ES2605705T3 - Tietilperazina para el tratamiento de una beta-amiloidopatía o alfa-sinucleopatía - Google Patents

Tietilperazina para el tratamiento de una beta-amiloidopatía o alfa-sinucleopatía Download PDF

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Abstract

2-(R2-tio)-10-[3-(4-R1-piperazin-1-il)propil]-10H-fenotiazina de acuerdo con la fórmula general I**Fórmula** en la que el resto R1 es un grupo metilo, el resto R2 es un grupo etilo y los restos R3 y R7 son hidrógeno, para el tratamiento de una β-amiloidopatía o una α-sinucleinopatía, que van acompañadas de un depósito de proteínas cerebral y una actividad reducida del transportador ABCC1 cerebral.

Description

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DESCRIPCION
Tietilperazina para el tratamiento de una beta-amiloidopatia o alfa-sinucleopatfa
La acumulacion de protemas o fragmentos de protemas (peptidos) en el cerebro es una caractenstica significativa de enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la edad. En el caso de la demencia de Alzheimer (enfermedad de Alzheimer, AD) y de la angiopatfa p-amiloide cerebral (CAA) es desencadenante de la enfermedad la agregacion de peptidos p-amiloide (Ap), no siendo conocido el mecanismo subyacente. La Ap-proteostasia, es decir el equilibrio de produccion y degradacion/transporte por medio de receptores o proteasas, se ve alterado en caso de la AD y CAA. Sin embargo, a la separacion de los peptidos Ap mediante transportadores celulares (transportadores ABC) se le ha concedido hasta ahora poca atencion. En el caso de la enfermedad de Parkinson (enfermedad de Parkinson) se acumula la protema a-sinuclema, que entre otras cosas regula la distribucion de dopamina en la sustancia negra. En el caso de la a-sinucleinopatfa enfermedad de Parkinson se sabe que los transportadores ABC desempenan un papel decisivo para el transporte (Kortekaas et al., Ann Neurol 2005, 57, 176179). Segun esto existen varias subfamilias A-G, que pueden transportar distintos sustratos de manera bidireccional (metabolitos, farmacos, peptidos, protemas, iones) e incluso pueden cambiarse de manera redproca en la funcion de transporte (por ejemplo ABCB1 y ABCC1, Tao et al. Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 64, 5, 961-969).
El documento WO2008/092898A1 describe una combinacion de dos principios activos para el tratamiento de enfermedades que se producen mediante agregacion de protemas. En el caso de uno de los principios activos se trata de un derivado de fenotiazina, no incluyendose tietilperazina. El documento WO96/04915A1 describe el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer por medio de derivados de fenotiazina o tioxantenos, no incluyendose tietilperazina. El documento WO2008/133884A2 describe el tratamiento de una pluralidad de enfermedades neurodegenerativas con una pluralidad de principios activos. En el caso de uno de los principios activos se trata de tietilperazina. Sin embargo, todos los datos experimentales se refieren a la enfermedad de Huntington.
Por medio de distintos modelos de raton modificados mediante ingeniena genetica pudo mostrarse que el transportador ABC (el elemento estructural conjunto de los transportadores ABC es un casete de union a ATP y un poro de transporte), ABCC1, es un importante transportador de protemas/peptidos, en particular transportador de Ap, que tiene efectos funcionales extraordinarios sobre la acumulacion de protemas cerebral. ABCC1 es ademas un importante transportador de a-sinuclema.
A continuacion se describen los estudios con respecto a la actividad de transportadores a modo de ejemplo en el transporte de Ap.
Para la determinacion de la actividad de ABCC1 in vivo se separo mediante ingeniena genetica en ratones transgenicos que expresan APP en cada caso el transportador ABCB1, el transportador ABCG2 o el transportador ABCC1 (ratones knockout).
A este respecto se encontro que:
i) la cantidad de Ap en los ratones a los que les faltan el transportador ABCC1 habfa aumentado 12 veces,
ii) la perdida de transportador ABCB1 conduce solo a un aumento de 3 veces y
iii) la perdida de ABCG2 no tiene ningun efecto de acumulacion de Ap.
Por tanto era objetivo de la presente invencion facilitar sustancias que influyan de manera adecuada en el transportador ABCC1 para poder tratar asf enfermedades neurodegenerativas, en particular p-amiloidopatfas o a- sinucleinopatfas. Este objetivo se soluciono con la 2-(R2-tio)-10-[3-(4-R1-piperazin-1-il)propil]-10H-fenotiazina de acuerdo con la reivindicacion 1. Otras formas de realizacion preferentes resultan de las reivindicaciones dependientes.
En otras palabras se soluciono el objetivo mediante la 2-(R2-tio)-10-[3-(4- R1-piperazin-1-il)propil]-10H-fenotiazina de acuerdo con la formula general I
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en la que el resto R es un grupo metilo, el resto R2 es un grupo etilo y los restos R3 y R7 son hidrogeno, para el tratamiento de una p-amiloidopatia o una a-sinucleinopatia, que van acompanadas de un deposito de protemas cerebral y una actividad reducida del transportador ABCCl cerebral.
Ademas existe tanto en el caso de las a-sinucleinopatias como en el caso de las p-amiloidopatias una necesidad de posibilidades de reconocer o diagnosticar o prediagnosticar estas enfermedades.
Era tambien objetivo de la memoria descriptiva la facilitation de un procedimiento, con el que pudieran diagnosticarse o prediagnosticarse a-sinucleinopatias como tambien p-amiloidopatias. Este objetivo se soluciona mediante un procedimiento para el diagnostico o prediagnostico de una p-amiloidopatia o a-sinucleinopatia o para la determination del riesgo de una persona de experimentation de padecer una enfermedad de este tipo, en el que la persona de experimentacion toma ya sustancias que se transportan a traves del transportador ABCC1 cerebral, que esta constituido por las siguientes etapas:
a) determinacion de la cantidad de la sustancia ingerida en muestras de liquidos corporales de la persona de
experimentacion en un momento determinado;
b) repetition de la determinacion de la etapa a) en al menos otro momento posterior;
c) comparacion de las cantidades determinadas en la etapa a) y b) con cantidades que se habian definido en
momentos iguales como caracteristicas para personas de experimentacion, que en el momento de la extraction
de la muestras no mostraban ninguna indication clmica de una p-amiloidopatia o a-sinucleinopatia.
Que la persona de experimentacion toma ya al menos una sustancia que se transporta a traves del transportador ABCC1 cerebral significa que esta sustancia no debe administrarse en primer lugar. Mas bien esta existe ya en el cuerpo de la persona de experimentacion, por ejemplo debido a un tratamiento farmacologico de otra enfermedad. Las muestras de liquidos corporales de la persona de experimentacion, que se someten a estudio, son preferentemente muestras de plasma sangumeo, suero sangumeo y/o liquido cefalorraquideo.
La p-amiloidopatia es preferentemente una demencia de Alzheimer, la a-sinucleinopatia es preferentemente la enfermedad de Parkinson. Eventualmente puede ser la a-sinucleinopatia tambien una demencia por cuerpos de Lewy (DLB). Las sustancias que se transportan a traves del transportador ABCC1 cerebral se seleccionan preferentemente de antibioticos (por ejemplo difloxacino, grepafloxacino), farmacos virostaticos/antivirales (por ejemplo saquinavir, ritonavir), antialergicos/antihistammicos (por ejemplo cimetidina), farmacos cardiovasculares (por ejemplo verapamilo), antidepresivos (por ejemplo citalopram), antihiperuricemicos (por ejemplo probenecid), citoestaticos (por ejemplo metotrexato, etoposit, edatrexato, ZD1694), vitaminas/analogos de vitaminas (por ejemplo metotrexato, acido folico, L-leucovorina), antiflogisticos (por ejemplo indometacina), antiepilepticos (por ejemplo acido valproico), hormonas/derivados de hormonas (por ejemplo 17p-estradiol), leucotrienos (por ejemplo LTC4), muestras fluorescentes (por ejemplo calcema, Fluo-3, BCECF, SNARF), metabolitos de sustancias naturales (producidos de manera endogena) acoplados con GSH, sulfato o glucuronido, toxinas o de farmacos (por ejemplo 2,4-dinitrofenil-SG, bimane-SG, N-etilmaleimida-SG, doxorubicina-SG, tiotepa-SG, ciclofosfamida-SG, melfalan-SG, clorambucilo-SG, acido etacrinico-SG, metolaclor-SG, atrazina-SG, sulforafan-SG, aflatoxina B1-epoxido-SG, 4- nitroquinolina 1-oxido-SG, As(SG)3, etoposid-Gluc, 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanol (NNAL)-3p-O-Gluc, SN-38-gluc, 4-metilumbelliferil-p-d-gluc, sulfato de 6-hidroxi-5,7-dimetil-2-metilamino-4-(3-piridilmetil)-benzotiazol (E3040S)-Gluc, leucotrieno C4, prostaglandina A2-SG, 15-desoxi-A12,14 prostaglandina J2-SG, hidroxinonenal-SG, 17p-estradiol-17-p-d-gluc, glucuronosilbilirrubina, bis-lucuronosilbilirrubina, hidrodesoxicolato-6-a-Gluc, estrona-3- sulfato, sulfato de deshidroepiandrosterona, sulfatolitocolato) (vease tambien Deeley RG et al.: Substrate recognition and transport by multi drug resistance protein 1 (ABCC1), FEBS letters 2006, 580 (4), pag. 1103-1111.)
Este analisis indirecto de la actividad de transportador del transportador ABCC1 puede aprovecharse para el diagnostico/prediagnostico de una correspondiente enfermedad. En personas de experimentacion que toman ya sustancias que pueden transportarse por ABCC1 de otros modos puede someterse a estudio el perfil de la concentration de principio activo en liquidos corporales, preferentemente plasma sangumeo, suero sangumeo y/o
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Kquido cefalorraqmdeo. Una medicion temporalmente dependiente muestra para personas de experimentacion, en las que existe una actividad de transportador ABCC1 reducida en comparacion con personas de experimentacion sanas, una curva de concentracion de sustancias retardada o desplazada (concentracion c trazada con respecto al tiempo t), es decir el maximo de la curva aparece de manera temporalmente modificada.
Cuando resulta una curva desplazada en comparacion con el caso sano, esto es una indicacion de una actividad modificada del transportador ABCC1. Esto significa que entonces tambien sustancias tales como Ap o a-sinuclema se transportan peor y es por consiguiente una indicacion de una correspondiente enfermedad.
Tanto los modelos de raton como tambien la influencia farmacologica del ABCC1 muestran que este es un transportador transmembrana celular importante para la protema Ap e implican que la barrera hematoencefalica y el plexo coroideo ocupan una posicion clave para la excrecion de Ap fuera del cerebro. Pudo mostrarse que la activacion farmacologica selectiva del transportador ABCC1 reduce significativamente la carga cerebral con Ap y puede usarse asf terapeuticamente para el tratamiento de enfermedades con proteostasia cerebral alterada. Ademas puede aprovecharse el analisis de la actividad de transportador del transportador ABCC1, tal como se ha descrito anteriormente, para el diagnostico/prediagnostico indirecto o directo de una correspondiente enfermedad. El analisis directo sena posible por medio de la administracion de sustancias que se transportan a traves del transportador ABCC1, y su determinacion. El analisis indirecto se explico ya anteriormente.
Las modificaciones de mecanismos de exportacion, que se encuentran relacionados con transportadores ABC, pueden influir sustancialmente en el perfil de agregacion temporal de Ap y otras protemas cerebrales. Como consecuencia de esto repercute positivamente una influencia de la funcion del transportador ABCC1 sobre el riesgo de padecer enfermedades neurodegenerativas, en particular Alzheimer. El “tratamiento de enfermedades neurodegenerativas” comprende en este sentido la profilaxis como tambien el tratamiento de enfermedades ya existentes.
El papel de los transportadores ABC en la excrecion de Ap se sometio a estudio por primera vez de manera que se determino que ABCC1 puede transportar Ap. Para ello se usaron ensayos Transwell in vitro con celulas endoteliales (endothelialcelltranswellassay, ECTA) de celulas endoteliales capilares primarias, cultivadas de cerebros de raton (mezcla de cultivo celular):
Los cultivos primarios de celulas endoteliales de capilares cerebrales de ratones deficientes en ABCB1, deficientes en ABCC1 (knockout) y de ratones control (C57BI/6, FVB/N) se usaron para someter a estudio la actividad de transporte espedfica de Ap. El transporte de Ap desde el compartimento abluminal (cerebro) hacia el compartimento luminal (sangre) esta alterado en endotelios deficientes en ABCB1 y deficientes en ABCC1. La velocidad promedio de transporte de Ap durante las primeras seis horas tras la administracion de peptidos de Ap (Ap42) ascendfa a 2,2 pg/min para las celulas control. A diferencia de esto alcanzaron las celulas deficientes en ABCC1 solo la mitad de la capacidad de transporte (1,0 pg/min). En las celulas deficientes en ABCB1 apenas estaba presente el transporte de Ap (0,3 pg/min). Otros estudios de endotelios capilares y celulas del plexo coroideo dieron como resultado que el transportador ABCB1 se expresa mucho en endotelios capilares cerebrales, mientras que la expresion de ABCC1 endotelial es mas baja en capilares cerebrales.
Por medio de modelos de raton de Alzheimer deficientes en transportadores ABC generados de nuevo se sometio a estudio entonces la significancia relativa de miembros de la familia de transportadores ABC in vivo. Los ratones modificados mediante ingeniena genetica presentan en cada caso una deficiencia (knock out) de transportadores ABC espedficos ABCG2, ABCB1 o ABCC1.
La inmunohistoqmmica de Ap de cortes cerebrales mostro:
i) aumentos significativos en el numero cortical y el tamano de placas positivas para Ap en ratones deficientes en ABCC1 en comparacion con ratones control (vease la figura 1 y 2a-c).
ii) Los ratones deficientes en ABCB1 mostraron un aumento mas bajo del numero y tamano de placas de Ap que ratones deficientes en ABCC1.
iii) Entre los ratones control y los ratones deficientes en ABCG2 no pudo detectarse ninguna diferencia significativa (figura 2a-c).
Para la determinacion de la cantidad de Ap soluble en tampon (en su mayor parte monomeros y oligomeros mas pequenos) y de Ap soluble en guanidina (en su mayor parte material fibrilar o agregado) se usaron ensayos de inmunoadsorcion acoplado a enzimas (Enzyme-linkedimmunoabsorbentassays, ELISAs) para Ap.
De acuerdo con los resultados morfologicos de la inmunohistoqmmica mostraron los ratones deficientes en ABCC1 un aumento significativo en caso de Ap agregado en comparacion con los ratones control en todos los momentos de medicion. La carga cerebral con Ap era la mas intensa en una edad de 25 semanas. En este momento eran los valores de Ap (Ap42) 12 veces mas altos que en los ratones control. El Ap soluble en tampon aumento igualmente
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con la edad, sin embargo tras 25 semanas, en el momento de la carga de placas mas alta, disminuyeron mucho los valores del Ap soluble en el grupo deficiente en ABCC1.
Se realizaron otros estudios que proporcionaron otras pruebas de la relacion entre el transporte eventualmente deficiente por medio de ABCC1 y la agregacion de Ap.
Las cineticas de transporte de transportadores ABC dependen entre otras cosas de caracteristicas de protemas/peptidos espedficas, como la carga espedfica. La variante tipo holandesa de la protema precursora de amiloide (mutante holandes, APPdt), que introduce una carga negativa adicional cerca del sitio de corte de la a- secretasa de APP y conduce asi a una angiopatia amiloide cerebral grave (CAA), influye en la eliminacion de APdt a traves de la barrera hematoencefalica. Los analisis de inmunotransferencia tipo Western de capilares cerebrales y plexo coroideo (CP) de ratones control mostraron una expresion fuerte de ABCB1 en endotelios capilares cerebrales (BC) y de ABCCl en el CP (figura 3d). Dado que los transportadores ABC desempenan un importante papel en la eliminacion del Ap, se asumio que ratones deficientes en ABC, APPdt-transgenicos (en la barrera hematoencefalica y en la barrera hemato-plexo coroideo) presentan una acumulacion reforzada de APdt en vasos menmgeos. El grado de la CAA en los ratones APPdt deficientes en ABC se cuantifico en la edad de 24 meses. De acuerdo con la suposicion estaba muy alterado al menos el 51 % de los vasos (> 75 % de la pared vascular cargada con Ap) en los animales deficientes en ABCC1 en comparacion con el 23 % en los controles (figura 3c).
Basandose en estos resultados se sometio a estudio en que medida pudo reducirse/influirse el contenido de Ap soluble en el cerebro mediante activacion mediada por principios activos de transportadores ABC. Se trataron ratones con depositos de amiloide durante 30 dias con la tietilperazina anti-emetica (Torecan®, 2-(etiltio)-10-[3-(4- metilpiperazin-1-il)propil]-10H-fenotiazina). Dos veces al dia se administraron 3 mg/kg de peso corporal por via intramuscular. El tratamiento profilactico comenzo ya antes de que los ratones formaran placas seniles. Las mediciones ELISA de los animales tratados mostraron una reduccion de la cantidad de Ap de al menos el 31 % en los ratones tratados en comparacion con animales tratados con vehiculo (vedculo = agua) (figura 3e). Los resultados estan reproducidos graficamente en la figura 3.
La capacidad de eliminacion de Ap resulto un factor clave en la regulacion de la acumulacion intracerebral de Ap.
Como activador especialmente eficaz del transportador ABCC1 resulto tietilperazina (Torecan®). Otros derivados partiendo de la misma estructura base mostraron igualmente buenos resultados en la activacion del transportador ABCC1. Los correspondientes derivados estan representados en la formula general I
imagen2
en la que los restos
R1 y R2 son iguales o distintos y son en cada caso independientemente entre si grupos alquilo C1-C6, que presentan independientemente entre si eventualmente otro sustituyente seleccionado de grupo alquilo, arilo, acilo (preferentemente acetilo), amino, nitro, sulfonilo, hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, ariltio, alquiltio y atomo de halogeno, presentando los respectivos grupos alquilo eventualmente al menos otro atomo de halogeno y el resto R3 se encuentra en una de las posiciones 6-9 del sistema de anillo de fenotiazina, preferentemente en la posicion 6, 7 u 8, y un atomo de hidrogeno o es un grupo alquilo, arilo, acrilo (preferentemente acetilo), amino, nitro, sulfonilo, hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, ariltio o alquiltio o un atomo de halogeno, presentando los respectivos grupos alquilo eventualmente al menos otro atomo de halogeno, o es un grupo NR4R5 o OR6, siendo R4, R5 y R6 iguales o distintos y seleccionandose en cada caso independientemente entre si de hidrogeno y grupo alquilo C1- C3 y el resto
R7 se encuentra en una de las posiciones 1, 2 o 4 del sistema de anillo de fenotiazina, preferentemente en la posicion 2 o 4, y un atomo de hidrogeno o es un grupo alquilo, arilo, acrilo (preferentemente acetilo), amino, nitro, sulfonilo, hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, ariltio o alquiltio o un atomo de halogeno, presentando los respectivos grupos alquilo eventualmente al menos otro atomo de halogeno, o es un grupo NR8R9 o OR10, siendo R8, R9 y
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R10 iguales o distintos y seleccionandose en cada caso independientemente entre s^ de hidrogeno y grupo alquilo C1-C3.
Estos derivados son correspondientemente muy adecuados para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, en particular de p-amiloidopatfas o a-sinucleinopatfas, comprendiendo el tratamiento tal como se han mencionado anteriormente tanto la profilaxis como el tratamiento de enfermedades ya existentes. El atomo de halogeno/los atomos de halogeno se seleccionan preferentemente de fluor y cloro. Los grupos acilo (-(C=O)-R) de los restos R1, 2, 3 7 son preferentemente grupos acetilo (-C(=O)CH3). Preferentemente son los restos R1 y R2 iguales o distintos y en cada caso independientemente entre sf un grupo alquilo C1-C6 o un grupo alquilo C1-C6 (preferentemente alquilo C1) sustituido con un grupo acetilo, asf como los restos R3 y R7 son hidrogeno o un grupo acetilo. Preferentemente son los restos R1 y R2 iguales o distintos y en cada caso independientemente entre sf un grupo alquilo C1-C3. Ademas se prefiere que los restos R3 y R7 sean hidrogeno. Se prefiere especialmente cuando el resto R1 sea un grupo metilo, el resto R2 sea un grupo etilo y los restos R3 y R7 sean hidrogeno (tietilperazina, Torecan®). En el uso para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas ha resultado ventajoso anadir a la 2- (R2-tio)-10-[3-(4-R1-piperazin-1-il)propil]-10H-fenotiazina otros principios activos, preferentemente 1-
benzohidrilpiperazinas, lo mas preferentemente 1-benzohidril-4-cinamil-piperazina (cinarizina).
Distintas enfermedades neurodegenerativas pueden tratarse con el derivado de 2-(R2-tio)-10-[3-(4-R1-piperazin-1- il)propil]-10H-fenotiazina de acuerdo con la invencion o pueden diagnosticarse por medio de los analisis indirectos descritos anteriormente. En una forma de realizacion especialmente preferente es la enfermedad neurodegenerativa una p-amiloidopatia, en particular demencia de Alzheimer (AD). Otra forma de realizacion se refiere al caso de que la enfermedad neurodegenerativa es una a-sinucleinopatfa, en particular enfermedad de Parkinson (PD). Ambas enfermedades, es decir p-amiloidopatfa y a-sinucleinopatfas, se caracterizan por depositos de protemas cerebrales que pueden tratarse por medio de una activacion del transportador ABCC1 o pueden diagnosticarse por medio de su actividad.
Otras enfermedades que pueden tratarse igualmente a traves de la activacion del transportador ABCC1 o pueden diagnosticarse por medio de la actividad del transportador ABCC1, se mencionan a continuacion. Asf es otra enfermedad que puede tratarse la demencia por cuerpos de Lewy (LBD). Esta esta caracterizada igualmente por agregacion de protemas cerebral, es decir es una a-sinucleinopatfa como el Parkinson.
Otra forma de realizacion no de acuerdo con la invencion se refiere al caso de que la enfermedad neurodegenerativa sea la enfermedad de Huntington (HD). Otra forma de realizacion no de acuerdo con la invencion se refiere al caso de que la enfermedad neurodegenerativa sea una enfermedad causadas por priones, en particular la enfermedad de Creutzfeld-Jacob (CJD) o insomnio familiar fatal (FFI). Otra forma de realizacion no de acuerdo con la invencion se refiere al caso de que la enfermedad neurodegenerativa sea una tauopatfa, en particular degeneracion cortico-basal (CBD), smdrome de Steel-Richardson-Olszewski (PSP, progessivesupranuclearpalsy- paralisis supranuclear progresiva) o enfermedad de Pick (PiD). Otra forma de realizacion no de acuerdo con la invencion se refiere al caso de que la enfermedad neurodegenerativa sea una degeneracion frontotemporal (FTLD), en particular degeneracion positiva para ubiquitina, degeneracion positiva para TDP43 o degeneraciones negativas para ubiquitina y TDP43. Otra forma de realizacion no de acuerdo con la invencion se refiere al caso de que la enfermedad neurodegenerativa sea esclerosis lateral amiotrofica (ELA). Otra forma de realizacion no de acuerdo con la invencion se refiere al caso de que la enfermedad neurodegenerativa sea una ataxia espinocerebelar (SCA) o paraparesia espastica (SPG). Otra forma de realizacion no de acuerdo con la invencion se refiere al caso de que la enfermedad neurodegenerativa/neuroinmunologica sea esclerosis multiple (EM) o un smdrome relacionado con EM, en particular ADEM o smdrome de Devic.
Descripcion de las figuras Muestran
La figura 1a que la densidad cortical de palcas neunticas en ratones deficientes en ABCC1 (ABCC1ko) se ha elevado en ~75 %;
la figura 1b,c que el tamano de placa promedio se ha elevado (+34 %) debido al mayor numero de placas (+63 %) con un tamano de mas de 700 |im2 y una frecuencia mas baja de placas mas pequenas (-24 %). Barras de error, erro estandar (n>3);
la figura 1d que la coloracion IHC en ratones deficientes en ABCG2 (ABCG2ko), deficientes en ABCB1 (ABCB1ko), deficientes en ABCC1 (ABCC1ko) y en ratones control muestra una densidad superficial mas alta de Ap en animales deficientes en ABCC1. Las placas tfpicas del mismo tamano estan representadas en corte, las barras de escala representan 500 |im (vista superior) y 50 |im (corte) (*p<0,05);
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la figura 2a
la figura 2b la figura 2c
la figura 3 la figura 3a la figura 3b
la figura 3c
la figura 3d la figura 3e
Ejemplos
Animales
que la densidad de placas en el cortex (cubierta) y el tamano en ratones deficientes en transportadores ABC espedficos es elevada. En particular, los ratones deficientes en ABCC1 (ABCC1ko) muestran una carga elevada de amiloide Ap (barras gris claro, en cada caso a la derecha fuera en las agrupaciones individuales), w = semana en el eje de abscisas;
que el tamano de placa total en ratones deficientes en ABCC1 (ABCCIko) y deficientes en ABCB1 (ABCBIko) en la edad de 25 semanas es elevado, w = semana en el eje de abscisas;
que el aumento total en el tamano de placa esta asociado con la aparicion de menos placas pequenas y mas placas mas grandes (>700 |im2), mientras que el numero de placas de tamano medio sigue estando en el mismo valor, barras de error, error estandar (n>5), *p<0,05;
que la deficiencia de ABCC1 fomenta la acumulacion de Ap y APdt y que la activacion de ABCC1 (mediante administracion de Torecan) reduce los valores de Ap; en la que
muestra que en una edad de 25 semanas la deficiencia en ABCC1 conduce a un aumento marcado (~12 veces) en Ap insoluble; y
muestra que la cantidad de Ap42 soluble en tampon en una edad de 25 semanas se reduce notablemente en comparacion con 22 semanas (-56 %). Esto se basa probablemente en la deposicion en depositos insolubles. En la misma edad, la superficie ocupada por deposiciones de Ap, que se mide en la inmunohistoqmmica, se ha elevado en un 83 % (barras de error, error estandar n>5, p<0,05);
muestra que el 53 % de los vasos sangmneos se ven muy alterados por CAA (>75 % de las paredes vasculares presentan Ap). Esto se refiere a ratones deficientes en ABCC1 (ABCCIko) en comparacion con el 23 % en los controles (n=3);
muestra que la expresion de ABCC1 puede observarse predominantemente en el plexo coroideo (CP), mientras que ABCB1 se expresa principalmente en los capilares del cerebro (BP);
muestra que la activacion de ABCC1 mediante tietilperazina (Torecan) reduce los valores de Ap en ratones (-28 %), barras de error, error estandar (n=4, *p<0,05).
Se adquirieron ratones APP-transgenicos (APP, APPdt) de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, EE.UU.) y de la Universidad de Tubingen (Tubingen, Alemania). Los ratones deficientes en NEP se adquirieron de Riken Brain Research Institute (Saitama, Japon). Los ratones deficientes en ABCG2, ABCB1 y ABCC1 se adquirieron de Taconic-Farms (Dinamarca). Todas las lmeas de raton transgenicas y deficientes se cruzaron durante al menos 9 generaciones en el fondo genetico FVB. Los ratones se mantuvieron en ciclo de luz/oscuridad de 12h/12h a 23 °C con libre acceso a alimentos y agua.
Procedimientos
Preparacion de tejidos
Para la preparacion de tejidos se sacrificaron los ratones mediante dislocacion cervical y se perfusionaron por via transcardfaca con PBS (solucion fisiologica de cloruro de sodio, tamponada con fosfato). El cerebro se separo y se coloco un hemisferio en paraformaldetudo al 4 % tamponado para incrustacion en parafina e inmunohistoqmmica. El otro hemisferio se congelo rapidamente en nitrogeno lfquido y se almaceno a -80 °C para analisis bioqmmicos.
ELISA
Se usaron kits ELISA (TH40HS, TK42HS) de The Genetics Company (TGC, Schlieren, Suiza) para la cuantificacion de Ap. Se homogeneizaron los hemisferios cerebrales usando PreCellys24 (12 s, 6.500 rpm). Tras adicion de tampon carbonato (pH 8,0) se mezclaron los homogeneizados usando PreCellys (5 s, 5.000 rpm) y se centrifugaron durante 90 min a 4 °C y 24.000 g, para separar especies de Ap insolubles y solubles. El sobrenadante que queda (fraccion soluble en tampon) se mezclo con clorhidrato de guanidina 8 M en una proporcion de 1:1,6. Para la extraccion de las especies de Ap agregadas se disolvio el sedimento en 8 volumenes de clorhidrato de guanidina 5 M, se agito a temperatura ambiente durante 3 h y se centrifugo a 24.000 g durante 20 min a 4 °C. El sobrenadante que queda representaba la fraccion soluble en guanidina (GuaHCl). Se midieron tres veces contenidos en protemas
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de todas las muestras, usandose un espectrofotometro Nanodrop1000 (ThermoFisher Scientific, Wilmington, EE.UU.). Los ELISA se realizaron de acuerdo con las indicaciones del fabricante usando diluciones apropiadas.
Inmunotransferencias tipo Western
Para las inmunotransferencias tipo Western se prepararon homogeneizados tisulares. Las concentraciones de protema total de los extractos se determinaron usando un ensayo BCA (Pierce, Teil von Thermo Fisher Scientific, Rockford, EE.UU.). Tras la electroforesis de 10 |ig de protema total por pista se sometieron a inmunotransferencia las protemas en membranas de PVDF. Tras el bloqueo en el 5 % de leche en polvo en tampon TBST (Tris 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, Tween20 al 0,1 %) durante 1 h a temperatura ambiente, se sometieron a estudio las inmunotransferencias o bien para determinar ABCB1 (1:500, D-11, Santa Cruz), ABCC1 (1:200, Alexis Bio) o p- actina (1:20.000, Sigma) durante la noche a 4 °C. Como anticuerpos de deteccion se usaron HRP anti-raton, HRP anti-rata o HRP anti-liebre. Para la visualizacion se usaron un kit de deteccion Amersham ECL Plus y una camara Roper-CoolSnap HQ2.
Inmunohistoquimica (IHC)
Los cerebros fijados en formalina se incrustaron en parafina y se cortaron secciones de 4 |im de espesor. Tras la separacion de la parafina se trataron posteriormente las secciones con un autotenidor BondMax™ (Menarini/Leica, Alemania). La inmunotincion se inicio tras el bloqueo de peroxidasa endogena (5 min) y reencuentro de epftopos (epitoperetrieval) durante 5 min con acido formico al 95 % (para anticuerpos 6F3D, Dako, Alemania) y acido formico al 70 % (para anticuerpos 4G8, Millipore, Alemania). Los anticuerpos primarios se incubaron de manera rutinaria a temperatura ambiente durante 30 min con las siguientes diluciones: 6F3D (1:100), 4G8 (1:500). Los anticuerpos primarios se detectaron con el kit de deteccion BondMax™ Bond Polymer Refine y segun el protocolo estandar DAB R30. Los cortes se digitalizaron completamente con una resolucion de 230 nm usando un escaner MiraxDesk/MiraxMidi y a continuacion se analizaron automaticamente usando el paquete de software AxioVision (Zeiss, Alemania).
Evaluacion de la gravedad de la CAA
Los cortes cerebrales de ratones APPdt se tineron con anticuerpos 4G8. Al menos dos secciones no consecutivas se sometieron a estudio para determinar CAA de los vasos menmgeos de manera ciega. Todos los vasos menmgeos se contaron manualmente y se clasifico la gravedad de la CAA tal como sigue:
Categona I: no alterado
Categona II: <25 % de la periferia tenida de manera positiva Categona III: <50 % de la periferia tenida de manera positiva Categona IV: <75 % de la periferia tenida de manera positiva Categona V: <100 % de la periferia tenida de manera positiva
El numero promedio de vasos para cualquier categona se calculo con respecto al numero total de vasos detectados.
Ensayo Transwell de celulas endoteliales (ECTA)
Se prepararon celulas endoteliales de capilares de cerebro de raton tal como se ha descrito en Coisne et al. (Coisne, C. et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in zerebral endothelium. Laboratory Investigation; 85, 734-746 (2005)). Al menos diez ratones de 3-4 semanas de edad se decapitaron y se separaron los cerebros. Tras disecar el tronco cerebral, la sustancia blanca y la meninge se homogeneizo el tejido en dos volumenes de tampon de lavado B (WBB) (Hanks bufferedsaltsolution (HBBS), HEPES 10 mM, BSA al 0,1 %) usando un homogeneizador Dounce de vidrio de 15 ml (Wheaton Industries, Millville, NJ; EE.UU). Un volumen de solucion de dextrano al 30 % se anadio al homogeneizado. Se centrifugo dos veces a 3.000 g y 4 °C. El sedimento que contema los vasos se resuspendio en WBB y se partieron los vasos grandes manualmente mediante pipeteado fuerte de la solucion. Se uso filtracion a vacm por membranas de 60 |im (SEFAR, Suiza) para separar vasos grandes de los capilares. Tras tratamiento combinado con colagenasa/dispasa (HBSS, HEPES 10 mM, TCLK 0,15 |ig/ml, DNAsa-I 10 |ig/ml, colagenasa/dispasa 1 mg/ml (Roche)) se consiguio una suspension de celulas individuales mediante pipeteado fuerte adicional de la solucion. Las celulas endoteliales se introdujeron en insertos Transwell revestidos con Matrigel (poros de 0,4 |im, Greiner Bio-One, Alemania) con una densidad de 120.000 celulas por inserto y se dejaron crecer en un cultivo glial de soporte.
Se uso amarillo azufre para la determinacion del flujo paracelular durante el ensayo. El medio de cultivo del compartimento abluminal se sustituyo con una solucion que contema 10 ng de Ap42 (concentracion final 1,6 nM). A continuacion se extrajeron muestras del compartimento luminal tras 2 h, 6 h o 24 h y se determino el contenido en Ap con ELISA (TK42-highsense, TGC, Suiza). La velocidad de transporte se determino tal como se ha descrito en Coisne et al. (Coisne, C. et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium. Laboratory Investigation; 85, 734-746 (2005)).
Estadisticas de ELISA
La prueba de bondad de ajuste de Lilliefors (alfa= 0,05) se aplico a los datos de ELISA y a los datos de ELISA transformados en log, para diferenciar entre la suposicion de datos de muestras distribuidos de manera normal y la 5 suposicion de datos de muestras distribuidos de manera normal en log. A pesar del pequeno tamano de muestras se rechazo para los dos conjuntos de datos la hipotesis cero (Ho) para 5 de 44 muestras. De acuerdo con la observacion de que predomina sesgos positivos (skew) y datos de muestras estrictamente positivos se descarto la suposicion de datos distribuidos de manera normal. Los valores medios y los intervalos de confianza se calcularon suponiendo una distribucion normal en log subyacente. La prueba de suma de rangos de Wilcoxon se aplico para 10 comparar los datos de ELISA de las distintas cepas de raton para cada momento.

Claims (6)

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    REIVINDICACIONES
    1.2-(R2-tio)-10-[3-(4-R1-piperazin-1-il)propil]-10H-fenotiazina de acuerdo con la formula general I
    imagen1
    en la que
    el resto R1 es un grupo metilo, el resto R2 es un grupo etilo y los restos R3y R6 7 son hidrogeno,
    para el tratamiento de una p-amiloidopatia o una a-sinucleinopatia, que van acompanadas de un deposito de
    protemas cerebral y una actividad reducida del transportador ABCC1 cerebral.
  2. 2. 2-(etil-tio)-10-[3-(4-metil-piperazin-1-il)propil]-10H-fenotiazina para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizada por que se anaden otros principios activos.
  3. 3. 2-(etil-tio)-10-[3-(4-metil-piperazin-1-il)propil]-10H-fenotiazina para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, caracterizada por que como otros principios activos se anaden 1-benzohidrilpiperazinas.
  4. 4. 2-(etil-tio)-10-[3-(4-metil-piperazin-1-il)propil]-10H-fenotiazina para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2 o 3, caracterizada por que como 1-benzohidrilpiperazina se anade 1-benzohidril-4-cinamil-piperazina.
  5. 5. 2-(etil-tio)-10-[3-(4-metil-piperazin-1-il)propil]-10H-fenotiazina para su uso de acuerdo con una de las
    reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que la p-amiloidopatia es la demencia de Alzheimer.
  6. 6. 2-(etil-tio)-10-[3-(4-metil-piperazin-1-il)propil]-10H-fenotiazina para su uso de acuerdo con una de las
    reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que la a-sinucleinopatia es la enfermedad de Parkinson o demencia por cuerpos de Lewy.
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