ES2605958T3 - Inhibidores y patrones del mal olor - Google Patents
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Abstract
Composición patrón del mal olor, que comprende - una proteína, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene a) una identidad de secuencia de al menos el 93%, preferiblemente al menos el 95%, más preferiblemente de al menos el 98%, y/o b) una similitud de secuencia de al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, más preferiblemente de al menos el 99%, con una secuencia de aminoácidos según cualquiera de SEQ ID NO 1 a 31, en la que la identidad de secuencia y similitud de secuencia se calculan según el algoritmo EMBOSS Needle que tiene una penalización por hueco abierto de 10,0, una penalización por extensión de hueco de 0,5 y usando la matriz Blosum62, - junto con una sustancia escindible por la proteína para generar un producto maloliente en condiciones que permiten tal escisión, en la que la sustancia escindible es N-alfa-lauroil-L-glutamina.
Description
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DESCRIPCION
Inhibidores y patrones del mal olor
La invencion se refiere al campo de sistemas de reaccion que generan mal olor, particularmente a partir de constituyentes del sudor humano. Especlficamente, la invencion se refiere a protelnas para generar malos olores, a sustratos para generar tales malos olores, a inhibidores de la generacion de tal mal olor y a sistemas de prueba y examen para medir su eficacia de inhibicion del mal olor y encontrar sustancias que no se sabla previamente que inhiblan la generacion de mal olor. Por tanto, la invencion tambien se refiere al campo de los desodorantes.
Generalmente se acepta que el sudor humano fresco es inodoro, y que el olor del sudor se genera por microorganismos que colonizan la piel humana y particularmente la axila. Por tanto, el olor generado a partir del sudor humano se considera caracterlstico en el sentido de que tras oler tal aroma queda claro inmediatamente que el aroma indica sudor humano. El olor puede considerarse ampliamente y segun la presente invencion que es un mal olor y puede ser muy pronunciado.
Durante anos, se ha intentado por tanto inhibir la generacion del mal olor del sudor para reducir el mal olor o enmascararlo. En el contexto de la presente invencion, “inhibicion” designa todos los medios para prevenir la formacion del mal olor del sudor a partir del sudor humano, incluyendo medios para ralentizar la generacion de tal mal olor. “Reduccion” se refiere a medios para tratar los constituyentes del mal olor del sudor para hacerlos menos intensos, por ejemplo uniendolos a e inmovilizandolos sobre una matriz. “Enmascarar” designa aquellos medios y esfuerzos destinados a afectar a la percepcion humana del mal olor del sudor, por ejemplo sobrecargando una nariz humana con otros aromas mas intensos y menos malolientes, o reduciendo o alterando de otra forma la capacidad del sistema olfativo humano para detectar uno o mas compuestos malolientes del mal olor del sudor.
Es deseable inhibir la formacion del mal olor del sudor y no solo para reducir o enmascarar tal mal olor. Una manera intentada frecuentemente es la aplicacion de antitranspirantes a la axila humana para impedir la formacion del sudor. El razonamiento es que si no se forma sudor, no se generara mal olor del sudor. Sin embargo, hay problemas tales como que influir en los procesos psicologicos humanos puede no ser sostenible o conducir a efectos secundarios no deseados. En el contexto de la presente invencion “inhibidores” son por tanto solo aquellas sustancias que son eficaces para ralentizar o impedir la formacion de uno o mas constituyentes del mal olor del sudor a partir del sudor humano distintas de cualquiera que se basa predominante en la supresion de la formacion de secreciones.
Por tanto, hay una necesidad general de encontrar inhibidores eficaces de la generacion del mal olor del sudor. La busqueda de tales inhibidores se ve dificultada por el hecho de que se sabe poco acerca de la formacion real del mal olor del sudor, particularmente los procesos psicologicos de los microorganismos responsables de la generacion del mal olor. Ademas, hay una falta de procedimientos normalizados para comparar la eficacia de posibles inhibidores de la generacion del mal olor.
El documento EP 1 387 891 (publicado tambien como WO 02/092024 A2) da a conocer una N-alfa-acil- glutaminoaminoacilasa aislada implicada segun se notifica en la transformacion de compuestos precursores inodoros que se encuentran en el sudor en acidos grasos malolientes. El documento describe ademas la aplicacion de esta enzima en el examen de alto rendimiento para detectar inhibidores.
Una desventaja de la enzima dada a conocer en el documento de patente europea anteriormente mencionado y en consecuencia tambien del sistema de prueba descrito en el mismo es que la enzima requiere como cofactor un ion de zinc y por tanto se ve afectada facilmente por la presencia de agentes quelantes. Sin embargo, los agentes quelantes de zinc como EDTA no son eficaces para inhibir la generacion del mal olor del sudor humano cuando se aplica al sudor humano in vivo. Por tanto, el sistema de prueba requiere gran cuidado cuando se preparan los reactivos usados en el mismo, y los posibles inhibidores identificados por el sistema de prueba tienen que reanalizarse para descartar que su efecto inhibidor del mal olor, tal como se determina mediante el sistema de prueba, no sea simplemente un resultado de su interferencia con iones de zinc.
Por tanto, era un problema de la presente invencion proporcionar un sistema de prueba para reproducir una ruta representativa de la generacion del mal olor del sudor que fuese independiente de la presencia de iones de zinc.
Description detallada de la invencion
En relation con la invencion, se describe por tanto en el presente documento una protelna que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene
a) una identidad de secuencia de al menos el 93%, preferiblemente al menos el 95%, mas preferiblemente de al menos el 98% y lo mas preferiblemente del 100%, y/o
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b) una similitud de secuencia de al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, mas preferiblemente de al menos el 99% y lo mas preferiblemente del 100%,
con una secuencia de aminoacidos segun cualquiera de SEQ ID NO 2 a 31, en la que la identidad de secuencia y la similitud de secuencia se calculan segun el algoritmo de EMBOSS Needle que tiene una penalizacion por hueco abierto de 10,0, una penalizacion por extension de hueco de 0,5 y usando la matriz Blosum62.
Se ha encontrado que tal protelna puede producir rapidamente el mal olor caracterlstico del sudor humano cuando se pone en contacto con sudor humano fresco, no maloliente o debilmente maloliente. Significativamente, se encontro tambien la capacidad de generar el mal olor del sudor tras poner en contacto la protelna con sudor humano esterilizado.
Incluso mas importante, se ha encontrado que la generation del mal olor del sudor humano mediante esta protelna no depende de la presencia de iones de zinc. La protelna tambien conserva su capacidad para escindir N-alfa- lauroil-L-glutamina para liberar un acido graso de laurollo bioqulmicamente facil de detectar y cuantificar incluso en presencia de concentraciones de EDTA suficientes para complejar iones de zinc. La protelna, que se cree que es una enzima, es por tanto util en un sistema convencional del mal olor y para examinar inhibidores del mal olor del sudor. Incluso mas beneficioso, se ha encontrado que la protelna puede tener una alta similitud de secuencia con protelnas que se encuentran en una gran variedad de organismos de diferente genero, familia, orden, clase e incluso filo. La protelna es por tanto una representante de un conjunto ubicuo de protelnas de funcion desconocida hasta ahora que aparecen en una fraction significativa de todos los microorganismos que colonizan la piel humana y particularmente la axila. Por tanto, ha de esperarse que inhibidores eficaces para la inhibition de la formation del mal olor por una protelna de este tipo generalmente seran eficaces para inhibir la formacion del mal olor del sudor tambien cuando se aplican al sudor humano in vivo y a la piel humana.
La protelna descrita en el presente documento esta disponible preferiblemente en forma aislada. “Aislado” en el contexto de la presente invention designa que la protelna se retira de su entorno original y particularmente no esta contaminada con otro material de microorganismos util en la production de la protelna. Incluso mas preferiblemente, la protelna esta en forma purificada, lo que significa que el contenido de la protelna en una composition en relation con otras protelnas o peptidos que tienen una longitud de al menos 10 aminoacidos y en relacion con acidos nucleicos es de al menos el 80% en peso, mas particularmente al menos el 90% en peso, todavla mas particularmente el 95% en peso y lo mas particularmente el 99% en peso o mayor.
La protelna, preferiblemente en forma aislada e incluso mas preferiblemente en forma purificada, comprende una secuencia de aminoacidos que tiene la identidad de secuencia y/o similitud de secuencia anterior con una secuencia de aminoacidos segun cualquiera de SEQ ID NO 2 a 31. La identidad de secuencia y similitud de secuencia en el contexto de la presente invencion se determinan segun el algoritmo EMBOSS “Needle”. Este algoritmo es el algoritmo convencional para alineaciones de secuencias de aminoacidos por parejas que cubren la longitud completa de ambas secuencias. El algoritmo implementa el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman S.B. y Wunsch C.D., 1970 J. Mol. Biol. 48, 443 - 453), en el que una penalizacion por un hueco de n posiciones se calcula segun la formula
penalizacion por apertura de hueco + (n-1) x penalizacion por extension de hueco
Se alinea la longitud total de cada secuencia de aminoacidos, y no hay penalizacion para extremos colgantes del solapamiento.
Penalizacion por hueco abierto en el contexto de la presente invencion es de 10,0. La penalizacion por extension de hueco en el contexto de la presente invencion es de 0,5. La matriz de puntuacion para comparar similitudes de aminoacidos en el contexto de la presente invencion es la matriz “Blosum62”. La penalizacion por hueco abierto, penalizacion por extension de hueco y matriz Blosum62 parametros convencionales usados en la tecnica. Pueden hacerse alineaciones de secuencias con estos parametros, por ejemplo por medio de herramientas libres disponibles publicamente. Por ejemplo, el EBI ofrece un servicio de alineacion de secuencias por parejas con los parametros de la presente invencion por medio de su surtido de herramientas de Internet.
La protelna descrita en el presente documento, particularmente en una forma aislada o purificada, puede consistir en cualquiera de las secuencias de aminoacidos SEQ ID NO 2 a 31, en la que opcionalmente falta la metionina N- terminal. Las protelnas que tienen estas secuencias de aminoacidos sin ninguna modification o aminoacido anadido adicional pueden particularmente generar el mal olor intenso y tlpico cuando se ponen en contacto con sudor humano esterilizado inodoro. En el contexto de la presente invencion, esterilizado significa que el sudor se filtra mediante filtration esteril, tal como conocen los expertos en la tecnica, en particular que tiene un punto de corte de filtration de 0,4 pm.
La protelna descrita en el presente documento, preferiblemente en forma aislada o purificada, preferiblemente
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comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos segun SEQ ID NO 3, incluso mas preferiblemente segun SEQ ID NO 4. Se ha encontrado que estas protelnas son particularmente utiles para generar un mal olor fuerte y tlpico del sudor humano cuando se ponen en contacto con sudor humano fresco esterilizado, inodoro. Segun la presente invencion la intensidad y el aroma del mal olor del sudor generado se clasifican mediante un panel de expertos de 10 expertos en olor entrenados, clasificandose la intensidad y el aroma en una escala de 0 (no detectable) a 9 (muy intenso/muy tlpico). Tal evaluacion es comun en la tecnica de analisis del olor.
Se ha encontrado particularmente que protelnas que comprenden isoleucina en la posicion 216 y prolina en la posicion 219 de SEQ ID NO 3, por ejemplo protelnas de SEQ ID NO 4, pueden producirse facilmente de manera biotecnologica y pueden producir el mal olor del sudor fuerte y tlpico cuando se ponen en contacto con sudor humano esterilizado fresco. Por tanto se prefiere que la protelna descrita en el presente documento comprenda o consista en una secuencia de aminoacidos segun SEQ ID NO 2 o en una secuencia segun cualquiera de SEQ ID NO 5 a 31.
Entre estas, se prefiere particularmente una protelna descrita en el presente documento que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO 2. Esta protelna se ha aislado de una cepa de Bacillus subtilis y se encontro particularmente que producla rapidamente un mal olor fuerte y tlpico cuando se ponla en contacto con sudor humano esterilizado fresco, siendo tal sudor, tal como se indico anteriormente, esencialmente inodoro en su estado fresco y esterilizado.
La protelna descrita en el presente documento, particularmente la protelna aislada o purificada que comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos segun cualquiera de SEQ ID NO 2 a 31, preferiblemente no escinde la amida del acido 3-metil-2-hexenico ni la amida del acido 3-metil-2-hidroxi-hexanoico sino que escinde N-alfa-lauroil- L-glutamina. Tal como se comento anteriormente, la escision de N-alfa-lauroil-L-glutamina por la protelna es independiente de la presencia de iones de zinc.
En relacion con la invencion, se describe ademas un acido nucleico aislado que codifica para una protelna descrita en el presente documento, es decir una protelna que tiene a) una identidad de secuencia de al menos el 93%, preferiblemente al menos el 95%, mas preferiblemente de al menos el 98%, y/o b) una similitud de secuencia de al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, mas preferiblemente de al menos el 99%, con una secuencia de aminoacidos segun cualquiera de SEQ ID NO 2 - 31 tal como se definio anteriormente. El acido nucleico preferiblemente comprende o consiste en una secuencia de bases segun SEQ ID NO 32 o SEQ ID NO 33. La secuencia de nucleotidos segun SEQ ID NO 32 esta particularmente adaptada para producir la protelna de SEQ ID NO 2 en Bacillus subtilis; el acido nucleico que comprende la secuencia de bases segun SEQ ID NO 33 esta particularmente adaptada para producir la protelna de SEQ ID NO 2 en E. coli K12. El experto entiende que los acidos nucleicos descritos en el presente documento tambien comprenden acidos nucleicos que codifican para la protelna que consiste en SEQ ID NO 2 optimizados para su expresion por otros microorganismos distintos de Bacillus subtilis y E. coli K12, en los que tal optimization es segun la preferencia de codones respectiva del microorganismo para cada aminoacido respectivo.
El acido nucleico descrito en el presente documento permite por tanto producir una protelna descrita en el presente documento de manera biotecnologica, para facilitar la proportion de tal protelna de manera reproducible y en cantidades suficientes.
Para este fin, en relacion con la invencion tambien se describe en el presente documento un vector de expresion, que comprende un acido nucleico descrito en el presente documento operativamente unido a un promotor. Y una celula huesped, preferiblemente una celula de E. coli celula o una celula de Bacillus subtilis, que comprende un acido nucleico que codifica para una protelna descrita en el presente documento, en la que la celula huesped se transforma preferiblemente con un vector de expresion descrito en el presente documento, tambien se describe en el presente documento. El vector de expresion en la celula huesped puede estar separado de o insertado (preferiblemente de manera estable) en el genoma de la celula huesped.
Tal production biotecnologica de protelnas mediante expresion genica recombinante tambien ofrece la posibilidad de anadir etiquetas N-terminales y/o C-terminales a la protelna. Tales etiquetas comprenden etiquetas como por ejemplo etiquetas de His o etiquetas de Strep u otras etiquetas y las conocen bien los expertos en la tecnica. Una ventaja particular de tales etiquetas es la facil purification de la protelna respectiva usando sistemas de cromatografla de afinidad especlficos. Estos protocolos de purificacion los conocen bien los expertos en la tecnica. La purificacion de protelnas con etiquetas de His sobre resinas funcionalizadas con Ni-NTA o Ni-IDA es de particular ventaja, ya que tales resinas estan disponibles facilmente (por ejemplo de GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Otra ventaja de las etiquetas de His unidas a las protelnas descritas en el presente documento es la no interferencia de la etiqueta de His con la actividad enzimatica de la enzima y su uso segun esta invencion. De este modo, una etiqueta de purificacion de este tipo podrla usarse para ayudar a la purificacion de protelnas, en el caso de que sea beneficioso.
Por otro lado, el experto en la tecnica sabe que tales etiquetas podrlan interferir con la eficacia de produccion de
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protelnas y/o actividad enzimatica especlfica. Tal como se observa en la figura 35, esto sucedio en este caso tambien: la actividad enzimatica total en el cultivo celular para la protelna etiquetada con His es inferior que para la protelna sin etiqueta de His.
Esto ofrece una posibilidad ventajosa particular de o bien producir mayores cantidades de protelna para mayores demandas, como para grandes numeros de pruebas (por ejemplo para el examen de grandes numeros de posibles inhibidores) o bien la produccion de protelna purificada para pruebas bioqulmicas detalladas (como por ejemplo la determinacion de la cinetica de la enzima, constantes de union del inhibidor, etc.)
En vista del problema anterior de la presente invencion, se proporciona una composicion patron del mal olor segun las reivindicaciones de la patente adjuntas. Las composiciones patron del mal olor de la presente invencion son particularmente utiles para generar un mal olor fuerte y tlpico del sudor humano cuando se ponen en contacto con sudor humano fresco y, antes de dicho contacto, esencialmente inodoro. Una ventaja particular de tales composiciones patron del mal olor segun la presente invencion es que no son dependientes de la presencia de iones de zinc en la composicion patron del mal olor o en el sudor. Las composiciones patron del mal olor de la presente invencion permiten por tanto estudiar e influir en la generacion de un mal olor muy tlpico del sudor humano en condiciones reproducibles, eliminando sustancialmente factores como superficie cutanea variable o temperaturas del sudor de personas de prueba.
Las composiciones patron del mal olor segun la presente invencion son particularmente adecuadas para encontrar y someter a prueba la eficacia de sustancias que influyen en la generacion, la intensidad y el “aroma” del mal olor del sudor. Esto puede lograrse anadiendo una sustancia candidata para modificar la velocidad, intensidad o “aroma” del mal olor del sudor a una composicion patron del mal olor de la presente invencion que entonces se pone en contacto con el sudor humano, particularmente con sudor humano fresco y preferiblemente esterilizado. Ademas, la sustancia candidata puede anadirse al sudor, sudor particularmente fresco y preferiblemente esterilizado que entonces se pone en contacto con una composicion patron del mal olor de la presente invencion.
La composicion patron del mal olor puede comprender una protelna aislada que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene
a) una identidad de secuencia de al menos el 93%, preferiblemente al menos el 95%, mas preferiblemente de al menos el 98% y/o
b) una similitud de secuencia de al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, mas preferiblemente de al menos el 99%,
con una secuencia de aminoacidos segun SEQ ID NO 1, en la que la identidad de secuencia y similitud de secuencia se calculan segun el algoritmo EMBOSS Needle que tiene una penalizacion por hueco abierto de 10,0, una penalizacion por extension de hueco de 0,5 y usando la matriz Blosum62. La secuencia de aminoacidos SEQ ID NO 1 se conoce de Bacillus subtilis. Sin embargo, no se conocla que tal protelna, cuando se pone en contacto con sudor humano inodoro, puede producir mal olor del sudor intenso y tlpico. La protelna es por tanto util tambien en composiciones patron del mal olor de la presente invencion.
La composicion patron del mal olor de la presente invencion comprende preferiblemente una protelna que comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos segun cualquiera de SEQ ID NO 1 a 31, preferiblemente que comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos segun SEQ ID NO 2 o cualquiera de SEQ ID NO 5 a 31. Se prefieren particularmente tales composiciones patron del mal olor en la que la protelna para generar mal olor del sudor consiste en una protelna purificada que consiste en cualquiera de las secuencias de aminoacidos SEQ ID NO 1 a 31, de manera particularmente preferible SEQ ID NO 2 o de 5 a 31, y lo mas preferiblemente de SEQ ID NO 2.
Por tanto, segun la presente invencion se proporciona una composicion patron del mal olor que consiste en
- una protelna aislada o purificada que consiste en cualquiera de las secuencias de aminoacidos SEQ ID NO 1, 2 a 31,
- N-alfa-lauroil-L-glutamina
- y un portador.
El portador es preferiblemente un portador llquido y lo mas preferiblemente es un tampon acuoso ajustado a un pH de > 4, incluso mas preferiblemente de 5 a 9 y lo mas preferiblemente de 6,2 a 7,8. Se prefiere particularmente que tal tampon sea un tampon hecho de agua, NaH2PO4/K2HPO4 50 mM y NaCl 50 mM. Tal portador es facil de producir de manera reproducible y en cantidades suficientes.
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En relacion con la invencion, tambien se describe una composicion de inhibicion del mal olor. La composition de inhibition del mal olor comprende una composicion patron del mal olor segun la presente invencion y un posible inhibidor de la reaction de escision para un producto maloliente de manera que la composicion de inhibicion del mal olor permite someter a prueba facilmente y de manera reproducible de un modo normalizado la eficacia de un posible inhibidor del mal olor del sudor.
La composicion de inhibicion del mal olor por tanto comprende
- una protelna preferiblemente aislada o purificada que comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos segun cualquiera de SEQ ID NO 1, 2 a 31,
- N-alfa-lauroil-L-glutamina y
- un portador para permitir la escision de N-alfa-L-lauroil-L-glutamina por la protelna en ausencia de un inhibidor, y
- el inhibidor candidato.
Incluso mas preferiblemente, la composicion de inhibidor del mal olor consiste en
- una protelna aislada o purificada que consiste en la secuencia de aminoacidos segun cualquiera de SEQ ID NO 1, 2, 5 a 31,
- N-alfa-lauroil-L-glutamina,
- un portador para permitir la escision de N-alfa-L-lauroil-L-glutamina por la protelna en ausencia de un inhibidor, y
- un inhibidor candidato.
En la composicion de inhibicion del mal olor, el portador es preferiblemente una disolucion, en agua, de NaCl 50 mM y NaH2PO4/K2HPO4 50 mM a pH 7.
La presente invencion proporciona ademas un sistema de examen de inhibidores del mal olor, que comprende una protelna, preferiblemente aislada, que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene
a) una identidad de secuencia de al menos el 93%, preferiblemente al menos el 95%, mas preferiblemente de al menos el 98%, y/o
b) una similitud de secuencia de al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, mas preferiblemente de al menos el 99%,
con una secuencia de aminoacidos segun cualquiera de SEQ ID NO 1 a 31, en la que la identidad de secuencia y similitud de secuencia se calculan segun el algoritmo EMBOSS Needle que tiene una penalization por hueco abierto de 10,0, una penalizacion por extension de hueco de 0,5 y usando la matriz Blosum62,
- junto con una sustancia que puede escindirse por la protelna para generar un producto maloliente en condiciones que permiten tal escision, concretamente N-alfa-lauroil-L-glutamina, y
- un conjunto de sustancias candidatas a inhibidores que van a examinarse.
El sistema de examen de inhibidores del mal olor comprende por tanto preferiblemente una maquina que realiza las etapas de hacer reaccionar la protelna y la sustancia escindible en presencia de una sustancia candidata a inhibidor seleccionada en condiciones que, en ausencia de un inhibidor eficaz, permiten la escision de la sustancia escindible para generar un producto maloliente.
Tambien para los beneficios comentados anteriormente la protelna es preferiblemente una protelna aislada o purificada.
Se prefiere particularmente un sistema de examen de inhibidores del mal olor de la presente invencion, en el que la protelna es una protelna aislada o purificada que consiste en una secuencia de aminoacidos segun cualquiera de SEQ ID NO 1, 2 a 31 y lo mas preferiblemente es una protelna purificada que consiste en una secuencia de aminoacidos segun SEQ ID NO 2.
Las condiciones que permiten tal escision incluyen preferiblemente la presencia de un tampon acuoso que comprende NaCl 50 mM y NaH2PO4/K2HPO4 50 mM a pH 7.
En resumen, se prefiere particularmente un sistema de examen de inhibidores del mal olor que comprende
- una protelna purificada que consiste en la secuencia de aminoacidos segun cualquiera de SEQ ID NO 1, 2, 3 a 31,
5 - N-alfa-lauroil-L-glutamina,
- un tampon acuoso de NaCl 50 mM y NaH2PO4/K2HPO4 50 mM a pH 7,
- una serie de sustancias candidatas a inhibidor, y
- un sistema automatico para mezclar la protelna, N-alfa-lauroil-L-glutamina y una o mas sustancias candidatas a inhibidor en el tampon.
10 Tal sistema de examen de inhibidores del mal olor esta particularmente adaptado a usarse en aplicaciones de examen de alto rendimiento para someter a prueba la eficacia de un gran surtido de posibles sustancias inhibidoras en concentraciones variables. El sistema de examen de inhibidores del mal olor de la presente invention ayuda por tanto ventajosamente en la identification de inhibidores del mal olor del sudor utiles adicionales. El sistema incluye ademas las ventajas que presentan la protelna y la composition patron del mal olor de la presente invencion, 15 particularmente que la generation del mal olor es independiente de iones de zinc.
De nuevo, la formation del mal olor y la inhibition de la formation del mal olor pueden analizarse y cuantificarse por un panel de expertos tal como se indicio anteriormente. Tambien se prefiere y es particularmente util en aplicaciones de alto rendimiento, sin embargo, es un sistema segun la presente invencion en el que la sustancia que va a escindirse y/o un producto de tal reaction de escision se detecta automaticamente, por ejemplo mediante 20 cromatografla de gases u opticamente por medio de fotometrla, fotometrla de fluorescencia o luminiscencia- fotometrla tras la adicion de reactantes adicionales. Tales medios para la detection los conoce el experto en la tecnica, por ejemplo del ejemplo 8 del documento EP 1387891 B1.
Por consiguiente, tambien se describe en el presente documento un metodo que puede normalizarse de generacion de un mal olor, que comprende la etapa de hacer reaccionar una protelna que comprende o consiste en una 25 secuencia de aminoacidos que tiene
a) una identidad de secuencia de al menos el 93%, preferiblemente al menos el 95%, mas preferiblemente de al menos el 98%, y/o
b) una similitud de secuencia de al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, mas preferiblemente de al menos el 99%,
30 con una secuencia de aminoacidos segun cualquiera de SEQ ID NO 1 a 31, en el que la identidad de secuencia y similitud de secuencia se calculan segun el algoritmo EMBOSS Needle que tiene una penalization por hueco abierto de 10,0, una penalizacion por extension de hueco de 0,5 y usando la matriz Blosum62,
- con una sustancia escindible mediante esta protelna en condiciones que permiten que tal escision produzca un mal olor, en el que la sustancia es preferiblemente N-alfa-lauroil-L-glutamina.
35 El metodo se realiza preferiblemente en sudor humano fresco y esterilizado, o en un tampon acuoso de NaCl 50 mM y tampon NaH2PO4/K2HPO4 50 mM a pH 7.
La protelna consiste preferiblemente en una secuencia de aminoacidos segun cualquiera de SEQ ID NO 1 a 31, preferiblemente segun cualquiera de SEQ ID NO 1, 2, 5 a 31 y lo mas preferiblemente segun SEQ ID NO 2.
Ademas, la invencion proporciona un metodo de examen para inhibidores del mal olor, comprendiendo el metodo las 40 etapas de
1. incubar una protelna que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene
a) una identidad de secuencia de al menos el 93%, preferiblemente al menos el 95%, mas preferiblemente de al menos el 98%, y/o
b) una similitud de secuencia de al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, mas preferiblemente de al
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menos el 99%,
con una secuencia de aminoacidos segun cualquiera de SEQ ID NO 1 a 31, en el que la identidad de secuencia y similitud de secuencia se calculan segun el algoritmo EMBOSS Needle que tiene una penalization por hueco abierto de 10,0, una penalizacion por extension de hueco de 0,5 y usando la matriz Blosum62,
- junto con una sustancia escindible por la protelna en condiciones que permiten tal reaction de escision en ausencia de un inhibidor, concretamente N-alfa-lauroil-L-glutamina, y
- una sustancia candidata a inhibidor para inhibir potencialmente la reaccion de escision, y 2. medir la generation del mal olor.
La invention se describe ademas mediante referencia a los ejemplos y las figuras. No debe entenderse que estos ejemplos limitan el alcance de las reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1: Amplificacion del gen yxel mediante PCR y clonacion en vectores de expresion de E. coli.
Se uso ADN genomico de una cepa de Bacillus subtilis, aislado del sobaco humano como molde para la amplificacion por PCR. Se usaron los cebadores directo (5'-GGGACTGATCATATGTGCACAAGTCTTAC-3') e inverso (5'-ATTGAGGATCCTTAATTAAGCTCATGAATACTCT-3') para la amplificacion por PCR.
Se trato el producto de PCR resultante con las endonucleasas de restriction Ndel y BamHI (New England Biolabs, Frankfurt, Alemania) segun las instrucciones del fabricante y se clono en los plasmidos pET24a (Merck, Darmstadt, Alemania) y pET28a (Merck, Darmstadt, Alemania). Los vectores de expresion resultantes se denominaron pET24a::yxel o pET28a::yxel. Contienen un acido nucleico que codifica para una protelna de SEQ ID NO 1. En el vector pET28a, la protelna esta unida a una etiqueta de His de 6 aminoacidos histidina consecutivos.
Ejemplo 2: Expresion genica y produccion de protefnas en E. coli
Se uso E. coli BL21(DE3) como huesped de expresion. Se hicieron crecer las cepas (o bien sin plasmido o bien portando los vectores de expresion descritos en el ejemplo 1) a 37°C en 100 ml de medio de Luria-Bertani usando matraces de agitation de 250 ml con agitation vigorosa. Se hicieron crecer cepas que contenlan plasmido en presencia de medio de Luria-Bertani que contenla kanamicina 30 mg/l. Despues de que la densidad celular alcanzara una DO600 de 1, se anadio IPTG hasta una concentration final de 0,1 mM, seguido por incubation adicional en condiciones identicas durante otras 2 horas.
Se tomaron muestras de 1,5 ml de los cultivos, se recogieron las celulas mediante centrifugation y se analizaron mediante SDS-PAGE seguido por tincion de Coomasie. Se observo una fuerte expresion genica y produccion de protelnas tras la induction, tal como se muestra mediante la figura 34.
Ejemplo 3: Determinacion de la actividad enzimatica y prueba para detectar efectos inhibidores.
Se recogieron celulas obtenidas como en el ejemplo 2 mediante centrifugacion y se lavaron dos veces con tampon PBS para eliminar componentes residuales del medio. Se resuspendio el sedimento celular final en tampon PBS (por litro de agua: 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4, pH 7,4) hasta alcanzar una DO600 final de 30. Se uso esta suspension celular de cepas (o bien sin plasmido o bien portando los vectores de expresion descritos en el ejemplo 1) para las pruebas de actividad. Se pusieron en contacto las suspensiones celulares lavadas en tampon PBS con N-alfa-lauril-glutamina (concentracion final de 0,2 mg/ml, “LG” en la figura 35), a 37°C (volumen final de 0,25 ml) durante 15 min. Se realizo la prueba real tal como se describe en el ejemplo 7 del documento WO 02/092024 A2, con CG como metodo de prueba. La cepa libre de plasmido mostro algo de actividad de fondo, mientras que las cepas que portan los vectores de expresion mostraron una fuerte actividad enzimatica, tal como puede observarse en la figura 35. Esta figura presenta la actividad enzimatica en relation con la actividad de la enzima de la presente invencion expresada en pET 24a. Como observation secundaria, la puesta en contacto de esta enzima con el sudor humano fresco da como resultado el desarrollo de un olor intenso del sudor humano.
Como prueba de la inhibition de la actividad, se anadio acetato de sodio a un conjunto de muestras hasta una concentracion final de 100 mM. Como resultado, se inhibio la actividad enzimatica hasta el nivel de la actividad de fondo de la cepa de E. coli libre de plasmido.
Se repitio el ensayo con enzimas que tenlan una secuencia de aminoacidos segun SEQ ID NO 2, 5 a 31,
respectivamente. Todas las enzimas produjeron asimismo un olor intenso del sudor humano cuando se pusieron en contacto con sudor humano fresco, inodoro.
Claims (9)
- 510152025303540REIVINDICACIONES1. Composicion patron del mal olor, que comprende- una proteina, que comprende una secuencia de aminoacidos que tienea) una identidad de secuencia de al menos el 93%, preferiblemente al menos el 95%, mas preferiblemente de al menos el 98%, y/ob) una similitud de secuencia de al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, mas preferiblemente de al menos el 99%,con una secuencia de aminoacidos segun cualquiera de SEQ ID NO 1 a 31, en la que la identidad de secuencia y similitud de secuencia se calculan segun el algoritmo EMBOSS Needle que tiene una penalization por hueco abierto de 10,0, una penalizacion por extension de hueco de 0,5 y usando la matriz Blosum62,- junto con una sustancia escindible por la proteina para generar un producto maloliente en condiciones que permiten tal escision, en la que la sustancia escindible es N-alfa-lauroil-L-glutamina.
- 2. Composicion de inhibicion del mal olor, que comprende una composicion patron del mal olor segun la revindication 1 y un inhibidor de la reaction de escision para generar un producto maloliente en condiciones que permiten tal escision en ausencia de dicho inhibidor.
- 3. Sistema de examen de inhibidores del mal olor, que comprende- una proteina, que comprende una secuencia de aminoacidos que tienea) una identidad de secuencia de al menos el 93%, preferiblemente al menos el 95%, mas preferiblemente de al menos el 98%, y/ob) una similitud de secuencia de al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, mas preferiblemente de al menos el 99%,con una secuencia de aminoacidos segun cualquiera de SEQ ID NO 1 a 31, en el que la identidad de secuencia y similitud de secuencia se calculan segun el algoritmo EMBOSS Needle que tiene una penalizacion por hueco abierto de 10,0, una penalizacion por extension de hueco de 0,5 y usando la matriz Blosum62,- junto con una sustancia escindible por la proteina para generar un producto maloliente en condiciones que permiten tal escision, en el que la sustancia escindible es N-alfa-lauroil-L-glutamina,- y un conjunto de sustancias candidatas a inhibidor que van a examinarse.
- 4. Metodo de examen para detectar inhibidores del mal olor, que comprende las etapas de 1) incubar- una proteina, que comprende una secuencia de aminoacidos que tienea) una identidad de secuencia de al menos el 93%, preferiblemente al menos el 95%, mas preferiblemente de al menos el 98%, y/ob) una similitud de secuencia de al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, mas preferiblemente de al menos el 99%,con una secuencia de aminoacidos segun cualquiera de SEQ ID NO 1 a 31, en el que la identidad de secuencia y similitud de secuencia se calculan segun el algoritmo EMBOSS Needle que tiene una penalizacion por hueco abierto de 10,0, una penalizacion por extension de hueco de 0,5 y usando la matriz Blosum62,- junto con una sustancia escindible por la proteina para generar un producto maloliente en condiciones que permiten tal escision, en el que la sustancia escindible es N-alfa-lauroil-L-glutamina,- y una sustancia candidata a inhibidor, y5101520252) medir la generacion del mal olor.
- 5. Uso de una protelna que comprende una secuencia de aminoacidos que tienea) una identidad de secuencia de al menos el 93%, preferiblemente al menos el 95%, mas preferiblemente de al menos el 98%, y/ob) una similitud de secuencia de al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, mas preferiblemente de al menos el 99%,con una secuencia de aminoacidos segun cualquiera de SEQ ID NO 2 a 31, en el que la identidad de secuencia y similitud de secuencia se calculan segun el algoritmo EMBOSS Needle que tiene una penalizacion por hueco abierto de 10,0, una penalizacion por extension de hueco de 0,5 y usando la matriz Blosum62 en una composicion patron del mal olor para generar un producto maloliente.
- 6. Uso segun la reivindicacion 5, en el que la secuencia de aminoacidos de la protelna comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos segun cualquiera de SEQ ID NO 2 a 31, en el que falta opcionalmente la metionina N- terminal.
- 7. Uso segun las reivindicaciones 5 o 6, en el que la protelna no escinde la amida del acido 3-metil-2-hexenico ni la amida del acido 3-metil-2-hidroxi-hexanoico sino que escinde N-alfa-lauroil-L-glutamina.
- 8. Uso de una protelna, que comprende una secuencia de aminoacidos que tienea) una identidad de secuencia de al menos el 93%, preferiblemente al menos el 95%, mas preferiblemente de al menos el 98%, y/ob) una similitud de secuencia de al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, mas preferiblemente de al menos el 99%,con una secuencia de aminoacidos segun cualquiera de SEQ ID NO 1 a 31, en el que la identidad de secuencia y similitud de secuencia se calculan segun el algoritmo EMBOSS Needle que tiene una penalizacion por hueco abierto de 10,0, una penalizacion por extension de hueco de 0,5 y usando la matriz Blosum62, para examinar un inhibidor de la generacion del mal olor.
- 9. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que la protelna es una protelna aislada o purificada que consiste en una secuencia de aminoacidos segun cualquiera de SEQ ID NO 1 a 31, preferiblemente segun cualquiera de SEQ ID NO 1, 2, 5-31, y lo mas preferiblemente segun SEQ ID 2.
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