JP6084924B2

JP6084924B2 - β−アミロイドパシーまたはα−シヌクレオパシーを治療するための２−（Ｒ２−チオ）−１０−［３−（４−Ｒ１−ピペラジン−１−イル）プロピル］−１０Ｈ−フェノチアジン、およびβ−アミロイドパシーまたはα−シヌクレオパシーの診断または事前診断のための方法

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Description

脳内への蛋白質または蛋白質断片（ペプチド）の蓄積は、年齢依存性神経変性疾患の重要な特徴である。アルツハイマー認知症（アルツハイマー病、ＡＤ）および脳β−アミロイドパシー（ＣＡＡ）においては、β−アミロイドペプチド（Ａβ）の凝集はトリガー因子であるが、基本的なメカニズムは知られていない。Ａβ蛋白質恒常性、即ち、受容体またはプロテアーゼによる生産および分解／除去の平衡はＡＤおよびＣＡＡにおいて乱されている。しかしながら、これまで、細胞トランスポーター（ＡＢＣトランスポーター）によるＡβペプチドの除去に対してほとんど注意が払われてこなかった。パーキンソン病においては、蛋白質α−シヌクレインが蓄積し、これは、とりわけ、黒質におけるドーパミン放出を調節する。パーキンソン病のα−シヌクレイノパシーにおいては、ＡＢＣトランスポーターが輸送について非常に重要な役割を演じることが知られている（Ｋｏｒｔｅｋａａｓｅｔａｌ．，ＡｎｎＮｅｕｒａｌ２００５，５７，１７６−１７９）。ここで、交互に種々の基質（代謝産物、医薬、ペプチド、蛋白質、イオン）を輸送することができ、また輸送機能において相互を置き換えることさえできる数個のサブファミリーＡからＧがある（例えば、ＡＢＣＢ１およびＡＢＣＣ１、Ｔａｏｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙａｎｄＰｈｒｍａｃｏｌｏｇｙ，６４，５，９６１−９６９）。

種々の遺伝子組換えマウスモデルによって、ＡＢＣトランスポーター（ＡＢＣトランスポーターの共通の構造的エレメントはＡＴＰ結合カセットおよび輸送体ポアである。）ＡＢＣＣ１は重要な蛋白質／ペプチドトランスポーター、特に、Ａβトランスポーターであり、これは、脳蛋白質の蓄積に対して非常に大きな機能的効果を有することが示されている。ＡＢＣＣ１は重要なα−シヌクレイントランスポーターでもある。

トランスポーター活性の調査は、本明細書中、以下で、Ａβ輸送に関する例として示される。

ＡＰＰを発現するトランスジェニックマウスにおけるインビボでのＡＢＣＣ１活性を決定するために、各場合において、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＧ２またはＡＢＣＣ１トランスポーターを遺伝子的に除去した（ノックアウトマウス）。

ここで、以下のことが見出された：
ｉ）ＡＢＣＣ１トランスポーターを欠如するマウスにおけるＡβの量は１２倍増大し、
ｉｉ）ＡＢＣＢ１トランスポーターの欠失は３倍の増加をもたらしたに過ぎず、および
ｉｉｉ）ＡＢＣＧ２の欠失はＡβ蓄積効果を有しない。

Ｋｏｒｔｅｋａａｓｅｔａｌ．，ＡｎｎＮｅｕｒａｌ２００５，５７，１７６−１７９Ｔａｏｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙａｎｄＰｈｒｍａｃｏｌｏｇｙ，６４，５，９６１−９６９

従って、本発明の目的は、ＡＢＣＣ１トランスポーターに適切に影響して、これにより、神経変性疾患、特にβ−アミロイドパシーまたはα−シヌクレオパシーを治療することができる物質を提供することであった。この目的は、請求項１に記載の２−（Ｒ^２−チオ）−１０−［３−（４−Ｒ^１−ピペラジン−１−イル）プロピル］−１０Ｈ−フェノチアジンによって解決された。さらに好ましい実施形態が従属請求項から得られる。

換言すれば、該目的は、脳蛋白質沈着物を伴うβ−アミロイドパシーまたはα−シヌクレイノパシーを治療するための、一般式Ｉ：

［式中、基：
Ｒ^１およびＲ^２は同一または異なり、各々、相互に独立して、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル基であり、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル基は、相互に独立して、場合により、アルキル、アリール、アシル（好ましくは、アセチル）、アミノ、ニトロ、スルホニル、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アリールチオ、アルキルチオ基およびハロゲン原子から選択されるもう１つの置換基を含んでもよく、ここで、該各アルキル基は、場合により、少なくとも１つのさらなるハロゲン原子を含んでもよく、
Ｒ^３はフェノチアジン環系の６から９位のうちの１つに位置し、および水素原子またはアルキル、アリール、アシル（好ましくは、アセチル）、アミノ、ニトロ、スルホニル、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アリールチオ、アルキルチオ基もしくはハロゲン原子であり、ここで、該各アルキル基は、場合により、少なくとも１つのさらなるハロゲン原子またはＮＲ^４Ｒ^５もしくはＯＲ^６基を含んでもよく、ここで、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は同一または異なり、各々、相互に独立して、水素およびＣ_１−Ｃ_３アルキル基から選択され、
Ｒ^７はフェノチアジン環系の１、２または４位のうちのいずれか１つに位置し、および水素原子またはアルキル、アリール、アシル（好ましくは、アセチル）、アミノ、ニトロ、スルホニル、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アリールチオもしくはアルキルチオ基またはハロゲン原子であり、ここで、該各アルキル基は、場合により、少なくとも１つのさらなるハロゲン原子またはＮＲ^８Ｒ^９もしくはＯＲ^１０基を含んでもよく、ここで、Ｒ^８、Ｒ^９およびＲ^１０は同一または異なり、各々、相互から独立して、水素およびＣ_１−Ｃ_３アルキル基から選択される。］
に従う２−（Ｒ^２−チオ）−１０−［３−（４−Ｒ^１−ピペラジン−１−イル）プロピル］−１０Ｈ−フェノチアジンによって解決された。

さらに、α−シヌクレインパシーおよびβ−アミロイドパシーの双方の場合において、これらの病気を同定し、または診断しまたは事前診断する必要がある。

また、本発明の目的は、α−シヌクレイノパシーおよびβ−アミロイドパシーを診断または事前診断することができる方法を提供することであった。この目的は請求項１１に記載の方法によって解決される。好ましい実施形態は従属請求項から得られる。換言すれば、当該目的は、β−アミロイドパシーまたはα−シヌクレオパシーの診断または事前診断のための、またはこのような病気を発症する発端者のリスクを決定するための方法によって解決され、ここで、該発端者は、脳ＡＢＣＣ１トランスポーターによって輸送された物質を既に取り込んでおり、該方法は、以下のステップ：
ａ）特定の時点において該発端者の体液試料中の摂取された物質の量を決定するステップ；
ｂ）少なくとも１回のさらにより遅い時点においてステップａ）の該決定を反復するステップ；
ｃ）ステップａ）およびｂ）で決定された量を、サンプリングの時点において、β−アミロイドパシーまたはα−シヌクレオパシーの臨床的兆候を示さなかった発端者についての同一の時系列における特徴として規定された量と比較するステップ
からなる。

該発端者が脳ＡＢＣＣ１トランスポーターを介して輸送される少なくとも１つの物質を既に取り込んでいるという事実は、この物質が投与される必要はないことを意味する。逆に言えば、該物質は、例えば、もう１つの病気の薬物治療の結果として発端者の身体に既に存在する。調べられた発端者の体液の試料は、好ましくは、血漿、血清および／または脳脊髄液からサンプリングされる。

該β−アミロイドパシーは好ましくはアルツハイマー型認知症であり、該α−シヌクレイノパシーは好ましくはパーキンソン病である。場合により、該α−シヌクレイノパシーはレビー小体（ＤＬＢ）を伴う認知症であってもよい。脳ＡＢＣＣ１トランスポーターを介して輸送される物質は、好ましくは、抗生物質（例えば、ジフロキサチン、グレパフロキサチン）、ビロスタット（ｖｉｒｏｓｔａｔ）／抗ウイルス医薬（例えば、サキナビール、リトナビール）、抗アレルギー剤／抗ヒスタミン剤（例えば、シメチジン）、心血管医薬（例えば、ベラパミル）、抗鬱剤（例えば、シタロプラム）、尿酸低下薬（例えば、プロベニシド）、細胞増殖抑制剤（例えば、メトトレキセート、エトポシト（ｅｔｏｐｏｓｉｔ）、エダトレキセート、ＺＤ１６９４）、ビタミン／ビタミンアナログ（例えば、メトトレキセート、葉酸、Ｌ−ロイコボリン）、消炎剤（例えば、ヨードメタシン）、抗癲癇剤（例えば、バルプロ酸）、ホルモン／ホルモン誘導体（例えば、１７β−エストラジオール）、ロイコトリエン（例えば、ＬＴＣ４）、蛍光試料（例えば、カルセイン、Ｆｌｕｏ−３、ＢＣＥＣＦ、ＳＮＡＲＦ）、（内因的に生産された）天然物質のＧＳＨ、スルフェートもしくはグルクロニド結合代謝産物、毒素、または医薬（例えば、２，４−ジニトロフェニル−ＳＧ、ビマン−ＳＧ、Ｎ−エチルマレイミド−ＳＧ、ドキソルビシン−ＳＧ、チオテパ−ＳＧ、シクロホスファミド−ＳＧ、メルファラン−ＳＧ、クロラムブシル−ＳＧ、エタクリン酸−ＳＧ、メタラクロール−ＳＧ、アトラジン−ＳＧ、スルホラファン−ＳＧ、アフラトキシンＢ１−エポキシド−ＳＧ、４−ニトロキノリン１−オキサイド−ＳＧ、Ａｓ（ＳＧ）３、エトポシド−ｇｌｕｃ、４−（メチルニトロサミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノール（ＮＮＡＬ）−３β−Ｏ−ｇｌｕｃ、ＳＮ−３８−ｇｌｕｃ、４−メチルウンベリフェリル−β−ｄ−ｇｌｕｃ、６−ヒドロキシ−５，７−ジメチル−２−メチルアミノ−４−（３−ピリジルメチル）−ベンゾチアゾールスルフェート（Ｅ３０４ＯＳ）−ｇｌｕｃ、ロイコトリエンＣ４、プロスタグランジンＡ２−ＳＧ、１５−デオキシ−Δ１２，１４プロスタグランジンＪ２−ＳＧ、ヒドロキシノネナール−ＳＧ、１７β−エストラジオール−１７−β−ｄ−ｇｌｕｃ、グルクロノシルビリルビン、ビス−ルクロノシルビリルビン、ヒオデオキシコレート−６−α−ｇｌｕｃ、エストロン−３−スルフェート、デヒドロエピアンドロステロンスルフェート、スルファトリトコレート）（また、ＤｅｅｌｅｙＲＧｅｔａｌ．：Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｐｏｒｔｂｙｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ１（ＡＢＣＣ１），ＦＥＢＳｌｅｔｔｅｒｓ２００６，５８０（４），ｐｐ．１１０３−１１１１参照）から選択される。

ＡＢＣＣ１トランスポーターの輸送活性のこの間接的な分析は、対応する病気の診断／事前診断のために用いることができる。他の経路によってＡＢＣＣ１輸送可能物質を既に取り込んだ発端者においては、体液、好ましくは血漿、血清および／または脳脊髄液中での活性物質の濃度のプロフィールを調べることができる。健康な発端者と比較してＡＢＣＣ１輸送活性が低下した発端者についての時間依存性測定は、遅延したかまたはシフトした物質の濃度曲線（時間ｔに対してプロットされた濃度ｃ）を示し、即ち、該曲線の最大値が経時的に変化する。

健康な事例と比較してシフトした曲線が得られる場合、これは、ＡＢＣＣ１輸送活性が変化したことの指標である。このことは、Ａβまたはα−シヌクレインのような物質があまり有効に輸送されず、従って、対応する病気の指標であることを意味する。

マウスモデルおよびＡＢＣＣ１の薬理学的影響の双方は、これがＡβ蛋白質についての重要な細胞膜貫通トランスポーターであることを示し、および血液脳関門および脈絡叢が、脳からのＡβ放出についての鍵となる位置を占有することを示唆する。ＡＢＣＣ１トランスポーターの選択的薬理学的活性化は、Ａβによる脳負荷を有意に低下させ、かくして、乱された脳蛋白質恒常性を伴う病気の治療のために治療的に用いることができるのを示すことができよう。さらに、前記したＡＢＣＣ１トランスポーターのトランスポーター活性の分析は、対応する病気の間接的または直接的診断／事前診断のために用いることができる。間接的分析は、ＡＢＣＣ１トランスポーターを介して輸送される物質の投与、およびこの決定を介して可能であろう。間接的な分析は、既に、前記にて詳しく記載されている。

ＡＢＣトランスポーターに関連する排出メカニズムの変化は、Ａβおよび他の脳蛋白質の一時的な凝集プロフィールに実質的に影響し得る。この結果、ＡＢＣＣ１トランスポーターの機能の影響は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を発症するリスクに対して大きな効果を有する。ここで、「神経変性疾患の治療」は、予防および既に存在する病気の治療も含む。

Ａβ放出におけるＡＢＣトランスポーターの役割は、最初に、ＡＢＣＣ１がＡβを輸送することができることを実証する形で調査された。この目的では、マウス脳からの初代培養毛細血管内皮細胞の内皮細胞でのインビトロ・トランスウェル・アッセイ（内皮細胞トランスウェルアッセイ、ＥＣＴＡ）（細胞培養アプローチ）を用いた。

ＡＢＣＢ１欠損、ＡＢＣＣ１欠損（ノックアウト）マウスおよび対照マウス（Ｃ５７ＢＩ／６、ＦＶＢ／Ｎ）の脳毛細血管からの内皮細胞の初代培養物を用いて、Ａβ特異的輸送活性を調べた。反管腔側（脳）から管腔側（血液）へのＡβの輸送は、ＡＢＣＢ１欠損およびＡＢＣＣ１欠損内皮細胞においては損なわれている。Ａβペプチド（Ａβ４２）の投与から最初の６時間後の間での平均Ａβ輸送速度は対照細胞では２．２ｐｇ／分であった。これとは対照的に、ＡＢＣＣ１欠損細胞は輸送能力（１．０ｐｇ／分）の半分に到達したに過ぎなかった。ＡＢＣＢ１欠損細胞においては、Ａβ輸送はほとんど存在しなかった（０．３ｐｇ／分）。毛細血管内皮細胞および脈絡叢からの細胞のさらなる調査は、ＡＢＣＢ１トランスポーターが脳毛細血管内皮細胞において強く発現されるが、脳毛細血管における内皮細胞ＡＢＣＣ１発現はより低いことを明らかにした。

次いで、新しく作製されたＡＢＣトランスポーター欠損アルツハイマー病マウスモデルを用い、ＡＢＣトランスポーターファミリーのメンバーの相対的な有意性をインビボで調べた。遺伝子組換えマウスは、各々、特異的ＡＢＣトランスポーターＡＢＣＧ２、ＡＢＣＢ１またはＡＢＣＣ１において欠損（ノックアウト）を呈する。

脳切片のＡβ免疫組織化学は以下を示した：
ｉ）対照マウスと比較したＡＢＣＣ１欠損マウスにおけるＡβ陽性プラークの皮質の数およびサイズの有意な増加（図１および２ａからｃ参照）。

ｉｉ）ＡＢＣＢ１欠損マウスは、ＡＢＣＣ１欠損マウスよりもＡβプラークの数およびサイズの増加が少なかった。

ｉｉｉ）対照マウスおよびＡＢＣＧ２欠損マウスの間で有意な差は決定できなかった（図２ａからｃ）。

緩衝液可溶性Ａβ（ほとんどのモノマーおよびより小さなオリゴマー）およびグアニジン可溶性Ａβ（ほとんどの線繊状のまたは凝集した材料）の量を決定するために、Ａβについて酵素結合免疫吸着テスト（酵素結合免疫吸着アッセイ、ＥＬＩＳＡ）を用いた。

免疫組織化学からの形態学的結果と合致して、ＡＢＣＣ１欠損マウスは、全ての測定時点において、対照マウスと比較して凝集したＡβの、有意な増加を示した。Ａβでの脳の負荷は２５週齢において最大であった。この時点において、Ａβ値（Ａβ４２）は対照マウスにおけるよりも１２倍高かった。緩衝液可溶性Ａβもまた２５週後を除いて齢と共に増加し、最高のプラーク負荷の時点において、ＡＢＣＣ１欠損群における可溶性Ａβの値は実質的に減少した。

さらなる調査を行い、これにより、ＡＢＣＣ１による除去の欠如の可能性およびＡβの凝集の間の関係についてのさらなる証拠が提供された。

ＡＢＣトランスポーターの輸送速度論は、とりわけ、特異的電荷のような特異的蛋白質／ペプチドの特徴に依存する。さらなる負の電荷をＡＰＰのα−セクレターゼの界面近くに導入し、従って重症の脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）をもたらすアミロイド前駆体蛋白質のＤｕｔｃｈ型変種（Ｄｕｔｃｈ突然変異体、ＡＰＰ_ｄｔ）は、血液脳関門を介するＡβ_ｄｔの排除に影響する。対照マウスからの脳毛細血管および脈絡叢（ＣＰ）のウェスタンブロット分析は、脳毛細血管内皮細胞（ＢＣ）におけるＡＢＣＢ１およびＣＰにおけるＡＢＣＣ１の強い発現を示した（図３ｄ）。ＡＢＣトランスポーターはＡβの排除において重要な役割を演じるので、（血液脳関門における、および血液脈絡叢バリヤーにおける）ＡＢＣトランスポーター欠損ＡＰＰ_ｄｔトランスジェニックマウスは、髄膜血管におけるＡβ_ｄｔの増大した蓄積を呈すると推定された。ＡＢＣ欠損ＡＰＰ_ｄｔマウスにおけるＣＡＡの程度を２４月齢において定量した。推定と合致して、血管の少なくとも５１％は、対照における２３％と比較して、ＡＢＣＣ１欠損マウスにおいてはひどく損なわれていた（Ａβを負荷した血管壁の＞７５％）（図３ｃ）。

これらの結果に基づき、脳内の可溶性Ａβの含有量が、ＡＢＣトランスポーターの活性物質に媒介される活性化によってどれくらい低下され／影響され得るかを調べた。アミロイド沈着物を持つマウスを、鎮吐薬チエチルペラジン（トレカン（ｔｒｅｃａｎ）（登録商標）、２−（エチルチオ）−１０−［３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロピル］−１０Ｈ−フェノチアジン）で３０日間処理した。３ｍｇ／ｋｇ体重を毎日２回筋肉内投与した。予防的処置は、マウスが老人性プラークを呈する前に開始した。処理された動物のＥＬＩＳＡ測定は、ビヒクル処理動物（ビヒクル＝水）と比較して、処理したマウスにおいて少なくとも３１％のＡβの量の低下を示した（図３ｅ）。結果を図３においてグラフで再現する。

Ａβを除去する能力は、Ａβの脳内蓄積の調節において鍵となる因子であることが判明した。

チエチルピペラジン（Ｔｏｒｅｃａｎ（登録商標））は、ＡＢＣＣ１トランスポーターの特に有効なアクチベーターであることが判明した。同一のスカフォールドから出発する他の誘導体もＡＢＣＣ１トランスポーターの活性において良好な結果を示した。対応する誘導体は一般式Ｉ：

［式中、基
Ｒ^１およびＲ^２は同一または異なり、各々、相互に独立して、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル基であり、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル基は、相互に独立して、場合により、アルキル、アリール、アシル（好ましくは、アセチル）、アミノ、ニトロ、スルホニル、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アリールチオ、アルキルチオ基およびハロゲン原子から選択されるもう１つの置換基を含んでもよく、ここで、該各アルキル基は、場合により、少なくとも１つのさらなるハロゲン原子を含んでもよく、
Ｒ^３はフェノチアジン環系の６から９位のうちの１つに位置し、および水素原子またはアルキル、アリール、アシル（好ましくは、アセチル）、アミノ、ニトロ、スルホニル、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アリールチオもしくはアルキルチオ基もしくはハロゲン原子であり、ここで、該各アルキル基は、場合により、少なくとも１つのさらなるハロゲン原子またはＮＲ^４Ｒ^５もしくはＯＲ^６基を含んでもよく、ここで、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は同一または異なり、各々、相互に独立して、水素およびＣ_１−Ｃ_３アルキル基から選択され、
Ｒ^７はフェノチアジン環系の１、２または４位のうちのいずれか１つに位置し、および水素原子またはアルキル、アリール、アシル（好ましくは、アセチル）、アミノ、ニトロ、スルホニル、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アリールチオもしくはアルキルチオ基またはハロゲン原子であり、ここで、該各アルキル基は、場合により、少なくとも１つのさらなるハロゲン原子またはＮＲ^８Ｒ^９もしくはＯＲ^１０基を含んでもよく、ここで、Ｒ^８、Ｒ^９およびＲ^１０は同一または異なり、各々、相互から独立して、水素およびＣ_１−Ｃ_３アルキル基から選択される。］
で表される。

これらの誘導体は、従って、神経変性疾患、特に、β−アミロイドパシーまたはα−シヌクレイノパシーの処置によく適しており、ここで、該処置は、既に言及したように、予め存在する病気の予防および治療の双方を含む。ハロゲン原子／複数ハロゲン原子は、好ましくは、フッ素および塩素から選択される。基Ｒ^{１、２、３、７}のアシル基（−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ）は、好ましくは、アセチル基（−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ_３）であり、好ましくは、基Ｒ^１およびＲ^２は同一または異なり、各々、相互に独立して、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル基、またはアセチル基で置換されたＣ_１−Ｃ_６アルキル基（好ましくは、Ｃ_１アルキル）であって、基Ｒ^３およびＲ^７は水素またはアセチル基である。好ましい実施形態において、基Ｒ^１およびＲ^２は同一または異なり、各々、相互に独立して、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基である。基Ｒ^３およびＲ^７が水素であるのがさらに好ましい。基Ｒ^１がメチル基であり、基Ｒ^２がエチル基であって、基Ｒ^３およびＲ^７が水素であるのが特に好ましい（チエチルペラジン、Ｔｏｒｅｃａｎ（登録商標））。神経変性疾患の処置で用いる場合、活性物質、好ましくは１−ベンゾヒドリルピペラジン、最も好ましくは１−ベンゾヒドリル−４−シンナミルピペラジン（シンナリジン）をさらに加えるのが有利であることが判明した。

種々の神経変性疾患を本発明による２−（Ｒ^２−チオ）−１０−［３−（４−Ｒ^１−ピペラジン−１−イル）プロピル］−１０Ｈ−フェノチアジン誘導体で治療することができるか、または前記した間接的分析によって診断することができる。特に好ましい実施形態において、神経変性疾患はβ−アミロイドパシー、特にアルツハイマー型認知症（ＡＤ）である。もう１つの実施形態は、神経変性疾患がα−シヌクレイノパシー、特にパーキンソン病（ＰＤ）である場合に関する。双方の病気、即ち、β−アミロイドパシーおよびα−シンクレイノパシーは、脳蛋白質沈着物によって特徴付けられ、該病気は、ＡＢＣＣ１トランスポーターの活性化によって治療することができるか、またはその活性によって診断することができる。

ＡＢＣＣ１トランスポーターの活性化によってやはり治療することができ、またはＡＢＣＣ１トランスポーター活性によって診断することができる他の疾患を以下に述べる。もう１つの治療可能な疾患は、かくして、レビー小体認知症（ＬＶＤ）である。これは、脳蛋白質の凝集によっても特徴付けられ、即ち、パーキンソン病のようなα−シヌクレイノパシーである。

もう１つの実施形態は、神経変性疾患がハンチントン病（ＨＤ）である場合に関する。もう１つの実施形態は、神経変性疾患がプリオン病、特に、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）または致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）である場合に関する。もう１つの実施形態は、神経変性疾患がタウオパシー、特に、皮質基底核変性（ＣＢＤ）、スティール・リチャードソン・オルスゼウスキー症候群（ＰＳＰ、進行性核上性麻痺）またはピック病（ＰＩＤ）である場合に関する。もう１つの実施形態は、神経変性疾患が前頭側頭変性（ＦＴＬＤ）、特にユビキチン陽性変性、ＴＤＰ４３陽性変性またはフォルビキチンおよびＴＤＰ４３陰性変性である場合に関する。もう１つの実施形態は、神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である場合に関する。もう１つの実施形態は、神経変性疾患が脊髄小脳失調（ＳＣＡ）または痙性対麻痺（ＳＰＧ）である場合に関する。もう１つの実施形態は、神経変性／神経免疫疾患が多発性硬化症（ＭＳ）またはＭＳ関連症候群、特にＡＤＥＭまたはドゥヴィック症候群である場合に関する。

図１ａは、ＡＢＣＣ１欠損マウス（ＡＢＣＣＩｋｏ）における神経突起プラーク（老人斑）の皮質密度がほぼ７５％増加することを示す。図１ｂは、７００μｍ^２よりも大きなサイズおよびより小さなプラークのより低い頻度（−２４％）を有する多数のプラーク（＋６３％）の結果として、平均プラークサイズが増加する（＋３４％）ことを示す。誤差バー、標準誤差（ｎ≧３）。図１ｃは、７００μｍ^２よりも大きなサイズおよびより小さなプラークのより低い頻度（−２４％）を有する多数のプラーク（＋６３％）の結果として、平均プラークサイズが増加する（＋３４％）ことを示す。誤差バー、標準誤差（ｎ≧３）。図１ｄは、ＡＢＣＧ２欠損（ＡＢＣＧ２ｋｏ）、ＡＢＣＢ１欠損（ＡＢＣＢＩｋｏ）、ＡＢＣＣ１欠損（ＡＢＣＣＩｋｏ）マウスにおける、および対照マウスにおけるＩＨＣ染色がＡＢＣＣ１欠損動物におけるＡβのより高い表面密度を示すことを示す。同一サイズの典型的なプラークが断面に示され、縮尺バーは５００μｍ（全体図）および５０μｍ（切片）を表す（＊ｐ＜０．０５）。図２ａは、特異的ＡＢＣトランスポーター・ノックアウトマウスでの皮質（被覆）におけるプラーク密度が増加することを示す。特に、ＡＢＣＣ１欠損（ＡＢＣＣＩｋｏ）マウスは増大したＡβアミロイド負荷を示す（個々のグループ分けにおける外側右側で、各場合において、明るい灰色バー）。横軸においてｗ＝週。図２ｂは、２５週齢のＡＢＣＣ１欠損（ＡＢＣＣＩｋｏ）およびＡＢＣＢ１欠損（ＡＢＣＢＩｋｏ）マウスにおける全プラークサイズが増加することを示す。横軸においてｗ＝週。図２ｃはプラークサイズの全増加はより少ないより小さなプラークおよびより大きなプラーク（＞７００μｍ^２）に関連し、他方、中程度のサイズのプラークの数は同一の値のままであることを示す。誤差バー、標準誤差（ｎ≧５）、＊ｐ＜０．０５。図３は、ＡＢＣＣ１の欠乏がＡβおよびＡβ_ｄｔの蓄積を促進し、および（Ｔｏｒｅｃａｎの投与による）ＡＢＣＣ１の活性化は、Ａβ値を低下させることを示す。図３ａは、２５週齢において、ＡＢＣＣ１欠乏は不溶性Ａβの顕著な増加（ほぼ１２倍）に至ることを示す。図３ｂは、２５週齢における緩衝液可溶性Ａβ４２の量は２２週齢（ほぼ５６％）と比較して認識可能に低下することを示す。これは、恐らくは、不溶性沈着物における沈着によるものである。同一週齢において、免疫組織化学において測定されたＡβ沈着物によって被覆された面積は、８３％増加する（誤差バー、標準誤差ｎ≧５、ｐ＜０．０５）。図３ｃは、血管の５３％がＣＡＡによってひどく損なわれていることを示す（血管壁の＞７５％はＡβを呈する。）。これは、対照（ｎ＝３）における２３％と比較したＡＢＣＣ１欠損マウス（ＡＢＣＣ１ｋｏ）に関する。図３ｄは、ＡＢＣＣ１の発現は脈絡叢（ＣＰ）において圧倒的に見ることができ、他方、ＡＢＣＤ１は、主として、脳（ＢＰ）の毛細血管で発現されることを示す。図３ｅは、チエチルペラジン（Ｔｏｒｅｃａｎ）によるＡＢＣＣ１の活性化はマウスにおけるＡβ値を降下させることを示す（＝２８％）。誤差バー、標準誤差（ｎ＝４、＊ｐ＜０．０５）。

動物
ＡＰＰ−トランスジェニックマウス（ＡＰＰ、ＡＰＰ_ｄｔ）はＴｈｅＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢａｒＨａｒｂｏｒ、ＵＳＡ）およびチューリンゲン大学（Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，ドイツ国）から入手した。ＮＥＰ欠損マウスは、ＲｉｋｅｎＢｒａｉｎＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（埼玉，日本国）から入手した。ＡＢＣＧ２、ＡＢＣＢ１、およびＡＢＣＣ１欠損マウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ−Ｆａｒｍｓ（デンマーク国）から入手した。全てのトランスジェニックおよびノックアウトマウス系統は、遺伝的ＦＶＢバックグラウンドにおいて少なくとも９世代の間交雑させた。マウスを、食物および水を自由に摂取させつつ、２３℃の１２時間／１２時間の明／暗サイクルに維持した。

方法
組織調製
組織調製のために、頸椎脱臼によってマウスを屠殺し、およびＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）で経心臓灌流させた。脳を取り出し、１つの半球を、パラフィン包埋および免疫組織化学のために、緩衝化４％パラホルムアルデヒド中に貯蔵した。他の半球を液体窒素中でショック凍結させ、生化学分析のために−８０℃に貯蔵した。

ＥＬＩＳＡ
ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐａｎｙ（ＴＧＣ，Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ，スイス国）からのＥＬＩＳＡキット（ＴＨ４０ＨＳ，ＴＫ４２ＨＳ）をＡβの定量で用いた。脳半球を、ＰｒｅＣｅｌｌｙｓ２４を用いてホモジナイズした（１２秒、６，５００ｒｐｍ）。炭酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えた後、ホモジネートを、ＰｒｅＣｅｌｌｙｓを用いて混合し（５秒、５，０００ｒｐｍ）、０℃および２４，０００ｇにおいて９０分間遠心して、可溶性Ａβ種から不溶物を分離した。残存する上清（緩衝液可溶性画分）を、１：１．６の比率で８Ｍグアニジン塩酸塩と混合した。凝集したＡβ種を抽出するために、ペレットを８容量の５Ｍグアニジン塩酸塩に溶解させ、室温で３時間撹拌し、２４，０００ｇにおいて４℃で２０分間遠心した。残りの上清はグアニジン可溶性画分を形成した（ＧｕａＨＣＩ）。全ての試料の蛋白質含有量は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ１０００分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡ）を用いて３回測定した。適当な希釈を用い、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡを行った。

ウェスタンブロット
組織ホモジネートをウェスタンブロットのために調製した。抽出物の全蛋白質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ）を用いて決定した。追跡当たり１０μｇの合計蛋白質の電気泳動の後に、蛋白質をＦＶＤＦ膜にブロットした。ＴＢＳＴ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中の５％粉乳中での室温における１時間のブロッキングの後、ブロットをＡＢＣＢ１（１：５００，Ｄ−１１，ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、ＡＢＣＣ１（１：２００，ＡｌｅｘｉｓＢｉｏ）またはβ−アクチン（１：２０．０００，Ｓｉｇｍａ）いずれかにて４℃で一晩調べた。抗マウスＨＲＰ、抗ラットＨＲＰまたは抗野兎ＨＲＰを検出抗体として用いた。ＡｍｅｒｓｈａｍＥＣＬＰｌｕｓ検出キットおよびＲｏｐｅｒＣｏｏｌＳｎａｐＨＱ^２カメラを可視化のために用いた。

免疫組織化学（ＩＨＣ）
ホルマリン固定脳をパラフィンに包埋し、４μｍの厚みの切片に切断した。パラフィンを除去した後、切片をＢｏｎｄＭａｘ（ＴＭ）自動染色器（Ｍｅｎａｒｉｎｉ／Ｌｅｉｃａ，ドイツ国）でさらに処理した。免疫染色を、内因性ペルオキシダーゼのブロッキング（５分）、および（抗体６Ｆ３Ｄ，Ｄａｋｏ，ドイツ国については）９５％ギ酸および（抗体４Ｇ８，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ドイツ国については）７０％ギ酸を用いる５分間のエピトープ検索の後に開始した。一次抗体を、以下の希釈物：６Ｆ３Ｄ（１：１００）、４Ｇ８（１：５００）と共に通常通りに室温にて３０分間インキュベートした。一次抗体はＤＡＢＲ３０標準プロトコルに従い、ＢｏｎｄＭａｘ（ＴＭ）ＢｏｎｄＰｏｌｙｍｅｒＲｅｆｉｎｄ検出キットで検出した。切片をＭｉｒａｘＤｅｓｋ／ＭｉｒａｘＭｉｄｉスキャナーを用いて２３０ｎｍの分解能にて完全にデジタル化し、次いで、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェアパッケージ（Ｚｅｉｓｓ，ドイツ国）を用いて自動分析した。

ＣＡＡの重症度の評価
ＡＰＰ_ｄｔの脳切片を４Ｇ８抗体で染色した。少なくとも２つの非連続切片を、盲検にて髄膜血管のＣＡＡについて調べた。全ての髄膜血管を手動でカウントし、およびＣＡＡの重症度を以下のようにカテゴリー分けした：
カテゴリーＩ：ひどく冒されてはいない。

カテゴリーＩＩ：外縁の≦２５％が陽性染色されている
カテゴリーＩＩＩ：外縁の≦５０％が陽性染色されている
カテゴリーＩＶ：外縁の≦７５％が陽性染色されている
カテゴリーＶ：外縁の≦１００％が陽性染色されている
各カテゴリーについての血管の平均数を、同定された血管の合計数に対して計算した。

内皮細胞トランスウェルアッセイ（ＥＣＴＡ）
マウスの脳毛細血管の内皮細胞はＣｏｉｓｎｅｅｔａｌ．（Ｃｏｉｓｎｅ，Ｃ．ｅｔａｌ．Ｍｏｕｓｅｓｙｎｇｅｎｉｃｉｎｖｉｔｒｏｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎｂａｒｒｉｅｒｍｏｄｅｌ：ａｎｅｗｔｏｏｌｔｏｅｘａｍｉｎｅｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｅｖｅｎｔｓｉｎｃｅｒｅｂｒａｌｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ．ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ；８５，７３４−７４６（２００５））に記載されているように調製した。少なくとも３から４週齢マウスを斬首し、脳を取り出した。脳幹、白色物質および髄膜の切開の後、１５ｍＬのガラスダウンサー（ｇｌａｓｓｄｏｕｎｃｅｒ）（ＷｈｅａｔｏｎＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｍｉｌｌｖｉｌｌｅ，ＮＪ；ＵＳＡ）を用い、組織を２容量の洗浄緩衝液Ｂ（ＷＢＢ）（ハンクスの緩衝化塩溶液（ＨＢＢＳ）、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡ）中でホモジナイズした。１容量の３０％デキストラン溶液をホモジネートに加えた。これを３，０００ｇおよび４℃にて２回遠心した。血管を含有するペレットをＷＢＢに再懸濁させ、大きな血管を、溶液の激しいピペッティングによって手動で破壊した。６０μｍメンブレン（ＳＥＦＡＲ，スイス国）を通す真空濾過を用いて大きな血管を毛細血管から分離した。コラゲナーゼ／ジスパーゼ（ＨＢＳＳ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、０．１５ｇ／ｍｌＴＣＬＫ、１０μｇ／ｍｌＤＮＡｓｅ−１、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ／ジスパーゼ（Ｒｏｃｈｅ）での組合せ処理の後、単細胞懸濁液を溶液のさらに激しいピペッティングによって達成した。内皮細胞を、挿入当たり１２０，０００細胞の密度を有するＭａｔｒｉｇｅｌ被覆トランスウェルインサート（０．４μｍポア，ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ−Ｏｎｅ，ドイツ国）に挿入し、支持膠細胞培養上で成長させた。

サルファーイエロー（ｓｕｌｐｈｕｒｙｅｌｌｏｗ）を用いて、アッセイの間に傍細胞フラックスを決定した。反管腔側の培養基を、１０ｎｇのＡｓｓ４２（１．６ｎＭ最終濃度）を含有する溶液で置き換えた。次いで、２時間、６時間または２４時間後に、管腔側区画からの試料を採取し、およびＡβ含有量をＥＬＩＳＡ（ＴＫ４２−高感度、ＴＧＣ、スイス国）で決定した。輸送速度はＣｏｉｓｎｅｅｔａｌ．（Ｃｏｉｓｎｅ，Ｃ．ｅｔａｌ．Ｍｏｕｓｅｓｙｎｇｅｎｉｃｉｎｖｉｔｒｏｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎｂａｒｒｉｅｒｍｏｄｅｌ：ａｎｅｗｔｏｏｌｔｏｅｘａｍｉｎｅｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｅｖｅｎｔｓｉｎｃｅｒｅｂｒａｌｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ．ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ；８５，７３４−７４６（２００５））に記載されている。

ＥＬＩＳＡ統計学
Ｌｉｌｌｉｅｆｏｒｓ適合度（ｇｏｏｄｎｅｓｓ−ｏｆ−ｆｉｔ）検定（アルファ＝０．０５）をＥＬＩＳＡデータおよびＬｏｇ変換ＥＬＩＳＡデータに適用して、正常に分布した試料データの推定およびｌｏｇ正常分布試料データの推定の間を区別した。小さな試料のサイズにも拘わらず、４４の試料のうち５について、データの双方の組で、帰無仮説（Ｈ_０）は無視した。圧倒的に陽性（スキュー）および厳格に陽性の試料データの観察に従い、正常に分布したデータの推定は排除した。平均信頼区間は、基本的なｌｏｇ正常分布を仮定して計算された。ウィルコクスン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）順位和検定を適用して、各時点について種々のマウス株のＥＬＩＳＡデータを比較した。

Claims

２−（エチルチオ）−１０−［３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロピル］−１０Ｈ−フェノチアジンを含む、脳ＡＢＣＣ１トランスポーターの活性低下と脳蛋白質沈着物とを伴うβ−アミロイドパシーを治療するための医薬組成物であって、
前記β−アミロイドパシーが、アルツハイマー型認知症である、前記医薬組成物。