ES2613029T3 - Polipéptidos de afinidad doble para purificación - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de purificación de una biomolécula diana, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto (i) una biomolécula diana, (ii) un polipéptido de afinidad doble y (iii) un soporte sólido que comprende un ligando de captura o un sitio de unión a polipéptido de afinidad doble, en el que la proporción entre las constantes de disociación en equilibrio del polipéptido de afinidad doble, [KD,t/KD,s], es al menos 10º en condiciones convencionales; y (b) recuperar la biomolécula diana por elución, en el que el polipéptido de afinidad de diana y el polipéptido de afinidad doble se ponen en contacto en solución antes de que la mezcla se ponga en contacto con el soporte sólido que comprende un ligando de captura o sitio de unión a polipéptido de afinidad doble.

Description

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tecnologías de purificación de afinidad convencionales para la industria del procesamiento aguas abajo debido a los costes más bajos, la especificidad elevada y la facilidad de uso sin comprometer la calidad de los procesos aguas abajo. Una característica esencial de la presente invención es el uso de un polipéptido de afinidad doble como un conector entre la molécula diana y el soporte sólido que comprende un ligando. Estos polipéptidos de afinidad doble son particularmente útiles para el procesamiento aguas abajo de las proteínas y péptidos biofarmacéuticos y de diagnóstico.

La invención sugiere la mejora del procedimiento completo de purificación de afinidad eliminando varias de las limitaciones de los sistemas actuales.

Utilizando el polipéptido de afinidad doble (PAD) y los soportes genéricos de la invención, la mayoría de los problemas y limitaciones anteriores se puede eliminar de forma completa, o reducir.

De acuerdo con la presente invención, la tecnología de purificación de afinidad doble se caracteriza por un soporte sólido genérico, el cual, en una realización, es una matriz de fase sólida, más los polipéptidos de afinidad doble específicos listos para su uso que sirven como moléculas conectoras. Un polipéptido de afinidad doble reacciona con la biomolécula diana. Posteriormente, el complejo polipéptido de afinidad doble -biomolécula diana conecta de forma no covalente con un ligando de captura inmovilizado sobre un soporte sólido, poniendo en contacto el complejo y el soporte sólido. La biomolécula diana se recupera mediante elución específica. Durante la elución el polipéptido de afinidad doble permanece unido al ligando sobre el soporte sólido.

Por lo tanto, en un aspecto la presente invención se refiere a un procedimiento para la purificación de una biomolécula diana, que comprende las etapas de : (a) poner en contacto (i) una biomolécula diana, (ii) un polipéptido de afinidad doble y (iii) un soporte sólido que comprende un ligando de captura o un sitio de unión a polipéptido de afinidad doble, en el que la proporción entre las constantes de disociación en equilibrio del polipéptido de afinidad doble, [KD,t/KD,s] es al menos 10º en condiciones convencionales; y (b) recuperar la biomolécula diana mediante elución.

El polipéptido de afinidad doble actúa como el compañero de ligamiento entre el soporte sólido y la molécula diana. En una realización particular, la afinidad del polipéptido de afinidad doble por el ligando inmovilizado es más fuerte que la afinidad por la molécula diana. Además, esta diferencia en la afinidad de unión puede expresarse como la proporción entre las constantes de disociación en equilibrio. En una realización esta proporción es al menos de 1.

El polipéptido de afinidad doble de acuerdo con la invención comprende al menos dos sitios de unión, de los cuales, un sitio de unión tiene afinidad por el ligando y otro sitio de unión tiene afinidad por la molécula diana. Estos sitios de unión son a base de polipéptido lo que significa que comprenden ya sea proteínas completas o fragmentos de proteínas. Tales fragmentos deberían al menos comprender la parte de la proteína que contiene el sitio de unión para la diana específica. El polipéptido de afinidad doble podría ser un polipéptido de fusión o podrían ser dos o más polipéptidos ligados de forma química en cualquier modo adecuado, por ejemplo, mediante un segmento conector.

Por lo tanto, en realizaciones adicionales la presente invención se refiere a un polipéptido de afinidad doble que tiene una constante de disociación en equilibrio para una biomolécula diana, KD,t, en el intervalo de 10-2 a 10-13 M, por ejemplo 10-8 M y una constante de disociación en equilibrio para un ligando de captura, KD,s, en el intervalo de 10-9 a 10-16 M, por ejemplo 10-10 M, y al mismo tiempo la proporción KD,t/KD,s, debería coincidir de forma que la proporción sea de al menos 10º, de forma más particular al menos 101, de forma más particular 102, de forma más particular 103 o incluso de forma más particular 104.

En otras palabras, lo anterior significa que la unión del PAD a la diana es, en realizaciones preferentes, más débil que la unión del PAD al ligando.

De forma particular, el dicho polipéptido de afinidad doble tiene una constante de disociación en equilibrio, KD,t para el polipéptido diana en el intervalo de 10-4 a 10-13 M, de forma más particular en el intervalo de 10-6 a 10-13 M y una constante de disociación en equilibrio, KD,s, para el ligando de captura en el intervalo de 10-9 a 10-16 M, de forma más particular en el intervalo de 10-11 a 10-16 M.

En general, la unión al ligando o la columna no puede ser demasiado fuerte. Por lo tanto, el valor en el extremo superior del intervalo no es importante con respecto a la KD,s.

En el contexto de la presente invención, la constante de disociación en equilibrio se mide de acuerdo con la reacción:

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A y B representan los compañeros de unión: la biomolécula diana y el polipéptido de afinidad doble, o el polipéptido

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juntos contengan el ADN total a introducir en el genoma de la célula hospedadora, o un transposón.

Los vectores de la presente invención preferentemente contienen uno o más marcadores de selección que permiten la selección fácil de las células transformadas. Un marcador de selección es un gen, el producto del cual proporciona resistencia a biocidas o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similares.

Un gen esencial condicional puede funcionar como un marcador de selección no antibiótico. Son ejemplo de marcadores de selección no antibióticos esenciales condicionales bacterianos los genes dal de Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis u otros Bacilli, que son solo esenciales cuando la bacteria se cultiva en ausencia de D-alanina. Además, los genes que codifican enzimas implicadas en la renovación de la UDP-galactosa pueden funcionar en una célula como marcadores esenciales condicionales cuando la célula se crece en presencia de galactosa o se crece en un medio que da lugar a la presencia de galactosa. Los ejemplos no limitativos de tales genes son los de

B. subtilis o B. licheniformis, que codifican la fosforilasa dependiente de UTP (EC 2.7.7.10), la uridililtransferasa dependiente de UDP-glucosa (EC 2.7.7.12) o la UDP-galactosa epimerasa (EC 5.1.3.2). Además, puede utilizarse como marcador de selección en células crecidas en medio mínimo con xilosa como única fuente de carbono un gen de la xilosa isomerasa tal como xylA, de Bacilli. Los genes necesarios para la utilización de gluconato, gntK y gntP, también pueden utilizarse como marcadores de selección en células crecidas en medio mínimo con gluconato como única fuente de carbono. Se conocen en la técnica otros ejemplos de genes esenciales condicionales. Los marcadores de selección de antibiótico confieren resistencia a antibióticos tales como ampicilina, kanamicina, cloranfenicol, eritromicina, tetraciclina, neomicina, higromicina o metotrexato.

Los marcadores adecuados para células hospedadoras de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Los marcadores de selección para su uso en una célula hospedadora de hongo filamentoso incluyen, pero sin limitación, amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5’-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintetasa), así como equivalentes de los mismos. Son preferentes para su uso en una célula de Aspergillus los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae, y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus.

Los vectores de la presente invención preferentemente contienen un elemento (o elementos) que permite la integración del vector en el genoma de la célula hospedadora o la replicación autónoma del vector, independiente del genoma, en la célula.

Para la integración en el genoma de la célula hospedadora, el vector puede depender de la secuencia del polinucleótido que codifica el polipéptido o de cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante recombinación homóloga o no homóloga. Como alternativa, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para la dirección de la integración mediante recombinación homóloga en el genoma de la célula hospedadora en un emplazamiento (o emplazamientos) preciso en el cromosoma (o cromosomas). Para aumentar la probabilidad de integración en un emplazamiento preciso, los elementos integracionales deberían contener preferentemente una cantidad suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, preferentemente 400 a 10.000 pares de bases y muy preferentemente 800 a 10.000 pares de bases, que tengan un alto grado de identidad con la secuencia diana correspondiente para potenciar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga con la secuencia diana en el genoma de la célula hospedadora. Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias de nucleótidos no codificantes o codificantes. Por otro lado, puede integrarse al vector en el genoma de la célula hospedadora mediante recombinación no homóloga.

Para la replicación autónoma, el vector puede comprender adicionalmente un origen de replicación que permita que el vector se replique de forma autónoma en la célula hospedadora en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador de plásmido que medie la replicación autónoma que funcione en una célula. La expresión “origen de replicación” o “replicador de plásmido”, como se define en el presente documento, es una secuencia de nucleótidos que permite a un plásmido o vector replicarse in vivo.

Los ejemplos de orígenes de replicación bacterianos son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184, que permiten la replicación en E. coli, y pUB110, pE194, pTA1060 y pAMβ1, que permiten la replicación en Bacillus.

Los ejemplos de orígenes de replicación para su uso en una célula hospedadora de levadura son los orígenes de replicación de 2 micrómetros, ARS1, ARS4, y la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6.

Los ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula de hongo filamentoso son AMA1 y ANS1 (Gems y col., 1991, Gene 98: 61-67, Cullen y col., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; documento WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos y vectores que comprenden el gen, se puede llevar a cabo de acuerdo con los procedimientos desvelados en el documento WO 00/24883.

Para aumentar la producción del producto génico puede insertarse en la célula hospedadora más de una copia de un polinucleótido de la presente invención. Un aumento en el número de copias del polinucleótido puede obtenerse integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedadora o incluyendo un

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gen marcador de selección amplificable con el polinucleótido, en donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador de selección, y por lo tanto las copias adicionales del polinucleótido, pueden seleccionarse cultivando las células en presencia del agente de selección apropiado.

Los procedimientos utilizados para ligar los elementos descritos anteriormente, para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención, son bien conocidos para un experto en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, citado anteriormente).

La presente invención también se refiere a células hospedadoras recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención, las cuales se utilizan de forma ventajosa en la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención se introduce en una célula hospedadora de forma que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicativo, como se describió antes. La expresión “célula hospedadora” abarca cualquier progenie de una célula parental que no es idéntica a la célula parental debido a mutaciones que se produjeron durante la replicación. La elección de una célula hospedadora dependerá en gran medida del gen que codifica el polipéptido y su fuente.

La célula hospedadora puede ser un microorganismo unicelular, por ejemplo, un procariota, o un microorganismo no unicelular, por ejemplo, un eucariota.

Los microorganismos unicelulares útiles son células bacterianas tales como bacterias grampositivas que incluyen, pero sin limitación, una célula de Bacillus, por ejemplo, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis; o una célula de Streptomyces, por ejemplo, Streptomyces lividans y Streptomyces murinus, o bacterias gramnegativas tales como

E. coli y Pseudomonas sp. En un aspecto preferente, la célula hospedadora bacteriana es una célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus o Bacillus subtilis. En otro aspecto preferente, la célula de Bacillus es un Bacillus alcalófilo.

La introducción de un vector en una célula hospedadora bacteriana puede, por ejemplo, efectuarse mediante transformación por protoplastos (véase, por ejemplo, Chang y Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111115), utilizando células competentes (véase, por ejemplo, Young y Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) o conjugación (véase, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).

La célula hospedadora también puede ser una eucariota, tal como una célula de mamífero, insecto, vegetal o fúngica.

En un aspecto preferente, la célula hospedadora es una célula fúngica. “Hongos”, como se utiliza en el presente documento, incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota (como define Hawksworth y col., en, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8ª edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU) así como Oomycota (como se cita en Hawksworth y col., 1995, citado anteriormente, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawksworth y col., 1995, citado anteriormente).

En un aspecto más preferente, la célula hospedadora fúngica es una célula de levadura. “Levadura”, como se utiliza en el presente documento, incluye levaduras ascosporógenas (Endomycetales), levaduras basidiosporógenas y levaduras que pertenecen a los Hongos Imperfectos (Blastomycetes). Dado que la clasificación de las levaduras puede cambiar en el futuro, para los fines de la invención, las levaduras se definirán como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F. A., Passmore, S. M. y Davenport, R. R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series n.º 9, 1980).

En incluso un aspecto más preferente, la célula hospedadora de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia.

En un aspecto muy preferente, la célula hospedadora de levadura es una célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otro aspecto muy preferente, la célula hospedadora de levadura es una célula de Kluyveromyces lactis. En otro aspecto muy preferente, la célula hospedadora de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica.

En otro aspecto más preferente, la célula hospedadora de levadura es una célula de hongo filamentoso. “Hongos filamentosos” incluye todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como define Hawksworth y col., 1995, citado anteriormente). Los hongos filamentosos se caracterizan en general por una pared micelial compuesta de quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es mediante elongación de la hifa y el catabolismo del carbono es aerobio obligado. En contraste, el crecimiento vegetativo de levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es mediante gemación de un talo unicelular y el catabolismo del carbono puede ser fermentativo.

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En un aspecto incluso más preferente, la célula hospedadora de hongo filamentoso es una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes o Trichoderma.

En un aspecto muy preferente, la célula hospedadora de hongo filamentoso es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. En otro aspecto muy preferente, la célula hospedadora de hongo filamentoso es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides o Fusarium venenatum. En otro aspecto muy preferente, la célula hospedadora de hongo filamentoso es una célula de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa o Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

Las células fúngicas pueden transformarse mediante un proceso que implica la formación de protoplastos, la transformación de los protoplastos y la regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Los procedimientos adecuados para la transformación de las células hospedadoras de Aspergillus y Trichoderma se describen en el documento EP 238 023 y en Yelton y col., 1984, Proceedings de la National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Los procedimientos adecuados para la transformación de especies de Fusarium se describen en Malardier y col., 1989, Gene 78: 147-156 y el documento WO 96/00787. Las levaduras pueden transformarse utilizando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J. N. Y Simon, M. I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, pág. 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito y col., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; y Hinnen y col., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

El contacto entre la biomolécula diana, el polipéptido de afinidad doble (PAD) y el soporte sólido, puede realizarse por varias vías optativas. En una realización, todos los componentes podrían ponerse en contacto en una etapa, por ejemplo cargando el polipéptido diana y la proteína de fusión sobre el soporte sólido sin preincubación en solución. El polipéptido de afinidad doble puede, sin embargo, ponerse en contacto con la diana antes de la carga de este complejo en el soporte sólido. En esta realización, en primer lugar se ponen en contacto la biomolécula diana y el polipéptido de afinidad doble, por ejemplo en solución, y, posteriormente, el complejo formado se pone en contacto con el soporte sólido. Dependiendo de la naturaleza del soporte sólido, las realizaciones preferentes de este principio podrían diferir.

En una realización preferente, el soporte sólido es una matriz de fase sólida. Esto incluye matrices de fase sólida convencionales. En el caso de matrices de fase sólida en la forma de columnas, en primer lugar se ponen en contacto la diana y el polipéptido de afinidad doble en solución y posteriormente se ponen en contacto con la matriz de fase sólida cargando el complejo sobre la columna.

En otra realización, los soportes sólidos están en forma de partículas.

El ligando de captura de acuerdo con la invención está unido de forma covalente al soporte sólido. Como se explica anteriormente, el ligando de acuerdo con la presente invención es distinto del ligando utilizado en la cromatografía de afinidad tradicional, en donde el fin del ligando es unirse a la diana. En la presente invención, el ligando debe unirse al PAD. Los ligandos son bien conocidos en la técnica y a continuación se proporcionan ejemplos que pueden aplicarse de acuerdo con la invención. En el contexto de la presente invención, en una realización particular en lugar de un ligando unido a la fase sólida, la fase sólida podría comprender de forma alternativa una afinidad de unión o un sitio de unión para el PAD. Un ejemplo podría ser celulosa como la fase sólida y el CBD (dominio de unión a celulosa) como parte del PAD.

En una realización, el ligando se elige de, pero sin limitación, el grupo que consiste en biotina, acarbosa, esteroides, haptenos, péptidos de epítopo, colorantes e inhibidores enzimáticos. En una realización particular, el ligando es biotina. El ligando puede estar unido al soporte sólido de forma química, como se describe en los ejemplos en donde se ilustra la unión química de la acarbosa y el rojo reactivo 6.

El acoplamiento de los ligandos de afinidad a los soportes afecta fuertemente la especificidad, capacidad y el coste de las columnas de cromatografía de afinidad tradicionales.

El actual estado de la técnica en la tecnología de acoplamiento covalente permite el acoplamiento quimio y regio selectivo de los ligandos de unión al soporte, a menudo utilizando espaciadores o conectores para anclar el ligando

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Algunos ligandos de afinidad también son sensibles a las proteasas, y la vida útil de la columna se reducirá a menos que se sigan de forma rigurosa procedimientos de limpieza y regeneración especiales. La libertad para diseñar procedimientos de purificación de afinidad eficaces está, por lo tanto, un tanto restringida.

Un sistema de columna de único uso de acuerdo con la invención o un sistema de columna que utilice ligandos sintéticos no tendrá las limitaciones técnicas anteriores. En una realización de la invención, el soporte sólido está en forma de una matriz de fase sólida. La matriz de fase sólida puede comprender, como estructura de la matriz, cualquier material natural o sintético, orgánico o inorgánico conocido per se por ser aplicable en la separación de proteínas y otras biomoléculas en fase sólida, por ejemplo, polisacáridos naturales o sintéticos tales como agar-agar y agarosas; celulosas, éteres de celulosa tales como hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa; almidones; gomas tales como goma guar y goma arábiga, goma ghatti, goma de tragacanto, goma de algarrobilla, goma de xantano; pectinas; mucinas; dextranos; quitinas; quitosanos; alginatos; carragenanos; heparinas; gelatinas; polímeros sintéticos tales como poliamidas tales como poliacrilamidas y polimetacrilamidas; poliimidas; poliésteres; poliéteres; compuestos vinílicos poliméricos tales como alcoholes polivinílicos y poliestirenos; polialquenos; materiales inorgánicos tales como materiales silíceos tales como dióxido de silicio incluyendo sílice amorfo y cuarzo; sílices; silicatos metálicos, vidrios de poro controlado y cerámicas; óxidos metálicos y sulfuros, o combinaciones de estos materiales naturales o sintéticos, y orgánicos o inorgánicos.

La estructura de la matriz preferentemente se selecciona de agar-agar, agarosas, celulosas, éteres de celulosa tales como hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, poliamidas tales como poli(met)acrilamidas, polivinil alcoholes polivinílicos, sílices y vidrios de poro controlado.

Los materiales de fase sólida como estructuras de matriz especialmente interesantes son, por ejemplo, perlas de agar o agarosa tales como perlas de Sepharosa y Superosa de GE Healthcare, USA, y Biogel A de Biorad, USA; perlas a base de dextrano tales como Sephadex, GE Healthcare; perlas a base de celulosa y membranas tales como celulosa Perloza de lontosorb, República Checa; perlas de composite tales como Sephacryl y Superdex, GE Healthcare, USA; perlas de polímeros orgánicos sintéticos tales como Fractogel de Tosoh Lifesciences LLC, USA; medios POROS de Applied Biosystems, USA, Bio-Rex, Bio-Gel P y Macro Prep de Biorad, HEMA y Separon de TESSEK y los medios Hyper D y Trisacryl de Pall Corporation, USA, Enzacryl y Azlactona, 3M, USA; perlas de materiales silíceos tales como vidrio de poro controlado, PROSEP, de Millipore, USA, y Spherocil, Pall Corporation, USA; y composites de sílice recubiertos en forma de perlas o membranas tales como ACTI-DISK, ACTI-MOD y CycloSep de Arbor Technologies, USA.

Después, el ligando se une de forma covalente a este material (por ejemplo, biotina o moléculas específicas similares de bajo peso molecular (BPM)). Se pueden seleccionar a partir de libros de texto sobre el tema varias químicas de acoplamiento de moléculas ligando al soporte sólido (Protein Purification, 1998, 2ª ed., eds. Janson, J-C., Rydén, L, Wiley & sons inc. Nueva York). A base de la tarea de purificación particular, se acopla el mejor candidato de derivados de ligando a la mejor opción de soporte sólido, por ejemplo, matriz o partículas de fase sólida. Las propiedades del procedimiento de producción de la matriz sólida de afinidad se analizan a través de pruebas prácticas de laboratorio y piloto.

Los ligandos pueden unirse al material de fase sólida mediante cualquier tipo de enlace covalente conocido per se como aplicable a este fin, ya sea mediante una reacción química directa entre el ligando y el material de fase sólida

o mediante una activación previa del material de fase sólida o del ligando con un reactivo adecuado conocido per se que haga posible unir la estructura de la matriz y el ligando. Los ejemplos de tales reactivos de activación adecuados son epiclorhidrina, epibromohidrina, alil glicidil éter; bis-epóxidos tales como butanodiol diglicidil éter; compuestos alifáticos sustituidos por halógeno tales como dicloropropanol, divinilsulfona; carbonildiimidazol; aldehídos tales como dialdehido glutárico; quinonas; bromuro de cianógeno; peryodatos tales como meta peryodato de sodio; carbodiimidas; clorotriazinas tales como cloruro cianúrico; cloruros de sulfonilo tales como cloruros de tosilo y cloruros de tresilo; N-hidroxi succinimidas; tolueno-4-sulfonatos de 2-fluoro-1-metilpiridinio; oxazolonas; maleimidas; disulfuros de piridilo e hidrazidas. Entre estos, son preferentes los reactivos de activación que dejan un grupo espaciador SP1 distinto de un enlace simple, por ejemplo epiclorhidrina, epibromohidrina, alil glicidil éter; bisepóxidos; compuestos alifáticos sustituidos con halógeno; divinil sulfona; aldehídos; quinonas; bromuro de cianógeno; cloro-triazinas; oxazolonas; maleimidas; disulfuros de piridilo e hidrazidas.

En una realización, el soporte sólido está en forma de partículas. Las partículas pueden seleccionarse del grupo que comprende microesferas, partículas de látex o perlas. Las partículas pueden fabricarse de, pero sin limitación, el grupo que consiste en, por ejemplo, poliestireno, sílice, naftaleno, polibutilmetacrilato.

El soporte sólido genérico puede producirse a costes comparables con las matrices de intercambio iónico y la proteína de afinidad doble recombinante puede producirse también como una proteína de fusión recombinante, mediante fermentación a bajo coste. Debido al coste reducido de los materiales de los procedimientos aguas abajo nuevos, la tecnología de purificación puede proporcionarse como desechables, los cuales eliminan la necesidad de una limpieza sin desmontar (LSD) cara y de determinadas validaciones. Otra consecuencia de los costes reducidos son las aplicaciones opcionales de volúmenes de columna grandes, que ahorra gastos de mano de obra de fabricación, evita reejecuciones de purificación repetidas y limita el tiempo de las tareas de la planta de procesamiento aguas abajo.

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Ejemplo 1 b. Preparación de la molécula de PAD [Proteína A-Neutravidina]

Para mejores resultados, asegurarse de que la Proteína A-SH se prepara como se describe anteriormente y esté lista para combinar con la Avidina activada con maleimida.

La Neutravidina activada con maleimida (Pierce, n.º 31007) está disponible de forma comercial para la preparación de forma directa de conjugados de Proteína NeutrAvidin™ (PNA) con proteínas, péptidos y otras moléculas que contienen un grupo sulfhidrilo (-SH) libre. La Proteína NeutrAvidin™ es un derivado de avidina modificado con varias características clave que proporcionan una proteína de unión a biotina con propiedades de unión no específica excepcionalmente baja. La Proteína NeutrAvidin™ no contiene hidratos de carbono, llevando la actividad de unión a lectina a niveles no detectables. De forma adicional, el punto isoeléctrico de la PNA es 6,3 ± 0,3, lo cual es mucho más bajo que el de la Avidina nativa y no tan ácido como el de la estreptavidina.

Protocolo

Se añadió 1,0 ml de agua ultra pura para suspender 5 mg de Neutravidina liofilizada. La proteína A-SH y la Neutravidina activada con maleimida se combinaron y se mezclaron en una proporción molar que corresponde a 1:1. La mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante una noche.

En general, no perjudica permitir que la reacción transcurra durante varias horas o durante una noche, aunque habitualmente la reacción estará completa en el tiempo especificado. Para detener la reacción de conjugación antes de la finalización, añadir tampón que contiene cisteína reducida en una concentración varias veces mayor que la de los sulfhidrilos de la Proteína A-SH.

Ejemplo 1c. Preparación de la molécula de PAD [Aficuerpo (IgG) -Avidina]

Protocolo

La avidina (10 mg) se activó con sulfo-SMCC como se describe en el Ejemplo 1a. Los dímeros de disulfuro de Aficuerpo anti IgG se redujeron a monómeros:

el aficuerpo anti IgG (5 mg) se disuelve en tampón PBS (5 ml) y 3,8 ml de esta solución se transfieren a un vial que contiene 12,3 mg de ditiotreitol (DTT), proporcionando una solución de DTT de concentración final 20 mM. Esta mezcla se agita a TA durante 2 h.

Después de esto, se elimina el DTT en exceso separando de la mezcla de reacción en dos porciones, pasando cada porción a través de una columna PD-10 (volumen de lecho 8 ml). Las columnas se han equilibrado con 25 ml de tampón PBS antes del uso. El Aficuerpo Anti IgG monomérico se eluye de las columnas en 2 x 9-10 fracciones, conteniendo cada una 1 ml. Midiendo la A280 de las fracciones, la proteína se localizó en 2 fracciones de cada columna. Estas fracciones se agruparon y se mezclaron con la solución de avidina activada con maleimida desalada (20 ml) en una proporción molar que corresponde a aproximadamente 1:1 (avidina calculada como monómero; PM = 17.000), y se dejó transcurrir el acoplamiento durante una noche a temperatura ambiente, con agitación suave de la mezcla de acoplamiento. El siguiente día, se concentraron 1500 μl de la mezcla de conjugación en un Amicon Ultra (límite de 3 kDa) hasta un volumen total de 400 μl, los cuales se utilizaron para el análisis por SDS PAGE. Esto mostró que toda la avidina había reaccionado y que aún había presente algo de Aficuerpo anti IgG que no había reaccionado. La mezcla de conjugación se congeló hasta la purificación mediante CET.

El protocolo anterior puede utilizarse para la preparación de todos los derivados de polipéptidos de afinidad doble de Aficuerpo-Avidina.

Ejemplo 1 d. Preparación de la molécula de PAD [Aficuerpo (Insulina) -Avidina]

La avidina (9 mg) se activó con sulfo-SMCC como se describe en el Ejemplo 1a. Los dímeros de disulfuro de Aficuerpo anti insulina (His6-Z000810-Cys; PBS00014) se redujeron a monómeros como se describe en el Ejemplo 1 c. Las fracciones de las columnas PD-10 agrupadas se mezclaron con la solución de avidina activada con maleimida desalada (16,1 ml) en una proporción molar que corresponde a aproximadamente 1:1 y se dejó proceder el acoplamiento durante una noche a temperatura ambiente, con agitación suave de la mezcla de acoplamiento. El siguiente día, la mezcla de conjugación se analizó por SDS PAGE. Esto mostró que toda la avidina había reaccionado y que aún había presente algo de Aficuerpo anti insulina que no había reaccionado.

La mezcla de conjugación se congeló hasta la purificación mediante CET.

Ejemplo 1e. Preparación de la molécula de PAD [Aficuerpo (Insulina) -Avidina]

La avidina (9 mg) se activó con sulfo-SMCC como se describe en el Ejemplo 1a. Los dímeros de disulfuro de Aficuerpo anti insulina (Insulina, His6-Z01139-Cys; PBS00022) se redujeron a

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