EA019571B1 - Применение сульфизоксазола для лечения болезни альцгеймера - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к применению композиции, содержащей сульфизоксазол, или его соль, или состав с пролонгированным высвобождением, для лечения болезни Альцгеймера, а также для защиты нейронов от интоксикации пептидом Абета у нуждающегося в этом субъекта.

Description

Данное изобретение относится к композициям и способам для лечения болезни Альцгеймера (ΑΌ).

ΑΌ представляет собой прототипическую кортикальную деменцию, характеризующуюся нарушением памяти совместно с дисфазией (нарушение речи, при котором происходит нарушение речепроизводства и понимания речи), диспраксией (неспособность координировать и выполнять определенные целенаправленные движения и жесты в отсутствие моторных или сенсорных нарушений) и агнозией (способность распознавать объекты, индивидуумов, звуки, формы или запахи), относящимися к вовлечению кортикальных ассоциативных зон. Также могут присутствовать особые симптомы, такие как спастический парапарез (слабость, поражающая нижние конечности) (1-4).

Заболеваемость болезнью Альцгеймера значительно возрастает с возрастом. ΑΌ в настоящее время представляет собой наиболее частую причину деменции. Она клинически характеризуется общим снижением когнитивной функции, которое медленно прогрессирует и делает пациентов на конечной стадии прикованными к кровати, страдающими недержанием и зависимыми от попечения. Смерть наступает в среднем через 9 лет после постановки диагноза (5).

Показатель заболеваемости ΑΏ значительно возрастает с возрастом. По демографическим прогнозам в США рассчитано, что количество людей старше 80 лет будет достигать на 2050 г. 370 млн. В настоящее время рассчитано, что ΑΌ поражено 50% людей старше 85 лет. Таким образом, за 50 лет деменцией будут поражены более 100 млн человек во всем мире. Большое количество людей, требующих постоянной заботы и другого обслуживания, будут значительным образом влиять на медицинские, денежные и человеческие ресурсы (6).

Ранним признаком заболевания является нарушение памяти и в него вовлечена эпизодическая память (память на повседневные события). Семантическая память (память на вербальный и зрительный смысл) вовлечена на более поздних стадиях заболевания. В отличие от этого кратковременная память (краткосрочная память, включающая структуры и процессы, используемые для временного хранения информации и управления ею) и процедурная память (подсознательная память, т.е. долговременная память навыков и порядка действия) сохраняются до поздних стадий. По мере прогресса заболевания появляются дополнительные признаки ухудшения речи, зрительного восприятия и пространственной недостаточности, агнозий и апраксий.

Классическая картина болезни Альцгеймера достаточно охарактеризована, чтобы позволить ее идентификацию приблизительно в 80% случаев (7). Однако существует клиническая гетерогенность, и это важно не только для клинического ведения, но обеспечивает применение дополнительных видов специфического медикаментозного лечения для функционально различных форм (8).

Патологические признаки ΑΏ включают амилоидные бляшки, содержащие β-амилоид (Ав), нейрофибриллярные клубки (ΝΡΤ), содержащие ι-белок, и дисфункцию и потерю нейронов и синапсов (9-11). За последнее десятилетие предложено две основных гипотезы причин ΑΌ: гипотеза амилоидного каскада, в которой утверждается, что процесс нейродегенерации представляет собой ряд событий, запускаемых аномальным процессингом белка-предшественника амилоида (АРР) (12), и гипотеза дегенерации цитоскелета нейронов (13), в которой утверждается, что запускающими событиями являются изменения цитоскелета. Наиболее широко признанной теорией, объясняющей прогрессирование ΑΌ, остается гипотеза амилоидного каскада (14-16), и исследователи ΑΌ в основном сосредоточены на определении механизмов, лежащих в основе токсичности, ассоциированной с белками Ав. В противоположность этому ιбелок получил намного меньше внимания фармацевтической индустрии, чем амилоид, вследствие фундаментальных и практических проблем. Кроме того, изменение плотности синапсов представляет собой патологическое нарушение, которое лучше всего коррелирует с когнитивным нарушением, чем остальные два факта. Исследования выявили, что, по-видимому, патология амилоида прогрессирует специфичным для нейромедиатора образом, где, по-видимому, наиболее уязвимыми являются холинэргические окончания, с последующими глутаматэргическими окончаниями и, наконец, ГАМК-эргическими окончаниями (11).

Сущность изобретения

Задачей настоящего изобретения является предоставление новых терапевтических подходов для лечения ΑΏ.

Авторы изобретения идентифицировали молекулярный путь, вовлеченный в возникновение ΑΌ, и предложили новые мишени для разработки новых способов лечения для облегчения ΑΌ и связанных нарушений, в частности для разработки способов комбинированного лечения с использованием новых или существующих молекул, ранее используемых для других показаний.

Таким образом, изобретение относится к новым композициям и способам лечения ЛЭ.

Более конкретно, изобретение относится к применению композиции, содержащей сульфизоксазол, или его соль, или состав с пролонгированным высвобождением, в лечении болезни Альцгеймера. Композиция может дополнительно содержать по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы акампросата, амлодипина, цилостазола, лефлуномида, метимазола, фенформина, прилокаина, тадалафила, тербинафина, зонизамида и рифабутина, их солей или составов с пролонгированным высвобождением, для одновременного, раздельного или последовательного введения с сульфизоксазолом. Композиция

- 1 019571 может дополнительно содержать по меньшей мере одно лекарственное средство, ингибирующее реакцию клеток на стресс, для комбинированного, раздельного или последовательного применения. Более того, указанная композиция может дополнительно содержать по меньшей мере одно лекарственное средство, модулирующее функцию синапсов, для комбинированного, раздельного или последовательного применения. В дополнение указанная композиция может содержать по меньшей мере одно лекарственное средство, модулирующее клеточный ангиогенез, для комбинированного, раздельного или последовательного применения. Предпочтительно композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент и может быть повторно введена индивидууму.

Изобретение также относится к применению композиции, содержащей сульфизоксазол, или его соль, или состав с пролонгированным высвобождением для производства лекарственного средства для защиты нейронов от интоксикации пептидом Άβ у нуждающегося в этом субъекта.

Как описано в настоящей заявке, указанные выше лекарственные средства и способы комбинированного лечения предоставляют новые и эффективные подходы для лечения ЛИ у человеческих индивидуумов.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Эффект выбранных лекарственных средств на жизнеспособность дифференцированных под действием ΝΟΡ РС 12 после вызванной β-амилоидом интоксикации. р<0,00001: значимо отличается от носителя; **: р<0,01; ***: р<0,0001: значимо отличается от Άβ_25-35. Двусторонний критерий Стьюдента. 10 мкМ Άβ_25-35 обеспечивает значительную интоксикацию, более 25%, по сравнению с обработанными носителем нейронами (фиг. 1Ά и В, красным). Эту интоксикацию значимо предотвращает прилокаин (фиг. 1Ά) или амлодипин (фиг. 1В).

Фиг. 2. Эффект выбранных лекарственных средств на высвобождение ЬИН в интоксицированной βамилоидом первичной культуре кортикальных нейронов крыс. ; р<0,000001: значимо отличается от носителя; *: р<0,05; **: р<0,01; ***: р<0,001 *****: р<0,00001: значимо отличается от Άβ_25-35. Двусторонний критерий Стьюдента 20 мкМ Άβ_25-35 обеспечивает значимую интоксикацию, более 25%, по сравнению с обработанными носителем нейронами (фиг. 2Ά и В, красным). Эту интоксикацию эффективно предотвращает ΒΌΝΡ при 10 нг/мл, который рассматривают в качестве положительного контроля для нейропротекции. Эту интоксикацию также значимо предотвращают лекарственные средства: зонизамид (фиг. 2Ά), или сульфизоксазол (фиг. 2В), или лефлуномид (фиг. 2С).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к новым терапевтическим подходам для лечения ЛИ. Изобретение относится к новому применению лекарственных средств или комбинаций лекарственных средств, которые обеспечивают эффективную коррекцию этого заболевания и которые можно использовать для лечения пациента.

Термин связанное с ЛИ нарушение означает болезнь Άльцгеймера (ΑΌ), сенильную деменцию ΑΌ-типа (8ΌΑΤ), болезнь Паркинсона, деменцию с тельцами Леви, сосудистую деменцию, умеренное когнитивное нарушение (МС1), ассоциированное с возрастом нарушение памяти (ΑΑΜΙ) и проблемы, ассоциированные со старением, постэнцефалический паркинсонизм, ЛБ8 и синдром Дауна.

Как применяют в настоящем документе, лечение нарушения включает лечение, предотвращение, профилактику, задержку или уменьшение симптомов, вызываемых нарушением. Термин лечение, в частности, включает контроль прогрессирования заболевания и ассоциированных симптомов.

Термин ингибирует так, как он относится к реакции клеток на стресс (С8К.), включает любое снижение С8К. по сравнению с существующей активностью у индивидуума. Такое снижение может включать частичное снижение, например 5-20%, которого достаточно для улучшения состояния пациента, а также более значительные снижения, например 20-50% или более полное ингибирование, например более 50%. Ингибирование можно оценивать или подтверждать с использованием известных биологических тестов, таких как описаны в экспериментальном разделе.

Также подразумевают, что указание конкретных соединений в рамках данного изобретения включает не только конкретно указанные молекулы, но также любые их фармацевтически приемлемые соли, гидраты, сложные эфиры, простые эфиры, изомеры, рацематы, конъюгаты или пролекарственные средства.

Термин комбинация означает лечение, где для получения биологического эффекта индивидууму совместно вводят по меньшей мере два или более лекарственных средств. При комбинированной терапии по данному изобретению по меньшей мере два лекарственных средства можно вводить совместно или раздельно, в одно и то же время или последовательно. Также по меньшей мере два лекарственных средства можно вводить посредством различных маршрутов и протоколов. Таким образом, хотя их можно формулировать совместно, лекарственные средства комбинации также можно формулировать раздельно.

Как указано выше, изобретение относится к композициям и способам лечения болезни Άльцгеймера или связанного нарушения у нуждающегося в этом индивидуума с применением лекарственного средства или комбинации лекарственных средств, которые ингибируют реакцию клеток на стресс.

- 2 019571

При всесторонней интеграции экспериментальных данных, охватывающих результаты цитобиологических исследований, экспериментов по определению профилей экспрессии и исследований генетических ассоциаций, описывающих различные аспекты болезни Альцгеймера и связи, существующие в клеточной передаче сигнала и функциональных путях, авторы изобретения обнаружили, что реакция клеток на стресс представляет собой важный механизм, который изменяется у индивидуумов с ΛΌ. Гены, локализованные в указанной функциональной сети и вовлеченные в болезнь Альцгеймера, отбирали по следующим критериям:

(1) - непосредственное взаимодействие с генами, этиологически ответственными за семейные случаи болезни Альцгеймера (АРР, АроЕ, пресенилины, ι-белок), (2) - функциональные партнеры генов, выбранных по критерию (1), (3) - ближайшие функциональные партнеры генов, выбранных по критерию (2).

При помощи этого процесса авторы изобретения смогли установить, что сеть, ответственная за реакцию клеток на стресс, представляет собой большую функциональную сеть, пораженную при болезни Альцгеймера.

Авторы изобретения более конкретно установили, что реакция клеток на стресс представляет собой функционально связанный признак болезни Альцгеймера. Как описано ниже, авторы изобретения в пределах сети реакции клеток на стресс идентифицировали три семейства белков, которые функционально связаны с возникновением и контролем болезни Альцгеймера и представляют собой важные мишени для (комбинационной) терапии. Более конкретно - эти группы белков представляют собой белки, принимающие участие в гомеостазе кальция, в сворачивании белков и в осуществлении апоптоза.

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение более конкретно относится к композициям и способам применения лекарственного средства или комбинации лекарственных средств, модулирующих активность белка, вовлеченного в гомеостаз кальция.

Кальций, один из наиболее важных внутриклеточных мессенджеров, опосредует плейотропию клеточных процессов в нейронах и эндотелиальных клетках, включая синаптическую пластичность, ангиогенез и апоптоз. Мутации, аномальное сворачивание или гиперфосфорилирование пресенилина, АРР и ιбелки влияют на гомеостаз кальция. Соответственно, нарушение внутриклеточной передачи сигнала посредством кальция усиливает характеристические нарушения при болезни Альцгеймера, приводя к ускоренному накоплению агрегатов β-амилоида и гиперфосфорилированию ι-белка, что указывает на существование регуляторной обратной связи между гомеостазом кальция и специфической для АО клеточной патологии.

Уровень внутриклеточного кальция точно регулируется совместным действием ряда проницаемых для кальция каналов, кальциевых насосов и кальциевых обменников в плазматической мембране и эндоплазматическом ретикулуме. Например, кальций динамически хранится в эндоплазматическом ретикулуме (ЕК), который способен накапливать очень высокие уровни Са²⁺ вследствие активности Са²⁺ БЕКСА насосов, достигая миллимолярных концентраций (17). Высвобождение Са²⁺ из эндоплазматического ретикулума контролируется двумя типами каналов высвобождения Са²⁺, а именно рецепторы рианодина (КУК) и рецепторы ΙΡ3 (ΙΤΡΚ). Их могут непосредственно активировать многие сигнальные мессенджеры, включая локальные колебания концентраций Са²⁺ или ΙΡ3 в цитоплазме, и их функционально модулируют несколько регуляторных белков, таких как РКА, РККС1. тТОК, кальциневрин, ΕΚΒΡ, фосфоламбан и т.д. (18). БЕКСА насосы регулируются концентрациями Са²⁺ в ЕК, где снижение содержания кальция в ЕК повышает активность БЕКСА. На уровне плазматической мембраны гомеостаз кальция в основном регулируется управляемыми внутриклеточным депо и потенциалозависимыми кальциевыми каналами, ответственными за вход Са²⁺, выталкивающими кальций АТФазными насосами, обменниками Να'/Са²' и потенциалозависимыми Иа⁺-каналами.

Авторы изобретения идентифицировали генную сеть, вовлеченную в путь гомеостаза кальция, функцию которого можно модифицировать мутантными пресенилиновыми белками или токсическим βамилоидом. Среди них особый интерес представляют рецепторы К3К (ΙΤΡ^) и КУК3, АТР2А3 (8ЕКСА3 Са²⁺ АТФаза), регулирующие гомеостаз кальция на уровне ЕК, АТФаза АТР2В1 плазматической мембраны, выталкивающей ионы кальция из эукариотических клеток против градиентов концентрации, и потенциалозависимые Να'-каналы. Показано, что АРР, Λβ42 и мутантный Ρ81 способны модулировать активность рецепторов рианодина и БЕКСА насосов. Ав42 и вариант ΕА^Ρ81 увеличивают экспрессию и активность КУК3 (19-21), приводя к повышенной уязвимости нейронов к эксайтотоксическому повреждению глутаматом (22). Кроме того, ингибирование обратного захвата кальция посредством 8ЕКСА насоса коррелирует со снижением высвобождения Ав, тогда как стимуляция активности 8ЕКСА увеличивает продукцию Ав (23). Кроме того, на уровне плазматической мембраны, в процессинге β-субъединиц потенциалозависимых натриевых каналов, которые модулируют и могут, при патологических состояниях, обращать активность обменников Ш'/Са²', вызывая избыточное внутриклеточное накопление кальция, участвуют пресенилин и ВАСЕ-1 (24).

В другом конкретном варианте осуществления настоящее изобретение более конкретно относится к композициям и способам с применением лекарственного средства или комбинации лекарственных

- 3 019571 средств, которые модулируют активность белков, вовлеченных в сворачивание или агрегацию белков.

Агрегация белков представляет собой центральный цитопатологический процесс при ΆΌ. Два основных клеточных признака болезни Альцгеймера проявляются в развитии нейрофибриллярных клубков (ΝΕΤ) и отложении амилоидных бляшек, состоящих из агрегированного гиперфосфорилированного ιбелка и фрагментов Αβ белка АРР соответственно. Другой белок, чувствительный к агрегации -αсинуклеин, общепризнанный скорее как специфический признак болезни Паркинсона, тем не менее можно выявить в амилоидных бляшках в большинстве случаев спорадической и семейной форм болезни Альцгеймера (25-26).

Авторы изобретения идентифицировали каскад из нескольких генов, вовлеченных в модуляцию сворачивания, посттрансляционной модификации и процессинга каждого основного составляющего ассоциированных с болезнью Альцгеймера белковых агрегатов. Это открытие подчеркивает важность комбинационного патологического действия неправильно уложенных белков ι, Ав и синуклеина для развития болезни Альцгеймера. Например, авторы изобретения идентифицировали разрушающий инсулин фермент ГОЕ, который также вовлечен в протеолиз Ав, (27) и белки АРВА1 и АРВА2ВР, взаимодействующие с АРР и регулирующие его стабильность и функции (28-29). Также анализ данных в качестве факторов риска развития болезни Альцгеймера выявил α-синуклеин (8ΝΟΑ), его партнера по взаимодействию синфилина (δΝΟΑΙΡ) и ΡΑΚΚ2, лигазу белка убиквитина, вовлеченную в выведение 8ΝΟΑ и защиту нейронов от токсичности α-синуклеина (30).

Дисбаланс активности киназ, таких как ΟδΚ3β, СЭК5 и МАКК (31-32) и фосфатаз, регулирующих уровень фосфорилирования ι-белка, может участвовать в агрегации ι-белка и интенсифицировать ее. Учитывая, что зависимое от ΟδΚ-3β фосфорилирование также функционально регулирует пресенилин, киназа ΟδΚ-3 β может играть особенно важную роль в патогенезе болезни Альцгеймера. Это заключение подкрепляется тем открытием авторов изобретения, что несколько сигнальных элементов, регулирующих активность киназы ΟδΚ-3β или ее прямое взаимодействие с ι-белком - \ν\νθΧ (33), гиалуроновая кислота СЭ44 рецептор, \νηΙ рецепторы Εζ2/ΚΟΚ2 и инсулин рецептор/ΡΤΡΚΟ рйо5рйа1а5е сотр1ех (34) могут быть ассоциированы с возникновением болезни Альцгеймера.

В дополнительном конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композициям и способам с использованием лекарственного средства или комбинации лекарственных средств, ингибирующих апоптоз.

Апоптоз, признанный основным клеточным механизмом, ответственным за потерю клеток при болезни Альцгеймера, может быть эффективно вызван повреждающими факторами клеток, как правило, ассоциированными с развитием болезни Альцгеймера - нарушенный гомеостаз кальция и увеличенная продукция активных форм кислорода (ΚΟδ), стимулированных токсическими агрегатами β-амилоидного пептида (А[3).

Как определено посредством анализа авторов изобретения, апоптоз в случае болезни Альцгеймера наиболее вероятно осуществляется по каноническим зависимым от р53 путям. р53 представляет собой ДНК-связывающий белок и действует в качестве фактора транскрипции, контролирующего экспрессию генов-мишеней, ингибирующих рост и инвазию опухолевых клеток. Таким образом, р53 общепризнан как белок-опухолевый супрессор, и он играет важную роль в регуляции прохождения клеточного цикла, в частности в переходе от С0 к С1 и к точке контроля повреждений ДНК С2/М и в индукции апоптоза. Последнее, по-видимому, опосредуется или стимуляцией экспрессии проапоптотических белков, таких как Вах, или посредством репрессии экспрессии антиапоптотических белков, таких как Вс1-2.

Белок р53 может регулироваться посттрансляционными модификациями и взаимодействием с позитивными и негативными регуляторными факторами. Авторы изобретения идентифицировали несколько регуляторных белков - \ν\νθΧ. МЭМ1, ΗΙΡΚ2 и РМЬ - подтверждающих представление об основной роли белка р53 в осуществлении гибели клеток при болезни Альцгеймера. Взаимодействующая с р53, содержащая νν-домен оксидоредуктаза (νΟΧν) представляет собой важный медиатор цитотоксичности ΤΝΡα и опосредует апоптоз синергично с р53 (35). Взаимодействующая с гомеодоменом ядерная серин/треониновая протеинкиназа-2 (ΗΙΡΚ2) фосфорилирует р53 по δе^ 46 и взаимодействует с р53 при активации р53-зависимой транскрипции и апоптотических путей (36). Наконец, ΡМ^ белок является антагонистом действия белка МЭМ2, стимулирующего разрушение р53 протеасомой, и активирует р53, привлекая его в мультибелковые комплексы, называемые ядерными тельцами ΡМ^ (37).

Среди рецепторных систем, которые могут непосредственно и специфически участвовать в индукции апоптоза при болезни Альцгеймера, особый интерес представляют нетриновые рецепторы υΝί.'5ί.' (гомолог С Иис-5) и ЭСС (делетированный при колоректальной карциноме), вовлеченные в направление аксонов и ангиогенез. Эти рецепторы называют предполагаемыми условными опухолевыми супрессорами, так как они ведут себя как нетринзависимые рецепторы, индуцируя апоптоз в отсутствие их лиганда (38). Связывание нетрина-1 с этими рецепторами ингибирует зависимый от опухолевого супрессора р53 апоптоз, а р53 непосредственно вовлечен в регуляцию транскрипции нетрина-1 и его рецепторов (39). Кроме того, рецептор ЭСС процессируется пресенилином с образованием внутриклеточного рецепторного домена, обладающего транскрипционной активностью (40). Таким образом, анализ данных авторов

- 4 019571 изобретения позволил предположить, что опосредованный нетриновыми рецепторами и зависимый от р53 апоптоз может представлять собой один из специфических проапоптотических путей, участвующих в патологической потере клеток при болезни Альцгеймера, в дополнение к относительно неспецифическим проапоптотическим программам, стимулируемым нарушенным гомеостазом кальция и избыточной продукцией ΚΟδ.

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение более конкретно относится к композициям и способам с использованием комбинации лекарственных средств, ингибирующей активность по меньшей мере двух определенных белков, вовлеченных в гомеостаз кальция, в свертывание белка и в осуществление апоптоза.

В настоящем изобретении авторы изобретения предлагают новые композиции, которые можно использовать для ингибирования реакции клеток на стресс, индуцируемый при болезни Альцгеймера, и других нейродегенеративных нарушений.

В конкретном варианте осуществления в композициях и способах по данному изобретению используют лекарственные средства, ингибирующие реакцию клеток на стресс посредством их взаимодействия с геном или белком, как перечислено выше, или их модулирования.

Более конкретно, композиции по данному изобретению содержат лекарственное средство или лекарственные средства, ингибирующие реакцию клеток на стресс, посредством связывания или модулирования активности белка, кодируемого геном, выбранным из АССЫ1, ΑΌΚΑ.1Α, ΑΌΚΒ2, ΑΡΑΌΙΝ, АКТ, Α1.12112, АЬОХ12, ΑΜΡΚ, АРВА1, АРВА2ВР, ΑΡΟ1, ΑΡΟ12, ΑΡΟΕΚ2, ΑΤΟ5, ΑΤΟ7, ΑΤΜ, АТР1А1, АТР2А3, АТР2В1, ΑΤΡ6ν1Ο, ΑΤΚ, ΒΑСΕ1, ΒΑΌ, ΒΑΧ, ΒϋΑΚ1, ВСЬ2, ВЕСЬ1М, гена ΒΚ каналов (^ΝΜΑ1, ^ΝΜΒ1), ΒΚϋΑ1, СΑСNΑ1С, гена кальциневрина (ΤΑΤαΝΕυΚΙΝ), СО36, (Ό44. СЭНР (Ό1Ι2. СОК5. (ΙΧΝΊΑ, СНК1, СНКМ1, СНКМ2, СНКМ3, СНКМ4, СНКМ5, СК1, ΟΓΝΝΑ2, ΟΤΝΝΒ1, СиьиМ, гена циклина (СУСЬИ^Е), ΙΧΏ ΌΟΚΒ, ПОКН, ΌΝΑΙΒ9, 1)()(40 Ι)ΚΙ0 ΕΌΝΚΑ, ΕΕΑνΕ2, ЕКК1, ЕКК2, ΕΖΚΙΝ, ΡΑδ, Ρ^ΡΠ, Ρ^Ρ^Α ΡΟΧΟ3Α, ΡΖ2, ΟΑΌΌ45, ΟΝΡΤΑΒ, ΟΡС5, ОКК2, ОКК5, ΟΚΡ170, ΟΚΙΝ2Β, ΟΚΙΝ3Α, ΟδΟΒ, ^δ! ΗΑδ2, ΗΑδ3, 11ΙΡ10 110.0 ΗδΡ90Β1, ΗδΡΑ5, ΜΈΤΑ, ΙΌΕ, IΜΡ^Η1, IΜΡ^Η2, ΙΝδ, ΙΝδΚ, ΙΚΡ1, ΙΤΒ1, ΙΤΟΑ1, ΙΤΟΒ1, ΙΤΡΚ1, 1ЦК1, ^ΑΜΑ1, ΜΑ^1^1, МАО, МСС1, МОМ1, ММЦ гена моэзина ^ΟΕδΙΝ), МТОН, гена ΝΑΙ)Ρ11-оксидазы (ΝΑΙ)ΡΙ 1 ΟΧΙΌΑδΕ), ΝΕΌΌ9, ΝΕΤΚΙΝ1, №^1, Ν11Η10 ΝΟδ1, ΝΟδ2Α, ΝΟδ3, ΡΑΕΕΚ, ΡΑΜ, ΡΑΚ^, ΡСΑΡ, ΡΌΕ11Α, ΡΌΕ3Α, ΡΌΕ4Ό, ΡΌΕ5, ΡΌΕ6Ό, И3К, ИК3С3, Ρ^Α, Ρ^СΒ1, Ρ1.Ι0 ΡΌΝ, ΡΜ^, ΡΟΡ2, ΡΚΌΧ5, ΡΚΌΧ6, И/КОР ΡΤΡΚΟ, ΡΊ^ΚΗ ΡνΚΌ1, ΚΑΟ1, ΚΑαα, гена радиксина (ΚΑΌΙΧΙΝ), 1/11(0 ΚΟΚ2, ΚΤΝ1, ΚΥΚ3, δΑΡΙ0 δСN1Α, δСN1Β, δϋΝΝ1Ό, δСNN1Ο, 8№ΒΡ5, δΙΌ1, δΌ€8Α1, δ^С8Α2, δ^С8Α3, δΙ.Ν/ δΝϋΑ, δΝΌΑΙΡ, δ0ΚΒδ2, 80ВС82, δΚϋ, δΥΝ1, ΤΗΒδ2, ΤΡ53, ΤΡ63, ΤΚΡС3, ΤΚΡС4, ΤΚΡС5, иЦС5С, νΡ815, νΝΤ1Α, νΝΤ5Α, ννΟΧ, гена ксантиноксидазы (ΧΑΝ^ΡΝΕ ΟΧΙΌΑδΕ) и ΥΕδ1.

Последовательности всех перечисленных выше генов и белков доступны в генных библиотеках, и их можно выделять известными в данной области способами. Кроме того, активность этих генов и белков можно оценивать известными в данной области способами, как описано в экспериментальном разделе.

Изобретение дополнительно относится к лекарственным средствам, которые можно использовать для модулирования этих генов-мишеней и белков-мишеней. Изобретение относится к идентификации и активности конкретных лекарственных средств, которые отдельно, но предпочтительно в комбинации(ях), модулируют указанный выше путь и которые можно использовать для лечения указанных заболеваний. В частности, авторы идентифицировали низкомолекулярные соединения, которые уже описаны в литературе, но использовались для лечения других заболеваний у людей.

В связи с этим, в наиболее предпочтительном варианте осуществления композиции по данному изобретению содержат, по меньшей мере, модулятор ΑΜΡΚ (предпочтительно выбранный из фенформина и видарабина), ингибитор АТР1А1 (предпочтительно омепразол), ингибитор СΑСNΑ1С (предпочтительно амлодипин), антагонист рецептора эндотелина ΕΌΝΚΑ (предпочтительно сульфизоксазол), модулятор ГАМК-эргических и глутаматергических рецепторов ΟΚΙΝ2Β и ΟΚΙΝ3Α (предпочтительно акампросат), ингибитор активности ΟδΙ<3Β (предпочтительно выбранный из альбутерола и метараминола), модулятор синтетаз гиалуроновой кислоты ΗΑδ1-3 (предпочтительно лефлуномид), ингибитор ГМКОН1 и ГМКОН2 (предпочтительно тиогуанин), ингибитор ΜΤΟΚ (предпочтительно рапамицин), ингибитор фосфодиэстераз ΡΌΕ11Α, ΡΌΕ4Α и ΡΌΕ5Α (предпочтительно тадалафил), ингибитор ΡΌΕ3Α (предпочтительно цилостазол), ингибитор ΡΌΕ4Ό (предпочтительно милринон), модулятор ΡΚΌΧ5 и ΡΚΌΧ6 (предпочтительно метимазол), активатор ΡΚΚΟ1 (предпочтительно выбранный из нитропруссида, тадалафила и цилостазола), модулятор ^ΟΑ (предпочтительно выбранный из алендроната и тербинафина), модулятор ΚΥΚ3 (предпочтительно прилокаин), ингибитор δСN1Α и активатор ΒΚ каналов (предпочтительно зонизамид), ингибитор δСN1Α/Β (предпочтительно выбранный из зонизамида и фосфенитоина), ингибитор ΥΕδ1 и δΚί.' (предпочтительно дазатиниб), активатор аутофагии (предпочтительно трегалоза) и/или химические шапероны (предпочтительно выбранные из фенилбутирата натрия, рифабутина, арабита и маннита).

Как указано выше, изобретение конкретно относится к разработке способов комбинированного лечения, направленного на механизмы ΑΌ и связанных нарушений. В связи с этим ниже описаны примеры наиболее предпочтительной мишени и комбинаций лекарственных средств.

- 5 019571

Более предпочтительно композиция содержит по меньшей мере одну из следующих комбинаций лекарственных средств для комбинированного, раздельного или последовательного введения:

модулятор АМРК (предпочтительно фенформин) и ингибитор натриевых каналов 8ί.'Ν1Λ и активатор ВК каналов (предпочтительно зонизамид), модулятор ГАМК-эргических и глутаматергических рецепторов (предпочтительно акампросат) и модулятор КНОА (предпочтительно тербинафин), ингибитор натриевых каналов 8ί.'Ν1Λ и активатор ВК каналов (предпочтительно зонизамид) и модулятор рецепторов рианодина ΚΥΚ3 (предпочтительно прилокаин), модулятор АМРК (предпочтительно фенформин) и модулятор рецепторов рианодина ΚΥΚ3 (предпочтительно прилокаин), модулятор АМРК (предпочтительно фенформин) и модулятор КНОА (предпочтительно тербинафин), ингибитор натриевых каналов 8США и активатор ВК каналов (предпочтительно зонизамид) и модулятор КНОА (предпочтительно тербинафин), модулятор рецептора рианодина ΚΥΚ3 (предпочтительно прилокаин) и модулятор КНОА (предпочтительно тербинафин), модулятор АМРК (предпочтительно фенформин) и химический шаперон (предпочтительно рифабутин), ингибитор натриевых каналов 8США и активатор ВК каналов (предпочтительно зонизамид) и химический шаперон (предпочтительно рифабутин), модулятор рецепторов рианодина ΚΥΚ3 (предпочтительно прилокаин) и химический шаперон (предпочтительно рифабутин), модулятор КНОА (предпочтительно тербинафин) и химический шаперон (предпочтительно рифабутин), или модулятор АМРК (предпочтительно фенформин) и ингибитор фосфодиэстераз РОЕ11А и РОЕ4А, РОЕ5А (предпочтительно тадалафил).

Наиболее предпочтительные примеры композиций по данному изобретению включают соединения, выбранные из акампросата, альбутерола, аледроната, амлодипина, арабита, цилостазола, дазатиниба, фосфенитоина, лефлуномида, маннита, метараминола, метимазола, милринона, нитропруссида, омепразола, фенформина, фенилбутирата натрия, прилокаина, рапамицина, рифабутина, сульфизоксазола, тадалафила, тербинафина, тиогуанина, трегалозы, видарабина и зонизамида или их комбинации.

В другом предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению содержат по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из акампросата, цилостазола, метимазола, фенформина, прилокаина, тадалафила, тербинафина, зонизамида и рифабутина или их солей или пролекарственных средств или производных или составов с пролонгированным высвобождением, для одновременного, раздельного или последовательного введения.

В более предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению содержат комбинацию по меньшей мере двух соединений, выбранных из группы, состоящей из акампросата, цилостазола, метимазола, фенформина, прилокаина, тадалафила, тербинафина, зонизамида и рифабутина или их солей или пролекарственных средств или производных или составов с пролонгированным высвобождением, для одновременного, раздельного или последовательного введения.

В другом варианте осуществления композиции по изобретению содержат комбинацию по меньшей мере из двух соединений, выбранных из группы, состоящей из акампросата, цилостазола, метимазола, фенформина, прилокаина, тадалафила, тербинафина, зонизамида и рифабутина, или их солей, или пролекарственных средств, или производных, или составов с пролонгированным высвобождением, где указанная композиция ингибирует реакцию клеток на стресс, индуцированную при нейродегенеративных нарушениях, выбранных из группы, состоящей из болезни Альцгеймера (АО), болезни Паркинсона (РО), бокового амиотрофического склероза (АБ8) и рассеянного склероза (М8).

В другом предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению содержат комбинацию по меньшей мере из двух соединений, выбранных из группы, состоящей из акампросата, цилостазола, метимазола, фенформина, прилокаина, тадалафила, тербинафина, зонизамида и рифабутина, или их солей, или пролекарственных средств, или производных, или составов с пролонгированным высвобождением, для лечения болезни Альцгеймера (АО).

Предпочтительно композиции для лечения болезни Альцгеймера или связанного нарушения у нуждающегося в этом индивидуума, содержат по меньшей мере одно из следующих комбинаций лекарственных средств для комбинированного, раздельного или последовательного введения:

- 6 019571 фенформин и зонизамид, акампросат и тербинафин,

зонизамид	и	прилокаин,
фенформин	и	прилокаин,
фенформин	и	тербинафин.
зонизамид	и	тербинафин,
прилокаин	и	тербинафин,
фенформин	и	рифабутин,
зонизамид	и	рифабутин,
прилокаин	и	рифабутин,

тербинафин и рифабутин, или фенформин и тадалафил.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления композиция по изобретению содержит, по меньшей мере, амлодипин и прилокаин, или их соли, или пролекарственные средства, или производные или составы с пролонгированным высвобождением для одновременного, раздельного или последовательного введения.

В другом предпочтительном варианте осуществления композиция по изобретению содержит, по меньшей мере, амлодипин и/или прилокаин, или их соли, или пролекарственные средства, или производные, или составы с пролонгированным высвобождением для лечения болезни Альцгеймера или связанного нарушения.

В другом конкретном варианте осуществления композиция по изобретению дополнительно содержит по меньшей мере одно лекарственное средство, ингибирующее реакцию клеток на стресс, для комбинированного, раздельного или последовательного применения.

Предпочтительно эти дополнительные лекарственные средства, ингибирующие реакцию клеток на стресс, выбирают из модулятора АМРК (предпочтительно видарабина), ингибитора АТР1А1 (предпочтительно омепразола), ингибитора активности О8К3В (предпочтительно выбранного из альбутерола и метараминола), ингибитора ΙΜΡΌΗ1 и ΙΜΡΌΗ2 (предпочтительно тиогуанина), ингибитора ΜΤΘΒ (предпочтительно рапамицина), ингибитора ΡΌΕ4Ό (предпочтительно милринона), активатора РККС1 (предпочтительно цилостазола), модулятора ИНОА (предпочтительно алендроната), ингибитора 8ί.'Ν1Λ/Β (предпочтительно фосфенитоина), ингибитора ΥΕ81 и 8ИС (предпочтительно дазатиниба), активатора аутофагии (предпочтительно трегалозы) и/или химических шаперонов (предпочтительно выбранных из фенилбутирата натрия, арабита и маннита).

В других конкретных вариантах осуществления эти дополнительные лекарственные средства, ингибирующие реакцию клеток на стресс, выбирают из лекарственного средства или лекарственных средств, связывающихся с белком, кодируемым геном, выбранным из АССЮ. АОЙА1А, ΑΌΚΒ2, АЕАΌΙΝ, АКТ, ΑΕΌΗ2, АЬОХ12, АМРК, АРВА1, АРВА2ВР, АРО1, АР612, ΑΡΘΕΒ2, ΑΤ65, ΑΤ67, ΑΤΜ, АТР1А1, АТР2А3, АТР2В1, ΑΤΡ6V1С1, АТС, ВАСЕ1, ВАЛ, ВАХ, ВСАЙ1, ВСЬ2, ВЕСЬ1М, гена ВК каналов (КС^А^ КСNΜВ1), ВЙСА1, СΑСNΑ1С, гена кальциневрина (САЕС1№иШЦ), СЛ36, СЛ44, СЛН1, СЛН2, СЛК5, СЛКМА, СНК1, ϋΗΚΜ1, №ΡΜ2, (ΊΙΡΜ.Χ С1ΙΙ/ΜΝ С11И\1Х СК1, СΤNNΑ2, ΟΤΝΝβ1, СЛЬиМ, гена циклина ((ΎίΤΙΧΤΑ ЛСС, ЛОКВ, ЛОКН, 1)\А,1ВА ЛОСК3, ЛЙЛ2, КОХИА, ЕЕАУЪ2, ЕКК1, ЕКК2, ΕΖΡΙΝ, ЕА8, ТЫВШ, БЫВША ЕОХОЗА, ΕΖ2, ОАЛЛ45, 6NΡΤΑВ, 6ΡС5, СКК2, СКК5, 6ΚΡ170, 6ЙШ2В, 6ЙШ3А, С8К3В, НА81, НА82, НА83, НЩК2, Η8ΡΑ8, Η8Ρ90В1, Η8ΡΑ5, НЕЙТА, ΙΌΕ, IΜΡ^Η1, ΙΜΡΌΜ, ΙΝ8, ΙΝ8Ρ, ΙΡΕ1, ПВ1, П^АЦ ΓΤ6β1, ΙΤΡΡ1, 1ΝΧ1, ^ΑΜΑ1, ΜΆΟ1Ε1, МАО, МСС1, ΜΌΜ1, ΜΜΕ, гена моэзина (ΜОΕ8IN), ΜΤОЙ, гена ХАВИ 1-оксидазы (\А1)1Ч 1 ОXI^Α8Ε), ΝΕΌΌ9, ΝΕΤΡΙΝ1, №КВ1, Ν^ΡΕ, ЫО81, ЫО82А ЧО83, ΡΑΕ^Й, ΡΑК1, ΡΑЙК2, ΡСΑΕ, ΡΏΕ^ Ρ^Ε3Α, ΡΌΕ4Ό, ΡΌΕ5, ΡΌΕ6Ό, И3К, ИК3С3, Ρ^Α ΡΕΟβ1, Ρ1.Ι/2- ΡΕΝ, ΡΜΕ, ΡОΡ2, ΡΡΌΧ5, ΡΡΠΧ6, ΡΗΧΟ^ ΡΤΡΡΟ, ΡΤΡΡΜ, ΡνΡΕ1, ЙАС1, ЙАСК1, гена радиксина (КАЛКЕХ), ЙНОА, ЙОЙ2, ΡΤΝ1, ЙУК3, 8ΑΡК3, 8СМА, 8СМВ, 8ΟΝΝ1ϋ, 8СNN16, 8Η3ВΡ5, 8X1, 8ЬС8А1, 8ЬС8А2, 8ЬС8А3, 8ΕΝ, ЗЫСА 8^АХ, 8ОЙВ82, 8ОИС82, 8ИС, 8ΥΝ1, ШВ82, ΤΡ53, ΤΡ63, ΤЙΡС3, ΤЙΡС4, ΤЙΡС5, ТОС5С, νΡ815, ХАХ/ЧА, №ΝΤ5Α УУОХ, гена ксантиноксидазы (ХАОТЮ^ ОХЮА8А) и ΥΕ81, или модулирующих активность белков, кодируемых этими генами.

Авторы изобретения установили, что указанные выше лекарственные средства и комбинации лекарственных средств обеспечивают улучшенное и синергическое биологическое действие, приводящее к эффективной коррекции или нормализации функциональной дисрегуляции, приводящей к АЛ и связанным нарушениям.

Указанные выше соединения перечислены в приведенной ниже таблице вместе с их номером СА8. Как обсуждалось ранее, следует понимать, что данное изобретение относится к использованию указанных выше соединений, а также их любых фармацевтически приемлемых соли, гидрата, сложного эфира,

- 7 019571 простого эфира, изомеров, рацематов, конъюгатов или пролекарственных средств. Пролекарственные средства можно получать (например, связывая лекарственное средство с подходящим носителем) для осуществления лучшего контроля за фармакокинетическими параметрами лечения.

Таблица 1

Наименование лекарственного средства	Номер САБ
Акампросат	77337-76-9
Альбутерол	18559-94-9
Алендронат	66376-36-1
Амлодипин	88150-42-9
Арабит	488-82-4, 7643-75-6, 6018-27-5
Цилостазол	73963-72-1
Дазатиниб	302962-49-8
Фосфенитоин	93390-81-9
Лефлуномид	75706-12-6
Манит	69-65-8
Метараминол	54-49-9
Метимазол	60-56-0
Милринон	78415-72-2
Нитропруссид	15078-28-1
Омепразол	73590-58-6
Фенформин	114-86-3
Фенилбутират натрия	1716-12-7
Прилокаин	721-50-6
Рапамидин	53123-88-9
Рифабутин	72559-06-9
Сульфизоксазол	127-69-5
Тадалафил	171596-29-5
Тербинафин	91161-71-6
Тиогуанин	154-42-7
Трегалоза	99-20-7
Видарабин	24356-66-9
Зонизамид	68291-97-4

Примеры фармацевтически приемлемых солей включают фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот, фармацевтически приемлемые соли присоединения оснований, фармацевтически приемлемые соли металлов, аммонийные и алкилированные аммонийные соли. Соли присоединения кислот включают соли неорганических кислот, а также органических кислот. Характерные примеры подходящих неорганических кислот включают соляную, бромисто-водородную, йодисто-водородную, фосфорную, серную, азотную кислоты и т.п. Характерные примеры подходящих органических кислот включают муравьиную, уксусную, трихлоруксусную, трифторуксусную, пропионовую, бензойную, коричную, лимонную, фумаровую, гликолевую, молочную, малеиновую, яблочную, малоновую, миндальную, щавелевую, пикриновую, пировиноградную, салициловую, янтарную, метансульфоновую, этансульфоновую, винную, аскорбиновую, памовую, бисметиленсалициловую, этандисульфоновую, глюконовую, цитраконовую, аспарагиновую, стеариновую, пальмитиновую, ЭДТА, гликолевую, п-аминобензойную, глутаминовую, бензолсульфоновую, п-толуолсульфоновую кислоты, сульфаты, нитраты, фосфаты, перхлораты, бораты, ацетаты, бензоаты, гидроксинафтоаты, глицерофосфаты, кетоглутараты и т.п. Дополнительные примеры фармацевтически приемлемых солей присоединения неорганических или органических кислот перечислены, например, в 1. Рйатш. δει. 1977, 66, 2, включенной в настоящий документ в

- 8 019571 качестве ссылки. Примеры солей металлов включают соли лития, натрия, калия, магния и т.п. Примеры аммонийных и алкилированных аммонийных солей включают аммонийные, метиламмонийные, диметиламмонийные, триметиламмонийные, этиламмонийные, гидроксиэтиламмонийные, диэтиламмонийные, бутиламмонийные, тетраметиламмонийные соли и т.п. Примеры органических оснований включают лизин, аргинин, гуанидин, диэтаноламин, холин и т.п.

Терапию по изобретению можно проводить отдельно или в виде комбинации лекарственных средств и/или в комбинации с любой другой терапией, направленной на тот же путь или обладающей другими способами действия. Ее проводят и можно проводить в домашних условиях, в кабинете врача, клинике, амбулаторном отделении при больнице или в больнице так, чтобы врач мог наблюдать эффект терапии и проводить любые поправки, которые необходимы. В конкретном варианте осуществления композиции по данному изобретению дополнительно содержат по меньшей мере одно лекарственное средство, модулирующее ангиогенез, предпочтительно увеличивающее ангиогенез, для комбинированного, раздельного или последовательного применения. Более предпочтительно лекарственные средства, модулирующие ангиогенез, выбраны из группы, состоящей из амбрисентана, аминокапроновой кислоты, аргатробана, балсалазида, бекаплермина, каберголина, клопидогреля, дезирудина, дигидроэрготамина, эплеренона, фенолдопама, флудрокортизона, гемфиброзила, гесперетина, лефлуномида, Ь-гистидина, лиотиронина, маримастата, мелоксикама, мепакрина, метазоламида, монтелукаста, нетилмицина, нитроглицерина, пириметамина, сульфизоксазола, сунитиниба, тиэтилперазина, тирофибана, топотекана и варфарина (см. табл. 2 ниже).

Таблица 2

Наименование лекарственного средства	Номер САЗ
Амбрисентан	177036-94-1
Аминокапроновая кислота	60-32-2
Аргатробан	74863-84-6
Балсалазид	80573-04-2
Бекаплермин	165101-51-9
Каберголин	81409-90-7
Клопидогрель	113665-84-2
Дезирулин	120993-53-5
Дигидроэрготамин	6190-39-2
Эплеренон	107724-20-9
Фенолдопам	67227-57-0
Флудрокортизон	127-31-1
Гемфиброзил	25812-30-0
Гесперетин	520-33-2
Лефлуномид	75706-12-6
Ь-гистидин	71-00-1
Лиотиронин	6893-02-3
Маримастат	154039-60-8

Мелоксикам	71125-38-7
Мепакрии	83-89-6
Метазоламид	554-57-4
Монтелукаст	158966-92-8
Нетилыицин	56391-56-1
Нитроглицерин	55-63-0
Пириметамин	58-14-0
Сульфизоксазол	127-69-5
Сунитиниб	557795-19-4
Тиэтилперазин	1420-55-9
Тирофибан	144494-65-5
Топотекан	119413-54-6
Варфарин	81-81-2

- 9 019571

Альтернативно или в дополнение к предшествующему варианту осуществления композиции по данному изобретению могут дополнительно содержать по меньшей мере одно лекарственное средство, модулирующее функцию синапсов, предпочтительно улучшающее функцию синапсов, для комбинированного, раздельного или последовательного применения. Более предпочтительные лекарственные средства, модулирующие функцию синапсов, выбраны из альфентанила, амилорида, амлодипина, азтреонама, баклофена, буклизина, буметанида, бупренорфина, лидокаина, хлорзоксазона, цинакальцета, дифиллина, элетриптана, эрготамина, флунитразепама, иматиниба, кетотифена, пегаптаниба, пентазоцина, фенобарбитала, прегабалина, пропилтиоурацила, темазепама, тиагабина, топирамата, триамтерена и вигабатрина (см. табл. 3 ниже).

Таблица 3

Наименование лекарственного средства	Номер САЗ
Альфентанил	71195-58-9
Амилорид	2016-88-8
Амлодипин	88150-42-9
Азтреонам	78110-38-0
Баклофен	1134-47-0
Буклизин	82-95-1
Буметанид	28395-03-1
Бупренорфин	52485-79-7
Хлорзоксазон	95-25-0
Цинакальцет	226256-56-0
Дифиллин	479-18-5
Элетриптан	143322-58-1
Эрготамин	113-15-5
Флунитразепам	1622-62-4
Иматиниб	152459-95-5
Кетотифен	34580-14-8
Лидокаин	137-58-6
Пегаптаниб	222716-86-1
Пентазоцин	359-83-1
Фенобарбитал	50-06-6
Прегабалин	148553-50-8
Пропилтиоурацил	51-52-5
Темазепам	846-50-4
Тиагабин	115103-54-3
Топирамат	97240-79-4
Триамтерен	396-01-0
Вигабатрин	60643-86-9

В конкретном варианте осуществления изобретение относится к композиции, содержащей лекарственное средство, ингибирующее реакцию клеток на стресс, лекарственное средство, усиливающее ангиогенез, и лекарственное средство, улучшающее функцию синапсов, для одновременного, раздельного или последовательного введения.

В другом конкретном варианте осуществления в изобретении применяют лекарственное средство, которое ингибирует по меньшей мере два из перечисленных выше видов активности. Кроме того, лекарственные средства, ингибирующие реакцию клеток на стресс, а также увеличивающие ангиогенез или улучшающие функцию синапсов, представляют собой особенно предпочтительные варианты осуществления данного изобретения.

Композиции по изобретению, как правило, содержат один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов. Длительность терапии зависит от стадии подлежащего лечению заболевания, применяемой комбинации, возраста и состояния пациента и того, как пациент реагирует на лечение.

Дозировку, частоту и способ введения каждого компонента комбинации можно контролировать независимо. Например, одно из лекарственных средств можно вводить перорально, тогда как второе лекар- 10 019571 ственное средство можно вводить внутримышечно. Комбинированное лечение можно проводить периодическими циклами, включающими перерывы так, чтобы организм пациента имел шанс восстановиться от каких-либо пока еще непредвиденных побочных эффектов. Лекарственные средства также можно формулировать совместно так, чтобы посредством одного введения доставлять все лекарственные средства.

Введение каждого лекарственного средства комбинации можно проводить любыми подходящими способами, которые приводят к концентрации лекарственного средства, которая, в комбинации с другим компонентом, способна к коррекции функционирования путей, вовлеченных в ΆΌ.

Хотя возможно вводить активные ингредиенты комбинации в виде чистых химических веществ, предпочтительно предоставлять их в виде фармацевтической композиции, также означающей в данном контексте фармацевтический состав. Возможные композиции включают композиции, подходящие для перорального, ректального, топического (включая трансдермальное, буккальное и сублингвальное) или парентерального (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное и интрадермальное) введения.

Более часто эти фармацевтические составы предписывают пациенту в упаковках для пациентов, содержащих ряд единиц дозирования или другие средства для введения отмеренных стандартных доз для применения в течение конкретного периода лечения в одной упаковке, как правило, в блистерной упаковке. Упаковки для пациентов обладают преимуществом над традиционными рецептами, где фармацевт отделяет необходимое пациенту количество фармацевтического препарата из общего количества, тем, что пациенту всегда доступен вкладыш в упаковку, содержащийся в упаковке для пациента, обычно отсутствующий в традиционных рецептах. Показано, что включение вкладыша в упаковку улучшает соблюдение пациентом схемы лечения по инструкциям врача. Таким образом, изобретение дополнительно относится к фармацевтическому составу, как описано в настоящем документе ранее, в комбинации с упаковочным материалом, подходящим для указанных составов. В такой упаковке для пациента назначаемое применение состава для комбинаторного лечения можно узнать из инструкций, условий, указаний, согласований и/или других средств, помогающих использованию состава наиболее подходящим для лечения образом. Такие меры делают упаковку для пациента особенно подходящей и адаптированной для использования для лечения комбинацией по настоящему изобретению.

Лекарственное средство может содержаться в подходящем количестве в любом подходящем веществе-носителе, и оно может присутствовать в количестве 1-99 мас.% от общей массы композиции. Композицию можно предоставлять в лекарственной форме, подходящей для перорального, парентерального (например, внутривенно, внутримышечно), ректального, кожного, назального, вагинального, ингаляционного, кожного (пластырь) или глазного способа введения. Таким образом, композиция может находиться в форме, например, таблеток, капсул, пилюль, порошков, гранулированных композиций, суспензий, эмульсий, растворов, гелей, включая гидрогели, паст, мазей, кремов, пластырей, пропиток, устройств с осмотической доставкой, суппозиториев, клизм, препаратов для инъекций, имплантатов, спреев или аэрозолей.

Фармацевтические композиции можно формулировать в соответствии с традиционной фармацевтической практикой (см., например, Кеттдоп: Т1е 8аепсе аиб Ргасбсе о£ Рйаттасу (201й еб.), еб. А.К Сеппато, Ырршсоб: ^1Шат8 & ХУПкит^ 2000 и Епсус1ореб1а о£ Рйаттасеи11са1 Тес1то1оду. еб§. 1. ЕлхагЬпск апб ЕС. Воу1ап, 1988-1999, Магсе1 Эеккег, Ыете Уогк).

Фармацевтические композиции по изобретению можно формулировать для высвобождения активного лекарственного средства, по существу, непосредственно после введения или в любой предопределенный момент или период времени после введения.

Составы с контролируемым высвобождением включают: (ί) составы, создающие, по существу, постоянную концентрацию лекарственного средства в организме в течение длительного периода времени; (ίί) составы, которые после предопределенного периода задержки создают, по существу, постоянную концентрацию лекарственного средства в организме в течение длительного периода времени; (ίίί) составы, которые замедляют действие лекарственного средства в течение предопределенного периода времени, поддерживая относительно постоянный эффективный уровень лекарственного средства в организме с одновременным минимизированием нежелательных побочных эффектов, ассоциированных с колебаниями уровня вещества активного лекарственного средства в плазме; (ίν) составы, локализующие действие лекарственного средства, например, посредством пространственного помещения композиции с контролируемым высвобождением рядом с пораженной тканью или органом или непосредственно в них; и (ν) составы, направляющие действие лекарственного средства с применением носителей или химических производных для доставки лекарственного средства к конкретному намеченному типу клеток.

Введение лекарственных средств в форме состава с контролируемым высвобождением особенно предпочтительно в тех случаях, когда лекарственное средство, отдельно или в комбинации, имеет (ί) узкий терапевтический индекс (т.е. различие между плазматической концентрацией, приводящей к опасным побочным эффектам или токсическим реакциям, и плазматической концентрацией, приводящей к терапевтическому эффекту, является небольшим; в основном, терапевтический индекс, Т1, определяют как отношение средней летальной дозы (ЬП₅₀) к средней эффективной дозе (ΕΌ₅₀)); (ίί) узкое окно всасывания в желудочно-кишечном тракте или (ίίί) очень короткое биологическое время полужизни так, что

- 11 019571 для поддержания уровня в плазме на терапевтическом уровне необходимо частое дозирование в течение суток.

Для достижения контролируемого высвобождения, при котором скорость высвобождения превосходит скорость метаболизма рассматриваемого лекарственного средства, можно осуществлять любой ряд стратегий. Контролируемого высвобождения можно достигать соответствующим выбором различных параметров и ингредиентов состава, включая, например, различные типы композиций и покрытий с контролируемым высвобождением. Таким образом, лекарственное средство формулируют с соответствующими эксципиентами в фармацевтическую композицию, которая после введения высвобождает лекарственное средство контролируемым образом (одно- или многодозовые таблетированные или капсулированные композиции, масляные растворы, суспензии, эмульсии, микрокапсулы, микросферы, наночастицы, пластыри и липосомы).

Твердые лекарственные формы для перорального применения

Составы для перорального применения включают таблетки, содержащие активный ингредиент(ы) в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми эксципиентами. Эти эксципиенты могут представлять собой, например, инертные разбавители или наполнители (например, сахарозу, микрокристаллическую целлюлозу, крахмалы, включая картофельный крахмал, карбонат кальция, хлорид натрия, фосфат кальция, сульфат кальция или фосфат натрия); гранулирующие и дезинтегрирующие средства (например, производные целлюлозы, включая микрокристаллическую целлюлозу, крахмалы, включая картофельный крахмал, кроскармеллозу натрия, альгинаты или альгиновую кислоту); связывающие средства (например, гуммиарабик, альгиновая кислота, альгинат натрия, желатин, крахмал, пептизированный крахмал, микрокристаллическая целлюлоза, карбоксиметилцеллюлоза натрий, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, этилцеллюлоза, поливинилпирролидон или полиэтиленгликоль) и смазки, способствующие скольжению средства и антиадгезивные средства (например, стеариновая кислота, диоксиды кремния или тальк). Другие фармацевтически приемлемые эксципиенты могут представлять собой красители, ароматизаторы, пластификаторы, увлажнители, буферные средства и т.п.

Таблетки могут быть непокрытыми или их можно покрывать известными способами, необязательно, для задержки дезинтеграции и всасывания в желудочно-кишечном тракте и, таким образом, обеспечения пролонгированного действия в течение длительного периода. Покрытие можно подобрать для высвобождения вещества активного лекарственного средства с предопределенным профилем (например, для получения состава с контролируемым высвобождением), или его можно подобрать так, чтобы не происходило высвобождения вещества активного лекарственного средства до прохождения желудка (растворяющееся в кишечнике покрытие). Покрытие может представлять собой сахарную глазурь, пленочное покрытие (например, на основе гидроксипропилметилцеллюлозы, метилцеллюлозы, метилгидроксиэтилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, акрилатные сополимеры, полиэтиленгликоли и/или поливинилпирролидон) или растворяющееся в кишечнике покрытие (например, на основе сополимера метакриловой кислоты, ацетофталата целлюлозы, фталата гидроксипропилметилцеллюлозы, ацетосукцината гидроксипропилметилцеллюлозы, фталата поливинилацетата, шеллака и/или этилцеллюлозы). Можно применять осуществляющее временную задержку вещество, например, такое как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат.

Композиции твердых таблеток могут включать покрытия, адаптированные для защиты композиции от нежелательных химических изменений (например, химическое разрушение до высвобождения вещества активного лекарственного средства). Покрытие можно применять для твердой лекарственной формы способом, подобным тому, что описан в Еисус1ореб1а о£ Рйагтасеийса1 Тсе1шо1оду.

Несколько лекарственных средств можно смешивать в таблетке вместе или их можно разделять. Например, первое лекарственное средство содержится внутри таблетки, а второе лекарственное средство находится снаружи таблетки так, что значительная часть второго лекарственного средства высвобождается до высвобождения первого лекарственного средства.

Составы для перорального применения также можно предоставлять в форме жевательных таблеток или в виде твердых желатиновых капсул, где активный ингредиент смешан с твердым инертным разбавителем (например, картофельный крахмал, микрокристаллическая целлюлоза, карбонат кальция, фосфат кальция или каолин), или в виде мягких желатиновых капсул, где активный ингредиент смешан с водой или масляной средой, например парафиновым маслом или оливковым маслом. Порошки и гранулированные вещества можно получать с использованием ингредиентов, указанных выше для таблеток и капсул, общепринятым способом.

Композиции с контролируемым высвобождением для перорального применения можно получать, например, для высвобождения активного лекарственного средства посредством регулирования растворения и/или диффузии вещества активного лекарственного средства.

Контролируемого высвобождения путем растворения или диффузии можно добиться посредством соответствующего покрытия таблетки, капсулы, драже или гранулированного состава лекарственных средств или помещая лекарственное средство в соответствующий матрикс. Покрытие для контролируемого высвобождения может включать одно или несколько из покрывающих веществ, указанных выше, и/или, например, шеллак, пчелиный воск, гликовакс (§1усо\\ах). гидрированное касторовое масло, карна

- 12 019571 убский воск, стеариловый спирт, глицерилмоностеарат, глицерилдистеарат, пальмитостеарат глицерина, этилцеллюлозу, акриловые смолы, 61-полимолочную кислоту, ацетобутират целлюлозы, поливинилхлорид, поливинилацетат, винилпирролидон, полиэтилен, полиметакрилат, метилметакрилат, 2гидроксиметакрилат, метакрилатные гидрогели, 1,3-бутиленгликоль, этиленгликольметакрилат и/или полиэтиленгликоли. В составе матрикса для контролируемого высвобождения вещество матрикса также может включать, например, гидратированную метилцеллюлозу, карнаубский воск и стеариловый спирт, карбопол 934, силикон, глицерилтристеарат, метилакрилат-метилметакрилат, поливинилхлорид, полиэтилен и/или галогенированный фторуглерод.

Композиция с контролируемым высвобождением, содержащая одно или несколько лекарственных средств заявленных комбинаций, также может находиться в форме плавающей таблетки или капсулы (т.е. таблетки или капсулы, которые после перорального введения плавают сверху содержимого желудка в течение определенного периода времени). Состав плавающей таблетки лекарственных(ого) средств(а) можно получать, гранулируя смесь лекарственных(ого) средств(а) с эксципиентами и 20-75% мас./мас. гидроколоидов, таких как гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза или гидроксипропилметилцеллюлоза. Затем полученные гранулы можно прессовать в таблетки. При контакте с желудочным соком таблетка, по существу, формирует около своей поверхности барьер из водонепроницаемого геля. Этот барьер из геля участвует в поддержании плотности менее чем у желудочного сока, позволяя, таким образом, таблетке оставаться плавать на его поверхности.

Жидкости для перорального введения

Удобными лекарственными формами для перорального введения являются порошки, диспергируемые порошки или гранулы, подходящие для получения водной суспензии посредством добавления воды. Состав в виде суспензии предоставляет активный ингредиент в смеси с диспергирующим средством или увлажнителем, суспендирующим средством и одним или несколькими консервантами. Подходящие суспендирующие средства представляют собой, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, метилцеллюлозу, альгинат натрия и т.п.

Парентеральные композиции

Фармацевтическую композицию также можно вводить парентерально посредством инъекции, инфузии или имплантации (внутривенно, внутримышечно, подкожно или т.п.) в лекарственных формах, составах или посредством подходящих средств доставки или имплантатов, содержащих традиционные, нетоксические фармацевтически приемлемые носители и вспомогательные средства. Состав и получение препаратов таких композиций хорошо известны специалистам в области фармацевтических составов.

Композиции для парентерального применения можно предоставлять в стандартных лекарственных формах (например, в ампулах с однократной дозой) или во флаконах, содержащих несколько доз, в которые можно добавлять подходящий консервант (см. ниже). Композиция может находиться в форме раствора, суспензии, эмульсии, инфузионного устройства или средства доставки для имплантации или ее можно предоставлять в виде сухого порошка для восстановления водой или другим подходящим носителем до использования. Кроме активных лекарственных средств (а), композиция может включать подходящие, приемлемые для парентерального применения носители и/или эксципиенты. Активное лекарственное средство(а) можно помещать в микросферы, микрокапсулы, наночастицы, липосомы или т.п. для контролируемого высвобождения. Композиция может включать суспендирующие, солюбилизирующие, стабилизирующие, регулирующие рН средства и/или диспергирующие средства.

Фармацевтические композиции по изобретению могут находиться в форме, подходящей для стерильной инъекции. Для получения такой композиции подходящее активное лекарственное средство(а) растворяют или суспендируют в приемлемом для парентерального применения жидком носителе. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые можно применять, находятся вода, вода с доведенным до подходящего рН добавлением подходящего количества соляной кислоты, гидроксида натрия или подходящего буфера, 1,3-бутандиол, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Водный состав также может содержать один или несколько консервантов (например, метил, этил или н-пропил пгидроксибензоат). В тех случаях, когда одно из лекарственных средств умеренно или слаборастворимо в воде, можно добавлять увеличивающее растворение средство или солюбилизатор, или растворитель может включать 10-60% мас./мас. пропиленгликоля или т.п.

Парентеральные композиции с контролируемым высвобождением могут находиться в форме водных суспензий, микросфер, микрокапсул, магнитных микросфер, масляных растворов, масляных суспензий или эмульсий. Альтернативно активное лекарственное средство(а) можно помещать в биологически совместимые носители, липосомы, наночастицы, имплантаты или инфузионные устройства. Вещества для применения в получении микросфер и/или микрокапсул представляют собой, например, биоразрушаемые/биоэродируемые полимеры, такие как полигалактин, поли(изобутилцианоакрилат), поли(2гидроксиэтил-Ь-глутамин). Биологически совместимые носители, которые можно использовать при формулировании парентерального состава с контролируемым высвобождением, представляют собой углеводы (например, декстраны), белки (например, альбумин), липопротеины или антитела. Вещества для применения в имплантатах могут не являться биоразрушаемыми (например, полидиметилсилоксан) или биоэродируемыми (например, поли(капролактон), поли(гликолевая кислота) или поли(сложные ортоэфиры)).

- 13 019571

Ректальные композиции

Для ректального применения подходящие лекарственные формы для композиции включают суппозитории (эмульсионного или суспензионного типа) и ректальные желатиновые капсулы (растворы или суспензии). В типичном составе суппозитория активное лекарственное средство(а) комбинируют с соответствующей фармацевтически приемлемой основой суппозитория, такой как масло какао, этерифицированные жирные кислоты, глицеринированный желатин и различные водорастворимые или диспергируемые основания, такие как полиэтиленгликоли. Можно добавлять различные добавки, усилители или поверхностно-активные вещества.

Вводимые через кожу и топические композиции

Фармацевтические композиции также можно вводить топически на кожу для чрескожного всасывания в лекарственных формах или составах, содержащих традиционные нетоксические фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты, включая микросферы и липосомы. Составы включают кремы, мази, лосьоны, линименты, гели, гидрогели, растворы, суспензии, карандаши, спреи, пасты, пластыри и другие разновидности систем трансдермальной доставки лекарственных средств. Фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты могут включать эмульгаторы, антиоксиданты, буферные средства, консерванты, увлажнители, усилители впитывания, хелатирующие средства, формирующие гель средства, мазевые основы, отдушки и средства защиты кожи.

Эмульгаторы могут представлять собой природные камеди (например, гуммиарабик или трагакантовую камедь).

Консерванты, увлажнители, усилители впитывания могут представлять собой парабены, такие как метил- или пропил-п-гидроксибензоат и хлорид бензалкония, глицерин, пропиленгликоль, мочевина и т.д.

Фармацевтические композиции, описанные выше для топического введения на кожу, также можно использовать применительно к топическому введению на часть организма, подлежащую лечению, или рядом с ней. Композиции можно адаптировать для непосредственного применения или для применения посредством специальных средств доставки лекарственных средств, таких как повязки или, альтернативно, пластыри, прокладки, губки, полоски или другие формы подходящего эластичного материала.

Дозировки и длительность лечения

Следует понимать, что лекарственные средства комбинации можно вводить одновременно, в одном или различных фармацевтических составах или последовательно. Если производится последовательное введение, задержка введения второго (или дополнительного) активного ингредиента не должна быть такой, чтобы пропало преимущество эффективного действия комбинации активных ингредиентов. Минимальное требование для комбинации по данному описанию состоит в том, что комбинация должна быть предназначена для комбинированного применения с преимуществом эффективного действия комбинации активных ингредиентов. Назначаемое применение комбинации можно узнать из условий, указаний, согласований и/или других средств, помогающих использованию комбинации по изобретению.

Хотя активные лекарственные средства по настоящему изобретению можно вводить дробными дозами, например два или три раза в сутки, предпочтительной является одна суточная доза каждого лекарственного средства в комбинации, где наиболее предпочтительной является одна суточная доза всех лекарственных средств в одной фармацевтической композиции (стандартная лекарственная форма).

Термин стандартная лекарственная форма относится к физически дискретным единицам (таким как капсулы, таблетки или наполняемый цилиндр шприца), подходящим в качестве однократных доз для людей, где каждая единица содержит предопределенное количество активного вещества или веществ, рассчитанных для оказания желаемого терапевтического эффекта, совместно с необходимым фармацевтическим носителем.

Введение можно проводить от одного до нескольких раз в сутки в течение от нескольких суток до нескольких лет, и оно может продолжаться даже в течение всей жизни пациента. В большинстве случаев показано постоянное или, по меньшей мере, периодически повторяющееся долговременное введение.

Кроме того, на применяемые дозы может влиять фармакогеномная (влияние генотипа на фармакокинетический, фармакодинамический профили или профиль эффективности лечения) информация о конкретном пациенте.

За исключением того, когда в ответ на особенно поражающие случаи болезни ΆΌ могут требоваться более высокие дозы, предпочтительная доза каждого лекарственного средства в комбинации, как правило, лежит в диапазоне доз, не превышающих доз, как правило, прописываемых для долговременного поддерживающего лечения, или доз, для которых доказана безопасность в крупномасштабных клинических исследованиях 3 фазы. Например, наиболее предпочтительная доза соответствует количествам от 1 до 10% количеств, как правило, прописываемых для долговременного поддерживающего лечения:

фенформин перорально приблизительно от 0,5 до 5 мг в сутки и рифабутин перорально приблизительно от 6 до 60 мг в сутки;

фенформин перорально приблизительно от 0,5 до 5 мг в сутки и арабит перорально приблизительно от 50 до 500 мг в сутки;

тадалафил перорально приблизительно от 0,05 до 0,5 мг в сутки и омепразол перорально приблизительно от 0,4 до 4 мг в сутки;

- 14 019571 цилостазол перорально приблизительно от 1 до 10 мг в сутки и омепразол перорально приблизительно от 0,4 до 4 мг в сутки;

фенформин перорально приблизительно от 0,5 до 5 мг в сутки и дазатиниб перорально приблизительно от 1 до 10 мг в сутки;

дазатиниб перорально приблизительно от 1 до 10 мг в сутки и акампросат перорально приблизительно от 7 до 70 мг трижды в сутки;

дазатиниб перорально приблизительно от 1 до 10 мг в сутки и тербинафин перорально приблизительно от 2,5 до 25 мг однократно или дважды в сутки.

Следует понимать, что фактически вводимое количество лекарственного средства определяет лечащий врач в зависимости от соответствующих обстоятельств, включающих состояние или состояния, подлежащие лечению, точной композиции для введения, возраст, массу и ответ индивидуального пациента, тяжесть симптомов пациента и выбранный способ введения. Таким образом, указанные выше диапазоны доз предназначены для предоставления общего руководства и помощи для указаний по настоящему документу, но не предназначены для ограничения объема изобретения.

Следующие примеры приведены с целью иллюстрации, а не в порядке ограничения.

Примеры

Тестирование лекарственных средств с использованием анализов ΐη υϊΙιό

Анализы ίη νίίτο представляют собой эффективный способ для улучшения лекарственных средств и их комбинаций, действующих на пути, вовлеченные в ΆΌ. Лекарственные средства по настоящему изобретению и их комбинации оптимизируют по действию в специфичных анализах ίη νίίτο, адаптированных в соответствии с сетью ΛΌ, идентифицированной в настоящем изобретении. Затем эти молекулы или их комбинации тестируют в модели ΛΌ ίη νίνο.

Эти тесты ίη νίίτο начинаются с изучения уровня экспрессии гена АРР с последующими анализами нейропротективного потенциала лекарственных средств для клеток, подвергаемых токсическому действию белка Αβ. Лекарственные средства для вовлеченных путей тестируют индивидуально с последующими анализами их комбинаторного действия. На последующем этапе наиболее эффективные комбинации, действующие на мишени в отдельных путях, комбинируют и тестируют в тестах нейропротективности.

Регуляция экспрессии АРР представляет собой важную точку для лечения ΛΌ, так как она расположена до образования конкретных токсических фрагментов и их действия на множество систем головного мозга, в конечном счете, приводя к разрушению когнитивных функций. При ΆΌ белок формирует агрегаты нерастворимых β-складчатых слоев фибриллярного белка Ав (амилоида). По-видимому, конформационные изменения из растворимой в фибриллярную форму являются самопроизвольным событием, частота которого увеличивается с увеличением концентраций Ав так, что любая продукция увеличенных количеств Ав по сравнению с нормальными (или продукция более крупных, менее растворимых форм Ав) приводит к усилению формирования бляшек. После начала формирования бляшки другие молекулы могут взаимодействовать с образующейся бляшкой с получением, в конечном счете, зрелой бляшки с ассоциированными с нею областями гибели нервных клеток. Учитывая это, авторы изобретения отдали приоритет тестированию действия лекарственных средств на жизнеспособность клеток, подвергаемых действию β-амилоидного белка.

Культура клеток РС 12

Клетки РС 12 (феохромоцитома крыс, номер АТСС: СКЬ-1721) из АТСС (АТСС СКЬ-1721) быстро размораживали в воде с температурой 37°С. Супернатант сразу же помещали в 9 мл среды для пролиферации РС 12, содержащей модифицированную Дульбекко среду Игла ΌΜΕΜ-Ε12 (номер Ран Вю1сс11: Р04-41450) с 15% инактивированной нагреванием лошадиной сыворотки (номер Ιηνίίτο^βη: 16050-130), 2,5% эмбриональной телячьей сыворотки (ЕВ8; номер Ιηνίίτο^βη: 16000-036), 1% пенициллина 10000 Ед/мл и стрептомицина 10 мг/мл (Р8; номер Раη ΒίοΙοοΙι: Р06-07100) и 1% Ь-глутамина 200 мМ (номер Раη Вю1сс11: Р04-80100).

Клетки центрифугировали (800 об./мин, 4°С в течение 5 мин) и добавляли в 5 мл среды для пролиферации РС 12, жизнеспособные клетки подсчитывали с применением счетной камеры Малассе с применением теста исключения нейтрального красного (81дта).

Затем клетки сеяли при 3х10⁴ клеток на 1 см² в среде для пролиферации РС 12 в 75 см² пластиковые флаконы (Сгстсг ВсГ: 658175), предварительно покрытые поли-Ь-лизином (10 мкг/мл, номер 81дта: Р2636).

Среду меняли через сутки. Через 3 суток культивирования, когда клетки достигали 80% конфлюентности, их отмывали в ΗΒδδ без кальция и магния (номер Раи Вю1сс11: Р06-33500) и инкубировали в ЭДТА с трипсином (0,05%, номер Раи Вю1сс11: Р10-023100). Ферментативную реакцию останавливали средой для пролиферации РС 12 с добавлением 0,5 мг/мл ДНКазы 1 степени 2 (номер Раи Вю1сс11: Т6037780100). Затем РС 12 центрифугировали (800 об//мин при 4°С в течение 10 мин) и клетки высевали при плотности 2,9х10⁴ на 1 см² в 175 см² флакон для культивирования (номер Сгстсг: 661195), предварительно покрытый поли-Ь-лизином.

- 15 019571

Интоксикация и анализ жизнеспособности с МТТ

Клетки РС 12 (пассаж № 2) высевают, исходя из 3300 клеток на 1 см² в 96-луночные планшеты (номер Стешет: 655180), предварительно покрытые нейробазальной средой (Ιηνίΐτο^βη, номер: 21103049) с поли-Ь-лизином (81дта), содержащей В27 (2%, Ιηνίΐτο^η, номер: 21103049), пенициллин (50 Ед/мл), стрептомицин (50 мкг/мл) и глутамин (1%) и 50 нг/мл ΝΟΕ (81дта номер: N1408). ΝΟΕ позволяет РС 12 дифференцироваться в клетки, подобные симпатическим нейронам.

Через 5 суток культивирования среду заменяют нейробазальной средой с добавлением ΝΟΕ (50 нг/мл), В27 без антиоксиданта, глутамина и антибиотиков. Через 24 ч клетки инкубируют в течение 1 ч с лекарственными средствами при 5 концентрациях, по 6 лунок на условие. Через 1 ч предварительной инкубации клетки интоксицируют 10 мкМ β-амилоида (25-35; 81дта) вместе с добавлением лекарственных средств в среде для культивирования клеток. Через 24 ч клетки однократно отмывают РВ8 (Ραη Βίο1есй, номер: Р04-36100) и жизнеспособность клеток РС 12 оценивают посредством теста жизнеспособности с МТТ (3-[4,5-диметилтиазолил-2-ил]-2,5-дифенилтетразолийбромид).

Клеточная культура кортикальных нейронов

Первичные кортикальные нейроны крысы культивируют, как описано в §1ндег е1 а1., 1999. В кратком изложении беременных самок крыс на 15 сутки беременности умерщвляют посредством смещения шейных позвонков (крысы \УЬ1аг; 1ану1ег) и из матки выделяют эмбрионы. Выделяют кору и помещают в охлаждаемую на ледяной бане среду Лейбовица (Ь15; Ιηνίΐτο^η), содержащую 1% пенициллинастрептомицина (Р8; Ιηνίΐτο^η) и 1% бычьего сывороточного альбумина (В8А; 81дша). Кору подвергают диссоциации посредством трипсинизации в течение 20 мин при 37°С (трипсин-ЭДТА IX; Ιηνίΐτο^η, разбавленный в РВ8 без кальция и магния). Реакцию останавливают добавлением модифицированной Дульбекко среды Игла (ΌΜΕΜ; Ιηνίΐτο^η), содержащей ДНКазу Ι степени ΙΙ (0,1 мг/мл; Роейе ΌίίίβηοδΙίο) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЕС8; Ιηνίΐτο^η). Затем клетки механически диссоциируют посредством 3 пассажей через 10 мл пипетку. Затем клетки центрифугируют при 180/д в течение 10 мин при 10°С. Супернатант удаляют и клетки осадка ресуспендируют в среде определенного состава для культивирования, состоящей из №игоЬа8а1 (Ιηνίΐτο^η), дополненной В27 (2%; Ιηνίΐτο^η), Ь-глутамином (0,2 мМ; Ιηνίΐτο^η), 1% раствором Р8 и 10 нг/мл нейротрофического фактора головного мозга (ΒΌΝΡ, Раи Вю1ее11). Жизнеспособные клетки подсчитывают в цитометре Нейбауэра с применением теста исключения трипанового синего. Клетки высевают при плотности 30000 клетки/лунку в 96-луночные планшеты (лунки предварительно покрыты поли-Ь-лизином (10 мкг/мл; 81дта)) и культивируют при 37°С во влажной атмосфере воздуха (95%)/СО₂ (5%).

Через 6 суток культивирования клетки инкубируют с лекарственными средствами (5 концентраций). Через 1 ч клетки подвергают интоксикации 20 мкМ β-амилоида (25-35; 8щта) в среде определенного состава без ΒΌΝΕ, но с лекарственными средствами. Кортикальные нейроны подвергают интоксикации в течение 2 суток. ΒΌΝΡ (10 нг/мл) используют в качестве положительного (нейропротективного) контроля.

Анализ активности лактатдегидрогеназы (ЬБН)

Через 2 суток культивирования супернатант собирают и анализируют с применением набора СуЮΙοχίοίΙν ^еΐесΐ^οη Κίΐ (ЬИН, Росйе Аррйеб 8с1ег1се5). Данный колориметрический анализ для количественного анализа гибели клеток основан на измерении активности лактатдегидрогеназы (ЬИН), высвобождаемой из цитозоля погибших клеток в супернатант. Оптическую плотность (ИО) определяют на спектрофотометре при длине волны 492 нм на мультисканирующем устройстве (Τίκηηο. РеГ АбсегИ). Результаты выражают в виде процента жизнеспособных клеток по сравнению с отрицательным контролем (носителем).

Результаты

Результаты, представленные на фиг. 1 и 2, получены на двух независимых культурах, 6 лунок на условие. Все значения выражены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего. На исходных данных проводили анализ по двустороннему критерию Стьюдента. Результаты выражают в виде процента длины нейритов по сравнению с контролем (носителем).

За один час перед интоксикацией 10 мкМ Αβ_25-3₅, которая длится 24 ч, дифференцированные под действием ΝΟΕ клетки РС 12 инкубируют с лекарственными средствами.

Через сутки после этой инкубации количественно определяют жизнеспособность дифференцированных под действием ΝΟΕ РС 12 с использованием анализа с МТТ. Авторы изобретения наблюдали, что 2 лекарственных средства оказывали явное нейропротективное действие в отношении этой интоксикации Αβ_25-35 (фиг. 1).

За час перед интоксикацией 20 мкМ Αβ_25-35, которая длится 2 суток, первичные кортикальные нейроны крыс инкубируют с лекарственными средствами. Через двое суток после этой инкубации количественно определяют высвобождение ЬИН в среду, отражающее уровень гибели клеток. Авторы изобретения наблюдали, что 3 лекарственных средства оказывали явное протективное действие в отношении этой интоксикации Αβ_25-35 (фиг. 2).

- 16 019571

Тесты ΐη νίνο

Соединения и их комбинации, активные в тестах ίη νίΙΐΌ. тестировали в модель болезни Άльцгеймера ίη νίνο. Наиболее надежным средством стимуляции отложения Άβ в головном мозге трансгенных мышей, которое служило в качестве моделей болезни ΑΌ в многочисленных исследованиях, служила сверхэкспрессия трансгенов сцепленного с болезнью Άльцгеймера мутантного предшественника белка амилоида β (ΆΡΡ) человека. По мере взросления у этих мутантных по ΆΡΡ мышей развивается сильная патология амилоида и другие ΑΌ-подобные признаки, включая сниженную плотность синапсов, реактивный глиоз и некоторые когнитивные расстройства. Во многих моделях на мутантных по ΆΡΡ мышах подтверждено мало доказательств явной потери нейронов и патологии нейрофибриллярных клубков (ΝΡΤ). Мыши, гемизиготные по этому трансгену ΒΚΙ-Λβ₄₂, жизнеспособны и фертильны с нормальной продолжительностью жизни. мРНК трансгенного ΒΚΙ-Άβ₄₂ экспрессируется с профилем, характерным для промотора прионного белка мыши; наибольшие уровни экспрессии трансгена выявляют в мозжечковых гранулоцитах и гиппокампе, за которыми следуют кора, варолиев мост, таламус и средний мозг. В трансгенном слитном белке Άβι_-42 слит с С-концом белка ΒΚΙ по фуриноподобному участку расщепления так, что расщепление приводит к эффективной секреции Άβ_μ42 в просвет сосуда или внеклеточное пространство. Таким образом, эти мыши специфично экспрессируют изоформу Άβ_μ42. У гемизиготных по ΒΚΙ-Άβ₄₂ мышей с возрастом накапливается не растворимый в детергенте амилоид-β и в мозжечке развиваются бляшки с ядром уже в возрасте 3 месяцев. Развитие патологии переднего мозга происходит позже, внеклеточные бляшки Άβ не присутствуют постоянно в гиппокампе и энторинальной/пириформной коре до возраста 12 месяцев. Отложения амилоида β (бляшки с ядром) можно наблюдать уже в 3 месяца в молекулярном слое мозжечка трансгенных мышей, и они с возрастом становятся более четко выраженными; эпизодические внеклеточные бляшки наблюдают в энторинальной/пириформной коре и гиппокампе в возрасте 6 месяцев, но систематически их не наблюдают до возраста >12 месяцев. Мыши с очень большим возрастом демонстрируют обширную патологию с бляшками с ядром и с диффузными бляшками в мозжечке, коре и гиппокампе и в обонятельной луковице. Во внеклеточных амилоидных бляшках наблюдают плотные амилоидные ядра с исходящими из центра фибриллами; на периферии этих бляшек наблюдают множество пучков дистрофичных нейритов. С бляшками ассоциирован реактивный глиоз.

Терапия лекарственными средствами

Трансгенных по Тд (Ρτηρ-ΙΤΜ2Β/ΑΡΡ695*42) Α12Ε мышей тс (43) получали из лаборатории 1аскκοη ЬаЬога1огу (1Шр://)ахт1се.)ах.огд/51гат/007002.111т1). Мышей-основателей с наивысшими уровнями Άβ₄₂ в плазме, линию ΒΚΙ-Άβ_42Ά (12е), поддерживали на основе скрещивания с В6С3. Взрослые самцы трансгенных мышей имели свободный доступ к пище и воде. В соответствии с одобренным ΙηκΙίΙιιΙίοηηΙ Απί!!!;·!! Саге аЫ Ике СоттШее протоколом мышей взвешивали и им однократно в сутки в течение от 10 до 20 последовательных недель и/п вводили или принудительно скармливали контрольный раствор (плацебо) или лекарственные средства РХТ, полученные в различных дозах.

Анализ выживаемости

Коэффициент выживаемости анализировали с использованием способов Каплана-Мейера. Для всех тестов попарного множественного сравнения использовали способы Холма-Сидака (апостериорные). Все случаи гибели от посторонних причин исключали. Все сравнения проводили между потомством одного помета для ограничения любых потенциально смещающих эффектов вследствие различий фоновой линии.

Поведенческие тесты

Поведенческие тесты разрабатывали и проводили в соответствии со способами, опубликованными различными авторами (44-47).

Пространственное обучение и память в водном лабиринте Морриса (М^М)

Этот эксперимент проводят в круглом бассейне диаметром 90 см, сделанном из белого пластика и заполненном окрашенной в молочно-белый цвет водой. На 0,5 см ниже уровня воды затопляли платформу для выхода диаметром 8 см, сделанную из прозрачного пластика. Зрительные ориентиры обеспечивают посредством различных геометрических форм, напечатанных на листах формата Ά4 и размещенных на четырех окружающих стенах (дистанция от бассейна составляла от 50 до 70 см). Каждой мыши давали четыре попытки ежедневно (интервал между попытками составлял от 5 до 7 мин, всего 16 попыток) в течение 4 суток. Каждую попытку проводили с одной из четырех различных стартовых точек. За движением мышей наблюдали с применением программного обеспечения У1бео1гаск 8оП\уаге (У1ете Ροίηΐ). Определяли время, затраченное на нахождение платформы для выхода (задержка выхода до 60 с). После нахождения платформы мыши позволяли сидеть на ней в течение 15 с. Мышей, которые не смогли найти платформу в течение 60 с, направляли к ней и позволяли оставаться на ней в течение 15 с. В таком случае в запись помещали задержку в 60 с. Для статистического анализа все четыре попытки в сутки усредняли, за исключением первой попытки на сутки 1. На сутки 9 (через 5 суток после последней тренировки) мышам предоставляли 60-секундную пробную попытку, в которой платформу убирали и мышам позволяли ее искать. Время, которое каждое животное затрачивало в каждом квадранте, записывали (время поиска

- 17 019571 в квадранте). Использовали несколько групп самцов мышей на 3, 7, 10 и 12 месяцах.

Некоторое небольшое количество мышей продемонстрировало замирание (например, неподвижное нахождение в воде и отказ плавать), что сильно препятствовало тесту, этих животных исключали из анализа.

Все поведенческие тесты проводили в тихих условиях с уменьшенной интенсивностью света.

Тест кратковременной памяти в водном лабиринте с радиальными лучами

Эту основанную на когнитивных способностях сенситивную меру кратковременной памяти получали с помощью устройства, состоящего из заполненного водой бассейна диаметром 100 см (также используемого для водного лабиринта Морриса и задач распознавания платформы), оборудованного алюминиевой вставкой с получением шести радиально располагающихся плавательных дорожек. Тестирование состоит из пяти попыток длительностью 1 мин за ежедневный сеанс в течение 9-12 последовательных суток. В начале каждого сеанса в конце одной из плавательных дорожек (случайно выбираемой, ежедневно изменяемой) помещали прозрачную затопленную платформу. Для каждой из первых четырех попыток обнаружения животное помещали на одну из дорожек, не содержащих платформы (в случайной последовательности), и позволяли ему искать платформу. В течение 60 с попытки каждый раз, когда животное попадало на дорожку, не содержащую платформы, ее осторожно возвращали в ее исходное положение и ошибку записывали. Через четыре попытки животному позволяли отдохнуть в течение 30 мин с последующей пятой (ретенция) попыткой, которую начинали в последней плавательной дорожке, не содержащей платформы. Для каждой попытки записывают количество ошибок (некорректный выбор дорожки) и задержку выхода (время достижения платформы, максимально 60 с).

Узнавание и запоминание пространственных ориентиров в тесте на круговой платформе

Этот тест с задачей на основе когнитивных способностей проводили с помощью устройства, состоящего из круговой платформы диаметром 69 см с 16 отверстиями для бегства, эквидистантно расположенными по окружности. Под одним из отверстий располагают укрытие для бегства и платформу окружают черной занавеской, на которой располагаются различные визуальные ориентиры. Животное вначале одной 5 мин попытки помещают в центр платформы и предъявляют негативные стимулы (яркий свет, поток воздуха из вентилятора). Записывают общее количество ошибок (засовывание головы в отверстия без укрытия) и задержку выхода (время до достижения отверстия с укрытием).

Способность к распознаванию в тесте распознавания платформы

Задача поиска на основе когнитивных способностей оценивает способность к идентификации и распознаванию объектов. Объект-мишень состоит из круговой платформы диаметром 9 см, с нанесенным черным знаком 10x40 см, расположенную на 0,8 см выше поверхности воды в круговом бассейне диаметром 100 см. Тестирование состоит из четырех 60 с попыток в сутки в каждые из четырех последовательных суток. В каждые сутки объект-мишень помещают в различные квадранты бассейна для каждой попытки, и животное выпускают в том же расположении окружности бассейна для всех четырех попыток. Для каждой попытки записывают общую задержку (максимум 60 с).

Модифицированный тест Ирвина

Для определения того, демонстрирует ли какая-либо из мышей физиологическую, поведенческую или сенсомоторную недостаточность, связанную с ее генотипом, использовали комплексный скрининг, модифицированный на основе теста Иривина. Для исследования двигательных навыков, координации и мышечной силы мышей помещали на проволоку, которую натягивали между двумя столбиками высотой 30 см и оценивали их способность балансировать на проволоке. Кроме того, определяют их способность хвататься и висеть на проволоке всеми четырьмя лапами в течение по меньшей мере 5 с и забираться на проволоку.

Количественное определение накопления амилоида в сосудах

Для количественного определения церебральной амилоидной ангиопатии (САА) проводили иммуноокрашивание погруженных в парафин срезов толщиной 5 мкм через мягкую и паутинную оболочки теменной коры или коры мозжечка с интервалами 30 мкм биотинилированным антителом АЬ9 (антитело к А131-16, 1:500) в течение ночи при 4°С (п=5-7 мышей на генотип в каждой возрастной группе, п=6 срезов на мышь). Положительно окрашенные кровеносные сосуды оценивали визуально с использованием модифицированной системы оценки Вонсаттеля (48). Показатель тяжести САА рассчитывают, умножая количество сосудов с САА на степень тяжести САА.

Гистология: иммуногистохимия и иммунофлуоресценция

Мышей Тд и \УТ в возрасте от 3 до 12 месяцев анестезируют и транскардиально последовательно перфузируют 0,9% ЫаС1 и 4% параформальдегидом в 0,1 моль/л фосфатно-солевом буфере (РВ8) (рН 7,4) или 10% формалином и 4% параформальдегидом в 0,1 моль/л РВ8 (рН 7,4). Головной и спинной мозг выделяли и хранили в 4% параформальдегиде. Некоторые образцы помещали в парафин и нарезали на скользящем микротоме с толщиной 10 мкм. В криостате нарезали криосрезы (14 мкм) и помещали на покрытые хромовыми квасцами предметные стекла. Эндогенную пероксидазу гасят обработкой среза метанолом, содержащим 0,3% Н₂О₂, в течение 30 мин. Срезы блокируют в 10% лошадиной сыворотке. Используют первичные антитела и инкубируют в течение ночи при 4°С в присутствии 1% лошадиной сыворотки. Все вторичные биотинилированные или конъюгированные с флуоресцеином-, техасским

- 18 019571 красным и АМСА антитела, флуорохромы, набор АВС и 3,3'-диаминобензидин в качестве хромогена для выявления активности пероксидазы получены из Уес1ог ЬаЬогаФпек. Инкубацию с вторичным антителом проводят при комнатной температуре в течение 1 ч. Все этапы отмывки (3-10 мин) и разбавления антител проводят с применением фосфатно-солевого буфера (0,1 моль/л РВ8, рН 7,4) или забуференного Тп8 физиологического раствора (0,01 моль/л ТгБ. 0,15 моль/л №С1, рН 7,4). Инкубацию с комплексом АВС и детекцию 3,3'-диаминобензидином проводят по инструкции производителя. Контрастное окрашивание гематоксилином проводят стандартными способами. Для каждого определения используют минимум три мыши на генотип, возраст и пол (49).

Получение экстрактов головного мозга

Головной мозг быстро извлекали на льду между 90 и 120 мин после последней инъекции и замораживали до -80°С. После замораживания правую полусферу головного мозга каждой мыши взвешивали. Анализ массы полусферы посредством среднего абсолютного отклонения позволил авторам изобретения исключить образцы за пределами 4 средних абсолютных отклонений от остального набора. Полусферы головного мозга гомогенизировали и по инструкциям производителя получали содержащие общий белок клеточные лизаты для наборов ферментативного анализа (Κ&Ό 8ув1еш8, 1пс.). В кратком изложении, кору головного мозга гомогенизируют в 800 мкл низкосолевого раствора, содержащего 1хбуфер для экстракции (Κ&Ό кб), и инкубируют на льду в течение 10 мин. Затем гомогенаты центрифугируют при 13000хд в течение 15 мин при 4°С. Концентрацию белка в каждом образце оценивают в соответствии с биуретовым анализом (Р1егсе). Уровни АРР, Λβ40 и Λβ42 измеряют посредством способов вестерниммуноблоттинга и сэндвич-ЕЬ18А, соответственно, как описано (41). Кроме того, в тех же экстрактах можно измерять активность α-, β- и γ-секретаз.

Анализ уровней общего АРР в экстрактах коры головного мозга мыши

В каждый гель помещали экстракты головного мозга с равным количеством белка, 30 мкг на дорожку на образец. Каждый гель содержал восемь видов обработки: контроль; лекарственное средство 1 в дозе 7,5 мг/кг и лекарственное средство 2 в нескольких дозах. Для минимизации различий между гелями каждый гель содержал три набора всех групп обработки. Каждый блот метят антителом 22С11. Каждый блот также метят антителом к β-актину для нормализации эффективности переноса. Интенсивность сигнала полосы АРР нормализуют на сигнал β-актина. В каждый гель/блот помещают два образца контроля для тестирования на различия от блота к блоту. Анализ блотов проводят двумя способами: по блотам (п=3) для тестирования различий от геля к гелю; и с объединением блотов (п=9 или 10), как описано (5051). Анализ по блотам с п=3 показал ту же тенденцию, что и конечный анализ с п=9 или 10. Представлены результаты комбинированного анализа.

Сэндвич-ЕЫ8А Αβ

При ЕБ18А Аβ головного мозга уровни Аβ переднего мозга и заднего мозга определяют независимо, а обонятельную луковицу исключают из анализа. Для анализа Аβ плазмы собирают кровь в покрытые ЭДТА пробирки после пункции сердца. Образцы крови центрифугируют при 3000 об./мин в течение 10 мин при 4°С, и плазму разделяют на аликвоты и хранят при -80°С до использования. Уровни Аβ определяют посредством специфичного к концам сэндвич-ЕЬ18А с использованием АЬ9 (АЬ к Аβ1-16) в качестве иммобилизующего АЬ для Аβ40, 13.1.1-НКР ^β к Аβ35-40) в качестве детектирующего АЬ для Аβ40, 2.1.3 ^β к Аβ35-42) в качестве иммобилизующего АЬ для Аβ42 и АЬ9-НКР в качестве детектирующего АЬ для Аβ42 (п=5-7 мышей на генотип в каждой возрастной группе). Уровни Аβ нормализуют относительно предыдущих результатов с использованием тех же групп мышей в качестве внутренних контролей для минимизации возможной вариабельности ЕБ18А, как описано (41).

Вестерн-блоттинг

Быстрозамороженные образцы переднего мозга гомогенизируют в буфере для радиоиммунопреципитационного анализа (К1РА) (Во51оп ВюРгобпсК ХУогсеЦег, МА) с 1% смесью ингибиторов протеаз (Косйе). Гомогенат центрифугируют при 100000 хд в течение 1 ч при 4°С. Концентрацию белка в супернатантах определяют с использованием анализа белка ВСА (Р1егсе). Образцы белка (20 мкг) разделяют в гелях В18-Тп8 12% ХТ или В18-Тт18 4-12% ХТ (Вю-Каб, Нетси1е8, СА) и переносят на 0,2 мкм нитроцеллюлозные мембраны. Блоты дважды подвергают микроволновой обработке в течение 2 мин в 0,1 М РВ8 и метят АЬ 82Е1 (антитело к А131-16, 1:1000; 1ВЬ, Оипша, 1арап) и антителом к С-концевым 20 аминокислотам АРР (1:1000), как описано (41). Блоты отмывают и повторно метят антителом к β-актину (1:1000; 81дша) в качестве контроля загрузки. Относительную интенсивность полос измеряют с применением программного обеспечения Ийаде!

Количественное определение отложения паренхимального амилоида

Полушария фиксируют погружением в 10% формалин и обрабатывают для заливки в парафин. Тканевые срезы головного мозга (5 мкм) подвергали иммуноокрашиванию антителом (АЬ) к общему Аβ. Срезы контрастно окрашивали гематоксилином. Для количественного определения использовали шесть срезов на мозг через гиппокамп, пириформную кору (брегма, от -1,70 до -2,80 мм) или мозжечок (околоклочок, петлевидная ножка и простые дольки; брегма, от -5,40 - -6,36 мм) (п=5-7 на генотип в каждой возрастной группе). Массу бляшек Аβ определяют с применением программного обеспечения Ме1а

- 19 019571

МогрН (Мо1еси1аг Ωονίοοδ. Ра1о Αΐΐο. ΟΆ). Для количественного анализа бляшек с ядром ряд их серийных срезов, анализируемых на массу Αβ, окрашивают тиофлавином 8 (ТНю8) и подсчитывают количество положительных по ТЫо8 бляшек в гиппокампе, энторинальной/пириформной коре или мозжечке. Все указанные выше анализы проводят слепым способом.

Статистический анализ данных ΐη νίνο

Результаты всех экспериментов анализировали с применением 8ΤЛΤI8ΤIСЛ 8.0 (8!а!зой). Уровни Αβ, массу амилоидных бляшек и тяжесть САА анализировали с использованием дисперсионного анализа с тестом апостериорного множественного сравнения Холма-Сидака или двусторонним критерием Стьюдента. Если набор данных не удовлетворяет гипотезам параметрических тестов, применяли или критерий Крускала-Уоллиса с последующим апостериорным множественным сравнением Данна, или критерий суммы рангов Манна-Уитни. Для тестирования того, согласуются ли уровни Ав у битрансгенных мышей с аддитивной суммой уровней Ав в потомстве одного помета с одним трансгеном, используют множественную линейную регрессию без теста пересечения. Все сравнения проводят между потомством одного помета.

Моделирование ответа на лекарственные средства проводят, исключая контрольные образцы (0 мг/кг). ΕΌ₅₀ соответствует дозе (мг/кг), необходимой для индукции 50%, от индуцированного лекарственным средством в экспериментах максимального ответа. Его рассчитывают с использованием модели уравнения Хилла для 1од ΕΌ₅₀.

Библиография

1. Сгоок К., Уегккоп1еш1 Α., е! а1. (1998). Α уапап! ой б1зеазе \\ЙН зразйс рагарагезк апб ипизиа1 р1ас.|иез бие !о бе1ейоп ой ехоп 9 ой ргезепЛп 1. №й Меб. 4 (4):452-5.

2. Нои1беп Н., Вакег М., е! а1. (2000). Уапап! Л1ζйе^те^'з б1зеазе тейй зразйс рагарагез1з апб сойоп \гоо1 р1ас.|иез 1з саизеб Ьу Р8-1 ти!айопз !На! 1еаб !о ехсерйопайу Ыдй ату1о1б-Ье!а сопсепйайопз. Лηη №иго1. 48 (5):806-8.

3. Клгок Й.В., Таббе1 К., е! а1. (1997). Т\го поуе1 (М233Т апб К278Т) ргезепЛп-1 ти!а!юпз ш еаг1у- опзе! б1зеазе ребфгеез апб ргейттагу еу1бепсе йог аззоаайоп ой ргезепЛп-1 ти!а!юпз \\ЙН а поуе1 рНепо!уре. №игогерой. 8 (6):1537-42.

4. Уегккошет1 Α., КаНто Н., е! а1. (2001). Уапап! Α1ζйе^те^ б1зеазе \\ЙН зразйс рагарагезк: пеигора11ю1ощса1 рНепо!уре. к №игораЛо1. Ехр. №иго1. 60(5):483-92.

5. Сйгоп М. (2004). 8йа!ед1ез йог б1зеазе тобйюайоп т Л1ζНе^те^'з б1зеазе. Νι! Кем №игозск 5(9):677-85.

6. 8иН Υ.Η. апб СНес1ег Е. (2002). Лту1ο^б ргесигзог рго1ет, ргезепЛпз, апб а1рйа-зупис1ет: то1еси1аг раЛодепез1з апб рйагтасо1одюа1 аррйсайопз т Л1ζНе^те^'з б1зеазе. РНагтасо1. Кем. 54 (3):469-525.

7. В1аскег Ό., Α1^ή М.8., е! а1. (1994). КейаЬййу апб уайбйу ой NINС^8-Л^К^Л сгйейа йог Α1ζНеппегА б1зеазе. ТНе №11юпа1 1пзЛи!е ой Меп!а1 Неа1!Н Сепейсз 1пЛаЙуе. ΑιόΙι №иго1. 51 (12):1198-204.

8. Коззог М.К, Еох КС., е! а1. (1996). Сйшса1 йеаЛгез ой зрогабю апб йатЛа1 Л1ζНе^те^'з б1зеазе. №игобедепега!юп. 5(4):393-7.

9. 61еппег С.С., №опд С.№., е! а1. (1984). ТНе ату1о1б берозйз т Л1ζНе^те^'з б1зеазе: 1Не1г паЛге апб раЛодепез1з. Лрр1 Ра!Но1. 2(6):357-69.

10. Ва11а!оге С, Бее У.М., е! а1. (2007). Таи-теб1а!еб пеигобедепегабоп т Л1ζНе^те^'з б1зеазе апб ге1а!еб б1зогбегз. №1!. Кем. №игозсй 8(9):663-72.

11. Ве11 К.Е. апб С1аибю Сие11о Α. (2006). Α1^ιό6 зупарйс йипсйоп т Л1ζНе^те^'з б1зеазе. Еиг. Б РНагтасо1. 545 (1):11-21.

12. Нагбу ΙΑ. апб Н1дд1пз 6.Α. (1992). Л1ζНе^те^'з б1зеазе: Ле ату1о1б сазсабе Нуро!кез1з. 8с1епсе. 256(5054):184-5.

13. Вгаак Н. апб Вгаак Е. (1991). №игораЛо1одюа1 з!адетд ой Л1ζНе^те^-^е1а!еб сНапдез. №иго- раЛо1. 82 (4):239-59.

14. Со1бе Т.Е. (2005). ТНе НуроЛез1з: 1еабтд из !о гайопа11у-без1дпеб Легареийс з!га!ед1ез йог

Ле !геа!теп! ог ргеуепйоп ой ΑΜβΛι^ι· б1зеазе. Вгат РаЛо1. 15(1):84-7.

15. Нагбу Б апб 8е1кое Ό.Ε (2002). ТНе ату1о1б НуроЛез1з ой Л1ζНе^те^'з б1зеазе: ргодгезз апб ргоЬ1етз оп Ле гоаб !о Легареибсз. 8аепсе. 297 (5580):353-6.

16. 8е1кое Ό.Ι (2000). ТНе депейсз апб то1еси1аг раЛо1оду ой Л1ζНе^те^'з б1зеазе: го1ез ой ату1о1б апб Ле ргезепЛпз. №иго1. С1т. 18 (4):903-22.

17. Сог1асН Α., К1арра Р., е! а1. (2006). ТНе епбор1азтк гейсийит: йо1бтд, са1сшт Нотеоз!аз1з, зйдпа1тд, апб гебох сопйок Лη!^οx^б Кебох 81дпа1. 8 (9-10):1391-418.

18. УегкНга!зку Α. (2004). Епбор1азтк гейсийит са1сшт зйдпайпд т пегуе се11з. Вю1 Кез. 37(4):693-9.

19. Сорапакй Е., 8сййгтапп Т., е! а1. (2007). ТНе ату1ойб ргесигзог рго!ет ро!епйа!ез СНОР тбисйюп апб се11 беаЛ т гезропзе !о ЕК Са2+ бер1ейоп. ВюсЫт. ВюрНуз Α^π. 1773 (2):157-65.

20. СНап 8.Б., Маупе М., е! а1. (2000). РгезепЛп-1 ти!а!юпз тсгеазе 1еуе1з ой гуапобте гесер!огз апб са1сшт ге1еазе т РС 12 се11з апб соййса1 пеигопз. й Вю1. СНет. 275 (24) :18195-200.

21. 8ирпе! С., Сгап! Б, е! а1. (2006). Лту1ο^б-Ьеίа-(1-42) шсгеазез гуапобте гесер!ог-3 ехргеззюп апб

- 20 019571 кипсйоп ίη пеигопк о£ ТдСК№Э8 шке. ί. ΒίοΙ. СНет. 281(50):38440-7.

22. Сио О., Ей V., е! а1. (1999). 1псгеакей уи1пегаФ1ку οί Фрросатра1 пеигопк ίο ехсйФохк песгокк т ргекепФп-1 ти!ап! кпоск-т тке. №11 Мей. 5(1):101-6.

23. ЬаЕег1а Е.М. (2002). Са1сшт йукйотеокккк апй 1п!гасе11и1аг ЦдпаШпд т Акйетег'к Фкеаке. №11 Кеу №еигокс1. 3(11):862-72.

24. \Уопд Н.К., 8акига1 Т., е! а1. (2005). в-8иЬипйк οί уо1!аде-да!ей койшт скаппеЕ аге поуе1 киЬк!га!ек οί Ье!а-кке ату1ок ргесигког ргокт-с1еаутд епхуте (ВАСЕ1) апй у-кесге!аке. ί Вю1. СНет. 280(24):2300917.

25. Ырра С.Е., 8с11Ш1й! М.Ь., е! а1. (1999). АпйЬоФек !о а1рйа-купис1ет йе(ес( Ье^у Ьойкк т тапу Оо\\п'8 купйготе Фатк \νί!1ι АПНеппеГк Фкеаке. Апп №еиго1. 45(3):353-7.

26. НатШоп К.Ь. (2000). Ье^у Ьойкк т А17ке1тег'к Фкеаке: а пеигораФо1одка1 гехк\\· οί 145 сакек иктд а1рйа-купис1ет 1ттипо1пк!ос11ет1к!гу. Вгат Ρаΐкο1. 10(3):378-84.

27. МогеШ Ь., Ь1оуега К., е! а1. (2003). 01Псгепйа1 йедгайайоп οί атуШй Ье!а депейс уапап!к аккоаа!ей \νί!1ι йегеййагу йетепйа ог к!гоке Ьу ткикп-йедгайтд епхуте. ί Вю1. С1ет. 278 (26):23221-6.

28. Ьее Ό.8., Тотйа 8., е! а1. (2000). КедФайоп οί Х11й-йерепйеп! атуШй ргесигког ргокт те!аЬо11кт Ьу ХВ51, а поуе1 Х11Ь-ЫпФпд рго1ет. ί. Вю1. С1ет. 275 (30):23134-8.

29. Мие11ег Н.Т., Вогд ΕΡ., е! а1. (2000). Мойи1айоп οί ату1о1й ргесигког рго1ет те!аЬо11кт Ьу ΧΙ1 а1рЬа/МтЕЕ А йе1ейоп апа1ук1к οί ргокт-ргокт т!егасйоп йотатк. ί. Вю1. С1ет. 275(50):39302-6.

30. Сооккоп М.К. (2003). №еигойедепегайоп: 1ю\у йоек рагкт ргеуеп! Ρа^к^пкοп'к Фкеаке? Сигг Вю1. 13 (13):К522-4.

31. Махапе!/ МФ. апй Ексйег ΡΜ. (2007). ИШапдйпд 1аи 11урегр11окр1югу1а!1оп т йгид йек1дп ког пеигойедепегайуе Фкеакек. №а! Кеу Эгид Э1ксоу. 6(6):464-79.

32. Сйигсйег I. (2006). Таи Фегареийс кйакдкк ког !1е !геа!теп! οί А1ζке^те^'к Фкеаке. Сигг Тор Мей. С1ет. 6(6):579-95.

33. 8хе С.1., 8и М., е! а1. (2004). Иота-гедФайоп ок \ν\ν йотат-соп1а1птд ох1йогейис1аке тйисек Таи р1токр1югу1айоп т уйго. А ро!епйа1 го1е т АФйетег'к Фкеаке. ί. Вк. С1ет. 279(29):30498-506.

34. ^а1сИ11 8., Сигсйой М.Ь., е! а1. (2000). [йепНПсайоп ок 1угокте ркοкркаΐакек На! йер1юкр1югу1а!е Не ткикп гесер!ог. А Ьги!е когсе арргоасй Ьакей оп киЬкйак-йарртд ти!ап!к. ί. Вю1. С1ет. 275 (13):9792-6.

35. Сйапд Ν.8., ОоИег!у ί., е! а1. (2003). ΕΝΚ1 рйуккаПу т!егас!к \νί!1ι \ν\ν йотат-соп1а1птд ох1йогейис!аке (νθΧ1) апй 1пФЬйк ^ОХ1-тей1а!ей арор!ок1к. ί. Вю1. С1ет. 278(11): 9195-202.

36. ΟΌγιζι С., СессФпеШ В., е! а1. (2002). Нотеойотат-ткгасйпд ргокт к1паке-2 р1юкр1югу1а!ек р53 а! 8ег 46 апй теФакк арорккк. №а! Се11 Вю1. 4(1):11-9.

37. Ζ1ιι.ι Н., Ж1 Ь., е! а1. (2003). МИМ2 апй рготуе1осу!е 1еикет1а ап!адо1Фе еасй оФег Фгоидй Фей ййес! ткгасйоп \νί!1ι р53, ί. Вю1. С1ет. 278(49):49286-92.

38. КоФгдиек 8., Эе ^еуег О., е! а1. (2007). Орроктд го1ек ок пейт-1 апй Фе йерепйепсе гесер!ог ЭСС т сапсег се11 туаккп, !итог дго\\Ф апй те!ак!ак1к. Опсодепе. 26(38):5615-25.

39. Агаката Н. (2004). №ейт-1 апй кк гесер!огк т Штопдепейк. №а!. Кеу. Сапсег. 4(12):978-87.

40. ТатдисЫ Υ., К1т 8.Н., е! а1. (2003). Ρ^екеп^1^п-йерепйеп! датта-кесге!аке ргосекктд ок йе1е!ей т со1огес!а1 сапсег (ИСС). ί. Вю1. С1ет. 278 (33):30425-8.

41. й-аИт Ό.Κ., е! а1. (2007) Ехрептеп!а1 Акйетег'к Э1кеаке Игад Ροк^ркеп[ (Ρкепке^^пе] йо\уегк Ату1ο^й-Ье!аΡер!^йе Ьеуе1к т Се11 Сикиге апй Мке. 1оигпа1 ок Ρка^тасο1οду апй ехрептеп!а1 Фегареийск 320:386-396.

42. 8апд Тае К1М, е! а1. (2006) №еигорго!есйуе ЕПсс! ок 8оте ΡΕπι! Ех!гас!к т Сикигей СТ105-1пйисей ΡΟ2 Се11к. Вю1. Ρ№πιι. Ви11. 29(10) 2021-2024.

43. МсСо\\ап Е., е! а1. (2005) А(342) 1к Еккепйа1 ког Ρа^епскута1 апй Уакси1аг АтуШй ИерокФоп т Мке. №еигоп 47:191-199.

44. Йе1д11!у К.Е., е! а1. (2008) Ике ок агйкк1а1 пеига1 пе!\уогкк !о йе!егтте содпфуе инрайтеи! апй Фегареийс еккесйуепекк т АФйетег'к йапкдешс тке. 1оигпа1 ок №еигокскпсе МеФойк 167:358-366.

45. Акйе К.Н. (2001) Ьеагшпд апй тетогу т !гапкдепк тке тойеШпд Λ1ζке^те^'κ Фкеаке. Ьеагшпд апй Метогу 8:301-308.

46. Саг1коп С.А., е! а1. (1997) Сепейс тойШсайоп ок Фе рйепо1урек ргойисей Ьу атуШй ргесигког рго!ет оуегехргеккюп т йапкдешс тке. Нитап Мо1еси1аг Сепейск 6:1951-1959.

47. Нк1ао К., е! а1. (1996) Согге1айуе тетогу йеккйк, АЬе!а екуайоп, апй атукк р1ас.|иек т йапкдешс тке. 8скпсе 274:99-102.

48. СгеепЬегд 8.М. апй Уопкайе1 ί.Ρ. (1997) О1адпок1к ок сегеЬга1 атуШй апдюраФу. 8епк1йуку апй кресШсйу ок согйса1 Форку. 81гоке 28 (7): 1418-22

49. 8с1ппйо\укк1 К., е! а1. (2006) А1ζке^те^'к О1кеаке-Ыке Таи №еигораФо1оду Ьеайк !о Метогу ЭеПсйк апй Ьокк ок Еипсйопа1 8упаркек т а №оуе1 Ми!а!ей Таи Тгапкдешс Мойке \\й1юи! Апу Мо!ог ЭеПсйк. Ат ί. ΡаΦο1. 169:599-616.

50. ЬаФг! И.К., е! а1. (2004) Эк!агу кирр1етеп!айоп \νί!1ι те1а!ошп гейисек 1еуе1к ок ату1о1й Ье!а

- 21 019571 рерйбек ίη 1ке тштпе сегеЬга1 сойех. 1оита1 οί Ртеа1 Векеатсй 36:224-231.

51. Вакка М.К, е! а1. (2005) ТНе Ге!а1 Ьа818 οί ату1о1бодепе818: ехрокиге 1о 1еаб апб 1а1еп1 оуегехргекδίοη оГ ату1о1б ргесигког рго!ет апб Ье!а-ату1о1б ίη И1е адтд Ьгат. 1оита1 оГ Иеигокстсе 25:823-829.

Claims (8)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение композиции, содержащей сульфизоксазол или его соль или состав с пролонгированным высвобождением, в лечении болезни Альцгеймера.
2. 2. Применение по п.1, где композиция дополнительно содержит по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы акампросата, амлодипина, цилостазола, лефлуномида, метимазола, фенформина, прилокаина, тадалафила, тербинафина, зонизамида и рифабутина, их солей или составов с пролонгированным высвобождением, для одновременного, раздельного или последовательного введения с сульфизоксазолом.
3. 3. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанная композиция дополнительно содержит по меньшей мере одно лекарственное средство, ингибирующее реакцию клеток на стресс, для комбинированного, раздельного или последовательного применения.
4. 4. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанная композиция дополнительно содержит по меньшей мере одно лекарственное средство, модулирующее функцию синапсов, для комбинированного, раздельного или последовательного применения.
5. 5. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанная композиция дополнительно содержит по меньшей мере одно лекарственное средство, модулирующее клеточный ангиогенез, для комбинированного, раздельного или последовательного применения.
6. 6. Применение по любому из предшествующих пунктов, где композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
7. 7. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанную композицию вводят индивидууму повторно.
8. 8. Применение композиции, содержащей сульфизоксазол или его соль или состав с пролонгированным высвобождением, для производства лекарственного средства для защиты нейронов от интоксикации пептидом Αβ у нуждающегося в этом субъекта.