ES2581381T3 - Composiciones y métodos de inhibición de la gripe - Google Patents
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Abstract
Un péptido aislado que, en cuanto a su secuencia de aminoácidos, consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 para su uso en un método de tratamiento de una infección por virus de la gripe.
Description
Sustituciones preferidas
Posición Sustituciones preferidas Sustituciones más preferidas
alternativas
- 9
- L9I, L9V, L9A, L9M, L9C L9I, L9V, L9A, L9M
- 10
- E10D, E10N, E10Q, E10I, E10L, E10V, E10A, E10M, E10C E10D, E10N, E10Q, E10I, E10L, E10V, E10A
- 11-12
- K11R, K11H, K11D, K11E, K11N, K11Q K11R, K11D, K11E, K11N, K11Q
- 13
- Y12W, Y12K, Y12R, Y12H Y12W, Y12K, Y12R
- 13
- V13I, V13L, V13A, V13G, V13T, V13S, V13M, V13C V13I, V13L, V13A, V13G, V13T, V13S, V13M
- 14
- E14D, E14K, E14R, E14H E14D, E14K, E14R E14D, E14R
- 15
- D15E, D15R, D15N, D15Q D15E D15E, D15R
- 16
- T16G, T16S, T16A, T16Q, T16N T16G, T16S, T16Q, T16N, I16A
- 17
- K17F, K17R, K17M, K17C, K17I, K17V, K17L, K17A K17F, K17M, K17I, K17V, K17L, K17A, K17R
- 18
- I18L, I18V, I18A, I18T, I18S, I18G, I18Q, I18N I18L, I18V, I18A, I18T, I18S, I18Q, I18N I18A
- 19
- D19E, D19N, D19Q D19E D19E
- 20
- L20I, L20V, L20A, L20M; L20C L20I, L20V, L20A L20A
- 21
- W21Y, W21A W21Y W21Y, W21A
- 22
- S22T, S22G, S22A, S22M, S22C S22T, S22G, S22A, S22M S22M
- 23
- Y23W, Y23S, Y23T, Y23A, Y23 W, Y23S Y23W, Y23A
- 24
- N24Q, N24D, N24E, N24Q N24Q
- 25
- A25I, A25V, A25L, A25I, A25V, A25L, A25M A25I, A25V, A25L, A25I
- 26
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- 27
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- 28
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- 29
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- 30
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- 31
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- 32
- E32P, E32Q, E32N E32D
- 33
- N33Q, N33E, N33D N33Q
- 34
- Q34G, Q34N, Q34E, Q34D, Q34T, Q34S Q34G, Q34N, Q34E, Q34D
- 35
- H35K, H35R, H35N, H35Q H35K, H35R
- 36
- T36S, T36G, T36S
- 37
- I37L, I37V, I37A, I27M, I37C 137L, 137V, 137A
- 38
- D38E, D38N, D38Q
- 39
- L39F, L39I, L39V, L39M, L39C, L39A, L39E, L39D, L39N, L39Q L39F, L39I, L39V, L39M, L39A, L39E, L39D
- 40
- T40H, T40R, T40K, T40S, T40G, T40A, T40M, T40H, T40S, T40G, T40A, T40M
- 41
- D41E, D41N, D41Q D41E
- 42
- S42G, S42T, S42I, S42L, S42V, S42A, S42M, S42C S42G, S42T, S42I, S42L, S42V, S42A
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muestran en la Figura 2 (SEQ ID NO: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, y 29, respectivamente). Las secuencias de los subtipos H8, H11, y H12 no se han presentado. Las regiones de inicio de fusión de la hemaglutinina 2 H3 se han identificado ahora como los restos 77 a 119 de la secuencia de aminoácidos de H3 (SEQ ID NO: 19) como se muestra en la Figura 2.
Un péptido aislado, al que se hace referencia en el presente documento como inhibidor 3 gripal (F3), que representa la secuencia de aminoácidos VEDTKIDLWSYNAELL, SEQ ID NO: 3 (restos 84-99 de SEQ ID NO: 19; H3 HA2), se ha descubierto ahora que tiene fuertes propiedades antivirales. Un péptido aislado que comprende los mismos dieciséis aminoácidos, en la secuencia aleatoriamente desordenada SWLVNKIYLTDDEVEL (SEQ ID NO: 14), no muestra propiedades antivirales discernibles. Las propiedades antivirales de F3 incluyen inhibición de unión viral, como se demuestra mediante ensayos de hemaglutinación. F3 también inhibe la unión, fusión e infección viral, como se demuestra mediante ensayos en placa.
Actividad anti virus de la gripe
El F3 tiene una fuerte actividad de inhibición de la infección frente a una amplia serie de H1, H3, H5, y virus de la gripe B, que presentan diversidad significativa tanto en la secuencia general como en la estructura de sus proteínas HA2 respectivas. El amplio espectro de actividad de F3 puede estar relacionado, al menos en parte, con el hecho de que la FIR, y particularmente la parte de la RIF representada por los restos 84-99 de todos los subtipos de gripe A y de gripe B conocidos, es una de las regiones más altamente conservadas en la proteína HA2. Aunque sin desear quedar ligado a la teoría, se cree que la similitud de secuencia entre F3 y la región correspondiente (restos 84-99) de subtipos HA2 de tipo silvestre, permite al péptido unirse eficazmente o, de otro modo, interaccionar con la parte correspondiente de la RIF entre subtipos de HA. Esta interacción interfiere con el funcionamiento normal de la proteína HA durante el proceso de fusión (por ejemplo, interfiriendo con la agregación de proteínas o cambios de conformación necesarios para que continúe el proceso de fusión).
El inhibidor 3 gripal, F3, se ha sintetizado en cantidades en gramos de resina de PEG-PS-PAL usando química de FMOC convencional. El producto peptídico a granel se ha purificado usando HPLC hasta > 95 % siendo el material residual principalmente péptidos relacionados más cortos. El péptido purificado se liofilizó para retirar el disolvente. El polvo liofilizado puede procesarse adicionalmente, por ejemplo, disolviéndolo en hexafluoroisopropanol y evaporando el disolvente con la ayuda de una corriente de nitrógeno ultrapuro (Praxair UHP, 99,999 %). El polvo resultante puede después reconstituirse en un momento posterior disolviendo el polvo en un tampón acuoso, tal como fosfato potásico 10 mM o solución salina tamponada con fosfato (PBS). La concentración de F3 en solución puede determinarse usando la fórmula: mg/ml = (A280 x mw) /e, en la que e representa la suma del coeficiente de extinción molecular de los dos aminoácidos cromogénicos en la secuencia de aminoácidos peptídica a 280 nm, es decir, la suma de 5560 (Trp) + 1200 (Tyr), para proporcionar e = 6760.
El F3 tiene fuerte actividad inhibidora del virus de la gripe A y una base amplia y muestra inhibición picomolar en ensayos de reducción en placa. Usando un ensayo de inmunoplaca con celulosa microcristalina AVICEL® como la capa superpuesta (Matrosovich et al., 2006), las placas se detectan fijando las monocapas y tiñendo con un anticuerpo específico para la nucleoproteína del virus de la gripe. En el ensayo de inhibición de péptido, el péptido se preincuba con aproximadamente 100 unidades formadoras de placas (ufp) del virus durante aproximadamente 1 hora, después se usa para infectar las monocapas. Se usaron dos condiciones para la incubación: (1) condición convencional en la que el péptido se incluye en la capa superpuesta a la misma concentración que se usó en la etapa de preincubación o (2) una condición en la que el péptido no se incluye en la capa superpuesta.
La inhibición de múltiples subtipos de virus de gripe A de F3 se evaluó utilizando ensayos en placas celulares de riñón canino de Madin-Darby ("MDCK", acrónimo de Madin-Darby Canine Kidney) realizados usando los subtipos A/WSN/33 (H1N1) y A/Udom/72 (H3N2) de virus de gripe A. Para evaluar los efectos de estos péptidos sobre la infectividad viral se usaron diluciones de 50 µM a 2,5 µM de F3 y el péptido de control aleatoriamente desordenado (SEQ ID NO: 14). Se ensayaron seis diluciones de F3 y del péptido de control frente al subtipo viral H1N1; y se ensayaron otras seis diluciones de cada péptido frente al subtipo viral H3N2.
En la condición (1), F3 inhibió la formación de placas de tamaño normal por varias tinciones diferentes de virus de la gripe A H1N1 y H3N2 con una CI50 en el intervalo de aproximadamente 100 -500 picomolar (pM). En la condición (2) la CI50 para inhibición de placas de tamaño normal estuvo en el intervalo de aproximadamente 10 a 100 nanomolar (nM) para F3. A concentraciones nM bajas (<10 nM) para la condición (1), o µM bajas (<10 µM) para la condición (2), resultó evidente la presencia de "miniplacas".
El péptido de control desordenado no inhibió la formación de placas de virus de gripe A en ninguna condición, lo que indica que la secuencia de aminoácidos de péptido es importante y que los efectos no específicos no pueden explicar la inhibición.
El F3 también es activo contra un virus de la gripe H5N1 recombinante y contra dos cepas de gripe B (B/Shanghai/361/2002 y B/Shanghai/10/2003), in vitro, en ensayos de inmunoplaca con una CI50 en el intervalo nM
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bajo (<5 nM). Dada la diversidad de estas cepas de gripe A y B diferentes, probablemente F3 sea eficaz contra la mayoría de los virus de la gripe.
Usando los métodos enseñados en el documento WO2005/044992 la RIF de los virus de la gripe A de subtipo H1 se ha identificado ahora como los restos 77 a 110 de la secuencia de HA2 de subtipo H1 (SEQ ID NO: 17). Un péptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, denominado en el presente documento inhibidor 1 gripal (F1) también tiene fuerte actividad antiviral (picomolar) contra subtipos de virus de la gripe A tanto del subtipo H1 como del H3, en ensayos en placa. La secuencia de aminoácidos de F1 coincide con los restos 84-102 de la secuencia de RIF del subtipo H1, SEQ ID NO: 17.
Para entender mejor el mecanismo de acción de los péptidos de la invención, por ejemplo, para determinar qué etapa en el ciclo de replicación viral se inhibe por F3, F1, y péptidos inhibidores de virus de la gripe relacionados, se han realizado estudios con diversas cepas de la gripe. A números óptimos de glóbulos rojos y a concentraciones de gripe A/PR/8/34 (H1N1), tanto F3 como F1 inhibieron la hemaglutinación inducida por virus de la gripe a concentraciones de aproximadamente 10 µM. A diluciones de células y virus optimas (1:8 para ambos), F3 inhibió la hemaglutinación a concentraciones entre 12,5 y 6,25 µM. Se obtuvieron resultados similares con otras cepas H3 y H1, es decir, cepas H1N1 A/New Caledonia/20/99 y A/WSN/33; y cepas H3N2 A/California/07/2004, A/New York/55/04, y A/Udom/72. Por el contrario, un péptido de control que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, una versión desordenada de F3, no inhibió la hemaglutinación a ninguna concentración.
Concentraciones más altas de virus pueden superar la inhibición de hemaglutinación, lo que sugiere un mecanismo estocástico. El resultado con este ensayo tradicional de unión de virus con célula sugiere que los péptidos de la invención interaccionan directamente con viriones para inhibir la unión con células. Por el contrario, el fármaco anti HFV FUZEON® interacciona con un producto intermedio de fusión de vida corta y no con una estructura de virión (Debnath, 2006; Platt, Durnin, y Kabat, 2005). La interacción directa con estructuras de virión nativas puede explicar, al menos en parte, la muy alta fuerza de F3 y F1 (aproximadamente 200 pM para placas de tamaño normal) en relación con el fármaco anti VIH FUZEON® (de 4 a 280 nM dependiendo de la cepa de VIH-1) en ensayos de infectividad de virus. Las miniplacas analizadas anteriormente pueden haber resultado del replegamiento de HA en el virión.
Se ha sugerido previamente que el replegamiento de HA se produce después de la exposición a un inhibidor de molécula pequeña del virus de la gripe A, que se sabe que interacciona con HA (Cianci, et al., 1999; Luo, Colonno, y Krystal, 1996; Luo et al., 1997). Este inhibidor de entrada y otros (Hoffman et al., 1997) fueron avances bastante significativos al finales de 1990, ya que identificaron HA como una diana terapéutica importante. Sin embargo, hasta ahora, dichos inhibidores de molécula pequeña no se han desarrollado como fármacos gripales, más probablemente debido a su eficacia relativamente baja, con una CI50 en el intervalo de concentración µM de bajo a medio. Un consenso en evolución en el campo creciente de inhibidores de la entrada viral es que los fármacos de molécula pequeña pueden no ser capaces de interferir eficazmente con las transiciones estructurales proteicas extensivas y múltiples interacciones intramoleculares que HA, y otras proteínas de fusión virales, experimentan durante el proceso de entrada viral.
Un modelo de trabajo para el proceso de fusión de célula -virión de virus de la gripe puede extrapolarse de trabajos intensos sobre virus de la gripe y otros virus de ARN durante muchas décadas. En la Figura 5 se muestra una representación esquemática de dicho modelo. Aunque aún es hipotético en algunos aspectos, este modelo puede destacar la importancia de los motivos estructurales/funcionales de las glucoproteínas de virus de la gripe A que pueden actuar como dianas de desarrollo de fármacos. En la Figura 5, el Panel A muestra la unión de la proteína hemaglutinina 1 de la gripe (HA1) con el receptor celular, que consiste en sialolípidos o en sialoproteínas. El panel B muestra la entrada del virión de la gripe en la vesícula endocítica. Una proteína de virus de la gripe, conocida como viroporina M2, reduce el pH para desencadenar el reordenamiento de los dominios helicoidales de la proteína HA2. La secuencia de la proteína HA2 correspondiente a la secuencia de aminoácidos de F3 (SEQ ID NO: 3) se localiza al lado de una secuencia “resorte” metastatizable. El reordenamiento permite que la parte del péptido de fusión de la proteína HA2 interaccione con la membrana de la vesícula. Los Paneles C y D ilustran HA2 “que salta hacia atrás” por un mecanismo de “correa en surco”, poniendo a las membranas viral y celular en estrecha proximidad. Para mayor claridad, no se muestran HA1 y los sialorreceptores en los Paneles C-E. El panel C’ muestra un mecanismo alternativo en el que las secuencias de HA2, que forman una pista con la capacidad de formar interfaz con membranas de bicapas, pueden facilitar la mezcla de membranas celulares y virales. El Panel E·muestra la formación del “poro de fusión” y la entrada de segmentos ribonucleoprotéicos del virus en la célula.
Estudios con animales vivos
El hurón se considera en general el mejor modelo para infección por virus de la gripe de seres humanos (Govorkova et al., 2005; Hampson, 2006; Maher y DeStefano, 2004; van Riel et al., 2007). De hecho, las directrices de la Unión Europea para eficacia de vacuna de la gripe requieren específicamente ensayar en el modelo de hurón. Pueden infectarse ratones y otros mamíferos pequeños con cepas humanas de virus de la gripe A, pero esto requiere típicamente, en el caso de cepas estacionales, la adaptación del virus para el nuevo hospedador. Por el contrario, los hurones pueden infectarse con la mayoría de las cepas de los virus de la gripe A humanas sin adaptación. La
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distribución y patogénesis tisular de los virus de gripe A adaptados en ratones es distinta de la que se produce en la enfermedad humana (Lu et al., 1999). La patogénesis de la infección por virus de gripe A en hurones es muy similar a la observada en seres humanos. Cuando los hurones se inoculan experimentalmente por vía intranasal, se produce replicación local del virus en el tracto respiratorio superior. La distribución de los receptores de ácido siálico en el tracto respiratorio de los hurones es similar a la de los seres humanos (van Riel et al., 2006; Yen et a/, 2007).
De una manera sorprendentemente similar a los seres humanos con la gripe, los hurones desarrollan actividad reducida, fiebre, inapetencia, secreción nasal, estornudos, disnea, diarrea, secreción conjuntival y señales neurológicas. El hallazgo patológico predominante tanto en hurones como en seres humanos es la descamación del epitelio respiratorio ciliado y la infiltración de la submucosa de la cavidad nasal con células inflamatorias de infiltración. En un periodo de 48 horas después de la infección de un hurón por el virus de la gripe, se produce la destrucción casi completa del epitelio respiratorio nasal, dejando solamente la membrana basal.
La distinción principal entre la gripe en hurones y seres humanos es el periodo de tiempo en el que se presentan los síntomas de la enfermedad. Los hurones comienzan a desarrollar los síntomas de gripe antes de un día después de la infección, pero a los 4 días después de la infección se han resuelto la mayoría de los hallazgos bien conocidos (actividad reducida, fiebre, inapetencia, secreción nasal, estornudos, etc.). Debería observarse que muchas cepas del virus de la gripe A humana son capaces de infectar el tracto respiratorio inferior de hurones a diversos grados. Como en seres humanos, las cepas altamente patógenas del virus de la gripe A, son capaces de propagarse en hurones desde el tracto respiratorio superior al cerebro o desde el tracto respiratorio inferior a la circulación y a otros órganos. Las cepas de H5N1 actuales de virus de la gripe A aviar pueden establecer infecciones letales en hurones (Govorkova et al., 2005; Thiry et al., 2007; Vahlenkamp y Harder, 2006).
Los estudios in vitro iniciales se centraron en cepas de laboratorio bien caracterizadas de virus de la gripe A correspondientes a subtipos actualmente en circulación en seres humanos incluyendo, A/WSN/33 (H1N1), A/PR/8/34 (H1N1) y A/Udom/72 (H3N2). Los péptidos F3 y F1 mostraron eficacia similar en ensayos de reducción de placas frente a diversas otras cepas de virus de gripe A, incluyendo aislados clínicos de las cepas H1N1 (A/New Caledonia/20/99) y H3N2 (A/NY/55/04; A/Cal/07/04), que no se han evaluado exhaustivamente en el laboratorio. Estudios con aislados clínicos recientes, tales como estos, son importantes para establecer la eficacia de los agentes terapéuticos con virus que provocan actualmente gripe en seres humanos. Cabe destacar que, estas cepas también causan gripe en hurones que crecen hasta altos títulos en los cornetes nasales y en los pulmones de esta especie después de inoculación intranasal.
Para todos los estudios, se propagaron aislados de virus en huevos de pollo embrionados (obtenidos en Charles River Laboratories o Louisiana State University Poultry Sciences Department) usando procedimientos convencionales. Se recogieron fluidos alantoides de huevos de 11 días de vida un día después de la inoculación, y se examinaron grupos de virus con respecto a la actividad de hemaglutinación frente a glóbulos rojos de pavo (tRBC, turkey red blood cells) (Lampire Laboratories, USA) usando procedimientos convencionales. Se valoraron grupos de hemaglutinación positivos (> 256 unidades de HA) por ensayo en placa viral, como se ha descrito anteriormente, y se conservaron en nitrógeno líquido hasta que se usaron para estudios de exposición. Los péptidos se prepararon en tampón de fosfato y las soluciones tamponadas se aplicaron directamente a las fosas nasales de hurones anestesiados usando una pipeta (vía de administración intranasal).
Estudio de exposición 1
Los hurones se trataron previamente con F3 o con una versión de control desordenada del péptido (SEQ ID NO: 14), durante dos días antes de la exposición al virus (Día -2 y día -1) a una dosis de aproximadamente 0,3 mg/kg por vía intranasal, una vez al día o dos veces al día. Doce horas después del último tratamiento, los animales se infectaron por inoculación intranasal con aproximadamente 105 ufp de la cepa de gripe H3N2 A/Cal/07/04, que es al menos 100 veces la dosis mínima infecciosa como se determina en estudios de hallazgos de dosis infecciosa. Los péptidos se volvieron a administrar a los hurones a la dosis de 0,3 mg/kg aproximadamente 12 horas después el Día 0, así como el Día 1 y Día 2 después de la exposición viral. El Día 2, todos los hurones tratados con el péptido de control desordenado habían desarrollado dificultad respiratoria significativa (respiración superficial rápida (respiración superficial rápida), fiebre alta y estornudos. Por el contrario, ninguno de los animales tratados con F3 tuvo dificultad respiratoria grave, aunque un subconjunto (2/5 en el grupo de predosificación dos veces al día, 1/6 en el grupo de predosificación una vez al día) mostró algunas señales respiratorias muy leves con fiebre ligera. El Día 3, ninguno de los hurones tratados con F3 mostró señales clínicas de gripe, mientras que el 50 % de los hurones tratados con el péptido de control desordenado aún presentaban letargo, y el 100 % de los hurones tratados con péptido de control desordenado presentaron secreción nasal significativa. Claramente F3 proporcionaba un beneficio de tratamiento significativo y sorprendentemente eficaz en este experimento de exposición inicial.
Estudio de exposición 2
En un segundo estudio de exposición, se incluyeron 12 hurones en el grupo de tratamiento F3 y se incluyeron 12 hurones en el grupo de péptido de control. Los animales se infectaron con aproximadamente 105 ufp de gripe A/Cal/07/04; sin embargo, en este estudio los hurones se trataron con 0,3 mg/kg de F3 o péptido de control cuatro
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horas después de la exposición viral el Día 0, sin tratamientos de exposición previral. El Día 2, los 12 hurones que se trataron con el péptido de control desordenado habían desarrollado dificultad respiratoria significativa, fiebre alta y estornudos. Por el contrario, ninguno de los animales tratados con F3 tuvo ninguna señal de dificultad respiratoria u otras señales de gripe en este momento. La Figura 6 muestra las respuestas patológicas observadas en los hurones durante el estudio, obtenidas supervisando la dificultad respiratoria (Panel A), la secreción nasal (Panel B) y la actividad (Panel C) para ambos grupos de tratamiento durante el periodo de estudio en vivo.
Como se indica en la Figura 6, los animales tratados con F3 mostraron respuestas patológicas significativamente reducidas en relación con el grupo de control. Solamente dos animales del grupo tratado con F3 desarrollaron señales leves de gripe y esto se produjo el Día 4 del experimento, dos días después de haberse detenido el tratamiento con el péptido. Además de parámetros clínicos, se recogieron aspirados nasales y tejidos pulmonares y extrapulmonares a intervalos diarios a lo largo del periodo de estudio para análisis del título de virus, patología macroscópica e histopatología. Los animales que se trataron con F3 mostraron presentaciones de pulmones normales. Por el contrario, los hurones tratados con el péptido de control mostraron pruebas de inflamación. Los tejidos de hurones tratados con F3 mostraron patología notablemente reducida en comparación con animales tratados con péptido de control, mostrando los hurones tratados con péptido de control infiltraciones, inflamación bronquial, con exudados bronquiales característicos de una infección de gripe.
El análisis de RT-PCR cuantitativa y cebadores conservados para el gen de la nucleoproteína del virus de la gripe, proporciona análisis fiables de niveles de ARN genómicos virales en homogeneizados tisulares de hurones tratados e infectados. Se recogieron muestras de aspirados nasales de los animales durante el periodo de estudio. Los títulos de virus de esas muestras se muestran en la Figura 7, Panel A. Los resultados de los análisis de homogeneizados de tejidos de hurón extraídos del cerebro, tráquea, hígado, bazo y sangre el Día 1 del estudio se muestran en el Panel B de la Figura 7. Los datos del Panel A demuestran que los títulos máximos de virus de la gripe en lavados nasales de hurones se redujeron en más de 2,0 log10 y en los pulmones en más de 6,0 log10. Estos resultados indican que F3 redujo significativamente la replicación de virus de la gripe en el tracto respiratorio superior de hurones. Los datos del Panel B indican que F3 bloqueó eficazmente la propagación del virus al tracto respiratorio inferior y también a otros órganos.
Identificación de la región de inicio de fusión, RIF, de la gripe
El extremo carboxilo de la RIF de un virus de la gripe puede definirse como el resto inmediatamente precedente a la primera secuencia peptídica que muestra una hidrofobicidad interfacial positivamente creciente en una representación de hidropatía interfacial de Wimley-White que se encuentra más allá del extremo carboxilo de la hélice N (resto 104). La Tabla 3 posterior muestra la escala de hidrofobicidad interfacial de Wimley-White para proteínas en interfaces de membrana como describen Wimley y White en 1996. Esta escala de hidrofobicidad o hidropatía se basa en el cambio de energía libre requerido para transferir un resto peptídico de una interfaz de bicapa de membrana hidrófoba a una fase acuosa. En esta escala, una energía libre positiva (ΔG), en kilocalorías por mol, indica un resto más hidrófobo (es decir, debe añadirse energía para transferir un resto hidrófobo desde una membrana hidrófoba en agua. De forma similar, una energía libre negativa indica un resto más hidrófilo.
En una representación de hidrofobicidad interfacial de Wimley-White, la RIF se caracteriza como una región pico de hidropatía (es decir, una región de hidrofobicidad relativamente más grande que incluye un máximo local en hidrofobicidad situado entre dos mínimos locales en hidrofobicidad. Esta región pico comienza en la hélice N de la proteína HA2 y termina a una distancia de aproximadamente 15 restos más allá de la hélice N.
Tabla 3: Escala de hidrofobicidad interfacial de Wimley-White Resto X pH ΔG (kcal mol-1)
- Ala
- 8 -0,17 ± 0.06
- Arg
- 2 -0,81 ± 0,11
- Asn
- 8 -0,42 ± 0,06
- Asp
- 8 -1,23 ± 0,07
- Asp
- 2 0,07 ± 0,11
- Cys
- 8 0,24 ± 0,06
- Gln
- 8 -0,58 ± 0,08
- Glu
- 8 -2,02 ± 0,11
- Glu
- 2 0,01 ± 0,15
- Gly
- 8 -0,01 ± 0,05
- His
- 8 -0,17 ± 0,06
- His
- 2 -0,96 ± 0,12
- Ile
- 8 0,31 ± 0,06
- Leu
- 8 0,56 ± 0,04
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Resto X pH ΔG (kcal mol-1)
- Lys
- 2 -0,99 ± 0,11
- Met
- 8 0,23 ± 0,06
- Phe
- 8 1,13 ± 0,05
- Pro
- 8 -0,45 ± 0,12
- Ser
- 8 -0,13 ± 0,08
- Thr
- 8 -0,14 ± 0,06
- Trp
- 8 1,85 ± 0,06
- Tyr
- 8 0,94 ± 0,06
- Val
- 8 -0,07 ± 0,05
- Para calcular un perfil de hidropatía interfacial para una proteína o un polipéptido pueden informáticos, tales como el explorador de proteínas de membrana (MPEx) disponible
- usarse en el programas sitio web:
blanco.biomol.uci.edu/mpex. El programa MPEx incorpora escalas de hidropatía de Wimley-White y constituye un método preferido para determinar el grado de hidrofobicidad interfacial de estas secuencias peptídicas. El programa informático MPEx se usó para ayudar a la caracterización del extremo carboxilo de la RIF en cada una de las trece variantes de HA2 secuenciadas mostradas en la Figura 2. El programa informático MPEx representa la puntuación de hidropatía interfacial de Wimley-White para la proteína o el péptido de interés promediando los valores de hidropatía de restos completos para todos los restos en una ventana que consiste en un número fijo de restos de aminoácidos consecutivos (preferentemente aproximadamente 19 restos) y representando el valor promedio de la hidropatía en esa ventana como la puntuación de hidropatía para el resto medio en la ventana. La ventana se desplaza después en un resto moviendo desde la dirección amino terminal a la carboxilo terminal, y el proceso se repite hasta que se ha determinado la puntuación de hidropatía para cada resto en la región de interés.
Se prepararon perfiles de hidropatía interfacial de Wimley-White para los 13 subtipos HA2 mostrados en la Figura 2 usando el programa MPEx, usando una ventana de 19 restos de aminoácidos. El extremo amino de la RIF se encuentra en el punto dentro de la hélice N de la proteína en el que la hidropatía interfacial comienza a aumentar de forma continua después de un mínimo local (es decir, en el resto 77 para todas las proteínas HA2 examinadas hasta la fecha). El extremo carboxilo de la RIF es el resto inmediatamente precedente al primer mínimo local en hidrofobicidad más allá de la hélice N, es decir, el resto inmediatamente antes de la primera secuencia peptídica con hidrofobicidad interfacial positivamente creciente que se encuentra más allá del extremo carboxilo de la hélice N. En cada subtipo de HA2 de gripe A mostrado en la Figura 2, la hélice N termina en el resto 104. No es necesario que la representación de las puntuaciones de hidropatía interfacial de Wimley-White cruce por encima del eje cero para ser útil en la determinación de la localización del extremo carboxilo de una FIR, únicamente tiene que haber un aumento en la puntuación de hidropatía en relación con los restos peptídicos precedentes.
Las Figuras 8-20 muestran los perfiles de hidropatía de Wimley-White de MPEx de las trece variantes secuenciadas de la proteína de fusión HA2 de gripe A (en estas Figuras, “A” indica la RIF del péptido, caracterizada por un pico en la representación de hidropatía). El extremo carboxilo de la RIF se indica en cada una de las Figuras 8-20 con una "B". A partir de los análisis, se ha determinado que el extremo amino de la RIF comienza en el resto 77 de la secuencia de HA2, en cada subtipo de HA2 viral. El extremo carboxilo de la RIF varía entre el resto 110 y el 119 para cada uno de los subtipos de HA2. En la Figura 2 la región RIF se destaca dentro de un borde oscurecido alrededor de los restos 77 a 110 o 119.
Los péptidos de la divulgación que tienen actividad mejorada puede identificarse preparando conjuntos de péptidos anidados, que son más largos (correspondientes a secuencias flanqueantes de HA) o están truncados en comparación con una parte de proteína inhibidora diana activa de una RIF (por ejemplo, SEQ ID NO: 2). Los péptidos que extienden la secuencia de aminoácidos de HA diana en 3-6 aminoácidos en los extremos amino o carboxilo de los péptidos se ensayan sistemáticamente frente a una batería de virus de la gripe para determinar si los segmentos de aminoácidos en uno de los lados de la secuencia contribuyen a una inhibición de infectividad aumentada. Si un péptido que es más largo que la secuencia diana, inhibe la infectividad del virus de gripe A con una CI50 menor que la de la diana, entonces los péptidos que tienen menos aminoácidos adicionales que la diana pueden ensayarse sistemáticamente para determinar el péptido mínimo con actividad inhibidora de infectividad. Los péptidos activos específicos para un tipo o subtipo particular también pueden ensayarse frente a varias cepas adicionales del mismo tipo o subtipo de virus de la gripe para determinar la amplitud de la actividad inhibidora. Por ejemplo, un péptido diana basado en SEQ ID NO: 5 debería inhibir múltiples virus de subtipos H5 con una CI50 < 100 nM.
Otras variantes peptídicas adecuadas para ensayo pueden determinarse alterando sistemáticamente restos en la secuencia diana a restos de alanina (denominado en el presente documento “exploración de alanina”). La comparación de los péptidos modificados con alanina con péptidos de tipo silvestre identifica restos importantes para la inhibición de la fusión/infectividad. Si más de un aminoácido afecta a la inhibición, pueden sintetizarse péptidos adicionales con alteraciones en cada resto importante.
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