KR20110028616A - 생체내 세포를 파괴하는 고밀도의 무기 나노입자 - Google Patents

생체내 세포를 파괴하는 고밀도의 무기 나노입자 Download PDF

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Abstract

본 출원은 의학 분야에서 사용될 수 있는 신규한 여기가능 입자에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 출원은 X선, γ-선, 방사성 동위원소 및/또는 전자빔과 같은 이온화 방사선에 의해 여기될 때 전자 및/또는 고에너지 광자를 생성할 수 있는 입자에 관한 것이며, 또한 건강, 특히 인간의 건강에서의 상기 입자의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 입자는 산소를 함유하는 무기 물질, 특히 산화물로 이루어지고, 상기 물질은 적정 밀도를 가지며, 또한 본 발명의 입자는 표적 세포, 조직 또는 기관을 방해, 변형 또는 파괴하기 위하여 제어가능한 외부 여기에 의해 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 활성화될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 입자의 제조방법, 및 상기 입자를 포함하는 약학 조성물 또는 의료장치 조성물에 관한 것이다.

Description

생체내 세포를 파괴하는 고밀도의 무기 나노입자{INORGANIC NANOPARTICLES OF HIGH DENSITY TO DESTROY CELLS IN-VIVO}
본 출원은 의학 분야에서 사용될 수 있는 신규한 여기가능 입자(excitable particle)에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 출원은 X선, 감마선(γ-선), 방사성 동위원소 및/또는 전자빔과 같은 이온화 방사선에 의해 여기될 때 전자 및/또는 고에너지 광자를 생성할 수 있는 입자에 관한 것이며, 또한 건강, 특히 인간의 건강에서의 상기 입자의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 입자는 산소를 함유하는 무기 물질, 특히 산화물로 이루어지고, 상기 물질은 적정 밀도를 가지며, 또한 본 발명의 입자는 표적 세포, 조직 또는 기관을 방해, 변형 또는 파괴하기 위하여 제어가능한 외부 여기에 의해 시험관내(in vitro), 생체외(ex vivo), 또는 생체내(in vivo)에서 활성화될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 입자의 제조방법, 및 상기 입자를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
다양한 형태의 방사선, 예컨대 X선, 감마선, UV선, 레이저 광, 마이크로파, 전자빔 뿐만 아니라 예를 들어, 중성자 및 양자의 입자빔이 암과 관련된 문제를 치료하기 위해 사용되고 있다. 상기 방사선의 일부는 방사선 민감성 분자와 조합되어 상기 적용을 위해 사용되고 있다. 전자기 방사선 및 이온화 방사선은 실제로 세포의 DNA 분자를 파괴하는 것이 가능하며, 이에 따라 상기 세포가 성장하고 분열하는 것을 방지할 수 있다. 이러한 효과는 주로 이온화 후에 방출되는 전자 및/또는 고에너지 광자(2KeV보다 더 높은 에너지)에 의해 생성되는 손상에 기인한다.
"이온화 방사선"이라는 용어는 원자 또는 분자로부터 하나 이상의 전자를 떼어낼 수 있는(이온화할 수 있는) 고에너지성 입자 또는 파(wave)를 나타낸다. 이온화 능력은 개개의 입자 또는 파의 에너지에 의존하는 것이고, 그들의 수에 의존하는 것은 아니다. 만일 개개의 입자 또는 파가 충분하게 에너지를 갖지 않는다면, 입자 또는 파의 대량 흐름은 가장 흔한 상황에서 이온화를 야기하지 않을 것이다.
이온화 방사선의 예는 에너지성 베타 입자, 광자, 중성자, 전자 및 알파 입자이다. 원자 또는 분자를 이온화시키는 광파(광자)의 능력은 전자기 스펙트럼에 따라 다양하다. X선 및 감마선은 거의 모든 분자 또는 원자를 이온화할 것이며; 원자외선은 다수의 원자 및 분자를 이온화할 것이며; 근자외선 및 가시광선은 매우 적은 분자를 이온화할 것이며; 마이크로파 및 전파는 비-이온화 방사선이다.
WO 2005/120590에는 (i) X선을 흡수하고 UV-가시 에너지를 방출하는 제1의 무기 화합물을 포함하는 핵, 및 (ii) UV-가시 에너지를 흡수하고 물 또는 산소와 접촉시에 자유 라디칼을 생성하는 제2의 무기 또는 유기 화합물을 포함하는 입자가 기재되어 있다. 활성화된 입자는 주변 산소를 세포에서 비가역적인 손상을 발생시키는 고 반응성 종인 자유 라디칼로 전환시킨다.
US 2007/0274909는 고에너지 방사선을 흡수하고 VUV 또는 UV-C 방사선을 발산하는 VUV 또는 UV-C 발산 물질을 포함하는, 생물학적 물질의 영상 또는 방사선 치료에 사용하기 위한 나노입자에 관한 것이다. 상기 명세서에 기재되어 있는 VUV 또는 UV-C 발산 물질은 의도적으로 또는 우연하게, 그러나 체계적으로 활성제와 도핑되며, 이의 목적은 상기 기재된 VUV 또는 UV-C 방사선 발산을 가능하게 하는 것이다. 그러나, 도핑제는 그의 입자 내 국소화에 따라 또는 그의 분산매 내 가용성에 따라 증가되는 독성과 연관될 수 있다.
US 6,955,639에는 금속, 특히 금, 나노입자를 사용하여 X선 방사선 효과를 증가시키는 방법이 기재되어 있다.
본원에서 본 발명자는 신규하고 매우 효과적인 나노입자를 제공하며, 이는 당업계에 개시된 것보다 더 용이하고 저렴하게 제조되지만, 더 중요하고 놀라운 것은 본원에서 입증된 바와 같이 이온화 방사선과 조합되어 표적세포를 매우 효과적으로 변형시키거나 파괴시킬 수 있다는 것이다.
본원에 기재된 나노입자에 의해 나타나는 또다른 특징은, 완전한 방사선치료의 맥락에서, 나노입자 및/또는 나노입자 집합체(aggregates) 주사의 횟수를 최소로 감소시킬 수 있도록 수일 동안 종양 내부에 잔존하는 그의 능력이다.
본 발명의 요약
본 발명자는 산소를 함유하는 무기 물질(즉, 단일 무기 물질로 제조된 것), 특히 산화물로 이루어진 나노입자를 사용하고, 그의 밀도가 7 g/cm3 이상, 바람직하게는 7 g/cm3 초과, 특히 산화물로 이루어진 나노입자에 대해서는 밀도가 7 g/cm3 초과 15 g/cm3 미만일 때, 표적 세포, 조직 또는 기관, 특히 본원에서는 양성 세포 또는 조직으로 정의되는 비정상 세포 또는 조직, 또는 병적인 세포 또는 조직, 예컨대 체내 깊숙이 위치할 수 있는 전-악성 또는 악성 세포(암종 세포) 또는 조직(종양)을 효과적으로 방해, 변형 또는 파괴하는 반면, 건강한 주변 조직이 손상되는 것은 제한할 수 있다는 것을 발견하였다.
상기 나노입자는 원하는 치료 효과를 발생시키기 위하여 추가의 별도 화합물 또는 물질의 존재를 요구하지 않는다. 특히, 본원에 기재된 나노입자는 입사된 방사선을 차후의 치료 효과를 가져오는 전자 및/또는 고에너지 광자의 효과적인 방출로 직접 전환할 수 있다.
WO 2005/120590 및 US 2007/0274909에 개시된 나노입자와 달리, 본 발명의 나노입자는 두 개의 별도의 화합물의 존재를 요구하지 않는데, 상기 두 개의 화합물 중 하나는 X선을 UV-가시 에너지로 전환하는 것을 필요로 하는 것이다. 특히, 본 발명의 나노입자는, 첫번째 화합물로서 X선을 흡수하고 이를 두번째 화합물에 의해 흡수되는 UV-가시 에너지로 전환하고 결과적으로 세포에 비가역적 손상을 가져오는 것을 목적으로 하는 무기 화합물을 포함하지 않는다. 이러한 나노입자는 UV 영역에서 빛을 특이적으로 발산하도록 도핑되거나 설계되지 않는다.
금속 나노입자에 비해, 본 발명의 나노입자는 그의 표면상에 히드록실(OH) 기를 나타내며, 이는 광범위한 pH에서 임의의 극성 환경에 대한 적합성을 가져오는 장점을 제공한다.
금속 나노입자에 비해, 본 발명의 나노입자, 특히 산화물로 이루어진 나노입자는 또한 제조가 더 용이하다는 장점을 제공한다. 나노입자 또는 나노입자 집합체의 농도가 높은 생체적합성 현탁액은 본원에 기재된 방법에 의해 수득될 수 있다.
합성 방법은 제조된 입자의 불리한 응집을 방지하기 위한 격리(착화)제 및/또는 환원제의 사용을 필요로 하지 않는다. 본원에 기재된 방법에서, 상기 언급된 현탁액에 격리(착화)제를 첨가하는 것은 선택적이어야 한다.
따라서, 합성 방법에는 일반적으로 하기가 (동시에 또는 순차적으로) 포함된다: 극성 매질에서 화학원소의 침전, 상기 화학원소의 결정화(산소는 무기 물질 구조의 부분임), 및 (필요하다면) 생리학적 매질에서 안정화.
또한, 본 발명의 나노입자는 표적으로 하는 분자가 표적 세포 또는 조직으로 농축되는 것을 필요로 하지 않는다.
증강된 침투 및 보유("EPR: Enhanced Permeation and Retention") 효과는 실제로 나노입자를 정맥내 경로(투여의 가능한 경로 중 하나임)로 주사하고나서 주어진 시간 이후에 종양 덩어리로 수동적으로 축적되는 원인이 된다. 실제로, 종양 혈관이 정상 모세혈관과 매우 구별된다는 점, 및 그의 혈관의 "누수(Leakiness)"가 정상 조직에서 일반적이지 않은 나노입자의 선택적인 분출을 고무시킨다는 점이 관찰되었다. 효과적인 종양 림프의 배수의 결핍은 침투 나노입자의 제거를 방지하고 그의 축적을 촉진시킨다. 따라서, 본 발명의 나노입자는 정맥내 투여 이후에 원발성 종양 뿐만 아니라 전이성 종양을 성공적으로 표적으로 삼을 수 있다.
또한, 유리하게는 본 발명의 나노입자는 실시예 부분에서 입증된 바와 같이 종양내 경로를 통해 투여될 수 있다.
그러나, 본원의 하기에서 또한 기재된 바와 같이, 본 발명의 나노입자 또는 나노입자 집합체는 유리하게는 생리학적 유체에서 6.5 내지 7.5의 pH에서 나노입자 또는 나노입자 집합체의 안정성을 허용하는 생체적합성 코팅으로 도포된다.
따라서, 본 발명의 추가의 이점은 그 자체로는 유해하지 않지만 적절한 조건하에 표적세포, 특히 암종 세포를 기능적으로 방해, 변형 또는 파괴하기 위해 안전하게 이용할 수 있는 나노입자를 제공하는 것이다. 나노입자의 원하는 치료 효과는 실제로 나노입자의 여기(excitation)에 엄격하게 의존하며, 상기 여기는 질과 양의 측면에서 그 자체로 유리하게 제어되며 당업자에 의해 표적화된, 즉 국소화된 방법에서 사용되는 이온화 방사선 원에 의해 생성된 것이다.
따라서, 본 발명에는 임의의 동물, 바람직하게는 포유류, 더욱더 바람직하게는 인간에서 적절하다면 표적화된 방법으로 사용할 수 있는 신규한 입자 군이 기재된다. 본 발명의 입자는 임의 유형의 조직 또는 기관에서 표면적으로 또는 깊게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에는, 상기 세포가 특히 X선, 감마선, 방사성 동위원소, 이온빔 및/또는 전자빔과 같은 이온화 방사선에 노출될 때, 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 세포의 변형 또는 파괴를 유도할 수 있는 활성화 입자가 기재되어 있다.
상기 적용되는 전략은 입사된 이온화 방사선을 주로 치료 효과를 가져오는 전자 및/또는 고에너지 광자의 효과적인 방출로 전환하는 것으로 이루어진다. 상기와 같은 결과는, 밀도가 7 g/cm3 이상, 바람직하게는 7 g/cm3 초과, 특히 산화물로 이루어진 나노입자에 대해서는 밀도가 7 g/cm3 초과 15 g/cm3 미만인, 산소를 함유하는 무기 물질로 이루어진 본 발명의 나노입자를 사용함으로써 얻어진다.
본 발명의 나노입자는 이온화 방사선으로부터 에너지를 흡수함으로써 여기되거나 활성화된다. 상기 흡수에 의해, 표적세포의 변형 또는 사멸을 유발하는 현상들의 일련의 캐스케이드가 야기된다. 이러한 현상들 중에서, 전자 및/또는 고에너지 광자의 방출은 본 발명의 측면에서 매우 중요하다.
본원에서, 본 발명자는 표적 세포, 조직 또는 기관, 예컨대 악성 세포 또는 조직을 변형시키거나 파괴시키는 것으로 이루어지는 원하는 치료 효과와 관련하여, 밀도가 7 g/cm3 이상, 바람직하게는 7 g/cm3 초과, 특히 산화물로 이루어진 나노입자에 대해서는 밀도가 7 g/cm3 초과 15 g/cm3 미만인, 산소를 함유하는 무기 물질의 효과를 입증한다.
본 발명은 산소를 함유하는 무기 물질로 이루어진 생성물 또는 화합물(본원에서는 나노입자 또는 나노입자 집합체임)에 관한 것이며, 상기 무기 물질의 밀도가 7 g/cm3 이상, 바람직하게는 7 g/cm3 초과, 특히 산화물로 이루어진 나노입자에 대해서는 밀도가 7 g/cm3 초과 15 g/cm3 미만이다. 상기 화합물의 제조방법이 본원에 개시된다.
본 발명의 목적은 표적 세포, 조직 또는 기관을 변형, 파괴 또는 제거하기 위하여 본 발명에 따른 나노입자 또는 나노입자 집합체를 사용하는 것이다.
본원에 개시된 특정 구현예는 동물의 표적세포가 본원에서 정의된 이온화 방사선에 노출될 때 상기 세포를 변형, 파괴 또는 제거하기 위한 약학 조성물을 제조하는데 나노입자 또는 나노입자 집합체를 사용하는 것, 및 이에 대응하는 치료방법에 관한 것으로서, 상기 나노입자는 산소를 함유하는 무기 물질로 이루어지며, 상기 무기 물질의 밀도는 7 g/cm3 이상, 바람직하게는 7 g/cm3 초과, 특히 산화물로 이루어진 나노입자에 대해서는 밀도가 7 g/cm3 초과 15 g/cm3 미만이다.
본원에는 특히 암 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 생성물, 특히 나노입자 또는 나노입자 집합체가 개시된다.
또다른 구현예는, 상기에서 정의된 바와 같은 생성물을 포함하는, 또는 전술한 방법에 의해 수득할 수 있는, 조성물, 특히 치료 또는 진단용 약학 조성물에 기초한다. 상기 조성물은 바람직하게는 주사가능 제형의 형태를 갖는다.
본원에는, 약학 조성물, 특히 명세서의 전체 기재내용에서 명백해지는 것처럼 포유류의 표적세포가 이온화 방사선에 노출될 때 상기 세포를 변형 또는 파괴하는 약학 조성물이 개시되어 있으며, 상기 약학 조성물은 나노입자 또는 나노입자 집합체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하며, 상기 나노입자는 산소를 함유하는 무기 물질로 이루어지며, 상기 무기 물질의 밀도는 7 g/cm3 이상, 바람직하게는 7 g/cm3 초과, 특히 산화물로 이루어진 나노입자에 대해서는 밀도가 7 g/cm3 초과 15 g/cm3 미만이며, 상기 나노입자 또는 나노입자 집합체는 바람직하게는 생체적합성 코팅으로 도포된다.
또다른 구현예는 상기 나노입자 또는 나노입자 집합체가 방사선, 특히 본원에서 정의된 이온화 방사선에 노출될 때 동물의 암을 예방 또는 치료하거나 동물의 암의 징후를 완화시키기 위해 본 발명에 따른 나노입자 또는 나노입자 집합체를 사용하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 개시내용에는 특히 본 발명에 따른 나노입자 또는 나노입자 집합체, 또는 상기 나노입자 또는 나노입자 집합체를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하고, 상기 대상체를 방사선, 특히 이온화 방사선에 노출함으로써, 대상체의 암을 예방 또는 치료하거나 암의 징후를 완화시키기 위한 방법이 포함되며, 상기 대상체는 동물, 특히 포유류, 바람직하게는 인간이다.
또다른 측면에서, 본 발명의 개시내용은 하나 이상의 임의의 본원에 기재된 생성물, 즉 나노입자, 나노입자 집합체, 및 조성물과 함께 상기 생성물(들)을 사용하기 위한 지시를 제공하는 표지 안내문을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명자는 놀랍게도, 산소를 함유하는 무기 물질, 바람직하게는 산소를 함유하는 결정화된 무기 물질, 더욱더 바람직하게는 산화물로 이루어진 나노입자가 동물의 비정상 세포, 조직 또는 기관을 방해, 변형 또는 파괴하기 위한 국소적 조사의 치료 효과를 증대시킬 수 있다는 점을 발견하였으며, 상기 무기 물질의 밀도는 7 g/cm3 이상, 바람직하게는 7 g/cm3 초과, 특히 산화물로 이루어진 나노입자에 대해서는 밀도가 7 g/cm3 초과 15 g/cm3 미만이다.
본 발명에 따른 나노입자를 사용하여 최초로 시험관내 방사선치료 효과의 강한 상승이 발견될 수 있다(예를 들어, 도 5b, 8, 10, 11a 및 11b 참조).
본원에서, 본 발명자는 본원에 기재된 나노입자를 주사한 후에 동물이 상기 나노입자를 활성화시킬 수 있는 낮은 양의 조사에 국소적으로 노출될 때 상기 동물의 종양이 크기가 감소하고 결국 소멸한다(완전관해)는 점을 입증한다(실시예, 및 도 6, 7 및 9 참조).
본 발명에서, "나노입자" 또는 "나노입자 집합체"라는 용어는 작은 크기의 합성물을 나타낸다. 그 형태는 예를 들어 둥근 것, 평평한 것, 신장된 것, 구형 또는 타원형 등일 수 있다. 그 형태는 제조방법에 의해 결정되거나 조절될 수 있고 원하는 적용 분야에 따라 당업자에 의해 조정될 수 있다.
입자의 형태는 그 특성에 크게 영향을 미치지 않는다. 그러나, 그 형태는 입자의 "생체적합성(생체적합성)"에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 약동학적 이유로, 본질적으로 신장형, 구형 또는 둥근 형태의 나노입자 또는 나노입자 집합체가 바람직하다. 구형 또는 둥근 형태가 특히 바람직하다. 또한, 매우 균일한 형태를 갖는 입자 또는 나노입자 집합체가 바람직하다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 입자 또는 나노입자 집합체의 크기는 일반적으로 약 3 nm 내지 400 nm, 바람직하게는 약 5, 10, 15 또는 20 nm 내지 200 nm, 더욱더 바람직하게는 약 20 내지 100 nm 또는 약 40 nm 내지 100 nm이다.
실제로, 상기 크기는 입자 또는 나노입자 집합체가 본질적으로 대식세포(식균작용)에 의해 포획되지 않고 심각한 차단을 야기하지 않고, 체내(조직, 세포, 혈관 등)에 확산될 수 있기에 충분히 작아야 한다. 바람직하게는, 이러한 효과는 평균 입자 크기가 100 nm 미만인 입자에 의해 인체 내에서 획득될 수 있다.
상기 집합체는 집합체 구조 내에서 개개의 나노입자의 융합을 유발할 수 있다.
비표면적이 작은 나노입자가 주변환경과의 그의 상호작용을 제한하기 위하여 바람직하다. 본 발명의 목적을 위해, 나노입자의 비표면적은 예를 들어 약 10 m2/g 내지 80 m2/g에 포함된다. 상기 비표면적은 바람직하게는 20 내지 60 m2/g에 포함된다.
본 발명에 따른 나노입자의 놀라운 효과는 나노입자의 구성성분인 산소를 함유하는 무기 물질, 바람직하게는 결정화된 물질의 성질에 주로 기인하며, 상기 물질의 밀도는 7 g/cm3 이상, 바람직하게는 7 g/cm3 초과, 특히 산화물로 이루어진 나노입자에 대해서는 밀도가 7 g/cm3 초과 15 g/cm3 미만, 특히 8 내지 14 g/cm3, 또는 8 내지 12 g/cm3이다. 특히 낮은 이온화 방사선을 사용할 때, 실제로 상기 나노입자는 이온화 방사선을 흡수할 수 있고, 충분한 양의 전자 및/또는 고에너지 광자를 방출할 수 있으며, 이는 표적 세포, 조직 또는 기관의 변형 또는 파괴의 직접적인 원인이 된다. 또한, 본 발명은 높은 이온화 방사선 하에서도 유리하게 사용이 가능하다(도 11b 참조).
이온화 방사선의 양은 시험관내에서 수행되는 적용에 대해 약 0.05 내지 6 그레이(Gray)의 양이 바람직하다.
상기 양은 특히 국소적으로, 생체외 또는 생체내에서 수행되는 적용에 대해 0.05 그레이 초과 16 또는 30 그레이 미만에 포함된다. 총 이온화 방사선의 범위는 현재 실무에 따라 인간에 있어서 1.5 그레이 내지 약 85 그레이이다.
전달되는 방사선의 총량은 단일 용량, 분할 용량, 과분할 용량 등과 같은 다른 스케줄에 따라 주어질 수 있다.
본원에서 조사되는 나노입자는 실시예에서 입증된 바와 같이 표준 방사선요법에 비해 분명한 치료 효과의 개선을 나탄낸다.
전술한 무기 물질은 바람직하게는 무기 물질이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 무기 물질은 산화물이다.
산화물은 하나 이상의 산소 원자 및 하나 이상의 두번째 별도의 화학원소를 포함하는 화학적 화합물이다. 상기 별도의 화학원소는 나노입자 또는 나노입자 집합체를 제조하기 위한 본원에 기재된 방법에서 전구체로서 사용될 수 있다. 본 발명에서, 바람직한 산화물은 금속 산화물(MxOy)("Metal Oxide Chemistry and Synthesis - from solution to solid state", Jean-Pierre Jolivet, Savoirs Actuels InterEditions/CNRS, Editions 1994 참조) 및 텅스텐산염(Mx(WO4)y)이다.
본 발명에서 이용가능한 금속 산화물은 란탄족 원소의 산화물 및 원소주기율표(멘델레예프의 표)의 화학(금속)원소의 산화물, 특히 원소주기율표의 제5주기 및 제6주기의 금속 원소의 산화물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 원소의 예는 다음과 같다:
- 란탄족 원소의 적합한 산화물은 예를 들어 CeO2, Nd2O3, Sm2O3, Eu2O3, Gd2O3, Tb2O3, Dy2O3, Ho2O3, Er2O3, Tm2O3, Yb2O3, Lu2O3 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있음;
- 원소주기율표의 제6주기의 금속 원소의 적합한 산화물은 예를 들어 HfO2, TaO2, Ta2O5, WO2, WO3, ReO2, OsO2, IrO2, PtO, PtO2, HgO, Hg2O, Tl2O3, PbO, Pb2O3, Pb3O4, PbO2, PoO2, Bi2O3 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있음;
- 원소주기율표의 제5주기의 금속 원소의 적합한 산화물은 예를 들어 NbO, RuO2, Rh2O3, RhO2, PdO, Ag2O, AgO, CdO, In2O3 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있음.
또한, 본원발명에서 산소를 함유하는 무기 물질로서 텅스텐산염(Mx(WO4)y)이 사용될 수 있다.
바람직한 텅스텐산염은 예를 들어 FeWO4, CuWO4, MnWO4, PbWO4 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 나노입자에서 산화물(들) 및 텅스텐산염(들)의 혼합물이 또한 가능하다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 나노입자는 산소를 함유하는 무기 물질로 이루어져야 하며, 상기 무기 물질의 밀도는 7 g/cm3 이상, 바람직하게는 7 g/cm3 초과, 특히 산화물로 이루어진 나노입자에 대해서는 밀도가 7 g/cm3 초과 15 g/cm3 미만, 특히 8 내지 14 g/cm3, 또는 8 내지 12 g/cm3이다.
밀도는 단위 부피 V 당 질량 m이다. 본 발명에서, 개선된 치료 효과는 밀도가 높은 나노입자를 사용하여 획득된다. 본원에서 상기 개선된 치료 효과를 얻기 위해 요구되는 밀도의 역가는 본 발명자에 의해 7 g/cm3로서 동정되었다. 가장 높은 밀도가 바람직하다는 것이 이해되어야 한다. 특히 바람직하게는, 밀도는 7.5 g/cm3 이상, 바람직하게는 8 g/cm3 이상, 더욱더 바람직하게는 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5 또는 14 g/cm3 이상이다.
나노입자 또는 나노입자 집합체의 밀도는 약 1g의 건조 분말에 대해 Accupyc 1340 피크노미터 장치를 사용하여 측정된다.
본원에 기재된 나노입자는 바람직하게는 유효원자번호(Zeff)가 50 이상, 바람직하게는 60 또는 61 이상, 더 바람직하게는 65, 66, 67 또는 68 이상인 무기 물질로 이루어진다.
유효원자번호는 원자번호와 유사하지만 원자에 대해 사용되기보다는 화합물(예컨대, 물) 및 다른 물질들의 혼합물(예컨대, 조직 및 골)에 대해 사용되는 용어이다. 유효원자번호는 화합물 또는 물질들의 혼합물에 대한 평균 원자번호를 계산한 것이다. 유효원자번호는 Zeff로 약칭된다.
유효원자번호는, 화합물에서 각 원자의 분수비(fractional proportion)를 얻은 후, 이를 원자의 원자번호와 곱하여 계산한다. 유효원자번호 Zeff에 대한 식은 하기와 같다:
Figure pct00001
상기 식 중,
f n 은 각 원소와 관련된 총 전자수의 분수(fraction)이며,
Z n 은 각 원소의 원자번호임.
상기 원자번호(이는 양성자수라고도 알려짐)는 원자의 핵에서 발견되는 양성자의 수이다. 이는 통상적으로 기호 Z로 나타낸다. 원자번호에 의해 화학원소가 특이적으로 식별된다. 중성 전하의 원자에서, 원자번호는 전자의 수와 같다.
일례는 두 개의 수소 원자(Z=1) 및 하나의 산소 원자(Z=8)로 이루어진 물(H2O)이다. 총 전자수는 1 + 1 + 8 = 10 이다. 두 개의 수소에 대응하는 전자의 분수는 2/10이며, 단일의 산소에 대응하는 전자의 분수는 8/10이다. 따라서, 물의 Zeff는 다음과 같다:
Figure pct00002
Zeff는 나노입자의 입사 방사선 흡수 용량에 관여한다.
하기의 표 1에는 본 발명에서 사용할 수 있는 화합물의 예가 제공되며, 그의 각각의 밀도 및 Zeff가 동정되어 있다.
산화물 식 Z eff 밀도(g/cm 3 )
세륨(IV) 산화물 CeO2 53.40 7.2
네오디늄(III) 산화물 Nd2O3 56.40 7.2
사마륨(III) 산화물 Sm2O3 58.39 7.6
유로퓸(III) 산화물 Eu2O3 59.38 7.4
가돌리늄(III) 산화물 Gd2O3 60.37 7.4
테르븀(III) 산화물 Tb2O3 61.37 7.9
디스프로슘(III) 산화물 Dy2O3 62.36 7.8
홀뮴 산화물 Ho2O3 63.36 8.4
에르븀 산화물 Er2O3 64.35 8.6
툴륨(III) 산화물 Tm2O3 65.34 8.6
이테르븀 산화물 Yb2O3 66.34 9.2
루테튬 산화물 lu2O3 67.33 9.4
하프늄(IV) 산화물 HfO2 67.26 9.7
탄탈룸(IV) 산화물 TaO2 68.25 10.0
탄탈룸(V) 산화물 Ta2O5 67.24 8.2
텅스텐(IV) 산화물 WO2 69.24 10.8
텅스텐(VI) 산화물 WO3 67.27 7.2
레늄(IV) 산화물 ReO2 70.23 11.4
오스뮴(IV) 산화물 OsO2 71.23 11.4
이리듐(IV) 산화물 IrO2 72.22 11.7
백금(II) 산화물 PtO 75.46 14.1
백금(IV) 산화물 PtO2 73.21 11.8
수은(I) 산화물 Hg2O 78.68 9.8
수은(II) 산화물 HgO 77.45 11.1
탈륨(III) 산화물 Tl2O3 77.29 10.2
납(II) 산화물(마시콧) PbO 79.45 9.6
납(IV) 산화물 PbO2 77.18 9.6
납(II,IV) 산화물 Pb2O3 78.28 10.1
납(II,II,IV) 산화물 Pb3O4 78.66 8.9
폴로늄(IV) 산화물 PoO2 79.17 8.9
비스무트 산화물 Bi2O3 79.28 8.9
니오븀(II) 산화물 NbO 38.61 7.3
루테늄(IV) 산화물 RuO2 39.63 7.1
로듐(III) 산화물 Rh2O3 41.55 8.2
로듐(IV) 산화물 RhO2 40.61 7.2
팔라듐(II) 산화물 PdO 43.57 8.3
은(I) 산화물 Ag2O 45.72 7.2
은(II) 산화물 AgO 44.57 7.5
카드뮴 산화물 CdO 45.56 8.2
인듐 산화물 In2O3 45.50 7.2
Figure pct00003
나노입자 또는 나노입자 집합체의 밀도 및 Zeff가 높을수록, 이온화 방사선의 흡수가 더 효과적이다. 전자 및/또는 고에너지 광자의 방출은 조사에 따라 증폭되며, 이로 인해 치료효과가 증대된다.
본원에서 본 발명자는 놀랍게도 광자 및 전자 방출 증폭에 대해 매개변수 밀도의 근본적이고 직접적인 역할을 강조하며, 상기 증폭은 본원에서 설명되는 바와 같이 밀도가 7 g/cm3 역가에 도달할 때, 바람직하게는 밀도가 7 g/cm3 역가를 초과할 때, 포유류에서 치료적 적용을 허용한다(실시예 참조). HfO2 및 CeO2 나노입자와 관련된 실시예 4, 10a 및 10b는 또한 상수 Zeff에 대해 밀도의 놀라운 영향을 강조하는 결과를 제공한다.
본 발명에 따른 나노입자 또는 집합체는 바람직하게는 생체적합성이며, 이는 그의 치료 효과를 제공하기 위해 동물 유기체, 통상적으로 포유류, 특히 인간에게 안전하게 투여될 수 있다는 것을 말한다. 상기 생체적합성은 예를 들어 입자를 구성하는 물질(들) 또는 화합물(들)의 성질에 의해, 및/또는 선택적인 코팅에 의해, 보장될 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 나노입자 또는 집합체는 생체적합성 코팅으로 도포된다. 본 발명의 나노입자 및/또는 집합체가 정맥내(IV) 경로를 통해 대상체에 투여될 때, 상기 생체적합성 코팅은 전술한 EPR 효과 측면에서 나노입자 및 집합체의 생체분포를 최적화하는데 특히 유리하다. 나노입자 또는 집합체의 전체 생체적합성 코팅은, 특히 IV 측면에서, 임의의 인식 성분(대식세포, 옵소닌 등)과 입자 표면의 상호작용을 피하기 위해 요구된다. "전체 코팅(full coating)"은 입자의 표면상에 적어도 완전한 단층을 생성할 수 있는 매우 고밀도의 생체적합성 분자의 존재를 나타낸다. 상기 코팅은 나노입자 또는 집합체의 소위 "스텔스(stealth) 효과"의 원인이 된다.
생체적합성 코팅은, 생체적합성 현탁액, 예컨대 생리학적 유체(혈액, 혈장, 혈청 등), 임의의 등장성 매질 또는 생리적 매질, 예를 들어 약학적 투여를 위해 요구되는 글루코스(5%) 및/또는 NaCl(0.9%)을 포함하는 매질(실시예 11 및 도 14 참조)에서 6.5 내지 7.5의 pH에서 나노입자에 안정성을 부여한다.
상기 생체적합성 코팅은 나노입자를 표면처리제로 처리함으로써 획득된다.
안정성은 0.22μm 필터 여과 이전과 이후에 나노입자 현탁액에서 측정되는 건조 추출 정량화(dry extract quantification)에 의해 확인이 가능하다(실시예 11 및 도 15 참조).
유리하게는, 상기 코팅은 생체 내에서 입자의 완전성을 보존하고, 그의 생체적합성을 보장하거나 향상시키며, (예를 들어, 스페이서(spacer) 분자, 생체적합성 중합체, 표적화제(targeting agent), 단백질 등으로) 그의 선택적인 관능화를 용이하게 한다. 실제로, 본 발명에 따른 특정 나노입자는 표적세포에 존재하는 인식 성분과의 상호작용을 가능하게 하는 표적화제를 또한 포함한다. 상기 표적화제는 나노입자 또는 집합체가 종양에 축적되자마자 작용할 것이다. 표적화제의 형태가 표적과의 상호작용을 일으킬 것이기 때문에, 상기 표적화제의 밀도는 주의깊게 조절된다. 실제로, 표적화제의 높은 밀도는 표적화제의 형태를 혼란시킬 수 있으며, 그 결과 표적에 의한 그의 인식을 혼란시킬 수 있다 ("Folate-targeted, cationic liposome-mediated gene transfer into disseminated peritoneal tumors.";　J A Reddy, C Abburi, H Hofland, S J Howard, I Vlahov, P Wils & C P Leamon; Gene therapy (2002) 9 p.1542-1550 / "Folate targeting of drug carriers: A mathematical 모델."; Ketan B. Ghaghadaa,b, Justin Sauld,e, ayaganesh V. Natarajanb,c, Ravi V. Bellamkondad,e, Ananth V. Annapragadaa,b,T.; Journal of Controlled Release 104 (2005) 113-128). 또한, 표적화제의 높은 밀도는 맥관구조에서 순환하는 동안 세망내피계(RES: Reticulo Endothelial System)에 의해 나노입자를 제거하게 할 수 있다.
생체적합성 코팅은 임의의 비결정 또는 결정 구조로 구성될 수 있다. 코팅은 소분자 및 자유 라디칼의 확산을 허용하는 것이 바람직하다. 특히, 코팅은 물(또는 O2)의 통과, 바람직하게는 그의 라디칼 형태의 통과를 허용하는 것이 중요하다 (생체적합성 코팅은 6.5 내지 7.5의 pH에서 용해되지 않을 것임). 이는 다공성 물질을 사용하거나, 및/또는 두께가 얇고 다공성인 코팅층을 추가함으로써, 달성될 수 있다. 따라서, 코팅의 통상적인 다공성은 약 0.05 내지 10 nm, 바람직하게는 0.1 또는 0.2 내지 5 nm에 포함된다. 통상적인 코팅의 두께는 일반적으로 약 0.2 내지 50 nm, 예를 들어 약 0.5 내지 5 nm 또는 약 10 내지 40 nm에 포함된다.
일반적으로, 코팅은 생분해성일 수도 있으며 생분해성이지 않을 수도 있다.
상기 두 개의 옵션은 본 발명의 목적에 따라 사용될 수 있다. 생분해성이 없는 코팅의 예로는, 실리카, 알루미나, 당류(예를 들어, 아가로스), 포스페이트, 실란, 양쪽성 이온 화합물, 지질, 망상 조직이거나 그렇지 않은, 변형되거나 그렇지 않은, 포화 탄소 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌 산화물) 및 무기 중합체(예를 들어, 폴리메타크릴레이트 또는 폴리스티렌) 뿐만 아니라 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질 또는 표면처리제가 있다.
생분해성이 있는 코팅의 예로는, 예를 들어 변형되거나 그렇지 않은, 자연적 형태이거나 그렇지 않은, 생물학적 분자, 및 변형되거나 그렇지 않은, 자연적 형태이거나 그렇지 않은, 생물학적 분자 중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질 또는 표면처리제가 있다, 상기 생물학적 중합체는 인지질, 단당류, 올리고당류 또는 다당류, 예를 들어 폴리설페이트되거나 그렇지 않은 덱스트란일 수 있다.
전술한 물질, 화합물 또는 표면처리제는 단독으로 또는 조합되어, 혼합물로 또는 집합물로, 합성되거나 그렇지 않거나, 공유결합되거나 그렇지 않거나, 선택적으로는 다른 화합물과 조합되어 사용될 수 있다. 또한, 자연적으로 수용성 또는 지용성이거나, 인위적으로 수용성 또는 지용성이 되도록 변형된 전술한 물질 중 임의의 것이 사용되는 것도 가능하다.
생체적합성 코팅은 바람직하게는 무기 제제, 금속 제제, 유기 제제, 및 이의 혼합물 또는 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물을 포함하거나 또는 이러한 화합물로 이루어진다.
적합한 무기 제제는 산화물, 수산화물 및 옥시수산화물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 무기 제제는 예를 들어 규소, 알루미늄, 지르코늄, 칼슘, 마그네슘 및/또는 주석을 포함할 수 있다.
상기 제제는 생물학적 매질과 나노입자의 상호작용을 조절하기 위해 상기 나노입자에 양전하 또는 음전하를 부여하도록 사용될 수 있다.
예를 들어 마그네슘 및 칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택된 무기 제제는 pH 7에서 나노입자의 표면에 양전하를 가져올 것이다.
예를 들어, 규소는 pH 7에서 나노입자의 표면에 음전하를 가져오기 위해 사용될 수 있다.
적합한 금속 제제는 금, 은 및 백금으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
적합한 유기 제제는 본원발명에 따른 나노입자와 상호작용을 할 수 있는 관능기 및 상기 나노입자에 생체적합성을 부여하는 관능기를 포함하는 임의의 제제일 수 있다.
나노입자와 상호작용을 할 수 있는 관능기를 포함하는 제제는 예를 들어 카르복실레이트(R-COO-), 설페이트(R-SO4 2-), 알코올(R-OH), 실란(R-Si(OR)3), 아민(R-NH2), 사차 암모늄(R-NH4 +), 포스폰산 관능기(R-PO(OH)2) 또는 인산 관능기(R-O-PO(OH)2)일 수 있다.
본 발명에 따른 나노입자에 생체적합성을 부여할 수 있는 관능기를 포함하는 제제는 스테릭(steric) 관능 및/또는 정전기 관능을 가질 수 있다. 상기 스테릭 관능을 가지는 제제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 산화물, 폴리비닐알코올, 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드(폴리(N-이소프로필아크릴아미드)), 폴리카바미드, 생체고분자 또는 다당류, 예컨대 덱스트란, 크실란, 셀룰로스, 콜라겐, 및 양쪽성 이온 화합물, 예컨대 폴리설포베타인 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
양의 정전기 관능을 가지는 제제는 아민, 예컨대 아미노프로필트리에톡시실란 또는 폴리리신일 수 있다.
음의 정전기 관능을 가지는 제제는 포스페이트(예를 들어, 폴리포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 등), 카르복실레이트(예를 들어, 시트르산 또는 디카르복실산, 특히 숙신산) 및 설페이트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 상기 코팅은 관심대상인 임의의 분자가 입자 표면에 결합할 수 있게 하는 다른 관능기(또는 링커(linker) 부분)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 나노입자의 통상적인 예는 생체적합성 코팅으로서 소듐 트리메타포스페이트(STMP) 또는 소듐 헥사메타포스페이트(HMP)와 같은 포스페이트 화합물을 포함하는 HfO2로 이루어진 나노입자이다.
본 발명에 따른 나노입자의 또다른 예는 생체적합성 코팅으로서 금속 제제, 폴리에틸렌, 산화물, 아민, 무수물, 포스페이트 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 관능기를 갖는 실란을 포함하는 HfO2로 이루어진 나노입자이다.
본 발명의 또다른 목적은, 하기를 포함하는, 상기 정의된 나노입자 또는 나노입자 집합체 또는 이의 혼합물의 제조방법에 관한 것이다:
- 산소를 함유하는 무기 물질을 제조할 수 있는 화학원소를 제공하는 단계, 여기서 상기 물질의 밀도는 7 g/cm3 이상, 바람직하게는 7 g/cm3 초과, 특히 산화물로 이루어진 나노입자에 대해서는 밀도가 7 g/cm3 초과 15 g/cm3 미만임,
- 상기 화학원소를 극성 매질(예컨대 수용액, 알코올 용액 등)에 침전시키고 결정화시켜, 상기 화학원소로부터 나노입자 또는 나노입자 집합체를 제조하는 단계, 및
- 선택적으로, 전술한 표면처리제를 사용하여 상기 나노입자 또는 집합체를 코팅하는 단계.
상기 침전 단계 동안:
- pH는 바람직하게는 약 7 내지 14로 조절하는 것이 유리함;
- 전구물질(화학원소)의 농도는 바람직하게는 약 10-3 내지 3 mol/l로 조절하는 것이 유리함;
- 이온강도는 바람직하게는 약 10-3 mol/l 내지 5 mol/l, 바람직하게는 약 10-3 mol/l 내지 3 mol/l로 조절하는 것이 유리함;
- 온도는 바람직하게는 약 20℃ 내지 350℃로 조절하는 것이 유리함.
선택적으로 코팅되기 전에, 무기 물질은 예를 들어 열처리에 의해 결정화되는 것이 바람직하다 (상기 처리 이후에 습식 또는 건식 밀링(milling) 단계가 수행될 수 있음). 침전 및 결정화 단계들은 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다.
또한, 원하는 결정상, 결정도, 입자 형태, 입자 크기 및/또는 밀도를 얻는 것을 보조하기 위해, 극성 매질에 격리(착화)제가 첨가될 수 있다.
또한, 결정화된 물질은 (주어진 pH에서 상기 나노입자에 안정성을 부여하기 위해 무기 입자의 표면에 전하를 제공하기 위하여) 세척(임의의 불순물을 제거하기 위함) 및/또는 해교(peptized)될 수 있다.
코팅 단계는 유리하게는 나노입자 또는 나노입자 집합체가 전술한 표면처리제(본원에서는 "코팅"이라고도 함)와 접촉하도록 놓아두는 단계로 이루어진다.
특정 구현예에서, 생체적합성 나노입자, 나노입자 집합체 또는 이의 혼합물의 현탁액의 제조방법은 하기 단계를 바람직하게는 순서대로 포함한다:
a) 산소를 함유하는 무기 물질, 특히 산화물 또는 텅스텐산염, 바람직하게는 산화물을 형성할 수 있는, 란탄족의 화학원소 또는 원소주기율표의 제5주기 또는 제6주기의 화학원소를 전구물질로서 제공하는 단계, 여기서 상기 물질의 밀도는 7 g/cm3 이상, 바람직하게는 7 g/cm3 초과, 특히 산화물로 이루어진 나노입자에 대해서는 밀도가 7 g/cm3 초과 15 g/cm3 미만, 특히 8 내지 14 g/cm3 또는 8 내지 12 g/cm3임,
b) 상기 a) 단계의 전구물질을 극성 매질에서, 바람직하게는 매질의 pH, 온도, 이온강도 및/또는 전구물질의 농도를 조절하고, 선택적으로는 착화제를 첨가하여, 침전시키는 단계,
c) 선택적으로, 열처리에 의해 상기 침전물을 결정화시키는 단계,
d) 선택적으로, 상기 b) 단계 또는 c) 단계의 마지막에 획득된 현탁액을 세척하여, 상기 현탁액에 존재하는 임의의 불순물, 염 및/또는 착화제를 제거하는 단계,
e) 선택적으로, 상기 현탁액에 존재하는 나노입자 또는 집합체의 표면에 전하를 제공하기 위하여 해교(peptization)를 수행하는 단계, 및
f) 선택적으로, 상기 나노입자 또는 집합체를 코팅하는 단계.
전술한 방법에 의해 획득된 나노입자 또는 나노입자 집합체의 현탁액의 pH는 생리학적 매질(pH 6.5 내지 7.5)로 조절될 수 있다.
상기 현탁액은 또한 대상체에 투여되기 전에 제형화 단계에 제공될 수 있다.
특정 구현예에서, HfO2로 이루어지거나 HfO2로 이루어진 핵을 포함하는, 나노입자 또는 나노입자 집합체의 제조방법은 하기 단계를 바람직하게는 순서대로 포함한다:
- 하프늄 전구물질의 용액(예컨대, 특히 HfCl4 또는 HfOCl2 용액)을 염기, 예컨대 특히 테트라메틸암모늄 수산화물(TMAOH)로 침전시키는 단계,
- 상기 획득한 비결정질 무기 현탁액을 예를 들어 50℃ 초과, 바람직하게는 100℃ 이상에서 열처리에 의해, 선택적으로는 현탁액을 교반하면서, 결정화시키는 단계,
- 선택적으로, 상기 획득한 결정화된 물질을 세척 및/또는 해교하는 단계,
- 선택적으로, 상기 결정화된 물질을 전술한 표면처리제와 접촉하게 하여 상기 물질을 코팅하는 단계.
본 발명의 또다른 목적은, 상기 정의된 나노입자 또는 집합체 및/또는 본원에 기재된 방법으로 획득할 수 있는 나노입자 또는 집합체를 포함하는 임의의 조성물에 기초한다. 의무적이지는 않지만, 본 발명의 조성물에서 입자는 크기 및 형태가 매우 균질한 것이 유리하다.
본 발명의 특정 목적은 상기 정의된 입자 또는 나노입자 집합체, 및 선택적으로는 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 특정 목적은 상기 정의된 입자 또는 나노입자 집합체, 및 선택적으로는 생리학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 진단 또는 이미징(imaging) 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 고체, 액체(현탁액 내 입자), 에어로졸, 겔, 페이스트 등의 형태일 수 있다. 바람직한 조성물은 액체 형태이다.
사용되는 부형제 또는 담체는 예를 들어 염류용액, 등장액, 멸균액, 완충액 등과 같이 이러한 형태의 적용을 위한 임의의 통상적인 지지체일 수 있다. 이는 또한 안정화제, 감미료, 계면활성제 등을 포함할 수도 있다. 이는 약학적 제형의 공지된 기술을 사용함으로써 예를 들어 앰플, 에어로졸, 병, 정제, 캡슐로 제형화될 수 있다.
본원에 기재된 조성물에서, 나노입자의 적합하거나 바람직한 농도는 약 10-3 mg의 나노입자/종양의 그램 내지 약 100 mg의 나노입자/종양의 그램, 특히 약 5 내지 50 mg의 나노입자/종양의 그램에 포함된다. 이는 다른 경로의 투여를 포함한다.
일반적으로, 액체 형태의 조성물은 0.05 g/L 내지 300 g/L, 0.05 g/L 내지 150 g/L, 바람직하게는 10 g/L 이상, 20 g/L 이상, 40 g/L 이상, 45 g/L 이상, 50 g/L 이상, 55 g/L 이상, 60 g/L 이상, 80 g/L 이상, 100 g/L 이상, 150 g/L 이상, 200 g/L 이상 또는 250 g/L 이상의 나노입자를 포함한다.
건식 추출은 나노입자를 포함하는 현탁액의 건조 단계에 따라 측정되는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물, 입자 및 집합체는 다수의 분야, 특히 인간 또는 가축의 의약 분야에 사용될 수 있다.
본 발명의 목적은 표적 세포, 조직 또는 기관을 변형, 파괴 또는 제거하기 위하여 전술한 나노입자 또는 나노입자 집합체를 사용하는 것이다.
이온화 방사선, X선, 감마선, 방사성 동위원소 및/또는 전자빔의 효과에 의해, 특히 나노입자는 여기되어 전자 및/또는 고에너지 광자를 생성한다.
상기 전자 및/또는 고에너지 광자는 주변 매질, 특히 물 또는 O2와 접촉함에 따라 자유 라디칼을 생성하거나, 및/또는 새로운 이온화를 발생시킬 수 있다.
이온화 방사선의 에너지에 따라, 상기 입자는 조직의 파괴, 및/또는 단지 이미징 및/또는 진단의 목적을 위한 시각화를 가능하게 할 수 있다.
따라서, 본 발명의 특정 목적은, 동물에서 표적 세포가 방사선, 특히 이온화 방사선에 노출될 때, 상기 표적 세포를 변형, 파괴 또는 제거하기 위한 약학 조성물을 제조하기 위해 본 발명에 따른 나노입자 또는 나노입자 집합체를 사용하는 것, 및 이에 대응하는 방법에 기초한다.
또한, 상기 약학 조성물은 암을 치료하기 위한 목적으로 나노입자 또는 나노입자 집합체와 다른 추가의 치료적 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 특정 목적은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 표적세포의 용해, 세포자멸 또는 파괴를 유도하거나 야기하기 위한 방법에 기초한 것으로서, 상기 방법은 세포, 특히 표적 세포를 전술한 하나 이상의 나노입자 또는 나노입자 집합체와 그 입자 또는 집합체가 그 표적세포 내부에 침투하거나 그 표적세포와 상호작용하기에 충분한 시간 동안 접촉시키는 단계, 및 방사선, 적합한 방사선, 특히 이온화 방사선, 바람직하게는 X선, γ-선, 방사성 동위원소 및/또는 전자빔에 노출시키는 단계를 포함하며, 이러한 노출은 상기 표적세포의 용해, 세포자멸 또는 파괴를 유도하거나 야기한다.
표적세포는 임의의 병리학적 세포, 즉 다시 말하면 병리학적 메카니즘에 관계된 세포일 수 있으며, 예를 들어 종양 세포, 협착 세포(섬유아/민무늬근 세포) 또는 면역계 세포(병리학적 세포 클론)와 같은 증식 세포이다. 바람직한 적용 분야는 악성 세포 또는 조직의 치료(예를 들어, 파괴 또는 기능 변형)에 기초한다.
이러한 점에서, 본 발명의 특정 목적은 암 치료를 위한 약학 조성물을 제조하기 위해 (전술한 이온화 방사선과 조합하여) 전술한 조성물, 입자 또는 나노입자 집합체를 사용하는 것에 기초한다.
또한, 본 발명의 개시내용은 동물에서 암 세포가 방사선, 특히 전술한 이온화 방사선에 노출될 때, 동물의 암을 예방 또는 치료하거나 암의 징후를 완화시키기 위해 전술한 조성물, 입자 또는 나노입자 집합체를 사용하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 특정 목적은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 암 세포의 용해 또는 파괴를 유도하거나 야기하기 위한 방법에 기초한 것으로서, 상기 방법은 전술한 하나 이상의 입자 또는 나노입자 집합체가 암 세포 내부에 침투하거나 암 세포와 상호작용하기에 충분한 시간 동안 상기 입자 또는 집합체를 암 세포와 접촉시키는 단계, 및 상기 암 세포를 방사선, 특히 전술한 이온화 방사선에 노출시키는 단계를 포함하며, 이러한 노출은 상기 암 세포의 용해 또는 파괴를 유도하거나 야기한다.
본 발명의 또다른 목적은 암을 앓고 있는 환자에게 전술한 조성물, 나노입자 또는 나노입자 집합체를 투여하여 그 입자 또는 나노입자 집합체가 비정상 세포 내부에 침투하거나 비정상 세포, 특히 암 세포와 상포작용하도록 하는 단계, 및 이어서 여기원, 특히 이온화 방사선 원의 존재하에 환자를 치료함으로써 환자의 비정상 세포의 변형, 방해 또는 기능적인 파괴를 유발하여 암을 예방 또는 치료하는 단계를 포함하는, 대상체 또는 환자의 암을 예방 또는 치료하거나 암의 징후를 완화시키기 위한 방법에 관한 것이다.
전통적인 암의 처치는 체계적으로 동시 복합 치료(예를 들어, 방사선요법 및 화학요법의 조합)의 동시적용을 나타낸다.
방사선요법의 측면에서, 이온화 방사선에 제공되는 본 발명의 나노입자는 다양한 암의 치료 프로토콜과 관련하여 사용될 수 있다. 상기 프로토콜은 수술, 방사선외과수술, 화학요법, 세포독성(들), 세포증식억제제(들)의 투여를 포함하는 치료법, 표적화 요법, 백신, 방사성핵종, 특히 면역 방사성핵종, 및 임의의 다른 암 치료용 생물학적 산물 또는 무기물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
놀랍게도, 본원에 기재된 나노입자는 또한 방사선요법 단독의 측면에서 효과의 증가가 관찰되면서 사용될 수 있다.
본 발명은 임의 유형의 악성 종양, 예컨대 혈액학적 종양 또는 악성암종, 및 고형 종양, 특히 상피성, 신경외배엽 또는 간엽 기원을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 나노입자는 전통적으로 방사선 요법이 사용 및/또는 권고되는 전-악성 병변 또는 특이적 양성 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 치료적 측면에서 일차 종양, 또는 이차 침습, 국부적 또는 멀리 떨어져 있는 전이에 적용될 수 있으며, 예방적 측면에서 흑색종, 폐암, 신장암, 유방암 등으로부터 관찰되는 침습(전이)과 같은 이차 악성 중추신경계의 관여를 피하기 위해 적용될 수 있다.
나노입자는 항암 치료 기간 동안 언제든지 사용될 수 있다. 나노입자는 예를 들어 네오아주반트로서(암 절제 수술의 개입 전) 또는 아주반트로서(수술 후) 투여될 수 있다.
나노입자는 또한 수술에 의해 제거될 수 없는 후기 종양에 대해서도 사용될 수 있다.
본원에서 설명된 바와 같이, 조사는 현재 이용가능한 임의의 방사선요법 또는 방사선촬영 시스템을 사용함으로써 입자를 투여한 후 언제든지 하나 이상의 경우에 적용될 수 있다.
본원에 기재된 나노입자는 특히 방사선요법이 전통적 치료법인 암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 상기 암은 특히 흑색종, AIDS 관련 악성 신생물을 포함하는 피부암; 뇌, 뇌간, 소뇌, 뇌하수체, 척추관, 안구 및 안와를 포함하는 중추신경계 종양; 두경부 종양; 폐암; 유방암; 위장 종양, 예컨대 간 및 간담즙 관 암, 결장, 직장 및 항문 암, 위, 췌장, 식도 암; 수컷 비뇨생식기 종양, 예컨대 전립선, 고환, 음경 및 요도 암; 부인과 종양, 예컨대 자궁경, 자궁내막, 난소, 난관, 질 및 외음부 암; 부신 및 복막후 종양; 위치와 무관한 골 및 연 조직의 육종; 림프종; 골수종; 백혈병; 및 소아과 종양, 예컨대 빌름스 종양, 신경아세포종, 중추신경계 종양, 유잉 육종 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 입자는 조사의 전체 양의 넓은 범위 내에서 여기될 수 있다.
양 및 스케줄(단일 용량으로, 또는 분할되거나 과분할된 프로토콜 측면에서 조사의 전달 및 계획 등)은 임의의 질환/해부학적 부위/질환 단계, 환자 설정/환자 연령(유아, 성인, 노인 환자)에 대해 규정되며, 임의의 특이적 상황에 대한 처치의 표준을 구성한다.
상기 조사는 현재 이용가능한 임의의 방사선요법 또는 방사선촬영 시스템을 사용함으로써 입자를 투여한 후 언제든지 하나 이상의 경우에 적용될 수 있다. 상기 입자는 국부(특히, 종양내(IT)), 피하, 정맥내(IV), 피내, 동맥내, 기도(흡입), 복강내, 근육내 및 구강 경로(경구)와 같은 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다. 상기 입자는 또한 종양 절제 이후에 종양 베드(bed)의 가상 공동(virtual cavity)과 같은 강내로 투여될 수 있다.
반복 주사 또는 투여가 적합한다면 이에 따라 수행될 수 있다.
"치료"라는 용어는 비정상 기능의 교정, 질병의 예방, 병리학적 징후의 개선, 예컨대 특히 비정상 조직, 특히 종양의 크기 또는 성장의 감소, 상기 크기 또는 성장의 조절, 비정상 세포 또는 조직의 억제 또는 파괴, 질병 진행의 지연, 암 진행의 지연에 의한 질병의 안정화, 전이 형성의 감소, 질병의 퇴보 또는 완전 관해(예를 들어, 암의 측면) 등을 위해 수행되는 임의의 작용을 의미한다.
전술한 바와 같이, 적합한 방사선 또는 여기원은 바람직하게는 이온화 방사선이며, 유리하게는 X선, 감마선, 전자빔, 이온빔 및 방사성 동위원소 또는 방사성 동위원소 방출로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. X선이 여기원으로서 특히 바람직하다.
이온화 방사선은 통상적으로 약 2 KeV 내지 약 25　000 KeV, 특히 약 2 KeV 내지 약 6000 KeV(LINAC 원), 또는 약 2 KeV 내지 약 1500 KeV(예컨대, 코발트 60 원)이다.
일반적으로 비제한적인 방식으로, 하기의 X선이 입자를 여기시키기 위하여 다양한 경우에 적용될 수 있다:
- 2 내지 50 keV의 표면 X선: 표면 근처의 나노입자를 여기시키기 위함(수 밀리미터의 침투);
- 50 내지 150 keV의 X선: 진단 뿐만 아니라 치료용;
- 6㎝ 두께의 조직을 침투할 수 있는, 200 내지 500 keV의 X선(오르토(ortho) 전압);
- 1000 keV 내지 25,000 keV의 X선(메가(mega) 전압). 예를 들어, 전립선 암의 치료를 위한 나노입자의 여기는 15,000 keV의 에너지를 갖는 5 포커싱된(five focused) X선을 통해 실시될 수 있다.
방사성 동위원소가 이온화 방사선 원으로서 선택적으로 사용될 수 있다(큐리요법(curietherapy) 또는 근접치료로서 지칭됨). 특히, 요오드 I125 (t½ = 60.1일), 팔라듐 Pd103 (t½ = 17일), 세슘 Cs137 및 이리듐 Ir192이 사용되는 것이 유리할 수 있다.
양성자와 같은 하전된 입자 빔, 탄소, 특히 고에너지 이온빔과 같은 이온 빔이 또한 이온화 방사선 원 및/또는 중성자 빔으로서 사용될 수 있다.
전자빔은 또한 4 MeV 내지 25 Mev에 포함되는 에너지를 갖는 이온화 방사선 원으로서 사용될 수 있다.
산화물 나노입자 또는 나노입자 집합체의 원자의 원하는 X선 흡수단에 가깝거나 대응하는 에너지에서 X선 방사선을 선택적으로 발생시키기 위해, 특이적 단색 조사 원이 사용될 수 있다.
바람직하게는, 이온화 방사선의 원은 선형가속기(LINAC), 코발트 60 및 근접치료(brachytherapy) 원으로부터 선택될 수 있다.
진단 분야에서, 본 발명의 나노입자는 임의 유형의 조직을 검출 및/또는 시각화하기 위한 콘트라스트 제제(contrast agent)로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 세포, 조직 또는 기관의 검출 또는 시각화를 위한 조성물을 제조하기 위해, 특히 방사선촬영 장치를 사용하여 방사선과 조합하여 전술한 조성물, 입자 또는 나노입자 집합체를 사용하는 것이다.
"조합"이라는 용어는 본 발명의 나노입자가 부분적으로 포함된 관심 대상인 세포, 조직 또는 기관이 정의된 여기원에 의해 여기될 때 요구되는 효과가 달성되는 것을 나타낸다. 그러나, 입자 및 광선이 동시에 투여될 필요도 없고, 동일한 프로토콜에 따를 필요도 없다.
또한, 본 발명의 개시내용은 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 나노입자 또는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 통상적으로, 상기 키트는 본 발명에 따른 하나 이상의 나노입자 또는 나노입자 집합체를 포함한다. 일반적으로, 상기 키트는 또한 본 발명의 약학 조성물의 하나 이상의 성분으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함한다. 상기 용기(들)과 관련하여, 제품을 사용하기 위한 지시를 제공하는 표지 안내문이 본 발명의 방법에 따라 나노입자, 나노입자 집합체 또는 조성물을 사용하기 위해 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 측면 및 이점은 하기의 실시예에서 더욱 명확해질 것이며, 이는 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니라 단지 예시하기 위해 제공된다.
도 1은 HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체의 생체적합성 현탁액을 HCT116 종양을 갖는 스위스(Swiss) 누드 마우스로 종양내 주사한 후에, 이의 시간에 따른 분포 및 분산을 나타낸다.
주사한지 2일 및 15일 후에, 종양에 대해 마이크로단층촬영을 수행하였다.
도 2a 및 2b는 나노입자 형태의 정성적 특징을 나타내는 HfO2 나노입자 및 나노입자 집합체의 투과전자현미경(TEM) 이미지이다 (스케일 바 = 200 nm). 분석을 위해 JEOL 100 CX를 사용한다.
도 2a는 나노입자 뿐만 아니라 나노입자로부터 형성된 집합체를 나타내며, 상기 나노입자와 집합체는 모두 형태가 본질적으로 구형이다.
도 2b는 다른 방법으로 제조된 나노입자 및 상기 나노입자로부터 형성된 집합체를 나타내며, 상기 나노입자와 집합체는 모두 형태가 본질적으로 신장형이다.
도 3은 세포에 내재화된 나노입자의 투과전자현미경(TEM) 사진을 나타낸다. HCT116 배양은 24시간 동안 처리하지 않았거나(대조군), 5 및 100μm의 HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체의 생체적합성 현탁액으로 처리하였다 (스케일 바 500 nm).
나노입자는 엔도좀을 통해 흡수되었다. TEM 시험은 농도 의존 방법에서 나노입자가 엔도좀을 통해 세포로 들어간다는 것을 명백하게 나타내었다. 나노입자는 그의 디자인(design) 및/또는 농도에 따라 집합된 방식으로 또는 개별화된 방식으로 세포에 들어가거나 침투할 수 있다.
도 4는 이온화 방사선이 강조된 전자기 스펙트럼을 나타낸다.
도 5a는 HfO2 나노입자 및 나노입자 집합체의 생체적합성 현탁액의 그레이 레벨(grey level) 또는 콘트라스트(contrast) 값을 농도의 함수로서 나타낸다:
밀도가 7보다 큰 HfO2: 원형 도트
밀도가 7보다 작은 HfO2: X형 도트
50 kV의 전압원으로 작동하는 X선 마이크로단층촬영기(Skyscan 1076)를 사용하여 분석을 수행하였다.
도 5b에 나타낸 바와 같이, 주어진 농도에 대해, 나노입자 또는 나노입자 집합체의 그레이 레벨(그의 흡수율 또는 흡수용량과 직접 관련됨)이 높을수록, 방사선 유도된 세포 사멸을 증가시키는 나노입자 또는 나노입자 집합체의 능력이 더 높아진다.
도 5b는 대조군과 비교하여, 400μm에서 두 개의 별도의 인간 결장 암종 세포주로 배양된 생체적합성 HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체를 사용한 클론원성(clonogenic) 생존 분석을 나타낸다.
SFx(X 그레이(gray)에서의 생존율)은 200 keV X선 조사 원(Tube Comet MXR-225/22- 200kV/15mA/0.2mm Cu)을 사용하여, 감방사선성 세포주 HCT116에서 2 Gy 양의 조사 이후에, 그리고 내방사선성 HT29 세포주에서 4 Gy 양의 조사 이후에, 측정한다. 2개의 다른 실험들로부터 평균값을 얻었다.
도 6: HfO2 나노입자 및/또는 나노입자 집합체를 포함하는 생체적합성 현탁액을 HCT116 종양을 갖는 스위스 누드 마우스에 종양내 주사(종양 부피의 20% 내지 50%의 주사 용량)하였다. 상기 마우스의 종양은 또한 외부에서 사용되는 조사 원과 결합된 어플리케이터[큐리요법 장치 이리듐-192 원]에 의해 국부적으로 조사되었다(4 Gy의 두 세션(session), 본원에서는 또한 두 개의 분할(fraction)로서 인식됨; 원형 도트)
동일한 생체적합성 현탁액을 대조군의 마우스에게 투여(종양 부피의 20% 내지 50%의 주사 용량)하였다. 상기 대조군에는 조사되지 않았다(X형 도트).
상기 기재된 군의 마우스는 방사선요법에 제공된 담체 처리된 마우스(삼각형 도트) 또는 방사선요법에 제공되지 않은 마우스(마름모꼴 도트)와 비교된다. 종양의 부피는 조사 이후에 각각의 군에서 25일 동안 일주일에 2회 모니터링되었다.
도 7은 조사한지 21일 후에 HCT116 종양 세포를 갖는 마우스의 사진을 나타낸다.
도 7a: 담체(입자는 없음)의 종양내 주사 이후에, 조사에 의해 처리된 마우스.
도 7b: 나노입자의 종양내 주사 이후에, 조사에 의해 처리된 마우스.
도 8은 400μm의 HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체의 부재하에(음성 대조군) 또는 존재하에, 200 keV X선 생성기(Tube Comet MXR-225/22- 200kV/15mA/0.2mm Cu)를 이용하여 조사된 HCT116(감방사선성 모델) 및 HT29(내방사선성 모델) 암 세포를 사용하여, 클론원성 생존 분석을 나타낸다. 조사량은 0 내지 4 Gy로 상이하다.
음성 대조군의 HCT116: X형 도트
나노입자를 갖는 HCT116: 사각형 도트
음성 대조군의 HT29: 마름모꼴 도트
나노입자를 갖는 HT29: 원형 도트
도 9는 HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체의 생체적합성 현탁액을 종양내 주사한 후에, 큐리요법 장치 이리듐-192 원을 이용한 외부 조사와 결합된 어플리케이터로 종양을 2x4 Gy 또는 1x8 Gy 조사한 후의, HCT116 종양의 부피 성장을 나타낸다.
8마리의 스위스 누드 마우스에 대해 평균값을 계산하였다.
담체가 주사된 대조군(조사되지 않음, 나노입자 없음): 마름모꼴 도트
나노입자가 주사된 군(조사되지 않음): X형 도트
담체가 주사되고 1x8 Gy 조사된 군(나노입자 없음): 사각형 도트
담체가 주사되고 2x4 Gy 조사된 군(나노입자 없음): 삼각형 도트
나노입자가 주사되고 1x8 Gy 조사된 군: 오픈된 원형 도트
나노입자가 주사되고 2x4 Gy 조사된 군: 원형 도트
도 10은 HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체(농도 800μm)의 존재하에 또는 부재하에, 24시간 처리 기간 후에 측정된 세포 생존율을 나타낸다. 조사량은 0 내지 6 Gy로 상이하다. WST-1 키트가 생존율을 판독하기 위해 사용된다. 각 도트는 3개의 실험들의 평균값이다.
나노입자가 포함됨, 및 조사됨: 삼각형 도트
나노입자가 포함되지 않음, 및 조사됨: 사각형 도트
도 11a는 400μm의 HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체의 부재하에(음성 대조군) 또는 존재하에, 200 keV X선 생성기(Tube Comet MXR-225/22- 200kV/15mA/0.2mm Cu)를 이용하여 조사된 HT1080(섬유육종 내방사선성 모델) 암 세포를 사용하여, 클론원성 생존 분석을 나타낸다. 조사량은 0 내지 4 Gy로 상이하다.
음성 대조군의 HT1080: X형 도트
나노입자를 갖는 HT1080: 사각형 도트
도 11b는 400μm의 HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체의 부재하에(음성 대조군) 또는 존재하에, 코발트 60 원을 이용하여 조사된 HT1080(섬유육종 내방사선성 모델) 암 세포를 사용하여, 클론원성 분석을 나타낸다. 조사량은 0 내지 4 Gy로 상이하다.
음성 대조군의 HT1080: X형 도트
나노입자를 갖는 HT1080: 사각형 도트
나노입자를 사용하여 대조군으로서 "인간 섬유아세포"(비-암종 세포)에 대해 유사한 클론원성 분석을 수행하였으며, 이는 효과를 나타내지 않았거나 매우 중간정도의 효과를 나타내었다. 조사 하에 암세포와 정상세포의 각 반응을 비교할 때 얻어진 결과는 높은 이익 대 위험 비율을 나타낸다.
도 12a는 밀도가 7.4 g/cm3인 HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체(400μm)를 사용하여 2 Gy 조사 후의 세포 생존율(대조군의 %)을 나타낸다(실시예 10a).
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 사각형 도트
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 마름모꼴 도트
나노입자(HfO2-L d=7.4)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 삼각형 도트
나노입자(HfO2-L d=7.4)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 원형 도트
도 12b는 밀도가 6.8 g/cm3인 HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체(400μm)를 사용하여 2 Gy 조사 후의 세포 생존율(대조군의 %)을 나타낸다(실시예 10a).
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 사각형 도트
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 마름모꼴 도트
나노입자(HfO2-E d=6.8)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 삼각형 도트
나노입자(HfO2-E d=6.8)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 원형 도트
도 12c는 밀도가 6.7 g/cm3인 HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체(400μm)를 사용하여 2 Gy 조사 후의 세포 생존율(대조군의 %)을 나타낸다(실시예 10a).
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 사각형 도트
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 마름모꼴 도트
나노입자(HfO2-V d=6.7)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 삼각형 도트
나노입자(HfO2-V d=6.7)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 원형 도트
도 12d는 밀도가 7.1 g/cm3인 CeO2 나노입자 또는 나노입자 집합체(400μm)를 사용하여 2 Gy 조사 후의 세포 생존율(대조군의 %)을 나타낸다(실시예 10b).
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 사각형 도트
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 마름모꼴 도트
나노입자(CeO2-W d=7.1)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 삼각형 도트
나노입자(CeO2-W d=7.1)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 원형 도트
도 12e는 밀도가 6.5 g/cm3인 CeO2 나노입자 또는 나노입자 집합체(400μm)를 사용하여 2 Gy 조사 후의 세포 생존율(대조군의 %)을 나타낸다(실시예 10b).
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 사각형 도트
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 마름모꼴 도트
나노입자(CeO2-S d=6.5)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 삼각형 도트
나노입자(CeO2-S d=6.5)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 원형 도트
도 12f는 밀도가 3.9 g/cm3인 TiO2 나노입자 또는 나노입자 집합체(400μm)를 사용하여 2 Gy 조사 후의 세포 생존율(대조군의 %)을 나타낸다(실시예 10d).
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 사각형 도트
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 마름모꼴 도트
나노입자(TiO2-5nm d=3.9)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 삼각형 도트
나노입자(TiO2-5nm d=3.9)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 원형 도트
도 12g는 밀도가 7.9 g/cm3인 PdO 나노입자 또는 나노입자 집합체(400μm)를 사용하여 2 Gy 조사 후의 세포 생존율(대조군의 %)을 나타낸다(실시예 10e).
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 사각형 도트
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 마름모꼴 도트
나노입자(PdO-A d=7.9)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 삼각형 도트
나노입자(PdO-A d=7.9)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 원형 도트
도 12h는 밀도가 3.8 g/cm3인 TiO2 나노입자 또는 나노입자 집합체(400μm)를 사용하여 2 Gy 조사 후의 세포 생존율(대조군의 %)을 나타낸다(실시예 10e).
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 사각형 도트
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 마름모꼴 도트
나노입자(TiO2-P25 d=3.8)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 삼각형 도트
나노입자(TiO2-P25 d=3.8)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 원형 도트
도 12i는 밀도가 6.6 g/cm3인 CeO2 나노입자 또는 나노입자 집합체(400μm)를 사용하여 2 Gy 조사 후의 세포 생존율(대조군의 %)을 나타낸다(실시예 10e).
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 사각형 도트
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 마름모꼴 도트
나노입자(CeO2-D d=6.6)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 삼각형 도트
나노입자(CeO2-D d=6.6)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 원형 도트
도 12j는 밀도가 5.4 g/cm3인 Nd2O3 나노입자 또는 나노입자 집합체(400μm)를 사용하여 2 Gy 조사 후의 세포 생존율(대조군의 %)을 나타낸다(실시예 10e).
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 사각형 도트
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 마름모꼴 도트
나노입자(Nd2O3-Z d=5.4)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 삼각형 도트
나노입자(Nd2O3-Z d=5.4)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 원형 도트
도 12k는 밀도가 5.6 g/cm3인 Eu2O3 나노입자 또는 나노입자 집합체(400μm)를 사용하여 2 Gy 조사 후의 세포 생존율(대조군의 %)을 나타낸다(실시예 10e).
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 사각형 도트
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 마름모꼴 도트
나노입자(Eu2O3-B d=5.6)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 삼각형 도트
나노입자(Eu2O3-B d=5.6)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 원형 도트
도 12l은 밀도가 7.2 g/cm3인 WO3 나노입자 또는 나노입자 집합체(400μm)를 사용하여 2 Gy 조사 후의 세포 생존율(대조군의 %)을 나타낸다(실시예 10e).
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 사각형 도트
나노입자(HfO2-참고 / 실시예 3 / d=8.3)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 마름모꼴 도트
나노입자(WO3-C d=7.2)가 포함됨, 및 조사되지 않음: 채워진 삼각형 도트
나노입자(WO3-C d=7.2)가 포함됨, 및 조사됨: 오픈된 원형 도트
도 13은 %로서 표현한 상대효율(세포 사멸을 유도하는 능력)을 나타낸다. 상기 상대효율은, 방사선치료 요법 단독(나노입자가 포함되지 않음)과 비교할 때 800μm에서 생체적합성 HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체(실시예 3 참조)의 세포 생존율(대조군의 %)에 대해 상대적인, 방사선치료 요법 단독(나노입자가 포함되지 않음)과 비교할 때 800μm에서 실시예 10에서 시험된 입자의 2 Gy 조사 후의 세포 생존율(대조군의 %)을 반영한다.
두 개의 군의 나노입자는 효과 측면에서 유의적인 차이를 나타내며 구별된다:
- 7 g/cm3 보다 작은 밀도: 시험된 나노입자의 상대효율은 약 55% 미만임.
- 7 g/cm3 이상의 밀도: 시험된 나노입자의 상대효율은 약 80% 보다 더 큼.
도 14는 하기의 다른 조건하에서, HMP 생체적합성 코팅을 포함하거나 포함지 않는, 약 5g/L의 농도에서 나노입자(실시예 10e의 CeO2-D, 실시예 10d의 TiO2-5nm 및 실시예 3의 HfO2 참조)의 안정성의 결핍 또는 안정성을 나타낸다: 샘플은 pH 3 또는 pH 7에서 물에서 또는 5% 글루코스 용액에서 2시간 동안 배양되었다(실시예 11 참조).
도 15는 0.22μm 여과 시험의 결과(실시예 11 참조)를 나타낸다: 서로 다른 샘플(실시예 10e의 CeO2-D, 실시예 10d의 TiO2-5nm 및 실시예 3의 HfO2)은 HMP 생체적합성 코팅을 포함하거나 포함하지 않는다(pH 7에서 물 또는 5% 글루코스 용액에서 2시간 동안 배양됨). 농도는 g/L으로 표현되며, 여과 수율은 %로 표현된다.
실시예 1: 코팅제로서 소듐 트리메타포스페이트를 사용한, 밀도가 7 g/cm3 보다 높은 하프늄 산화물(HfO2) 나노입자 또는 나노입자 집합체의 생체적합성 현탁액.
테트라메틸암모늄 수산화물(TMAOH) 용액을 40 g의 HfCl4 용액에 첨가한다. 최종 현탁액의 pH가 7 내지 13에 도달할 때까지, TMAOH 용액의 첨가를 수행한다. 백색 침전물이 획득된다.
상기 침전물을 오토클레이브로 이동시켜 120℃ 내지 300℃의 온도에서 가열하여, 결정화를 수행한다. 냉각 후에, 상기 현탁액을 탈염수로 세척한다.
나노입자 또는 나노입자 집합체의 안정한 현탁액을 얻기 위하여, 해교(peptization) 단계를 수행한다.
그 후, 소듐 트리메타포스페이트의 현탁액을 상기 해교된 용액에 첨가하고 (첨가하는 소듐 트리메타포스페이트의 양은 치사량(LD)50/5 미만임), 현탁액의 pH를 6.5 내지 7.5로 조절한다.
시험관내 실험을 위해, 0.22μm 필터를 사용하여 멸균 단계를 수행한다.
생체내 실험을 위해, 글루코스 5%를 사용하여 제형화 단계를 멸균 단계 이전에 또는 이후에 수행할 수 있다.
이에 따라 획득한 생체적합성 나노입자 또는 나노입자 집합체의 현탁액의 주요 특징을 하기의 표에 나타낸다.
Figure pct00004

실시예 2: 코팅제로서 소듐 트리메타포스페이트를 사용한, 밀도가 7 g/cm3 보다 낮은 하프늄 산화물(HfO2) 나노입자 또는 나노입자 집합체의 생체적합성 현탁액.
테트라메틸암모늄 수산화물(TMAOH) 용액을 40 g의 HfCl4 용액에 첨가한다. 최종 현탁액의 pH가 1 내지 5에 도달할 때까지, TMAOH 용액의 첨가를 수행한다. 백색 침전물이 획득된다.
상기 침전물을 오토클레이브로 이동시켜 120℃ 내지 300℃의 온도에서 가열하여, 결정화를 수행한다. 냉각 후에, 상기 현탁액을 탈염수로 세척한다.
나노입자 또는 나노입자 집합체의 안정한 현탁액을 얻기 위하여, 해교 단계를 수행한다.
그 후, 소듐 트리메타포스페이트의 현탁액을 상기 해교된 용액에 첨가하고 (첨가하는 소듐 트리메타포스페이트의 양은 LD50/5 미만임), 현탁액의 pH를 6.5 내지 7.5로 조절한다.
시험관내 실험을 위해, 0.22μm 필터를 사용하여 멸균 단계를 수행한다.
생체내 실험을 위해, 글루코스 5%를 사용하여 제형화 단계를 멸균 단계 이전에 또는 이후에 수행할 수 있다.
이에 따라 획득한 생체적합성 나노입자 또는 나노입자 집합체의 현탁액의 주요 특징을 하기의 표에 나타낸다.
Figure pct00005

실시예 3: 코팅제로서 소듐 헥사메타포스페이트를 사용한, 밀도가 7 g/cm3 보다 높은 하프늄 산화물(HfO2) 나노입자 또는 나노입자 집합체의 생체적합성 현탁액.
테트라메틸암모늄 수산화물(TMAOH) 용액을 40 g의 HfCl4 용액에 첨가한다. 최종 현탁액의 pH가 7 내지 13에 도달할 때까지, TMAOH 용액의 첨가를 수행한다. 백색 침전물이 획득된다.
상기 침전물을 오토클레이브로 이동시켜 120℃ 내지 300℃의 온도에서 가열하여, 결정화를 수행한다. 냉각 후에, 상기 현탁액을 탈염수로 세척한다.
나노입자 또는 나노입자 집합체의 안정한 현탁액을 얻기 위하여, 해교 단계를 수행한다.
그 후, 소듐 헥사메타포스페이트의 현탁액을 상기 해교된 용액에 첨가하고 (첨가하는 소듐 헥사메타포스페이트의 양은 LD50/5 미만임), 현탁액의 pH를 6.5 내지 7.5로 조절한다.
시험관내 실험을 위해, 0.22μm 필터를 사용하여 멸균 단계를 수행한다.
생체내 실험을 위해, 글루코스 5%를 사용하여 제형화 단계를 멸균 단계 이전에 또는 이후에 수행할 수 있다.
이에 따라 획득한 생체적합성 나노입자 또는 나노입자 집합체의 현탁액의 주요 특징을 하기의 표에 나타낸다.
Figure pct00006

실시예 4:
실시예 1 및 실시예 2에서 제조한 HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체의 생체적합성 현탁액을 사용한, 세포 생존율 분석 또는 x 그레이(gray)에서의 생존율(SFx) 분석 (도 5b).
물질 및 방법
SFx를 측정하기 전에, 각각의 결장 암 세포주(감방사선성 HCT116 및 내방사선성 HT29 암 세포)에 대해 콜로니형성률(plating efficiency)을 측정하였다. 플레이트마다 50 내지 200개의 콜로니가 형성되도록 세포를 플레이팅(plating)시키고, 부착을 감안하여 37℃에서 3시간 내지 하룻밤 동안 배양하였다. 그 후, 실시예 1(밀도가 8.5임) 및 실시예 2(밀도가 6.5임)의 400μm의 HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체로 24시간의 최대 배양 시간 동안 세포를 처리하였다.
200 keV 조사 장치(Tube Comet MXR-225/22- 200kV/15mA/0.2mm Cu)에 의해, HT29 암 세포에 대해 4 Gy 조사를 사용하고, HCT116 암 세포에 대해 2 Gy 조사를 사용하여, 조사를 수행하였다. 조사 이후에, 세포를 순메탄올(absolute methanol)에서 0.5 % 크리스탈 바이올렛으로 염색하기 전에, 37℃에서 8일을 초과하는 기간 동안 배양하였다. 50개 이상의 세포들을 갖는 콜로니만 카운트하였다.
SFx는 하기의 식에 따라 결정하였다:
SFx = [x 조사량에서의 (콜로니의 수) / x 조사량에서의 (플레이팅된 세포의 총 수)] × 콜로니형성률
결과: 감방사선성 또는 내방사선성 세포에 대한 밀도의 효과
도 5b에 나타낸 바와 같이, 비처리 대조군의 세포에 비해, 조사는 실시예 2의 HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체(밀도가 6.5임)로 혼입되거나 접촉된 감방사선성(HCT116) 및 내방사선성(HT29) 암 세포 모두에 대해, 거의 어떠한 유의적인 효과도 나타내지 않았다. 그러나, 실시예 1의 HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체(밀도가 8.5임)로 암 세포를 처리하는 것은, 감방사선성(HCT116) 및 내방사선성(HT29) 암 세포 모두에 대해 방사선 유도된 세포 사멸의 수준을 유의적으로 증가시켰다.
실시예 5:
실시예 3의 HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체의 생체적합성 현탁액을 사용한, 클론원성 분석(도 8).
표준화된 콜로니-형성 분석에 의해 세포 생존율을 정량화하였다. HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체(400μm)로 세포의 24시간의 최대 배양시간 이후에 즉시, 유리 배양접시를 선형 가속장치로 이동시켰다. 세포를 다른 조사량으로 조사하였다(조사량 속도: 1 Gy/min, 200 keV: Tube Comet MXR-225/22- 200kV/15mA/0.2mm Cu, 실온).
감방사선성 및 내방사선성 암 세포 모두에 대한 결과(도 8)는 나노입자에 대한 방사선 증강률(ER)을 나타낸다. HT29 세포는 4 Gy 양 단독에 대해 1.60의 ER을 나타낸 반면, HCT116 세포는 동등한 양에 대해 1.33의 ER을 나타내었다. 이러한 데이터는, 방사선과 조합된 나노입자가 감방사선성 및 내방사선성 세포주 모두에서 세포 생존율의 감소와 연관되는 클론원성 억제의 원인이 된다는 것을 입증한다.
실시예 6:
실시예 3의 HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체의 생체적합성 현탁액을 사용한, 세포 생존율 분석(도 10).
200 KeV X선 조사(Tube Comet MXR-225/22- 200kV/15mA/0.2mm Cu)를 이용하여 조사량을 변화시키면서(6 Gy까지) 나노입자(800μm)의 존재하에 또는 부재하에 24시간의 처리 기간 후에, WST-1 키트를 사용하여 세포 생존율을 측정하였다. 나노입자의 효과는 도 10에 나타난다.
800μm 나노입자의 존재는 임의의 나노입자가 결핍된 대조군에 비해 세포 생존율의 감소를 야기한다. 1 Gy의 X선 조사를 받은 나노입자는 3 Gy X선 조사를 받은 대조군(방사선요법 단독)에 비해 유사한 효능을 야기한다.
나노입자 단독에 대해, 독성의 어떠한 징후도 관찰되지 않았다.
10개의 다른 농도로 수행된 실험들은 일관된 결과를 나타내었다.
이는 나노입자의 상기 양 증강 효과를 분명하게 입증한다. 놀랍게도, 효율적인 특징들이 낮은 양의 방사선요법에서 관찰된다: 이는 정기적인 방사선요법 프로토콜을 이용한 나노입자의 사용 가능성 뿐만 아니라, 일반적인 요법과 유사하거나 그보다 더 우수한 효율을 위한, 일반적인 방사선요법의 양의 잠재적 감소의 보장을 나타낸다.
실시예 7:
실시예 3의 나노입자 생체적합성 현탁액을 사용한, 종양내 주사 후의 나노입자 분산(도 1).
나노입자 현탁액을 HCT116 종양을 갖는 스위스 누드 마우스에 종양내 주사하였다. 종양에서 나노입자가 잔류하는 시간은 적어도 15일이며, 윤리적인 이유로 요구되는 마우스의 희생 때문에 더 이상의 연구는 할 수 없었다. 또한, 나노입자는 높은 콘트라스트 수준을 나타내며, X선 마이크로단층촬영에 의해 용이하게 검출될 수 있다. 따라서, 종양으로부터 생성물의 잠재적 누출을 평가하기 위하여, 나노입자를 주사하고 2일 및 15일 후에 마이크로단층촬영을 수행하였다. 종양 내 분포는 2일과 15일 사이에 동등하게 남아 있으며, 나노입자는 종양 내에 남아 있는 것(15일 초과)으로 나타난다.
실시예 8:
실시예 3의 나노입자를 사용한, HCT116 종양 모델에서 나노입자의 성능 연구(도 6, 7 및 9).
옆구리에 HCT116 종양이 이식된 스위스 누드 마우스에 나노입자 현탁액을 종양내 주사하였다. 종양의 국부 조사는 큐리요법 장치 이리듐-192 원을 이용한 외부 조사와 결합된 어플리케이터를 사용하여 수행하였다. 종양에 근접한 이리듐-192 원의 위치와 거주 시간은, 분할(fraction)마다 4 또는 8 그레이(gray)의 조사량을 종양에 전달하기 위하여 최적화된다. 일 군의 마우스에 나노입자를 종양내 주사하고(주사 용량은 종양 부피의 20% 내지 50%임), 두 개의 분할의 4 그레이 조사를 하거나 조사하지 않았다(주사로부터 24시간 및 48시간 후).
두번째 군에 나노입자를 종양내 주사하고(주사 용량은 종양 부피의 20% 내지 50%임), 하나의 분할의 8 그레이 조사를 하거나 조사하지 않았다(주사로부터 24시간 후). 마우스의 4개의 군이 방사선요법을 받거나 받지 않은 담체 처리된 동물과 비교된다. 종양 부피는 각 군에서 일주일에 2회 모니터링하였다. 나노입자는 방사선요법 단독을 받은 대조군 마우스에 비해 종양의 전체 퇴보를 야기한다. 조사로부터 20일 후의 평가는, 동일한 스케줄에 따라 방사선요법 단독을 받은 대조군에 비해, 2x4 그레이 또는 1x8 그레이 조사 후에 나노입자 처리된 마우스에서 종양 성장의 억제가 100%로 나타났다.
분할된 조사의 이용은 조사된 참조군에 비해 더 우수한 이익 대 위험 비율이 입증되었다. 본 발명에서, 더 낮은 양의 방사선요법을 사용한 분할된 프로토콜이 가능하다. 상기 프로토콜은 정기적 방사선요법 프로토콜에 비해 더 우수한 이익 대 위험 비율을 허용한다. 실제로, 상기 분할된 프로토콜은 건강한 조직에 대해 통상의 프로토콜에 의해 관찰될 수 있는 유해한 부작용을 감소시키며, 동등하거나 더 우수한 치료 효과를 가져온다.
실시예 9:
200 keV X선 원(Tube Comet MXR-225/22- 200kV/15mA/0.2mm Cu) 또는 코발트 60 원을 이용한, 실시예 3의 HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체의 생체적합성 현탁액을 사용한 클론원성 분석 (도 11a 및 11b).
물질 및 방법
세포 생존율 분석 또는 x 그레이(gray)에서의 생존율(SFx)의 측정 이전에, HT1080 암 세포주(내방사선성 암 세포)에 대해 콜로니형성률(plating efficiency)을 측정하였다. 처리에 따라 50 내지 200개의 콜로니가 형성되는 밀도로 세포를 플레이팅(plating)시켰다. 세포가 부착될 때, 실시예 3의 400μm의 HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체(밀도가 8.3 g/cm3임)를 24시간의 최대 배양시간으로 첨가하였다. 200 keV 조사 장치(Tube Comet MXR-225/22- 200kV/15mA/0.2mm Cu)(도 11a) 및 코발트 60 원(도 11b)을 이용하여, 세포 조사를 수행하였다. 조사 이후에, 세포를 크리스탈 바이올렛 용액으로 고정하고 염색하기 전에, 37℃에서 약 8일 동안 배양하였다. 50개 이상의 세포들을 포함하는 콜로니만 카운트하였다. SFx는 하기의 식을 사용하여 결정하였다:
SFx = [x 양에서의 (콜로니의 수) / x 양에서의 (플레이팅된 세포의 총 수)] × 콜로니형성률
결과: 내방사선성 세포에 대한 조사의 효과
도 11a 및 11b에 나타낸 바와 같이, 실시예 3의 HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체(밀도가 8.3임)로 암 세포를 처리하는 것은, 200 keV 조사 장치(Tube Comet MXR-225/22- 200kV/15mA/0.2mm Cu) 또는 코발트 60 원으로 조사된 내방사선성(HT1080) 암 세포에 대해 방사선 유도된 세포 사멸의 수준을 유의적으로 증가시켰다.
결과는 나노입자의 방사선 증강률(ER)을 나타낸다. HT1080 세포는 200 keV 원(Tube Comet MXR-225/22- 200kV/15mA/0.2mm Cu)만에 의한 4-Gy 조사량에 대해 1.38의 ER을 나타내었으며, 코발트 60 원을 사용할 때 동등한 조사량에 대해 1의 ER이 관찰되었다. 이러한 데이터는, 저 이온화 방사선 에너지 원 또는 고 이온화 방사선 에너지 원을 사용할 때 나노입자가 조사된 내방사선성 HT1080 세포주의 유리한 클론원성 억제의 원인이 된다는 것을 입증한다.
상기 결과는 밀도가 7 g/cm3 보다 높은 생체적합성 산화물 나노입자 또는 나노입자 집합체의, 에너지 방사선 원, 특히 고에너지 방사선 원으로 조사된 세포(내방사선성 세포도 포함됨)의 사멸을 유도하는 효과를 입증한다.
실시예 10:
세포 생존율에 대한 생체적합성 산화물 나노입자 또는 나노입자 집합체의 밀도의 효과.
WST-1 분석에 의해, 세포 생존율에 기초한 효능의 나노입자 또는 나노입자 집합체 스크리닝이 가능하다. 밀도가 상이한 생체적합성 무기 나노입자 또는 나노입자 집합체가 여기에서 시험된다.
세포 생존율은 200 keV 원(Tube Comet MXR-225/22- 200kV/15mA/0.2mm Cu)을 사용하여 고정된 조사량(2 Gy) 하에서, 나노입자 (800μm down to 3.125μm)의 존재하에 또는 나노입자의 부재하에 24시간의 처리 기간 및, 96시간의 후배양 기간 후에 측정한다.
생체적합성 산화물 나노입자 또는 나노입자 집합체의 세포 생존율은 상기 나노입자 또는 나노입자 집합체(400μm) 및 접합 곡선을 사용하여 2 Gy 조사 후에 측정한다 (도 12a 내지 12l 참조).
방사선치료 요법 단독(나노입자가 포함되지 않음)에 비해 400μm에서 20%보다 높은(>20%) 세포 생존율의 감소는 유의적인 것으로 고려된다. 실제로, 상기 생체적합성 나노입자 또는 나노입자 집합체가 클론원성 분석에 이용될 때, 이는 HCT116 세포주에 대해 1.33의 방사선 증강률(ER)을 나타내며, HT29 세포주에 대해 1.60의 방사선 증강률(ER)을 나타낸다(실시예 5 참조).
반면, 방사선치료 요법 단독(나노입자가 포함되지 않음)에 비해 400μm에서 20%와 동일하거나 이보다 낮은(≤20%) 세포 생존율의 감소는 유의적이지 않은 것으로 고려된다. 실제로, 상기 생체적합성 나노입자 또는 나노입자 집합체가 클론원성 분석에 이용될 때, 조사는 감방사선성(HCT116) 및 내방사선성(HT29) 암 세포 모두에 대해 유의적인 효과를 거의 나타내지 않았다(실시예 4 참조).
서로 다른 시험된 산화물을 제조하기 위한 방법은 하기의 a) 내지 d)에 기재한다. 시판되는 나노입자는 하기의 e)에 기재한다. 밀도 값, 400μm에서의 세포 생존율(방사선치료 요법 단독과의 비교시) 및 800μm에서의 상대효율을 하기 표에 나타낸다(하기의 a) 내지 e) 참조).
도 12는 나노입자 또는 나노입자 집합체를 사용하여 2 Gy 조사 후의 세포 생존율(대조군의 %)을 나타낸다.
상기에서 설명한 바와 같이, 도 13은 %로서 표현한 상대효율(세포 사멸을 유도하는 능력)을 나타낸다. 상기 상대효율은, 방사선치료 요법 단독(나노입자가 포함되지 않음)과 비교할 때 800μm에서 생체적합성 HfO2 나노입자 또는 나노입자 집합체(실시예 3 참조)의 세포 생존율(대조군의 %)에 대해 상대적인, 방사선치료 요법 단독(나노입자가 포함되지 않음)과 비교할 때 800μm에서 실시예 10에서 시험된 입자의 2 Gy 조사 후의 세포 생존율(대조군의 %)을 반영한다.
본 연구에서 수행된 시험관내 효능 분석은 d=7 g/cm3에 대해 역가 효과를 갖는 산화물의 밀도의 중요성을 강조한다(도 13 참조).
두 개의 군의 나노입자는 효율 측면에서 유의적인 차이를 나타내며 구별된다:
- 7 g/cm3 보다 작은 밀도: 시험된 나노입자의 상대효율은 약 55% 미만임.
- 7 g/cm3 이상의 밀도: 시험된 나노입자의 상대효율은 약 80% 보다 더 높음.
a) 코팅제로서 소듐 헥사메타포스페이트를 사용한, 밀도가 6.7 내지 8.3 g/cm 3 인 하프늄 산화물(HfO 2 ) 나노입자 또는 나노입자 집합체의 생체적합성 현탁액.
테트라메틸암모늄 수산화물(TMAOH) 용액을 40 g의 HfCl4 용액에 첨가한다. 최종 현탁액의 pH가 표 2에 기재된 원하는 pH 값에 도달할 때까지, TMAOH 용액의 첨가를 수행한다.
백색 침전물이 획득된다.
상기 침전물을 오토클레이브로 이동시켜 120℃ 내지 300℃의 온도에서 가열하여, 결정화를 수행한다. 냉각 후에, 상기 현탁액을 탈염수로 세척한다.
나노입자 또는 나노입자 집합체의 안정한 현탁액을 얻기 위하여, 해교 단계를 수행한다.
그 후, 소듐 헥사메타포스페이트의 현탁액을 상기 해교된 용액에 첨가하고 (첨가하는 소듐 헥사메타포스페이트의 양은 LD50/5 미만임), 현탁액의 pH가 약 6.5 내지 7.5가 되도록 조절한다.
하기 표 2에서 분명하게 알 수 있듯이, HfO2 나노입자의 밀도는 최초 현탁액의 pH를 주의깊게 조절하면서 제어할 수 있다. 표 2의 각각의 산화물에 노출된 조사된 세포의 생존율에 관련된 데이터를 도 12a, 12b 및 12c에 각각 나타낸다.
산화물 pH 밀도 방사선치료 요법 단독에 비해 400μm의 산화물 농도로 관찰된 세포 생존율(대조군의 %) 800μm의 산화물 농도로 관찰된 상대효율
HfO2 참고
실시예 3		 8.3 >20% 100%
HfO2-L pH 7 7.4 39%(HfO2 참고: 40%) 97%
HfO2-E pH 3 6.8 16%(HfO2 참고: 35%) 53%
HfO2-V pH 2 6.7 9%(HfO2 참고: 43%) 30%
b) 코팅제로서 소듐 헥사메타포스페이트를 사용한, 밀도가 6.5 내지 7.1 g/cm 3 인 세륨 산화물(CeO 2 ) 나노입자 또는 나노입자 집합체의 생체적합성 현탁액.
CeO2 합성은 문헌 [Zhou & Al., Chem Mater, 2003, 15, 378-382]로부터 조정된다.
Ce(SO4)2.4H2O를 탈염수에 용해하여, 0.4 M 용액을 획득한다. 그 후, 암모니아 용액을 교반을 지속하면서 실온에서 적하 첨가하였다. 암모늄 용액 대 세륨 설페이트 용액의 최종 부피비가 1:5에 도달할 때까지 암모늄 용액을 첨가한다. 생성된 현탁액을 이어서 원심분리에 의해 탈염수로 4회 세척한다.
최종 펠릿을 탈염수에 현탁하여, pH 4에서 0.05M(CeO2-1) 또는 0.2M(CeO2-2) 모두의 세륨 산화물 전구물질의 용액을 획득한다. 용액 CeO2-1 및 CeO2-2를 24시간 동안 180℃에서 열수처리한다. 그 후, 샘플을 원심분리에 의해 탈염수로 4회 세척한다. 각각의 샘플을 105℃에서 최종적으로 건조시키고 열처리한다. 샘플 CeO2-1을 1시간 동안 700℃에서 하소(calcine)하고, 샘플 CeO2-2를 1시간 동안 900℃에서 하소하여, 샘플 CeO2-S 및 CeO2-W를 각각 획득한다.
나노입자 또는 나노입자 집합체의 안정한 현탁액을 얻기 위하여, 해교(peptization) 단계를 수행한다.
그 후, 소듐 헥사메타포스페이트의 현탁액을 상기 해교된 용액에 첨가하고 (첨가하는 소듐 헥사메타포스페이트의 양은 LD50/5 미만임), 현탁액의 pH를 6.5 내지 7.5가 되도록 조절한다.
하기 표 3에서 분명하게 알 수 있듯이, CeO2 나노입자의 밀도는 온도와 열처리 기간 모두를 주의깊게 조절하여 제어할 수 있다. 표 3의 각각의 산화물에 노출된 조사된 세포의 생존율에 관련된 데이터를 도 12d 및 12e에 각각 나타낸다.
산화물 온도 및 하소 기간 밀도 방사선치료 요법 단독에 비해 400μm의 산화물 농도로 관찰된 세포 생존율(대조군의 %) 800μm의 산화물 농도로 관찰된 상대효율
HfO2 참고
실시예 3
 8.3 >20% 100%
CeO2-W
 900℃
1시간		 7.1
 30%(HfO2 참고: 48%) 91%
CeO2-S
 700℃
1시간		 6.5
 20%(HfO2 참고: 35%)
 56%
c) 밀도가 2.7 내지 8.3 g/cm 3 인 툴륨 산화물(Tm 2 O 3 ) 나노입자 또는 나노입자 집합체의 생체적합성 현탁액.
5 g의 TmCl3를 HCl 2M에 용해시킨다. 그 후, 테트라메틸암모늄 수산화물(TMAOH) 용액을 pH가 7(Tm2O3-0) 또는 8(Tm2O3-1)이 될 때까지 TmCl3 용액에 첨가한다. 백색 침전물이 획득된다.
상기 침전물을 오토클레이브에서 열수처리, 즉 120℃ 내지 300℃의 온도에서 가열한다. 그 후, 생성된 현탁액을 탈염수로 원심분리에 의해 세척하고, 하룻밤 사이에 105℃에서 건조한다.
분말들이 하소되어진다:
·Tm2O3: 400℃, 1시간
·Tm2O3: 600℃, 1시간
·Tm2O3: 800℃, 5분
·Tm2O3: 800℃, 2시간
하기 표 4에서 분명하게 알 수 있듯이, Tm2O3 나노입자의 밀도는 온도 및 열처리 기간 모두를 주의깊게 조절하면서 제어할 수 있다.
산화물 온도 및 하소 기간 밀도
Tm2O3
800℃
2시간		 8.3
Tm2O3 800℃
5분		 6.8
Tm2O3
600℃
1시간		 6.1
Tm2O3 400℃
1시간		 4.9
Tm2O3-1 처리되지 않음 2.7
d) 코팅제로서 소듐 헥사메타포스페이트를 사용한, 밀도가 7 g/cm 3 보다 낮은 티타늄 산화물(TiO 2 ) 나노입자 또는 나노입자 집합체의 생체적합성 현탁액.
15 mL의 TiCl4를 부드럽게 휘저으면서 180 mL의 HCl 3M 용액에 적하 첨가한다. 120 mL의 탈염수를 또한 첨가하여 최종 부피 215 mL를 얻는다. 상기 용액의 pH는 NaOH 3 M 용액을 사용하여 pH 2까지 점진적으로 조절한다. 24시간 동안 60℃에서 가열된 용액은 백색 침전물로 전환되었다. 나노입자 또는 나노입자 집합체의 안정한 현탁액을 얻기 위하여, 해교 단계를 수행한다.
그 후, 소듐 헥사메타포스페이트의 현탁액을 상기 해교된 용액에 첨가하고 (첨가하는 소듐 헥사메타포스페이트의 양은 LD50/5 미만임), 현탁액의 pH를 6.5 내지 7.5가 되도록 조절한다.
표 5의 TiO2 산화물에 노출된 조사된 세포의 생존율에 관련된 데이터를 도 12f에 나타낸다.
산화물 밀도 방사선치료 요법 단독에 비해 400μm의 산화물 농도로 관찰된 세포 생존율(대조군의 %) 800μm의 산화물 농도로 관찰된 상대효율
HfO2 참고
실시예 3
 8.3 >20% 100%
TiO2_5nm 3.9 11%(HfO2　참고: 49%) 48%
e) 코팅제로서 소듐 헥사메타포스페이트를 사용한, 밀도가 3.8 내지 7.9 g/cm 3 인 시판되는 산화물 나노입자 또는 나노입자 집합체의 생체적합성 현탁액.
모든 나노입자 집합체의 산화물 나노입자는 시판되는 분말(가장 높은 순도)로서 획득된다.
상기 분말을 수용액에 분산하고, 용액에 효율적인 분산을 위해 초음파를 받게 하였다.
나노입자 또는 나노입자 집합체의 안정한 현탁액을 얻기 위하여, 해교 단계를 수행한다.
그 후, 소듐 헥사메타포스페이트의 현탁액을 상기 해교된 용액에 첨가하고 (첨가하는 소듐 헥사메타포스페이트의 양은 LD50/5 미만임), 현탁액의 pH를 6.5 내지 7.5가 되도록 조절한다.
표 6의 각각의 산화물에 노출된 조사된 세포의 생존율에 관련된 데이터를 도 12g, 12h, 12i, 12j, 12k 및 12l에 각각 나타낸다.
산화물 밀도 방사선치료 요법 단독에 비해 400μm의 산화물 농도로 관찰된 세포 생존율(대조군의 %) 800μm의 산화물 농도로 관찰된 상대효율
HfO2 참고
실시예 3
 8.3 >20% 100%
PdO-A 7.9 34%(HfO2　참고: 48%) 79%
TiO2-P25 3.8 12%(HfO2　참고: 49%) <25%
CeO2-D 6.6 12%(HfO2　참고: 24%) 42%
Nd2O3-Z 5.4 <10%(HfO2　참고: 33%) <25%
Eu2O3-B 5.6 <10%(HfO2　참고: 21%) <25%
WO3-C 7.2 40.5%(HfO2　참고: 42%) 95%
실시예 11:
코팅제로서 소듐 헥사메타포스페이트를 사용한, 티타늄 산화물(TiO 2 ), 세륨 산화물(CeO 2 ) 및 하프늄 산화물(HfO 2 ) 나노입자 또는 나노입자 집합체 현탁액의 효과적인 안정성을 위한 생체적합성 표면 코팅의 중요도.
생체내에서 사용하기 위해, 활성화될 수 있는 나노입자 또는 나노입자 집합체는 생체적합성이어야 한다. 생체적합성은, 혈액순환에서 응집을 피하고 효과적인 생체분포(EPR 효과)를 허용하기 위하여, 생리학적 매질(6.5≤pH≤7.5)에서 높은 안정성을 필요로 한다. 따라서, 주사하기 이전의 전제조건은 생리학적 조건에서 나노입자 또는 나노입자 집합체 현탁액의 안정성을 체크하는 것이다.
따라서, 본 발명자는 물 및 글루코스(5%)에서 HMP 코팅의 존재하에 또는 부재하에 입자의 안정성을 평가하였다. 안정성은 서로 다른 매질에서 0.22μm 필터를 사용한 여과 수율에 의해 시각적으로 확인하였다.
결과: 안정성
나노입자 현탁액(실시예 10d의 TiO2-5nm, 실시예 10e의 시판되는 CeO2-D, 및 실시예 3의 HfO2-참고) - pH 3의 해교된 현탁액 또는 pH 7의 현탁액 - 생체적합성 표면 코팅제로서 HMP를 포함하지 않음 - 이 글루코스 용액(5%)에서 제형화된다. 또한, HMP 코팅을 포함하는 pH 7의 나노입자 현탁액이 글루코스 용액(5%)에서 제형화된다. 각각의 현탁액에 대한 나노입자의 농도는 약 5 g/L이다. 각 샘플을 2시간 놓아두고, 현탁액에서 나노입자의 안정성의 일차 식별 분석이 시각적으로 수행된다(도 14).
이러한 일차 평가는, 모든 입자가 pH 6-7에 가까운 등전점(IEP)을 갖기 때문에 입자 표면상에 양전하의 존재에 기인하여, 코팅되지 않은 모든 샘플이 물 및 글루코스 용액(5%)에서 pH 3에서 안정적으로 잔류한다는 것을 보여준다.
현탁액(물 또는 글루코스)의 pH를 7까지 증가시킴으로써, 나노입자의 침전이 관찰되며, 상기 pH는 IEP에 근접한 것이다. HMP를 사용한 입자 코팅은 물 및 글루코스 용액(5%)에서 pH 7에서 안정성을 크게 증가시킨다.
결과: 여과의 수율
0.22μm 컷오프 필터는 잘 해리된 나노입자 또는 나노입자 집합체만 통과시킨다. 응집이 매우 조금 발생할지라도, 입자는 필터에 축적되어 필터를 빠르게 차단할 것이다. 입자 농도는 여과 이전과 이후의 대조표를 통해 측정하였다.
도 15에 나타낸 데이터는 생리학적 조건하에서 나노입자의 표면 성질을 향상시키고 입자 안정성을 향상시키는데 절대적으로 필요한 생체적합성 코팅의 역할을 입증한다.

Claims (15)

  1. 동물의 표적세포가 이온화 방사선에 노출될 때 상기 세포를 변형 또는 파괴하는 약학 조성물을 제조하기 위한, 나노입자 또는 나노입자 집합체의 용도로서,
    상기 나노입자는 산화물(MxOy)로 이루어지며, 상기 산화물의 밀도는 7 g/cm3 이상이며, 상기 나노입자 또는 나노입자 집합체는 pH 6.5 내지 7.5의 생리학적 유체에서 나노입자에 안정성을 부여하는 생체적합성 코팅으로 도포된 것인, 용도.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 산화물이 CeO2, Nd2O3, Sm2O3, Eu2O3, Gd2O3, Tb2O3, Dy2O3, Ho2O3, Er2O3, Tm2O3, Yb2O3, Lu2O3, HfO2, TaO2, Ta2O5, WO2, WO3, ReO2, OsO2, IrO2, PtO, PtO2, HgO, Hg2O, Tl2O3, PbO, Pb2O3, Pb3O4, PbO2, PoO2, Bi2O3, NbO, RuO2, Rh2O3, RhO2, PdO, Ag2O, AgO, CdO 및 In2O3로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 용도.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 산화물이 HfO2인, 용도.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노입자 또는 나노입자 집합체의 크기가 약 10 내지 200 nm인, 용도.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이온화 방사선이 X선, γ-선, 전자빔 및 방사성 동위원소의 방출로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 용도.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이온화 방사선이 약 2 KeV 내지 약 25000 KeV인, 용도.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 이온화 방사선이 약 2 KeV 내지 6000 KeV인, 용도.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 이온화 방사선이 약 2 KeV 내지 1500 KeV인, 용도.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노입자가 유효원자번호(Z eff )가 50 이상인 무기 물질로 이루어진 것인, 용도.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노입자가 본질적으로 구형의 형태인, 용도.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적세포가 양성 세포, 전-악성 세포 및 악성 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 용도.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 악성 세포가 혈액학적 종양 및 고형 종양으로 이루어진 군에서 선택된 종양의 세포인, 용도.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학 조성물이 나노입자 또는 나노입자 집합체와 구분되는 암을 치료하기 위한 추가의 치료적 화합물을 더 포함하는 것인, 용도.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 동물이 인간인, 용도.
  15. 포유류의 표적세포가 이온화 방사선에 노출될 때 상기 세포를 변형 또는 파괴하기 위한 약학 조성물로서,
    상기 약학 조성물은 나노입자 또는 나노입자 집합체 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하며, 상기 나노입자는 산화물(MxOy)로 이루어지며, 상기 산화물의 밀도는 7 g/cm3 이상이며, 상기 나노입자 또는 나노입자 집합체는 pH 6.5 내지 7.5의 생리학적 유체에서 나노입자에 안정성을 부여하는 생체적합성 코팅으로 도포된 것인, 약학 조성물.
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