KR20160113331A - 인플루엔자를 억제하는 조성물 및 방법 - Google Patents

인플루엔자를 억제하는 조성물 및 방법 Download PDF

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로버트 에프. 게리
러셀 비. 윌슨
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오토이뮨 테크놀로지스, 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 인플루엔자 감염의 치료 또는 예방, 또는 인플루엔자 감염의 사람간 전염을 예방하는데 유용한 펩타이드, 펩타이드 유사체, 펩타이드 유도체 및 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 펩타이드는 야생형 인플루엔자 헤마글루티닌 2 단백질의 융합 개시 영역(FIR) 중 인플루엔자 바이러스-세포 융합 억제 부위 또는 이의 변형체를 포함한다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 펩타이드는 야생형 인플루엔자 헤마글루티닌 2 단백질의 일부의 8 내지 40개의 연속 아미노산 잔기 또는 이의 변형체로 이루어지고, 상기 단백질의 일부는 상기 단백질의 FIR 및 FIR의 아미노-말단 및 카르복시-말단 측에 있는 5개 이하의 아미노산 잔기를 포함한다.

Description

인플루엔자를 억제하는 조성물 및 방법{Influenza inhibiting compositions and methods}
[관련 출원에 대한 상호 참조]
본 출원은 2007년 6월 25일에 출원된 미국 임시출원 일련번호 60/937,120에 대해 우선권을 주장하며, 2003년 11월 4일에 출원된 미국 임시출원 일련번호 60/517,181에 대해 우선권을 주장하는 2004년 11월 3일에 출원된 미국 출원 일련번호 10/578,013의 일부계속출원이고, 각 출원은 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
[기술 분야]
본 발명은 인플루엔자 바이러스에 의한 세포의 바이러스 감염을 예방하거나 억제하는데 효과적인 펩타이드를 포함하는 조성물, 및 이것으로 인플루엔자 감염을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.
모든 바이러스는 복제하기 위해 바이러스 표적 세포에 결합하고 그 세포내로 침입해야 한다. 클래스 I 막 융합 단백질을 보유하는 RNA 바이러스를 비롯한, 외피 바이러스의 경우에는 (a) 표적 세포에 대한 비리온의 결합, (b) 원형질막 또는 내부 세포막과 바이러스 외피의 융합, (c) 융합 영역에서 바이러스 외피와 세포막의 불활성화에 따른 융합 포어(fusion pore)의 생성, (d) 이 포어를 통한 바이러스 RNA의 전이 및 (e) 바이러스 RNA에 의한 세포 기능의 변경을 수반한다.
상기 단계 (b)와 (c)는 바이러스 막과 세포 외피의 융합을 수반하는 것으로, 표적 세포의 표면 단백질 및 막과 바이러스 막관통 당단백질(융합 단백질)의 상호작용에 의해 매개된다. 이러한 상호작용은 융합 단백질의 입체적 변화를 유발하여 표적 세포막 내로 바이러스 융합 펩타이드를 삽입시킨다. 이러한 삽입이 있은 후에는 융합 단백질 내에 추가 입체형태 변화가 일어나 바이러스 외피와 세포막을 근접시키고, 결과적으로 두 이중층막을 융합시킨다.
바이러스는 이러한 융합 과정이 붕괴되면 숙주 내로 확산 및 전파될 수 없다. 이러한 융합 과정의 고의 붕괴는 유도성 펩타이드 및 융합 단백질 서열에 상동성인 펩타이드 모방체, 융합 단백질을 인식하는 항체, 및 융합 단백질에 대항하여 작용하는 기타 인자들에 의해 달성될 수 있다.
오르토믹소바이러스(orthomyxovirus)인 인플루엔자 바이러스의 외피 단백질인 헤마글루티닌 2(HA2)는 전형적인 RNA 바이러스 클래스 I 융합 단백질이다. HA2는 융합 펩타이드라고 불리는 아미노 말단의 소수성 도메인을 포함하고, 이 도메인은 헤마글루티닌 전구체 단백질의 절단 동안 노출된다. 레트로바이러스 막관통 단백질은 융합 펩타이드 외에 HA2의 공지된 구조와 일치하는 여러 구조적 특징, 예컨대 연장된 아미노-말단 나선(N-나선, 보통 "헵타드(heptad) 반복체" 또는 "류신 지퍼"), 카르복시 말단 나선(C-나선) 및 막관통 도메인에 근접한 방향족 모티프를 포함한다. 이러한 5가지 도메인 중 적어도 4개의 존재는 바이러스 외피 단백질을 클래스 I 융합 단백질로 정의한다.
도 1은 6가지 클래스 I 바이러스 패밀리의 융합 단백질이 보유한 전술한 5가지 도메인을 도시한 것이다. 이 융합 단백질은 소수성 융합 펩타이드로 시작해서, 앵커 펩타이드로 끝나고 연장된 아미노 말단 알파-나선(N-나선, 보통 "헵타드 반복체" 또는 "류신 지퍼"), 카르복시 말단 알파-나선(C-나선) 및 때로 비리온 외피에 인접한 방향족 모티프를 포함한다. 또한, 각 바이러스 과에 대해 본 발명자들에 의해 발견되고 미국 출원 일련번호 10/578,013에 개시된 융합 개시 영역(FIR)이라고도 불리는 6번째 도메인이 도시되어 있다.
미국 인구의 약 10 내지 20%는 매년 계절성 인플루엔자를 앓는다. 대부분은 1 내지 2주가 지나면 인플루엔자에서 회복되지만, 유아, 노인 및 만성 의학적 병태를 가진 자는 플루 후 폐렴 및 기타 치명적인 합병증을 일으킬 수 있다. 인플루엔자의 원인인자는 오르토믹소바이러스인 인플루엔자 바이러스로, 이는 분절성 바이러스 게놈의 재편성 및 돌연변이 과정을 통해 새 주를 쉽게 발생시킨다.
A형 인플루엔자 바이러스의 고 독성 주는 유행병과 범유행병을 일으킬 수 있다. 최근에는 높은 치사율을 나타낼 수 있는 조류 A형 인플루엔자 바이러스 아형 H5N1의 고 병원성 주가 출현했다. 인플루엔자 바이러스가 공중보건에 대해, 그리고 생물테러의 잠재적 인자로서 미치는 위협 때문에, 계절성 인플루엔자 및 범유행병성 인플루엔자의 위협 증가에 대한 치료제 개발은 최우선시되고 있다.
본 발명은 인플루엔자 감염의 치료 또는 예방 및/또는 인플루엔자 감염의 사람간 전염의 예방에 유용한 펩타이드, 펩타이드 유사체, 펩타이드 유도체 및 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 펩타이드는 야생형 인플루엔자 헤마글루티닌 2 단백질의 융합 개시 영역(FIR)의 인플루엔자 바이러스-세포 융합 억제부 또는 이의 변형체를 포함한다. 변형체는 야생형 헤마글루티닌 2 단백질 서열의 아미노산 잔기 서열에서 선택된 치환에 의하여 야생형 단백질과 상이한 것이다.
제1 양태에 따르면, 본 발명의 분리된 펩타이드는 선택된 야생형 인플루엔자 헤마글루티닌 2 단백질의 일부인 8 내지 40개의 연속 아미노산 잔기 또는 이의 변형체를 포함한다. 헤마글루티닌 2 단백질의 일부는 단백질의 융합 개시 영역(FIR)과 이 FIR의 아미노 말단 및 카르복시 말단 측에 존재하는 5개 이하의 아미노산 잔기를 포함한다. 이러한 일부는 또한 적어도 서열 YNAELL(서열번호 1) 또는 Y1S, Y1T, Y1W, Y1A, N2Q, A3L, A3I, A3V, E4D, E4K, E4R, E4H, L5I, L5V, L5A, L6I, L6V 및 L6A로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 서열번호 1의 서열과 상이한 변형체를 포함한다.
이러한 제1 양태에서, 변형체는 앞에서 언급한 선택된 야생형 단백질의 일부의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 선택된 야생형 서열과 달라진다. 이러한 치환은 다른 야생형 인플루엔자 헤마글루티닌 2 단백질의 대응 아미노산 잔기 또는 야생형 잔기의 보존적 치환으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 적어도 하나의 야생형 헤마글루티닌 2 아미노산 서열 중 대응 영역의 윔리-화이트(Wimley-White) 계면 친수성 프로파일의 국소 최대치 및 국소 최소치의 약 5개 아미노산 잔기 내에, 프로필의 국소 최대치 및 국소 최소치를 보유하는 변형체의 윔리-화이트 계면 친수성 프로파일을 유지하도록 선택되는 것이 좋다. 바람직하게는, 선택된 야생형 서열의 변형체는 야생형 서열과 적어도 50%의 서열 동일성을 공유하는 것이 좋다.
제2 양태에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 야생형 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 헤마글루티닌 2 단백질의 FIR의 8 내지 40개의 아미노산 잔기 일부를 이 단백질의 잔기 72 내지 113 범위의 영역에서 유래하는 것으로 포함하거나, 또는 야생형 서열에 하나 이상의 아미노산 잔기 치환에 의해 야생형 서열의 72 내지 113 잔기와 상이한 변형체를 포함한다. 변형체의 치환은 다른 야생형 헤마글루티닌 2 단백질의 대응하는 아미노산 잔기 또는 이의 보존적 치환 중에서 선택되고, 바람직하게는 펩타이드의 윔리-화이트 친수도 프로필의 전반적 형태를 보존하도록, 즉 대응하는 야생형 헤마글루티닌 2 아미노산 서열의 윔리-화이트 친수도 프로필의 국소 최대치 및 국소 최소치의 약 5개 아미노산 잔기 내에 국소 최대치와 국소 최소치를 보유하는 변형체의 윔리-화이트 친수도 프로필을 유지하도록 선택하는 것이 좋다. 이러한 양태의 변형체는 보존적 치환에 의해 야생형 서열과 상이한 것이 바람직하다.
제3 양태에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열(EVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDS) 중 8 내지 40개의 연속 아미노산 잔기 또는 이의 변형체를 포함한다. 서열번호 2는 야생형 인플루엔자 A 아형 H3의 헤마글루티닌 2 단백질(서열번호 19)의 아미노산 잔기 72 내지 113을 포함한다. 8 내지 40개의 아미노산 잔기는 서열번호 2의 아미노산 중 적어도 23 내지 28 잔기 또는 이의 변형체를 포함한다. 이러한 양태에서, 변형체는 다음과 같은 아미노산 치환으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 서열번호 2와 다른 것이다: E1D, E1N, E1Q, V2G, V2S, V2T, V2I, V2L, V2A, V2M, V2C, E3D, E3N, E3Q, G4T, G4S, G4K, G4R, G4H, G4Q, G4N, R5K, R5H, R5Q, R5N, I6L, I6V, I6A, I6M, I6C, Q7N, Q7E, Q7D, Q7G, Q7S, Q7T, D8E, D8N, D8Q, D8M, D8C, L9I, L9V, L9A, L9M, L9C, E10D, E10N, E10Q, E10I, E10L, E10V, E10A, E10M, E10C, K11R, K11H, K11D, K11E, K11N, K11Q, Y12W, Y12K, Y12R, Y12H, V13I, V13L, V13A, V13G, V13T, V13S, V13M, V13C, E14D, E14K, E14R, E14H, D15E, D15R, D15N, D15Q, T16G, T16S, T16A, T16Q, T16N, K17F, K17R, K17M, K17C, K17I, K17V, K17L, K17A, I18L, I18V, I18A, I18T, I18S, I18G, I18Q, I18N, D19E, D19N, D19Q, L20I, L20V, L20A, L20C, L20M, W21Y, W21A, S22T, S22G, S22A, S22M, S22C, Y23W, Y23S, Y23T, Y23A, N24Q, N24D, N24E, A25I, A25V, A25L, A25M, E26D, E26K, E26R, E26H, L27A, L27I, L27V, L27M, L28I, L28V, L28A, L28M, V29I, V29L, V29A, V29M, A30I, A30L, A30V, A30M, A30C, L31I, L31V, L31A, L31M, L31C, E32D, E32N, E32Q, N33Q, N33Q, Q34E, N33E, Q34E, Q34D, Q34G, Q34S, Q34T, H35K, H35R, H35N, H35Q, T36S, T36G, I37L, I37V, I37A, I37M, I37C, D38E, D38N, D38Q, L39F, L39I, L39V, L39M, L39C, L39A, L39E, L39D, L39N, L39Q, T40H, T40R, T40K, T40S, T40G, T40A, T40M, D41E, D41N, D41Q, S42G, S42T, S42I, S42L, S42V, S42A, S42M 및 S42C.
바람직한 특정 양태에서, 본 발명의 펩타이드는 야생형 인플루엔자 A 헤마글루티닌 2(HA2) 또는 인플루엔자 B 헤마글루티닌(HB) 단백질의 FIR 일부를 나타내는, 서열번호 3 내지 13의 서열 중 임의의 서열의 적어도 8개 연속 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이다. 다른 바람직한 양태에서, 이 펩타이드는 서열번호 3 내지 13 중 어느 하나의 변형체의 적어도 8개 아미노산 연속 잔기를 포함한다. 이러한 대안적 양태에서, 변형체는 앞에서 논한 제3 양태에 기술된 것과 유사한 하나 이상의 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 치환에 의해 선택된 서열과 다른 것이다.
페레트(ferret)의 비강에 투여했을 때, 플루 억제제-3(F3)이라 지칭한 본 발명의 펩타이드는 동물에서의 인플루엔자 발생 및 동물간 인플루엔자 전염을 효과적으로 차단했다. F3의 아미노산 서열은 사람의 혈행 중에 있는 A/H3N2 주를 비롯한 대부분의 인플루엔자 A H3 아형 바이러스의 잔기 84-99와 동일하다. 또한, F3은 시험관내 면역플라크(immunoplaque) 분석법에서 낮은 nM 범위(<5nM)의 IC50으로, 재조합 H5N1 인플루엔자 바이러스 및 B형 인플루엔자의 두 주(B/Shanghai/361/2002 및 B/Shanghai/10/2003)에 대해서도 활성을 나타낸다. 이러한 다른 A형 인플루엔자 및 B형 인플루엔자 주의 다양성을 감안하면, F3은 대부분의 인플루엔자 바이러스에 대해 효과적일 것이다.
다른 관점에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드의 유사체(예, 사이클릭 펩타이드 또는 비천연 아미노산 함유 펩타이드), 펩타이드 잔기에 결합된 비-HA2-유래의 그룹(예, 지질 또는 비-인플루엔자 HA2 펩타이드 서열)를 포함하는 본 발명의 펩타이드 또는 유사체의 유도체, 및 본 발명의 펩타이드, 유사체 또는 유도체에 특이적인(즉, 특이적 및 선택적으로 결합할 수 있는) 분리된 항체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 관점은 인플루엔자 감염을 치료 또는 예방하기 위한 치료 방법에 사용되는 본 발명의 펩타이드, 유사체, 유도체 또는 항체의 용도이다. 이러한 용도는 인플루엔자를 치료하는 약제를 제조하는데 사용되는 본 발명의 펩타이드, 유사체, 유도체 또는 항체의 용도를 포함할 수 있다. 본 발명의 펩타이드, 유사체, 유도체 및 항체는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 약제학적 조성물에 포함될 수 있다.
도 1은 타입 I 바이러스의 6종의 과 유래의 융합 단백질 중 이전에 동정된 5개 도메인 및 융합 개시 영역(FIR)으로 알려진 제6 도메인을 도시하고 있다.
도 2는 HA2 변형체 H1(서열번호 17), H2(서열번호 18), H3(서열번호 19), H4(서열번호 20), H5(서열번호 21), H6(서열번호 22), H7(서열번호 23), H9(서열번호 24), H10(서열번호 25), H13(서열번호 26), H14(서열번호 27), H15(서열번호 28) 및 H16(서열번호 29)의 서열 정렬을 나타낸다.
도 3은 인플루엔자 B 헤마글루티닌 2, B/Yamagata/16/1988(서열번호 30)의 아미노산 잔기 서열을 나타낸다.
도 4는 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 헤마글루티닌 2 단백질들의 잔기 72-113, 구체적으로 인플루엔자 A 아형 H1(서열번호 17), H2(서열번호 18), H3(서열번호 19), H4(서열번호 20), H5(서열번호 21), H6(서열번호 22), H7(서열번호 23), H9(서열번호 24), H10(서열번호 25), H13(서열번호 26), H14(서열번호 27), H15(서열번호 28), H16(서열번호 29) 및 인플루엔자 B/Yamagata/16/1988 헤마글루티닌 2(서열번호 30)의 잔기 72-113을 비교한 것이다.
도 5는 바이러스-세포 융합의 가능한 기전을 도시한 것이다.
도 6은 인플루엔자 바이러스 A/Cal/07/04로 시험감염되고 본 발명의 펩타이드 또는 대조용 펩타이드로 처리된 페레트의 두 그룹에서 관찰되는 병리학적 반응을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 펩타이드 또는 대조용 펩타이드로 치료되고 인플루엔자 바이러스 A/Cal/07/04로 감염된 페레트 유래의 샘플을 바이러스 역가 분석한 것이다.
도 8은 인플루엔자 A H1 헤마글루티닌 2의 윔리-화이트 계면 친수도 플롯을 도시한 것이다.
도 9는 인플루엔자 A H2 헤마글루티닌 2의 윔리-화이트 계면 친수도 플롯을 도시한 것이다.
도 10은 인플루엔자 A H3 헤마글루티닌 2의 윔리-화이트 계면 친수도 플롯을 도시한 것이다.
도 11은 인플루엔자 A H4 헤마글루티닌 2의 윔리-화이트 계면 친수도 플롯을 도시한 것이다.
도 12는 인플루엔자 A H5 헤마글루티닌 2의 윔리-화이트 계면 친수도 플롯을 도시한 것이다.
도 13은 인플루엔자 A H6 헤마글루티닌 2의 윔리-화이트 계면 친수도 플롯을 도시한 것이다.
도 14는 인플루엔자 A H7 헤마글루티닌 2의 윔리-화이트 계면 친수도 플롯을 도시한 것이다.
도 15는 인플루엔자 A H9 헤마글루티닌 2의 윔리-화이트 계면 친수도 플롯을 도시한 것이다.
도 16은 인플루엔자 A H10 헤마글루티닌 2의 윔리-화이트 계면 친수도 플롯을 도시한 것이다.
도 17은 인플루엔자 A H13 헤마글루티닌 2의 윔리-화이트 계면 친수도 플롯을 도시한 것이다.
도 18은 인플루엔자 A H14 헤마글루티닌 2의 윔리-화이트 계면 친수도 플롯을 도시한 것이다.
도 19는 인플루엔자 A H15 헤마글루티닌 2의 윔리-화이트 계면 친수도 플롯을 도시한 것이다.
도 20은 인플루엔자 A H16 헤마글루티닌 2의 윔리-화이트 계면 친수도 플롯을 도시한 것이다.
본 발명은 인플루엔자 감염을 치료 또는 예방하거나, 또는 인플루엔자 감염의 사람간 전염을 방지하는데 유용한 펩타이드, 펩타이드 유사체, 펩타이드 유도체, 항체 및 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 야생형 인플루엔자 헤마글루티닌 2 단백질의 융합 개시 영역(FIR)의 일부와 아미노산 서열 유사성이 있는 펩타이드를 이용한다. 본 발명의 펩타이드는 인플루엔자 바이러스-세포 융합을 억제할 수 있고, 이로써 인플루엔자 감염을 치료 및/또는 예방할 수 있다. 본 발명의 펩타이드는 FIR 영역에 야생형 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 2 단백질의 선택된 일부 또는 선택된 일부의 변형체를 포함할 수 있다. 변형체는 야생형 헤마글루티닌 2 단백질 서열의 아미노산 잔기 서열에서 선택된 치환에 의해서 야생형 단백질과 다른 것이다. 본 발명의 펩타이드는 활성화 또는 융합에 필요한 입체적 변화 또는 단백질 응집의 방해 등에 의해 표적 세포 표면과 바이러스 융합 펩타이드의 FIR 도메인과의 정상적인 상호작용을 방해하여 인플루엔자 감염을 예방하고 치료하는 것으로 생각되지만, 이러한 이론에만 국한하려는 것은 아니다.
제1 양태에서, 본 발명의 분리된 펩타이드는, 선택된 야생형 인플루엔자 헤마글루티닌 2 단백질의 융합 개시 영역(FIR) 및 이 FIR의 아미노-말단 및 카르복시-말단 측에 존재하는 5개 이하의 아미노산 잔기를 포함하는, 상기 단백질 일부의 8 내지 40개의 연속 아미노산 잔기, 바람직하게는 9 내지 16개의 연속 아미노산 잔기, 또는 이의 변형체를 포함한다. 8 내지 40개의 아미노산 펩타이드는 적어도 서열 YNAELL(서열번호 1) 또는 서열번호 1의 서열과 다음과 같은 치환으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 상이한 변형체를 포함한다: Y1S, Y1T, Y1W, Y1A, N2Q, A3L, A3I, A3V, E4D, E4K, E4R, E4H, L5I, L5V, L5A, L6I, L6V 및 L6A. 서열번호 1은 특성규명된 인플루엔자 A 헤마글루티닌 2 단백질의 FIR 전체 중 가장 고도로 보존적인 일부 중 하나를 나타낸다(즉, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 2 서열의 잔기 94 내지 99). FIR의 아미노산 서열은 단백질의 N-나선 중 대략 잔기 77에서 시작하고 선택된 야생형 헤마글루티닌 2 단백질의 잔기 110 내지 잔기 119 범위에 있는 잔기에서 끝나는 선택된 야생형 헤마글루티닌 2 단백질의 일부를 포함한다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 인플루엔자 FIR의 카르복시-말단 끝은 윔리-화이트 계면 소수성 증가 영역을 시작하는, 잔기 104(N-나선의 카르복시 말단)를 지난 제1 잔기의 바로 전 잔기이다. 달리 말하자면, FIR은 N-나선(잔기 77)에서 시작해서 N-나선의 카르복시-말단 이후 약 15 잔기 내에서 끝나는, 야생형 헤마글루티닌 2 단백질의 윔리-화이트 계면 친수성 프로파일의 피크를 나타내는 아미노산 잔기의 서열을 특징으로 한다. 피크 영역(즉, FIR)의 카르복시 말단은 친수도 프로필에서 국소 최소치를 특징으로 한다. FIR의 카르복시 말단에 국소 최소치 직후의 잔기는 친수도 프로필(즉, 계면 소수성 증가 영역)의 다른 피크를 시작한다.
이러한 제1 양태에서, 변형체는 앞에서 언급한 선택된 야생형 단백질 일부의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 선택된 야생형 서열과 다른 것이다. 이러한 치환은 다른 야생형 인플루엔자 헤마글루티닌 2 단백질의 대응 아미노산 잔기 또는 대응 잔기의 보존적 치환 중에서 선택되고, 바람직하게는 적어도 하나의 야생형 헤마글루티닌 2 FIR 아미노산 서열의 대응 영역의 윔리-화이트 계면 친수성 프로파일의 국소 최대치 및 국소 최소치의 약 5개 아미노산 잔기 내에서 프로필의 국소 최대치 및 국소 최소치를 보유하는 변형체의 윔리-화이트 계면 친수성 프로파일을 유지하도록 선택되는 것이 좋다. 예를 들어, 야생형 헤마글루티닌 2는 인플루엔자 A 헤마글루티닌 2의 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H9, H10, H11, H12, H13, H15 및 H16 변형체(서열번호 17-29)로 이루어진 그룹에서 선택되는 아형에서 유래되거나, 또는 인플루엔자 B 헤마글루티닌 2 단백질(서열번호 30)에서 유래될 수 있다. 인플루엔자 A 헤마글루티닌 2 아형 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H9, H10, H11, H12, H13, H15 및 H16의 아미노산 서열은 도 2에 도시했고, 여기서 FIR 영역은 검정색 테두리에 싸여있다. 인플루엔자 B 헤마글루티닌 2의 아미노산 서열(서열번호 30)은 도 3에 제시된다. 선택된 야생형 서열의 변형체는 야생형 서열과 적어도 50% 서열 동일성(예, 적어도 60%, 적어도 70% 또는 적어도 80% 서열 동일성)을 공유한다.
제2 양태에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 야생형 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 헤마글루티닌 2 단백질의 잔기 72 내지 113의 8 내지 40개, 바람직하게는 9 내지 16개의 연속 아미노산 잔기를 포함하거나, 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 야생형 서열의 잔기 72 내지 113과 다른 변형체를 포함한다. 변형체에서의 치환은 다른 야생형 헤마글루티닌 2 단백질의 대응하는 아미노산 잔기 또는 이의 보존적 치환으로부터 선택되고, 바람직하게는 야생형 펩타이드의 윔리-화이트 친수도 프로필의 전반적 형태를 보존하도록, 즉 대응하는 야생형 헤마글루티닌 2 아미노산 서열의 윔리-화이트 친수도 프로필의 국소 최대치 및 국소 최소치의 약 5개 아미노산 잔기 내에 국소 최대치 및 국소 최소치를 보유하는 변형체의 윔리-화이트 친수도 프로필을 유지하도록 선택되는 것이 좋다. 예를 들어, 본 양태의 변형체는 특정 야생형 아미노산 잔기의 보존적 치환을 함유한다.
본 명세서에 사용된, "보존적 치환"이란 용어와 이의 변형어는 펩타이드 서열 내에 야생형 잔기와 다르지만 동일한 클래스의 아미노산인 아미노산 잔기의 존재를 의미한다(즉, 비극성 잔기는 비극성 잔기 대신, 방향족 잔기는 방향족 잔기 대신, 극성 비하전성 잔기는 극성 비하전성 잔기 대신, 하전성 잔기는 하전성 잔기 대신). 또한, 보존적 치환은 대체되는 야생형 잔기와 동일한 부호 및 일반적으로 유사한 크기의 계면 친수도 값을 보유하는 잔기를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된, "비극성 잔기"란 용어는 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신 및 프롤린을 의미하고, "방향족 잔기"란 용어는 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판을 의미하며; "극성 비하전성 잔기"란 용어는 세린, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴 및 글루타민을 의미하고; "하전성 잔기"란 용어는 음하전성 아미노산 아스파르트산 및 글루탐산뿐만 아니라 양하전성 아미노산 리신, 아르기닌 및 히스티딘을 의미한다.
도 4는 인플루엔자 B 헤마글루티닌 2(즉, 서열번호 30의 잔기 72-113)와 함께 도 2에 제시된 각 인플루엔자 A 헤마글루티닌 2 아형의 잔기 72-113을 비교한 것이다. 도 4에서 명백하듯이, 여러 헤마글루티닌 아형 간에는 유의적인 서열 유사성이 있다. 각 인플루엔자 A 헤마글루티닌 2 아형의 잔기 72-113 영역은 H3 아형의 대응 영역(즉, 서열번호 2)과 50% 또는 그 이상의 서열 동일성을 공유한다. 서열번호 2와 다른 다양한 아형의 잔기 72-113 간의 서열 동일성 %는 다음과 같다: H4와 H14는 서열번호 2와 약 95.2% 서열 동일성을 공유하고; H7과 H15는 서열번호 2와 약 59.5% 서열 동일성을 공유하며; H10과 H16은 서열번호 2와 약 54.7% 서열 동일성을 공유하고; H5와 H6은 서열번호 2와 약 52% 서열 동일성을 공유하며; H1, H2, H9 및 H13은 서열번호 2와 50% 서열 동일성을 공유한다. 인플루엔자 B 헤마글루티닌 2의 잔기 72-113은 서열번호 2와 약 30.9% 서열 동일성을 공유하지만, 서열번호 2와 인플루엔자 B 단백질의 잔기 72-113 간의 차이는 주로 보존적 치환이다.
도 2, 도 3 및 도 4에서 명백하듯이, 공지된 야생형 헤마글루티닌 2 단백질은 잔기 72-113의 범위 내의 위치에 1 이상의 아미노산 클래스에 속하는 아미노산 잔기를 공동으로 보유한다. 따라서, 이러한 경우, 본 발명의 펩타이드 변형체도 상기 위치에 1 이상의 아미노산 클래스의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 선택된 야생형 서열의 변형체는 야생형 서열과 적어도 50% 서열 동일성(예, 적어도 60%, 적어도 70% 또는 적어도 80% 서열 동일성)을 공유하는 것이 바람직하다.
제3 양태에서, 본 발명의 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열(EVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDS)의 8 내지 40개, 바람직하게는 9 내지 16개의 연속 아미노산 잔기, 또는 이의 변형체를 포함한다. 서열번호 2는 아미노산 잔기 72 내지 113을 포함하는 야생형 인플루엔자 A 아형 H3 헤마글루티닌 2 단백질의 일부이다. 이러한 양태에서, 상기 펩타이드는 적어도 서열번호 2의 아미노산 잔기 23 내지 28, 또는 이의 변형체를 포함하고, 이 변형체는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 서열번호 2와 다른 것이다. 변형체 서열 내의 하나 이상의 아미노산 치환은 표 1에 제시된 치환 그룹 중에서 선택된다. 변형체는 서열번호 2와 적어도 50% 서열 동일성(예컨대, 적어도 60%, 적어도 70% 또는 적어도 80% 서열 동일성)을 공유하는 것이 바람직하다. 표 1에서, 제1 컬럼의 치환이 바람직하며, 제2 컬럼의 치환은 보다 바람직하고 제1 컬럼의 치환보다 더욱 보존적인 반면, 제3 컬럼의 치환은 본 발명의 펩타이드에 포함될 수 있는 대안예이다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
바람직한 특정 양태에서, 본 발명의 펩타이드는 야생형 인플루엔자 A 헤마글루티닌 2(HA2) 또는 인플루엔자 B 헤마글루티닌(HB) 단백질의 FIR 일부를 나타내는, 표 2에 제시된 서열(서열번호 3-13) 중 임의의 서열의 적어도 8개 연속 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드이다. 바람직한 다른 양태에서, 이 펩타이드는 서열번호 3 내지 13 중 어느 하나의 변형체의 적어도 8개 연속 아미노산 잔기를 포함한다. 이러한 대안적 양태에서, 변형체는 선택된 서열과 하나 이상의 아미노산 치환에 의해, 바람직하게는 보존적 치환에 의해 달라진 것이며, 표 1에 제시된 바와 같이 펩타이드의 각 위치에서 대응하는 치환 잔기로부터 선택되는 것이 바람직하다.
또한, 도 2 및 도 4에 제시된 서열은 볼드체활자 타입의 다수의 잔기를 나타내고 있으며, 이는 정렬된 헤마글루티닌 2 아미노산 서열의 표시된 위치에 있는 컨센서스 잔기를 나타낸다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 아미노산 서열의 정렬 비교에서 아미노산 잔기에 적용되는 바와 같은 "컨센서스"란 용어는 주어진 위치에서 정렬된 서열들 대부분에서 보이는 아미노산을 의미한다. 도 2에서, 컨센서스 잔기는 도면에 제시된 13개 서열 중 적어도 7개 서열의 주어진 위치에서 보이는 아미노산이다. 도 4에서, 컨센서스 잔기는 도면에 제시된 14개 서열 중 적어도 8개 서열의 주어진 위치에서 보이는 아미노산이다. 도 4에서 비교된 헤마글루티닌 2 서열의 잔기 72 내지 113의 영역에서, 컨센서스 잔기는 다음과 같다: V73, E74, R76, I77, L80, D86, D90, W92, S93, Y94, N95, A96, E97, L98, L99, V100, L101, L102, E103, N104, T107, D109, D112 및 S113. 바람직하게는, 본 명세서에 기술된 임의의 양태를 포함하는 본 발명의 펩타이드는 상기 컨센서스 잔기 하나 이상을, 상기 모든 컨센서스 잔기까지, 그리고 상기 컨센서스 잔기 전부를 포함해서 HA2 단백질의 영역 내에 또는 이 펩타이드에 속하는 그 변형체 내에 포함하는 것이 좋다.
Figure pat00004
인플루엔자 B 헤마글루티닌 2 펩타이드(서열번호 8)을 제외한 표 2의 모든 서열들은 서열번호 3과 50% 이상의 서열 동일성을 공유하고, 즉 서열번호 4, 5, 9 및 13은 서열번호 3과 62.5% 동일하고, 서열번호 6, 7, 9, 10, 11 및 12는 서열번호 3과 56.2% 동일하다. 인플루엔자 B 헤마글루티닌 2는 서열번호 3과 약 31% 서열 동일성을 공유하지만, 서열번호 8과 서열번호 3 간의 차이는 주로 보존적 치환이다. 또한, 서열번호 3 내지 13으로 제시된 각 펩타이드는 컨센서스 잔기 D86, D90, W92, S93, Y94, N95, A96, E97, L98, L99, V100, L101 및 L102를 포함한다.
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 유사체를 제공한다. 한 양태에서, 유사체는 이황화 결합(즉, 시스틴 가교)을 공유하는 적어도 2개의 시스테인 잔기를 함유하여 사이클릭 구조를 형성하는 사이클릭 펩타이드를 포함한다. 각 시스테인 잔기는 독립적으로 펩타이드 잔기, 펩타이드의 아미노 말단에 직접 또는 결합성 펩타이드 서열을 통해 결합된 잔기, 또는 펩타이드의 카르복시 말단에 직접 또는 결합성 펩타이드 서열을 통해 결합된 잔기이다. 사이클릭 펩타이드 구조는 많은 펩타이드들의 생체내 생체안정성을 향상시키는 것으로 알려져 있다.
다른 양태에 따르면, 유사체는 적어도 하나의 비천연 아미노산 잔기(예컨대, D-아미노산 잔기, N-메틸화된 잔기, 예컨대 N-메틸 발린, 하이드록시프롤린, 아미노부티르산 등)를 포함한다. 이러한 임의의 비천연 아미노산의 치환은 많은 펩타이드 화합물의 펩티다제에 의한 절단에 대한 내성을 부여하거나(예, D-아미노산, 하이드록시프롤린), 또는 펩타이드의 알파 나선 함량을 증가시키는(예, 아미노부티르산) 것으로 알려져 있다.
또 다른 양태에서, 유사체는 하나 이상의 프롤린, 글리신 또는 글루탐산 잔기에 의한 펩타이드 아미노산 잔기의 하나 이상의 자연 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 프롤린 및 글리신 잔기는 필요하거나 바람직한 경우 펩타이드의 알파 나선 함량을 중단시킬 수 있고, 반면 글루탐산 잔기는 펩타이드의 알파 나선 함량을 증가시킬 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 펩타이드 또는 유사체가 부속 그룹을 포함하는 본 발명의 펩타이드 유도체 또는 유사체를 제공한다. 한 양태에 따르면, 부속 그룹은 지질, 예컨대 펩타이드에 에스테르, 아미드, 에테르, 티오에스테르 또는 티오에테르 결합을 통해 결합된 C8 내지 C20 알킬 그룹 또는 알킬 카르복실레이트 그룹이다. 예를 들어, 유도체는 펩타이드의 잔기에 결합된 지방산 알킬 에스테르 그룹, 예컨대 미리스테이트 그룹을 포함할 수 있다. 지질 치환체는 예컨대 펩타이드의 생체안정성을 증가시킬 수 있다.
다른 양태에서, 유도체는 펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기의 측쇄에 존재하는 아미노, 하이드록시 또는 티올 치환체에 부속된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 그룹을 포함한다. 이러한 PEG 유도체는 종종 유의적인 수준의 펩티다제를 포함하는 간과 같은 기관에서의 흡수 억제 등에 의해 단백질 약동학을 개선시킬 수 있다.
또 다른 유도체 양태에 따르면, 펩타이드는 8 내지 40개 아미노산 펩타이드의 아미노 말단, 이 펩타이드의 카르복시 말단 또는 양 말단에 결합된 비-HA2 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 비-HA2 서열은 비-HA2 단백질(예, 혈청 알부민) 또는 비-HA2 단백질의 일부일 수 있고, 또는 예컨대 펩타이드의 가용화에 도움을 주는 서열, 예컨대 ASKSKSK(서열번호 15) 또는 이의 변형체를, 바람직하게는 펩타이드의 카르복시 말단에 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 유도체는 본 발명의 펩타이드를 포함하는 제1 펩타이드 분절(야생형 서열의 잔기 72 내지 113의 영역 유래의 야생형 인플루엔자 HA2 단백질의 일부의 8 내지 40개 연속 아미노산 잔기 또는 이의 변형체), 및 제1 펩타이드 분절의 아미노 말단, 카르복시 말단 또는 아미노 말단과 카르복시 말단에 결합된 비-HA2 펩타이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 펩타이드 분절을 포함하는 분리된 폴리펩타이드이다.
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 펩타이드, 유사체 또는 유도체에 특이적인(즉, 특이적 및 선택적으로 결합할 수 있는) 분리된 항체를 제공한다. 이러한 항체는 본 발명의 조성물로 치료 받은 피검체 유래의 생물학적 샘플에서 본 발명의 펩타이드, 유사체 또는 유도체의 농도의 존재를 측정하는 시약으로 유용하다. 또한, 야생형 헤마글루티닌 2 아형의 일부를 포함하는 본 발명의 펩타이드를 표적으로 하는 항체는 자연 헤마글루티닌 2 단백질에도 결합할 수 있다. 이러한 결합은 또한 인플루엔자 바이러스-세포 융합 과정의 약간의 억제 수준을 제공할 수 있다. 항체는 마우스와 같은 비-사람 동물의 항체에서 유래된 키메라 항체 또는 사람화된 항체일 수 있는 모노클로날 항체인 것이 바람직하다. 주어진 단백질 또는 펩타이드로부터 모노클로날 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 또한, 키메라 항체 또는 사람화된 항체를 제조하는 방법도 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 다른 관점은 인플루엔자 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 사용될 수 있는 본 발명의 펩타이드, 유사체, 유도체 또는 항체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 바람직한 특정 양태에서, 이 조성물은 본 발명의 펩타이드, 유사체, 유도체 또는 항체를 피검체에게, 예컨대 비강 또는 폐관으로 전달하기에 적합한 약제학적으로 허용되는 비히클 또는 담체에 포함한다. 활성 성분을 비강 또는 폐관으로부터 전달하기에 적합한 비히클 및 담체는 당업계에 공지되어 있고 식염수 용액, 완충식염수 용액, 흡입성 분말 및 이의 유사물을 포함한다. 담체는 또한 다른 부형제 성분, 예컨대 계면활성제, 보존제, 분산제 및 이의 유사물을 포함할 수도 있다. 조성물은 에어로졸, 비에어로졸성 액체, 연고 또는 크림(예컨대, 비측 적용 용도) 및 이의 유사물로서 전달될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 인플루엔자를 앓고 있는 피검체에게 본 발명의 약제학적 조성물의 인플루엔자 억제량을 투여하여 인플루엔자 감염을 치료 또는 예방하는 방법의 일부로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 관점은 인플루엔자 감염을 치료 또는 예방하는데 사용되는 본 발명의 펩타이드, 유사체, 유도체, 항체 또는 약제학적 조성물의 용도이다. 이는 인플루엔자를 치료하는 약제의 제조에 사용되는 본 발명의 펩타이드, 유사체, 유도체 또는 항체의 용도를 포함할 수 있다.
인플루엔자 바이러스
인플루엔자 A 바이러스에는 여러 아형이 있다. 각 바이러스 아형은 바이러스의 지질 막 외피에 매립되어 있는 2종의 당단백질의 1가지 특이적 조합 형태를 포함한다. 2종의 아형을 정의하는 당단백질은 헤마글루티닌 2(HA2) 및 뉴라미니다제이다. HA2에는 H1 내지 H16으로 불리는 16종의 공지된 변형체가 있고, 뉴라미니다제에는 N1 내지 N9로 불리는 9종의 공지된 변형체가 각각 존재한다. 각 바이러스 아형은 이의 헤마글루티닌 2 및 뉴라미니다제 변형체 번호에 의해 구체적으로 특성화된다. 예를 들어, 인플루엔자 A 아형 H3N2는 돼지 플루이고, 아형 H5N1은 조류 플루이다.
HA2는 인플루엔자 바이러스를 포함하는 오르토믹소바이러스 과의 모든 바이러스의 융합 단백질이다. 모든 인플루엔자 바이러스의 FIR은 HA2 당단백질 내에 존재한다. 16종의 공지된 HA2 변형체, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 및 H16 중 13종의 아미노산 서열은 도 2에 제시했다(각각 서열 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 및 29). H8, H11 및 H12 아형의 서열은 보고되지 않았다. H3 헤마글루티닌 2의 융합 개시 영역은 현재 도 2에 제시된 H3 아미노산 서열(서열번호 19)의 잔기 77 내지 119로 확인되었다.
본 명세서에서 플루 억제제-3(F3)으로 언급하고 아미노산 서열이 VEDTKIDLWSYNAELL, 서열번호 3(서열번호 19의 잔기 84-99; H3 HA2)인 분리된 펩타이드는 현재 강력한 항바이러스 성질을 가진 것으로 밝혀졌다. 같은 16개의 아미노산을 무작위로 뒤섞인 서열 SWLVNKIYLTDDEVEL(서열번호 14)로 포함하는 분리된 펩타이드는 식별할 수 있는 항바이러스 성질을 전혀 나타내지 않는다. F3의 항바이러스 성질은 혈구응집 분석에 의해 입증되는 바와 같은 바이러스 결합 억제를 포함한다. 또한, F3은 플라크 분석에 의해 입증되는 바와 같이 바이러스 결합, 융합 및 감염을 억제한다.
항인플루엔자 바이러스 활성
F3은 각각의 HA2 단백질의 전반적인 서열 및 구조 모두에 있어서 유의적인 다양성을 나타내는 광범위한 H1, H3, H5 및 인플루엔자 B 바이러스에 대하여 강력한 감염 억제 활성을 나타낸다. F3 활성의 광범위한 스펙트럼은 FIR, 특히 모든 공지된 인플루엔자 A 아형 및 인플루엔자 B의 잔기 84-99로 표시되는 FIR 일부가 HA2 단백질에서 가장 고도로 보존적인 영역 중 하나라는 사실과 적어도 부분적으로 관련이 있을 수 있다. F3과 야생형 HA2 아형의 대응 영역(잔기 84-99) 사이의 서열 유사성이 펩타이드가 FA 아형들을 따라 FIR의 대응 일부에 효과적으로 결합하거나 다른 방식으로 상호작용할 수 있게 하는 것으로 생각되지만, 이러한 이론에만 국한시키려는 것은 아니다. 이러한 상호작용은 융합 과정 동안 HA 단백질의 정상적인 작동을 방해한다(예, 융합 과정의 진행에 필요한 입체형태 변화 또는 단백질 응집의 방해).
F3은 표준 FMOC 화학을 이용하는 PEG-PS-PAL 수지에서 그램 함량으로 합성되었다. 이 대량 펩타이드 산물은 HPLC에 의해 >95%로 정제되었고, 남은 물질은 주로 더 짧은 관련 펩타이드였다. 정제된 펩타이드는 용매를 제거하기 위해 동결건조했다. 동결건조된 분말은 예를 들어 헥사플루오로이소프로판올에 용해 및 고순도 질소(Praxair UHP, 99.999%) 스트림의 보조 하에 용매 증발 등에 의해 추가로 처리될 수 있다. 그 결과 수득되는 분말은 이후에 10mM 인산칼륨 또는 인산염완충 식염수(PBS)와 같은 수성 완충액에 상기 분말을 용해시켜 재구성시킬 수 있다. 용액 중에 F3의 농도는 수학식: mg/ml = (A280 x mw)/e (여기서, e는 280nm에서의 펩타이드 아미노산 서열에 존재하는 2개의 발색성 아미노산의 분자흡광계수의 총합, 즉 e=6760을 제공하는 5560(Trp) + 1200(Tyr)의 총합을 나타낸다)을 사용하여 측정할 수 있다.
F3은 강력하고 광범위함을 기반으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 억제 활성을 갖고 있으며 플라크 감소 분석에서 피코몰의 억제를 나타낸다. 중층으로 AVICEL® 미세결정형 셀룰로스를 이용한 면역플라크 분석에서, 플라크는 단층을 고정시키고 인플루엔자 바이러스 핵단백질에 대한 특정 항체로 염색하여 검출한다. 펩타이드 억제 분석에서, 펩타이드는 약 100 플라크 형성 단위(pfu)의 바이러스와 약 1시간 동안 예비항온처리된 후, 단층을 감염시키는데 사용된다. 항온처리에는 2가지 조건을 사용했다: (1) 예비항온처리 단계에 사용되었던 농도와 동일 농도로 펩타이드를 중층에 포함시키는 표준 조건, 또는 (2) 중층에 펩타이드를 포함시키지 않는 조건.
F3은 인플루엔자 A 바이러스의 A/WSN/33(H1N1) 및 A/Udorn/72(H3N2) 아형을 이용하여 수행한 마딘-다비 개 신장(Madin-Darby Canine Kidney)("MDCK") 세포 플라크 분석을 통해 인플루엔자 A 바이러스의 다수 아형의 억제에 대해 평가했다. 50μM에서 2.5μM까지의 희석률의 F3 및 무작위로 뒤섞인 대조용 펩타이드(서열번호 14)를 이들이 바이러스 감염력에 미치는 효과를 평가하는데 사용했다. F3 및 대조용 펩타이드의 6가지 희석물을 H1N1 바이러스 아형에 대해 시험하고, 각 펩타이드의 다른 6가지 희석물을 H3N2 바이러스 아형에 대해 시험했다.
조건 (1) 하에서, F3은 H1N1 및 H3N2 인플루엔자 A 바이러스의 여러 다른 주에 의한 정상 크기의 플라크 형성을 억제했고, IC50은 약 100 내지 500 피코몰(pM) 범위였다. 조건 (2) 하에서, 정상 크기 플라크의 억제에 대한 IC50은 F3의 경우 약 10 내지 100 나노몰(nM) 범위였다. 조건 (1)의 낮은 nM 농도(<10nM) 또는 조건 (2)의 낮은 μM(<10μM) 농도에서는 "미니플라크"의 존재가 명백했다.
뒤섞인 대조용 펩타이드는 어떠한 조건 하에서도 인플루엔자 A 바이러스 플라크 형성을 억제하지 않았고, 이는 펩타이드의 아미노산 서열이 중요하며 비특이적 효과가 억제를 나타낼 수 없다는 것을 시사한다.
F3은 또한 낮은 nM 범위(<5nM)의 IC50 하에 시험관내 면역플라크 분석에서 2종의 인플루엔자 B(B/Shanghai/361/2002 및 B/Shanghai/10/2003) 및 재조합 H5N1 인플루엔자 바이러스에 대해 활성을 나타낸다. 이러한 다른 인플루엔자 A 및 B 주의 다양성을 감안하면, F3은 대부분의 인플루엔자 바이러스들에 대해 효과적일 것이다.
H1 아형 인플루엔자 A 바이러스의 FIR은 현재 미국 특허출원 일련번호 10/578,013에 교시된 방법에 의해 H1 HA2 서열(서열번호 17)의 잔기 77 내지 110으로 동정되었다. 또한, 본 명세서에서 플루 억제제-1(F1)로 지칭된 서열번호 4의 아미노산 서열을 보유한 분리된 펩타이드도 플라크 분석에서 H1 및 H3 인플루엔자 A 바이러스 아형 모두에 대해 강력한(피코몰) 항바이러스 활성을 나타낸다. F1의 아미노산 서열은 H1 FIR 서열, 서열번호 17의 잔기 84-102에 부합한다.
본 발명의 펩타이드의 작용 기전을 더 잘 이해하기 위해, 예컨대 바이러스 복제 사이클의 어느 단계가 F3, F1 및 관련 인플루엔자 바이러스 억제성 펩타이드에 의해 억제되는지를 측정하기 위해 다양한 인플루엔자 주를 가지고 연구를 수행했다. 최적의 수의 적혈구와 인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1) 농도에서, F3과 F1은 모두 약 10μM 농도에서 인플루엔자 바이러스 유도성 혈구응집을 억제했다. 최적의 세포 및 바이러스 희석물(둘 모두 1:8)에서, F3은 12.5 내지 6.25μM 사이의 농도에서 혈구응집을 억제했다. 다른 H3 및 H1 주, 즉 H1N1 주 A/New Caledonia/20/99 및 A/WSN/33; 및 H3N2 주 A/California/07/2004, A/New York/55/04 및 A/Udorn/72에 의해서도 유사한 결과가 수득되었다. 이에 반해, 서열번호 14의 아미노산 서열을 보유한 대조용 펩타이드인 뒤섞인 형태의 F3은 어떠한 농도에서도 혈구응집을 억제하지 못했다.
고농도의 바이러스는 혈구응집 억제를 극복할 수 있어, 확률적 기전을 암시한다. 이러한 통상의 바이러스 대 세포 결합 분석법에 의한 결과는 본 발명의 펩타이드가 비리온과 직접 상호작용하여 세포에 대한 결합을 억제한다는 것을 암시한다. 이에 반해, FUZEON® 항-HIV 약물은 단명하는 융합 중간체와 상호작용하고 비리온 구조와는 상호작용하지 않는다(Debnath, 2006; Platt, Durnin, and Kabat, 2005). 천연 비리온 구조와의 직접적인 상호작용은 바이러스 감염력 분석에서 FUZEON® 항-HIV 약물(HIV-1 주에 따라 4 내지 280 nM)에 비해 F3 및 F1의 매우 높은 효력(일반 크기의 플라크에 대해 약 200pM)을 적어도 부분적으로 설명할 수 있다. 앞에서 논한 미니플라크는 비리온에서 HA의 리폴딩(refolding)으로부터 야기될 수 있다.
HA의 리폴딩은 종래에 HA와 상호작용하는 것으로 알려진 인플루엔자 A 바이러스의 소분자 억제제에 노출된 후 일어나는 것으로 시사된 바 있다(Cianci et al., 1999; Luo, Colonno, and Krystal, 1996; Luo et al., 1997). 이러한 진입 억제제 등(Hoffman et al., 1997)은 중요한 치료 표적으로 HA를 확인했을 때인 1990년대 후반에 매우 유의적인 진보였다. 하지만, 이러한 소분자 억제제는 지금까지 인플루엔자 약물로 개발되지 않았는데, 그 이유는 IC50이 낮은 μM 내지 중간 μM 농도 범위로 효능이 비교적 낮기 때문일 것이다. 급증하는 바이러스 진입 억제제 분야에서 전개되는 여론은 소분자 약물이 바이러스 진입 과정 동안 HA와 다른 바이러스 융합 단백질이 일으키는 광대한 단백질 구조 전이 및 다수의 분자간 상호작용을 효과적으로 방해할 수 없다는 것이다.
인플루엔자 바이러스 비리온-세포 융합 과정의 활동 모델은 수십년에 걸친 인플루엔자 바이러스 및 여타 RNA 바이러스에 대한 집중적인 연구로부터 외삽법에 의해 추정될 수 있다. 이러한 모델의 개략적인 표시는 도 5에 도시했다. 일부 관점에서는 이론적이지만, 상기 모델은 약물 개발 표적으로 작용할 수 있는 인플루엔자 A 바이러스 당단백질의 구조적/기능적 모티프의 중요성을 강조할 수 있다. 도 5에서, 패널 A는 시알로지질 또는 시알로단백질로 이루어진 세포 수용체에 대한 인플루엔자 헤마글루티닌 1(HA1) 단백질의 결합을 보여준다. 패널 B는 세포내이입 소포 내로 인플루엔자 비리온의 진입을 도시한 것이다. M2 비로포린으로 알려진 인플루엔자 바이러스 단백질은 pH를 저하시켜 HA2 단백질의 나선형 도메인의 재배열을 유발한다. F3의 아미노산 서열(서열번호 3)에 대응하는 HA2 단백질의 서열은 준안정 "스프링" 서열 옆에 위치한다. 재배열은 HA2 단백질의 융합 펩타이드 부분이 소포 막과 상호작용할 수 있게 한다. 패널 C 및 D는 바이러스와 세포막을 더 가깝게 근접시키는, "리쉬-인 그루브(leash-in groove)" 기전에 의해 "스냅 백(snap back)"하는 HA2를 예시하고 있다. 분명히 하기 위해, HA1 및 시알로수용체는 패널 C 내지 E에서는 보이지 않는다. 패널 C'는 이중층 막과 계면을 형성하는 능력으로 트랙을 형성하는 HA2의 서열이 세포 막과 바이러스 막의 혼합을 도모할 수 있는 대체 기전을 보여준다. 패널 E는 "융합 포어"의 형성 및 바이러스에서 세포로 리보핵단백질 분절의 진입을 보여준다.
생체 동물 연구
페레트는 일반적으로 사람의 인플루엔자 바이러스 감염 모델 중 최상의 모델로 간주되고 있다(Govorkova et al., 2005; Hampson, 2006; Maher and DeStefano, 2004; van Riel et al., 2007). 실제로 인플루엔자 백신 효능에 대한 유럽연합지침서는 구체적으로 페레트 모델에서의 시험을 요구한다. 마우스 및 여타 작은 포유동물은 사람의 인플루엔자 A 바이러스 주에 의해 감염될 수 있으나, 일반적으로 계절성 주인 경우, 새 숙주에 대한 바이러스의 적응을 필요로 한다. 이에 반해, 페레트는 적응 없이도 사람 인플루엔자 A 바이러스의 대부분의 주에 의해 감염될 수 있다. 마우스에 적응된 인플루엔자 A 바이러스의 조직 분포 및 병인은 사람 질환에서 나타나는 것과는 상이하다(Lu et al., 1999). 페레트에서의 인플루엔자 A 바이러스 감염의 병인은 사람에서 관찰되는 것과 매우 유사하다. 페레트가 비내로 실험 접종되었을 때, 상기도에서 바이러스의 국소적 복제가 일어난다. 페레트 기도에서 나타나는 시알산 수용체의 분포는 사람과 유사하다(van Riel et al., 2006; Yen et al., 2007).
페레트는 놀랍게도 플루에 걸린 사람과 유사한 방식으로 활동 감소, 열, 식욕부진, 콧물, 재채기, 호흡곤란, 설사, 결막분비물 및 신경학적 징후를 나타낸다. 페레트와 사람 모두에서 나타나는 주요 병리학적 소견은 호흡기 섬모 상피의 박리 및 침윤성 염증세포에 의한 비강 점막하 조직의 침윤이다. 페레트는 인플루엔자 바이러스에 감염 후 48시간 내에 비측 호흡기 상피의 거의 완전한 파괴를 일으켜 기저막만을 남긴다.
페레트와 사람 인플루엔자의 주요 차이는 질환의 증상이 나타나는 시간 길이다. 페레트는 감염 후 1일 이내에 인플루엔자의 증상을 나타내기 시작하지만, 감염 후 4일까지는 공지된 대부분의 소견(활동 감소, 열, 식욕부진, 콧물, 재채기 등)이 치유되었다. 사람 인플루엔자 A 바이러스의 대부분의 주는 페레트의 하기도를 다양한 정도로 감염시킬 수 있음을 유의해야 한다. 인플루엔자 A 바이러스의 고병원성 주는 사람에서처럼 페레트에서도 상기도로부터 뇌로 또는 하기도로부터 혈행 및 여타 기관으로 확산될 수 있다. 현재 유행하는 조류 인플루엔자 A 바이러스의 H5N1 주는 페레트에서 치명적인 감염을 형성시킬 수 있다(Govorkova et al., 2005; Thiry et al., 2007; Vahlenkamp and Harder, 2006).
초기 시험관내 연구는 A/WSN/33(H1N1), A/PR/8/34(H1N1) 및 A/Udorn/72(H3N2)를 비롯하여, 현재 사람에게 번지고 있는 아형에 대응하는 인플루엔자 A 바이러스의 특성규명이 잘 이루어진 실험 주에 초점을 맞추었다. 펩타이드 F3과 F1은 플라크 감소 분석에서, 실험실 평가가 충분히 이루어지지 않은 H1N1(A/New Caledonia/20/99) 및 H3N2(A/NY/55/04; A/Cal/07/04) 주 임상 분리물을 비롯한 여러 다른 인플루엔자 A 바이러스 주들에 대해 유사한 효능을 나타냈다. 이와 같은 최근의 임상 분리물을 이용한 연구는 현재 사람의 인플루엔자 유발 바이러스를 가지고 치료제의 효능을 증명하는데 중요하다. 중요한 점은, 이러한 주들이 또한 페레트에서 비내 접종 후 페레트의 비갑개 및 폐에서 고역가로 성장하여 페레트에 인플루엔자를 유발시켰다.
모든 연구를 위해, 바이러스 분리물은 표준 절차를 이용하여 닭 발육란(찰스 리버 레보레이토리즈 또는 루이지애나 스테이트 유니버시티 파울트리 사이언시스 디파트먼트에서 입수)에서 증식시켰다. 접종 1일 후 11일된 발육란에서 요막액을 수거하고, 바이러스 풀(pool)의 혈구응집 활성을 칠면조 적혈구(tRBC)(Lampire Laboratories, USA)에 대하여 표준 절차에 따라 조사했다. 양성 혈구응집(>256 HA 유닛) 풀은 전술한 바와 같이 바이러스 플라크 분석으로 적정하고 시험감염 연구에 사용하기 전까지 액체 질소에 보관했다. 펩타이드는 인산염 완충액에 준비하고 완충 용액을 마취한 페레트의 비측 통로로 피펫을 이용하여 직접 적용했다(비내 투여 경로).
시험감염 연구 1
페레트는 바이러스 노출전 2일 동안(-2일 및 -1일) 약 0.3mg/kg 용량의 F3 또는 뒤섞인 펩타이드 대조군(서열번호 14)으로 비내 경로를 통해 1일 1회 또는 1일 2회씩 전처리했다. 마지막 처리 후 12시간째, 감염 용량 조사 연구에서 측정된 최소 감염 용량의 적어도 100배인 약 105 pfu의 H3N2 인플루엔자 A/Cal/07/04 주를 비내 접종하여 동물을 감염시켰다. 바이러스 노출 0일 뿐만 아니라 1일과 2일째에도 약 12시간 후 0.3mg/kg 용량의 펩타이드를 페레트에게 재투여했다. 2일째, 뒤섞인 펩타이드 대조군으로 처리된 모든 페레트는 상당한 호흡곤란(빠르고 앝은 호흡), 고열 및 재채기를 일으켰다. 이에 반해, F3 처리된 동물은 모두 심한 호흡 곤란을 전혀 나타내지 않았고, 일부(1일 2회 사전 용량투여 그룹의 2/5, 1일 1회 사전 용량투여 그룹의 1/6)가 미열과 약간의 매우 가벼운 호흡기 징후를 나타냈다. 3일째, F3으로 처리된 모든 페레트는 인플루엔자의 임상 징후를 전혀 나타내지 않았고, 뒤섞인 펩타이드 대조군으로 처리된 페레트의 50%는 여전히 혼수상태였고, 뒤섞인 펩타이드 대조군 처리된 페레트 100%는 유의적인 콧물을 보였다. 분명하게, F3이 본 초기 시험감염 실험에서 유의적이고 놀랍게 효과적인 치료 이익을 제공했다.
시험감염 연구 2
2차 시험감염 연구에서는 F3 처리 그룹 및 대조용 펩타이드 그룹에 각각 12마리의 페레트를 사용했다. 동물은 약 105 pfu의 인플루엔자 A/Cal/07/04로 감염시켰고; 단 본 연구에서는 사전 바이러스 노출 처리 없이 0일째 바이러스 노출 후 4시간 후에 F3 또는 대조용 펩타이드 0.3mg/kg으로 처리했다. 2일째, 뒤섞인 펩타이드 대조군으로 처리된 12마리 페레트는 모두 유의적인 호흡곤란, 고열 및 재채기를 일으켰다. 이에 반해, F3으로 처리된 동물은 모두 이 시기에 호흡곤란이나 여타 인플루엔자 징후를 전혀 나타내지 않았다. 도 6은 본 생물 연구 기간 동안 두 처리 그룹 모두의 호흡곤란(패널 A), 콧물(패널 B) 및 활동(패널 C)을 모니터하여 수득한, 본 연구 중에 페레트에서 관찰되는 병리 반응을 도시한 것이다.
도 6에 도시된 바와 같이, F3 처리된 동물은 대조군에 비해 상당히 감소된 병리 반응을 보였다. F3 처리된 그룹 중 2마리의 동물만이 가벼운 인플루엔자 징후를 나타냈는데, 이것은 실험 4일째 나타났고 펩타이드 처리 후 2일째 중단되었다. 임상 파라미터 외에, 바이러스 역가, 총체적 병태 및 조직병리학적 분석을 위해 본 연구 기간 동안 매일 코 흡인물 및 폐 조직과 폐외 조직을 수집했다. F3 처리된 동물은 정상적인 폐위를 나타냈다. 이에 반해, 대조군 펩타이드 처리 페레트는 염증의 흔적을 나타냈다. F3 처리 페레트 유래의 조직은 대조용 펩타이드 처리 동물에 비해 분명하게 감소된 병태를 나타냈고, 대조용 펩타이드 처리 페레트는 침윤, 기관지 염증을 인플루엔자 감염의 특징적인 기관지 삼출물과 함께 나타냈다.
인플루엔자 바이러스 핵단백질 유전자에 대한 정량적 RT-PCR 분석 및 보존적 프라이머는 처리 및 감염된 페레트 유래의 조직 균질액 중의 바이러스 게놈 RNA 수준에 대한 신뢰할 수 있는 분석을 제공한다. 연구 기간 동안 동물로부터 코 흡인물 샘플을 수집했다. 이 샘플들의 바이러스 역가는 도 7 패널 A에 도시했다. 본 연구의 1일째 뇌, 기관, 간, 비장에서 취한 페레트 조직 균질액 및 혈액의 분석 결과는 도 7의 패널 B에 도시했다. 패널 A의 데이터는 인플루엔자 바이러스 피크 역가가 페레트 비측 세척물에서는 2.0 log10 이상 감소하고 폐에서는 6.0 log10 이상 감소했음을 입증했다. 이러한 결과는 F3이 페레트의 상부 호흡기 관에서 인플루엔자 바이러스의 복제를 유의적으로 감소시킨다는 것을 시사한다. 패널 B의 데이터는 F3이 하부 호흡기 관 및 여타 기관에서도 역시 바이러스 확산을 효과적으로 차단했음을 시사한다.
인플루엔자 FIR 의 동정
인플루엔자 바이러스의 FIR의 카르복시 말단은 윔리-화이트 계면 친수도 플롯에서 양의 증가성 계면 소수성을 나타내는, N-나선의 카르복시 말단을 지나 발견되는 제1 펩타이드 서열 바로 전 잔기로 정의될 수 있다(잔기 104). 이하 표 3은 1996년에 윔리와 화이트에 의해 설명된 막 계면에 있는 단백질들의 윔리-화이트 계면 소수성 스케일을 나타낸다. 이러한 소수성 또는 친수도 스케일은 펩타이드 잔기가 소수성 막 이중층 계면으로부터 수성 상으로 이동하는데 요구되는 자유 에너지 변화를 기반으로 한다. 이러한 스케일에서 양의 자유 에너지(△G)(kcal/mol)는 더 큰 소수성 잔기임을 시사한다(즉, 소수성 잔기를 소수성 막에서 물로 이동시키기 위해서는 에너지가 추가되어야 한다). 이와 마찬가지로, 음의 자유 에너지는 더 큰 친수성 잔기임을 시사한다.
윔리-화이트 계면 소수성 플롯에서, FIR은 친수도 피크 영역(즉, 소수성의 두 국소 최소값 사이에 위치한 소수성의 국소 최대값을 포함하는 상대적으로 더 큰 소수성 영역)으로 특성 규명되어 있다. 이러한 피크 영역은 HA2 단백질의 N-나선에서 시작하고 N-나선을 지나 약 15 잔기 내에서 끝난다.
Figure pat00005
웹사이트 blanco.biomol.uci.edu/mpex에서 이용할 있는 Membrane Protein Explorer(MPEx)와 같은 컴퓨터 프로그램은 단백질이나 폴리펩타이드의 계면 친수성 프로파일을 계산하는데 사용할 수 있다. MPEx 프로그램은 윔리-화이트 친수도 스케일을 포함하여, 펩타이드 서열의 계면 소수성 정도를 알아내는 바람직한 방법이다. MPEx 컴퓨터 프로그램은 도 2에 제시된 13개의 서열분석된 HA2 변형체 각각에서 FIR의 카르복시 말단을 특성규명하는 것을 도와주기 위해 사용되었다. MPEx 컴퓨터 프로그램은 고정된 수의 연속 아미노산 잔기(바람직하게는 약 19 잔기)로 이루어진 윈도우 중의 모든 잔기들의 전체 잔기 친수도 값을 평균을 내고, 이 윈도우 내의 친수도 평균 값을 윈도우 내 중간 잔기의 친수도 스코어로서 플로팅하여 당해 단백질 또는 펩타이드의 윔리-화이트 계면 친수도 스코어를 플로팅한다. 상기 윈도우는 그 다음 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 한 잔기씩 이동시키고, 이 과정을 당해 영역 내의 각 잔기의 친수도 스코어가 측정될 때까지 반복한다.
도 2에 제시된 13개 HA2 아형 모두의 윔리-화이트 계면 친수성 프로파일은 19 아미노산 잔기의 윈도우를 이용하여 MPEx 프로그램으로 밝혀냈다. FIR의 아미노 말단은 계면 친수도가 국소 최소값 후 안정적으로 증가하기 시작하는 단백질의 N-나선 내의 지점(즉, 현재까지 조사된 모든 HA2 단백질의 잔기 77)에서 발견된다. FIR의 카르복시 말단은 N-나선을 지나 소수성의 최초 국소 최소값 바로 전 잔기, 즉 N-나선의 카르복시 말단을 지나 발견되는 양의 증가성 계면 소수성을 나타내는 제1 펩타이드 서열 바로 전 잔기이다. 도 2에 제시된 각 인플루엔자 A HA2 아형에서, N-나선은 잔기 104에서 끝난다. 윔리-화이트 친수도 스코어 플롯은 FIR의 카르복시 말단의 위치를 확인하는데 유용하도록 하기 위해 제로 축 위로 넘어갈 필요는 없으며, 이전 펩타이드 잔기에 비해 친수도 스코어의 증가만이 있으면 된다.
도 8 내지 20은 인플루엔자 A의 HA2 융합 단백질의 13가지 서열분석된 변형체들의 MPEx 윔리-화이트 친수도 프로필을 도시한 것이다(이 도면에서, "A"는 친수도 플롯의 피크로 특성규명된, 펩타이드의 FIR을 나타낸다). FIR의 카르복시 말단은 도 8 내지 20에서 각각 "B"로 표시한 것이다. 이 분석들로부터 FIR의 아미노 말단은 각 바이러스 HA2 아형에서 HA2 서열의 잔기 77에서 시작하는 것으로 측정되었다. FIR의 카르복시 말단은 각 HA2 아형의 잔기 110 내지 119 사이에서 변화되었다. FIR 영역은 도 2에 잔기 77 내지 110 또는 119 둘레에 진한 테두리로 강조된 부분이다.
활성이 향상된 본 발명의 펩타이드는 FIR의 활성 표적 억제제 단백질 부분(예, 서열번호 2)에 비해 더 길거나(HA의 인접 서열에 대응) 또는 절두형인 펩타이드의 중첩 세트를 준비하여 동정할 수 있다. 펩타이드의 아미노 또는 카르복시 말단에서 3 내지 6개의 아미노산으로 표적 HA 아미노산을 연장시킨 펩타이드는 서열의 어느 쪽의 아미노산 분절이 감염력 억제 증가에 기여하는지를 측정하기 위해 일련의 인플루엔자 바이러스에 대해 체계적으로 시험한다. 표적 서열보다 더 긴 펩타이드가 표적보다 낮은 IC50으로 인플루엔자 A 바이러스의 감염력을 억제한다면, 표적보다 추가 아미노산 수가 적은 펩타이드를, 감염력 억제 활성을 가진 최소 펩타이드를 측정하기 위해 체계적으로 시험할 수 있다. 특정 형/또는 아형에 특이적인 활성 펩타이드도 역시 억제 활성의 폭을 측정하기 위해 동일 형 또는 아형의 여러 다른 주들에 대해 시험할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 5를 기반으로 하는 표적 펩타이드는 IC50<100nM로 다수의 H5 아형 바이러스를 억제해야 한다.
시험에 적합한 다른 펩타이드 변형체는 표적 서열의 잔기를 알라닌 잔기로 체계적으로 변경시켜 결정할 수 있다(이하, "알라닌 스캐닝"이라 칭함). 알라닌 변형 펩타이드와 야생형 펩타이드의 비교는 융합/감염력 억제에 중요한 잔기를 동정해준다. 하나보다 많은 아미노산이 억제에 영향을 미친다면, 각 유효 잔기에 변경을 가진 추가 펩타이드를 합성할 수 있다.
본 발명의 펩타이드(예컨대, 서열번호 3에서 서열번호 13까지)에 의해 추정적으로 표적화된 기능성 도메인은 알파 나선 형태이다. 나선성을 증가시키거나 붕괴시키는 펩타이드 변형은 인플루엔자 A 바이러스 융합/감염력 억제제로서 펩타이드의 활성을 변경시킬 수 있다. 따라서, 활성 펩타이드의 변형체 또는 유사체는 나선 함량에 유리한 아미노산, 예컨대 아미노부티레이트(AIB) 또는 글루탐산을 다른 아미노산 대신 사용하여 제조할 수 있다. 이와 마찬가지로, 펩타이드에 프롤린 또는 글리신의 첨가는 알파-나선 함량을 저하시킬 수 있고, 이는 유익하게도 억제 활성을 향상시키거나 감소시킬 것이다. 또한, 조합 라이브러리의 스크리닝에 의해 동정된 HA2에 대한 결합 증가를 나타내는 추가 펩타이드 유사체도 인플루엔자 바이러스 감염력 억제에 대하여 시험할 수 있다.
비강 또는 폐 내의 펩티다제는 생체내 기준 치료제의 유용성을 제한할 가능성이 있다. 플라크 감소 분석에서 활성인 펩타이드 변형체가 호흡기 조직에서 분해되거나 빠르게 제거된다면 펩타이드 안정성 및 유지성을 증가시키기 위해 추가 변형이 수행될 수 있다. 건조 분말 또는 제형에 대한 변경/첨가는 펩타이드의 안정성을 향상시킬 수 있다. 이황화 폐환된 펩타이드를 제공하기 위해 2개 이상의 시스테인이 첨가된 폐환된 펩타이드 유사체는 2차 구조를 안정화시킬 수 있고 분해에 더욱 내성적인 펩타이드를 제조할 수 있다. 또한, 프롤린과 2 이상의 잔기의 치환은 합성 펩타이드의 안정성을 크게 증가시킬 수 있다. 단백질(예, 혈청 알부민) 또는 지질(예, 미리스트산)과의 다양한 아미노- 또는 카르복시 말단 변형 또는 접합도 역시, 펩티다제 절단 부위에 비천연 아미노산(하이드록시프롤린 또는 D-아미노산)의 도입시와 마찬가지로 바이러스 억제성 펩타이드의 활성의 안정성을 향상시킬 수 있다(Qureshi et al., 1990).
억제성 펩타이드가 수용액 내에 낮은 용해성을 나타내는 경우에, 이 펩타이드의 용해성을 증가시키기 위해 카르복시 말단에 서열 변형 ASKSKSK(서열번호 15)가 부가되도록 펩타이드 변형체를 합성할 수 있다. 이 서열은 2차 구조를 보존하면서 모델 펩타이드의 용해성을 증가시키는 것으로 확인되었다. 용해성 증가는 또한 인플루엔자 바이러스 외피 매개의 융합을 억제하는데 필요한 농도를 저하시킬 수 있다.
보존적 잔기 서열
고도로 보존적인 서열 YNAELL(서열번호 1)은 13개의 서열분석된 HA2 아형 중 11개의 FIR 내에 존재하고, 서열번호 1에서 하나의 아미노산 치환을 나타내는 대응 서열 YNAKLL(서열번호 16)은 다른 두 아형에서 나타나는 것으로 관찰되었다. 13개의 서열분석된 HA2 변형체 중에 단 하나의 다른 서열은 YNAELL(서열번호 1)보다 더 많이 보존적이다. 서열 AIAGFIE(서열번호 31, 전체 길이 단백질의 잔기 5 내지 11)는 HA2 단백질의 융합 펩타이드 FP 내에 존재한다. FP 도메인은 종래 공지된 클래스 I 바이러스 융합 단백질의 5개 도메인 중 하나이며, FP 도메인은 바이러스 대 세포 융합 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 이미 알려져 있다.
본 발명을 설명하는 문맥(특히 다음 청구의 범위 문맥)에서 단수 표현 용어 및 "상기"와 같은 표현은 별다른 표시가 없거나 문맥상 분명한 모순이 없는 한 단수 및 복수를 모두 포함하는 것으로 간주되어야 한다. "포함하는", "보유하는", "함유하는"이란 표현은 다른 언급이 없는 한 개방식 표현(즉, "포함하지만, 이에 국한되지 않는")으로 간주되어야 한다. 본 명세서에서 수치 범위의 언급은 단지 본 명세서에 다른 표시가 없는 한 그 범위 내에 속하는 각각의 별도의 수치를 개별적으로 언급하는 속기 방법으로 사용되는 것이며, 각각의 별도의 수치는 각각 언급되었지라도 본 명세서에 포함되어 있는 것이다. 본 명세서에 설명된 모든 방법은 본 명세서에 다른 표시가 없고 또는 문맥상 분명한 모순이 없는 한, 적당한 임의의 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 모든 임의의 실시예 또는 예시적 용어(예, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 자세히 설명하기 위한 것이며 다른 주장이 없는 한 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 본 명세서 내의 언어들은 모두 권리주장되지 않은 임의의 요소들이 본 발명의 실시에 필수적인 것을 나타내는 것으로 간주되지 않아야 한다.
본 명세서는 본 발명의 바람직한 구체예를 본 발명을 수행하기 위해 본 발명자에게 알려진 최상의 방식을 포함해서 설명하고 있다. 이러한 바람직한 구체예들의 변형은 이전 설명을 통해 당업자에게는 명백해질 수 있다. 본 발명자들는 당업자들이 이러한 적당한 변형을 이용할 수 있을 것으로 생각하며, 본 발명자들은 본 명세서에 구체적으로 설명된 것과 다른 방식으로 본 발명을 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법률이 허용하는 한 후속되는 청구의 범위에 인용된 구성 요소의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 가능한 모든 변형에서 전술한 요소들의 임의의 조합은 다른 표시가 없는 한 또는 문맥상 다른 분명한 모순이 없는 한 본 발명에 포함된다.
[참고문헌]
하기 참고문헌은 전문이 각각 참조로서 포함된다.
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A/H3 HA2 <223> Synthetic peptide <400> 14 Ser Trp Leu Val Asn Lys Ile Tyr Leu Thr Asp Asp Glu Val Glu Leu 1 5 10 15 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 15 Thr Arg Asp Ser Leu Thr Glu Ile Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu 1 5 10 15 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <223> Residues 94-99 of influenza A/H13 and A/H16 hemagglutinin 2 <400> 16 Tyr Asn Ala Lys Leu Leu 1 5 <210> 17 <211> 222 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <223> Influenza A/H1 hemagglutinin 2 <400> 17 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly 1 5 10 15 Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser 20 25 30 Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile 35 40 45 Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr 50 55 60 Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu Glu Lys Arg Met Glu Asn Leu 65 70 75 80 Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala 85 90 95 Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp 100 105 110 Leu Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn 115 120 125 Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys 130 135 140 Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro 145 150 155 160 Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val 165 170 175 Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr 180 185 190 Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe 195 200 205 Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 210 215 220 <210> 18 <211> 222 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <223> Influenza A/H2 hemagglutinin 2 <400> 18 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly 1 5 10 15 Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Asp Gln Gly Ser 20 25 30 Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Phe Asp Gly Ile 35 40 45 Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu 50 55 60 Ala Val Gly Lys Glu Phe Ser Asn Leu Glu Arg Arg Leu Glu Asn Leu 65 70 75 80 Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala 85 90 95 Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp 100 105 110 Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Met Gln Leu Arg Asp 115 120 125 Asn Val Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys 130 135 140 Asp Asp Glu Cys Met Asn Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro 145 150 155 160 Lys Tyr Glu Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Asn Glu Ile Lys Gly Val 165 170 175 Lys Leu Ser Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ala Thr 180 185 190 Val Ala Gly Ser Leu Ser Leu Ala Ile Met Met Ala Gly Ile Ser Phe 195 200 205 Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 210 215 220 <210> 19 <211> 221 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <223> Influenza A/H3 hemagglutinin 2 <400> 19 Gly Leu Phe Ser Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr 20 25 30 Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile 35 40 45 Asn Gly Lys Leu Asn Arg Val Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His 50 55 60 Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu 65 70 75 80 Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala 85 90 95 Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp 100 105 110 Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Arg Arg Gln Leu Arg Glu 115 120 125 Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys 130 135 140 Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp 145 150 155 160 Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val 165 170 175 Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala 180 185 190 Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp 195 200 205 Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile 210 215 220 <210> 20 <211> 221 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <223> Influenza A/H4 hemagglutinin 2 <400> 20 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Gln Gly 1 5 10 15 Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ala Glu Gly Thr 20 25 30 Gly Thr Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Thr 35 40 45 Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Tyr His 50 55 60 Gln Ile Glu Lys Glu Phe Glu Gln Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu 65 70 75 80 Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala 85 90 95 Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Val Thr Asp 100 105 110 Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Arg Val Arg Arg Gln Leu Arg Glu 115 120 125 Asn Ala Glu Asp Lys Gly Asn Gly Cys Phe Glu Ile Phe His Gln Cys 130 135 140 Asp Asn Ser Cys Ile Glu Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp 145 150 155 160 Ile Tyr Arg Asp Glu Ala Ile Asn Asn Arg Phe Gln Ile Gln Gly Asp 165 170 175 Lys Leu Thr Gln Gly Tyr Lys Asp Ile Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ser 180 185 190 Ile Ser Cys Phe Leu Leu Val Ala Leu Leu Leu Ala Phe Ile Leu Trp 195 200 205 Ala Cys Gln Asn Gly Asn Ile Arg Cys Gln Ile Cys Ile 210 215 220 <210> 21 <211> 219 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <223> Influenza A/H5 hemagglutinin 2 <400> 21 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly 1 5 10 15 Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser 20 25 30 Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val 35 40 45 Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu 50 55 60 Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu 65 70 75 80 Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala 85 90 95 Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp 100 105 110 Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp 115 120 125 Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys 130 135 140 Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro 145 150 155 160 Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Asn Gly Val 165 170 175 Lys Leu Glu Ser Ile Gly Ile Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr 180 185 190 Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu 195 200 205 Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg 210 215 <210> 22 <211> 222 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <223> Influenza A/H6 hemagglutinin 2 <400> 22 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly 1 5 10 15 Leu Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Glu Asn Ser Gln Gly Ser 20 25 30 Gly Tyr Ala Ala Asp Arg Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Ile 35 40 45 Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu 50 55 60 Ala Val Asp His Glu Phe Ser Asn Leu Glu Arg Arg Ile Asp Asn Met 65 70 75 80 Asn Lys Arg Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala 85 90 95 Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Leu His Asp 100 105 110 Ala Asn Val Lys Ser Leu His Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Arg Asp 115 120 125 Asn Ala Asn Asp Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Trp His Lys Cys 130 135 140 Asp Asn Glu Cys Ile Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro 145 150 155 160 Lys Tyr His Asp Glu Ser Lys Leu Asn Arg Gln Lys Ile Glu Ser Val 165 170 175 Lys Leu Glu Asn Leu Gly Val Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr 180 185 190 Val Ser Ser Ser Leu Val Leu Val Gly Leu Ile Ile Ala Met Gly Leu 195 200 205 Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Met Gln Cys Arg Ile Cys Ile 210 215 220 <210> 23 <211> 221 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <223> Influenza A/H7 hemagglutinin 2 <400> 23 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ala Gln Gly Glu 20 25 30 Gly Thr Ala Ala Asp Tyr Lys Ser Thr Gln Ser Ala Ile Asp Gln Val 35 40 45 Thr Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Gln Gln Phe Lys 50 55 60 Leu Ile Asp Asn Glu Phe Thr Glu Val Glu Lys Gln Ile Gly Asn Val 65 70 75 80 Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Met Thr Glu Val Trp Ser Tyr Asn Ala 85 90 95 Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Ala Asp 100 105 110 Ser Glu Met Asn Lys Leu Tyr Glu Arg Val Lys Arg Gln Leu Arg Glu 115 120 125 Asn Ala Glu Glu Asp Gly Thr Gly Cys Phe Glu Ile Phe His Lys Cys 130 135 140 Asp Asp Asp Cys Met Ala Ser Ile Arg Asn Asn Thr Tyr Asp His Ser 145 150 155 160 Lys Tyr Arg Glu Glu Ala Met Gln Asn Arg Ile Gln Ile Asp Pro Val 165 170 175 Lys Leu Ser Ser Gly Tyr Lys Asp Val Ile Leu Trp Phe Ser Phe Gly 180 185 190 Ala Ser Cys Phe Ile Leu Leu Ala Ile Ala Met Gly Leu Val Phe Ile 195 200 205 Cys Val Lys Asn Gly Asn Met Arg Cys Thr Ile Cys Ile 210 215 220 <210> 24 <211> 222 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <223> Influenza A/H9 hemagglutinin 2 <400> 24 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Ser Gly 1 5 10 15 Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln Gly Val 20 25 30 Gly Met Ala Ala Asp Arg Asp Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Lys Ile 35 40 45 Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Val Asp Lys Met Asn Lys Gln Tyr Glu 50 55 60 Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Val Glu Thr Arg Leu Asn Met Ile 65 70 75 80 Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr Asn Ala 85 90 95 Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Glu His Asp 100 105 110 Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu Gly Ser 115 120 125 Asn Ala Val Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His Lys Cys 130 135 140 Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn Arg Arg 145 150 155 160 Lys Tyr Lys Glu Glu Ser Arg Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu Gly Val 165 170 175 Lys Leu Glu Ser Glu Gly Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Ser Thr 180 185 190 Val Ala Ser Ser Leu Val Ile Ala Met Gly Phe Ala Ala Phe Leu Phe 195 200 205 Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser Cys Arg Cys Asn Ile Cys Ile 210 215 220 <210> 25 <211> 221 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <223> Influenza A/H10 hemagglutinin 2 <400> 25 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ala Gln Gly Thr 20 25 30 Gly Gln Ala Ala Asp Tyr Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile 35 40 45 Thr Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Thr Glu Phe Glu 50 55 60 Ser Ile Glu Ser Glu Phe Ser Glu Thr Glu His Gln Ile Gly Asn Val 65 70 75 80 Ile Asn Trp Thr Lys Asp Ser Ile Thr Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala 85 90 95 Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Met Ala Asp 100 105 110 Ser Glu Met Leu Asn Leu Tyr Glu Arg Val Arg Lys Gln Leu Arg Gln 115 120 125 Asn Ala Glu Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Ile Tyr His Thr Cys 130 135 140 Asp Asp Ser Cys Met Glu Ser Ile Arg Asn Asn Thr Tyr Asp His Ser 145 150 155 160 Gln Tyr Arg Glu Glu Ala Leu Leu Asn Arg Leu Asn Ile Asn Pro Val 165 170 175 Lys Leu Ser Ser Gly Tyr Lys Asp Ile Ile Leu Trp Phe Ser Phe Gly 180 185 190 Glu Ser Cys Phe Val Leu Leu Ala Val Val Met Gly Leu Val Phe Phe 195 200 205 Cys Leu Lys Asn Gly Asn Met Arg Cys Thr Ile Cys Ile 210 215 220 <210> 26 <211> 223 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <223> Influenza A/H13 hemagglutinin 2 <400> 26 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Pro Gly 1 5 10 15 Leu Ile Asn Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Gln Asn Glu Gln Gly Thr 20 25 30 Gly Ile Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gln Ile 35 40 45 Thr Thr Lys Ile Asn Asn Ile Ile Asp Lys Met Asn Gly Asn Tyr Asp 50 55 60 Ser Ile Arg Gly Glu Phe Asn Gln Val Glu Lys Arg Ile Asn Met Leu 65 70 75 80 Ala Asp Arg Ile Asp Asp Ala Val Thr Asp Ile Trp Ser Tyr Asn Ala 85 90 95 Lys Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Asp Lys Thr Leu Asp Met His Asp 100 105 110 Ala Asn Val Lys Asn Leu His Glu Gln Val Arg Arg Glu Leu Lys Asp 115 120 125 Asn Ala Ile Asp Glu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Leu Leu His Lys Cys 130 135 140 Asn Asp Ser Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Thr 145 150 155 160 Glu Tyr Ala Glu Glu Ser Lys Leu Lys Arg Gln Glu Ile Asp Gly Ile 165 170 175 Lys Leu Lys Ser Glu Asp Asn Val Tyr Lys Ala Leu Ser Ile Tyr Ser 180 185 190 Cys Ile Ala Ser Ser Val Val Leu Val Gly Leu Ile Leu Ser Phe Ile 195 200 205 Met Trp Ala Cys Ser Ser Gly Asn Cys Arg Phe Asn Val Cys Ile 210 215 220 <210> 27 <211> 221 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <223> Influenza A/H14 hemagglutinin 2 <400> 27 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Gln Gly 1 5 10 15 Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ala Glu Gly Thr 20 25 30 Gly Thr Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile 35 40 45 Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Tyr His 50 55 60 Gln Ile Glu Lys Glu Phe Glu Gln Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu 65 70 75 80 Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala 85 90 95 Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Val Thr Asp 100 105 110 Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Arg Val Arg Arg Gln Leu Arg Glu 115 120 125 Asn Ala Glu Asp Gln Gly Asn Gly Cys Phe Glu Ile Phe His Gln Cys 130 135 140 Asp Asn Asn Cys Ile Glu Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asn 145 150 155 160 Ile Tyr Arg Asp Glu Ala Ile Asn Asn Arg Ile Lys Ile Asn Pro Val 165 170 175 Thr Leu Thr Met Gly Tyr Lys Asp Ile Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ser 180 185 190 Met Ser Cys Phe Val Phe Val Ala Leu Ile Leu Gly Phe Val Leu Trp 195 200 205 Ala Cys Gln Asn Gly Asn Ile Arg Cys Gln Ile Cys Ile 210 215 220 <210> 28 <211> 221 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <223> Influenza A/H15 hemagglutinin 2 <400> 28 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ala Gln Gly Gln 20 25 30 Gly Thr Ala Ala Asp Tyr Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile 35 40 45 Thr Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Lys Gln Phe Glu 50 55 60 Leu Ile Asp Asn Glu Phe Thr Glu Val Glu Gln Gln Ile Gly Asn Val 65 70 75 80 Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Leu Thr Glu Ile Trp Ser Tyr Asn Ala 85 90 95 Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Ala Asp 100 105 110 Ser Glu Met Asn Lys Leu Tyr Glu Arg Val Arg Arg Gln Leu Arg Glu 115 120 125 Asn Ala Glu Glu Asp Gly Thr Gly Cys Phe Glu Ile Phe His Arg Cys 130 135 140 Asp Asp Gln Cys Met Glu Ser Ile Arg Asn Asn Thr Tyr Asn His Thr 145 150 155 160 Glu Tyr Arg Gln Glu Ala Leu Gln Asn Arg Ile Met Ile Asn Pro Val 165 170 175 Lys Leu Ser Ser Gly Tyr Lys Asp Val Ile Leu Trp Phe Ser Phe Gly 180 185 190 Ala Ser Cys Val Met Leu Leu Ala Ile Ala Met Gly Leu Ile Phe Met 195 200 205 Cys Val Lys Asn Gly Asn Leu Arg Cys Thr Ile Cys Ile 210 215 220 <210> 29 <211> 223 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <223> Influenza A/H16 hemagglutinin 2 <400> 29 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Pro Gly 1 5 10 15 Leu Ile Asn Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Gln Asn Glu Gln Gly Thr 20 25 30 Gly Ile Ala Ala Asp Lys Ala Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Glu Ile 35 40 45 Thr Thr Lys Ile Asn Asn Ile Ile Glu Lys Met Asn Gly Asn Tyr Asp 50 55 60 Ser Ile Arg Gly Glu Phe Asn Gln Val Glu Lys Arg Ile Asn Met Leu 65 70 75 80 Ala Asp Arg Val Asp Asp Ala Val Thr Asp Ile Trp Ser Tyr Asn Ala 85 90 95 Lys Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gly Arg Thr Leu Asp Leu His Asp 100 105 110 Ala Asn Val Arg Asn Leu His Asp Gln Val Lys Arg Ile Leu Lys Ser 115 120 125 Asn Ala Ile Asp Glu Gly Asp Gly Cys Phe Asn Leu Leu His Lys Cys 130 135 140 Asn Asp Ser Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn His Glu 145 150 155 160 Asp Tyr Arg Glu Glu Ser Gln Leu Lys Arg Gln Glu Ile Glu Gly Ile 165 170 175 Lys Leu Lys Ser Glu Asp Asn Val Tyr Lys Val Leu Ser Ile Tyr Ser 180 185 190 Cys Ile Ala Ser Ser Ile Val Leu Val Gly Leu Ile Leu Ala Phe Ile 195 200 205 Met Trp Ala Cys Ser Asn Gly Asn Cys Arg Phe Asn Val Cys Ile 210 215 220 <210> 30 <211> 223 <212> PRT <213> Influenza B virus <220> <223> Influenza B hemagglutinin 2 <400> 30 Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Met Ile Ala Gly Trp His Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val 20 25 30 Ala Val Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile Asn Lys Ile 35 40 45 Thr Lys Asn Leu Asn Ser Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gln 50 55 60 Arg Leu Ser Gly Ala Met Asp Glu Leu His Asn Glu Ile Leu Glu Leu 65 70 75 80 Asp Glu Lys Val Asp Asp Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gln Ile 85 90 95 Glu Leu Ala Val Leu Leu Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp 100 105 110 Glu His Leu Leu Ala Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro 115 120 125 Ser Ala Val Asp Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys 130 135 140 Asn Gln Thr Cys Leu Asp Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala Gly 145 150 155 160 Glu Phe Ser Leu Pro Thr Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala Ser 165 170 175 Leu Asn Asp Asp Gly Leu Asp Asn His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr Ser 180 185 190 Thr Ala Ala Ser Ser Leu Ala Val Thr Leu Met Ile Ala Ile Phe Ile 195 200 205 Val Tyr Met Val Ser Arg Asp Asn Val Ser Cys Ser Ile Cys Leu 210 215 220 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Influenza A Virus <220> <223> Residues 5-11 of hemagglutinin 2 from influenza A subtypes: H1-H7, H9, H10, and H13-H16 <400> 31 Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu 1 5

Claims (16)

  1. 선택된 야생형 인플루엔자 헤마글루티닌 2 단백질 일부의 8 내지 40개 연속 아미노산 잔기로 이루어지는 분리된 펩타이드 또는 이의 변형체로서, 상기 선택된 헤마글루티닌 2 단백질 일부가 단백질의 융합 개시 영역(FIR) 및 FIR의 아미노-말단 및 카르복시-말단 측에 있는 5개 이하의 아미노산 잔기를 포함하고 적어도 서열 YNAELL(서열번호 1)을 포함하거나 Y1S, Y1T, Y1W, Y1A, N2Q, A3L, A3I, A3V, E4D, E4K, E4R, E4H, L5I, L5V, L5A, L6I, L6V 및 L6A로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 서열번호 1과 상이한 변형체를 포함하며;
    상기 FIR의 아미노산 서열은 단백질의 N-나선에 있는 대략 잔기 77에서 시작하고 선택된 야생형 헤마글루티닌 2 단백질의 잔기 110 내지 잔기 119 범위에 있는 잔기에서 끝나는 상기 선택된 야생형 헤마글루티닌 2(HA2) 단백질 일부를 포함하고, FIR의 카르복시 말단은 야생형 서열의 잔기 104를 지나 윔리-화이트(Wimley-White) 계면 소수성을 증가시키는 영역을 시작하는 제1 잔기의 바로 전 잔기이며;
    상기 변형체는 선택된 야생형 단백질 일부의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 선택된 야생형 단백질과 상이하고; 이러한 치환은 다른 야생형 인플루엔자 HA2 단백질의 대응 아미노산 잔기 중에서 선택되며, 바람직하게는 적어도 하나의 야생형 HA2 단백질의 대응 영역의 윔리-화이트 계면 친수도 프로필의 국소 최대치 및 국소 최소치의 약 5개 아미노산 잔기 내에 국소 최대치 및 국소 최소치를 보유하는 변형체의 윔리-화이트 계면 친수도 프로필을 유지하도록 선택되는, 선택된 야생형 인플루엔자 헤마글루티닌 2 단백질 일부의 8 내지 40개 연속 아미노산 잔기로 이루어지는 분리된 펩타이드 또는 이의 변형체.
  2. 제1항에 있어서, 야생형 인플루엔자 헤마글루티닌 2 단백질이 A형 인플루엔자 HA2 아형 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H9, H10, H13, H14, H15 및 H16으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 분리된 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 야생형 인플루엔자 헤마글루티닌 2 단백질이 B형 인플루엔자 HA2 단백질인, 분리된 펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 헤마글루티닌 2 단백질의 일부가 선택된 야생형 HA2 단백질의 잔기 72 내지 113으로 이루어지는, 분리된 펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드가 서열번호 2(EVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDS)의 8 내지 40개의 연속 아미노산 잔기 또는 이의 변형체로 이루어지고, 상기 변형체는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 서열번호 2와 상이하며;
    상기 펩타이드가 적어도 서열번호 2의 아미노산 잔기 23 내지 28 또는 이의 변형체를 포함하고, 상기 하나 이상의 아미노산 잔기 치환이 E1D, E1N, E1Q, V2G, V2S, V2T, V2I, V2L, V2A, V2M, V2C, E3D, E3N, E3Q, G4T, G4S, G4K, G4R, G4H, G4Q, G4N, R5K, R5H, R5Q, R5N, I6L, I6V, I6A, I6M, I6C, Q7N, Q7E, Q7D, Q7G, Q7S, Q7T, D8E, D8N, D8Q, D8M, D8C, L9I, L9V, L9A, L9M, L9C, E10D, E10N, E10Q, E10I, E10L, E10V, E10A, E10M, E10C, K11R, K11H, K11D, K11E, K11N, K11Q, Y12W, Y12K, Y12R, Y12H, V13I, V13L, V13A, V13G, V13T, V13S, V13M, V13C, E14D, E14K, E14R, E14H, D15E, D15R, D15N, D15Q, T16G, T16S, T16A, T16Q, T16N, K17F, K17R, K17M, K17C, K17I, K17V, K17L, K17A, I18L, I18V, I18A, I18T, I18S, I18G, I18Q, I18N, D19E, D19N, D19Q, L20I, L20V, L20A, L20C, L20M, W21Y, W21A, S22T, S22G, S22A, S22M, S22C, Y23W, Y23S, Y23T, Y23A, N24Q, N24D, N24E, A25I, A25V, A25L, A25M, E26D, E26K, E26R, E26H, L27A, L27I, L27V, L27M, L28I, L28V, L28A, L28M, V29I, V29L, V29A, V29M, A30I, A30L, A30V, A30M, A30C, L31I, L31V, L31A, L31M, L31C, E32D, E32N, E32Q, N33Q, N33Q, Q34E, N33E, Q34E, Q34D, Q34G, Q34S, Q34T, H35K, H35R, H35N, H35Q, T36S, T36G, I37L, I37V, I37A, I37M, I37C, D38E, D38N, D38Q, L39F, L39I, L39V, L39M, L39C, L39A, L39E, L39D, L39N, L39Q, T40H, T40R, T40K, T40S, T40G, T40A, T40M, D41E, D41N, D41Q, S42G, S42T, S42I, S42L, S42V, S42A, S42M 및 S42C로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 분리된 펩타이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 변형체가 서열번호 2와 적어도 50%의 서열 동일성을 공유하는, 분리된 펩타이드.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 변형체가 서열번호 2와 적어도 60%의 서열 동일성을 공유하는, 분리된 펩타이드.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 변형체가 서열번호 2와 적어도 70%의 서열 동일성을 공유하는, 분리된 펩타이드.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 변형체가 서열번호 2와 적어도 80%의 서열 동일성을 공유하는, 분리된 펩타이드.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2의 변형체가 E26K 치환을 포함하는, 분리된 펩타이드.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드가 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 펩타이드.
  12. 다음의 변형 중 적어도 하나를 포함하는, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드의 유사체:
    (a) 이황화 가교를 형성하는 적어도 2개의 시스테인 잔기를 포함하고, 각 시스테인 잔기가 독립적으로 펩타이드 잔기, 펩타이드의 아미노-말단에 결합된 잔기 또는 펩타이드의 카르복시-말단에 결합된 잔기인 사이클릭 펩타이드 구조;
    (b) 펩타이드의 펩티다제 절단 부위에 비천연 아미노산 잔기의 치환;
    (c) 펩타이드 서열 내의 잔기를 대체하는 하나 이상의 프롤린 잔기; 또는
    (d) 펩타이드 서열 내의 잔기를 대체하는 하나 이상의 글리신 잔기.
  13. 제12항에 있어서, 비천연 아미노산 잔기가 D-아미노산인 유사체.
  14. 펩타이드에 결합된 비-HA2 유래의 그룹을 포함하는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드 또는 유사체의 유도체.
  15. 제14항에 있어서, 비-HA2 유래의 그룹이
    (a) 펩타이드 잔기에 결합된 지질;
    (b) 펩타이드 잔기에 결합된 폴리에틸렌 글리콜 그룹; 또는
    (c) 펩타이드의 아미노-말단, 카르복시-말단 또는 양 말단에 결합된 비-HA2 펩타이드 서열
    중에서 적어도 하나의 그룹을 포함하는 유도체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드, 유사체 또는 유도체에 대해 선택적인 분리된 항체.
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