CN103298933A - 恶臭标准物和抑制剂 - Google Patents

恶臭标准物和抑制剂 Download PDF

Info

Publication number
CN103298933A
CN103298933A CN2011800607339A CN201180060733A CN103298933A CN 103298933 A CN103298933 A CN 103298933A CN 2011800607339 A CN2011800607339 A CN 2011800607339A CN 201180060733 A CN201180060733 A CN 201180060733A CN 103298933 A CN103298933 A CN 103298933A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
stench
aminoacid sequence
sequence
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2011800607339A
Other languages
English (en)
Inventor
M·蓬佩尤斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of CN103298933A publication Critical patent/CN103298933A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C12N9/84—Penicillin amidase (3.5.1.11)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/33—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing oxygen
    • A61K8/36—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q15/00—Anti-perspirants or body deodorants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及产生恶臭的反应系统领域，特别是产生来自人汗液组分的恶臭。特别地，本发明涉及用于产生恶臭的蛋白质、产生该恶臭的底物、该恶臭产生的抑制剂、以及用于测量其恶臭抑制效力的检测、并发现以前未知的抑制恶臭产生的物质的筛选系统。因而，本发明还涉及除臭剂领域。

Description

恶臭标准物和抑制剂
技术领域
本发明涉及产生恶臭(特别是来自人汗液的组分)的反应系统的领域。特别地，本发明涉及用于产生恶臭的蛋白质、用于产生此恶臭的底物、此恶臭产生的抑制剂、以及用于测量其恶臭抑制效力以及发现以前未知的抑制恶臭产生的物质的测试和筛选系统。因此，本发明还涉及除臭剂领域。
通常认为人新鲜的汗液是无气味的，而汗液的气味由聚居于人皮肤，特别是腋窝的微生物产生的。因而，在一闻到这种气味立刻就清楚这种气味指示人的汗液的意义上，认为由人汗液产生的气味是特征性的。该气味广泛地并且根据本发明被认为是恶臭的，且可以是非常显著的。
因而，较长时间来已经努力抑制汗液恶臭的产生，来降低恶臭或掩盖恶臭。在本发明的上下文中，“抑制”指防止来自人汗液的汗液恶臭形成的所有工具，包括用于减慢这种恶臭产生的工具。“降低”指用于治疗汗液恶臭组分以使其较不强烈的工具，例如，通过结合并固定于基质上。“掩盖”指旨在影响人对汗液恶臭的感知的那些工具和努力，例如，通过用其他的更强烈的且较少恶臭气味占据人的鼻子，或除此之外降低或损伤人嗅觉系统检测一种或多种汗液恶臭的恶臭化合物的能力。
理想的是抑制汗液恶臭的形成而不仅仅是降低或掩盖这样的恶臭。通常尝试的一种方法是向人的腋窝施用止汗药，以防止汗液的形成。理由是当没有汗液形成时，就不会产生汗液恶臭。但是，需要关注这种对人生理过程的影响可能不会持久，或导致不理想的副作用。因而，在本发明的上下文中，“抑制剂”仅仅是有效地减慢或防止来自人汗液的汗液恶臭的一种或多种组分形成的那些物质，而不是主要依赖于抑制分泌形成的任何物质。
因而，普遍需要发现汗液恶臭产生的有效抑制剂。寻找这样的抑制剂受阻于对汗液恶臭的实际形成、特别是对负责恶臭产生的微生物的生理过程所知甚少的事实。此外，缺乏标准的程序来比较潜在的恶臭产生抑制剂的效力。
文献EP 1 387 891(也作为WO 02/092024A2公布)公开了报道参与汗液中发现的无气味前体化合物转化成恶臭的脂肪酸的经分离的N-α-酰基-谷氨酰胺-酰化氨基酸水解酶。该文献还描述了该酶应用于对抑制剂的高通量筛选。
上述欧洲专利文献公开的该酶以及还是其中描述的相应测试系统的不利之处在于该酶需要作为辅助因子的锌离子，因而容易被螯合剂存在影响。但是，当体内施用于人汗液时，如EDTA的锌螯合剂不能有效地抑制人汗液恶臭的产生。因而，当制备该文献中使用的试剂时，测试系统需要很大的谨慎，并且需要再分析通过该测试系统鉴定的潜在的抑制剂，以排除由该测试系统确定的其恶臭抑制效果不只是其对锌离子干扰的结果。
因而，本发明的技术问题是提供测试系统，其用于再现汗液恶臭产生的代表性的途径而不依赖于锌离子的存在。
发明的详细描述
因而，根据本发明，提供了包含氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列与根据SEQ ID NO：2至31中任一项氨基酸序列具有，
a)至少93％、优选至少95％、更优选至少98％和最优选100％的序列同一性，和/或
b)至少97％、优选至少98％、更优选至少99％和最优选100％的序列相似性，
其中序列同一性和序列相似性是根据具有空位开放罚分10.0、空位延伸罚分0.5并使用Blosum62矩阵的EMBOSS针算法计算的。
已经发现当接触新鲜的、无恶臭或弱恶臭的人汗液时，此类蛋白质能够快速产生人汗液特征性的恶臭。显著地，也在这些蛋白质与无菌的人汗液接触时发现产生汗液恶臭的能力。
甚至更重要地，已经发现由这种蛋白质导致的来自人汗液的恶臭产生不依赖于锌离子的存在。即使在足以络合锌离子的浓度的ETDA存在时，蛋白质还是保留其切割N-α-月桂酰-L-谷氨酰胺以释放生化学易于检测和定量月桂酰脂肪酸的能力。被认为是酶的该蛋白质因而在恶臭标准系统中是有用的，且对筛选汗液恶臭抑制剂是有用的。甚至更有益的，已经发现该蛋白质与在不同属、科、目、纲、甚至门的许多种生物体中发现的蛋白质具有高的序列相似性。因而，本发明的蛋白质是在聚居于人皮肤特别是腋窝的所有微生物的相当大的一部分中出现的、迄今为止功能未知的普遍的蛋白质集的代表。因而，可以预期当在体内施用于人汗液和人皮肤时，有效抑制由本发明的蛋白质导致的恶臭形成的抑制剂通常也将有效地抑制汗液恶臭形成。
本发明的蛋白质优选以分离的形式获得。在本发明的上下文中，“分离的”指蛋白质被从其原始环境中移出，特别地没有被生产蛋白质中有用的其他微生物材料污染。甚至更优选地，蛋白质处于纯化的形式，这意味着在组合物中蛋白质的含量相对于具有至少10个氨基酸长度的其它蛋白质或肽以及相对于核酸是至少80wt.-％、更特别地至少90wt.-％、仍然更特别地95wt.-％、以及最特别地99wt，-％或更多。
优选地处于分离的和甚至更优选处于纯化形式的蛋白质包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与根据SEQ ID NO：2至31中任一个的氨基酸序列具有上文的序列同一性和/或序列相似性。根据EMBOSS“针”算法确定本发明的上下文中的序列同一性和序列相似性。该算法是用于在覆盖两个序列的全长上的配对氨基酸序列比对的标准算法。该算法执行Needleman-Wunsch算法(Needleman S.B.和Wunsch C.D.，1970J.Mol.Biol.48，443-453)；其中n个位置的空位罚分是根据以下公式计算的：
空位开放罚分+(n-1)x空位延伸罚分。
比对每个氨基酸的全长，对重叠的突出末端没有罚分。
在本发明上下文中的空位开放罚分是10.0。在本发明上下文中的空位延伸罚分是0.5。在本发明上下文中用于比较氨基酸相似性的评分矩阵是“Blosum62”矩阵。空位开放罚分、空位延伸罚分和“Blosum62”矩阵是本领域中使用的标准参数。可使用这些参数，例如，通过公众可获得的免费工具进行序列比对。例如，EBI提供了免费配对序列比对服务，其通过多种因特网工具的本发明的参数。
本发明的蛋白质，特别是处于分离的或纯化形式的蛋白质，可以由氨基酸序列SEQ ID NO：2至31中任一项组成，其中任选地N末端甲硫氨酸缺失。当与无气味无菌的人汗液接触时，具有这些氨基酸序列而没有其他添加的氨基酸或修饰的蛋白质特别地能够产生强烈的、典型的恶臭。在本发明的上下文中，如本领域技术人员已知的，无菌的意指汗液通过过滤除菌(特别是具有0.4μm过滤截断值)过滤。
本发明的蛋白质，优选处于分离的或纯化形式的蛋白质，优选包含或由根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成，甚至更优选地包含或由根据SEQID NO：4的氨基酸序列组成。当与无菌无气味的新鲜人汗液接触时，发现这些蛋白质对产生人汗液强烈和典型的恶臭特别有用。根据本发明，产生的汗液恶臭的强度和气味由10位经训练的气味专家的专家组分类，强度和气味排序为0(不可检测)至9级(非常强/非常典型)。此类评估在气味分析领域是常见的。
特别地已经发现在SEQ ID NO：3的216位包含异亮氨酸并在219位包含脯氨酸的蛋白质，例如，SEQ ID NO：4的蛋白质，能够容易地被生物技术生产，且当与无菌新鲜的人汗液接触时，能够产生强烈和典型的恶臭。因而，优选本发明的蛋白质包含或由根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列或由根据SEQ ID NO：5至31中任一项的序列组成。
其中，本发明的蛋白质特别优选地包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：2组成。该蛋白质分离自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株，并且特别地发现当接触新鲜无菌的人汗液(如前所述，此类汗液在其新鲜无菌的状态下基本上是无气味的)时，其能快速地产生强烈和典型的恶臭。
本发明的蛋白质，特别地包含或由根据SEQ ID NO：2至31中任一项的氨基酸序列组成的分离的或纯化的蛋白质，优选地不切割3-甲基-2-己烯酸酰胺和3-甲基-2-羟基-己酸酰胺但切割N-α-月桂酰-L-谷氨酰胺。如前所述的，蛋白质切割N-α-月桂酰-L-谷氨酰胺不依赖于锌离子的存在。
根据本发明，还提供了分离的核酸，所述核酸编码本发明蛋白质，即与根据如上定义的SEQ ID NO：2-31中任一项的氨基酸序列具有a)至少93％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性，和/或b)至少97％、优选至少98％、更优选至少99％的序列相似性的蛋白质。核酸优选包含或由根据SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33的碱基序列组成。根据SEQ IDNO：32的核苷酸序列特别地适应于在枯草芽孢杆菌中生产SEQ ID NO：2的蛋白质；包含根据SEQ ID NO：33的碱基序列的核酸特别地适应于在大肠杆菌K12中生产SEQ ID NO：2的蛋白质。本领域技术人员理解本发明还包含编码由SEQ ID NO：2组成的蛋白质的核酸，所述由SEQ ID NO：2组成的蛋白质被优化用于由除枯草芽孢杆菌和大肠杆菌K12以外的其它微生物表达，其中此类优化是根据微生物对于各种氨基酸的各自的密码子偏好进行。
因而，本发明的核酸允许生物技术地生产本发明的蛋白质，以促进可再现地并以足够量地提供此类蛋白质。
为了这个目的，本发明还提供了表达载体，其包含有效连接于启动子的根据本发明的核酸。而且，本发明还提供了宿主细胞，优选大肠杆菌细胞或枯草芽孢杆菌细胞，所述细胞包含编码根据本发明的蛋白质的核酸，其中优选地用本发明的表达载体转化宿主细胞。在宿主细胞中的表达载体可以是独立的或，优选稳定地，插入宿主细胞的基因组。
通过重组基因表达的此类生物技术蛋白质生产还提供了向蛋白质添加N末端和/或C末端标签的可能性。此类标签包含例如His-标签或Strep-标签的标签或其它标签，并且是本领域技术人员熟知的。此类标签特别的优点是使用特异性的亲和色谱相同容易纯化各自的蛋白质。这些纯化流程是本领域技术人员所熟知的。在用Ni-NTA或Ni-IDA功能化的树脂上纯化带有His标签的蛋白质是特别有利的，因为此类树脂容易获得(例如，来自GE Healthcare，Uppsala，Sweden)。附着于本发明的蛋白质的His标签的另一个优点是His标签不干扰根据本发明的酶的酶促活性以及其使用。因此，在有益处的情况下此类纯化的标签可用于帮助蛋白质纯化。
在另一方面，本领域技术人员已知此类标签可能干扰蛋白质生产效率和/或特异性的酶活性。如图35所见，此处还发生了：His标记的蛋白质的细胞培养物中总的酶活性低于没有His-标签的蛋白质。
这为对于较高的需要，如用于大量检测(例如，用于筛选大量潜在抑制剂)而生产较大量的蛋白质，或为用于具体的生物化学检测而生产纯化的蛋白质(如例如，确定酶动力学，抑制剂结合常数等)提供了特别有利的可能性。
鉴于本发明的上述问题，还提供了恶臭标准组合物。本发明的恶臭标准组合物包含本发明的蛋白质，优选分离的或纯化的蛋白质，还优选地包含或由根据SEQ ID NO：2至31中任一项的氨基酸序列连同可被蛋白质切割以产生恶臭产物的物质组成。可切割的物质可以是天然的、新鲜的以及无菌人汗液的成分。根据本发明，当其中可切割的物质是N-α-月桂酰-L-谷氨酰胺时，恶臭标准组合物是特别优选的。
当与新鲜的、在所述接触前基本上无气味的人汗液接触时，本发明的恶臭标准组合物对于产生人汗液的强烈的典型的恶臭是特别有用的。根据本发明的此类恶臭标准组合物的特别的优点是其不依赖于锌离子存在于恶臭标准组合物或汗液中。因而，本发明的恶臭标准组合物允许在基本上消除了如测试人的不同皮肤表面或汗液温度的因素的可再现的条件下研究和影响人汗液非常典型的恶臭的产生。
根据本发明的恶臭标准组合物特别适合于发现和检测影响汗液恶臭产生、强度和“气味”的物质的效力。这可通过如下实现：向本发明的恶臭标准组合物添加用于改变汗液恶臭的速度、强度或“气味”的候选物质，然后使所述恶臭标准组合物接触人汗液，特别是新鲜并且优选无菌的人汗液。也可将候选物质添加至汗液，特别是新鲜并且优选无菌的汗液，然后使所述汗液接触本发明的恶臭标准组合物。
根据本发明的恶臭标准组合物不局限于上述恶臭标准组合物。恶臭标准组合物还可以包含分离的蛋白质，所述蛋白质包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有，
a)至少93％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性，和/或
b)至少97％、优选至少98％、更优选至少99％的序列相似性，
其中序列同一性和序列相似性是根据具有空位开放罚分10.0、空位延伸罚分0.5并使用Blosum62矩阵的EMBOSS针算法计算的。氨基酸序列SEQ ID NO：1已知来自枯草芽孢杆菌。但是，并不知道当接触无气味的人汗液时，此类蛋白质能够产生典型和强烈的汗液恶臭。因而，蛋白质在本发明的恶臭标准组合物中也是有用的。
本发明的恶臭标准组合物优选包含蛋白质，所述蛋白质包含或由根据SEQ ID NO：1至31中任一项的氨基酸序列组成，优选包含或由根据SEQID NO：2或SEQ ID NO：5至31中任一项的氨基酸序列组成。特别优选地是此类恶臭标准组合物，其中用于产生汗液恶臭的蛋白质由纯化的蛋白质组成，该纯化的蛋白质由氨基酸序列SEQ ID NO：1至31中任一项组成，特别优选地由SEQ ID NO：2或5至31组成，最优选地由SEQ ID NO：2组成。
因而，根据本发明提供了恶臭标准组合物，其由以下组成；
-由氨基酸序列SEQ ID NO：1、2至31中任一项组成的分离的或纯化的蛋白质，
-N-α-月桂酰-L-谷氨酰胺，
-和载剂。
载剂优选是液体载剂，最优选是调节至pH＞4、甚至更优选地为5至9、最优选地为6.2至7.8的水缓冲剂。特别优选地此类缓冲剂是由水、50mMNaH2PO4/K2HPO4和50mM NaCl组成的缓冲剂。此类载剂容易可再现且不足量地生产。
根据本发明提供了恶臭抑制组合物。该恶臭抑制组合物包含根据本发明的恶臭标准组合物和产生恶臭产物的切割反应的潜在抑制剂，使得本发明的恶臭抑制组合物允许以标准化的方法容易地并可再现地检测抑制剂的潜在汗液恶臭的效力。
因而，根据本发明，恶臭抑制组合物包含：
-优选地分离的或纯化的蛋白质，其包括或由根据SEQ ID NO：1、2至31中任一项氨基酸序列组成，
-N-α-月桂酰-L-谷氨酰胺和，
-载剂，其在抑制剂不存在时允许由蛋白质切割N-α-月桂酰-L-谷氨酰胺，和
-候选抑制剂。
甚至更优选地，本发明的恶臭抑制剂组合物由以下组成：
-分离的或纯化的蛋白质，其由根据SEQ ID NO：1、2、5至31中任一项的氨基酸序列组成，
-N-α-月桂酰-L-谷氨酰胺，
-载剂，其在抑制剂不存在时允许由蛋白质切割N-α-月桂酰-L-谷氨酰胺，和
-候选抑制剂。
在本发明的恶臭抑制剂组合物中，载剂优选是pH7的在水中的50mMNaCl和50mM NaH2PO4/K2HPO4的溶液。
本发明还提供了恶臭抑制剂筛选系统，其包含
-优选地分离的蛋白质，
-与在允许此类切割的条件下可被蛋白质切割以产生恶臭产物的物质，和
-待筛选的抑制剂候选物质组，
所述分离的蛋白质包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与根据SEQ IDNO：1至31中任一项的氨基酸序列具有，
a)至少93％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性，和/或
b)至少97％、优选至少98％、更优选至少99％的序列相似性，其中序列同一性和序列相似性是根据具有空位开放罚分10.0、空位延伸罚分0.5并使用Blosum62矩阵的EMBOSS针算法计算的。
因而，恶臭抑制剂筛选系统优选地包含在选定的抑制剂候选物质存在时实施将蛋白质和可切割物质反应的步骤的设备，所述步骤在不存在有效的抑制剂时允许切割可切割物质以产生恶臭产物的条件下进行。
再一次地，可切割物质优选为N-α-月桂酰-L-谷氨酰胺。而且也为了以上提及的有利之处，蛋白质优选为分离的或纯化的蛋白质。
特别优选地是本发明的恶臭抑制剂筛选系统，其中蛋白质是分离的或纯化的蛋白质，其由根据SEQ ID NO：1、2至31中任一项的氨基酸序列组成，并且最优选地是由根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的纯化的蛋白质。
允许此类切割的条件优选地包括存在pH7的包含50mM NaCl和50mM NaH2PO4/K2HPO4的水缓冲剂。
总而言之，恶臭抑制剂筛选系统特别优选地包含
-由根据SEQ ID NO：1、2、3至31中任一项的氨基酸序列组成的纯化的蛋白质，
-N-α-月桂酰-L-谷氨酰胺，
-pH7的50mM NaCl和50mM NaH2PO4/K2HPO4的水缓冲剂，
-抑制剂候选物质的阵列，和
-用于向缓冲剂中混合蛋白质、N-α-月桂酰-L-谷氨酰胺和一种或多种抑制剂候选物质的自动仪。
此类恶臭抑制剂筛选系统特别地适应用于高通量筛选应用中，用于检测不同浓度中多类潜在的抑制剂物质的效力。因而，本发明的恶臭抑制剂筛选系统有利地有助于鉴定其他有用的汗液恶臭抑制剂。系统还实现了涉及本发明的蛋白质和恶臭标准组合物的优点，特别是不依赖于锌离子的恶臭产生。
再一次地，如上所述，可以由专家组分析和定量恶臭的形成和恶臭形成的抑制。但是，在高通量应用中优选地和特别地有用的也是根据本发明的系统，其中，待切割的物质和/或此类切割反应的产物自动地被检测，例如，通过气相色谱或通过基于添加其他反应物光度测定、荧光光度测定或发光光度测定来光学检测。用于检测的此类方法是本领域技术人员已知的，例如，从EP 1387891 B1的实施例8中可知。
因此，本发明还提供了可标准化的产生恶臭的方法，其包括在允许此类切割的条件下使蛋白质与可被此蛋白质切割的物质反应以产生恶臭的步骤，其中物质优选N-α-月桂酰-L-谷氨酰胺，所述蛋白质包含或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与根据SEQ ID NO：1至31中任一项的氨基酸序列具有，
a)至少93％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性，和/或
b)至少97％、优选至少98％、更优选至少99％的序列相似性，
其中序列同一性和序列相似性是根据具有空位开放罚分10.0、空位延伸罚分0.5并使用Blosum62矩阵的EMBOSS针算法计算的。
方法优选在新鲜且无菌的人汗液中进行，或在pH7的50mM NaCl和50mM NaH2PO4/K2HPO4的水缓冲剂中进行。
蛋白质优选由根据SEQ ID NO：1至31中任一项，优选由根据SEQ IDNO：1、2、5至31中任一项，并最优选由根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。
此外，本发明提供了筛选恶臭抑制剂的方法，方法包括步骤：
1、在不存在抑制剂时允许此类切割反应的条件下，孵育含有氨基酸序列的蛋白质，
-与可被蛋白质切割的物质，和
-用于潜在抑制切割反应的抑制剂，和
2、测量恶臭产生，
所述氨基酸序列具有与根据SEQ ID NO：1至31中任一项的氨基酸序列，
a)至少93％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性，和/或
b)至少97％、优选至少98％、更优选至少99％的序列相似性，其中序列同一性和序列相似性是根据具有空位开放罚分10.0、空位延伸罚分0.5并使用Blosum62矩阵的EMBOSS针算法计算的。
通过参考实施例和附图进一步描述本发明。这些实施例不应该被理解为限制权利要求的范围。
实施例
实施例1：通过PCR扩增yxel基因并克隆至大肠杆菌表达载体中。
分离自人腋窝的枯草芽孢杆菌菌株的基因组DNA用作PCR扩增的模板。正向引物(5’-GGGACTGATCATATGTGCACAAGTCTTAC-3’)和反向引物(5’-ATTGAGGATCCTTAATTAAGCTCATGAATACTCT-3’)用于PCR扩增。
根据制造商的说明书用限制性内切酶NdeI和BanHI(New EnglandBiolabs，Frankfurt，Germany)处理得到的PCR产物，并克隆至质粒pET24a(Merck，Darmstadt，Germany)和pET28a(Merek，Darmstadt，Germany)中。得到的表达载体称为pET24a::yxeI或pET28a::yxeI。它们含有编码SEQ ID NO：1的蛋白质的核酸。在载体pET28a中，蛋白质连接于6个连续的组氨酸氨基酸的His标签。
实施例2、大肠杆菌中基因表达和蛋白质生产。
大肠杆菌BL21(DE3)用作表达宿主。使用250ml摇瓶，在37℃100ml Luria-Bertani培养基中培养菌株(不含质粒或者携带实施例1中描述的表达载体)并用力摇动。在存在含有30mg/l卡那霉素的Luria-Bertani培养基下培养含有质粒的菌株。在细胞密度达到OD600为1后，加入IPTG至最终浓度为0.1mM，随后在相同的条件下额外孵育另外2小时。
从培养物中取1.5ml样品，通过离心收获细胞，并用SDS-PAGE以及随后的Coomasie染色分析。如图34所示，在诱导后观察到强烈的基因表达和蛋白质生产。
实施例3：酶活性的确定和抑制剂作用的检测
通过离心收获如实施例2中获得的细胞，并用PBS缓冲剂洗涤2次，以除去残留的培养基组分。在PBS缓冲剂(每升水：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g K H2PO4、pH7.4)中重悬最终的细胞沉淀物，以达到最终OD600为30。菌株(不含质粒或者携带如实施例1所述的表达载体)的此细胞悬液用于活性测试。在PBS缓冲剂中使洗涤的细胞悬液在37℃与N-α-月桂酰-L-谷氨酰胺(0.2mg/ml终浓度，图35中的“LG”)接触15分钟(最终体积0.25ml)。如WO02/092024A2的实施例7所述进行实际的检测，GC作为测试方法。不含质粒的菌株表现出一些背景活性，而携带表达载体的菌株表现强的酶活性，如图35所见。该图展示相对于pET24a中表达的本发明的酶的活性的酶活性。补充说明，新鲜的人汗液接触该酶导致产生人汗液的强烈气味。
作为活性抑制的检测，向一组样品添加乙酸钠，至终浓度为100mM。作为结果，酶活性被抑制至不含质粒的大肠杆菌菌株的背景活性的水平。
分别用具有根据SEQ ID NO：2、5至31的氨基酸序列的酶重复该测定。当与新鲜，无气味的人汗液接触时，所有的酶同样产生了强烈的人汗液气味。

Claims (15)

1.包含氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列与根据SEQ ID NO：2至31中任一项的氨基酸序列具有
a)至少93％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性，和/或
b)至少97％、优选至少98％、更优选至少99％的序列相似性，
其中序列同一性和序列相似性是根据具有空位开放罚分10.0、空位延伸罚分0.5并使用Blosum62矩阵的EMBOSS针算法计算的。
2.根据权利要求1的蛋白质，其中蛋白质的氨基酸序列包含根据SEQID NO：2至31中任一项的氨基酸序列或由根据SEQ ID NO：2至31中任一项的氨基酸序列组成，其中任选地N末端甲硫氨酸缺失。
3.根据权利要求1或2中任一项的蛋白质，其中蛋白质不切割3-甲基-2-己烯酸-酰胺和3-甲基-2-羟基-己酸-酰胺，但切割N-α-月桂酰-L-谷氨酰胺。
4.分离的核酸，其编码根据权利要求1至3中任一项的蛋白质。
5.表达载体，其包含根据权利要求4中任一项的核酸，所述核酸与启动子有效连接。
6.宿主细胞，其包含编码根据权利要求1至3中任一项的蛋白质的核酸，所述宿主细胞优选用根据权利要求5的表达载体转化。
7.恶臭标准组合物，其包含
-包含氨基酸序列的蛋白质，
-与在允许此类切割的条件下可被蛋白质切割以产生恶臭产物的物质，
所述氨基酸序列与根据SEQ ID NO：1至31中任一项的氨基酸序列具有
a)至少93％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性，和/或
b)至少97％、优选至少98％、更优选至少99％的序列相似性，
其中序列同一性和序列相似性是根据具有空位开放罚分10.0、空位延伸罚分0.5并使用Blosum62矩阵的EMBOSS针算法计算的。
8.根据权利要求7的恶臭标准组合物，其中可切割的物质是N-α-月桂酰-L-谷氨酰胺。
9.恶臭抑制组合物，其包含根据权利要求7至8中任一项的恶臭标准组合物和切割反应的抑制剂，所述切割反应在不存在所述抑制剂时在允许此类切割的条件下产生恶臭产物。
10.恶臭抑制剂筛选系统，所述系统包含
-包含氨基酸序列的蛋白质，
-与在允许此类切割的条件下可被蛋白质切割以产生恶臭产物的物质，
-以及待筛选的抑制剂候选物质组，
所述氨基酸序列与根据SEQ ID NO：1至31中任一项的氨基酸序列具有
a)至少93％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性，和/或
b)至少97％、优选至少98％、更优选至少99％的序列相似性，
其中序列同一性和序列相似性是根据具有空位开放罚分10.0、空位延伸罚分0.5并使用Blosum62矩阵的EMBOSS针算法计算的。
11.根据权利要求10的恶臭抑制剂筛选系统，其中可切割的物质是N-α-月桂酰-L-谷氨酰胺。
12.筛选恶臭抑制剂的方法，所述方法包括步骤，
1)孵育
-包含氨基酸序列的蛋白质，
-与在允许此类切割的条件下可被蛋白质切割以产生恶臭产物的物质，
-以及抑制剂候选物质，和
2)测量恶臭产生，
所述氨基酸序列与根据SEQ ID NO：1至31中任一项的氨基酸序列具有
a)至少93％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性，和/或
b)至少97％、优选至少98％、更优选至少99％的序列相似性，
其中序列同一性和序列相似性是根据具有空位开放罚分10.0、空位延伸罚分0.5并使用Blosum62矩阵的EMBOSS针算法计算的。
13.根据权利要求1至3中任一项的蛋白质在恶臭标准组合物中用于产生恶臭产物的用途。
14.包含氨基酸序列的蛋白质用于筛选恶臭产生的抑制剂的用途，所述氨基酸序列与根据SEQ ID NO：1至31中任一项的氨基酸序列具有
a)至少93％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性，和/或
b)至少97％、优选至少98％、更优选至少99％的序列相似性，
其中序列同一性和序列相似性是根据具有空位开放罚分10.0、空位延伸罚分0.5并使用Blosum62矩阵的EMBOSS针算法计算的。
15.根据权利要求13或14的用途，其中蛋白质是分离的或纯化的蛋白质，所述蛋白质由根据SEQ ID NO：1至31中任一项的氨基酸序列组成，优选地由根据SEQ ID NO：1、2、5-31中任一项的氨基酸序列组成，并且最优选地由根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。
CN2011800607339A 2010-12-17 2011-12-19 恶臭标准物和抑制剂 Pending CN103298933A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201061424114P 2010-12-17 2010-12-17
US61/424,114 2010-12-17
EP10195789.2 2010-12-17
EP10195789 2010-12-17
PCT/EP2011/073275 WO2012080516A2 (en) 2010-12-17 2011-12-19 Malodour standards and inhibitors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103298933A true CN103298933A (zh) 2013-09-11

Family

ID=45443102

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011800607339A Pending CN103298933A (zh) 2010-12-17 2011-12-19 恶臭标准物和抑制剂

Country Status (13)

Country Link
US (1) US9249448B2 (zh)
EP (1) EP2651969B1 (zh)
JP (1) JP6093709B2 (zh)
KR (1) KR20140009249A (zh)
CN (1) CN103298933A (zh)
AU (1) AU2011343159A1 (zh)
BR (1) BR112013015067A2 (zh)
CA (1) CA2816246A1 (zh)
ES (1) ES2605958T3 (zh)
MX (1) MX2013006962A (zh)
PL (1) PL2651969T3 (zh)
RU (1) RU2013132814A (zh)
WO (1) WO2012080516A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111032095A (zh) * 2017-11-22 2020-04-17 弗门尼舍有限公司 鉴定能调节衣物恶臭、发霉恶臭和/或汗液恶臭的化合物的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1258531A1 (en) 2001-05-14 2002-11-20 Givaudan SA Compounds and methods for inhibiting axillary malodour
US9109246B2 (en) * 2007-10-10 2015-08-18 Givaudan Sa Enzymatic methods and enzymes

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE EMBL: "DATABASE EMBL ACCESSION NO.BAA08325.1", 《DATABASE EMBL》 *
DATABASE UNIPROT: "DATABASE UNIPROT ACCESSION NO.D4G3U7", 《DATABASE UNIPROT》 *
DATABASE UNIPROT: "DATABASE UNIPROT ACCESSION NO.D5MWB7", 《DATABASE UNIPROT》 *
DATABASE UNIPROT: "DATABASE UNIPROT ACCESSION NO.E0TYE2", 《DATABASE UNIPROT》 *
DATABASE UNIPROT: "DATABASE UNIPROT ACCESSION NO.Q2HPP6", 《DATABASE UNIPROT》 *
RATHINASWAMY PRIYA ET AL: "CLONING,PURIFICATION,CRYSTALLIZATION AND PRELIMINARY STRUCTURAL STUDIES OF PENICILIN V ACYLASE FROM BACILLUS SUBTILIS", 《ACTA CRYSTALLOGRAPHICA SECTION F STRUCTURAL BIOLOGY AND CRYSTALLIZATION COMMUNICATIONS》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111032095A (zh) * 2017-11-22 2020-04-17 弗门尼舍有限公司 鉴定能调节衣物恶臭、发霉恶臭和/或汗液恶臭的化合物的方法

Also Published As

Publication number Publication date
US9249448B2 (en) 2016-02-02
AU2011343159A1 (en) 2013-07-04
CA2816246A1 (en) 2012-06-21
PL2651969T3 (pl) 2017-02-28
EP2651969B1 (en) 2016-08-31
US20130315851A1 (en) 2013-11-28
MX2013006962A (es) 2013-07-15
BR112013015067A2 (pt) 2018-08-28
WO2012080516A3 (en) 2012-12-20
EP2651969A2 (en) 2013-10-23
JP6093709B2 (ja) 2017-03-08
JP2014509186A (ja) 2014-04-17
KR20140009249A (ko) 2014-01-22
ES2605958T3 (es) 2017-03-17
RU2013132814A (ru) 2015-01-27
WO2012080516A2 (en) 2012-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6975185B2 (ja) 長寿命アルファ溶血素ナノポア
CN107109479B (zh) 具有改变的特征的α-溶血素变体
JP7027334B2 (ja) アルファ溶血素バリアントおよびその使用
Kim et al. Cotranslational incorporation of a structurally diverse series of proline analogues in an Escherichia coli expression system
EP2483397A2 (en) Incorporation of methyl lysine into polypeptides
KR20140006052A (ko) 개량형 니트릴 히드라타제
CN107002074A (zh) 活性型突变酶的制造方法及新型活性型突变酶、以及可溶性化突变蛋白的制造方法
JP2020072679A (ja) 蛍光ベースの検出方法によるサンプル中の微生物を検出する方法
CN103298933A (zh) 恶臭标准物和抑制剂
Cheng et al. Purification and characterization of an eggshell membrane decomposing protease from Pseudomonas aeruginosa strain ME-4
EP1561807B1 (en) Method of degrading hardly degradable protein
JP4982849B2 (ja) 細菌検出およびグラム陽性／陰性識別方法
Lu et al. Localization and enzyme kinetics of aminopeptidase N3 from Toxoplasma gondii
JP5431339B2 (ja) 酵素学的方法および酵素
AU2011343159A2 (en) Malodour standards and inhibitors
AU719576B2 (en) Protein which binds ATP and nucleic acid and which possesses putative helicase and ATPase properties
WO2021193749A1 (ja) ペプチドグリカン分解活性を有するタンパク質および該タンパク質をコードするｄｎａ、微生物分解製剤ならびに微生物分解方法
EP4382597A1 (en) Reagent for measuring ?-glucan, method for producing same and use thereof
Malathi et al. Optimization of protease enzyme production by the halo-tolerant Vibrio alginolyticus isolated from marine sources
CN109913435B (zh) 一种羧肽酶及其编码基因、重组载体、重组菌及应用
CA2455299A1 (en) A microorganism with protease decomposing proteins recalcitrant to proteolysis
Kurane et al. Studies on Keratinase Enzyme Using Bacteria Isolated From Feather Dumping Soil and Its Application in Dehairing and Tannery Waste Management.
Li Understanding Freshwater Mussel Adhesion Through Recombinant Synthesis of Dresseina bugensis Foot Protein 7
Bugensis Understanding Freshwater Mussel Adhesion Through Recombinant Synthesis of
CN118324869A (zh) 精氨酸光学探针

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20130911