ES2606862T3 - Soluto de ectoína compatible así como derivados del mismo para estabilización enzimática - Google Patents

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Abstract

Una composición seca que comprende los componentes: (a) una deshidrogenasa; (b) un cofactor redox; (c) un agente capaz de inducir un cambio en al menos una propiedad óptica de un reactivo indicador en presencia de equivalentes redox; (d) un reactivo indicador; y (e) al menos un soluto compatible que es ectoína o un derivado de la misma, en la que dicha deshidrogenasa es una glucosa deshidrogenasa y en la que dicho derivado de ectoína se selecciona entre el grupo que consiste en: hidroxiectoína, homoectoína, un éster de hidroxiectoína, un éter de hidroxiectoína, un derivado de sulfonilo de ectoína o un derivado de sulfonilo esterificado de ectoína y una amida de un derivado de sulfonilo de ectoína.

Description

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DESCRIPCION
Soluto de ectoma compatible as^ como derivados del mismo para estabilizacion enzimatica
La presente invencion se refiere a medios y metodos para mantener y preservar la actividad enzimatica. En particular, la invencion se refiere a una composicion seca que comprende una deshidrogenasa, un cofactor redox, un agente capaz de inducir al menos un cambio optico en una propiedad optica de un reactivo indicador en presencia de equivalentes redox, un reactivo indicador, y al menos un soluto compatible que es ectoma o un derivado de la misma. La invencion contempla ademas un elemento de ensayo de diagnostico para la determinacion de un analito en una muestra de un fluido corporal y un metodo para la fabricacion de tal elemento de ensayo. Adicionalmente la presente invencion preve el uso de al menos un soluto compatible tal como se ha mencionado anteriormente para reducir una disminucion de la actividad enzimatica de al menos una enzima en una composicion en condiciones secas. Asimismo, se contempla un metodo para determinar la presencia o la cantidad de un analito en una muestra de fluido corporal basandose en el elemento de ensayo de acuerdo con la invencion.
Los elementos de ensayo de diagnostico se fabrican habitualmente para su uso en aplicaciones en el punto de atencion del paciente. Por tanto, los elementos deben ser robustos con respecto a la manipulacion y el almacenamiento. Esto incumbe, en particular, a la qmmica de ensayo de los elementos de ensayo. (vease Hones 2008, Diabetes Technology & Therapeutics 10: S10)
Sin embargo, muchos elementos de ensayo de diagnostico se basan en una qmmica de ensayo de enzimas mas bien complejas presentes en el elemento de ensayo. En particular, el elemento de ensayo comprende un soporte y una capa de deteccion en el que la capa de deteccion contiene normalmente enzimas. Es decisivo para la funcion apropiada de los elementos de ensayo que estas enzimas permanezcan biologicamente activas durante el almacenamiento y tras el tratamiento. Puesto que no es posible generalmente la calibracion para una medicion individual, los elementos de ensayo se calibran normalmente por lotes. La informacion de calibracion para un lote de elementos de ensayo se almacena y se usa para cada elemento del lote independientemente de las diferencias individuales en el tratamiento y almacenamiento.
Sin embargo, los pretratamientos de los elementos de ensayo y las condiciones de almacenamiento pueden influir seriamente en la actividad de las enzimas. Por ejemplo, el tratamiento termico, durante la fabricacion o el almacenamiento de los elementos de ensayo puede desnaturalizar las enzimas de modo que la actividad enzimatica global presente en un elemento de ensayo se reduce significativamente, lo cual, a su vez, dara lugar a resultados del ensayo erroneos cuando se use tal elemento de ensayo. Analogamente, muchas enzimas son sensibles con respecto a los procesos de oxidacion que dan lugar tambien a la desnaturalizacion e inactivacion irreversible de las enzimas. Sin embargo, sobre los elementos de ensayo hay presentes muchas enzimas, al menos durante el tiempo de almacenamiento, en un entorno sin disolvente que puede promover incluso tales procesos de oxidacion. Asimismo, la capa de deteccion puede comprender componentes adicionales que facilitan aun mas los procesos de oxidacion tales como cofactores redox y otros componentes redox relevantes.
El problema de preservar las actividades enzimaticas en condiciones tan desfavorables, sin embargo, no incumbe solamente a los elementos de ensayo. Antes bien, de modo mas general, se proporcionan y se almacenan muchas preparaciones de enzimas en una forma esencialmente sin disolvente, tal como preparaciones liofilizadas.
Se han investigado diversos de los denominados solutos compatibles, es decir, compuestos de bajo peso molecular de diferentes clases qmmicas, tales como azucares, polioles, aminoacidos libres, derivados de aminoacidos, aminas y analogos de azufre esteres de sulfato, peptidos cortos y 2,3-difosfoglicerato dclico, por sus propiedades conservantes para protemas en solucion y en condiciones secas (veanse Arakawa 1985, Biophys J 47: 4l1; Lippert 1992, Appl Microbiol Biotechnol 37: 61; Goller 1999, J Mol Catal B Enzymatic 7:37; Lentzen 2006, Appl Microbiol Biotechnol 72: 623; y los documentos WO2007/002657 y US2010/0255120).
La estabilizacion de la glucosa oxidasa por la ectoma y la hidroxiectoma en biosensores para la determinacion electroqmmica de glucosa en solucion se ha comunicado previamente (documento WO2007/097653; Loose 2006, Proceedings of the 24th IASTED International Multi-conference Biomedical Engineering, 167-173, Innsbruck, AT). Sin embargo, la glucosa oxidasa es conocida por ser una enzima bastante estable con respecto al estres oxidativo y al calor. Por otro lado, se comunico que la hidroxiectoma era incapaz de prevenir la agregacion de protemas en solucion para la lactato deshidrogenasa (Andersson 2000, Biotechnol Appl Biochem 32: 145-153). Las deshidrogenasas en general y las glucosa deshidrogenasas, en particular, son enzimas bastante sensibles al estres oxidativo y al tratamiento termico. Estas son, sin embargo, importantes herramientas de diagnostico.
Se ha notificado la ectoma como agente en biosensores de colesterol que comprenden colesterol deshidrogenasa dirigidos a la deteccion electroqmmica de la actividad enzimatica (WO2007/132226 o WO2006/067424).
No obstante, existe la necesidad de preservar la actividad enzimatica de enzimas sensibles al almacenamiento y a la temperatura usadas en aplicaciones diagnosticas y, en particular, para la clase de las deshidrogenasas, tales como la glucosa deshidrogenasa.
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El problema tecnico que subyace a la presente invencion se podna considerar la provision de medios y metodos para satisfacer las necesidades mencionadas anteriormente. El problema se resuelve mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones y en la presente descripcion a continuacion.
As^ pues, la presente invencion se refiere a una composicion seca tal como se divulga en las reivindicaciones 1 a 5.
El termino "seca", tal como se usa en el presente documento, significa que la composicion carece esencialmente de un disolvente o una mezcla de disolventes. "Carece esencialmente", tal como se usa en el presente documento, significa que al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 92 %, al menos un 95 %, o al menos un 98 % del disolvente o mezcla de disolventes que estaba originalmente presente en una solucion de la composicion se ha eliminado de la composicion. De acuerdo con esto, preferentemente se preve que el disolvente o mezcla de disolventes este presente en la composicion seca de la invencion en una cantidad de hasta un 15% y, preferentemente, de hasta un 10%, hasta un 8%, hasta un 5%, hasta un 2%. Los valores porcentuales mencionados anteriormente y otros valores porcentuales a los que se hace referencia en el presente documento usados para definir cantidades se refieren a porcentajes en peso (p/p).
Tal composicion de la invencion es preferentemente una composicion solida en condiciones normales, es decir, a temperatura ambiente y a presion normal.
Un disolvente de acuerdo con la presente invencion es un disolvente que permite disolver los componentes de la composicion de la presente invencion en condiciones que no afectan irreversiblemente a la funcion de los componentes de la composicion y, en particular, a la actividad enzimatica de la deshidrogenasa. Asimismo, se preve que el disolvente disuelva los componentes, preferentemente a una presion convencional, preferentemente 0,1 MPa ± 10 % en un intervalo de temperaturas de 5 a 40 °C y, mas preferentemente, a temperatura ambiente, 20 °C ± 10 °C. m Disolventes adecuados de acuerdo con la presente invencion incluyen, preferentemente, agua, tampones basados en agua, tales como solucion salina tamponada con fosfato o tampones Tris, alcoholes tales como hexanol, 2-metoxi-propanol, 2-metil-2-butanol, tampon citrato, fosfato de glicerina, o tampon de Good (preferentemente en adicion al tampon Tris). Se entendera que, de acuerdo con la presente invencion, un disolvente que se va a usar puede ser una mezcla de dos o mas de los disolventes mencionados anteriormente. Mezclas de disolventes preferentes previstas en este contexto son mezclas de agua o tampones basados en agua con alcoholes y, en particular, las mezclas de disolventes a las que se hace referencia en los Ejemplos adjuntos que siguen a continuacion.
Una composicion seca de acuerdo con la presente invencion se puede proporcionar, preferentemente, disolviendo los componentes de la composicion de la presente invencion primero en un disolvente o una mezcla de disolventes y posteriormente eliminando dicho disolvente o mezcla de disolventes mediante un tratamiento adecuado de modo que la composicion remanente carezca esencialmente de dicho disolvente o mezcla de disolventes. Tratamientos adecuados previstos preferentemente por la presente invencion incluyen tratamiento termico, tecnicas de evaporacion, liofilizacion. Preferentemente, el tratamiento previsto es el tratamiento termico y, en particular, el tratamiento termico en las siguientes condiciones: tratamiento termico a aproximadamente 60 °C o mas durante aproximadamente un periodo de 20 a 45 minutos o a aproximadamente 95 °C durante aproximadamente un periodo de 1 a 2 minutos con circulacion de calor; espesor de la composicion de 20 a 200 micrometros o inferior; a una presion de 0,1 MPa o 0,01 MPa. Asimismo, se entendera que a fin de mantener la composicion en condiciones secas, el almacenamiento se lleva a cabo preferentemente en presencia de un agente desecante. Agentes desecantes adecuados incluyen, preferentemente, gel de sflice, zeolitas, carbonato de calcio o sulfato de magnesio.
El termino "deshidrogenasa", tal como se usa en el presente documento, se refiere a polipeptidos que son capaces
de catalizar la oxidacion de un sustrato mediante transferencia de hidruros (H-) como equivalentes redox a una
molecula aceptora, preferentemente a un cofactor redox tal como se hace referencia en otra parte del presente documento. Las deshidrogenasas previstas por la presente invencion son, preferentemente, aquellas que dependen de un cofactor redox (o denominado a veces co-enzima) tales como pirrolo quinolina quinona (PQQ), nicotinamida adenina dinucleotido (NAD), o un derivado de los mismos, o un cofactor de flavina, tal como flavina adenina dinucleotido (FAD) o mononucleotido de flavina (FMN). Las deshidrogenasas preferentes son, en particular, lactato deshidrogenasa (numero EC 1.1.1.27 o 1.1.1.28), glucosa deshidrogenasas (vease mas abajo), alcohol
deshidrogenasa (numero EC 1.1.1.1 o 1.1.1.2), L-aminoacido deshidrogenasa (numero EC 1.4.1.5), glicerina
deshidrogenasa (numero EC 1.1.1.6), malato deshidrogenasa (numero EC 1.1.1.37), 3-hidroxibutirato deshidrogenasa (numero EC 1.1.1.30), o sorbitol deshidrogenasa (numero EC 1.1.1.14).
La deshidrogenasa de la invencion es una glucosa deshidrogenasa. Mas preferentemente, dicha glucosa deshidrogenasa se selecciona entre el grupo que consiste en: glucosa deshidrogenasa (numero EC 1.1.1.47), quinoprotema glucosa deshidrogenasa (numero Ec 1.1.5.2), en particular, glucosa deshidrogenasa dependiente de pirrolo quinolina quinona (PQQ) (numero EC 1.1.5.2), glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (numero Ec 1.1.1.49), glucosa deshidrogenasa dependiente de nicotinamida adenina dinucleotido (NAD) (numero EC 1.1.1.119), y glucosa deshidrogenasa dependiente de flavina adenina dinucleotido (FAD) (numero EC 1.1.99.10) o mutantes enzimaticamente activos de las mismas. De acuerdo con la presente invencion es preferente un mutante de glucosa deshidrogenasa (numero E.C. 1.1.1.47) divulgado en el documento WO2011/020856 que tiene una mutacion de al
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menos una posicion de los aminoacidos 96, 170 y/o 252, que se incorpora por referencia en el presente documento. Mutaciones preferentes previstas en estas posiciones de aminoacido son sustituciones de Glu96Gly, Glu170Arg o Lys y/o Lys252Leu.
La estructura y propiedades de miembros preferentes de dichas familias de enzimas son bien conocidas en la tecnica (veanse Olsthoorn 1998, Biochemistry 37: 13854-13861; Pauly 1976, Hoppe Seylers Z Physiol Chem 356: 1613-1623; Tsujimura 2006, Biosci Biotechnol Biochem 70: 654-659). Mutantes enzimaticamente activos de las enzimas mencionadas anteriormente se pueden obtener sustituyendo, anadiendo o eliminando uno o mas aminoacidos de las secuencias de aminoacidos notificadas para las enzimas de tipo silvestre mencionadas anteriormente en la tecnica anterior, tal como se ha enumerado previamente. Los mutantes preferentes son los mutantes de la glucosa deshidrogenasa dependiente de PQQ que tienen una especificidad por el sustrato mejorada en comparacion con la homologa de tipo silvestre tal como se divulga en los documentos US 7.132.270 o US 7.547.535. Ambos documentos se incorporan por referencia en el presente documento con respecto a los mutantes. Mutantes adicionales son los divulgados en Baik et al. (Baik 2005, Appl Environ Microbiol 71: 3285), Vasquez- Figuera et al. (Vasquez-Figuera 2007, Chem BioChem 8: 2295), y el documento WO 2005/045016.
El termino "cofactor redox", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molecula que puede actuar como aceptor para equivalentes redox transferidos enzimaticamente y, en particular, hidruro (H-). Preferentemente, el cofactor redox es PQQ, NAD o FAD. Se ha de entender que el cofactor redox que se va a incluir en la composicion de la presente invencion depende de las propiedades de la deshidrogenasa prevista. Por ejemplo, la PQQ se combina en una composicion de acuerdo con la presente invencion con una glucosa deshidrogenasa dependiente de PQQ, el NAD se combina en una composicion de acuerdo con la presente invencion con una glucosa deshidrogenasa dependiente de NAD, y el FAD se combina en una composicion de acuerdo con la presente invencion con una glucosa deshidrogenasa dependiente de FAD. Un cofactor redox de acuerdo con la presente invencion puede ser preferentemente un derivado de PQQ, NAD o FAD. Derivados preferentes de NAD son los divulgados en el documento WO 2007/012494 que se incorpora por referencia en el presente documento con respecto a los derivados NAD/NADH y/o NADP/NADPH divulgados. Mas preferentemente, el cofactor redox de acuerdo con la presente invencion es carba-NAD tal como se divulga en el documento WO 2007/012494.
La ectoma (numero CAS: 96702-03-3) es un compuesto organico bien conocido que se produce de forma natural en bacterias y que tiene la formula C6H10N2O2. Tambien se denomina acido (S)-2-metil-3,4,5,6-tetrahidropyrimidina-4- carboxflico. La ectoma se puede obtener de diversas bacterias, en particular del genero Halomonadaceae o Firmicutes, mediante tecnicas bien conocidas en la tecnica (vease el documento WO1994/15923).
Un "derivado" de ectoma, al que se hace referencia de acuerdo con la presente invencion, es una molecula organica estructuralmente relacionada capaz de prevenir una reduccion de la actividad enzimatica de al menos una enzima a la que se hace referencia en el presente documento en solucion asf como en estado seco. Preferentemente, dicha reduccion de la actividad enzimatica se previene de un modo similar o igual y/o en un grado similar o igual que el encontrado para la ectoma. Mas preferentemente, el derivado de ectoma, si esta presente en una composicion de acuerdo con la invencion, debera ser capaz de prevenir la reduccion de la actividad enzimatica que se produce durante la fabricacion y/o el almacenamiento, en particular el almacenamiento, a temperatura ambiente o incluso a temperaturas mayores tales como 45 °C o 50 °C, o incluso a temperaturas de hasta 60 °C, en un grado estadfsticamente significativo. Preferentemente, el derivado, si esta presente en la composicion, sera capaz de mantener al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % de la actividad enzimatica de al menos una enzima en la composicion en comparacion con la actividad enzimatica encontrada en una composicion de control sin dicho derivado de ectoma. La prevencion de la reduccion de la actividad enzimatica en condiciones secas se puede determinar tal como se describe en otra parte del presente documento, por ejemplo, en los Ejemplos adjuntos. Preferentemente, dicho derivado de ectoma se selecciona entre el grupo que consiste en: hidroxiectoma, homoectoma, un ester de hidroxiectoma, un eter de hidroxiectoma, un derivado de sulfonilo de ectoma, un derivado de sulfonilo esterificado de ectoma y una amida de un derivado de sulfonilo de ectoma. Al igual que la ectoma, la hidroxiectoma se puede obtener de diferentes bacterias, en particular del genero Halomonadaceae o Firmicutes, mediante tecnicas bien conocidas en la tecnica (vease el documento WO1994/15923). Los otros derivados de ectoma mencionados anteriormente se pueden obtener, por ejemplo, mediante derivatizacion qmmica de hidroxiectoma in vitro.
Al menos un soluto compatible al que se hace referencia en el presente documento significa que se pueden usar dos o mas solutos compatibles juntos en la composicion de la presente invencion. Preferentemente, la ectoma y uno o mas derivados de la misma se pueden aplicar en la composicion de la invencion. La hidroxiectoma es un derivado preferente en este contexto. Ademas, se puede aplicar tambien una combinacion de derivados de ectoma, tales como hidroxiectoma y homoectoma.
El termino "equivalentes redox", tal como se usa el presente documento, se refiere a los hidruros (H-) que se transfieren de un sustrato de la deshidrogenasa al cofactor redox o a los electrones transferidos al reactivo indicador desde el cofactor redox.
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El termino "agente capaz de inducir un cambio en al menos una propiedad optica de un reactivo indicador en presencia de equivalentes redox" se refiere a una molecula que, en presencia de los equivalentes redox, es capaz de inducir un cambio en al menos una propiedad optica del reactivo indicador. Se ha de entender que, de acuerdo con la presente invencion, el agente puede inducir tambien un cambio en mas de una propiedad optica del reactivo indicador que se puede detectar posteriormente. Una propiedad optica a la que se hace referencia en el presente documento se refiere a una propiedad del reactivo indicador que se puede detectar opticamente tal como la polarizacion, refraccion, reemision, emision o absorcion de la luz y propiedades asociadas a las mismas. Se ha de entender que tal cambio en al menos una propiedad optica, tal como se usa en el presente documento, engloba la deteccion de la presencia de una propiedad que no era detectable antes, la deteccion de la ausencia de una propiedad que se habfa detectado antes y la deteccion de cambios cuantitativos de una propiedad, es decir, la deteccion del cambio de la intensidad de la senal que se correlaciona con el grado del cambio de la al menos una propiedad optica. Propiedades opticas preferentes previstas por la presente invencion son el color, la fluorescencia, la luminiscencia, o la refractometna. Las propiedades opticas que van a ser cambiadas por el agente previsto de acuerdo con la presente invencion dependen del tipo de reactivo indicador. Dependiendo de la propiedad optica deseada que se va a detectar y del agente que se va a usar en la composicion, el experto en la materia esta en posicion de seleccionar sin mas un reactivo indicador adecuado, en particular entre los reactivos indicadores a los que se hace referencia en otra parte del presente documento.
Un agente al que se hace referencia anteriormente es capaz, preferentemente, de transferir directa o indirectamente, es decir, mediante un mediador adicional, equivalentes redox del cofactor redox al reactivo indicador. Como consecuencia de dicha transferencia de equivalentes redox, el reactivo indicador sera modificado de tal manera que se produzca un cambio en al menos una propiedad optica. Por ejemplo, un reactivo indicador incoloro o no fluorescente en estado oxidado puede convertirse en un reactivo indicador coloreado o fluorescente mediante la transferencia de equivalentes redox mediada por el agente en estado reducido. La transferencia de equivalentes redox puede ser directa, en la que los equivalentes redox son transferidos por el agente al reactivo indicador, o puede ser indirecta. En este ultimo caso, los equivalentes redox se transfieren desde el agente hasta un mediador intermedio que transfiere posteriormente los equivalentes redox al reactivo indicador. Se debe entender que se puede usar, preferentemente, mas de un mediador. Por ejemplo, el agente puede transferir los equivalentes redox a un primer mediador que posteriormente transfiere los equivalentes redox a un segundo mediador y dicho segundo mediador transfiere despues los equivalentes redox al reactivo indicador. Se ha de entender que en tal cascada de mediadores se podnan usar mas de dos mediadores. Una ventaja de usar uno o mas mediadores para la transferencia de equivalentes redox al reactivo indicador es que se puede mejorar la eleccion del momento de la deteccion optica.
Mediadores que se pueden aplicar en el contexto de la presente invencion son bien conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, ferrocianuro potasico, derivados de quinona, azul de Nilo (numero CAS: 3625-57-8), azul de Meldola (numero CAS: 7057-57-0), complejos de osmio tal como se divulga en el documento EP 1 457 572 B1, incorporado por referencia en el presente documento, o complejos de metales de transicion tales como cloruro de hexamino rutenio.
Un agente de acuerdo con la invencion que se preve preferentemente es una fenazina. Mas preferentemente, dicha fenazina es etosulfato de fenazina, metosulfato de fenazina, trifluorometanosulfonato de 1-(3-carboxipropoxi)-5- etilfenazinio o metosulfato de 1-metoxifenazina. Tales fenazinas se pueden aplicar para inducir un cambio en al menos una propiedad optica de un reactivo indicador. Detalles para la deteccion y de como se han de aplicar tales fenazinas se pueden encontrar en el documento EP 0 654 079 A1 que se incorpora por referencia en el presente documento.
Asimismo, un agente previsto en este contexto es preferentemente una quinona. Mas preferentemente, dicha quinona es fenantrenoquinona, fenantrolinquinona, o benzo[h]-quinolinquinona.
Otro agente previsto es este contexto es una nitrosoanilina. Mas preferentemente, dicha nitrosoanilina es clorhidrato de [(4-nitrosofenil)imino]dimetanol.
Tambien previsto preferentemente por la presente invencion es un agente capaz de inducir un cambio en al menos una propiedad optica de un reactivo indicador en presencia de equivalentes redox, siendo dicho agente una enzima capaz de catalizar la transferencia de equivalentes redox desde el cofactor redox al reactivo indicador. Mas preferentemente, la enzima prevista en este contexto de acuerdo con la presente invencion es una diaforasa (numero EC 1.6.99.2), preferentemente una lipoamida deshidrogenasa o una NADH deshidrogenasa o un mutante enzimaticamente activo de las mismas. Diaforasas preferentes son las de corazon de cerdo, Clostridium kluyverii o Bacillus stearothermophilus. La estructura de dichas enzimas es bien conocida en la tecnica y se describe, por ejemplo, en el documento DE 2 061 984. Se pueden proporcionar mutantes enzimaticamente activos tal como se describe en otra parte del presente documento. Diaforasas particularmente preferentes previstas de acuerdo con la presente invencion son las que tienen una termoestabilidad y unas propiedades catalfticas mejoradas tal como se divulga en el documento US2007/196899 que se incorpora por referencia en el presente documento con respecto al contenido divulgativo correspondiente.
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Preferentemente, el soluto compatible reduce una disminucion de la actividad enzimatica de al menos una enzima en la composicion en condiciones secas. Mas preferentemente, dicha al menos una enzima es la deshidrogenasa. Mas preferentemente, la al menos una enzima puede ser, no obstante, tambien ambas, la deshidrogenasa asf como una enzima, preferentemente una diaforasa tal como se ha especificado anteriormente, que se aplica en la composicion de la presente invencion como agente capaz de inducir un cambio en al menos una propiedad optica de un reactivo indicador en presencia de equivalentes redox. Mas preferentemente, la disminucion de la actividad enzimatica es prevenida o al menos es reducida significativamente en la composicion de la invencion durante la fabricacion y/o el almacenamiento a temperatura ambiente, o incluso a temperaturas mayores a las que se hace referencia anteriormente, por parte del al menos un soluto compatible en comparacion con una composicion de control sin dicho soluto compatible de modo que al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % de la actividad enzimatica de una o ambas enzimas se mantenga.
El termino "reactivo indicador", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molecula o una entidad molecular que, como consecuencia de la transferencia de equivalentes redox, sera modificada de tal manera que se produzca un cambio en al menos una propiedad optica.
Reactivos indicadores preferentes para su aplicacion en la composicion de la invencion engloban heteropoliacidos, preferentemente, acido 2,18-fosforomolibdenico, quinonas, preferentemente resazurina, diclorofenolindofenol, y/o sales de tetrazolio, preferentemente, las sales disponibles en el mercado WST-3, WST-4 y WST-5 (Dojindo, Inc. EE.UU.). Estos reactivos indicadores se reducen tras la transferencia de los equivalentes redox y esta reduccion va acompanada de un cambio en al menos una propiedad optica y, en particular, el color.
Reactivos indicadores preferentes adicionales previstos de acuerdo con la presente invencion son reactivos tales como los fluoroforos, cuya fluorescencia cambia tras la transferencia de los equivalentes redox. Fluoroforos adecuados incluyen, entre otros, los nucleotidos de flavina y los nicotina adenina dinucleotidos a los que se hace referencia en otra parte en el presente documento tambien en el contexto de los cofactores redox. Si un cofactor redox tal como carba-NAD o NAD se aplica en la composicion de la invencion como reactivo indicador, los componentes (b), (c) y (d) de la composicion de la invencion puede estar todos representados por la misma molecula, es decir, carba-NAD o NAD. De acuerdo con esto, los componentes (b), (c) y (d) pueden estar representados en la composicion de la invencion por la misma entidad qmmica. Asimismo, se puede usar preferentemente una nitrosoanilina modificada tal como se divulga en los documentos EP 0 620 283 B1 o EP 0 831 327 B1, cuyo contenido descriptivo respectivo se incorpora por referencia en el presente documento, como componente (c) y componente (d). Asf, los componentes (c) y (d) pueden estar representados en la composicion de la invencion por la misma entidad qmmica.
Los procedimientos para eliminar el disolvente de una composicion a los que se ha hecho referencia anteriormente en el presente documento y, en particular, el tratamiento termico, son conocidos por influir en la actividad enzimatica, en particular en la actividad enzimatica de enzimas sensibles tales como las deshidrogenasas. Ademas, en condiciones secas, enzimas tales como las deshidrogenasas llegan a ser mas sensibles a procesos de oxidacion y la desnaturalizacion enzimatica asociada (Andersson 2000, Biotechnol. Appl. Biochem 32: 145-153). De acuerdo con esto, la fabricacion de composiciones secas complejas para ensayos de deteccion enzimatica, asf como el almacenamiento de las mismas, va acompanado con frecuencia de un aumento de la inactivacion de las enzimas por desnaturalizacion, agregacion u otros procesos. Tras la reconstitucion de las enzimas en un entorno que contiene disolvente, se observa frecuentemente una disminucion de la actividad enzimatica. Ventajosamente, en los estudios subyacentes a la presente invencion se ha encontrado que la reduccion de dicha actividad enzimatica que se produce durante la fabricacion y/o el almacenamiento de las composiciones secas complejas de la presente invencion se puede prevenir significativamente mediante la adicion del al menos un soluto compatible, tal como se ha especificado con detalle en otra parte del presente documento. El descubrimiento es sorprendente ya que se ha notificado que la ectoma y derivados de la misma son insuficientes para prevenir la agregacion, por ejemplo, de la lactato deshidrogenasa lo que tambien da como resultado una reduccion de la actividad enzimatica (Andersson 2000, loc cit.). Ademas, tambien es sorprendente que el efecto preservativo se produce incluso en las condiciones redox sensibles presentes en la composicion mas bien compleja carente de disolvente de la presente invencion. De modo interesante, y tambien sorprendente, no se observo un efecto preservativo de la ectoma en solucion para las deshidrogenasas investigadas. En particular, la actividad enzimatica presente en una composicion seca que tiene los componentes de la composicion de la invencion excepto el al menos un soluto compatible se ha encontrado en los estudios subyacentes a la presente invencion que disminuye en el estado seco y durante el almacenamiento en condiciones secas y a temperaturas por encima de 4 °C. En particular, se ha encontrado que solo aproximadamente un 50 % de la actividad enzimatica de, por ejemplo, una glucosa deshidrogenasa esta presente tras 3 semanas de almacenamiento a 45 °C y solo aproximadamente un 55 % de la actividad enzimatica de, por ejemplo, una diaforasa se mantiene en dichas condiciones. Sin embargo, se podfan mantener actividades enzimaticas significativamente mayores en los estudios que subyacen a la presente invencion cuando estaba presente en la composicion el al menos un soluto compatible que era ectoma o un derivado de la misma. Una ventaja adicional de la composicion de la presente invencion es que el soluto compatible aplicado en la composicion no interfiere con el sistema de deteccion optica. En particular, no interfiere con las senales opticas generadas ni tampoco afecta a la estabilidad o la funcion del reactivo indicador, el cofactor redox, o el agente capaz de inducir el al menos un cambio optico. Asimismo, la conversion enzimatica y las tasas de conversion no se ven afectadas, preferentemente, por el soluto
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compatible.
En una realizacion preferente de la composicion de la presente invencion, el soluto compatible esta presente en cantidades de al menos un 3 % (p/p), al menos un 4 % (p/p), al menos un 5 % (p/p), al menos un 6 % (p/p), al menos un 7 % (p/p) o al menos un 8 % (p/p).
En una realizacion preferente de la composicion de la presente invencion, dicha composicion comprende ademas al menos un estabilizante, un detergente, un agente de hinchamiento, un agente formador de pelfcula, y/o una partfcula solida. Estabilizantes, detergentes, agentes de hinchamiento, agentes formadores de pelfcula, agentes oxidantes y/o partfculas solidas adecuados para su uso en la composicion de la invencion son conocidos por el experto en la materia.
Preferentemente, el dicho al menos un estabilizante es polivinilpirrolidona y, mas espedficamente, PVP K25.
Preferentemente, el dicho al menos un detergente se selecciona entre el grupo que consiste en: N-metil-n-oleoil- taurato de sodio, N-octanoil-N-metil-glucamida, Mega 8 (N-metil-N-octanoil-glucamida), sulfosuccinato de dioctil- sodio (DONS), Rhodapex® (preferentemente CO-433 o CO-436).
Preferentemente, el dicho al menos un agente de hinchamiento se selecciona entre el grupo que consiste en: copolfmero de metil vinil eter y anhndrido de acido maleico, goma de xantano y copolfmero de metil vinil eter y acido maleico.
Preferentemente, el dicho al menos un agente formador de pelfcula se selecciona entre el grupo que consiste en: dispersiones de propionato de polivinilo, esteres polivimlicos, acetatos polivimlicos, esteres poliacnlicos, acido polimetacnlico, polivinil amidas, poliamidas, poliestireno y tambien son adecuados polimerizados mixtos tales como de butadieno, estireno o ester de acido maleico.
Preferentemente, la dicha al menos una partfcula solida se selecciona entre el grupo que consiste en: partfculas de sflice, en particular, dioxido de silicio, silicatos de sodio o silicatos de aluminio, tierra de diatomeas, oxidos metalicos, en particular, oxido de titanio y/o oxido de aluminio, materiales de oxidos sinteticos, en particular, nanopartfculas de materiales de oxidos tales como nanopartfculas de dioxido de silicio, oxido de aluminio, u oxido de titanio, caolm, polvo de vidrio, sflice amorfa, sulfato de calcio, y sulfato de bario.
En una realizacion particularmente preferente de la composicion de la invencion, dicha composicion comprende e, incluso mas preferentemente, consiste esencialmente en los componentes enumerados en la Tabla 1 de los Ejemplos adjuntos.
Todas las definiciones y explicaciones para los terminos elaborados anteriormente en el presente documento se aplican mutatis mutandis a las realizaciones descritas a continuacion. Definiciones y explicaciones adicionales elaboradas adicionalmente mas adelante tambien se aplican mutatis mutandis a todas las realizaciones descritas en esta memoria descriptiva.
La presente invencion se refiere a un elemento de ensayo de diagnostico para la determinacion de un analito en una muestra de un fluido corporal que comprende la composicion de la presente invencion y un soporte.
El termino "soporte" usado en el contexto de la presente invencion se refiere a un soporte solido al que se puede aplicar la composicion de la presente invencion. Preferentemente, la composicion se puede inmovilizar sobre el soporte. Ademas, se preve tambien que la composicion se puede disponer espacialmente sobre el soporte. El soporte se puede disponer de una manera tal que permita la deteccion del cambio de la al menos una propiedad optica del reactivo indicador, es decir, preferentemente no comprende componentes o disposiciones espaciales que interfieran con la deteccion de la al menos una propiedad optica. Soportes adecuados pueden comprender viales que contienen la composicion de la presente invencion, por ejemplo, viales dispuestos en un formato de placa con pocillos. Otros ensayos pueden aplicar guiaondas opticos o placas semiconductoras. Soportes preferidos son, no obstante, los usados para las tiras de ensayo. Dichas tiras de ensayo comprenden normalmente una o mas capas que forman un soporte solido.
El termino "muestra de un fluido corporal", tal como se usa en el presente documento, se refiere a todos los fluidos corporales de los que se conoce o se sospecha que comprenden el analito que se va a determinar. Fluidos corporales preferentes conocidos por comprender una pluralidad de analitos diagnosticamente relevantes son la sangre, incluyendo sangre completa, plasma y suero, orina, saliva, lfquido cefalorraqrndeo, lfquido sinovial, y sudor. Mas preferentemente, la muestra de fluido corporal de acuerdo con la presente invencion es una muestra de sangre completa.
El termino "analito", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molecula biologica presente en la muestra de fluido corporal, cuya presencia, ausencia o cantidad sera determinada de acuerdo con la presente invencion. Puesto que la determinacion descrita en el presente documento se basa en la actividad enzimatica de una
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deshidrogenasa, se entendera que dicho analito es un sustrato de la deshidrogenasa comprendida por la composicion. Analitos preferentes previstos para ser determinados de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo, mediante los elementos de ensayo de diagnostico mencionados anteriormente, son glucosa, maltosa, manosa, galactosa, glutamato, glucosa-6-fosfato, etanol o lactosa y, mas preferentemente, glucosa.
Preferentemente, los elementos de ensayo de diagnostico de la invencion comprenden un area de ensayo que contiene dicha composicion, en el que el area de ensayo tiene una cara de aplicacion de la muestra a la que se aplica la muestra de fluido corporal y una cara de deteccion que permite la deteccion de un cambio en una propiedad optica cuando el analito reacciona con la composicion. La muestra se ha a aplicar a la cara de aplicacion de la muestra y se preve, preferentemente, que celulas tales como los eritrocitos presentes en muestras de sangre, no alcancen la cara de deteccion.
Detalles sobre tal elemento de ensayo y la fabricacion del mismo se pueden encontrar en el documento EP 0 821 234 B1 que se incorpora por referencia en el presente documento. Elementos de ensayo adicionales previstos de acuerdo con la presente invencion son los divulgados en los documentos EP 1 035 919 Bl o EP 1 035 920 B1, cuyo contenido descriptivo respectivo se incorpora por referencia en el presente documento.
Espedficamente, el area de ensayo del elemento de ensayo de diagnostico de la invencion comprende, preferentemente, una lamina transparente sobre la cual se aplican una primera y una segunda capa de pelmula, estando colocada una encima de otra en este orden. Es importante que la primera capa situada sobre la lamina transparente disperse la luz considerablemente menos que la segunda depositada encima. La cara no recubierta de la lamina transparente se denomina cara de deteccion, y la cara de la segunda capa que esta opuesta a la cara sobre la que la segunda capa se apoya sobre la primera capa se denomina cara de aplicacion de la muestra.
Las capas de pelmula del elemento de ensayo de diagnostico de acuerdo con la invencion se producen a partir de dispersiones o emulsiones de formadores de pelmula polimericos. Las dispersiones de formadores de pelmula contienen partmulas polimericas microscopicas que son insolubles en el lfquido portador (normalmente agua) y se dispersan finamente en el lfquido portador. Si el lfquido se elimina mediante evaporacion durante la formacion de la pelmula, las partmulas se aproximan entonces y se tocan con precision entre sf. Las elevadas fuerzas que se producen en el proceso y la ganancia de energfa superficial asociada a la formacion de la pelmula dan como resultado un crecimiento de las partmulas en una capa de pelmula sustancialmente cerrada. De modo alternativo, tambien es posible usar una emulsion del formador de pelmula en la que este esta disuelto en un disolvente. El polfmero disuelto se emulsiona en un lfquido portador que es inmiscible con el disolvente. Esteres polivimlicos, acetatos polivimlicos, esteres poliacnlicos, acido polimetacnlico, polivinil amidas, poliamidas y poliestireno son particularmente adecuados como polfmeros para tales formadores de pelmula. Ademas de los homopolfmeros, tambien son adecuados polimerizados mixtos tales como de butadieno, estireno o ester de acido maleico.
Las asf denominadas capas de pelmula se localizan sobre una lamina transparente en el area de ensayo del soporte de ensayo de diagnostico de acuerdo con la invencion. Para esto, se tienen en cuenta laminas de plastico que son impermeables a los lfquidos. Una lamina de policarbonato ha demostrado ser particularmente adecuada.
Las dos capas de pelmula se pueden producir a partir de compuestos de recubrimiento que contienen los mismos formadores de pelmula polimericos o se pueden producir a partir de compuestos de recubrimiento que contienen distintos formadores de pelmula polimericos.
Mientras que la primera capa contiene un agente de hinchamiento y opcionalmente una carga que disperse debilmente la luz, la segunda capa requiere un agente de hinchamiento y en cualquier caso al menos un pigmento que disperse considerablemente la luz. Ademas, la segunda capa puede contener tambien cargas no porosas al igual que cargas porosas.
Mediante la adicion del agente de hinchamiento que se hincha bien (es decir, una sustancia que aumenta su volumen cuando absorbe agua) no solo se obtienen capas que pueden ser penetradas facilmente por el lfquido de la muestra sino que tambien tienen buenas propiedades de separacion de celulas, por ejemplo eritrocitos y adicionalmente tambien pigmentos de la sangre, a pesar de este efecto de apertura por parte del agente de hinchamiento. Las propiedades de hinchamiento deben ser tan buenas que, para un ensayo en el que el cambio de la al menos una propiedad optica depende principalmente de la penetracion del lfquido de la muestra a traves de la capa, el cambio de la propiedad optica sea medible despues de un maximo de un minuto. Agentes de hinchamiento especialmente adecuados han demostrado ser el copolfmero de metil vinil eter y anlmdrido de acido maleico, la goma de xantano y el copolfmero de metil vinil eter y acido maleico.
La cantidad de pigmento que dispersa considerablemente la luz en la segunda capa es de al menos un 25 % en peso con respecto a la capa doble seca lista para su uso del area de ensayo. Puesto que las cargas que dispersan debilmente la luz y los pigmentos que dispersan considerablemente la luz son esenciales para las propiedades opticas de las capas de pelmula, la primera y la segunda capa de pelmula tienen diferentes cargas y pigmentos.
La primera capa de no pelmula debe contener cargas o debe contener aquellas cargas cuyo mdice de refraccion esta proximo al mdice de refraccion del agua. El dioxido de silicio, silicatos y silicatos de aluminio han demostrado
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ser particularmente adecuados para ello. Particularmente preferente es un silicato de sodio y aluminio con el nombre comercial Transpafill.RTM®. Este tiene una composicion promedio de un 66 % en peso de SiO2, un 26 % en peso de Al2O3, un 7 % en peso de Na2O y un 1 % en peso de SO3. El tamano de granulado promedio de las partfculas primarias particularmente preferentes es de aproximadamente 0,06 pm.
De acuerdo con la invencion, la segunda capa debe dispersar muy considerablemente la luz. Idealmente, el mdice de refraccion de los pigmentos en la segunda capa de pelfcula debe ser de al menos 2,5. Por tanto, se usa preferentemente el dioxido de titanio. Las partfculas con un diametro promedio de aproximadamente 0,2 a 0,8 pm han demostrado ser particularmente ventajosas. Tipos de dioxido de titanio facilmente procesables en la modificacion anatasa son muy especialmente preferentes.
Es posible que la composicion de la invencion este comprendida en una capa de pelfcula, preferentemente, la primera capa de pelfcula. No obstante, tambien es posible que la composicion de la presente invencion este presente en ambas capas de pelfcula.
A fin de optimizar el area de ensayo en el soporte de ensayo de diagnostico de acuerdo con la invencion, ha demostrado ser particularmente ventajoso cuando ambas capas de pelfcula contienen un agente humectante no hemolftico. Agentes humectantes neutros, es decir, no cargados son particularmente preferentes para ello. La N- octanoil-N-metil-glucamida es el mas particularmente preferente.
A fin de producir un area de ensayo de un elemento de ensayo de diagnostico de acuerdo con la invencion cada una de las capas de pelfcula respectivas se producen sucesivamente a partir de una dispersion homogenea de dichos componentes. Para esto se usa la lamina transparente como base para formar el compuesto de recubrimiento para la primera capa de pelfcula. Una vez que se ha aplicado el compuesto de recubrimiento para la primera capa de pelfcula con un espesor de capa particular, se seca la capa. A continuacion, se aplica a esta capa el compuesto de recubrimiento para la segunda capa, tambien con un espesor de capa fino y se seca. Tras el secado, el espesor de la primera y la segunda capa de pelfcula deben ser en conjunto de no mas de 0,20 mm, preferentemente de no mas de 0,12 mm, en particular preferentemente de no mas de 0,08 mm.
El area de ensayo producida de esta manera se puede montar sobre una capa de soporte para una mejor manipulacion, teniendo en cuenta para tal capa aquellos materiales que no absorban el lfquido que se va a examinar. Estos son los asf denominados materiales no absorbentes, siendo particularmente preferentes las laminas de plastico hechas, por ejemplo, de poliestireno, cloruro de polivinilo, poliester, policarbonato o poliamida. Laminas de metal o de vidrio son adecuadas como materiales de soporte adicionales.
En una realizacion preferente del elemento de ensayo de acuerdo con la invencion, la cara de deteccion del area de ensayo que se ha de observar y medir para determinar un cambio en al menos una propiedad optica del reactivo indicador debe ser visible a traves de la capa de soporte a fin de determinar el analito que se ha de detectar en la muestra corporal. Esto se puede conseguir mediante una capa de soporte transparente. No obstante, tambien es posible que la capa de soporte tenga una perforacion que este cubierta por la cara de deteccion del area de ensayo. La cara de deteccion, por tanto, es visible a traves de la perforacion. Preferentemente, en un elemento de ensayo de diagnostico de acuerdo con la invencion hay una perforacion en la capa de soporte por debajo de la cara de deteccion del area de ensayo a traves de la cual se puede observar la cara de deteccion del area de ensayo. La perforacion tiene un diametro algo menor que la dimension lineal del area de ensayo de modo que el area de ensayo por fuera de la perforacion se apoya en la capa de soporte y puede estar unida a ella.
La presente invencion se refiere adicionalmente a un metodo para la fabricacion de un elemento de ensayo de diagnostico que comprende la etapa de producir una composicion de acuerdo con la presente invencion sobre un soporte solido.
En una realizacion preferente de dicho metodo de la invencion, dicha produccion comprende las etapas de:
(i) aplicar una composicion que comprende los componentes (a) a (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) a un area de ensayo sobre el soporte; y
(ii) eliminar dicho disolvente de la composicion;
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(i) aplicar una composicion que comprende los componentes (a), (b), (d) y (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) a un area de ensayo sobre el soporte en una primera capa;
(ii) eliminar dicho disolvente de la composicion de la primera capa;
(iii) aplicar una composicion que comprende los componentes (c) a (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) en una segunda capa sobre la primera capa; y
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(iv) eliminar dicho disolvente de la composicion de la segunda capa;
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(i) aplicar una composicion que comprende los componentes (a), (b), (d) y (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) a un area de ensayo sobre el soporte en una primera capa;
(ii) eliminar dicho disolvente de la composicion de la primera capa;
(iii) aplicar una composicion que comprende los componentes (b) a (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) en una segunda capa sobre la primera capa; y
(iv) eliminar dicho disolvente de la composicion de la segunda capa;
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(i) aplicar una composicion que comprende los componentes (a), (d) y (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) a un area de ensayo sobre el soporte en una primera capa;
(ii) eliminar dicho disolvente de la composicion de la primera capa;
(iii) aplicar una composicion que comprende los componentes (b) a (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) en una segunda capa sobre la primera capa; y
(iv) eliminar dicho disolvente de la composicion de la segunda capa;
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(i) aplicar una composicion que comprende los componentes (c) a (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) a un area de ensayo sobre el soporte en una primera capa;
(ii) eliminar dicho disolvente de la composicion de la primera capa;
(iii) aplicar una composicion que comprende los componentes (a), (b), (d) y (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) en una segunda capa sobre la primera capa; y
(iv) eliminar dicho disolvente de la composicion de la segunda capa.
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(i) aplicar una composicion que comprende los componentes (b) a (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) a un area de ensayo sobre el soporte en una primera capa;
(ii) eliminar dicho disolvente de la composicion de la primera capa;
(iii) aplicar una composicion que comprende los componentes (a), (b), (d) y (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) en una segunda capa sobre la primera capa; y
(iv) eliminar dicho disolvente de la composicion de la segunda capa.
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(i) aplicar una composicion que comprende los componentes (b) a (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) a un area de ensayo sobre el soporte en una primera capa;
(ii) eliminar dicho disolvente de la composicion de la primera capa;
(iii) aplicar una composicion que comprende los componentes (a), (d) y (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) en una segunda capa sobre la primera capa; y
(iv) eliminar dicho disolvente de la composicion de la segunda capa.
Preferentemente, la composicion se aplica a una capa de deteccion en el area de ensayo. La capa de deteccion se puede producir en particular mediante al menos un proceso qmmico humedo, mas en particular a partir de una o mas dispersiones, preferentemente dispersiones acuosas de la composicion de la presente invencion. Dichos procesos de formacion de capas a partir de una o mas dispersiones son conocidos en principio por el experto en la materia, y se puede hacer referencia a modo ilustrativo, por ejemplo, a la tecnica anterior mencionada previamente EP 0 821 234 B1.
El disolvente se puede eliminar de la composicion tras la aplicacion de dicha composicion al area de ensayo del elemento de ensayo mediante todas las tecnicas conocidas para la eliminacion de disolventes que incluyen
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tratamiento termico, evaporacion o liofilizacion. Preferentemente, dicho disolvente de la etapa (b) se elimina sustancialmente mediante tratamiento termico.
Tambien preferentemente, dicho soluto compatible reduce la disminucion de la actividad enzimatica de al menos una enzima en la composicion y, en particular, durante la eliminacion sustancial del disolvente en la etapa (b) que se consigue, por ejemplo, mediante tratamiento termico y durante el mantenimiento de la composicion en condiciones secas sobre el elemento de ensayo.
La presente invencion contempla tambien, en principio, el uso de al menos un soluto compatible, que es ectoma o un derivado de la misma, para prevenir una reduccion de la actividad enzimatica de al menos una enzima en una composicion en condiciones secas, en el que dicha composicion comprende una deshidrogenasa, un cofactor redox, un agente capaz de inducir un cambio en al menos una propiedad optica de un reactivo indicador en presencia de equivalentes redox, y un reactivo indicador.
Preferentemente, dicho al menos un soluto compatible en la composicion en condiciones secas esta comprendido en un elemento de ensayo de diagnostico, preferentemente un elemento de ensayo de diagnostico tal como se ha especificado anteriormente con detalle.
La presente invencion se refiere tambien a un metodo para determinar la presencia o la cantidad de un analito en una muestra de fluido corporal que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto el elemento de ensayo de diagnostico de la invencion con un fluido corporal del que se sospecha que comprende el analito en condiciones adecuadas para transformar la al menos una enzima a su estado reconstituido;
(b) medir un cambio en al menos una propiedad optica del reactivo indicador en la composicion humedecida que comprende al menos una enzima en estado reconstituido sobre el elemento de ensayo de diagnostico, mediante el cual se determinara la presencia o la cantidad del analito en la muestra de fluido corporal.
Como ya se ha expuesto en otra parte en el presente documento, dependiendo de la especificidad del sustrato de la deshidrogenasa que se va a usar en la composicion sobre el elemento de ensayo de diagnostico, se pueden determinar diferentes analitos mediante el metodo de la invencion.
"Poner en contacto", tal como se usa en el presente documento, significa que la muestra de fluido corporal se aplica al soporte de tal modo que permite el contacto ffsico de la composicion de la invencion comprendida por el soporte y la muestra de fluido corporal. En particular, el ponerlos en contacto se lleva a cabo durante un tiempo y en unas condiciones que son suficientes para permitir que la deshidrogenasa sea reconstituida, es decir, humedecida y disuelta y llegue a ser por tanto, biologicamente activa. Las condiciones adecuadas dependen del soporte de diagnostico y son conocidas en la tecnica. La muestra de fluido corporal aplicada al elemento de ensayo, preferentemente, tiene un volumen de menos de 2 microlitros, mas particularmente de menos de 1 microlitro.
Tras la reconstitucion de dicha deshidrogenasa biologicamente activa, la enzima se unira a su sustrato, es decir, al analito comprendido en la muestra de fluido corporal, y lo convertira en el producto correspondiente y equivalentes redox. Los equivalentes redox generados por la deshidrogenasa permiten determinar la actividad de la deshidrogenasa ya que los equivalentes redox, generados por la conversion enzimatica catalizada por la deshidrogenasa, son transferidos al reactivo indicador por el agente capaz de inducir un cambio en al menos una propiedad optica del reactivo indicador en presencia de equivalentes redox en la composicion comprendida. El cambio en la al menos una propiedad optica del reactivo indicador se puede medir. Dependiendo del elemento de ensayo de diagnostico, la medicion del cambio de la propiedad optica se puede conseguir mediante tecnicas diferentes descritas en otra parte del presente documento con mas detalle. Para detectar el cambio de una propiedad optica tal como el color, se puede usar un detector optico que resuelve espacialmente. Un "detector optico que resuelve espacialmente" se ha de entender que significa un detector optico que tiene una multiplicidad de sensores opticos que son capaces de registrar regiones de la cara de deteccion de la capa de deteccion que no son completamente congruentes. Mas en particular, el detector optico que resuelve espacialmente puede comprender al menos un sensor de imagen, es decir, un grupo de detectores opticos que puede ser unidimensional o bidimensional. Mas en particular, el detector optico puede comprender, por tanto, un chip CCD y/o un chip CMOS. Ademas, el detector optico que resuelve espacialmente puede comprender al menos un elemento optico para la formacion de imagenes de la cara de deteccion y/o la capa de deteccion sobre una superficie sensible a las imagenes del detector optico que resuelve espacialmente.
Un cambio en al menos una propiedad optica medido mediante el metodo descrito anteriormente sera indicativo de la presencia del analito. El experto en la materia entendera que a fin de determinar la cantidad de un analito, podna ser necesario comparar el grado del cambio de la propiedad optica. Para este fin, ademas, podna ser necesario comparar una senal detectada asociada al cambio optico con senales asociadas a cambios opticos inducidos por cantidades conocidas de los analitos, es decir, senales de calibracion. El modo en que se puede establecer tal calibracion es bien conocido por el experto habitual en la materia.
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El termino "cantidad", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad absoluta o relativa del analito presente en una muestra aplicada al elemento de ensayo de diagnostico. Una cantidad relativa preferente de acuerdo con la presente invencion es la concentracion, es decir, la cantidad en relacion con el volumen.
FIGURAS
Fig. 1: Se indican los valores promedio de la actividad en comparacion con la cantidad de estabilizante (soluto compatible). Se ha restado la actividad determinada en los elementos de ensayo sin estabilizante.
Fig. 2: Vista grafica del efecto estabilizante de la ectoma y la hidroxiectoma sobre la glucosa deshidrogenasa y la diaforasa.
Fig. 3: Vista grafica de la temperatura de almacenamiento en comparacion con el nivel de glucosa medido como indicador de la actividad enzimatica. A) sin estabilizante; B) ectoma; 1 g/100 g de composicion; C) hidroxiectoma, 1 g/100 g de composicion;
Fig. 4: Influencia de diferentes tampones usados en las composiciones de recubrimiento. A) tampon PO4, pH 6,8, sin estabilizante; tras 45 dfas; de 45 °C a 4 °C; B) tampon PO4, pH 6,8, 2 g de ectoma por 100 g de RF; tras 45 dfas; de 45 °C a 4 °C; C) HEPES pH 7,1, sin estabilizante; tras 45 dfas; de 45 °C a 4 °C; D) HEPES pH 7,1, 2 g de ectoma por 100 g de Rf; tras 45 dfas; de 45 °C a 4 °C;
Fig. 5: El efecto estabilizante de la ectoma sobre la Gluc-DOR y el mutante 31 de la Gluc-DOR ya es observable al cabo de 3 semanas a 45 °C.
Ejemplos
Ejemplo 1: Generacion de tiras de ensayo
Se produjeron cuatro pelmulas de reaccion diferentes para determinar los niveles de glucosa y se aplicaron como recubrimiento sobre una lamina esencialmente tal como se describe en el documento EP 0 821 234, Ejemplo 1. La formulacion de la composicion se muestra en la siguiente tabla 1.
Tabla 1: Componentes por 100 g de la pelicula del primer recubrimiento antes del secado
Glucosa deshidrogenasa de Bacillus subtilis
1 09 g 1 09 g 1 09 g 1 09 g
Diaforasa de Bacillus subtilis
0 77 g 0 77 g 0 77 g 0 77 g
NAD
0 58 g 0 58 g 0 58 g 0 58 g
Tampon fosfato de Na/K o HEPES
0 35 g 0 35 g 0 35 g 0 35 g
ectoma o hidroxiectoma
0 00 g 1 00 g 2 00 g 4 00 g
Goma de xantano
0 29 g 0 29 g 0 29 g 0 29 g
Sflice FK 320DS
5 80 g 5 80 g 5 80 g 5 80 g
N-metil-n-oleoil-taurato de sodio
0 03 g 0 03 g 0 03 g 0 03 g
N-octanoil-N-metil-glucamida
0 17 g 0 17 g 0 17 g 0 17 g
Polivinilpirrolidona
0 86 g 0 86 g 0 86 g 0 86 g
Cloruro de tetraetilamonio
0 07 g 0 07 g 0 07 g 0 07 g
Sal de hexasodio del acido 2,18-fosforomolibdenico
0 33 g 0 33 g 0 33 g 0 33 g
Dispersion - Propionato de polivinilo (50 % p/p en agua)
5 00 g 5 00 g 5 00 g 5 00 g
K3[Fe(CN)6]
0 01 g 0 01 g 0 01 g 0 01 g
2-metil-2-butanol
1 00 g 1 00 g 1 00 g 1 00 g
anadir agua hasta 100 g
Se ajusto el pH a 6,8 y la composicion se aplico como recubrimiento en forma de pelmula (aproximadamente 120 micrometros) sobre una lamina de policarbonato (125 micrometros). La composicion aplicada como recubrimiento se seco posteriormente a 50 °C.
Se aplico un segundo recubrimiento al primer recubrimiento sobre la lamina tal como sigue:
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Tabla 2: Componentes de la pelicula del segundo recubrimiento
Gantrez
1,47 g
N-metil-n-oleoil-taurato de sodio
0,03 g
PVP K25
2,01 g
Mega 8
0,37 g
Cloruro de tetraetilamonio
0,45 g
Sflice FK 320DS
2,00 g
Dioxido de titanio E171
22,00 g
Dispersion- Propionato de polivinilo (50 % p/p en agua)
6,25 g
Cloruro de bis-(2-hidroxietil)-(4-hidroxiiminociclohexa-2,5-dienilidin)-amonio
0,48 g
Sal de hexasodio del acido 2,18-fosforomolibdenico
1,41 g
K3[Fe(CN)6]
0,01 g
2-metil-2-butanol
1,00 g
anadir agua hasta 100 g
Se ajusto el pH a 6,8 y la composicion se aplico como recubrimiento en forma de una segunda pelmula (aproximadamente 25 micrometros) sobre la primera pelmula aplicada como recubrimiento sobre la lamina. La composicion aplicada como recubrimiento se seco posteriormente a 50 °C. Se produjeron tiras de ensayo para la determinacion de glucosa tal como se describe en el documento EP 0 821 234, secciones ([0063 -0067]).
Ejemplo 2: Determinacion de la actividad enzimatica en el elemento de ensayo
Los elementos de ensayo se almacenaron en viales de plastico en presencia de un agente desecante durante 6 semanas a 45 °C. En una etapa posterior, el area de ensayo de un elemento de ensayo se eluyo con ultrasonidos usando tampon de elucion. En el sobrenadante se determino la actividad enzimatica.
Tabla 3: Tampon de elucion y tecnica de deteccion para las diferentes actividades enzimaticas
Tampon de elucion tecnica de deteccion
Glucosa deshidrogenasa
Tris/HCl, NaCl, NAD; pH 8,5 Deteccion UV a 340 nm
Diaforasa
Tris/HCl, NaCl. Triton; pH 8,8 INT ^ Sal Tetrazolio; deteccion a 492 nm
Los resultados se muestran en la Fig. 1. La Figura muestra que hay un efecto estabilizante significativo (mas de un 10 %) para las concentraciones de ectoma mayores de 0,3 g por l00 g de composicion de recubrimiento. Se puede observar el mismo efecto para la hidroxiectoma tal como se muestra en la Fig. 2. Asimismo, la Figura muestra que la deshidrogenasa al igual que la diaforasa estan estabilizadas.
Ejemplo 3: Determinacion de la actividad enzimatica en el elemento de ensayo
Los elementos de ensayo se almacenaron en viales de plastico en presencia de un agente desecante durante 63 dfas a 4 °C (KS), 24 °C (RT), 35 °C (DT), y 45 °C (HT). Los elementos de ensayo se usaron para determinar los niveles de glucosa en sangre en una pluralidad de muestras de sangre venosa. Las muestras se midieron con un metodo de referencia (Hitachi) en paralelo. Los resultados se normalizaron con respecto a los elementos de ensayo almacenados en condiciones KS.
En la Figura 3, se indica la temperatura de almacenamiento asf como el nivel de glucosa medido como indicador de la actividad enzimatica. Como es evidente, la ectoma y la hidroxiectoma actuan como estabilizantes y preservan las actividades enzimaticas.
Ejemplo 4: Determinacion de la actividad enzimatica en el elemento de ensayo con diferentes tampones
Los elementos de ensayo se almacenaron y se trataron esencialmente tal como se describe en el Ejemplo 3. Se usaron diferentes tampones, principalmente un tampon fosfato pH 6,8, sin estabilizante, un tampon fosfato pH 6,8, 2 g de ectoma por 100 g de pelmula del primer recubrimiento, un tampon HEPES pH 7,1, sin estabilizante, y un tampon HEPES pH 7,1, 2g de ectoma por 100 g de pelmula del primer recubrimiento, en las composiciones de recubrimiento tal como se indica en la Figura 4. Como resulta evidente a partir de la Figura, se observo la actividad
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estabilizante de la ectoma, independiente del sistema de tamponado.
Ejemplo 5: Determinacion de la actividad enzimatica de un mutante 2 de glucosa deshidrogenasa en solucion y dependencia de la ectoma o la hidroxiectoma
Se combinaron altouotas de una solucion que comprendfa el mutante 2 de glucosa deshidrogenasa tal como se divulga en el documento WO2011/020856 con diferentes cantidades de ectoma o hidroxiectoma tal como se indica en la Tabla 4.
Tabla 4: Soluciones estabilizantes
Ej. N.°
contenido Estabilizante y concentracion
1
Glucosa deshidrogenasa Mut. 2 3000 U/ml, NAD 10 mg/ml; Fosfato K-Na 15 mM, pH 6,8. 0 (referencia)
2
idem ectoma 4 % (p/v)
3
idem ectoma 2 % (p/v)
4
idem ectoma 1 % (p/v)
5
idem hidroxiectoma 4 % (p/v)
6
idem hidroxiectoma 2 % (p/v)
7
idem hidroxiectoma 1 % (p/v)
Las altouotas se almacenaron en diferentes condiciones de almacenamiento (8 dfas a 4 °C; 8 dfas a 35 °C, 4 dfas a 4 °C seguido de 4 dfas a 45 °C) y se determino la actividad enzimatica tras el almacenamiento. Los resultados se muestran en la Tabla 5. No se pudo determinar un efecto estabilizante ni de la ectoma ni de la hidroxiectoma en solucion.
Tabla 5: Resultados
Ej. N.°
Nota Unidades 8 dfas a 4 °C 8 dfas a 35 °C 4 dfas a 4 °C, 4 dfas a 45 °C
1
referencia kU/g 213 126 50
2
ectoma aprox. 4 % kU/g 207 137 57
3
ectoma aprox. 2 % kU/g 222 149 59
4
ectoma aprox. 1 % kU/g 222 144 60
5
hidroxiectoma aprox. 4 % kU/g 207 131 56
6
hidroxiectoma aprox. 2 % kU/g 221 141 60
7
hidroxiectoma aprox. 1 % kU/g 208 122 52
Ejemplo 6: Evaluacion de los elementos de ensayo con Gluc-DOR (= Glucosa deshidrogenasa dependiente de PQQ)
Se produjo un elemento de ensayo con Gluc-DOR y un mutante de la misma (Gluc-DOR 31) tal como se describe en el Ejemplo 1 anterior. El elemento de ensayo se analizo tal como se describe en el Ejemplo 2 anterior. La determinacion de la actividad enzimatica se llevo a cabo usando nitrosoanilina tal como se describe en el documento EP 0 620 283 B1. Como resulta evidente a partir de la Figura 5, se observa ya un efecto estabilizante tras 3 semanas a 45 °C.

Claims (12)

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    REIVINDICACIONES
    1. Una composicion seca que comprende los componentes:
    (a) una deshidrogenasa;
    (b) un cofactor redox;
    (c) un agente capaz de inducir un cambio en al menos una propiedad optica de un reactivo indicador en presencia de equivalentes redox;
    (d) un reactivo indicador; y
    (e) al menos un soluto compatible que es ectoma o un derivado de la misma, en la que dicha deshidrogenasa es una glucosa deshidrogenasa y
    en la que dicho derivado de ectoma se selecciona entre el grupo que consiste en: hidroxiectoma, homoectoma, un ester de hidroxiectoma, un eter de hidroxiectoma, un derivado de sulfonilo de ectoma o un derivado de sulfonilo esterificado de ectoma y una amida de un derivado de sulfonilo de ectoma.
  2. 2. La composicion de la reivindicacion 1, en la que dicha glucosa deshidrogenasa se selecciona del grupo que consiste en: glucosa deshidrogenasa (numero EC 1.1.1.47), quinoprotema glucosa deshidrogenasa (numero EC
    1.1.5.2) , en particular, glucosa deshidrogenasa dependiente de pirrolo quinolina quinona (PQQ) (numero EC
    1.1.5.2) , glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (numero EC 1.1.1.49), glucosa deshidrogenasa dependiente de nicotinamida adenina dinucleotido (NAD) (numero EC 1.1.1.119) y glucosa deshidrogenasa dependiente de flavina adenina dinucleotido (FAD) (numero EC 1.1.99.10) o mutantes enzimaticamente activos de las mismas.
  3. 3. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que dicho un agente capaz de inducir un cambio en la al menos una propiedad optica en presencia de equivalentes redox es capaz de transferir dichos equivalentes redox del cofactor redox al reactivo indicador.
  4. 4. La composicion de la reivindicacion 3, en la que dicho agente es (i) una diaforasa, preferentemente una lipoamida deshidrogenasa o una NADH deshidrogenasa, (ii) una fenazina, preferentemente etosulfato de fenazina, metosulfato de fenazina, trifluorometanosulfonato de 1-(3-carboxipropoxi)-5-etilfenazinio o metosulfato de 1-metoxifenazina, (iii) una nitrosoanilina, preferentemente clorhidrato de [(4-nitrosofenil)imino]dimetanol o (iv) una quinona, preferentemente, fenantrenoquinona, fenantrolinquinona, o benzo[h]-quinolinquinona.
  5. 5. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho cofactor redox se selecciona entre el grupo que consiste en: carba-NAD, NAD, FAD y PQQ.
  6. 6. Un elemento de ensayo de diagnostico para la determinacion de un analito en una muestra de fluido corporal que comprende la composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 sobre un soporte.
  7. 7. El elemento de ensayo de la reivindicacion 6, en el que dicho soporte comprende un area de ensayo que contiene dicha composicion, en el que el area de ensayo tiene una cara de aplicacion de la muestra sobre la que se aplica la muestra de fluido corporal y una cara de deteccion que permite la deteccion del cambio en al menos una propiedad optica del reactivo cuando el analito reacciona con la composicion.
  8. 8. Un metodo para la fabricacion de un elemento de ensayo de diagnostico que comprende la etapa de producir una composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 sobre un soporte.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 8, en el que dicha produccion comprende las etapas de:
    (i) aplicar una composicion que comprende los componentes (a) a (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) a un area de ensayo sobre el soporte; y
    (ii) eliminar dicho disolvente de la composicion;
    o
    (i) aplicar una composicion que comprende los componentes (a), (b), (d) y (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) a un area de ensayo sobre el soporte en una primera capa;
    (ii) eliminar dicho disolvente de la composicion de la primera capa;
    (iii) aplicar una composicion que comprende los componentes (c) a (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) en una segunda capa sobre la primera capa; y
    (iv) eliminar dicho disolvente de la composicion de la segunda capa;
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    (i) aplicar una composicion que comprende los componentes (a), (b), (d) y (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) a un area de ensayo sobre el soporte en una primera capa;
    (ii) eliminar dicho disolvente de la composicion de la primera capa;
    (iii) aplicar una composicion que comprende los componentes (b) a (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) en una segunda capa sobre la primera capa; y
    (iv) eliminar dicho disolvente de la composicion de la segunda capa;
    o
    (i) aplicar una composicion que comprende los componentes (a), (d) y (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) a un area de ensayo sobre el soporte en una primera capa;
    (ii) eliminar dicho disolvente de la composicion de la primera capa;
    (iii) aplicar una composicion que comprende los componentes (b) a (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) en una segunda capa sobre la primera capa; y
    (iv) eliminar dicho disolvente de la composicion de la segunda capa;
    o
    (i) aplicar una composicion que comprende los componentes (c) a (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) a un area de ensayo sobre el soporte en una primera capa;
    (ii) eliminar dicho disolvente de la composicion de la primera capa;
    (iii) aplicar una composicion que comprende los componentes (a), (b), (d) y (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) en una segunda capa sobre la primera capa; y
    (iv) eliminar dicho disolvente de la composicion de la segunda capa.
    o
    (i) aplicar una composicion que comprende los componentes (b) a (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) a un area de ensayo sobre el soporte en una primera capa;
    (ii) eliminar dicho disolvente de la composicion de la primera capa;
    (iii) aplicar una composicion que comprende los componentes (a), (b), (d) y (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) en una segunda capa sobre la primera capa; y
    (iv) eliminar dicho disolvente de la composicion de la segunda capa.
    o
    (i) aplicar una composicion que comprende los componentes (b) a (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) a un area de ensayo sobre el soporte en una primera capa;
    (ii) eliminar dicho disolvente de la composicion de la primera capa;
    (iii) aplicar una composicion que comprende los componentes (a), (d) y (e) de la composicion de la invencion y un disolvente (es decir, una composicion que comprende los componentes en estado disuelto en vez de en estado seco) en una segunda capa sobre la primera capa; y
    (iv) eliminar dicho disolvente de la composicion de la segunda capa.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 8 o 9, en el que el soluto compatible reduce una disminucion de la actividad enzimatica de al menos una enzima en la composicion en condiciones secas.
  11. 11. Uso de al menos un soluto compatible que es ectoma o un derivado de la misma para reducir una disminucion de la actividad enzimatica de al menos una enzima en una composicion en condiciones secas, en la que dicha composicion comprende una deshidrogenasa, un cofactor redox, un agente capaz de inducir un cambio en al menos una propiedad optica de un reactivo indicador en presencia de equivalentes redox, y un reactivo indicador,
    en el que dicho derivado de ectoma se selecciona entre el grupo que consiste en:
    hidroxiectoma, homoectoma, un ester de hidroxiectoma, un eter de hidroxiectoma, un derivado de sulfonilo de ectoma o un derivado de sulfonilo esterificado de ectoma y una amida de un derivado de sulfonilo de ectoma, y en el que dicha deshidrogenasa es una glucosa deshidrogenasa.
  12. 12. El uso de la reivindicacion 11, en el que dicho al menos un soluto compatible en la composicion en condiciones secas esta comprendido en un elemento de ensayo de diagnostico, preferentemente, un elemento de ensayo de diagnostico de acuerdo con la reivindicacion 6 o 7.
    5 13. Un metodo para determinar la presencia o la cantidad de un analito en una muestra de fluido corporal que
    comprende las etapas de:
    (a) poner en contacto el elemento de ensayo de diagnostico de la reivindicacion 6 o 7 con un fluido corporal del que se sospecha que comprende el analito en condiciones adecuadas para transformar la al menos una enzima
    10 a su estado reconstituido;
    (b) medir un cambio en al menos una propiedad optica del reactivo indicador en la composicion humedecida que comprende al menos una enzima en estado reconstituido sobre el elemento de ensayo de diagnostico, mediante el cual se determinara la presencia o la cantidad del analito en la muestra de fluido corporal.
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