ES2602048T3 - Nanopartículas inorgánicas de alta densidad para destruir células in vivo - Google Patents

Abstract

El uso de nanopartículas o agregados de nanopartículas para la preparación de una composición farmacéutica para uso en un método de alteración o de destrucción de células diana en un animal cuando dichas células se exponen a radiaciones ionizantes, en donde cada nanopartícula o agregado de nanopartículas consiste en un óxido metálico seleccionado del grupo que consiste en CeO2, Tm2O3, HfO2, WO3 y PdO, en donde la densidad de dicha nanopartícula o la densidad de dicho agregado de nanopartículas es de al menos 7,1 g/cm3 cuando el óxido metálico es CeO2, de al menos 8,3 g/cm3 cuando el óxido metálico es Tm2O3, de al menos 7,4 g/cm3 cuando el óxido metálico es HfO2, de al menos 7,2 g/cm3 cuando el óxido metálico es WO3, y de al menos 7,9 g/cm3 cuando el óxido metálico es PdO, y en donde cada nanopartícula o agregado de nanopartículas está cubierto con una cubierta biocompatible que permite la estabilidad de la nanopartícula o agregado de nanopartículas a pH entre 6,5 y 7,5 en un fluido fisiológico.

Description

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DESCRIPCION

Nanopartfculas inorganicas de alta densidad para destruir celulas in vivo Campo de la invencion

La presente solicitud se refiere a nuevas partfculas excitables que pueden ser utilizadas en el sector de la salud. Mas particularmente se refiere a partfculas que pueden generar electrones y/o fotones de alta energfa cuando son excitadas por radiaciones ionizantes, tales como los rayos X, rayos gamma (rayos y), isotopos radiactivos y/o haces de electrones, y a los usos de las mismas en la salud, en particular en la salud humana. Las partfculas descritas en esta memoria estan hechas de un material inorganico que comprende ox^geno, en particular un oxido, teniendo dicho material una densidad adecuada, y pudiendo ser activado in vitro, ex vivo, o in vivo, por excitacion externa controlable, con el fin de perturbar, alterar o destruir las celulas, tejidos u organos diana. La invencion se refiere tambien a metodos para la produccion de dichas partfculas, y a composiciones farmaceuticas que contienen las mismas.

Antecedentes

Para tratar problemas relacionados con el cancer, han sido utilizadas radiaciones de diversas formas, tales como rayos X, rayos gamma, rayos UV, luz laser, microondas, haces de electrones, asf como haces de partfculas de, por ejemplo, neutrones y protones. Algunas de dichas radiaciones se han utilizado en tales aplicaciones, en combinacion con moleculas sensibles a la radiacion. Las radiaciones electromagneticas y ionizantes son capaces en efecto, de romper la molecula de ADN de la celula, evitando de este modo el crecimiento y division de dicha celula. Este efecto se debe principalmente a los danos creados por los electrones y/o los fotones de alta energfa (energfa superior a 2 keV) emitidos despues de la ionizacion.

El termino "radiaciones ionizantes" se refiere a partfculas u ondas altamente energeticas que pueden desprender (ionizarse) al menos un electron desde un atomo o molecula. La capacidad ionizante depende de la energfa de las partfculas u ondas individuales, y no de su numero. Una gran corriente de partfculas u ondas, no causara ionizacion, en las situaciones mas comunes, si las partfculas o las ondas individuales no son suficientemente energeticas.

Son ejemplos de radiaciones ionizantes las partfculas energeticas, partfculas beta, fotones, neutrones, electrones y partfculas alfa. La capacidad de las ondas de luz (fotones) para ionizar un atomo o molecula vana a lo largo del espectro electromagnetico. Los rayos X y los rayos gamma ionizaran casi cualquier molecula o atomo; la luz del ultravioleta lejano ionizara muchos atomos y moleculas; la luz del ultravioleta cercano y la luz visible son ionizantes para muy pocas moleculas; las microondas y las ondas de radio son radiaciones no ionizantes.

El documento WO 2005/120590 describe una partfcula que comprende (i) un nucleo que comprende un primer compuesto inorganico que absorbe los rayos X y que emite energfa UV-visible, y (ii) un segundo compuesto inorganico u organico, que absorbe la energfa UV-visible y que produce radicales libres en contacto con el agua o el oxfgeno. Las partfculas activadas convierten el oxfgeno circundante en radicales libres que son especies altamente reactivas que producen danos irreversibles en las celulas.

El documento US 2007/0274909 se refiere a nanopartfculas para uso en la formacion de imagenes o en el tratamiento por radiacion de material biologico, que comprenden un material emisor de VUV o UV-C, que absorbe la radiacion de alta energfa y emite radiacion VUV o UV-C. Los materiales emisores de VUV o UV-C descritos en esta memoria descriptiva estan intencionada o no intencionadamente, pero sistematicamente, dopados con un activador cuyo objetivo es permitir la emision de la radiacion VUV o UV-C descrita. Sin embargo, los agentes dopantes pueden estar asociados con un aumento de la toxicidad, dependiendo de su localizacion en la partfcula o de su solubilidad en el medio de dispersion.

El documento US 6.955.639 describe un metodo para mejorar los efectos de la radiacion de rayos X utilizando nanopartfculas de metal, en particular de oro.

El documento WO 2008/059419 describe nanopartfculas que comprenden agentes reductores no metalicos elaboradas para presentar una estructura de bandas electronicas, para uso como sensibilizadores de radiacion, comprendiendo dichos agentes reductores uno o mas materiales oxfdicos.

El documento WO 2008/007290 describe nanopartfculas con nucleo y cubierta, en las cuales el material del nucleo tiene un salto de banda mas ancho que el material de la cubierta.

En la presente memoria se proporcionan nuevas y potentes nanopartfculas, que son mas faciles y mas baratas de preparar que las descritas en la tecnica, pero lo que es mas importante y sorprendente, que son capaces de lograr una alteracion o destruccion muy eficiente de las celulas diana en combinacion con radiaciones ionizantes, como se demuestra en esta memoria.

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Otra caractenstica presentada por las nanopartmulas descritas en la presente memoria es su capacidad para permanecer dentro del tumor durante varios dfas lo que permite reducir al mmimo el numero de inyecciones de nanopartmulas y/o agregados de nanopartmulas, en el contexto de un tratamiento completo de radioterapia.

Sumario de la invencion

Los inventores han descubierto ahora y describen en esta memoria que es posible, de manera eficiente, perturbar, alterar o destruir celulas, tejidos u organos diana, en particular celulas o tejidos anormales, definidos aqm como celulas o tejidos benignos, o celulas o tejidos enfermos, tales como celulas pre-malignas o malignas (celulas cancerosas) o tejidos pre-malignos o malignos (tumores), posiblemente localizados profundamente en el cuerpo, a la vez que se limitan los danos a los tejidos sanos circundantes, utilizando una nanopartmula hecha de un material inorganico que comprende oxfgeno (en otras palabras, preparada con un unico material inorganico), en particular un oxido, cuya densidad es de al menos 7 g/cm3, preferiblemente por encima de 7 g/cm3, en particular, para una nanopartmula hecha de un oxido, por encima de 7 g/cm3 y por debajo de 15 g/cm3.

La invencion se refiere mas particularmente al uso de nanopartmulas o agregados de nanopartmulas para la preparacion de una composicion farmaceutica para uso en un metodo de alteracion o destruccion de celulas diana en un animal cuando dichas celulas se exponen a radiaciones ionizantes, en donde cada nanopartmula o agregado de nanopartmulas consiste en un oxido metalico seleccionado del grupo que consiste en CeO2, T1TI2O3, HfO2, WO3 y PdO, en donde la densidad de dicha nanopartmula o la densidad de dicho agregado de nanopartmulas es de al menos 7,1 g/cm3 cuando el oxido metalico es CeO2, de al menos 8,3 g/cm3 cuando el oxido metalico es Tm2O3, de al menos 7,4 g/cm3 cuando el oxido metalico es HfO2, de al menos 7,2 g/cm3 cuando el oxido metalico es WO3, y de al menos 7,9 g/cm3 cuando el oxido metalico es PdO, y en donde cada nanopartmula o agregado de nanopartmulas esta cubierto con una cubierta biocompatible que permite la estabilidad de la nanopartmula o agregado de nanopartmulas a pH entre 6,5 y 7,5 en un fluido fisiologico. La invencion se refiere tambien mas particularmente a tales nanopartmulas o agregados de nanopartmulas, o composiciones farmaceuticas que comprenden tales nanopartmulas o agregados de nanopartmulas, para uso en la alteracion o destruccion de celulas diana en un animal cuando dichas celulas se exponen a radiaciones ionizantes.

Tales nanopartmulas no requieren la presencia de un compuesto o material adicional distinto para generar el efecto terapeutico deseado. En particular, las nanopartmulas descritas en esta memoria son capaces de convertir directamente la radiacion entrante en una emision eficiente de electrones y/o fotones de alta energfa, que es responsable del subsiguiente efecto terapeutico.

Contrariamente a las nanopartmulas descritas en los documentos WO 2005/120590 y US 2007/0274909, las presentes nanopartmulas no requieren la presencia de dos compuestos distintos, uno de los cuales es necesario para convertir los rayos X en energfa UV-visible. En particular, las presentes nanopartmulas no comprenden un compuesto inorganico cuyo objetivo es, como un primer compuesto, absorber los rayos X y convertirlos en energfa UV-visible absorbida por un segundo compuesto que es, a su vez, responsable de los danos irreversibles en las celulas. Estas nanopartmulas tampoco estan dopadas ni disenadas para emitir espedficamente luz en la region UV.

En comparacion con las nanopartmulas metalicas, las presentes nanopartmulas ofrecen la ventaja de presentar grupos hidroxilo (OH) en su superficie, los cuales son responsables de la compatibilidad con cualquier entorno polar, en un amplio intervalo de pH.

En comparacion con las nanopartmulas metalicas, las presentes nanopartmulas, en particular las nanopartmulas hechas de un oxido, ofrecen ademas la ventaja de ser mas faciles de preparar. Se pueden obtener suspensiones biocompatibles con una alta concentracion de nanopartmulas o agregados de nanopartmulas con un metodo como se describe en esta memoria.

El procedimiento de smtesis no requiere el uso de un agente reductor y/o de un agente secuestrante (complejante) para evitar la agregacion perjudicial de las partmulas preparadas. En los metodos descritos aqm, la adicion de un agente secuestrante (complejante) a las suspensiones mencionadas antes, es solamente opcional.

Por lo tanto, el procedimiento de smtesis incluye generalmente (de forma simultanea o secuencial): precipitacion de un elemento qmmico en un medio polar, cristalizacion de dicho elemento qmmico (el oxfgeno es parte de la estructura del material inorganico) y estabilizacion (si fuera necesario) en un medio fisiologico.

Las presentes nanopartmulas no requieren tampoco una molecula dirigida a concentrarse en las celulas o tejidos diana.

El efecto de permeabilidad y retencion aumentada ("EPR") es verdaderamente responsable de la acumulacion pasiva en la masa tumoral, al cabo de un tiempo despues de la inyeccion por via intravenosa (una posible via de administracion) de las nanopartfculas. Se ha observado en efecto, que los vasos del tumor son bastante distintos de los capilares normales y que su "derrame" vascular favorece la extravasacion selectiva de nanopartfculas no habitual en los tejidos normales. La falta de drenaje linfatico tumoral efectivo evita el aclaramiento de las nanopartfculas penetrantes y promueve su acumulacion. Las presentes nanopartfculas son por lo tanto capaces de dirigirse satisfactoriamente a los tumores primarios, asf como a los metastasicos despues de administracion intravenosa.

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Las presentes nanopartfculas tambien se pueden administrar ventajosamente por via intratumoral, como se demuestra en la seccion experimental.

Sin embargo, las presentes nanopartfculas o agregados de nanopartfculas estan ventajosamente cubiertas con una cubierta biocompatible que permite la estabilidad de la nanopartfcula o agregado de nanopartfculas a pH entre 6,5 y 7,5 en un fluido fisiologico, como se describe adicionalmente en esta memoria mas adelante.

Es, por lo tanto, una ventaja adicional de la presente invencion proporcionar nanopartfculas que no son nocivas por sf mismas, sino que se pueden emplear de forma segura, en condiciones apropiadas, para perturbar funcionalmente, alterar o destruir celulas diana, en particular, las celulas cancerosas. El efecto terapeutico deseado de las nanopartfculas es en efecto, estrictamente dependiente de su excitacion, siendo generada dicha excitacion por la fuente de radiacion ionizante, que esta ella misma ventajosamente controlada, en terminos de calidad y cantidad, y que se utiliza de una manera dirigida, es decir, localizada, por el experto en la tecnica.

La presente invencion describe por lo tanto una nueva clase de partfculas que se pueden utilizar, si fuera apropiado de una manera dirigida, en cualquier animal, preferiblemente en un mairnfero, aun mas preferiblemente en un ser humano. Las partfculas de la invencion se pueden utilizar en cualquier tipo de tejido u organo, superficial o profundo. En particular, la presente invencion describe partfculas activables que pueden inducir una alteracion o destruccion de celulas in vitro, ex vivo o in vivo, cuando dichas celulas se exponen a radiaciones ionizantes, tales como, en particular, rayos X, rayos gamma, isotopos radiactivos, haces de iones y/o haces de electrones.

La estrategia aplicada consiste en convertir las radiaciones ionizantes entrantes principalmente en una emision eficiente de electrones y/o de fotones de alta energfa, que es responsable del efecto terapeutico. Tal resultado se obtiene utilizando las presentes nanopartfculas hechas de un material inorganico que comprende oxfgeno, cuya densidad es de al menos 7 g/cm3, preferiblemente por encima de 7 g/cm3 en particular, para una nanopartfcula hecha de un oxido, por encima de 7 g/cm3 y por debajo de 15 g/cm3. Tfpicamente, la densidad de dicha nanopartfcula es de al menos 7,1 g/cm3 cuando el oxido metalico es CeO2, de al menos 8,3 g/cm3 cuando el oxido metalico es Tm2O3, de al menos 7,4 g/cm3 cuando el oxido metalico es HfO2, de al menos 7,2 g/cm3 cuando el oxido metalico es WO3, y de al menos 7,9 g/cm3 cuando el oxido metalico es PdO.

Las presentes nanopartfculas se excitan o se activan por absorcion de energfa de las radiaciones ionizantes. Tal absorcion lleva a una cascada posterior de fenomenos que conducen a la alteracion o muerte de la celula diana. Entre estos fenomenos, la emision de electrones y/o de fotones de alta energfa es predominante y crftica en el contexto de la presente invencion.

Los inventores describen en esta memoria la eficiencia de un material inorganico que comprende oxfgeno, cuya densidad es de al menos 7 g/cm3, preferiblemente por encima de 7 g/cm3, en particular, para una nanopartfcula hecha de un oxido, por encima de 7 g/cm3 y por debajo de 15 g/cm3, para obtener el efecto terapeutico deseado, que consiste en la alteracion o destruccion de una celula, tejido u organo diana, tal como una celula o tejido maligno.

La presente descripcion se refiere a productos o compuestos, aqrn nanopartfculas o agregados de nanopartfculas, hechos de un material inorganico que comprende oxfgeno, siendo la densidad de dicho material inorganico de al menos 7 g/cm3, preferiblemente por encima de 7 g/cm3, en particular, para una nanopartfcula hecha de un oxido, por encima de 7 g/cm3y por debajo de 15 g/cm3. Se describen aqrn, metodos para preparar tales compuestos.

Es un objetivo descrito en la presente memoria utilizar una nanopartfcula o agregado de nanopartfculas segun la presente invencion para alterar, destruir o eliminar una celula, tejido u organo diana.

Un aspecto particular descrito aqrn, se refiere al uso de una nanopartfcula o agregado de nanopartfculas para preparar una composicion farmaceutica destinada a alterar, destruir o eliminar celulas diana en un animal cuando dichas celulas se exponen a radiaciones ionizantes como se describen aqrn, en donde la nanopartfcula esta hecha de un material inorganico que comprende oxfgeno, siendo la densidad de dicho material inorganico de al menos 7 g/cm3, preferiblemente por encima de 7 g/cm3, en particular, para una nanopartfcula hecha de un oxido, por encima de 7 g/cm3 y por debajo de 15 g/cm3, y al correspondiente metodo de tratamiento.

Los productos descritos aqrn, en particular nanopartfculas o agregados de nanopartfculas, para uso en el tratamiento del cancer, se divulgan en particular, en la presente memoria.

Otro aspecto de la descripcion se basa en una composicion, en particular una composicion farmaceutica para uso en terapia o diagnostico, que comprende un producto tal como se ha definido antes o que se puede obtener por el metodo mencionado antes. Tal composicion esta preferiblemente en la forma de una formulacion inyectable.

Se da a conocer en esta memoria una composicion farmaceutica, en particular, como sera evidente en toda la descripcion, una composicion farmaceutica destinada a alterar o destruir celulas diana en un mai^ero cuando dichas celulas se exponen a radiaciones ionizantes, comprendiendo dicha composicion farmaceutica una nanopartfcula o agregado de nanopartfculas y un vehfculo o excipiente farmaceuticamente aceptable, en donde la nanopartfcula esta hecha de un material inorganico que comprende oxfgeno, siendo la densidad de dicho material inorganico de al menos 7 g/cm3, preferiblemente por encima de 7 g/cm3, en particular, para una nanopartfcula hecha

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de un oxido, por encima de 7 g/cm3 y por debajo de 15 g/cm3, y en donde la nanopartmula o agregado de nanopartmulas esta cubierto preferiblemente con una cubierta biocompatible.

Otro aspecto de la descripcion se refiere al uso de una nanopartmula o agregado de nanopartmulas como se describe en la presente memoria para prevenir o tratar un cancer o para aliviar los smtomas de un cancer en un animal, cuando dicha nanopartmula o agregado de nanopartmulas se expone a radiaciones, en particular a radiaciones ionizantes, como se definen aqm.

La presente divulgacion, en particular, incluye un metodo para prevenir o tratar un cancer o para aliviar los smtomas de un cancer en un sujeto, siendo el sujeto un animal, en particular un mairnfero, preferiblemente un ser humano, mediante la administracion de una nanopartmula o agregado de nanopartmulas como se describe en esta memoria, o de una composicion que comprende dicha nanopartfcula o agregado de nanopartmulas, al sujeto, y exponiendo dicho sujeto a radiaciones, en particular a radiaciones ionizantes.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona kits que comprenden uno cualquiera o mas de los productos descritos en la presente memoria, es decir, nanopartmulas, agregados de nanopartmulas, y composiciones, junto con un prospecto que proporciona instrucciones para utilizar el producto o productos.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra la distribucion y dispersion a lo largo del tiempo de la suspension biocompatible de nanopartmulas o agregados de nanopartmulas de HfO2 despues de inyeccion intratumoral en ratones suizos atfmicos portadores de tumor HCT116. Se ha realizado microtomograffa sobre el tumor, 2 y 15 dfas despues de la inyeccion.

Las figuras 2A y 2B son imagenes de microscopfa electronica de transmision (TEM) de nanopartmulas o agregados de nanopartmulas de HfO2 que dan una caracterizacion cualitativa de la forma de las nanopartmulas (barra de escala = 200 nm). Se utiliza para el analisis JEOL 100 CX.

La Figura 2A muestra nanopartmulas y tambien agregados formados con nanopartmulas, que son ambos esencialmente de forma esferica.

La Figura 2B muestra nanopartmulas preparadas de una manera diferente y agregados formados con dichas nanopartmulas, que son ambos esencialmente de forma alargada.

La Figura 3 muestra imagenes de microscopfa electronica de transmision (TEM) de las nanopartmulas internalizadas en las celulas. Se trataron cultivos de HCT116 durante 24 h con suspensiones biocompatibles 5 pM y 100 pM de nanopartmulas o agregados de nanopartmulas de HfO2 y sin dichas suspensiones (control), (barra de escala 500 nm).

Las nanopartmulas fueron captadas a traves de los endosomas. El estudio TEM revelo claramente que las nanopartmulas entran en las celulas a traves de los endosomas de una manera que depende de la concentracion. Las nanopartmulas pueden entrar o penetrar en la celula, en una forma agregada o individualizada, dependiendo de su diseno y/o de su concentracion.

Figura 4: Espectro electromagnetico con radiaciones ionizantes, resaltado.

La Figura 5A muestra el nivel de gris o valor de contraste de la suspension biocompatible de nanopartmulas y agregados de nanopartmulas de HfO2 como una funcion de su concentracion:

HfO2 con densidad > 7: puntos de drculos

HfO2 con densidad < 7: puntos de cruces

Los analisis se realizaron utilizando un microtomografo de rayos X (SkyScan 1076) operando con una fuente de energfa de 50 KV.

Para una concentracion dada, cuanto mas alto es el nivel de gris de las nanopartmulas o agregados de nanopartmulas (directamente relacionado con su velocidad o capacidad de absorcion), mas alta es la capacidad de las nanopartmulas o agregados de nanopartfculas para aumentar la muerte celular inducida por la radiacion, como se muestra en la figura 5B.

La Figura 5B muestra un ensayo de supervivencia clonogenico utilizando nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de HfO2 biocompatibles incubadas con dos lmeas de celulas distintas de carcinoma de colon humano a 400 pM, en comparacion con el control.

Se determina la SFx (fraccion de supervivencia bajo x grays) despues de una dosis de irradiacion de 2 Gy en la lmea de celulas HCT116 radiosensibles y despues de una dosis de irradiacion de 4 Gy en la lmea de celulas HT29

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radiorresistentes, utilizando una fuente de irradiacion de rayos X de 200 keV (Tubo Cometa MXR-225/22 -200 kV/15 mA/0,2 mm Cu). Los valores medios se generan de 2 experimented diferentes.

Figura 6: se ha inyectado intra-tumoralmente una suspension biocompatible que comprende nanopartteulas y/o agregados de nanopartteulas de HfO2, a ratones suizos atimicos portadores de tumores HCT116 (volumen de inyeccion entre 20 % y 50 % del volumen del tumor). Los tumores de dichos ratones se han irradiado ademas localmente (2 sesiones, identificadas aqrn tambien como 2 fracciones, de 4 Gy; puntos de drculos) con un aplicador acoplado a una fuente de irradiacion utilizada de un modo externo [dispositivo de curieterapia con fuente de iridio- 192]

La misma suspension biocompatible ha sido administrada a un grupo control de ratones (volumen de inyeccion entre 20 % y 50 % del volumen del tumor). Dicho grupo control no fue irradiado (puntos de cruces).

Los grupos de ratones descritos anteriormente se comparan con los ratones tratados con el vehteulo sometidos a radioterapia (puntos de triangulos) o no sometidos a radioterapia (puntos de rombos). El volumen del tumor se vigila en cada grupo dos veces por semana durante 25 dfas despues de la irradiacion.

La Figura 7 muestra imagenes de ratones portadores de celulas tumorales HCT116, 21 dfas despues de la irradiacion:

Figura 7A: ratones tratados con irradiacion despues de la inyeccion intratumoral de un vehteulo (sin partteulas)

Figura 7B: ratones tratados con irradiacion despues de la inyeccion intratumoral de nanopartteulas

La Figura 8 muestra ensayos de supervivencia clonogenicos utilizando celulas cancerosas HCT116 (modelo radiosensible) y HT29 (modelo radiorresistente) irradiadas utilizando un generador de rayos X de 200 keV (Tubo Cometa MXR-225/22 -200 kV/15 mA/0,2 mm Cu), en ausencia (control negativo) o en presencia de nanopartteulas o agregados de nanopartteulas de HfO2 a 400 pM. La dosis de irradiacion vana de 0 a 4 Gy.

Control negativo con HCT116: puntos de cruces

Nanopartteulas con HCT116: puntos de cuadrados

Control negativo con HT29: puntos de rombos

Nanopartteulas con HT29: puntos de cteculos

La Figura 9 muestra la evolucion de los volumenes de tumor HCT116 despues de inyeccion intratumoral de una suspension biocompatible de nanopartteulas o agregados de nanopartteulas de HfO2, seguida por una irradiacion del tumor de 2 * 4 Gy o de 1 x 8 Gy con un aplicador acoplado a una irradiacion externa utilizando el dispositivo de curieterapia con fuente de iridio-192.

Se calculan los valores medios de 8 ratones suizos atimicos.

Grupo control con vehteulo inyectado (sin irradiacion, sin nanopartteulas): puntos de rombos.

Grupo con nanopartteulas inyectadas (sin irradiacion): puntos de cruces

Grupo con vehteulos inyectados y sometido a una irradiacion de 1 x 8 Gy (sin nanopartteulas): puntos de cuadrados

Grupo con vehteulos inyectados y sometido a una irradiacion de 2 x 4 Gy (sin nanopartteulas): puntos de triangulos

Grupo con nanopartteulas inyectadas y sometido a una irradiacion de 1 x 8 Gy: puntos de drculos abiertos

Grupo con nanopartteulas inyectadas y sometido a una irradiacion de 2x4 Gy: puntos de drculos

La Figura 10 muestra la viabilidad celular medida despues de un pertedo de tratamiento de 24 horas con o sin nanopartteulas o agregados de nanopartteulas de HfO2 (concentracion 800 pM). Las dosis de irradiacion vanan de 0 a 6 Gy. Se utiliza el kit WST1 para leer la viabilidad. Cada punto es el valor medio de 3 experimentos.

Con nanopartteulas e irradiacion: puntos de triangulos

Sin nanopartteulas y con irradiacion: puntos de cuadrados

La Figura 11A muestra ensayos de supervivencia clonogenicos que utilizan celulas cancerosas HT1080 (modelo de fibrosarcoma radiorresistente) irradiadas utilizando un generador de rayos X de 200 keV (Tubo Cometa MXR-225/22 -200 kV/15 mA/0,2 mm Cu), en ausencia (control negativo) o en presencia de nanopartteulas o agregados de nanopartteulas de HfO2 a 400 pM. La dosis de irradiacion vana de 0 a 4 Gy.

Control negativo con HT1080: puntos de cruces

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Nanopartfculas con HT1080: puntos de cuadrados

La Figura 11B muestra ensayos clonogenicos que utilizan celulas cancerosas HT1080 (modelo de fibrosarcoma radiorresistente) irradiadas utilizando una fuente de cobalto 60, en ausencia (control negativo) o en presencia de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de HfO2 a 400 pM. La dosis de irradiacion vana de 0 a 4 Gy.

Control negativo con HT1080: puntos de cruces

Nanopartfculas con HT1080: puntos de cuadrados

Se realizaron ensayos clonogenicos similares sobre “celulas de fibroblastos humanos” (celulas no cancerosas) como un control, utilizando nanopartfculas, y no demostraron ningun efecto o un efecto muy moderado. Los resultados obtenidos cuando se compara la reaccion respectiva de las celulas cancerosas y las celulas normales bajo irradiacion, revelan una alta relacion beneficio-riesgo.

La Figura 12A muestra la viabilidad celular (% de control) despues de una irradiacion de 2 Gy utilizando nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de HfO2 (400 pM) con densidad de 7,4 g/cm3 (ejemplo 10 a)).

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y sin irradiacion: puntos de cuadrados llenos

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y con irradiacion: puntos de rombos abiertos

Con nanopartfculas (HfO2-L d = 7,4) y sin irradiacion: puntos de triangulos llenos

Con nanopartfculas (HfO2-L d = 7,4) y con irradiacion: puntos de drculos abiertos

La Figura 12B muestra la viabilidad celular (% de control) despues de una irradiacion de 2 Gy utilizando nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de HfO2 (400 pM) con densidad de 6,8 g/cm3 (ejemplo 10 a)).

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y sin irradiacion: puntos de cuadrados llenos

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y con irradiacion: puntos de rombos abiertos

Con nanopartfculas (HfO2-E d = 6,8) y sin irradiacion: puntos de triangulos llenos

Con nanopartfculas (HfO2-E d = 6,8) y con irradiacion: puntos de drculos abiertos

La Figura 12C muestra la viabilidad celular (% de control) despues de una irradiacion de 2 Gy utilizando nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de HfO2 (400 pM) con densidad de 6,7 g/cm3 (ejemplo 10 a)).

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y sin irradiacion: puntos de cuadrados llenos

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y con irradiacion: puntos de rombos abiertos

Con nanopartfculas (HfO2-V d = 6,7) y sin irradiacion: puntos de triangulos llenos

Con nanopartfculas (HfO2-V d = 6,7) y con irradiacion: puntos de drculos abiertos

La Figura 12D muestra la viabilidad celular (% de control) despues de una irradiacion de 2 Gy utilizando nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de CeO2 (400 pM) con densidad de 7,1 g/cm3 (ejemplo 10 b))

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y sin irradiacion: puntos de cuadrados llenos

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y con irradiacion: puntos de rombos abiertos

Con nanopartfculas (CeO2-W d = 7,1) y sin irradiacion: puntos de triangulos llenos

Con nanopartfculas (CeO2-W d = 7,1) y con irradiacion: puntos de drculos abiertos

La Figura 12E muestra la viabilidad celular (% de control) despues de una irradiacion de 2 Gy utilizando nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de CeO2 (400 pM) con densidad de 6,5 g/cm3 (ejemplo 10 b))

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y sin irradiacion: puntos de cuadrados llenos

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y con irradiacion: puntos de rombos abiertos

Con nanopartfculas (CeO2-S d = 6,5) y sin irradiacion: puntos de triangulos llenos

Con nanopartfculas (CeO2-S d = 6,5) y con irradiacion: puntos de drculos abiertos

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La Figura 12F muestra la viabilidad celular (% de control) despues de una irradiacion de 2 Gy utilizando nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de TiO2 (400 pM) con densidad de 3,9 g/cm3 (ejemplo 10 d)).

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y sin irradiacion: puntos de cuadrados llenos

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y con irradiacion: puntos de rombos abiertos

Con nanopartfculas (TiO2-5 nmd = 3,9) y sin irradiacion: puntos de triangulos llenos

Con nanopartfculas (TiO2-5 nmd = 3,9) y con irradiacion: puntos de drculos abiertos

La Figura 12G muestra la viabilidad celular (% de control) despues de una irradiacion de 2 Gy utilizando nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de PdO (400 pM) con densidad de 7,9 g/cm3 (ejemplo 10 e)).

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y sin irradiacion: puntos de cuadrados llenos

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y con irradiacion: puntos de rombos abiertos

Con nanopartfculas (PdO-A d = 7,9) y sin irradiacion: puntos de triangulos llenos

Con nanopartfculas (PdO-A d = 7,9) y con irradiacion: puntos de drculos abiertos

La Figura 12H muestra la viabilidad celular (% de control) despues de una irradiacion de 2 Gy utilizando nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de TO2 (400 pM) con densidad de 3,8 g/cm3 (ejemplo 10 e)).

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y sin irradiacion: puntos de cuadrados llenos

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y con irradiacion: puntos de rombos abiertos

Con nanopartfculas (TiO2-P25 d = 3,8) y sin irradiacion: puntos de triangulos llenos

Con nanopartfculas (TiO2-P25 d = 3,8) y con irradiacion: puntos de drculos abiertos

La Figura 12I muestra la viabilidad celular (% de control) despues de una irradiacion de 2 Gy utilizando nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de CeO2 (400 pM) con densidad de 6,6 g/cm3 (ejemplo 10 e)).

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y sin irradiacion: puntos de cuadrados llenos

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y con irradiacion: puntos de rombos abiertos

Con nanopartfculas (CeO2-D d = 6,6) y sin irradiacion: puntos de triangulos llenos

Con nanopartfculas (CeO2-D d = 6,6) y con irradiacion: puntos de drculos abiertos

La Figura 12J muestra la viabilidad celular (% de control) despues de una irradiacion de 2 Gy utilizando nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de Nd2O3 (400 pM) con densidad de 5,4 g/cm3 (ejemplo 10 e)).

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y sin irradiacion: puntos de cuadrados llenos

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y con irradiacion: puntos de rombos abiertos

Con nanopartfculas (Nd2O3-Z d = 5,4) y sin irradiacion: puntos de triangulos llenos

Con nanopartfculas (Nd2O3-Z d = 5,4) y con irradiacion: puntos de drculos abiertos

La Figura 12K muestra la viabilidad celular (% de control) despues de una irradiacion de 2 Gy utilizando nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de Eu2O3 (400 pM) con densidad de 5,6 g/cm3 (ejemplo 10 e)).

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y sin irradiacion: puntos de cuadrados llenos

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y con irradiacion: puntos de rombos abiertos

Con nanopartfculas (Eu2O3-B d = 5,6) y sin irradiacion: puntos de triangulos llenos

Con nanopartfculas (Eu2O3-B d = 5,6) y con irradiacion: puntos de drculos abiertos

La Figura 12L muestra la viabilidad celular (% de control) despues de una irradiacion de 2 Gy utilizando nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de WO3 (400 pM) con densidad de 7,2 g/cm3 (ejemplo 10 e)).

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y sin irradiacion: puntos de cuadrados llenos

Con nanopartfculas (HfO2-Ref. /ejemplo 3 / d = 8,3) y con irradiacion: puntos de rombos abiertos

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Con nanopartfculas (WO3-C d = 7,2) y sin irradiacion: puntos de triangulos llenos Con nanopartfculas (WO3-C d = 7,2) y con irradiacion: puntos de drculos abiertos

La Figura 13 muestra la eficiencia relativa (capacidad para inducir la muerte celular) expresada como porcentaje. Dicha eficiencia relativa refleja la viabilidad celular (% de control) despues de una irradiacion de 2 Gy de las partfculas ensayadas en el ejemplo 10, a 800 jM, cuando se compara con el tratamiento radioterapeutico solo (sin nanopartfculas), con respecto a la viabilidad celular (% de control) de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de HfO2 biocompatibles (vease el ejemplo 3), a 800 jM, cuando se compara con el tratamiento radioterapeutico solo (sin nanopartfculas).

Se distinguen dos grupos de nanopartfculas con diferencias importantes en terminos de eficiencia:

- densidad < 7 g/cm3: la eficiencia relativa de las nanopartfculas ensayadas es inferior a aproximadamente el 55 %

- densidad > 7 g/cm3: la eficiencia relativa de las nanopartfculas ensayadas es superior a aproximadamente el 80 %

La Figura 14 revela la estabilidad o falta de estabilidad de las nanopartfculas (vease CeO2-D del ejemplo 10 e), TiO2- 5 nm del ejemplo 10d) y HfO2 del ejemplo 3) a concentracion de aproximadamente 5 g/L, comprendiendo o no una cubierta biocompatible de HMP, en diferentes condiciones: se incubaron las muestras durante 2 horas en agua o en una solucion de glucosa al 5 % a pH 3 o pH 7 (vease el ejemplo 11).

La Figura 15 muestra los resultados de los ensayos de filtracion por 0,22 jm (vease el ejemplo 11): las diferentes muestras (CeO2-D del ejemplo 10 e), TiO2-5 nm del ejemplo 10d) y HfO2 del ejemplo 3) contienen o no una cubierta biocompatible de HMP (incubadas durante 2 horas en agua o en una solucion de glucosa al 5 % a pH 7). Las concentraciones se expresan en g/L y el rendimiento de la filtracion en %.

Descripcion detallada de la invencion

Ha sido encontrado sorprendentemente, por los inventores, que una nanopartfcula hecha de un material inorganico que comprende oxfgeno, preferiblemente un material inorganico cristalizado que comprende oxfgeno, aun mas preferiblemente un oxido, siendo la densidad de dicho material inorganico de al menos 7 g/cm3, preferiblemente por encima de 7 g/cm3, en particular, para una nanopartfcula hecha de un oxido, por encima de 7 g/cm3 y por debajo de 15 g/cm3, puede mejorar el efecto terapeutico de una irradiacion local destinada a perturbar, alterar o destruir las celulas, tejidos u organos anormales en un animal. Tfpicamente, la densidad de la nanopartfcula es de al menos 7,1 g/cm3 cuando el oxido metalico es CeO2, de al menos 8,3 g/cm3 cuando el oxido metalico es T1TI2O3, de al menos 7,4 g/cm3 cuando el oxido metalico es HfO2, de al menos 7,2 g/cm3 cuando el oxido metalico es WO3, y de al menos 7,9 g/cm3 cuando el oxido metalico es PdO.

Se puede observar por primera vez un fuerte aumento de la eficacia de la radioterapia in vitro utilizando nanopartfculas segun la presente invencion (vease las figuras 5B, 8, 10, 11A y 11B, por ejemplo).

Los inventores proporcionan en la presente memoria la prueba de que los tumores en animales se reducen de tamano y eventualmente desaparecen (remision completa) despues de la inyeccion de las nanopartfculas descritas aqrn, cuando dichos animales se exponen localmente a una irradiacion de dosis baja capaz de activar dichas nanopartfculas (vease la parte experimental y las figuras 6, 7 y 9).

El termino "nanopartfcula" o "agregado de nanopartfculas" se refiere a productos sinteticos de pequeno tamano. Su forma puede ser, por ejemplo, redonda, plana, alargada, esferica u oval. La forma se puede determinar o controlar por el metodo de produccion, y puede ser adaptada por los expertos en la tecnica segun las aplicaciones deseadas.

La forma de las partfculas no tiene una gran influencia sobre sus propiedades. Sin embargo, la forma puede influir en la "biocompatibilidad" de las partfculas. Por lo tanto, por razones farmacocineticas, se prefieren nanopartfculas o agregados de nanopartfculas que sean esencialmente de forma alargada, esferica o redonda. Se prefiere particularmente la forma esferica o redonda. Tambien, se prefieren partfculas o agregados de nanopartfculas que tengan una forma bastante homogenea.

De una manera preferida, el tamano de las partfculas o agregados de nanopartfculas segun la invencion esta comprendido, tipicamente, entre aproximadamente 3 nm y 400 nm, preferiblemente entre aproximadamente 5, 10, 15 o 20 nm y 200 nm, aun mas preferiblemente entre aproximadamente 20 y 100 nm o aproximadamente 40 nm y 100 nm.

En realidad, el tamano de los objetos debe ser idealmente suficientemente pequeno para que puedan difundirse en el cuerpo (tejidos, celulas, vasos sangumeos, etc.), esencialmente sin ser capturados por los macrofagos (fagocitosis) y sin causar una obstruccion significativa. Ventajosamente, estos efectos se pueden obtener en los seres humanos con partfculas que tienen un tamano medio de partfcula inferior a 100 nm.

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La agregacion puede llevar a la fusion de las nanopartfculas individuales dentro de la estructura de agregado.

Se prefieren las nanopartfculas que tienen un area superficial espedfica baja, con el fin de limitar sus interacciones con el entorno circundante. Para el proposito de la presente invencion, el area superficial espedfica de la nanopartfcula esta comprendida, por ejemplo, entre aproximadamente 10 m2/g y 80 m2/g. El area superficial espedfica esta comprendida preferiblemente entre 20 y 60 m2/g.

La sorprendente eficiencia de las nanopartfculas descritas en la presente memoria, se debe principalmente a la naturaleza de su material constitutivo que es un material inorganico que comprende oxfgeno, preferiblemente un material cristalizado, cuya densidad es de al menos 7 g/cm3, preferiblemente por encima de 7 g/cm3, en particular, para una nanopartfcula hecha de un oxido, por encima de 7 g/cm3 y por debajo de 15 g/cm3, en particular entre 8 y 14 g/cm3, u 8 y 12 g/cm3. Tfpicamente, la densidad de la nanopartfcula es de al menos 7,1 g/cm3 cuando el oxido metalico es CeO2, de al menos 8,3 g/cm3 cuando el oxido metalico es T1TI2O3, de al menos 7,4 g/cm3 cuando el oxido metalico es HfO2, de al menos 7,2 g/cm3 cuando el oxido metalico es WO3, y de al menos 7,9 g/cm3 cuando el oxido metalico es PdO. Una nanopartfcula de este tipo es, en efecto, capaz de absorber radiaciones ionizantes y de emitir una cantidad suficiente de electrones y/o fotones de alta energfa, en particular cuando se utilizan radiaciones ionizantes de baja intensidad, para que sean directamente responsables de la alteracion o destruccion de una celula, tejido u organo diana. Se debe observar que la presente invencion se puede utilizar tambien ventajosamente con radiaciones ionizantes de alta intensidad (vease la figura 11B)

Las dosis de radiaciones ionizantes son preferiblemente dosis comprendidas entre aproximadamente 0,05 grays y 6 grays para aplicaciones realizadas in vitro.

Las dosis estan comprendidas entre mas de 0,05 grays y menos de 16 o 30 grays para aplicaciones realizadas ex vivo o in vivo. Las radiaciones ionizantes totales vanan de 1,5 grays hasta aproximadamente 85 grays en el ser humano segun la practica actual.

La dosis total de radiaciones administrada se puede dar siguiendo diferentes programas tales como de dosis unica, dosis fraccionada, dosis hiperfraccionada, etc.

Las nanopartfculas irradiadas descritas en esta memoria, proporcionan, como se demuestra en la seccion experimental, una clara mejora del efecto terapeutico en comparacion con la radioterapia estandar.

El material inorganico mencionado antes es preferiblemente un material inorganico. En la presente invencion, el material inorganico es un oxido como se indica en las reivindicaciones. Un oxido es un compuesto qmmico que contiene al menos un atomo de oxfgeno y al menos un segundo elemento qmmico distinto. Dicho elemento qmmico distinto se puede utilizar como un precursor en los metodos descritos aqm para preparar una nanopartfcula o agregado de nanopartfculas. En el contexto de la presente invencion, un oxido preferido es un oxido metalico (MxOy) (vease “Metal Oxide Chemistry and Synthesis - from solution to solid state”, Jean-Pierre Jolivet, Savoirs Actuels InterEditions/ CNRS, Editions 1994) y un tungstato (Mx((WO4)y).

El oxido metalico de interes descrito en la presente memoria, se puede seleccionar del grupo que consiste en un oxido de un elemento lantanido y un oxido de un elemento qmmico (metalico) de la tabla periodica de los elementos (tabla de Mendeleyev), en particular un oxido de un elemento metalico de los periodos 5 y 6 de la tabla periodica.

Se indican a continuacion, ejemplos de elementos, descritos en la presente memoria, que pueden ser utilizados:

- los oxidos apropiados de un elemento lantanido se pueden seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste en

CeO2, Nd2O3, Sm2O3, Eu2O3, Gd2O3, Tb2O3, Dy2O3, Ho2O3, Er2O3, Tm2O3, Yb2O3, Lu2O3 y mezclas de los

mismos;

- los oxidos apropiados de un elemento metalico del penodo 6 de la tabla periodica de los elementos se pueden seleccionar por ejemplo del grupo que consiste en HFO2, TaO2, Ta2O5, WO2, WO3, ReO2, OsO2, IrO2, PtO, PtO2, HgO, Hg2O, TI2O3, PbO, Pb2O3, Pb3O4, PbO2, PoO2, Bi2O3 y mezclas de los mismos;

- los oxidos apropiados de un elemento metalico del penodo 5 de la tabla periodica de los elementos se pueden seleccionar por ejemplo del grupo que consiste en NbO, RuO2, Rh2O3, RhO2, PdO, Ag2O, AgO, CdO, In2O3, y mezclas de los mismos.

El tungstato (Mx(WO4)y) se describe tambien en esta memoria como un material inorganico que comprende oxfgeno.

Los tungstatos preferidos se pueden seleccionar del grupo que consiste, por ejemplo, en FeWO4, CuWO4, MnWO4, PbWO4 y mezclas de los mismos.

Tambien es posible la mezcla de oxidos y tungstatos en una nanopartfcula particular.

Como se ha indicado previamente, se describen aqm nanopartfculas de interes que tienen que ser hechas de un material inorganico que comprende oxfgeno, siendo la densidad de dicho material inorganico de al menos 7 g/cm3,

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preferiblemente por encima de 7 g/cm3, en particular, para una nanopartfcula hecha de un oxido, por encima de 7 g/cm3 y por debajo de 15 g/cm3, en particular entre 8 y 14 g/cm3, u 8 y 12 g/cm3.

La densidad es masa m por unidad de volumen V. En el contexto de la presente invencion, se obtiene una mejor eficacia terapeutica utilizando nanopartfculas que tienen una densidad alta.

El umbral de densidad requerido para conseguir tal mejora de la eficacia terapeutica ha sido descrito aqu por los inventores, como de 7 g/cm3. Se debe entender que se prefieren las densidades mas altas. Las densidades descritas son de al menos 7,5 g/cm3, preferiblemente de al menos 8 g/cm3, incluso mas preferiblemente de al menos 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5 o 14 g/cm3.

La densidad de las nanopartfculas o agregados de nanopartfculas se determina a partir de aproximadamente 1 g de polvo seco utilizando un equipo de picnometro Accupyc 1340.

Las nanopartfculas descritas en esta memoria se hacen preferiblemente de un material inorganico que tiene un numero atomico efectivo (Zeff) de al menos 50, preferiblemente al menos 60 o 61, mas preferiblemente de al menos 65, 66, 67 o incluso 68.

Numero atomico efectivo es un termino que es similar al numero atomico pero que se utiliza para compuestos (por ejemplo, agua) y mezclas de diferentes materiales (tales como tejidos y huesos) mas que para atomos. El numero atomico efectivo calcula el numero atomico medio para un compuesto o mezcla de materiales. Se abrevia como Zeff.

El numero atomico efectivo se calcula tomando la proporcion fraccionaria de cada atomo en el compuesto y multiplicandola por el numero atomico del atomo. La formula para el numero atomico efectivo, Zeff, es la siguiente:

imagen1

donde

fn es la fraccion del numero total de electrones asociados con cada elemento, y Zn es el numero atomico de cada elemento.

El numero atomico (conocido tambien como el numero de protones) es el numero de protones que se encuentra en el nucleo de un atomo. Se representa tradicionalmente por el sfmbolo Z. El numero atomico identifica de forma unica un elemento qmmico. En un atomo de carga neutra, el numero atomico es igual al numero de electrones.

Un ejemplo es el del agua (H2O) que se compone de dos atomos de hidrogeno (Z = 1) y un atomo de oxfgeno (Z = 8). El numero total de electrones es 1 + 1 + 8 = 10. La fraccion de electrones correspondientes a los dos hidrogenos es 2/10 y la fraccion de electrones correspondientes al unico oxfgeno es (8/10). Por lo tanto, el Zeff del agua es:

imagen2

El Zeff participa en la capacidad de las nanopartfculas para la absorcion de las radiaciones entrantes.

La siguiente tabla 1 proporciona ejemplos de compuestos de interes, e identifica su respectiva densidad y Zeff. Tabla 1:

Oxido

Formula Zeff Densidad (g/cm3)

Oxido de cerio (IV)

CeO2 53,40 7,2

Oxido de neodimio (III)

Nd2O3 56,40 7,2

Oxido de samario (III)

sm2O3 58,39 7,6

Oxido de europio (III)

Eu2O3 59,38 7,4

Oxido de gadolinio (III)

Gd2O3 60,37 7,4

Oxido de terbio (III)

Tb2O3 61,37 7,9

Oxido de disprosio (III)

Dy2O3 62,36 7,8

Oxido de holmio

Ho2O3 63,36 8,4

Oxido de erbio

Er2O3 64,35 8,6

Oxido de tulio (III)

Tm2O3 65,34 8,6

Oxido de iterbio

Yb2O3 66,34 9,2

Oxido de lutecio

Lu2O3 67,33 9,4

Oxido de hafnio (IV)

HfO2 67,26 9,7

Oxido de tantalio (IV)

TaO2 68,25 10,0

Oxido de tantalio (V)

Ta2O5 67,24 8,2

Oxido de tungsteno (IV)

WO2 69,24 10,8

Oxido de tungsteno (VI)

WO3 67,27 7,2

Oxido de renio (IV)

ReO2 70,23 11,4

Oxido de osmio (IV)

OsO2 71,23 11,4

Oxido de iridio (IV)

IrO2 72,22 11,7

Oxido de platino (II)

PtO 75,46 14,1

Oxido de platino (IV)

PtO2 73,21 11,8

Oxido de mercurio (I)

Hg2O 78,68 9,8

Oxido de mercurio (II)

HgO 77,45 11,1

Oxido de talio (III)

TI2O3 77,29 10,2

Oxido de plomo (II) (masicotita)

PbO 79,45 9,6

Oxido de plomo (IV)

PbO2 77,18 9,6

Oxido de plomo (II, IV)

Pb2O3 78,28 10,1

Oxido de plomo (II, II, IV)

Pb3O4 78,66 8,9

Oxido de polonio (IV)

PoO2 79,17 8,9

Oxido de bismuto

Bi2O3 79,28 8,9

Oxido de niobio (II)

NbO 38,61 7,3

Oxido de rutenio (IV)

RuO2 39,63 7,1

Oxido de rodio (III)

Rh2O3 41,55 8,2

Oxido de rodio (IV)

RhO2 40,61 7,2

Oxido de paladio (II)

PdO 43,57 8,3

Oxido de plata (I)

Ag2O 45,72 7,2

Oxido de plata (II)

AgO 44,57 7,5

Oxido de cadmio

CdO 45,56 8,2

Oxido de indio

In2O3 45,50 7,2

Tungstato

Formula Zeff Densidad (g/cm3)

Tungstato de hierro

FeWO4 61,1 7,5

Tungstato de cobre

CuWO4 60,8 7,5

Tungstato de plomo

PbWO4 73,6 8,5

A mas alta densidad y Zeff de la nanopartfcula o agregado de nanopartfculas, mas eficiente es la absorcion de las 5 radiaciones ionizantes. La emision de electrones y/o fotones de alta energfa se amplifica entonces, despues de la irradiacion, mejorando de este modo la eficacia terapeutica.

Los inventores destacan sorprendentemente en esta memoria el papel fundamental y directo del parametro densidad sobre la amplificacion de la emision de fotones y electrones, permitiendo dicha amplificacion aplicaciones terapeuticas en un marnffero, como se explica aqm, cuando la densidad alcanza, y preferiblemente excede, el 10 umbral de 7 g/cm3 (vease la parte experimental). Los ejemplos 4, 10 a) y 10 b) en lo que se refiere a nanopartfculas de HfO2 y CeO2, proporcionan ademas resultados que destacan la sorprendente influencia de la densidad para un Zeff constante.

Las nanopartfculas o agregados segun la presente invencion, son ventajosamente biocompatibles, es decir, se pueden administrar de forma segura a un organismo animal, tfpicamente a un mairnfero, en particular a un ser

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humano, para proporcionar su efecto terapeutico. Dicha biocompatibilidad se puede asegurar, por ejemplo, por la naturaleza de los compuestos o materiales que constituyen la partfcula y/o por una cubierta opcional.

Las nanopartfculas o agregados preferidos segun la invencion, se cubren con una cubierta biocompatible. Cuando las nanopartfculas y/o los agregados de la presente invencion se administran a un sujeto por via intravenosa (IV), tal cubierta biocompatible es particularmente ventajosa para optimizar la biodistribucion de las nanopartfculas y agregados en el contexto del efecto EPR descrito anteriormente. Se requiere una cubierta biocompatible completa de la nanopartfcula o agregado, en particular en el contexto IV, con el fin de evitar la interaccion de la superficie de la partfcula con cualquier elemento de reconocimiento (macrofago, opsoninas, etc.). La “cubierta completa” implica la presencia de una densidad muy alta de moleculas biocompatibles capaces de crear al menos una monocapa completa sobre la superficie de la partfcula. Dicha cubierta es responsable del llamado “efecto de sigilo” de la nanopartfcula o agregado.

La cubierta biocompatible permite en particular la estabilidad de la nanopartfcula a pH entre 6,5 y 7,5 en una suspension biocompatible, tal como un fluido fisiologico (sangre, plasma, suero, etc.), cualquier medio isotonico o medio fisiologico, por ejemplo, un medio que comprende glucosa (al 5 %) y/o NaCl (al 0,9 %) (vease el ejemplo 11 y la figura 14), que es necesario para una administracion farmaceutica.

Tal cubierta biocompatible se obtiene tratando la nanopartfcula con un agente de tratamiento de superficie.

La estabilidad se puede confirmar mediante la cuantificacion del extracto seco medido en una suspension de nanopartfculas antes y despues de filtracion por un filtro de 0,22 pm (vease el ejemplo 11 y la figura 15).

Ventajosamente, dicha cubierta conserva la integridad de las partfculas in vivo, asegura o mejora la biocompatibilidad de las mismas, y facilita una funcionalizacion opcional de las mismas (por ejemplo, con moleculas espaciadoras, polfmeros biocompatibles, agentes que se dirigen a objetivos, protemas, etc.). Una nanopartfcula especial, segun la presente invencion, comprende ademas, en efecto, un agente dirigido al objetivo que permite su interaccion con un elemento de reconocimiento presente en la celula diana. Dichos agentes dirigidos al objetivo actuaran una vez que las nanopartfculas o agregados se acumulan en el tumor. Como la conformacion del agente dirigido al objetivo sera responsable de su interaccion con el objetivo, la densidad de dicho agente dirigido al objetivo debera ser controlada cuidadosamente. Una densidad alta del mismo puede, en efecto, perturbar la conformacion del agente dirigido al objetivo y en consecuencia su reconocimiento por el objetivo (“Folate-targeted, cationic liposome-mediated gene transfer into disseminated peritoneal tumors”; J.A. Reddy, C. Abburi, H. Hofland, S.J. Howard, I. Vlahov, P. Wils & C. P. Leamon; Gene Therapy (2002) 9 p1542-1550 / “Folate targeting of drug carriers: A mathematical model”; Ketan B. Ghaghadaa,b, Justin Sauld,e, ayaganesh V Natarajanb,c, Ravi V. Bellamkondad,e, Ananth V. Annapragadaa,b,T; Journal of Controlled Release 104 (2005) 113-128). Ademas, una densidad alta del agente dirigido al objetivo puede favorecer el aclaramiento de las nanopartfculas por el sistema retfculo-endotelial (RES) durante la circulacion en el sistema vascular.

La cubierta biocompatible puede estar compuesta de alguna estructura amorfa o cristalina. Es preferible que la cubierta permita la difusion de moleculas pequenas y radicales libres. En particular, es importante que la cubierta permita el paso del agua (o el O2) y, preferiblemente, el paso de su forma radical (la cubierta biocompatible no se disolvera a pH entre 6,5 y 7,5). Esto se puede conseguir utilizando materiales que sean porosos y/o anadiendo una capa de cubierta que tenga un espesor bajo y que sea porosa. Por lo tanto, una porosidad tfpica de la cubierta esta comprendida entre aproximadamente 0,05 y 10 nm, preferiblemente 0,1 o 0,2 y 5 nm. Un espesor tfpico de la cubierta esta generalmente comprendido entre aproximadamente 0,2 y 50 nm, por ejemplo, entre aproximadamente 0,5 y 5 nm o aproximadamente 10 y 40 nm.

En general, la cubierta puede ser no biodegradable o biodegradable. Ambas opciones se pueden utilizar para el proposito de esta invencion.

Son ejemplos de cubiertas no biodegradables uno o mas materiales o agentes de tratamiento de superficie seleccionados del grupo que consiste en sflice, alumina, azucar (agarosa, por ejemplo), fosfato, silano, compuestos zwitterionicos, lfpidos, polfmeros carbonados saturados (poli(oxido de etileno) por ejemplo) y polfmeros inorganicos, reticulados o no, modificados o no (polimetacrilato o poliestireno, por ejemplo), asf como combinaciones de los mismos.

Son ejemplos de cubiertas biodegradables, por ejemplo, uno o mas materiales o agentes de tratamiento de superficie seleccionados del grupo que consiste en una molecula biologica, modificada o no, natural o no, y un polfmero molecular biologico; modificado o no, de forma natural o no. El polfmero biologico puede ser un fosfolfpido, un sacarido, un oligosacarido o un polisacarido, polisulfatado o no, por ejemplo, dextrano.

Los materiales mencionados antes, compuestos o agentes de tratamiento de superficie, se pueden usar solos o en combinaciones, mezclas o ensamblajes, combinados o no, covalentes o no, opcionalmente en combinacion con otros compuestos. Por otra parte, tambien es posible utilizar uno cualquiera de los materiales mencionados antes, siendo dicho material naturalmente soluble en agua o soluble en lfpidos o siendo modificado artificialmente para llegar a ser soluble en agua o soluble en lfpidos.

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La cubierta biocompatible comprende preferiblemente o esta hecha de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un agente inorganico, un agente metalico, un agente organico, y una mezcla o combinacion de los mismos.

El agente inorganico apropiado se puede seleccionar del grupo que consiste en un oxido, un hidroxido, y un oxihidroxido. El agente inorganico puede comprender, por ejemplo, silicio, aluminio, zirconio, calcio, magnesio y/o estano.

Tales agentes se pueden utilizar para cargar la nanopartfcula, ya sea positiva o negativamente con el fin de modular las interacciones de dicha nanopartfcula con los medios biologicos.

Un agente inorganico seleccionado del grupo que consiste en, por ejemplo, magnesio y calcio, llevara una carga positiva a la superficie de la nanopartfcula a un pH 7.

Por ejemplo, se puede utilizar el silicio para llevar una carga negativa a la superficie de la nanopartfcula a un pH 7.

El agente metalico apropiado se puede seleccionar del grupo que consiste en oro, plata y platino.

Un agente organico apropiado puede ser cualquier agente que comprenda una funcion capaz de interactuar con una nanopartfcula segun la presente invencion y una funcion capaz de conferir biocompatibilidad a dicha nanopartfcula.

El agente que comprende una funcion capaz de interactuar con una nanopartfcula puede ser, por ejemplo, un carboxilato (R -COO"), un sulfato (R-SO42"), un alcohol (R-OH), un silano (R-Si(OR)3), una amina (R-NH2), un amonio cuaternario (R-NH4+), una funcion fosfonica (R-PO(OH)2) o una funcion fosforica (RO-PO(OH)2).

El agente que comprende una funcion capaz de conferir biocompatibilidad a una nanopartfcula segun la presente invencion, puede tener una funcion esterica y/o una funcion electrostatica. Tal agente con una funcion esterica se puede seleccionar del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), oxido de polietileno, alcohol polivimlico, poliacrilato, poliacrilamida (poli(N-isopropilacrilamida)), policarbamida, un biopolfmero o un polisacarido tal como dextrano, xilano, celulosa, colageno, y un compuesto zwitterionico tal como polisulfobetama, etc.

El agente con una funcion electrostatica positiva puede ser una amina tal como aminopropiltrietoxisilano, o polilisina.

El agente con una funcion electrostatica negativa se puede seleccionar del grupo que consiste en fosfato (por ejemplo, un polifosfato, un metafosfato, un pirofosfato, etc.), carboxilato (por ejemplo, citrato o acido dicarboxflico, en particular, acido succmico) y sulfato.

La cubierta puede contener tambien diferentes grupos funcionales (o segmentos de enlace), que permiten que cualquier molecula de interes se una a la superficie de la partfcula.

Un ejemplo tfpico de una nanopartfcula segun la invencion es una nanopartfcula hecha de HfO2 que comprende un compuesto de fosfato tal como trimetafosfato de sodio (STMP) o hexametafosfato de sodio (HMP) como una cubierta biocompatible.

Otro ejemplo de una nanopartfcula segun la invencion es una nanopartfcula hecha de HfO2, que comprende, como una cubierta biocompatible, un silano que lleva al menos un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en un agente metalico, polietileno, un oxido, una amina, un anhfdrido, un fosfato y cualquier combinacion de los mismos.

Otro objetivo descrito en la presente memoria, se refiere a un metodo para producir una nanopartfcula o agregado de nanopartfculas tal como se ha definido aqm antes o una mezcla de los mismos, que comprende:

- proporcionar un elemento qmmico que permite la preparacion de un material inorganico que comprende oxfgeno, siendo la densidad de dicho material de al menos 7 g/cm3, preferiblemente por encima de 7 g/cm3, en particular, para una nanopartfcula hecha de un oxido, por encima de 7 g/cm3 y por debajo de 15 g/cm3,

- preparar una nanopartfcula o agregado de nanopartfculas a partir de dicho elemento qmmico por precipitacion de dicho elemento qmmico en un medio polar (tal como una solucion acuosa, una solucion alcoholica, etc.) y por cristalizacion, y, opcionalmente

- recubrir la nanopartfcula o agregado utilizando un agente de tratamiento de superficie como se ha descrito previamente.

Durante la etapa de precipitacion:

- el pH se ajusta preferiblemente, ventajosamente, entre aproximadamente 7 y 14;

- la concentracion del precursor (elemento qmmico) se ajusta preferiblemente, ventajosamente, entre aproximadamente 10-3 y 3 mol/L;

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- la fuerza ionica se ajusta preferiblemente, ventajosamente, entre aproximadamente 10-3 mol/L y 5 mol/L; preferiblemente entre aproximadamente 10-3 mol/L y 3 mol/L;

- la temperatura se ajusta preferiblemente, ventajosamente, entre aproximadamente 20 °C y 350 °C.

Antes de ser opcionalmente recubierto, el material inorganico se recristaliza preferiblemente, por ejemplo, por medio de tratamiento termico (dicho tratamiento puede ir seguido por una etapa de molienda seca o humeda). Las etapas de precipitacion y cristalizacion se pueden llevar a cabo de forma simultanea o secuencial.

Se puede anadir ademas un agente secuestrante (complejante) al medio de polar para ayudar a alcanzar la fase de cristalizacion, cristalinidad, forma de las partfculas, tamano de partfcula y/o densidad deseadas.

El material cristalizado tambien puede ser lavado (para eliminar cualquier impureza) y/o peptizado (para llevar una carga electrica sobre la superficie de la parrtcula inorganica con el fin de conferir estabilidad a dicha nanoparrtcula a un pH dado).

La etapa de recubrimiento consiste ventajosamente en poner la nanopartfcula o agregado de nanopartfculas en contacto con un agente de tratamiento de superficie (llamado tambien en esta memoria "recubrimiento") como se ha definido previamente.

En un aspecto particular de la descripcion, un metodo para producir una suspension de nanoparrtculas

biocompatibles, agregados de nanopartfculas o una mezcla de los mismos, comprende las siguientes etapas,

preferiblemente en orden:

a) proporcionar como precursor, un elemento qmmico del grupo de los lantanidos, o del penodo 5 o 6 de la tabla periodica, que es capaz de formar un material inorganico que comprende oxfgeno, en particular, un oxido o un tungstato, preferiblemente un oxido, siendo la densidad de dicho material de al menos 7 g/cm3, preferiblemente por encima de 7 g/cm3, en particular, para una nanoparrtcula hecha de un oxido, por encima de 7 g/cm3 y por debajo de 15 g/cm3, en particular, entre 8 y 14 g/cm3, u 8 y 12 g/cm3,

b) precipitar el precursor de la etapa a) en un medio polar, preferiblemente mediante el ajuste del pH, la

temperatura, la fuerza ionica del medio y/o la concentracion del precursor, y anadiendo opcionalmente un

agente complejante,

c) opcionalmente cristalizar el precipitado mediante un tratamiento termico,

d) opcionalmente lavar la suspension obtenida al final de la etapa b) o c) para eliminar cualquier impureza, sal y/o agente complejante presente en la misma,

e) opcionalmente realizar una etapa de peptizacion con el fin de llevar una carga a la superficie de las nanopartfculas o agregados presentes en la suspension, y opcionalmente

f) recubrir las nanopartfculas o agregados.

El pH de la suspension de nanopartfculas o agregados de nanoparrtculas obtenida con un metodo como el descrito anteriormente, se puede ajustar con un medio fisiologico (a pH entre 6,5 y 7,5).

Las suspensiones descritas anteriormente se pueden someter ademas a una etapa de formulacion antes de ser administradas a un sujeto.

En un ejemplo particular, un metodo para producir una nanopartfcula o agregado de nanopartfculas, estando la nanoparrtcula hecha de, o comprendiendo un nucleo de, HfO2, comprende preferiblemente las siguientes etapas, en orden:

- precipitar una solucion de precursor de hafnio (tal como en particular solucion de HfCU o HfOCh) con una base, tal como, en particular, hidroxido de tetrametilamonio (TMAOH),

- cristalizar la suspension inorganica amorfa obtenida de este modo, por ejemplo, por medio de tratamiento termico por encima de 50 °C, preferiblemente al menos 100 °C, mientras se agita opcionalmente la suspension,

- opcionalmente lavar y/o peptizar el material cristalizado obtenido de este modo,

- opcionalmente recubrir dicho material cristalizado poniendo dicho material en contacto con un agente de tratamiento de superficie como se ha definido previamente.

Otro objetivo de la descripcion se basa en cualquier composicion que comprende nanopartfculas o agregados tales como se han definido anteriormente en esta memoria y/o que se pueden obtener por los metodos descritos aquf Aunque no es obligatorio, las partfculas de las composiciones descritas en esta memoria tienen ventajosamente un tamano y forma bastante homogeneos.

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Un objetivo particular de la descripcion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende partoulas o agregados de nanopartoulas tales como se han definido anteriormente en esta memoria y, opcionalmente, un excipiente o vehnculo farmaceuticamente aceptable.

Otro objetivo particular de la descripcion se refiere a una composicion para diagnostico o para formacion de imagenes que comprende partoulas o agregados de nanopartoulas tales como se han definido anteriormente y, opcionalmente, un excipiente o vetnculo fisiologicamente aceptable.

Las composiciones pueden estar en la forma de un solido, lfquido (partoulas en suspension), aerosol, gel, pasta, y similares. Las composiciones preferidas estan en forma lfquida.

El excipiente o vetnculo que se emplea puede ser cualquier soporte clasico para este tipo de aplicacion, tal como por ejemplo soluciones salinas, isotonicas, esteriles, tamponadas, y similares. Tambien pueden comprender estabilizantes, edulcorantes, tensioactivos.

Se pueden formular por ejemplo como ampollas, aerosoles, frascos, comprimidos, capsulas, utilizando tecnicas conocidas de formulacion farmaceutica.

En las composiciones descritas en esta memoria, las concentraciones apropiadas o deseables de nanopartoulas estan comprendidas entre aproximadamente 10-3 mg de nanopartoulas por gramo de tumor y aproximadamente 100 mg de nanopartoulas por gramo de tumor, en particular entre aproximadamente 5 y 50 mg de nanopartoulas por gramo de tumor. Esto incluye diferentes vfas de administracion.

En general, las composiciones en forma lfquida comprenden entre 0,05 g/L y 300 g/L de nanopartoulas, 0,05 g/L y 150 g/L, preferiblemente al menos 10 g/L, 20 g/L, 40 g/L, 45 g/L, 50 g/L, 55 g/L, 60 g/L, 80 g/L, 100 g/L, 150 g/L, 200 g/L o 250 g/L.

El extracto seco se mide idealmente despues de una etapa de secado de la suspension que comprende las nanopartoulas.

Las composiciones, las partfculas y los agregados de la invencion, se pueden utilizar en muchos campos, particularmente en medicina humana o veterinaria.

Es un objetivo de la presente descripcion utilizar una nanopartoula o agregado de nanopartoulas como se describe aqrn, para alterar, destruir o eliminar una celula, tejido u organo diana.

Bajo el efecto de las radiaciones ionizantes, rayos X, rayos gamma, isotopos radiactivos y/o haces de electrones en particular, las nanopartoulas se excitan y producen electrones y/o fotones de alta energfa.

Dichos electrones y/o fotones de alta energfa, al entrar en contacto con el medio circundante, agua u O2 en particular, pueden generar radicales libres y/o nuevas ionizaciones.

Dependiendo de la energfa de las radiaciones ionizantes, las partfculas pueden permitir asf la destruccion de tejidos y/o, simplemente, una visualizacion para formacion de imagenes y/o para fines de diagnostico.

Por lo tanto, se divulga aqrn el uso de una nanopartoula o agregado de nanopartoulas como se describe en la presente memoria, para preparar una composicion farmaceutica destinada a alterar, destruir o eliminar celulas diana en un animal, cuando dichas celulas se exponen a radiaciones, en particular a radiaciones ionizantes, y los metodos correspondientes.

El producto farmaceutico puede comprender ademas un compuesto terapeutico adicional, distinto de una nanopartfcula o agregado de nanopartoulas, destinado tambien a tratar el cancer.

Otro objetivo particular descrito aqrn se basa en un metodo para inducir o causar la lisis, apoptosis o destruccion de celulas diana, in vitro, ex vivo o in vivo, que comprende poner en contacto las celulas, en particular las celulas diana, con una o mas nanopartoulas o agregados de nanopartfculas tal como se han definido anteriormente en esta memoria, durante un penodo de tiempo suficiente para permitir que las partfculas o agregados penetren dentro de las celulas diana o interaction con dichas celulas y, exponer las celulas a radiaciones, siendo las radiaciones apropiadas, en particular, radiaciones ionizantes, preferiblemente rayos X, rayos gamma, isotopos radiactivos y/o haces de electrones, induciendo o causando dicha exposicion la lisis, apoptosis o destruccion de dichas celulas diana.

Las celulas diana pueden ser cualquier celula patologica, es decir, las celulas implicadas en un mecanismo patologico, por ejemplo, celulas proliferativas, tales como celulas tumorales, celulas estenosantes (celulas de fibroblastos/musculo liso), o celulas del sistema inmunitario (clones de celulas patologicas). Una aplicacion preferida se basa en el tratamiento (por ejemplo, la destruccion o alteracion funcional) de las celulas o tejidos malignos.

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A este respecto, un objetivo particular descrito aqrn se basa en el uso de composiciones, partoulas o agregados de nanopartoulas tal como se han definido antes en esta memoria (en combinacion con radiaciones ionizantes como se ha definido previamente) para producir una composicion farmaceutica destinada al tratamiento del cancer.

La presente divulgacion incluye ademas el uso de composiciones, partoulas o agregados de nanopartoulas tal como se han definido antes en esta memoria, para prevenir o tratar un cancer o para aliviar los smtomas de un cancer en un animal, cuando dichas celulas se exponen a radiaciones, en particular a radiaciones ionizantes como se ha definido previamente.

Otro objetivo particular descrito aqrn se basa en partoulas o agregados de nanopartoulas tal como se han definido antes en esta memoria, para uso en un metodo para inducir o causar la lisis o destruccion de celulas cancerosas, in vitro, ex vivo o in vivo, que comprende poner en contacto las celulas cancerosas con una o mas partoulas o agregados de nanopartoulas tal como se han definido antes en esta memoria, durante un penodo de tiempo suficiente para permitir que las partoulas o agregados penetren dentro de las celulas cancerosas o interaction con dichas celulas y, exponer las celulas a radiaciones, en particular a las radiaciones ionizantes como se han definido previamente, induciendo o causando dicha exposicion la lisis o destruccion de dichas celulas.

Otro objetivo descrito aqrn se refiere a una composicion, a nanopartoulas o agregados de nanopartoulas tal como se han definido antes en esta memoria, para uso en un metodo para prevenir o tratar un cancer o para aliviar los smtomas de un cancer en un sujeto o paciente, que comprende administrar al paciente que sufre de un cancer dicha composicion, nanopartoulas o agregados de nanopartoulas como se han definido anteriormente, en condiciones que permitan que las partoulas o agregados de nanopartoulas penetren dentro de las celulas anormales o interaction con dichas celulas, en particular celulas cancerosas, y posteriormente tratar al sujeto en presencia de una fuente de excitacion, en particular una fuente de radiaciones ionizantes, llevando a una alteracion, perturbacion o destruccion funcional de las celulas anormales del paciente, y de este modo prevenir o tratar un cancer.

El tratamiento clasico del cancer implica sistematicamente la concurrencia de tratamientos multimodales (combinacion de radioterapia y quimioterapia, por ejemplo).

Las nanopartoulas descritas en esta memoria, sometidas a radiaciones ionizantes, en el contexto de la radioterapia, se pueden utilizar en asociacion con un protocolo diferente de terapia de cancer. Dicho protocolo se puede seleccionar del grupo que consiste en cirugfa, radiocirugfa, quimioterapia, un tratamiento que comprende la administracion de citostaticos, citotoxicos, una terapia dirigida, una vacuna, radionucleidos, y cualquier otro producto biologico o inorganico destinado a tratar el cancer.

De modo sorprendente, las nanopartoulas descritas aqrn se pueden utilizar ademas en el contexto de la radioterapia sola con aumento observado de la eficacia.

La invencion se puede utilizar para tratar cualquier tipo de tumor maligno, tal como los tumores o tumores malignos hematologicos, y los tumores solidos, en particular de origen epitelial, neuroectodermico o mesenquimatoso. Ademas, las nanopartoulas se pueden utilizar para tratar una lesion premaligna o una enfermedad benigna espedfica donde la terapia de radiacion se utiliza clasicamente y/o esta indicada.

La invencion es aplicable, en el contexto de la terapia, a los tumores primarios, o invasiones secundarias, metastasis loco-regionales o distantes, y en el contexto de la profilaxis, a fin de evitar la afectacion secundaria maligna del sistema nervioso central tal como las invasiones observadas (metastasis) de melanoma, cancer de pulmon, cancer de rinon, cancer de mama, etc.

Las nanopartoulas se pueden utilizar en cualquier momento durante el penodo de tratamiento anticancer. Se pueden administrar por ejemplo como un neoadyuvante (antes de la intervencion quirurgica para la extirpacion del cancer) o como un adyuvante (despues de la cirugfa).

Las nanopartoulas se pueden utilizar tambien para tumores avanzados que no se pueden extirpar quirurgicamente.

Como se explica en la presente memoria, la irradiacion se puede aplicar en cualquier momento despues de la administracion de las partoulas, en una o mas ocasiones, mediante el uso de cualquier sistema disponible en la actualidad de radioterapia o radiograffa.

Las nanopartoulas descritas aqrn se destinan en particular a ser utilizadas para tratar un cancer donde la radioterapia es un tratamiento clasico. Dicho cancer se puede seleccionar en particular del grupo que consiste en cancer de piel, incluyendo neoplasmas malignos asociados con el SIDA, melanoma; tumores del sistema nervioso central, incluyendo los tumores de cerebro, tronco encefalico, cerebelo, hipofisis, conducto raqrndeo, el ojo y la orbita; tumores de cabeza y cuello; canceres de pulmon; canceres de mama; tumores gastrointestinales, tales como los canceres de hfgado y del tracto hepatobiliar, canceres de colon, recto y anal, cancer de estomago, pancreas, esofago; tumores genitourinarios masculinos, tales como los canceres de prostata, testoulos, pene y uretra; tumores ginecologicos, tales como los canceres de cuello uterino, de endometrio, ovarios, trompa de Falopio, vagina y vulva; los tumores suprarrenales y retroperitoneales; sarcomas de hueso y tejidos blandos, independientemente de la

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localizacion; linfoma; mieloma; leucemia; y tumores pediatricos tales como el tumor de Wilm, neuroblastoma, tumores del sistema nervioso central, sarcoma de Ewing, etc.

Las partfculas pueden ser excitadas dentro de un gran intervalo de dosis total de irradiacion. Las cantidades y los programas (planificacion y administracion de irradiaciones en una sola dosis, o en el contexto de un protocolo fraccionado o hiperfraccionado, etc.) se definen para cualquier enfermedad / sitio anatomico / estadfo de la enfermedad del paciente / edad del paciente (ninos, adultos, pacientes de edad avanzada), y constituye el estandar de cuidados para cualquier situacion espedfica.

La irradiacion se puede aplicar en cualquier momento despues de la administracion de las partfculas, en una o mas ocasiones, mediante el uso de cualquier sistema actualmente disponible de radioterapia o radiograffa. Las partfculas se pueden administrar por diferentes vfas tales como via local (intra-tumoral (IT) en particular), subcutanea, intravenosa (IV), intradermica, intraarterial, vfas respiratorias (inhalacion), intraperitoneal, intramuscular y oral (per os). Las partfculas se pueden administrar ademas en una intracavidad tal como la cavidad virtual del lecho tumoral despues de la tumorectoirna.

Se pueden realizar inyecciones o administraciones repetidas, cuando sea apropiado.

El termino "tratamiento" indica cualquier accion realizada para corregir funciones anormales, prevenir enfermedades, mejorar signos patologicos, tales como, en particular, la reduccion en el tamano o crecimiento de un tejido anormal, en particular de un tumor, el control de dicho tamano o crecimiento, la supresion o destruccion de celulas o tejidos anormales, la ralentizacion de la progresion de la enfermedad, la estabilizacion de la enfermedad con retraso de la progresion del cancer, la reduccion de la formacion de metastasis, la regresion de una enfermedad o la remision completa (en el contexto de cancer, por ejemplo), etc.

Como se ha indicado previamente, las radiaciones o fuentes de excitacion apropiadas son preferiblemente radiaciones ionizantes y se pueden seleccionar ventajosamente del grupo que consiste en rayos X, rayos gamma, haces de electrones, haces de iones e isotopos radiactivos o emisiones de radioisotopos. Los rayos X son una fuente de excitacion particularmente preferida.

Las radiaciones ionizantes son tfpicamente de aproximadamente 2 keV a aproximadamente 25.000 keV, en particular de aproximadamente 2 keV a aproximadamente 6000 keV (fuente LINAC), o de aproximadamente 2 keV a aproximadamente 1500 keV (tal como una fuente de cobalto 60).

En general, y de manera no restrictiva, los siguientes rayos X se pueden aplicar en diferentes casos para excitar las partfculas:

- Rayos X superficiales de 2 a 50 keV: para excitar las nanopartfculas cerca de la superficie (penetracion de unos milfmetros);

- Rayos X de 50 a 150 keV: en diagnostico, pero tambien en terapia;

- Rayos X (ortovoltaje) de 200 a 500 keV que pueden penetrar un espesor de tejido de 6 cm;

- Rayos X (megavoltaje) de 1000 keV a 25.000 keV. Por ejemplo, la excitacion de las nanopartfculas para el tratamiento del cancer de prostata se puede realizar por medio de cinco rayos X enfocados con una energfa de 15.000 keV.

Los isotopos radiactivos, se pueden utilizar alternativamente como una fuente de radiacion ionizante (denominada curieterapia o braquiterapia). En particular, se pueden utilizar ventajosamente, yodo I125 (t A = 60,1 dfas), paladio Pd103 (t A = 17 dfas), cesio Cs137 e iridio Ir192.

Las partfculas cargadas tales como haces de protones, haces de iones tal como carbono, en particular, haces de iones de alta energfa, se pueden utilizar tambien como una fuente de radiacion ionizante y/o haces de neutrones.

Los haces de electrones se pueden utilizar tambien como una fuente de radiacion ionizante con energfa comprendida entre 4 MeV y 25 MeV.

Se podnan utilizar fuentes espedficas de irradiacion monocromatica para generar selectivamente radiacion de rayos X de una energfa proxima a, o correspondiente a, la absorcion deseada de rayos X en el borde de los atomos del oxido de la nanopartfcula o agregado de nanopartfculas.

Preferiblemente, las fuentes de radiaciones ionizantes se pueden seleccionar entre las fuentes de Acelerador lineal (LINAC), cobalto 60 y braquiterapia.

En el campo del diagnostico, las nanopartfculas de la invencion se pueden utilizar como agentes de contraste, para detectar y/o visualizar cualquier tipo de tejido. Por lo tanto, un objetivo descrito en esta memoria es el uso de composiciones, partfculas o agregados de nanopartfculas tal como se han definido anteriormente, en combinacion

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con radiaciones, utilizando en particular dispositivos de radiograffa, para producir una composicion destinada a la deteccion o la visualizacion de celulas, tejidos u organos.

El termino "en combinacion" indica que se obtiene el efecto buscado cuando las celulas, tejidos u organos de interes, que tienen parcialmente incorporadas las nanopartfculas de la invencion, son excitados por la fuente definida. Sin embargo, no es necesario que las partfculas y los rayos sean administrados simultaneamente, ni segun el mismo protocolo.

La presente divulgacion proporciona ademas kits que comprenden una cualquiera o mas de las nanopardculas o composiciones descritas en esta memoria. Tfpicamente, el kit comprende al menos una nanopartfcula o agregado de nanopartfculas como se ha descrito aqrn. Generalmente, el kit comprende tambien uno o mas recipientes llenos con uno o mas de los ingredientes de las composiciones farmaceuticas descritas en la presente memoria. Asociado con tal recipiente o recipientes, se puede proporcionar un prospecto con instrucciones para el uso de las nanopartfculas, agregados de nanopartfculas o composiciones segun los presentes metodos.

Otros aspectos y ventajas de la invencion se pondran de manifiesto en los siguientes ejemplos.

Seccion experimental

Ejemplo 1: Suspension biocompatible de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de oxido de hafnio (HfO2) con una densidad superior a 7 g/cm3, utilizando trimetafosfato de sodio como agente de recubrimiento.

Se anade una solucion de hidroxido de tetrametilamonio (TMAOH) a 40 g de solucion de HfCU. La adicion de la solucion de TMAOH se realiza hasta que el pH de la suspension final alcance un pH comprendido entre 7 y 13. Se obtiene un precipitado blanco.

El precipitado se transfiere despues a un autoclave y se calienta a una temperatura comprendida entre 120 °C y 300 °C para llevar a cabo la cristalizacion. Despues de enfriar, se lava la suspension con agua desionizada.

Se realiza una etapa de peptizacion, con el fin de obtener una suspension estable de las nanopartfculas o agregados de nanopartfculas.

A continuacion, se anade la suspension de trimetafosfato de sodio a la solucion peptizada (siendo la cantidad de trimetafosfato de sodio anadida, inferior la dosis letal (LD) 50/5) y se ajusta el pH de la suspension a un pH comprendido entre 6,5 y 7,5.

Para los experimentos in vitro se realiza una etapa de esterilizacion en esta fase, utilizando un filtro de 0,22 pm.

Para los experimentos in vivo, se puede realizar una etapa de formulacion utilizando glucosa al 5 % antes o despues de la etapa de esterilizacion.

La siguiente tabla presenta las principales caractensticas de la suspension biocompatible de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas obtenida de este modo.

Densidad

Morfologfa (Vease la figura 2A) Superficie espedfica (SS) en m2/g Diametro hidrodinamico medio (O) en nm

8,5

Forma esferica 20 < SS < 60 15 <O <200

Ejemplo de referencia 2: Suspension biocompatible de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de oxido de hafnio (HfO2) con una densidad inferior a 7 g/cm3, utilizando trimetafosfato de sodio como agente de recubrimiento.

Se anade una solucion de hidroxido de tetrametilamonio (TMAOH) a 40 g de solucion de HfCU. La adicion de solucion de TMAOH se realiza hasta que el pH de la suspension final alcance un pH comprendido entre 1 y 5. Se obtiene un precipitado blanco.

El precipitado se transfiere despues a un autoclave y se calienta a una temperatura comprendida entre 120 °C y 300 °C para llevar a cabo la cristalizacion. Despues de enfriar, se lava la suspension con agua desionizada.

Se realiza una etapa de peptizacion, con el fin de obtener una suspension estable de las nanopartfculas o agregados de nanopartfculas.

A continuacion, se anade la suspension de trimetafosfato de sodio a la solucion peptizada (siendo la cantidad de trimetafosfato de sodio anadida inferior a la LD50/5) y se ajusta el pH de la suspension a un pH comprendido entre 6,5 y 7,5.

Para los experimentos in vitro se realiza una etapa de esterilizacion en esta fase, utilizando un filtro de 0,22 pm.

Para los experimentos in vivo, se puede realizar una etapa de formulacion utilizando glucosa al 5 % antes o despues de la etapa de esterilizacion.

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La siguiente tabla presenta las principales caractensticas de la suspension biocompatible de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas obtenida de este modo.

Densidad

Morfologfa Superficie especffica (SS) en m2/g Diametro hidrodinamico medio (O) en nm

6,5

Forma esferica 20 < SS < 60 15 < O < 200

Ejemplo 3: Suspension biocompatible de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de oxido de hafnio (HfO2) con una densidad superior a 7 g/cm3, utilizando hexametafosfato de sodio como agente de recubrimiento.

Se anade una solucion de hidroxido de tetrametilamonio (TMAOH) a 40 g de solucion de HfCl4. La adicion de solucion de TMAOH se realiza hasta que el pH de la suspension final alcance un pH comprendido entre 7 y 13. Se obtiene un precipitado blanco.

El precipitado se transfiere despues a un autoclave y se calienta a una temperature comprendida entre 120 °C y 300 °C para llevar a cabo la cristalizacion. Despues de enfriar, se lava la suspension con agua desionizada.

Se realiza una etapa de peptizacion, con el fin de obtener una suspension estable de las nanopartfculas o agregados de nanopartfculas.

A continuacion, se anade una suspension de hexametafosfato de sodio a la solucion peptizada (siendo la cantidad de hexametafosfato de sodio anadida inferior a la LD50/5) y se ajusta el pH de la suspension a un pH comprendido entre 6,5 y 7,5.

Para los experimentos in vitro se realiza una etapa de esterilizacion en esta fase, utilizando un filtro de 0,22 pm.

Para los experimentos in vivo, se puede realizar una etapa de formulacion utilizando glucosa al 5 % antes o despues de la etapa de esterilizacion.

La siguiente tabla presenta las principales caractensticas de la suspension biocompatible de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas obtenida de este modo.

Densidad

Morfologfa (Vease la figura 2A) Superficie especffica (SS) en m2/g Diametro hidrodinamico medio (O) en nm

8,3

Forma esferica 20 < SS < 60 15 < O < 200

Ejemplo 4:

Analisis de supervivencia de las celulas o analisis de la fraccion de supervivencia a x grays (SFx) utilizando una suspension biocompatible de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de HfO2 como se ha preparado en el ejemplo 1 y ejemplo 2 (figura 5B).

Materiales y metodo

Se determino la eficiencia de cultivo en placas para cada lmea celular de cancer de colon (celulas cancerosas HCT116 radiosensibles y HT29 radiorresistentes) antes de la determinacion de SFx. Se pusieron las celulas en placas de manera que se formaron 50 a 200 colonias por placa, y se incubaron entre 3 horas y toda la noche a 37 °C para permitir la adherencia. Se trataron entonces las celulas durante un tiempo maximo de incubacion de 24 horas con nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de HfO2 a 400 pM tanto del ejemplo 1 (con una densidad igual a 8,5) como del ejemplo 2 (con una densidad igual a 6,5).

Se llevo a cabo la irradiacion utilizando una irradiacion de 4 Gy para las celulas cancerosas HT29 y una irradiacion de 2 Gy para las celulas cancerosas HCT116, con un irradiador de 200 keV (Tubo Cometa MXR-225/22- 200 kV/15 mA/0,2 mm Cu). Despues de la irradiacion, se incubaron las celulas durante mas de 8 dfas a 37 °C antes de ser tenidas con cristal violeta al 0,5 % en metanol absoluto. Se contaron solo las colonias con al menos 50 celulas. Se determino la SFx por la siguiente formula:

SFx = [(numero de colonias) a dosis x / (numero total de celulas puestas en placas) a dosis x] * eficiencia de cultivo en placas

Resultados: Efecto de la densidad sobre las celulas radiosensibles o radiorresistentes

Como se muestra en la figura 5B, la irradiacion casi no tuvo ningun efecto significativo tanto sobre las celulas cancerosas radiosensibles (HCT116) como sobre las radiorresistentes (HT29) que tienen incorporadas o que estan en contacto con las nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de HfO2 del ejemplo 2 (densidad igual a 6,5), en comparacion con las celulas de control no tratadas. Sin embargo, el tratamiento de las celulas cancerosas con nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de HfO2 del ejemplo 1 (densidad igual a 8,5), dio como resultado un

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aumento significativo en el nivel de muerte celular inducida por la radiacion tanto en las celulas cancerosas radiosensibles (HCT116) como en las radiorresistentes (HT29).

Ejemplo 5:

Ensayo clonogenico utilizando la suspension biocompatible de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de HfO2 del ejemplo 3 (figura 8):

La supervivencia celular se cuantifico por el ensayo normalizado de formacion de colonias. Se transfirieron las placas de cultivo de vidrio al acelerador lineal inmediatamente despues de un tiempo maximo de incubacion de 24 horas de las celulas con las nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de HfO2 (400 jM). Se irradiaron las celulas con una dosis diferente de irradiacion (tasa de dosis: 1 Gy/min, 200 keV: Tubo Cometa MXR-225/22- 200 kV/15 mA/0,2 mm Cu, a temperatura ambiente).

Los resultados sobre ambas celulas cancerosas, radiosensibles y radiorresistentes (figura 8) indican la relacion de aumento de la radiacion (ER) para las nanopartfculas. Las celulas HT29 mostraron una ER de 1,60 para la dosis de 4 Gy sola, mientras que las celulas HCT116 presentaron una ER de 1,33 para la dosis equivalente. Estos datos demuestran que las nanopartfculas en combinacion con las radiaciones son responsables de la inhibicion clonogenica correlacionada con una reduccion de la supervivencia celular tanto en las lmeas celulares radiosensibles como en las radiorresistentes.

Ejemplo 6:

Ensayo de viabilidad celular utilizando la suspension biocompatible de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de HfO2 del ejemplo 3 (figura 10):

La viabilidad celular se midio utilizando el kit WST-1 despues de un penodo de tratamiento de 24 horas con o sin nanopartfculas (800 |jM) con dosis variables de irradiacion (hasta 6 Gy) utilizando una irradiacion de rayos X de 200 keV (Tubo Cometa MxR-225/22- 200 kV/15 mA/0,2 mm Cu). Los efectos de las nanopartfculas se presentan en la figura 10.

La presencia de nanopartfculas a 800 jM lleva a una disminucion de la viabilidad celular en comparacion con un control privado de toda nanopartfcula. Las nanopartfculas sometidas a 1 Gy de irradiacion de rayos X lleva a una eficacia similar cuando se compara con un control sometido a una irradiacion de 3 Gy de rayos X (radioterapia sola).

No se observo ningun signo de toxicidad con nanopartfculas solas.

Los experimentos realizados con 10 concentraciones diferentes, mostraron resultados consistentes.

Esto demuestra claramente el efecto de aumento de la dosis de las nanopartfculas. Sorprendentemente, se observan propiedades eficientes a una dosis baja de radioterapia: esto indica el posible uso de nanopartfculas utilizando protocolos de radioterapia regular, pero tambien ofrece la promesa de una potencial reduccion de la dosis usual de radioterapia para una eficacia similar o mejor que el tratamiento habitual.

Ejemplo 7:

Dispersion de nanopartfculas despues de inyeccion intra-tumoral utilizando la suspension biocompatible de nanopartfculas del ejemplo 3 (figura 1):

La suspension de nanopartfculas se ha inyectado intratumoralmente a ratones suizos atfmicos portadores de tumores HCT116. El tiempo de residencia de las nanopartfculas en el tumor es de al menos 15 dfas, y no ha sido posible una investigacion mas larga debido al sacrificio de los ratones requerido por razones eticas. Ademas, las nanopartfculas presentan un nivel de contraste alto y son facilmente detectables por microtomograffa de rayos X. Por lo tanto, se ha realizado una microtomograffa 2 y 15 dfas despues de la inyeccion de nanopartfculas con el fin de evaluar la posibilidad de fugas de producto desde el tumor. Parece que la distribucion en el tumor sigue siendo equivalente entre 2 y 15 dfas y que las nanopartfculas permanecen en el tumor (mas de 15 dfas).

Ejemplo 8:

Estudio de funcionamiento de las nanopartfculas en un modelo de tumor HCT116 utilizando las nanopartfculas del ejemplo 3 (figuras 6, 7 y 9):

La suspension de nanopartfculas ha sido inyectada intra-tumoralmente a ratones suizos atfmicos portadores de tumores HCT116 injertados en el flanco. Se ha realizado la irradiacion local del tumor con un aplicador acoplado a una irradiacion externa utilizando el dispositivo de curieterapia con fuentes de iridio-192. La posicion y el tiempo de residencia de las fuentes de iridio-192 cerca del tumor se ha optimizado con el fin de administrar al tumor una dosis de irradiacion de 4 u 8 grays por fraccion. Un grupo de ratones ha sido inyectado intra-tumoralmente con nanopartfculas (el volumen inyectado esta entre 20 % y 50 % del volumen del tumor) y se ha sometido o no a dos fracciones de irradiaciones de 4 grays (24 y 48 horas despues de la inyeccion).

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Un segundo grupo ha sido inyectado intra-tumoralmente con nanopartfculas (el volumen inyectado esta entre 20 % y 50 % del volumen del tumor) y se ha sometido o no a una sola fraccion de irradiaciones de 8 grays (24 horas despues de la inyeccion). Los 4 grupos de ratones se comparan con los animales tratados con el vehnculo sometidos o no a radioterapia. El volumen del tumor se controla en cada grupo, dos veces por semana. Las nanopartfculas llevan a una regresion total del tumor en comparacion con los ratones control sometidos a radioterapia sola. La evaluacion el dfa 20 despues de la irradiacion, demostro una inhibicion del crecimiento del tumor igual al 100 % en los ratones tratados con nanopartfculas despues de una irradiacion de 2x4 grays o 1x8 grays cuando se compara con el control sometido a radioterapia sola con el mismo programa de dosificacion.

La utilizacion de irradiacion fraccionada ha demostrado una mejor relacion beneficio-riesgo en comparacion con un grupo de referencia irradiado. En este contexto, es posible un protocolo fraccionado que utiliza dosis bajas de radioterapia. Un protocolo de este tipo permite una mejor relacion beneficio-riesgo en comparacion con el protocolo de radioterapia regular. En efecto, un protocolo fraccionado de este tipo reduce los efectos secundarios perjudiciales que se pueden observar con los protocolos convencionales sobre los tejidos sanos y es responsable de una eficacia del tratamiento equivalente o incluso mejor.

Ejemplo 9:

Ensayo clonogenico utilizando la suspension biocompatible de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de HfO2 del ejemplo 3, utilizando o bien una fuente de rayos X de 200 keV (Tubo Cometa MXR-225/22- 200 kV/15 mA/0,2 mm Cu) o una fuente de cobalto 60 (figura 11A y 11B):

Materiales y metodo

Se determino la eficiencia de cultivo en placas para la lmea de celulas cancerosas HCT1080 (celulas cancerosas radiorresistentes) antes del analisis de supervivencia celular o fraccion de supervivencia a x grays (SFx). Las celulas se pusieron en placas a una densidad para formar entre 50 y 200 colonias segun el tratamiento. Cuando las celulas estan unidas, se anaden nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de HfO2 a 400 pM del ejemplo 3 (con una densidad igual a 8,3 g/cm3), con un tiempo maximo de incubacion de 24 horas. Se llevo a cabo la irradiacion celular utilizando un irradiador de 200 keV (Tubo Cometa MXR-225/22- 200 kV/15 mA/0,2 mm Cu) (figura 11A) y una fuente de cobalto 60 (figura 11B). Despues de la irradiacion, se incubaron las celulas durante aproximadamente 8 dfas a 37 °C antes de ser fijadas y tenidas con solucion de cristal violeta. Solo se contaron las colonias que comprenden al menos 50 celulas. La SFx se determino utilizando la siguiente formula:

SFx = [(numero de colonias) a dosis x / (numero total de celulas puestas en placas) a dosis x] * eficiencia de cultivo en placas

Resultados: Efecto de la irradiacion sobre las celulas radiorresistentes

Como se muestra en las figuras 11A y 11B, el tratamiento de las celulas cancerosas con nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de HfO2 del ejemplo 3 (densidad igual a 8,3), da como resultado un aumento significativo en el nivel de muerte celular inducida por la radiacion en las celulas cancerosas radiorresistentes (HT1080) irradiadas con un irradiador de 200 keV (Tubo Cometa MXR-225/22- 200 kV/15 mA/0,2 mm Cu) o con una fuente de cobalto 60.

Los resultados indican la relacion de aumento de la radiacion (ER) de las nanopartfculas. Las celulas HT1080 mostraron una ER de 1,38 para la dosis de 4 Gy sola, con una fuente de 200 keV (Tubo Cometa MXR-225/22- 200 kV/15 mA/0,2 mm Cu) y se observa una ER de 1 para la dosis equivalente cuando se utiliza una fuente de cobalto 60. Estos datos demuestran que las nanopartfculas son responsables de una ventajosa inhibicion clonogenica de las lmeas celulares HT1080 radiorresistentes irradiadas utilizando o bien una fuente de radiacion ionizante de baja energfa o bien una fuente de radiacion ionizante de alta energfa.

Los resultados anteriores demuestran la eficacia de las nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de oxido, biocompatibles, con una densidad superior a 7 g/cm3 para inducir la muerte de las celulas (incluso de las celulas radiorresistentes) que han sido irradiadas con una fuente de radiacion de energfa, en particular una fuente de radiacion de energfa alta.

Ejemplo 10:

Efecto de la densidad de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de oxido, biocompatibles, sobre la viabilidad celular.

El ensayo WST-1 permite el cribado de la eficacia de las nanopartfculas o agregados de nanopartfculas basado en la viabilidad celular. Se ensayan aqrn nanopartfculas o agregados de nanopartfculas inorganicas biocompatibles de distintas densidades.

La viabilidad celular se mide despues de un penodo de tratamiento de 24 horas, con nanopartfculas (a 800 pM reduciendo hasta 3,125 pM) o sin nanopartfculas, despues de una dosis de irradiacion fija (2 Gy) utilizando una

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fuente de 200 keV (Tubo Cometa MXR-225/22- 200 kV/15 mA/0,2 mm Cu), seguido por un penodo post incubacion de 96 horas.

La viabilidad celular con nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de oxido biocompatibles, se determina despues de una irradiacion de 2 Gy utilizando dichas nanopartfculas o agregados de nanopartfculas (400 pM) y una curva de ajuste (vease las figuras 12A a L).

Una disminucion de la viabilidad celular superior al 20 % (> 20 %) a 400 pM cuando se compara con un tratamiento radioterapeutico solo (sin nanopartfculas) es considerada relevante. En efecto, cuando dichas nanopartfculas o agregados de nanopartfculas biocompatibles se utilizan en ensayos clonogenicos, permiten una relacion de aumento de la radiacion (ER) de 1,33 sobre las lmeas celulares HCT116 y de 1,60 sobre las lmeas celulares HT29 (vease el ejemplo 5).

Al contrario, una disminucion de la viabilidad celular inferior o igual al 20 % (< 20 %) a 400 pM cuando se compara con un tratamiento radioterapeutico solo (sin nanopartmulas) es considerada como no relevante. En efecto, cuando dichas nanopartmulas o agregados de nanopartmulas biocompatibles se utilizan en ensayos clonogenicos, la irradiacion casi no tiene ningun efecto significativo sobre ambas celulas cancerosas, las radiosensibles (HCT116) y las radiorresistentes (HT29) (vease el ejemplo 4).

La descripcion de metodos para preparar los diferentes oxidos ensayados, se registra en los puntos a) a d). Las nanopartmulas comerciales se describen en el punto e). Los valores de densidad, de viabilidad celular a 400 pM (cuando se compara con un tratamiento radioterapeutico solo) y de eficiencia relativa a 800 pM, se detallan en las tablas que siguen (vease los puntos a) a e)).

Las figuras 12 presentan la viabilidad celular (% de control) despues de una irradiacion de 2 Gy utilizando nanopartmulas o agregados de nanopartmulas.

Como se ha explicado previamente, la figura 13 presenta la eficiencia relativa (capacidad para inducir la muerte celular), expresada como porcentaje. Dicha eficiencia relativa refleja la viabilidad celular (% de control) despues de una irradiacion de 2 Gy de las partmulas ensayadas en el ejemplo 10, a 800 pM, cuando se compara con un tratamiento radioterapeutico solo (sin nanopartmulas), con respecto a la viabilidad celular (% de control) de las nanopartmulas o agregados de nanopartmulas de HfO2 biocompatibles (vease el ejemplo 3) a 800 pM, cuando se compara con un tratamiento radioterapeutico solo (sin nanopartmulas)

Los ensayos de eficiencia in vitro realizados en este estudio destacan la importancia de la densidad del oxido con un efecto umbral para d > 7 g/cm3 (vease la figura 13).

Se distinguen dos grupos de nanopartmulas con diferencias significativas en terminos de eficiencia:

- densidad < 7 g/cm3: la eficiencia relativa de las nanopartmulas ensayadas es inferior a aproximadamente 55 %

- densidad > 7 g/cm3: la eficiencia relativa de las nanopartmulas ensayadas es superior a aproximadamente 80 %.

a) Suspension biocompatible de nanopartmulas o agregados de nanopartmulas de oxido de hafnio (HfO2) con una densidad que vana de 6,7 hasta 8,3 g/cm3, utilizando hexametafosfato de sodio como agente de recubrimiento.

Se anade una solucion de hidroxido de tetrametilamonio (TMAOH) a 40 g de solucion de HfCU. Se realiza la adicion de solucion de TMAOH hasta que el pH de la suspension final alcance el valor de pH deseado que se indica en la tabla 2.

Se obtiene un precipitado blanco.

Se transfiere despues el precipitado a un autoclave y se calienta a una temperatura comprendida entre 120 °C y 300 °C para realizar la cristalizacion. Despues de enfriar, se lava la suspension con agua desionizada.

Se realiza una etapa de peptizacion, con el fin de obtener una suspension estable de las nanopartmulas o agregados de nanopartmulas.

A continuacion, se anade la suspension de hexametafosfato de sodio a la solucion peptizada (siendo la cantidad de hexametafosfato de sodio anadida inferior a la LD50/5) y se ajusta el pH de la suspension para que este comprendido entre aproximadamente 6,5 y 7,5.

Como se ve por la siguiente tabla 2 la densidad de las nanopartmulas de HfO2 se puede modular con un ajuste cuidadoso del pH de la suspension inicial. Los datos relativos a la viabilidad de las celulas irradiadas expuestas a cada uno de los oxidos de la tabla 2, aparecen respectivamente en las figuras 12A, 12B y 12C.

Tabla 2:

Oxido

pH Densidad Viabilidad celular (% de control) Eficiencia relativa observada

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10

15

20

25

30

observada con una concentracion de oxido 400 |jM en comparacion con un tratamiento radioterapeutico solo con una concentracion de oxido 800 jM

HfO2 Ref. Ejemplo 3

8,3 > 20 % 100 %

HfO2-L

pH 7 7,4 39 % (HfO2 Ref.: 40 %) 97 %

HfO2-E

pH 3 6,8 16 % (HfO2 Ref.: 35 %) 53 %

HfO2-V

pH 2 6,7 9 % (HfO2 Ref.: 43 %) 30 %

b) Suspension biocompatible de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de oxido de cerio (CeO2) con una densidad que vana de 6,5 hasta 7,1, utilizando hexametafosfato de sodio como agente de recubrimiento.

La smtesis de CeO2 se adapta de Zhou & Al., Chem. Mater, 2003, 15, 378-382.

Se disuelve Ce(SO4)2.4H2O en agua desionizada para obtener una solucion 0,4 M. Se anade entonces solucion de amomaco gota a gota a temperatura ambiente con agitacion continua. Se anade solucion de amomaco hasta alcanzar una relacion de volumen final de solucion de amomaco con respecto a la solucion de sulfato de cerio de 1:5. La suspension resultante se lava entonces por centrifugacion 4 veces con agua desionizada.

El sedimento final se suspende en agua desionizada para obtener las soluciones de los precursores de oxido de cerio, 0,05 M (CeO2-1) o 0,2 M (CeO2-2), ambas a pH 4. Las soluciones CeO2-1 y CeO2-2, se someten a tratamiento hidrotermico a 180 °C durante 24 horas. Se lavan entonces las muestras 4 veces con agua desionizada por centrifugacion. Cada muestra se seca finalmente a 105 °C y se somete a un tratamiento termico. La muestra de CeO2-1 se calcina a 700 °C durante 1 hora y la de CeO2-2 a 900 °C durante 1 hora para obtener respectivamente las muestras CeO2-S y CeO2-W,

Se realiza una etapa de peptizacion, con el fin de obtener una suspension estable de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas.

A continuacion, se anade la suspension de hexametafosfato de sodio a la solucion peptizada (siendo la cantidad de hexametafosfato de sodio anadida inferior a la LD50/5) y se ajusta el pH de la suspension para que este comprendido entre 6,5 y 7,5.

Como se ve por la siguiente tabla 3 la densidad de las nanopartfculas de CeO2 se puede modular con un ajuste cuidadoso tanto de la temperatura como de la duracion del tratamiento termico. Los datos relativos a la viabilidad de las celulas irradiadas expuestas a cada uno de los oxidos de la tabla 3, aparecen respectivamente en las figuras 12D y 12E.

Tabla 3:

Oxido

Temperatura y duracion de la calcinacion Densidad Viabilidad celular (% de control) observada con una concentracion de oxido 400 jM en comparacion con un tratamiento radioterapeutico solo Eficiencia relativa observada con una concentracion de oxido 800 jM

HfO2 Ref. Ejemplo 3

8,3 > 20 % 100 %

CeO2-W

900 °C, 1 h 7,1 39 % (HfO2 Ref.: 48 %) 91 %

CeO2-S

700 °C, 1 h 6,5 20 % (HfO2 Ref, 35 %) 56 %

c) Suspension biocompatible de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de oxido de tulio (T1TI2O3) con una densidad que vana de 2,7 hasta 8,3 g/cm3.

Se disuelven 5 g de TmCh en HCl 2 M. Se anade entonces solucion de hidroxido de tetrametilamonio (TMAOH) a la solucion de TmCh hasta que el pH es 7 (Tm2O3-0) u 8 (Tm2O3-1). Se obtiene un precipitado blanco.

El precipitado se somete a tratamiento hidrotermico en autoclave, esto es, se calienta a una temperatura entre 120 °C y 300 °C. La suspension resultante se lava entonces por centrifugacion con agua desionizada y se seca a 105 °C durante la noche.

Los polvos se someten a calcinacion:

• Tm2O3: 400 °C, 1 h

• Tm2O3: 600 °C, 1 h

• T1TI2O3: 800 °C, 5 min

• TT2O3: 800 °C, 2 h

Como se ve por la siguiente tabla 4, la densidad de las nanopartfculas de TT2O3 se puede modular con un ajuste cuidadoso tanto de la temperatura como de la duracion del tratamiento termico.

5 Tabla 4:

Oxido

Temperatura y duracion de la calcinacion Densidad

TT203

800 °C, 2 h 8,3

TT203

800 °C, 5 min 6,8

TT203

600 °C, 1 h 6,1

TT203

400 °C, 1 h 4,9

TT203-1

Ninguna 2,7

d) Suspension biocompatible de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de oxido de titanio (TO2) con una densidad inferior a 7 g/cm3, utilizando hexametafosfato de sodio como agente de recubrimiento.

Se anaden 15 mL de TiCU gota a gota a 180 mL de solucion de HCl 3 M con agitacion suave. Se anaden despues 10 120 mL de agua desionizada para tener un volumen final de 215 ml. El pH de la solucion se ajusta progresivamente

a 2 utilizando solucion de NaOH 3 M. La solucion se convierte en un precipitado blanco que se calienta a 60 °C durante 24 h. Se realiza una etapa de peptizacion, con el fin de obtener una suspension estable de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas.

A continuacion, se anade la suspension de hexametafosfato de sodio a la solucion peptizada (siendo la cantidad de 15 hexametafosfato de sodio anadida inferior a la LD50/5) y se ajusta el pH de la suspension para que este comprendido entre 6,5 y 7,5.

Los datos relativos a la viabilidad de las celulas irradiadas expuestas a oxido TO2 de la tabla 5, aparecen en las figuras 12F.

Tabla 5:

Oxido

Densidad Viabilidad celular (% de control) observada con una concentracion de oxido 400 |jM en comparacion con un tratamiento radioterapeutico solo Eficiencia relativa observada con una concentracion de oxido 800 jM

HfO2 Ref. Ejemplo 3

8,3 > 20 % 100 %

TiO2_5 nm

3,9 11 % (HfO2 Ref.: 49 %) 48 %

20

e) Suspension biocompatible de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de oxido comercial con una densidad que vana de 3,8 hasta 7,9, utilizando hexametafosfato de sodio como agente de recubrimiento.

Todas las nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de oxido se obtienen como polvos comerciales (del mas alto grado de pureza).

25 Se dispersan los polvos en solucion acuosa y se someten a ultrasonidos para una dispersion eficiente en la solucion.

Se realiza una etapa de peptizacion, con el fin de obtener una suspension estable de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas.

A continuacion, se anade la suspension de hexametafosfato de sodio a la solucion peptizada (siendo la cantidad de hexametafosfato de sodio anadida inferior a la LD50/5) y se ajusta el pH de la suspension para que este 30 comprendido entre 6,5 y 7,5.

Los datos relativos a la viabilidad de las celulas irradiadas expuestas a cada uno de los oxidos de la tabla 6, aparecen respectivamente en las figuras 12G, 12H, 12I, 12J, 12K y 12L.

Tabla 6:

5

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20

25

30

35

Oxido

Densidad Viabilidad celular (% de control) observada con una concentracion de oxido 400 pM en comparacion con un tratamiento radioterapeutico solo Eficiencia relativa observada con una concentracion de oxido 800 pM

HfO2 Ref. Ejemplo 3

8,3 > 20 % 100 %

PdO-A

7,9 34 % (HfO2 Ref.: 48 %) 79 %

TiO2-P25

3,8 12 % (HfO2 Ref.: 49 %) < 25 %

CeO2-D

6,6 12 % (HfO2 Ref.: 24 %) 42 %

Nd2Oa-Z

5,4 < 10 % (HfO2 Ref.: 33 %) < 25 %

Eu2O3-B

5,6 < 10 % (HfO2 Ref.: 21 %) < 25 %

WO3-C

7,2 40,5 % (HfO2 Ref.: 42 %) 95 %

Ejemplo 11:

Importancia de una cubierta superficial biocompatible para la estabilidad eficiente de una suspension de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas de oxido de titanio (TO2), oxido de cerio (CeO2) y oxido de hafnio (HfO2), utilizando hexametafosfato de sodio como agente de recubrimiento.

Para ser utilizadas in vivo, las nanopartfculas o agregados de nanopartfculas activables deben ser biocompatibles. La biocompatibilidad requiere alta estabilidad en medios fisiologicos (6,5 < pH > 7,5) para evitar la agregacion en la circulacion sangumea y para permitir una distribucion eficiente (efecto EPR). Por lo tanto, un pre-requisito antes de la inyeccion es comprobar la estabilidad de la suspension de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas en condiciones fisiologicas.

Se ha evaluado asf la estabilidad de las partfculas con o sin cubierta de HMP en agua y en glucosa (al 5 %). Se confirmo la estabilidad visualmente en los diferentes medios y por el rendimiento de la filtracion utilizando un filtro de 0,22 pm.

Resultados: estabilidad

Se formulan en solucion de glucosa (al 5 %), las suspensiones de nanopartfculas (TiO2-5 nm del ejemplo 10 d), CeO2-D comercial del ejemplo 10 e) y HfO2-Ref. del ejemplo 3) - suspension peptizada a pH 3 o suspension a pH 7 - sin HMP como agente de recubrimiento superficial biocompatible. Se formulan tambien suspensiones de nanopartfculas a pH 7 con cubierta de HMP en solucion de glucosa (al 5 %). La concentracion de nanopartfculas para cada suspension es de aproximadamente 5 g/L. Se deja cada muestra 2 h y se realiza visualmente un primer analisis discriminatorio de la estabilidad de las nanopartfculas en suspension (figura 14).

La primera evaluacion demuestra que todas las muestras no recubiertas permanecen estables a pH 3 en agua y en solucion de glucosa (al 5 %) debido a la presencia de cargas positivas sobre la superficie de las partfculas puesto que todas las partfculas tienen un punto isoelectrico (IEP) proximo a pH 6-7. Aumentando el pH de la suspension (agua o glucosa) hasta 7, se observa la precipitacion de nanopartfculas, siendo el pH proximo al IEP. El recubrimiento de las partfculas utilizando HMP aumenta notablemente la estabilidad a pH 7 en agua y en solucion de glucosa (al 5 %).

Resultados: rendimiento de la filtracion

Los filtros de corte a 0,22 pm permiten solamente el paso de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas bien disociados. Incluso si solo hay muy pocas agregaciones, las partfculas se acumularan sobre el filtro y bloquearan rapidamente el filtro. La concentracion de partfculas se estimo mediante balance antes y despues de la filtracion.

Los datos presentados en la figura 15 demuestran el papel de la cubierta biocompatible que es absolutamente necesaria para mejorar las propiedades de superficie de la nanopartfcula y para mejorar la estabilidad de las partfculas en condiciones fisiologicas.

Claims (21)

1. 5

   10

   15

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   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. El uso de nanopartfculas o agregados de nanopartfculas para la preparacion de una composicion farmaceutica para uso en un metodo de alteracion o de destruccion de celulas diana en un animal cuando dichas celulas se exponen a radiaciones ionizantes, en donde cada nanopartfcula o agregado de nanopartfculas consiste en un oxido metalico seleccionado del grupo que consiste en CeO2, Tm2O3, HfO2, WO3 y PdO, en donde la densidad de dicha nanopartfcula o la densidad de dicho agregado de nanopartfculas es de al menos 7,1 g/cm3 cuando el oxido metalico es CeO2, de al menos 8,3 g/cm3 cuando el oxido metalico es T1TI2O3, de al menos 7,4 g/cm3 cuando el oxido metalico es HfO2, de al menos 7,2 g/cm3 cuando el oxido metalico es WO3, y de al menos 7,9 g/cm3 cuando el oxido metalico es PdO, y en donde cada nanopartfcula o agregado de nanopartfculas esta cubierto con una cubierta biocompatible que permite la estabilidad de la nanopartfcula o agregado de nanopartfculas a pH entre 6,5 y 7,5 en un fluido fisiologico.
2. 2. El uso segun la reivindicacion 1, en donde la cubierta biocompatible es una cubierta no biodegradable seleccionada del grupo que consiste en sflice, alumina, azucar, fosfato, silano, compuesto zwitterionico, lfpido, polfmero carbonado saturado y un polfmero inorganico; o una cubierta biodegradable seleccionada del grupo que consiste en un polfmero biologico, fosfolfpido, sacarido, oligosacarido y polisacarido.
3. 3. El uso segun la reivindicacion 2, en donde el oxido metalico se selecciona del grupo que consiste en CeO2, HfO2, WO3 y PdO, y la cubierta biocompatible es hexametafosfato de sodio (HMP).
4. 4. El uso segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el oxido metalico es HfO2.
5. 5. El uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4, en donde el oxido metalico es HfO2, y la cubierta biocompatible es trimetafosfato de sodio (STMP) o hexametafosfato de sodio (HMP).
6. 6. El uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el tamano de cada nanopartfcula o agregado de nanopartfculas esta entre aproximadamente 10 y 200 nm.
7. 7. El uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dichas radiaciones ionizantes se seleccionan del grupo que consiste en rayos X, rayos gamma, haces de electrones y emisiones de radioisotopos.
8. 8. El uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde las radiaciones ionizantes son de aproximadamente 2 keV a aproximadamente 25.000 keV.
9. 9. El uso segun la reivindicacion 8, en donde las radiaciones ionizantes son de aproximadamente 2 keV a 6000 keV.
10. 10. El uso segun la reivindicacion 8, en donde las radiaciones ionizantes son de aproximadamente 2 keV a 1500 keV.
11. 11. El uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde cada nanopartfcula o agregado de nanopartfculas es esencialmente de forma esferica.
12. 12. El uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde las celulas diana se seleccionan del grupo que consiste en celulas benignas, celulas pre-malignas y celulas malignas.
13. 13. El uso segun la reivindicacion 12, en donde dichas celulas malignas son celulas de un tumor seleccionado del grupo que consiste en un tumor hematologico y un tumor solido.
14. 14. El uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la composicion farmaceutica comprende ademas un compuesto terapeutico adicional, distinto de una nanopartfcula o agregado de nanopartfculas, destinado a tratar el cancer.
15. 15. El uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde dicho animal es un ser humano.
16. 16. Nanopartfcula o agregado de nanopartfculas para uso en la alteracion o destruccion de celulas diana en un animal cuando dichas celulas se exponen a radiaciones ionizantes, en donde cada nanopartfcula o agregado de nanopartfculas consiste en un oxido metalico seleccionado del grupo que consiste en CeO2, Tm2O3, HfO2, WO3 y PdO, en donde la densidad de dicha nanopartfcula o la densidad de dicho agregado de nanopartfculas es de al menos 7,1 g/cm3 cuando el oxido metalico es CeO2, de al menos 8,3 g/cm3 cuando el oxido metalico es Tm2O3, de al menos 7,4 g/cm3 cuando el oxido metalico es HfO2, de al menos 7,2 g/cm3 cuando el oxido metalico es WO3, y de al menos 7,9 g/cm3 cuando el oxido metalico es PdO, y en donde cada nanopartfcula o agregado de nanopartfculas esta cubierto con una cubierta biocompatible que permite la estabilidad de la nanopartfcula o agregado de nanopartfculas a pH entre 6,5 y 7,5 en un fluido fisiologico.
17. 17. Nanopartfcula o agregado de nanopartfculas segun la reivindicacion 16, para uso en la deteccion o visualizacion y despues en la alteracion o destruccion de celulas diana en un animal cuando dichas celulas se exponen a radiaciones ionizantes.
18. 18. Nanopartfcula o agregado de nanopartfculas para uso segun la reivindicacion 16 o la reivindicacion 17, en donde el oxido metalico es HfO2, y la cubierta biocompatible es trimetafosfato de sodio (STMP) o hexametafosfato de sodio (HMP).
19. 19. Composicion farmaceutica para uso en la alteracion o destruccion de celulas diana en un animal cuando dichas 5 celulas se exponen a radiaciones ionizantes, en donde dicha composicion farmaceutica comprende nanopartfculas o

    agregado de nanopartfculas y un excipiente farmaceuticamente aceptable, en donde cada nanopartfcula o agregado de nanopartfculas consiste en un oxido metalico seleccionado del grupo que consiste en CeO2, T1TI2O3, HfO2, WO3 y PdO, en donde la densidad de dicha nanopartfcula o la densidad de dicho agregado de nanopartfculas es de al menos 7,1 g/cm3 cuando el oxido metalico es CeO2, de al menos 8,3 g/cm3 cuando el oxido metalico es Tm2O3, de al 10 menos 7,4 g/cm3 cuando el oxido metalico es HfO2, de al menos 7,2 g/cm3 cuando el oxido metalico es WO3, y de al menos 7,9 g/cm3 cuando el oxido metalico es PdO, y en donde cada nanopartfcula o agregado de nanopartfculas esta cubierto con una cubierta biocompatible que permite la estabilidad de la nanopartfcula o agregado de nanopartfculas a pH entre 6,5 y 7,5 en un fluido fisiologico.
20. 20. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 19, para uso en la deteccion o visualizacion y despues en la 15 alteracion o destruccion de celulas diana en un animal cuando dichas celulas se exponen a radiaciones ionizantes.
21. 21. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 19 o la reivindicacion 20, en donde el oxido metalico es HfO2, y la cubierta biocompatible es trimetafosfato de sodio (STMP) o hexametafosfato de sodio (HMP).