO-dPEG®4-Mal 1.44 μL)로 처리하고 혼합물을 25℃에서 90분 동안 반응시켰다. 과량의 DBCO-dPEG®4-Mal을 HiTrap 컬럼을 사용하여 PBS로 탈염하여 제거하였다. 생성된 단백질의 작은 분취량을 질량 분광분석법으로 분석하였다.
DBCO-PEG4에 대한 항-FLAG Fab' 단편의 접합은 질량 분광계 분석으로부터 추론될 수 있다. 항-FLAG Fab'의 질량 스펙트럼 (데이터는 나타내지 않음)은 24112.3 Da (경쇄) 및 24574.5 Da (파파인-절단된 중쇄)에서 피크를 나타냈다. 항체 접합체의 스펙트럼과 유사하게, DBCO-PEG4:Fab' 접합체의 질량 스펙트럼 (데이터는 나타내지 않음)은 경쇄에 비해 감소된 중쇄 양을 나타내어, 이 사슬에 상응하는 피크는 스펙트럼에서 보이지 않고, 중쇄가 DBCO-PEG4-Mal과 반응하였지만 생성된 접합체가 질량 분광계에서 날아갈 수 없음을 시사하였다. 항체 접합체와 대조적으로, DBCO-PEG4:Fab'의 스펙트럼은 경쇄에 대한 일부 접합이 24785.4 (+ 674.1 Da, 예측된 MW + 674.7 Da)에서 작은 피크의 존재에 의해 발생하였음을 나타냈다.
RLuc8 - 항FLAG 항체 접합체의 제조: 아지도-PEG8-유도체의 대략 2/3를 DBCO-PEG4-유도체화 항-FLAG 항체에 첨가하였다. 생성된 각각의 혼합물을 4℃에서 54 h 동안 반응시킨 후 PBS로 평형화된 Superdex 200 10/300 증가 겔 여과 컬럼 (GE Healthcare) 상에서 겔 여과로 정제하였다.
아지도-PEG8-유도체화 RLuc8 및 DBCO-PEG4-유도체화 항체 반응 혼합물의 용리 크로마토그램의 분석 (데이터는 나타내지 않음)은 원하는 접합체가 약 12 mL에서 작은 숄더로서 용리되었음을 표시하였다. 이 피크는 동일한 조건하에 수득된 항체 (~13.5 mL의 용리 피크), 또는 RLuc8 (~16.5 mL의 용리 피크)의 크로마토그램에 존재하지 않는다.
RLuc8 - 항Fab ' 접합체의 제조: 남은 아지도-PEG8-유도체화 RLuc8을 DBCO-PEG4-Fab'에 첨가하였다. 생성된 각각의 혼합물을 4℃에서 54 h 동안 반응시킨 후 겔 여과로 정제하였다.
아지도-PEG8-유도체화 RLuc8 및 DBCO-PEG4-유도체화 Fab' 반응 혼합물의 용리 크로마토그램의 분석 (데이터는 나타내지 않음)은 RLuc8 (~16.5 mL의 용리 피크) 또는 Fab' (또한 ~16.5 mL의 용리 피크)보다 먼저, 14.5 mL에서 용리된 단백질의 피크를 나타냈다.
실시예 8. 항체:RLuc8 및 Fab': RLuc8 접합체의 BRET 분석
Solulink 및 Click-PEG 링커를 포함하는 항체:RLuc8 및 Fab':RLuc8 접합체를 항체 또는 Fab'에 유리 또는 접합된 BRET 구성성분 RLuc8과 FLAG 펩티드에 접합된 GFP2 사이의 에너지 전달의 효율을 결정하기 위해 시험하였다.
재료 및 방법
FLAG 펩티드 (DYKDDDDK; 서열 번호 7))를 Peptide 2.0 Inc, 미국으로부터 수득하였다. 백색 Optiplate에서, FLAG-GFP2 및 FLAG 펩티드 (다양한 농도)가 있거나 없는 RLuc8 또는 RLuc8 접합체를 PBS로 95 μl의 최종 부피로 만들고 5분 동안 배양하였다. 배양 후, 에탄올 (0.5 nmol) 중 5 μL의 0.1 mM 코엘레테라진 400a (Cayman Chemicals)을 첨가하고 발광/ 형광을 측정하였다. BRET 전달을 첫 번째 위치에 410 nm 방출 필터 및 두 번째 위치에 515 nm 필터가 장착된 동시 이중 방출 광학 장치가 있는 FLUOstar Optima 형광계 (BMG Labtech)를 사용하여 분석하였다.
반응 성분의 첨가 순서가 BRET 비율에 영향을 미치는지 조사하기 위해, 다음 첨가 순서를 시험하였다: (i) RLuc8 접합체 단독; (ii) RLuc8 접합체 + FLAG-GFP2 ; (iii) RLuc8 접합체 +FLAG-GFP2 (5분 동안 배양) 및 FLAG 펩티드 첨가; (iv) RLuc8 접합체 + FLAG 펩티드 (5분 동안 배양) 후 FLAG-GFP2 첨가; (v) 모든 시약 (코엘레테라진 400a 제외)을 동시에 첨가. 생성된 혼합물을 추가 5분 동안 배양하고 에탄올 (0.5 nmol) 중 5 μL의 0.1 mM 코엘레테라진 400a (Cayman Chemicals)을 첨가하였다. 발광/ 형광을 측정하였다. BRET 전달을 첫 번째 위치에 410 nm 방출 필터 및 두 번째 위치에 515 nm 필터가 장착된 동시 이중 방출 광학 장치가 있는 FLUOstar Optima 형광계 (BMG Labtech)를 사용하여 분석하였다. 측정을 위해 0.5s의 통합 시간이 사용되었다.
BRET 비율은 520 nm에서의 광도 대 420 nm에서의 광도의 비율로서 정의된다. BRET 비율을 GFP2 강도 (평균 0 - 5 s)를 RLuc8 강도 (평균 0 - 5 s)로 나누어 계산하였다.
결과
초기 실험은 항체:RLuc8 및 Fab':RLuc8 접합체의 루시퍼라제 활성을 특성화하였다. 항-FLAG Fab'-히드라지노니코틴아미드:RLuc8- 포르밀벤즈아미드 접합체, 항-FLAG mAb-dPEG4-DBCO:RLuc8:dPEG8아지드 접합체 및 항-FLAG Fab'-dPEG4-DBCO:RLuc8:dPEG8아지드 접합체는 코엘레테라진 400a가 첨가될 때 루시퍼라제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다 (데이터는 나타내지 않음). 항-FLAG Fab'- 히드라지노니코틴아미드:RLuc8- 포르밀벤즈아미드 접합체를 FLAG-GFP2의 첨가 없이 시험하지 않았다.
유리 FLAG 펩티드의 첨가 전 항-FLAG 접합체와 FLAG-GFP2의 배양은 Solulink 링커에 대해 0.42 및 Click/PEG-연결된 접합체에 대해 0.32의 BRET 비율을 초래하였다. 유리 FLAG 펩티드의 첨가 전 항-Fab' 접합체와 FLAG-GFP2의 배양은 Solulink 링커에 대해 0.17 및 Click/PEG-연결된 접합체에 대해 0.11의 BRET 비율을 초래하였다. 항체 기반 접합체는 상응하는 Fab' 기반 대응물보다 훨씬 더 높은 BRET 비율을 생성하였다 (도 2). 코엘레테라진 400a의 첨가 전 반응 혼합물에 유리 FLAG 펩티드 (850 μM)의 포함은 Click/PEG-연결된 접합체 및 mAb-Solulink-RLuc 접합체에 대한 BRET 비율을 감소시켰다 (도 2). Click/PEG-연결된 접합체를 추가로 조사하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 시약 첨가 순서를 변경하는 것은 표지되지 않은 FLAG 펩티드의 첨가 후 BRET 비율에 거의 영향을 미치지 않았다. 모든 경우에 BRET 비율이 약 22% 감소하였다. 배양 시간을 10분으로 늘리는 것은 100 nM FLAG 펩티드에 대한 반응 (%)에 영향을 미치지 않는다 (데이터는 나타내지 않음). 복합체를 미리 형성하기 위해 5분 동안 FLAG-GFP2와 미리 배양된 항체-Click/PEG-RLuc8에 대한 유리 FLAG 펩티드의 첨가 직후 BRET 비율을 측정하였을 때, BRET 비율은 FLAG 펩티드가 첨가되지 않은 복합체의 경우와 동일한 것으로 밝혀졌다. 그러나, BRET 비율 측정 전에 동일한 미리 형성된 복합체를 유리 FLAG 펩티드와 5분 동안 배양한 경우, 비율은 FLAG-GFP2가 후속 첨가된, 항체-Click/PEG-RLuc8:유리 FLAG 펩티드 복합체의 사전 형성과 동일한 것으로 밝혀져, 항체:FLAG 펩티드:FLAG-GFP2 복합체가 형성되는데 5분이 충분한 시간임을 시사한다. 모든 추가 분석은 시약을 동시에 첨가하고 5분 동안 배양하여 수행하였다.
실시예 9. BRET 비율에 대한 링커 길이의 영향
재료 및 방법
12 - 60 PEG 단위로 이루어진 링커를 갖는 일련의 항체:RLuc8 및 Fab':RLuc8 접합체를 생성하였다. 간단하게, 단백질 및 접합체가 PBS로 평형화된 Superdex S200 16/60 컬럼 (GE Healthcare) 상의 겔 여과에 의해 저 MW 미반응 Click 시약으로부터 분리되기 전에, RLuc8 (3 mL PBS 중 165 nmol)을 2 당량의 아지도-dPEG8-NHS 에스테르, 아지도-dPEG24-TFP 에스테르 또는 아지도-dPEG36-TFP 에스테르 (Quanta Biodesign)와 4℃에서 64 h 동안 혼합하지 않고 반응시켰다.
단백질 및 접합체가 PBS로 평형화된 Superdex S200 16/60 컬럼 (GE Healthcare) 상의 겔 여과에 의해 과량의 저 MW Click 시약으로부터 분리되기 전에, 부분적으로 환원된 항-FLAG 항체 (3 mL PBS 중 84 nmol) 또는 Fab' (3 mL PBS 중 16 nmol)를 2 당량의 DBCO-dPEG4-Mal, DBCO-dPEG12-Mal 또는 DBCO-dPEG24-Mal (Quanta Biodesign)와 4℃에서 64 h 동안 혼합하지 않고 반응시켰다. 항체 또는 항체 단편으로의 DBCO 혼입 정도는 309 nm (ε309 nm = 12000 M-1cm- 1)에서 접합체의 흡광도로부터 mAb에 대해 0.9 - 1.0 및 Fab'에 대해 1.5 - 1.6인 것으로 추정되었다.
접합 반응은 이의 제한된 가용성으로 인해 아지도-PEGn-유도체화 RLuc8과 대략 등몰량의 DBCO-PEGm-유도체화 항체, 또는 0.25 - 0.4 몰당량의 DBCO-PEGm-유도체화 Fab' 사이에　설정되었다. SDS-PAGE로 분석하기 전에 4℃에서 40 h 동안 반응물을 배양하였다. 다량의 출발 물질이 반응하지 않고 남아 있기 때문에, 반응 혼합물을 농축하고 접합체가 겔 여과에 의해 단리되기 전에 추가 1주일 동안 진행한 다음 SDS-PAGE로 분석하였다. SDS-PAGE 분석은 접합이 중쇄에서만 발생함을 나타냈다 (데이터는 나타내지 않음). 정제된 접합체의 농도를 분광학적으로 추정하였다.
정제된 접합체를 실시예 8에 기술된 BRET 분석에서 사용하였다. 50 μL 에탄올 중 1 mM 코엘레테라진 400a의 용액을 제조하고, 0.5 μL를 최종 분석에 첨가하는 것을 제외하고 이전과 같이 BRET 전달을 측정하였다. BRET 비율은 적절하게, 50 nM 항체- 또는 Fab'-RLuc8 접합체, 100 또는 200 nM FLAG-GFP2 및 FLAG 펩티드를 사용하여 결정하였다. 반응 혼합물은 PBS로 부피를 구성하였다. 코엘레테라진 400a를 첨가한 후의 최종 반응 부피는 100 μL이었다.
1 mM 코엘레테라진 400a의 용액을 50 μL의 에탄올에서 제조하고, 0.5 μL를 최종 분석에 첨가하는 것을 제외하고 실시예 8에 기술된 바와 같이 BRET 분석을 수행하였다.
결과
가변 길이-PEG 링커의 효과를 조사하기 위해, BRET 비율은 각각의 항체-Click/PEG-RLuc8 접합체 단독 (50 nM) 또는 100 또는 200 nM FLAG-GFP2, 또는 200 nM FLAG-GFP2 및 1 μM FLAG 펩티드에 대해 결정되었다. 항체-Click/PEG-RLuc8 접합체에 대한 BRET 비율은 FLAG-GFP2의 부재하에 0.05에서 100 nM FLAG-GFP2의 존재하에 대략 0.2로 증가하였고, 200 nM FLAG-GFP2의 존재하에 0.25로 추가로 증가하였다 (도 4a). 1 μM FLAG 펩티드의 존재하에, 비율은 대략 절반으로 떨어졌고, FLAG 펩티드가 항체:RLuc8 접합체에 대해 FLAG-GFP2와 경쟁할 수 있음을 나타낸다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 상이한 길이의 PEG 링커에 대해 BRET 비율의 약간의 변이가 있었다. 따라서, 200 nM FLAG-GFP2의 존재하에 BRET 비율이 약간 증가하였고 12 내지 60의 PEG 링커 길이에 대해, 각각 0.23 내지 0.27로 BRET 비율이 증가하였다. 이는 1 μM FLAG 펩티드에 대한 반응 증가를 동반하였고 반응은 12-PEG 링커에서 45 %부터 60-PEG 링커에서 51 %까지로 증가하였다.
Fab'-PEG-RLuc8 접합체에 대해서도 유사한 효과가 발견되어, Fab'-RLuc8 및 FLAG-GFP2의 BRET 비율은 항체 기반 대응물에 대한 비율보다 작았지만, FLAG 펩티드의 존재하에 BRET 비율 감소가 또한 관찰되었고 (도 4b), Fab'-RLuc8 접합체 및 FLAG-GFP2가 또한 FLAG 펩티드에 대한 센서로서 사용될 수 있음을 나타냈다.
실시예 10. 면역센서를 사용하여 분석물 농도를 결정하는 경쟁 결합 분석
재료 및 방법
본 발명의 면역센서가 분석물의 농도를 검출하고 측정할 수 있는지를 결정하기 위해, 항체-12/36-RLuc8 접합체를 코엘레테라진 400a를 첨가하기 전에 5분 동안 200 nM FLAG-GFP2 및 다양한 농도의 FLAG 펩티드 (256 μM 내지 0.5 nM 미만)와 배양하고 BRET 비율을 실시예 9에 기술된 바와 같이 Fluorostar 플레이트 판독기를 사용하여 결정하였다. BRET 비율을 로그[FLAG] 값에 대해 플롯팅하였다.
또한 Clariostar 플레이트 판독기 (BMG) 및 항체-24/36-RLuc8 접합체를 사용하여 보정을 수행하였다. 생물발광 모드에서 측정이 이루어졌고 이중 선형 가변 필터를 RLuc8 방출에 대해 410-80 (Gain: 3300) 및 GFP2 방출에 대해 515-30 (Gain: 4095)로 설정하였다. 1.54 s의 통합 시간이 사용되었다. 코엘레테라진 400a는 100 μL 에탄올을 건조된 분취량 (0.5 mM)에 첨가하여 제조하고, 1 μL를 최종 분석에 첨가하여 5 μM의 최종 농도를 제공하였다. 최종 농도 5 nM의 RLuc8-접합체 및 10 nM GFP2-FLAG를 분석에 사용하였다. 최종 분석 부피는 부피를 구성하는 데 사용된 PBS (BSA (1 mg/ml)를 포함)를 사용하여 100 μL이었다.
Clariostar를 사용하여 표준 곡선을 구성하기 위해, 5 nM mAb-24/36-RLuc8 접합체를 BSA (1 mg/mL)가 있는 PBS 중 10 nM FLAG-GFP2에 첨가하였고 혼합물을 28℃에서 5분 동안 표지되지 않은 FLAG 펩티드 (다양한 농도)와 배양하였다. 코엘레테라진 400a를 첨가하고 BRET 반응을 측정하였다. BRET 비율을 RLuc8 강도 (평균 0 - 13.86 s)로 GFP2 강도 (평균 0 - 13.86 s)를 나누어 계산하였다. BRET 비율을 윈도우용 Graphpad Prism 7의 정규화 기능을 사용하여 정규화하고, 로그 [FLAG] 값에 대해 플롯팅하고 로그 [작용제] 대 정규화된 응답 - 가변 기울기 모델로 피팅하였다.
결과
Fluorostar 플레이트 판독기로 측정한 도 5에 나타낸 바와 같이, BRET 비율은 FLAG 펩티드의 농도에 의존적이다. 이는 FLAG-GFP2의 존재하에, 항체-12/36-RLuc8이 시료에서 FLAG 펩티드의 양을 결정하기 위해 사용될 수 있음을 시사한다. 곡선의 변곡점은 항체:FLAG 상호작용에 대한 Kd에 대략 상응한다 (180 nM, Hong 등, 2011).
항체 24/36-RLuc8 접합체와 함께 Clariostar 플레이트 판독기를 사용하여 결정된 보정 곡선을 도 6에 나타낸다. EC50는 1.41　nM의 FLAG 펩티드인 것으로 계산되었다. 반응은 5분 배양에서 4.16 pM (공백 ± SD *3)의 검출 한계를 갖고 5.41 pM (90 %)과 0.37 μM (10 %) 사이에서 선형이었다. 이에 비해, 반딧불이/Cy3.5 BRET 시스템을 기반으로 하는 BRET 분석의 검출 한계는 0.2 μM이었고 (Yamakawa 등, 2002) GreenLuc/AF610 BRET 시스템을 기반으로 하는 BRET 분석의 검출 한계는 1.7 nM이었다 (Smirnova 등, 2016). 이는 표 4에 요약되어 있다.
초기 연구 (Hong 등, 2011)]에서 FLAG-항-FLAG 상호작용에 대한 Kd는 전체 항체에 대해 180 nM, 및 PEG화 Fab'에 대해 ~ 390 nM인 것으로 밝혀졌다. Fluorostar 플레이트 판독기를 사용하여 수행된 분석, 상이한 접합체 (mAb-12/36-RLuc8) 및 더 높은 농도 (20 Х)의 mAb-PEG-RLuc8 접합체는 274 nM의 EC50를 유발하였고 이 경우 반응은 32.4 nM - 2.3 μM 사이에서 선형이었다 (최대 반응의 90% - 10 %) (도 5).
결론적으로, 본원에 기술된 면역센서 및 방법은 저분자량 항원 분석의 감도를 300배 증가시키고 이전에 발표된 데이터 (20 - 60분)에 비해 분석 시간을 5분으로 줄였다.
표 4. mAb를 사용하는 BRET 기반 경쟁 면역분석에 대한 분석 매개변수의 비교. RLuc = 레닐라 루시퍼라제, FFLuc = 반딧불이 루시퍼라제, GFP = 녹색 형광 단백질, Cy = 시아닌, AF = Alexafluor. 선형 범위 = 최대 반응의 90 - 10 %이고 검출 한계는 공백 신호 (100 %) ± 3 Х SD. * L. 밍그렐리카 루시퍼라제의 녹색 변이체 **본원에 개시된 방법.
Figure pct00024
실시예 11. FLAG- GFP 2 - PEG4 - DBCO - 아지도 - PEG8 -암피실린의 합성
재료 및 방법
암피실린- PEG8 -N 3 의 합성: PBS (pH 8.0, 1 mL) 중 암피실린의 나트륨염 (4.8 mg, 0.0128 mmol)의 교반된 용액에 PBS (pH 8.0, 1 mL) 중 NHS-PEG8-N3의 용액 (Quanta Biodesign #10503; N-히드록시숙신이미드 에스테르 (폴리에틸렌 글리콜8)아지드)를 첨가하고 이를 25℃에서, 16 h 동안 교반하고 빛으로부터 보호하였다. 반응 혼합물을 0.22 μM 아크로디스크 필터를 통해 여과한 다음 분취 HPLC로 정제하였다 (역상 C18 컬럼 (Gilson HPLC), 16분에 걸쳐 용리 0-80% B (용리 용매: A = H2O 중 0.1 % TFA; B = 아세토니트릴 중 0.1 % TFA), 214 nm에서 검출). 17분에 분획을 합치고 진공에서 건조될 때까지 감소시켰다. 합친 분획 (8 mg, 68.8 % 수율)을 분석 LC-MS로 분석하였다 ((Waters Alliance aHPLC, C18 역상, QDa 질량 검출기) 구배 용리 0-80% B, 214 nm에서 검출). aHPLC의 4.09분에서 주요 피크는 797.40 ESI -ve 이온 모드의 MS를 제공하였다 (M = 798.91).
FLAG- GFP 2 -암피실린의 합성 : FLAG-GFP2 (실시예 1)를 PBS로 탈염하였다. 20, 30 또는 40 nmol DBCO-dPEG4-TFP 에스테르 (Quanta Biodesign)를 20 nmol 단백질에 첨가하고 혼합물을 4℃에서 밤새 반응시켰다. 반응 혼합물을 질량 분광분석법으로 분석한 다음 풀링하였다. 과량의 (1.9 μmol) 암피실린-PEG8-N3를 56 nmol GFP2-PEG4-DBCO 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응을 4℃에서 밤새 진행시킨 후 겔 여과로 정제하고 단백질 풀을 질량 분광분석법으로 분석하였다.
결과
FLAG-GFP2와 DBCO-dPEG4-TFP 에스테르의 반응은 비접합 단백질의 혼합물, 및 1, 1.5 또는 2 당량의 DBCO-PEG4-TFP 에스테르와 반응에서 DBCO-PEG4의 1개 또는 2개의 부가물을 갖는 접합체를 생성하는 것으로 밝혀졌다 (데이터는 나타내지 않음). 3가지 반응의 생성물이 유사하므로, 이를 합하여 암피실린-PEG8-N3과 반응시켰다. 질량 분광계 분석은 미반응 FLAG-GFP2의 혼합물, 및 1개 또는 2개의 부가물의 혼합물 (+1365.8, 예측 + 1348.6)을 나타냈다.
실시예 12. 나노바디 - Rluc8의 제조
분자 생물학: 단일 도메인 낙타류 나노바디 VHH T9 (T9-NB1; Tabares-da Rosa 등, 2011)를 암호화하는 코돈 최적화된 DNA 서열 (대장균에서의 발현용)은 GenScript USA Inc (Piscataway, New Jersey, USA)에 의해 합성되었다. 이는 N-말단 헥사히스티딘 태그에 이어서 담배 식각 바이러스 프로테아제 (TEV) 절단 부위, T9-NB1 서열, RLuc8 서열 및 SortaseA 생체접합 서열 (LPETGG)을 암호화도록 설계된 변형된 pET43a 대장균 발현 벡터에 결찰되었다. 생성된 단백질 서열은 서열 번호 8에 제공된 것과 같다.
단백질 발현: 재조합 N-His-T9-NB1-RLuc8 단백질을 생산하기 위해, 발현 플라스미드를 대장균 BL21 DE3 균주로 형질전환하고 0.7의 OD600에 도달할 때까지 100 μg/ml 암피실린이 보충된 1 L 부피의 TB에서 37℃에서 진탕하며 성장시켰다. 배양물을 16℃로 옮기고 단백질 발현을 최종 농도 0.5 mM로 IPTG를 첨가하여 유도하고 배양물을 추가 16시간 동안 진탕 배양하였다. 발현 후, 세포 배양물을 20분 동안 5000 x g에서 원심분리하고 세포 펠렛을 -20℃에서 냉동 보관하였다.
단백질 정제: 단백질 정제는 세포 1 g 당 완충액 5 ml의 비율을 사용하여 용해 완충액 (25 mM 트리스-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10 mM 이미다졸, 0.5 mg/ml 리소자임, 벤조나제 엔드뉴클레아제 [EMD Millipore], 1 mM PMSF, EDTA가 없는 완전 프로테아제 억제제 정제 [Roche])에서 세포 펠렛을 해동하여 개시하였다. 세포 얼음 냉각된 Avestin C5 세포 분쇄기를 통해 3회 통과시켜 추가로 용해시킨 다음 4oC에서 48,000 x g에서 원심분리하였다. 상청액 (세포 용해물)을 5 μm 필터를 통해 여과하고 Profinia 친화도 크로마토그래피 정제 시스템 (Bio-Rad)을 사용하여 IMAC 세척 완충액 1 (25 mM 트리스-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸)로 미리 평형화된 1 ml HiTrap IMAC 세파로스 FF 컬럼 (GE Healthcare)에 적용하였다. 그런 다음 IMAC 컬럼을 IMAC 세척 완충액 1 및 IMAC 세척 완충액 2 (25 mM 트리스-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸)로 순차적으로 세척하였다. 세척 후, 결합된 단백질을 IMAC 용리 완충액 (25 mM 트리스-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 350 mM 이미다졸)으로 용리하였다.
N-말단 헥사히스티딘 태그를 제거하고 또한 이미다졸 농도를 20 mM로 감소시키기 위해, 용리된 단백질을 1　mM DTT가 보충된 IMAC 세척 완충액 2에 투석하는 동안 Spectra/Por 투석막 (MWCO 3500Da)에서 20:1의 단백질 대 프로테아제 몰 비로 4oC에서 밤새 TEV 프로테아제와 배양하였다. 그런 다음 투석된 소화 반응물을 his 태그된 TEV 프로테아제 및 절단된 헥사히스티딘 태그를 포획하기 위해 1　ml HiTrap IMAC 세파로스 FF 컬럼에 통과시켰다. 이후에 컬럼을 IMAC 세척 완충액 2로 2회 세척하고 결합되지 않은 분획 및 제1 IMAC 세척액 (태그되지 않은 T9-NB1-rLuc8을 함유함)을 풀링하였다. 풀링된 분획을 Amicon Ultra 원심분리 필터 유닛 (Ultra-15 MWCO 10)을 사용하여 농축하고 1xPBS에서 미리 평형화된 HiLoad 16/60 Superdex 200 컬럼에 로딩하였다. 적절한 피크를 수집하고 그런 다음 단백질을 0.28mg/ml로 농축한 후 액체 질소에서 급속 동결하고 -70oC에서 보관하였다.
실시예 13. TCC-4'-S-(CH 2 ) 2 -CO- GFP 2 의 합성
개요: 표시되지 않는 한, 모든 시약 및 용매는 상업적 공급체에서 구입하여 받은 대로 사용하였다. 메틸 3-[(4-아미노페닐)설파닐] 프로파노에이트는 ChemSpace에 의해 맞춤 합성되었고 받은 대로 사용하였다. 분석 LC-MS는 QDa ESI 질량 분광계 검출기, 용매 (용매 A: 물 중 0.1% TFA; 용매 B: 아세토니트릴; 실행 시간 11분, 구배 20-80% B)를 사용하여 Waters Alliance HPLC에서 수행하였다.
TCC-4'-S-(CH 2 ) 2 - CO 2 H의 합성:
Figure pct00025
무수 테프라히드로푸란 (8 mL) 중 3,4-디클로로페닐 이소시아네이트 (124.1 mg, 0.66 mmol)와 메틸 3-[(4-아미노페닐)설파닐]프로파노에이트 (139.5 mg, 0.66 mmol)의 혼합물을 실온에서 16 h 동안 질소 분위기에서 교반하였다. 휘발성 물질을 감압 하에 제거하고, 잔류물을 헥산/에틸 아세테이트 (1:1, 10 mL)로 세척하고, 나머지 백색 고체를 감압 하에 건조시켰다. 분석 LC-MS는 7.132분에서 단일 깨끗한 피크를 나타냈다 (ESI-MS +ve 모드, A = 214 nm); MS 예상된 MW 399.29, 실측 399.08.
Figure pct00026
메틸 4-[3-(3,4-디클로로페닐)우레이도]페닐티오프로피오네이트 (264 mg, 0.66 mmol)에 메탄올 (15 mL)에 이어 1M NaOH (aq.) (15 mL)를 첨가하였다. 현탁액을 16시간 동안 60℃로 가열하였다. 실온으로 냉각한 후, 혼합물을 0℃에서, 6 M HCl를 사용하여 pH 4.0으로 산성화하였다. 현탁액을 에틸 아세테이트/헥산 (1:1, 50 mL)으로 2회 추출하고, 합한 유기 추출물을 무수 황산나트륨 상에서 건조시킨 다음, 감압 하에서 휘발성 물질을 제거하여 4{3-(3,4-디클로로페닐)우레이도]페닐티오프로피온산 [TCC-4'-S-(CH2)2-CO2H]을 백색 고체로 수득하였다. 분석 LC-MS는 6.434 분에서 단일 깨끗한 피크를 나타냈다 (ESI-MS +ve 모드, A = 214nm); MS 예상된 MW 385.26, 실측 385.01.
TCC-4'-S-(CH 2 ) 2 -CO- GFP 2 의 합성: TCC-4'-S-(CH2)2-CO2H (2 mg)를 PBS (pH 7.4, 700 μL) 및 135 μL DMSO의 혼합물에 용해시켰다. 그런 다음 이 용액을 실온에서, PBS 중 FLAG-GFP2의 용액 (pH 7.4, 1.40 mg/mL, 1.25 mL, 1.75 mg)에 첨가하였다. 별도로, EDC (10 mg)를 1 mL PBS (pH 7.4)에 용해시키고 술포-NHS (10 mg)를 1 mL PBS (pH 7.4)에 용해시켰다. 100 μL의 EDC 용액 및 100 μL의 sNHS 용액을 GFP2/TCC-4'-S-(CH2)2-CO2H 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서, 부드럽게 회전시키면서 16시간 동안 교반하였다. TCC-4'-S-(CH2)2-CO-GFP2 접합체를 GE Healthcare 프로토콜에 따라 PD-10 컬럼을 사용하여 정제하여 2.84 mg/mL에서 3.5 mL의 TCC-4'-S-(CH2)2-CO-GFP2 접합체를 수득하였다.
실시예 14: BRET 센서를 사용한 소분자의 검출
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법 및 면역센서는 소분자, 예를 들어 TCC를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 도 7은 본원에 기술된 예시된 면역센서에 소분자의 첨가가 표지된 항원 대신에 나노바디에 대한 표지되지 않은, 항원의 경쟁적 결합으로 인한 BRET 비율 감소를 초래하는 개략적인 경쟁 분석을 나타낸다.
계측: 동시 이중 방출 BRET 측정을 CLARIOstar 마이크로플레이트 판독기 (BMG LabTech)으로 수행하였다. BRET2 측정은 RLuc/CLZ400a 방출 필터 (410 nm 주파수폭, 80 nm) 및 GFP2 방출 필터 (515 nm 주파수폭, 30 nm)를 포함하는 BRET2 방출 필터 세트를 사용하였다. BRET2 비율을 통합된 공여자 방출 채널 강도에 대한 통합된 수용자 방출 채널 강도의 비율로서 계산하였다.
BRET 2 분석: 모든 반응을 백색 96-웰 플레이트 (Perkin-Elmer, 오스트레일리아)에서 수행하였다. 최종 농도 10 nM의 T9NB1-RLuc8 및 10 nM의 TCC-4'-S-(CH2)2-CO-GFP2를 PBS 중 100 μL 2% DMSO의 최종 부피로 모든 분석에서 사용하였다.
보정 곡선을 구성하기 위해, 10 nM의 T9NB1-RLuc8 및 10 nM의 TCC-4'-S-(CH2)2-CO-GFP2를 TCC의 상이한 최종 농도의 범위, 즉 1, 3, 6.3, 12.5, 25, 50, 100 및 200 nM로 22℃에서 5분 동안 배양하고, DMSO 중 TCC의 스톡 또는 DMSO 단독 (PBS 중 2% 최종 농도)으로부터 첨가하였다. 배양 시간의 끝에, EtOH 중 1 μL의 코엘레테라진 400a (1 mM 스톡)를 반응 혼합물 (최종 [CLZ400a] = 10 μM)에 첨가하고 발광 강도를 즉시 기록하였다. BRET2 비율을 계산하였고 도 8에서 TCC의 농도 함수로서 나타낸다. 표적 TCC 항원의 존재하에 센서 작제물의 BRET2 비율의 용량 의존적 변화는 17.3　nM의 EC50 값으로 관찰되었다.
최종 농도 10 nM T9NB1-RLuc8 단독, 10 nM의 TCC-4'-S-(CH2)2-CO-GFP2를 갖는 10 nM T9NB1-RLuc8 또는 10 nM GFP2를 갖는 10 nM T9NB1-RLuc8을 PBS 중 100 μL 2% DMSO의 최종 부피로, 대조군 분석을 위해 사용하였다. 대조군 분석의 경우, 정제된 단백질을 22℃에서 5분 동안 배양하였다. 배양 시간의 끝에, EtOH 중 1 μL의 코엘레테라진 400a (1 mM 스톡)를 반응 혼합물 (최종 [CLZ400a] = 10 μM)에 첨가하고 발광 강도를 즉시 기록하였다. BRET2 비율을 계산하였고 도 9에 나타낸 바와 같다.
본 출원은 2019년 5월 1일 출원된 호주 출원 번호 2019901483 및 2019년 5월 8일 출원된 호주 출원 번호 2019901566으로부터 우선권을 주장하고, 그 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
당업자는 광범위하게 기술된 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 특정 구현예에 나타낸 바와 같이 본 발명에 다양한 변형 및/또는 수정이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 본 구현예는, 따라서, 모든 면에서 예시적인 것으로 간주되어야하고 제한적인 것은 아니다.
본원에서 논의 및/또는 참조된 모든 간행물은 그 전체가 본원에 포함된다.
본 명세서에 포함된 문서, 행위, 자료, 장치, 물품 등에 대한 모든 논의는 오로지 본 발명의 맥락을 제공하기 위한 것이다. 이들 문제 중 일부 또는 전부가 본 출원의 각 청구항의 우선일 이전에 존재했던 바와 같이 본 발명과 관련된 분야에서 선행 기술 기반의 일부를 형성하거나 일반적인 일반 지식이었다는 것을 인정하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
REFERENCES
Figure pct00027
SEQUENCE LISTING <110> Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation <120> Immunosensors <130> 529697PCT <150> AU2019901483 <151> 2019-05-01 <150> AU2019901566 <151> 2019-05-08 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 1 Trp Ala Leu Gln Arg Pro His 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 2 Trp Glu Leu Gln Arg Pro Tyr 1 5 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> X is any amino acid <400> 3 Leu Pro Xaa Thr 1 <210> 4 <211> 365 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG-GFP2 <400> 4 Met Gly His His His His His His Gly Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 1 5 10 15 Ser Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys 20 25 30 Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly 35 40 45 Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg 50 55 60 Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu 65 70 75 80 Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu 85 90 95 Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln 100 105 110 Ile Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Val 115 120 125 Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu 130 135 140 Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly 145 150 155 160 Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr 165 170 175 Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Ser 180 185 190 Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His 195 200 205 Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr 210 215 220 Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys 225 230 235 240 Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp 245 250 255 Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr 260 265 270 Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile 275 280 285 Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln 290 295 300 Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val 305 310 315 320 Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys 325 330 335 Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr 340 345 350 Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 355 360 365 <210> 5 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-His-RLuc8 <400> 5 Met Gly His His His His His His Gly Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 1 5 10 15 Gly Ser Ala Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile 20 25 30 Thr Gly Pro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp 35 40 45 Ser Phe Ile Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val 50 55 60 Ile Phe Leu His Gly Asn Ala Thr Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His Val 65 70 75 80 Val Pro His Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu Ile 85 90 95 Gly Met Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu 100 105 110 Asp His Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro 115 120 125 Lys Lys Ile Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Ala Leu Ala Phe 130 135 140 His Tyr Ala Tyr Glu His Gln Asp Arg Ile Lys Ala Ile Val His Met 145 150 155 160 Glu Ser Val Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp Ile 165 170 175 Glu Glu Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met Val 180 185 190 Leu Glu Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Val Leu Pro Ser Lys Ile Met 195 200 205 Arg Lys Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys 210 215 220 Glu Lys Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile 225 230 235 240 Pro Leu Val Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn 245 250 255 Tyr Asn Ala Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Leu Phe Ile 260 265 270 Glu Ser Asp Pro Gly Phe Phe Ser Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys 275 280 285 Lys Phe Pro Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Leu 290 295 300 Gln Glu Asp Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val 305 310 315 320 Glu Arg Val Leu Lys Asn Glu Gln Leu Pro Glu Thr Gly Gly Ala Ala 325 330 335 Leu Glu Ala Ser 340 <210> 6 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG-RLuc8 <400> 6 Met Gly His His His His His His Gly Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 1 5 10 15 Ser Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys 20 25 30 Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly 35 40 45 Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg 50 55 60 Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu 65 70 75 80 Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu 85 90 95 Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln 100 105 110 Ile Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Ala 115 120 125 Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile Thr Gly Pro 130 135 140 Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp Ser Phe Ile 145 150 155 160 Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val Ile Phe Leu 165 170 175 His Gly Asn Ala Thr Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His Val Val Pro His 180 185 190 Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu Ile Gly Met Gly 195 200 205 Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu Asp His Tyr 210 215 220 Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro Lys Lys Ile 225 230 235 240 Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Ala Leu Ala Phe His Tyr Ala 245 250 255 Tyr Glu His Gln Asp Arg Ile Lys Ala Ile Val His Met Glu Ser Val 260 265 270 Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp Ile Glu Glu Asp 275 280 285 Ile Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met Val Leu Glu Asn 290 295 300 Asn Phe Phe Val Glu Thr Val Leu Pro Ser Lys Ile Met Arg Lys Leu 305 310 315 320 Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys Glu Lys Gly 325 330 335 Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile Pro Leu Val 340 345 350 Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn Tyr Asn Ala 355 360 365 Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Leu Phe Ile Glu Ser Asp 370 375 380 Pro Gly Phe Phe Ser Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys Lys Phe Pro 385 390 395 400 Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Leu Gln Glu Asp 405 410 415 Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val Glu Arg Val 420 425 430 Leu Lys Asn Glu Gln Leu Pro Glu Thr Gly Gly Ala Ala Leu Glu Ala 435 440 445 Ser <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG peptide <400> 7 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 8 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanobody Sensor <400> 8 Met Gly His His His His His His Gly Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 1 5 10 15 Ser Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr 20 25 30 Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Tyr Thr 35 40 45 Pro Tyr Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu 50 55 60 Phe Val Ala Gly Ile Gly Gly Ile Asp Gly Thr Ala Ala Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Val Arg Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Lys Thr 85 90 95 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Ser Cys Ala Thr Arg Ala Ser Met Gln Val Leu Thr Ser Pro Arg Val 115 120 125 Tyr Pro Ile Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Ser 130 135 140 Ala Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile Thr Gly 145 150 155 160 Pro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp Ser Phe 165 170 175 Ile Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val Ile Phe 180 185 190 Leu His Gly Asn Ala Thr Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His Val Val Pro 195 200 205 His Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu Ile Gly Met 210 215 220 Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu Asp His 225 230 235 240 Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro Lys Lys 245 250 255 Ile Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Ala Leu Ala Phe His Tyr 260 265 270 Ala Tyr Glu His Gln Asp Arg Ile Lys Ala Ile Val His Met Glu Ser 275 280 285 Val Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp Ile Glu Glu 290 295 300 Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met Val Leu Glu 305 310 315 320 Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Val Leu Pro Ser Lys Ile Met Arg Lys 325 330 335 Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys Glu Lys 340 345 350 Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile Pro Leu 355 360 365 Val Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn Tyr Asn 370 375 380 Ala Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Leu Phe Ile Glu Ser 385 390 395 400 Asp Pro Gly Phe Phe Ser Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys Lys Phe 405 410 415 Pro Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Leu Gln Glu 420 425 430 Asp Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val Glu Arg 435 440 445 Val Leu Lys Asn Glu Gln Leu Pro Glu Thr Gly Gly Ala Ala Leu Glu 450 455 460 Ala Ser 465

Claims (69)

  1. 시료에서 분석물을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
    i) 시료를
    화학발광 공명 에너지 전달 (CRET) 쌍의 제1 구성성분에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자; 및
    CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원와 접촉시키는 단계로,
    여기서, 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때, CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 10 내지 75%의 범위인 단계; 및
    ii) CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율이 시료의 존재하에 변경되었는지 여부를 결정하는 단계로,
    여기서 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율의 감소는 분석물이 시료에 존재한다는 것을 표시하는 것인 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CRET 쌍의 제1 구성성분은 폴리펩티드이고 CRET 쌍의 제2 구성성분은 폴리펩티드인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CRET 쌍의 제1 구성성분은 BRET 공여자 도메인을 포함하고 CRET 쌍의 제2 구성성분은 BRET 수용자 도메인을 포함하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CRET 쌍의 제1 구성성분은 BRET 수용자 도메인을 포함하고 CRET 쌍의 제2 구성성분은 BRET 공여자 도메인을 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자가 링커를 통해 CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착되는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 링커가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 사슬, 탄화수소 사슬, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 링커가 PEG10 내지 PEG60을 포함하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 링커가 PEGn-L-PEGm을 포함하고, 여기서 m 및 n은 독립적으로 0 내지 40의 정수이고 L은 접합 요소인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때, 제1 구성성분에서 제2 구성성분으로의 에너지 전달의 효율은 15 내지 65%의 범위인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CRET 쌍의 제1 구성성분은 항체 또는 항체 유사 분자의 항원 결합 부위에 부착되지 않는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자와 CRET 쌍의 제1 구성성분 사이의 부착은 부위 특이적인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CRET 쌍의 제1 구성성분은 항체 또는 항체 유사 분자의 잔기의 측쇄에 부착되는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 잔기가 시스테인인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 잔기가 사슬 내 이황화 결합에 관여하는 시스테인인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 잔기가 항체 또는 항체 유사 분자의 힌지 영역의 시스테인이거나 잔기가 중쇄-경쇄 이황화 결합 또는 둘의 조합에 관여하는 시스테인인 방법.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CRET 쌍의 제1 구성성분은 탄수화물 모이어티를 통해 항체 또는 항체 유사 분자에 부착되는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자가 동일한 CRET 쌍의 2개의 제1 구성성분을 갖는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자가 IgG, IgA, IgM, IgE, 단일클론 항체, Fab', rIgG (반항체), f(ab')2, 나노바디, 아피바디, 안티칼린, DARPin, 모노바디, 아비머, 마이크로바디, 키메라 항체, scFv, scFv 다량체, 단일 도메인 항체 또는 단일 도메인 융합 항체인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자가 IgG, Fab', rIgG (반항체) 또는 f(ab')2인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자가 IgG인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자가 단일클론 항체인 방법.
  22. 제18항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자가 나노바디인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석물은 작은 유기 분자, 약물, 약물 대사산물, 항생제, 호르몬, 알레르겐, 펩티드, 단백질, 자연 발생 항체, 당, 지질 또는 핵산인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분이 루시퍼라제, β-갈락토시다제, 락타마제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-글루쿠로니다제 또는 β-글루코시다제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생물발광 단백질인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 생물발광 단백질은 레닐라 루시퍼라제, 반딧불이 루시퍼라제, 코엘렌테레이트 루시퍼라제, 북미 개똥벌레 루시퍼라제, 방아벌레 루시퍼라제, 딱정벌레 루시퍼라제, 박테리아 루시퍼라제, 가우시아 루시퍼라제, 에쿼린, 아라크노캄파 루시퍼라제, 오플로포러스 크라실리로스트리스 루시퍼라제 또는 이들 중 하나의 생물학적 활성 변이체 또는 단편, 이의 둘 이상의 키메라로 이루어진 그룹으로부터 선택된 루시퍼라제인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분은 기질을 변형시킬 수 있는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 기질은 루시페린, 칼슘, 코엘레테라진, 푸리마진 또는 코엘레테라진, 루시페린 또는 푸리마진의 유도체, 유사체 또는 안정화된 유도체인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분이 형광 수용자 도메인인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 형광 수용자 도메인이 녹색 형광 단백질 (GFP), GFP의 청색 형광 변이체 (BFP), GFP의 청록색 형광 변이체 (CFP), GFP의 황색 형광 변이체 (YFP), 강화 GFP (EGFP), 슈퍼폴더 GFP, 아자미 그린, mWasabi, TagGFP, 터보 GFP, AcGFP, ZsGreen, T-Sapphire, 강화 CFP (ECFP), CyPET, AmCyan1, 미도리-이시 그린, TagCFP, mTFP1 (Teal), 강화 YFP (EYFP), GFPS65T, 에메랄드, 비너스, mOrange, 토파즈, mCitrine, YPet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow, mBanana, 쿠사비라 오렌지, 쿠사비라 오렌지 2, mOrange, mOrange2, GFPuv, 불안정화 EGFP (dEGFP), 불안정화 ECFP (dECFP), 불안정화 EYFP (dEYFP), dKeima-탠덤, HcRed, HcRed-탠덤, t-HcRed, DsRed, AQ143, DsRed2, t-dimer2, tdimer2(12), mRFP1, mTangarine, 포실로포린, 레닐라 GFP, 에쿼리아 빅토리아 GFP, 몬스터 GFP, paGFP, 카에데 단백질, tdTomato, mCherry, mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2, JRed, HcRed1, mRaspberry, mPlum, TagRFP, 터보FB 및 R-피코에리트린 (R-PE), B-피코에리트린 (B-PE), C-피코시아닌 (CPC), 알로피코시아닌 (APC) 및 R- 피코시아닌 (RPC)을 포함하는 피코빌리단백질 및 이들 중 어느 하나의 생물학적 활성 변이체 또는 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CRET 쌍의 제1 구성성분은 RLuc8이고 CRET 쌍의 제2 구성성분은 GFP2인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 특이적 결합될 때, 상기 공여자 도메인과 수용자 도메인의 분리 및 상대적 배향이 BRET 쌍의 푀르스터 거리의 ± 50% 이내인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 BRET 쌍의 푀르스터 거리가 약 4 nm 내지 약 18 nm이거나, 약 6 nm 내지 약 12 nm이거나, 약 7.5 nm 내지 10.5 nm인 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (ii)는 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율이 시료의 존재하에 감소되었는지를 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (i)는
    (a) 먼저 시료를 항체 또는 항체 유사 분자와 접촉시킨 다음 생성된 혼합물을 표지된 항원과 접촉시키는 단계;
    (b) 먼저 시료를 표지된 항원과 접촉시킨 다음 생성된 혼합물을 항체 또는 항체 유사 분자와 접촉시키는 단계; 또는
    (c) 시료를 동시에 항체 또는 항체 유사 분자 및 표지된 항원과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 이차 항체가 필요하지 않는 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 시료에서 분석물의 농도를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  37. CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자; 및
    CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원
    을 포함하고, 상기 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율이 10 내지 75%의 범위인, CRET 쌍.
  38. CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착되고
    i) 분석물; 및
    ii) CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원
    에 결합할 수 있으며, 상기 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때 제1 구성성분과 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 10 내지 75%의 범위인, 항체 또는 항체 유사 분자.
  39. 시료에서 분석물을 검출하는 미세유체 시스템으로서, 상기 시스템은
    i) CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자를 함유하기에 적합한 적어도 하나의 저장소,
    ii) CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원을 함유하기에 적합한 적어도 하나의 저장소;
    iii) 하나 이상의 마이크로채널을 포함하는 미세유체 장치,
    iv) 장치에서 항체 또는 항체 유사 분자, 표지된 항원, 시료 및 of the CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분의 기질을 혼합하기 위한 수단,
    v) 항체 또는 항체 유사 분자에 대한 분석물의 결합을 검출하기 위한 반응 챔버, 및
    vi) 전기 광학 감지 장치를 포함하고,
    여기서, 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때, CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 10 내지 75%의 범위이고; 그리고
    여기서 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율의 감소는 분석물이 시료에 존재함을 표시하는 것인 시스템.
  40. 제39항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자는 장치에 고정되지 않는 시스템.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 실시간으로 분석물을 검출하기 위해 사용될 수 있는 시스템.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자, 표지된 항원 및 기질은 상이한 마이크로채널을 통해 장치로 들어가는 시스템.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세유체 장치는 적어도 2개의 입력 마이크로채널을 포함하고, 상기 입력 마이크로채널 중 하나는 항체 또는 항체 유사 분자를 장치 내로 흐르게 하기 위한 것인 시스템.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전기 광학 감지 장치는 적어도 2개의 상이한 파장 채널을 포함하는 시스템.
  45. 제44항에 있어서, 상기 전기 광학 감지 장치는 2개의 상이한 파장 채널을 동시에, 또는 빠르게 연속적으로 검출할 수 있는 시스템.
  46. 제45항에 있어서, 상기 전기 광학 감지 장치는 1초 미만으로 2개의 상이한 파장 채널을 검출할 수 있는 시스템.
  47. 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세유체 장치는 둘 이상의 분석물의 검출을 가능하게 하도록 설계된 시스템.
  48. 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
    i) 상이한 링커 항체 또는 항체 유사 분자를 CRET 쌍의 제1 구성성분에 연결하는 둘 이상의 항체 또는 항체 유사 분자를 수득하는 단계,
    ii) 둘 이상의 항체 또는 항체 유사 분자를 CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원과 접촉시키는 단계,
    iii) CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율을 측정하는 단계, 및
    iv) 표지된 항원에 결합될 때, 10 내지 75%의 범위인 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율을 갖는, 적어도 하나의 항체 또는 항체 유사 분자를 선택하는 단계.
  49. 제48항에 있어서, 상기 단계 iv)는 표지된 항원에 결합될 때, 둘 이상의 항체 또는 항체 유사 분자의 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 더 높은 효율의 에너지 전달을 갖는 항체 또는 항체 유사 분자를 선택하는 것을 포함하는 방법.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 표지된 항원에 결합될 때, 상기 선택된 항체 또는 항체 유사 분자의 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율이 50 내지 75%의 범위인 방법.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
    v) 둘 이상의 표지된 항원을 수득하는 단계, 각각의 표지된 항원은 선택적 링커를 통해 CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 선택된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하고; 상기 둘 이상의 표지된 항원은 (i) 상이한 링커 및/또는 (ii) 상이한 길이의 항원을 포함하고,
    vi) 상기 둘 이상의 표지된 항원을 CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 선택된 항체 또는 항체 유사 분자와 접촉시키는 단계,
    vii) CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율을 측정하는 단계, 및
    viii) 선택된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때, 10 내지 75%의 범위인 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율을 갖는 적어도 하나의 표지된 항원을 선택하는 단계.
  52. 표지된 항원을 확인하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
    i) 둘 이상의 표지된 항원을 수득하는 단계로, 각각의 표지된 항원은 선택적 링커를 통해 CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하고; 상기 둘 이상의 표지된 항원은 (i) 상이한 링커 및/또는 (ii) 상이한 길이의 항원을 포함하는 것인 단계,
    ii) 상기 둘 이상의 표지된 항원을 CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자와 접촉시키는 단계,
    iii) CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율을 측정하는 단계, 및
    iv) 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때, 10 내지 75%의 범위인 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율을 갖는 적어도 하나의 표지된 항원을 선택하는 단계.
  53. 제52항에 있어서, 상기 단계 iv)는 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때, 둘 이상의 표지된 항원의 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 더 높은 효율의 에너지 전달을 갖는 표지된 항원을 선택하는 것을 포함하는 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때 상기 선택된 표지된 항원의 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율이 50 내지 75%의 범위인 방법.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
    v) 항체 또는 항체 유사 분자를 CRET 쌍의 제1 구성성분에 연결하는 상이한 링커를 갖는 둘 이상의 항체 또는 항체 유사 분자를 수득하는 단계,
    vi) 둘 이상의 항체 또는 항체 유사 분자를 선택된 표지된 항원에 접촉시키는 단계,
    vii) CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율을 측정하는 단계, 및
    viii) 선택된 표지된 항원에 결합될 때, 10 내지 75%의 범위인 CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율을 갖는 적어도 하나의 항체 또는 항체 유사 분자를 선택하는 단계.
  56. 시료를 분류하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
    i) 시료를
    a) CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자, 및
    b) CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원
    과 접촉시키는 단계로, 여기서, 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때, 제1 구성성분과 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 10 내지 75%의 범위이고,
    여기서 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 하나 이상의 분석물이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 때 변경되는 것인 단계; 및
    ii) 에너지 전달의 효율의 변화를 기반으로 시료를 분류하는 단계.
  57. 제56항에 있어서, 상기 단계 (ii)는 하기 중 하나 이상 또는 전부를 포함하는 방법:
    A) 전기 광학 감지 장치를 사용하여 CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분에 의한 기질의 변형을 검출하는 단계,
    B) 전기 광학 감지 장치로부터의 적어도 하나의 신호를 처리하고 전기 광학 응답의 패턴과 하나 이상의 관심 시료의 하나 이상의 미리 결정된 특성과 상관시키는 단계, 및
    C) 응답 패턴의 상관관계를 기반으로 시료를 분류하는 단계.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 단계 (i)는 하기 단계를 포함하는 방법:
    A) 하나 이상의 마이크로채널을 포함하는 미세유체 장치를 통해 하기를 흐르게 하는 단계,
    a) 시료,
    b) 항체 또는 항체 유사 분자,
    c) 표지된 항원, 및
    d) CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분의 기질; 및
    B) 장치에서 항체 또는 항체 유사 분자, 표지된 항원, 시료 및 기질을 혼합하는 단계.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 각각 상이한 분석물 및 둘 이상의 상이한 표지된 항원에 결합하는 둘 이상의 상이한 항체 또는 항체 유사 분자를 포함하고, 단계 ii)는 각각의 분석물 또는 분석물의 범위의 존재, 부재 또는 농도를 기반으로 시료를 분류하는 것을 포함하는 방법.
  60. 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 실시간으로 시료를 분류하기 위해 사용될 수 있는 방법.
  61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자는 장치에 고정되지 않는 방법.
  62. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자 및 기질은 상이한 마이크로채널을 통해 장치로 들어가는 방법.
  63. 시료를 분류하는 미세유체 시스템으로서, 상기 시스템은
    i) CRET 쌍의 제1 구성성분에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자를 함유하기에 적합한 적어도 하나의 저장소,
    ii) CRET 쌍의 제2 구성성분에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원을 함유하기에 적합한 적어도 하나의 저장소;
    iii) 하나 이상의 마이크로채널을 포함하는 미세유체 장치,
    iv) 장치에서 항체 또는 항체 유사 분자, 표지된 항원, 시료 및 CRET 쌍의 제1 또는 제2 구성성분의 기질을 혼합하기 위한 수단,
    v) 항체 또는 항체 유사 분자에 대한 분석물의 결합을 검출하기 위한 반응 챔버, 및
    vi) 전기 광학 감지 장치를 포함하고,
    여기서, 표지된 항원이 항체 또는 항체 유사 분자에 결합될 때, CRET 쌍의 제1 구성성분과 CRET 쌍의 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율은 10 내지 75%의 범위이고; 그리고
    여기서 CRET 쌍의 제1 및 제2 구성성분 사이의 에너지 전달의 효율의 감소는 분석물이 시료에 존재함을 표시하는 시스템.
  64. 제63항에 있어서, 각각 상이한 분석물 또는 분석물의 범위 및 둘 이상의 상이한 표지된 항원에 결합하는 둘 이상의 상이한 항체 또는 항체 유사 분자를 포함하는 시스템.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 실시간으로 시료를 분류하는 데 사용될 수 있는 시스템.
  66. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자는 장치에 고정되지 않는 시스템.
  67. 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 유사 분자, 표지된 항원 및 기질이 상이한 마이크로채널을 통해 장치로 들어가는 시스템.
  68. 제63항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세유체 장치는 적어도 2개의 입력 마이크로채널을 포함하고, 여기서 입력 마이크로채널 중 하나는 항체 또는 항체 유사 분자를 장치 내로 흐르게 하기 위한 것인 시스템.
  69. 시료에서 분석물을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
    i) 코엘레테라진의 존재하에, 시료를 하기와 접촉시키는 단계:
    a) 레닐라 루시퍼라제 또는 이의 변이체에 부착된 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 유사 분자; 및
    b) 녹색 형광 단백질 2에 부착된 항체 또는 항체 유사 분자에 결합할 수 있는 항원을 포함하는 표지된 항원; 및
    ii) 레닐라 루시퍼라제와 녹색 형광 단백질 2 사이의 생물발광 공명 에너지 전달 (BRET)이 변형되었는지를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 레닐라 루시퍼라제와 녹색 형광 단백질 2 사이의 에너지 전달의 효율의 감소는 분석물이 시료에 존재함을 표시하는 방법.
KR1020217039177A 2019-05-01 2020-04-30 면역센서 KR20220034034A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2019901483A AU2019901483A0 (en) 2019-05-01 Immunosensor
AU2019901483 2019-05-01
AU2019901566 2019-05-08
AU2019901566A AU2019901566A0 (en) 2019-05-08 Immunosensor
PCT/AU2020/050430 WO2020220086A1 (en) 2019-05-01 2020-04-30 Immunosensor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220034034A true KR20220034034A (ko) 2022-03-17

Family

ID=73029225

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217039177A KR20220034034A (ko) 2019-05-01 2020-04-30 면역센서

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20220268706A1 (ko)
EP (1) EP3963324A4 (ko)
JP (1) JP2022531246A (ko)
KR (1) KR20220034034A (ko)
CN (1) CN114341637A (ko)
AU (1) AU2020265898A1 (ko)
CA (1) CA3138608A1 (ko)
WO (1) WO2020220086A1 (ko)
ZA (1) ZA202109785B (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024070697A1 (ja) * 2022-09-26 2024-04-04 富士フイルム株式会社 イムノクロマトグラフ検査装置

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2013204332B2 (en) * 2012-04-16 2015-07-16 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods and systems for detecting an analyte or classifying a sample
US10138267B2 (en) * 2015-04-06 2018-11-27 Hunan Skyworld Biotechnologies Co. Ltd. Bioconjugates of heterocyclic compounds
US11740238B2 (en) * 2015-09-04 2023-08-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods of detecting a substance of interest

Also Published As

Publication number Publication date
US20220268706A1 (en) 2022-08-25
EP3963324A4 (en) 2023-07-05
CA3138608A1 (en) 2020-11-05
AU2020265898A1 (en) 2021-12-23
WO2020220086A1 (en) 2020-11-05
EP3963324A1 (en) 2022-03-09
ZA202109785B (en) 2023-06-28
JP2022531246A (ja) 2022-07-06
CN114341637A (zh) 2022-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3538665B1 (en) Protease sensor molecules
US20060154314A9 (en) GFP-SNAP25 fluorescence release assay for botulinum neurotoxin protease activity
US8518713B2 (en) Self-illuminating dot systems and methods of use thereof
KR20230079494A (ko) 구조적 보완에 의한 바이오발광성의 활성화
CN111164426B (zh) 碳水化合物传感器
Xie et al. Nanobody/NanoBiT system-mediated bioluminescence immunosensor for one-step homogeneous detection of trace ochratoxin A in food
KR20220034034A (ko) 면역센서
Zhang et al. Novel signal-on immunosensors for rapid and sensitive detection of Microcystin-LR
Ge et al. Combinational biosynthesis of dual-functional streptavidin-phycobiliproteins for high-throughput-compatible immunoassay
Niu et al. Novel fluorescence-based biosensors incorporating unnatural amino acids
US20080108128A1 (en) Resonance Energy Transfer Assay System for Multi-Component Detection
Nhat et al. Antibody-based fluorescent and fluorescent ratiometric indicators for detection of phosphotyrosine
A Frank Creation of artificial luciferases to expand their analytical potential
Deo et al. Bioluminescence resonance energy transfer from aequorin to a fluorophore: an artificial jellyfish for applications in multianalyte detection
US8569003B2 (en) Fusion protein having luminescence activity
CN112739719A (zh) 结合Gα蛋白的单域抗体
JPWO2017057752A1 (ja) 新規人工生物発光酵素群
AU2003301960A1 (en) Methods of isolation of active compounds and activated targets
AU2004291948A1 (en) Resonance energy transfer assay system for multi-component detection