RU2810986C2 - Катионный разветвленный пептид для ингибирования респираторных вирусов - Google Patents
Катионный разветвленный пептид для ингибирования респираторных вирусов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2810986C2 RU2810986C2 RU2022111711A RU2022111711A RU2810986C2 RU 2810986 C2 RU2810986 C2 RU 2810986C2 RU 2022111711 A RU2022111711 A RU 2022111711A RU 2022111711 A RU2022111711 A RU 2022111711A RU 2810986 C2 RU2810986 C2 RU 2810986C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peptide
- virus
- peptides
- rsv
- cells
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 164
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title abstract description 58
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 title abstract description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 title description 16
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 title description 6
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 claims abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims abstract description 18
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract description 5
- 206010062106 Respiratory tract infection viral Diseases 0.000 claims abstract description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims abstract description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims abstract description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims abstract description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 28
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 abstract description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 18
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 13
- 108010044762 nucleolin Proteins 0.000 abstract description 12
- 102100021010 Nucleolin Human genes 0.000 abstract description 10
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 9
- 239000003446 ligand Substances 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 9
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 abstract description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 abstract description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 abstract 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 abstract 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 75
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 57
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 38
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 26
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 26
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 24
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 22
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 22
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 19
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 19
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 19
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 11
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 8
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 7
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- KCFYEAOKVJSACF-UHFFFAOYSA-N umifenovir Chemical compound CN1C2=CC(Br)=C(O)C(CN(C)C)=C2C(C(=O)OCC)=C1CSC1=CC=CC=C1 KCFYEAOKVJSACF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960004626 umifenovir Drugs 0.000 description 7
- 230000003253 viricidal effect Effects 0.000 description 7
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 6
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 6
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 241001432884 Orthopneumovirus Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 4
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 4
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 4
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 4
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 4
- UZOFELREXGAFOI-UHFFFAOYSA-N 4-methylpiperidine Chemical compound CC1CCNCC1 UZOFELREXGAFOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010066091 Bronchial Hyperreactivity Diseases 0.000 description 3
- -1 Fmoc amino acids Chemical class 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 description 3
- 108091034135 Vault RNA Proteins 0.000 description 3
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 231100000028 nontoxic concentration Toxicity 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 description 2
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical group [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000036732 histological change Effects 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 231100000682 maximum tolerated dose Toxicity 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 2
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 2
- VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 1,2-ethanedithiol Chemical compound SCCS VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014133 Antimicrobial Cationic Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010050820 Antimicrobial Cationic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 208000009079 Bronchial Spasm Diseases 0.000 description 1
- 208000014181 Bronchial disease Diseases 0.000 description 1
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 1
- 206010006482 Bronchospasm Diseases 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000000541 Defensins Human genes 0.000 description 1
- 108010002069 Defensins Proteins 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 206010022004 Influenza like illness Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 208000002200 Respiratory Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 101800001838 Serine protease/helicase NS3 Proteins 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000010085 airway hyperresponsiveness Effects 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000003012 bilayer membrane Substances 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 230000036427 bronchial hyperreactivity Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 102000014509 cathelicidin Human genes 0.000 description 1
- 108060001132 cathelicidin Proteins 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 1
- 108091006116 chimeric peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- NZWOPGCLSHLLPA-UHFFFAOYSA-N methacholine Chemical compound C[N+](C)(C)CC(C)OC(C)=O NZWOPGCLSHLLPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002329 methacholine Drugs 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000005543 nano-size silicon particle Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229910021426 porous silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004202 respiratory function Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229960000329 ribavirin Drugs 0.000 description 1
- HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N ribavirin Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1N=CN=C1 HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N veratrole Chemical compound COC1=CC=CC=C1OC ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007501 viral attachment Effects 0.000 description 1
- 230000007502 viral entry Effects 0.000 description 1
- 229940100050 virazole Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области медицины. Предложено применение способа интраназального введения пептида R4K2KQLLPIVNKQSC для лечения респираторной вирусной инфекции, вызванной респираторно-синцитиальным вирусом или вирусом гриппа, где R - аргинин; K - лизин; Q - глутамин, L - лейцин, Р - пролин, I - изолейцин, V - валин, N - аспарагин, S - серин, С - цистеин. Катионный разветвленный пептид R4K2KQLLPIVNKQSC блокирует вход вируса в клетку как за счет связывания с клеточным рецептором нуклеолином, так и за счет связывания с лигандами (белком F) на поверхности РСВ. 13 ил., 6 табл., 8 пр.
Description
Изобретение относится к области медицины, и может быть использовано создания средства, обладающего противовирусными свойствами в отношении респираторно-синцитиального вируса (РСВ) и вируса гриппа.
Эпидемиологические исследования позволяют утверждать, что среди всех вирусных патогенов именно респираторные вирусы (грипп, респираторно-синцитиальный вирус, риновирусы и т.д.) являются самыми распространенными (более 90% от всех случаев инфекционных заболеваний). Один из самых распространенных вирусных патогенов -респираторно-синцитиальный вирус (РСВ). Он поражает нижние дыхательные пути, что примерно в 40% случаев, сопровождается тяжелым бронхиолитом и пневмонией. Особенно РСВ инфекция опасна для новорожденных, у которых часто приводит к летальному исходу, для лиц с иммунодефицитами и для астматиков [Pretorius и др., 2016]. Несмотря на десятилетия исследований респираторных вирусных инфекций к настоящему моменту не существует эффективных, безопасных и при этом доступных средств лечения и профилактики. Попытки создать профилактическую вакцину оказались неудачными, поэтому в настоящее время для лечения РСВ-инфекции применяется только виразол (рибавирин), однако он вызывает многочисленные побочные эффекты [Janai НK, 1990]. Многие анти-РСВ терапевтические средства еще находятся в разработке [Osminkina и др., 2014; Хаитов и др., 2010]. Препараты на основе моноклональных антител малодоступны ввиду их высокой стоимости.
Один из перспективных подходов к созданию антивирусных средств - это использование природных пептидов. Природные пептиды являются неотъемлемой частью врожденного иммунного ответа с бактерицидными, иммуномодулирующими и противовирусными свойствами. У млекопитающих два основных семейства таких пептидов: дефензины и кателицидины [Gwyer Findlay, Currie, Davidson, 2013].
Основные механизмы противовирусного действия природных пептидов это:
1. блокирование входа вируса в клетку (путем конкурентного ингибирования либо клеточного рецептора, либо лиганда на поверхности вируса),
2. дестабилизация вириона,
3. блокирование репликации вируса,
4. активация противовирусных интерферонов.
О перспективности данного подхода свидетельствует тот факт, что около 15-ти пептид-содержащих антимикробных препаратов проходят клинические исследования [Fjell и др., 2012; Greber, Dawgul, 2017].
Применение природных пептидов в медицинской практике сопряжено с рядом проблем; а именно: процесс выделения пептидов из природных источников затратен, химический синтез крупных (40-50 а.о.) природных пептидов обходится ненамного дешевле, не высокая стабильность - линейные пептиды легко разрушаются протеазами.
Несмотря на вышеуказанные сложности, существуют способы их преодоления. В первую очередь это картирование крупных пептидов и выявление в их структуре биологически-значимой части. Благодаря такому подходу можно добиться снижения размера целевого пептида (с 40-50 до 22-35 а.о.). Во-вторых, это стабилизация структуры пептидов за счет введения точечных аминокислотных замен или дополнительных химических связей. В-третьих, путем дендримеризации пептидов (синтез разветвленных пептидов) можно добиться повышения их стабильности за счет наличия неприродных ε-связей и биологической активности за счет повышения валентности молекулы пептида по отношению к биологическому рецептору, при сокращенном количестве циклов присоединения аминокислот к наращиваемой пептидной цепи.
В данном изобретении мы описываем катионный разветвленный пептид КК-45, который проявляет выраженные антивирусные свойства по отношению к респираторным вирусам (в частности, к РСВ и вирусу гриппа).
Применение пептида в качестве антивирусных средств является перспективным направлением. В международной базе данных представлено множество изобретений в данной области.
В изобретении US9102712 B2 описаны фармацевтические композиции, содержащие активные дендримерные пептиды, которые демонстрируют противомикробные, противогрибковые или противовирусное свойства. Отличие, представленного нами изобретения по сравнению с изобретением, описанным в US9102712 B2, состоит в том, что использована другая химическая формула дендримерного пептида, а также пептиды, описанные в US9102712 B2, предлагается использовать совместно с антибиотиками для синергетического эффекта, а не в качестве индивидуальных соединений.
Изобретение, описанное в ES2365685 A1, представляет собой разветвленные макромолекулы, используемые в качестве противовирусного, антибактериального и противогрибкового средства. Основное отличие от нашего изобретения заключается в том, что данные пептиды, синтезированны из полифенольного ядра, карбосилановой структуры и функционализированны на периферии анионными группами, которые придают макромолекуле отрицательный суммарный заряд и способны связываться с ВИЧ и ВПГ. То же время пептид КК-45 имеет иную химическую структуру, обеспечивающую положительный, а не отрицательный заряд, в водных растворах.
Дендримерные пептиды, описанные в изобретении ES2444490 A1 близки с описанными в патенте ES2365685 A1. Указанные в данном патенте ES2444490 A1 молекулы были синтезированы из поливалентного ядра, в частности полифенольного ядра или ядра атома кремния, были получены в виде сферических дендримеров, так же, тест вирусного ингибирования проводился с анион-связывающим вирусом - ВИЧ-1, что и является главным отличием от нашего изобретения. Еще одним важным отличием пептида КК-45 вот соединение описанных в ES2444490 A1 является отсутствие элемента кремния в структуре.
Новые дендримерные пептидные соединения в патенте US9079937B2, которые проявляют антимикробную активность, могут быть приготовлены в виде фармацевтических соединений и использованы для профилактики и лечения различных заболеваний у млекопитающих, включая человека. Настоящие пептиды особенно ценны, так как их действие быстрое, широкое по спектру и практически не влияет на резистентность, вызываемую стандартными антибиотиками. Основным отличием является спектр действия. В патенте US9079937B2 был описан антибактериальный спектр действия днендримерных соединений, в то время как пептид КК-45 проявляет антивирусный эффект в отношении респираторных вирусов.
Настоящее изобретение ES2255060 T3 относится к противовирусным пептидным агентам и, в частности, оно относится к дендримерам, которые, как было обнаружено, обладают значительной противовирусной активностью против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и других оболочечных вирусов. Отличие от нашего изобретения заключается в том, что дендримерный пептид КК-45 направлен на респираторные вирусы.
Наиболее близким к нашей разработке является изобретение RU2451026C2, где описаны химерные пептиды, способные ингибировать или аттенуировать вирусную инфекцию. Пептиды содержат первичную структуру, которая содержит, по меньшей мере, один сегмент, который замедляет активацию протеазы NS3 вируса семейства Flaviviridae, и сегмент, проникающий в клетку. В заявленном изобретении мишенью является респираторно - синцитиальный вирус, вирус гриппа, которые относятся к роду вирусов из семейства ортомиксовирусов (Orthopneumovirus).
В настоящем изобретении описана разработка катионного разветвленного пептида, который способны ингибировать вирусную инфекцию, вызванную вирусами семейства Orthopneumovirus. Разработанные пептиды характеризуются структурной формулой R4K2KQLLPIVNKQSC, где R - аргинин; K - лизин; Q - глутамин, L - лейцин, Р - пролин, I - изолейцин, V - валин, N - аспарагин, S - серии, С - цистеин.
Средство для профилактики или лечения респираторной вирусной инфекции, вызванной респираторно-синцитиальным вирусом или вирусом гриппа содержит эффективное количество указанного катионного разветвленного пептида.
Средство может быть произведено в лекарственной форме, предназначенной для ингаляционного или интраназального введения введения. В одном из вариантов изобретения твердая лекарственная форма (лиофилизат) растворяется или диспергируется в жидкой среде перед применением и полученная суспензия, эмульсия, или раствор вводится ингаляционно или интраназально. Средство может быть введено на ранней стадии инфекции во время инкубационной фазы, или во время активной инфекции после возникновения симптомов.
Эффективное количество означает количество агента (пептида), которое является достаточным при введении субъекту, страдающему от инфекции с целью лечения, улучшения симптомов, предупреждения и/или отсрочки возникновения инфекции, заболевания. Растворители включают, но не ограничиваются ими, фосфатные буферные растворы, не содержащую пирогенов воду, изотонический солевой раствор.
Технический результат настоящего изобретения состоит в том, что результирующая структура катионного разветвленного пептида специфически связывается с вирионами посредством линейной С-концевой последовательности, а за счет наличия разветвленной структуры на N-конце, стерически препятствует нормальной функции белка F вируса, а именно, нарушает его структурную перестройку из префузионной в постфузионную форму. Полученный синтетический пептид с дендримерной (разветвленной) структурой ингибирует прикрепление вируса семейства Orthopneumovirus к клеткам-мишеням, при этом высокая антивирусная активность пептида, объясняется его способностью конкурентно связываться с рецептором -нуклеолином. Таким образом, полученное средство способно ингибировать вирусную инфекцию, вызванную вирусами семейства Orthopneumovirus, путем комбинированного действия полученного синтетического дендримерного пептида -ингибирования проникновения вируса в клетку и прямого вирулицидного действия -повреждающего действия пептида на оболочку вируса за счет его высокой плотности положительного заряда.
Сущность заявленного изобретения поясняется чертежами.
Краткое описание графических материалов.
Фигура 1. Структура белка F вируса РСВ и структуры изучаемых пептидов. А. Структура белка F вируса РСВ. Белок F разделен на две субъединицы, F1 и F2. В его структуре выделяют следующие участки: FP - пептид слияния для взаимодействия с клеткой; ТМ - трансмембранный домен для закрепления белка F в оболочке РСВ; HR-1 и HR-2 - области, образующие α-спиральную структуру. Домены D1, D2 и D3 образуют основной глобулярный домен. Антигенный ∅-сайт имеет важное значение для процесса слияния вируса с клеткой, его локализация отмечено на схеме.
Б. Структуры изучаемых пептидов. Синим цветом выделена разветвленная (дендримерная) часть пептида, красным цветом выделена линейная часть пептида, имитирующая антигенной ∅-сайт.
Фигура 2. Схема получение дендримерного пептида КК-45.
Фигура 3. Строение и масс-спектр синтезированного пептида КК-45 (+ позитивные заряды на остатках аргинина и лизина, всего 9).
Фигура 4. Цитотоксичность пептидов in vitro в культуре клеток МА-104.
× - статистически значимо отличается от «КК-44» по U-критерию Манна-Уитни. N=10.
* - статистически значимо отличается от «D-12» по U-критерию Манна-Уитни. N=10.
Фигура 5. Вирулицидная активность пептидов.
А - количество синцитиев в 1 мл.
Б - количество синцитиев в %.
* - статистически значимо отличается от «КК-44» по U-критерию Манна-Уитни. N=10.
# - статистически значимо отличается от «D-12» по U-критерию Манна-Уитни. N=10.
х - статистически значимо отличается от «mAb» по U-критерию Манна-Уитни. N=10.
. - статистически значимо отличается от «ФР» по U-критерию Манна-Уитни. N=10.
Фигура 6. Блокирование лигандов на поверхности РСВ.
А - Блокирование лигандов на поверхности РСВ в процентах относительно 0 мг/мл.
Б - Связывание пептидов с РСВ.
* - статистически значимо отличается от «КК-44» по U-критерию Манна-Уитни. N=10.
# - статистически значимо отличается от «D-12» по U-критерию Манна-Уитни. N=10.
х - статистически значимо отличается от «mAb» по U-критерию Манна-Уитни. N=10.
. - статистически значимо отличается от «Heparin» по U-критерию Манна-Уитни. N=10
∧ - статистически значимо отличается от «РСВ» по U-критерию Манна-Уитни. N=10
Фигура 7. Связывание пептидов с нуклеолином.
А - Ингибирование связывания с рецепторами клеток. Количество синцитиев в % относительно 0 мкг/мл.
Б - Связывание пептидов с нуклеолином.
* - статистически значимо отличается от «КК-44» по U-критерию Манна-Уитни. N=10.
# - статистически значимо отличается от «D-12» по U-критерию Манна-Уитни. N=10.
. - статистически значимо отличается от «Гепарин» по U-критерию Манна-Уитни. N=10
∧ - статистически значимо отличается от «Нуклеолин» по U-критерию Манна-Уитни. N=10
Фигура 8. Вирусная нагрузка в легких.
А - Вирусную нагрузку оценивали методом RT-PCR с использованием специфических праймеров и зонда. vRNA - РНК вируса, tRNA - общая РНК.
Б - Вирусная нагрузка в ткани легких методом титрования БАЛ на монослое чувствительных клеток с последующим подсчетом количество синцитиев.
х - статистически значимо отливается от «РСВ/PBS» по U-критерию Манна-Уитни. N=10.
Фигура 9. Клеточный состава БАЛ.
А - Общее количество клеток в 1 мл БАЛ.
Б - Количество макрофагов в 1 мл БАЛ.
В - Количество лимфоцитов в 1 мл БАЛ.
× - статистически значимо отливается от «РСВ/PBS» по U-критерию Манна-Уитни. N=10.
Фигура 10. Гистологическое изменение ткани легких.
А - Площадь перибронхиального инфильтрата измеряемая в пике.
Б - Общее количество клеток в инфильтрате.
В - Толщина стенки бронхов измеряемая в пике.
× - статистически значимо отливается от «РСВ/PBS» по U-критерию Манна-Уитни. N=10.
Фигура 11. Удельная сопротивляемость бронхов.
х - статистически значимо отливается от «РСВ/PBS» по U-критерию Манна-Уитни. N=10.
Фигура 12. Противовирусная активность препарата КК-45 в культуре клеток MDCK (1, 2 и 3 опыты)
Фигура 13. Противовирусная активность препарата КК-45 в культуре клеток MDCK (4 опыт).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Пример 1. Получение пептида, имитирующего фрагмент ∅-сайта (HRA-домена) F-белка вируса РСВ.
Один из подходов к разработке антивирусных препаратов - создание пептидных ингибиторов, предотвращающих процессы прикрепления и слияния вируса с клетками-мишенями. В одной из работ [Lambert и др., 1996]. Место для ввода текста. была продемонстрирована антивирусная активность пептидов из HR2-домена F-белка. Домены HR2 и HR1 участвуют в структурных перестройках белка F, что необходимо для слияния вируса с клеткой и инициации инфекционного процесса. Спроектированные Lambert и коллегами [Lambert и др., 1996] пептиды связывались с доменом HR2 и тем самым препятствовали инфекции.
В то же время домен HR1 белка F вируса РСВ также имеет большое значение для инфекционного процесса. Недавние исследования показали важность нулевого (∅) антигенного сайта белка слияния F в инфекции. Этот антигенный сайт располагается на границе HR1-домена и домена D1 (Фиг. 1А). Антитела, направленные против этого сайта, в значительной степени предотвращали перестройку белка F из префузионной в пост-фузионную конформацию, что приводило к уменьшению инфекции.
Учитывая это, мы спроектировали линейный пептид из нулевого сайта (АА201-212) белка F - КК-44. Также к линейной части QLLPIVNKQSC мы добавили дендримерный фрагмент с N-конца (пептид КК-45). Также был синтезирован малый дендримерный пептид D-12, использованный в качестве контроля влияния дендримерной части пептида (Фиг. 1Б, таблица 1).
Для синтеза пептида использовали автоматический синтезатор пептидов PS3 (Protein Technologies Inc., США). Схема синтеза представлена на фигуре 2.
Для очистки пептида использовалась высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) в виде системы LC-20 Prominence (Shimadzu, Япония). При элюировании использовали линейный градиент 5-70% элюента В (25 минут) при 30 мл/мин с детектированием при 226/280 нм. Элюент А содержал 0,1% TFA/H20; элюент В содержал чистый ацетонитрил (Sigma-Aldrich). Стационарна фаза - Kromasil Eternity С18.
Функциональные группы боковых цепей Fmoc-аминокислот (AnaSpec, США/ Sigma Aldrich, Германия / Iris Biotech, Германия) были защищены трет-бутилом (t-Bu) для гидроксильных и карбоксильных групп, трет-бутилоксикарбонилом (Boc) или флуоренилметоксикарбонилом (Fmoc) для е-аминогруппы лизина, тритильной группой (Trt) для SH-группы цистеина и амидной группы аспарагина и глутамина, и 2,2,4,6,7-пентаметил-дигидробензофуран-5-сульфонил (Pbf) для гуанидиновой группы аргинина. Синтез осуществляли автоматически на пептидном синтезаторе PS3 (Protein Technologies Inc., США) с использованием сополимера 1% дивинилбензола с полистиролом (смола Fmoc-Rink Amide-MBHA) или смол на ПЭГ-основе (Rink-amide chemmatrix, TGR-, TGA-).
Для конденсации использовали смесь HBTU/NMM. Растворителем, использованным для всех стадий синтеза, был N,N-диметилформамид (ДМФА) или смесь ДМФА с N-метилпирролидоном (МП); снятие Fmoc-защиты после каждой стадии конденсации проводили в растворе 4-метилпиперидина (для Fmoc), а полное снятие защит осуществляли путем использования трифторуксусной кислоты (TFA) (все защитные группы боковых цепей, кроме Fmoc, были лабильными для TFA).
Схема твердофазного синтеза основана на повторяющемся цикле стандартных операций, который включает:
1) На старте навеску исходной смолы, например Fmoc-Rink Amide-MBHA, вносят в реактор, добавляют ДМФА, энергично перемешивают суспензию до полного набухания смолы, операцию повторяют 3 раза по 10-30 мин, удаляя растворитель фильтрованием под давлением.
2) Удаление Fmoc-защиты 20% раствором 4-метилпиперидина (МПП) в течение 10-20 мин 2 раза.
3) Промывку смолы ДМФА при тщательном перемешивании, операцию повторяют 3 раза, удаляя отработанный растворитель фильтрованием под давлением.
4) Присоединение аминокислоты путем добавления в реактор активированной Fmoc-аминокислоты в среде ДМФА или N-метилпирролидона (МП) и инкубацией в течение 30 мин -2 ч.
5) Промывку смолы с пептидом ДМФА при тщательном перемешивании, операцию повторяют 3 раза, удаляя отработанный растворитель фильтрованием под давлением.
6) Операции по пунктам 2-5 повторяются.
Отщепление пептида от смолы проводят смесью трифторуксусной кислоты (95%) с добавлением тиоанизола, 1,2-этандитиола, триизопропилсилана и деионизированной воды. Сырой пептидный продукт из этой смеси осаждают сухим диэтиловым эфиром, осадок дополнительно промывают диэтиловым эфиром и экстрагируют 5% водной уксусной кислотой и экстракт высушивали лиофильно, получая «сырой пептид». Очистку сырого пептида проводят путем высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенной фазе (С18), используя градиентное элюирование.
Заявляемый ДКП - стабильное вещество при хранении в сухом виде. В результате был получен дендримерный пептид общей формулы:
[((Arg)2Lys)2LysGlnLeuLeuProIleValAsnLysGlnSerCys-C(O)NH2]+CF3COO-n, где карбоксильная группа цистеина находится в форме амида с (C(O)NH2), и где CF3COOHn обозначает трифторуксусную кислоту, которая в форме аниона формирует соль с пептидом-противоином, имеющим щелочные/основные свойства (n=9). Содержание в молях кислоты-аниона соответствует числу молей позитивного заряда пептидного катиона. Число зарядов при нейтральном рН равно 9 (фиг. 3).
Пример 2. Цитотоксическая активность дендримерного пептид КК-45.
Цитотоксичность пептидов изучали с помощью МТТ-теста на культуре клеток МА-104 (эмбриональная почка обезьяны) в широком диапазоне концентраций от 0,04 до 2,5 мг/мл. Данная культура была выбрана в связи с тем, что последующие исследования антивирусной активности проводились на этой же культуре клеток. Для этого в 96-лучночный планшет засевали 20000 клеток/лунку в объеме 100 мкл полной среды Игла-Мем (10% ЭТС, 300 мг/л L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина, 25 мМ HEPES). На следующий день в клетки вносили пептиды в различных концентрациях. Через сутки в клетки вносили 25 мкл раствора МТТ (4 мг/мл) и инкубировали 4 ч. После чего клетки лизировали раствором (20% SDS на 0,02н водном растворе H2SO4). Далее измеряли оптическую плотность при длинах волн 570 и 650 нм и на основе этих данных рассчитывали значения СС50 (50%-ая цитотоксическая концентрация - концентрация тестируемого вещества, необходимая для гибели 50% клеток).
В результате тестирования 3-х пептидов установлено, что линейный пептид КК-44 и контрольный дендримерный пептид D12 являются не токсичными в данном диапазоне концентраций. В то же время комплексный дендримерный пептид КК-45 проявлял более выраженный цитотоксический эффект; значение СС50 составляло 0,50±0,09 мг/мл (Фиг. 4). По всей видимости, за счет высокой плотности положительного заряда и относительно крупного размера, данный пептид оказывают более выраженное повреждающее действие на мембрану клетки, приводя к потере ее жизнеспособности.
Пример 3. Вирулицидная активность к РСВ пептидов.
Была изучена вирулицидная активность этих пептидов по методике, описанной в статье [Donalisio и др., 2012] с некоторыми модификациями. Кратко, пептиды в диапазоне нетоксических концентрации 250 мкг/мл были инкубированы с вирусом (Титр=1000 синцитиеобразующих единиц/мл) 2 ч при комнатной температуре после чего вирус титровали на заранее подготовленном монослое клеток МА-104, а через 5 суток подсчитывали количество синцитиев методом световой микроскопии. В качестве отрицательного контроля вирус обрабатывали физиологическим раствором (ФР), а в качестве положительного контроля вирус обрабатывали нейтрализующими моноклональными антителами (mAb) в концентрации 10 мкг/мл.
В итоге наибольшим вирулицидным эффектом обладали нейтрализующие моноклональные антитела; общее количество синцитиев составило 4350±3165, а количество синцитиев в процентах от отрицательного контроля (вирус обрабатывался физиологическим раствором - ФЗ) составило 4±3%. Дендрмерный пептид КК-45 оказывал выраженной прямое вирулицидное действие на вирионы РСВ, количество синцитиев составило 12400±6396, процентная доля от отрицательного контроля составила 10±6%. Линейный пептид КК-44 также проявлял высокую вирулицидную активность, количество синцитиев 7767±3801, а процент синцитиев от группы отрицательного контроля составил 7±5%. В то же время контрольный дендрмерный пептид D-12 не оказывали такого эффекта (Фиг. 5А, 5Б). По всей видимости крупные дендримерные пептиды с высокой плотностью позитивного заряда (+8 для КК-45) оказывают прямое дестабилизирующее действие на оболочку РСВ, что в итоге приводит к снижению жизнеспособности вируса.
Пример 4. Блокирование лигандов на поверхности РСВ.
Пептиды были изучены в тесте на ингибирование лигандов на поверхности вирионов РСВ. Для этого засевали клетки МА-104 в 96-луночный планшет в количестве 15 тыс/лун в полной среде ДМЕМ, инкубировали ночь до образования монослоя и отмывали от сывороточной среды физиологическим раствором, вносили 100 мкл/лун холодной бессывороточной среды ДМЕМ и охлаждали планшет до +4С. Далее пептиды титровали до получения следующих концентраций 500, 250, 125, 62,5, 31,25 мкг/мл, охлаждали на льду и вносили охлажденный до +4С вирус в количестве 50 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на лунку объемом 100 мкл бессывороточной среды ДМЕМ. Инкубировали смесь пептид/РСВ при +4С в течение 1 ч после чего вносили ее к клеткам МА-104 в лунки предварительно отмытого и охлажденного до +4С планшета. Инкубировали смесь пептид/РСВ с клетками 2 ч при +4С, удаляли содержимое из лунок вместе с не связавшимся вирусом, меняли среду на бессывороточную ДМЕМ и инкубировали при +37С в СО2-инкубаторе в течение 3-5 суток до образования синцитиев. Далее количество синцитиев в лунке подсчитывали методом световой микроскопии (учитывая число блящек). При таком дизайне эксперимента пептиды, обладающие способностью взаимодействовать с вирионами, будут связываться с лигандами (скорее всего с белками F и G вируса) на их поверхности и при внесении к клеткам препятствовать процессу прикрепления/слияния.
Проведенные исследования показали, что инкубация линейного КК-44 с вирусом не приводит к снижению инфекционного процесса; ЕС50 составляет более 500 мкг/мл. Это может свидетельствовать о его неспособности нарушать структурные перестройки в белке F, необходимые для слияния вируса с клетками, или о низкой стабильности пептида. В то же время дендримерная форма пептида - КК-45 значительно подавляет образование синцитиев (ЕС50=33±3 мкг/мл). Стоит отметить, что контрольный дендримерный пептид D-12 также обладал анти-РСВ эффектом в данном тесте, но значительно (в 6 раз) более слабым (ЕС50=197±48 мкг/мл) (фиг. 6А).
В дополнительных экспериментах мы исследовали способность пептидов взаимодействовать с РСВ методом ИФА по методике сходной с опубликованной в работе [Donalisio и др., 2012]. Для этого пептиды в концентрациях 0,25, 2,5, 25 и 250 мкг/мл сорбировали на планшет при +37С в течение 2 ч, после чего двукратно отмывали (0,25%Tween-20/PBS) и осуществляли забивку 2% обезжиренным сухим молоком (SIGMA) при +4С в течение ночи. В качестве отрицательного контроля осуществляли сорбцию 1% BSA (ПанЭко) (соответствует значениям 0 мг/мл на фигуре 6А) и гепарина в аналогичном диапазоне концентраций (от 0,25 до 250 мкг/мл). Далее после трехкратной отмывки вносили РСВ в бессывороточной среде ДМЕМ (Т=10000 БОЕ/мл) и инкубировали 2 ч при +37С.После двукратной отмывки вносили антитела против F-белка вируса (РСВ Fusion Protein Monoclonal Antibody (C106D) (ThermoFisher)) в разведении 1/200 и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. После двукратной отмывки вносили вторичные биотинилированные антитела (rat anti-mouse IgG1-biotin (BD)). Отмывали 2 раза и вносили конъюгат SaV-HRP (BD) в разведении 1/1000 с последующей инкубацией 1 час при комнатной температуре. После трехкратной отмывки вносили ТМБ (BD) и инкубировали 10-20 минут. Реакцию останавливали 2н H2SO4. Оптическую плотность (ОП) измеряли на планшетном фотометре Multiskan GO (ThermoFisher) при двух длинах волн: 450 и 620 нм. Программным обеспечением прибора высчитывалась разница между ОП450 и ОП620 (ΔОП).
Проведенное исследование показало, что линейный пептид КК-44 значительно связывался с РСВ; ΔОП составляла 0,97±0,10 (фиг. 6Б). Дендримерная форма этого пептида - КК-45 и контрольный дендримерный пептид D-12 также связывались РСВ, но с меньшей интенсивностью; ΔОП составили 0,67±0,14 и 0,73±0,13 (фиг. 6Б). Эти данные свидетельствуют о том, что линейный пептид КК-44, несмотря на связывание его с вирусом не оказывает ингибирующего действия на инфекционный процесс (фиг. 6Б). По всей видимости, данный пептид не приводит к нарушению функционирования белка F и/или не стабилен в условиях длительного культивирования. В то же время пептид КК-45 значительно ингибирует дальнейший инфекционный процесс (фиг. 6Б). Скорее всего, это обусловлено тем, что пептид КК-45, специфически связывается с вирионами посредством линейной С-концевой последовательности, за счет наличия разветвленной структуры на N-конце, стерически препятствует нормальной функции белка F вируса, а именно, нарушает его структурную перестройку из префузионной в постфузионную форму.
Контрольный пептид D-12 также значительно связывался с РСВ, в данном случае может иметь место его неспецифическое связывание за счет электростатического взаимодействия; D-12 с высокой плотностью положительного заряда взаимодействует с отрицательно заряженными участками вириона (например, липидными рафтами в бислойной мембране). Слабо выраженная антивирусная активность данного пептида (D-12) в тесте на ингибирование лигандов РСВ (фиг. 6Б) вероятнее всего объясняется его способностью связываться с поверхностью вириона, что дестабилизирует его оболочку.
Пример 5. Ингибирование связывания РСВ с рецепторами клеток.
Для оценки способности пептидов ингибировать вход вируса в клетки-мишени клеточную линию МА-104 засевали в 96-луночный планшет в полной питательной среде ДМЕМ (10% ЭТС, 300 мг/л L-глутамин, 25 мМ HEPES, 50 мкг/мл Гентамицина) и культивировали в 5% CO2 при 37°С так, чтобы через сутки конфлюентность монослоя составила 100%. Отмывали планшет от полной среды ДМЕМ физиологическим раствором (который был охлажден до +4С). Далее манипуляции проводили на льду при +4С, т.к. при этой температуре РСВ способен прикрепляться к клеткам-мишеням, но не способен осуществлять слияние с ними. После отмывки в лунки планшета вносили по 50 мкл холодной бессывороточной среды ДМЕМ (600 мг/л Л-глутамина, 25 мМ HEPES, 50 мкг/мл Гентамицина) и тестируемые пептиды, которые титровали в диапазоне нетоксичных концентраций, и инкубировали 30 минут на льду. В качестве положительного контроля применяли гепарин, который связывается с РСВ и конкурентно препятствует связыванию вируса с клеточными рецепторами - гепаран-сульфатами [Donalisio и др., 2012]. Далее в лунки вносили РСВ А2 в количестве 50 БОЕ на лунку в объеме 50 мкл/лунку бессывороточной ДМЕМ, инкубировали вирус 2 часа на льду. Затем отмывали не связавшийся вирус и пептиды, вносили в лунки 100 мкл бессывороточной ДМЕМ и инкубировали при +37С в CO2-инкубаторе 2-3 суток. Подсчитывали количество синцитиев методом световой микроскопии [Donalisio и др., 2012]. На основе данных о влиянии различных концентраций пептидов на количество синцитиев были рассчитаны значения ЕС50 и ЕС75, т.е. концентрации пептидов, необходимых для ингибирования прикрепления вируса к клетке на 50% (в 2 раза) и 75% (в 4 раза), соответственно.
Проведенные исследования показали, что КК-44 в незначительной степени ингибирует прикрепления вируса к клетке; значения ЕС50 составили 979±244 мкг/мл. Пептида D-12 не демонстрировал ингибирующего эффекта. Самую высокую способность ингибировать прикрепление РСВ к клеткам-мишеням продемонстрировал пептид КК-45 значение ЕС50 составило 47±8 мкг/мл, что сопоставимо с положительным контролем гепарином (ЕС50 - 48±11 мкг/мл) (фиг 7А).
В отдельных экспериментах была изучена способность пептидов связываться с клеточным рецептором для РСВ - белком нуклеолином. Для этого пептиды в концентрациях 2,5, 25 и 250 мкг/мл сорбировали на планшет при +37С в течение 2 ч после чего двукратно отмывали (0,25%Tween-20/PBS) и осуществляли забивку 2% обезжиренным сухим молоком (SIGMA) при +4С в течение ночи. В качестве отрицательного контроля осуществляли сорбцию 1% BSA (ПанЭко) (соответствует значениям 0 мг/мл на фигуре 6) и гепарина в аналогичном диапазоне концентраций (от 2,5 до 250 мкг/мл). Далее после трехкратной отмывки вносили 100 мкл 1 мкг/мл раствора нуклеолина NCL (Human NCL / Nucleolin Protein (Recombinant 6His, N-terminus) (aa2-482) (LSBio)) и инкубировали 2 ч при +4С. После двукратной отмывки вносили кроличьи поликлональные антитела против нуклеолина (Nucleolin Polyclonal Antibody (ThermoFisher)) в разведении 1/500 и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. После двукратной отмывки вносили детектирующие анти-кроличьи IgG-антитела меченые HRP (Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP (ThermoFisher)). Отмывали 3 раза и вносили ТМБ (BD) инкубировали 15-30 минут.Реакцию останавливали 2н H2SO4. Оптическую плотность (ОП) измеряли на планшетном фотометре Multiskan GO (ThermoFisher) при двух длинах волн: 450 и 620 нм. Программным обеспечением прибора высчитывалась разница между ОП450 и ОП620.
Как было сказано выше пептиды КК-44 и КК-45 моделируют участок белка F вируса, необходимый для связывания с клеткой-мишенью; при этом КК-45 -дендримерный пептид, содержащий линейный участок F-белка вируса АА201-212 и дендримерную часть (R4K2K), пептид КК-44 имеет линейную структуру АА201-212. В качестве контроля был дополнительно синтезирован дендримерный пептид D-12 (R4K2K).
Проведенные исследования показали, что дендримерная форма КК-45 значительно связывается с нуклеолином (ΔОП=0,79±0,01), в то время как линейная форма пептида КК-44, а также контрольный дендримерный пептид D-12 связываются заметно слабее; ΔОП - 0,22±0,01 и 0,28±0,04 (фиг. 7Б). Высокая антивирусная активность пептида КК-45, скорее всего, объясняется его способностью конкурентно связываться с рецептором -нуклеолином. Линейный пептид КК-44 не проявлял выраженной анти-РСВ-активности, что также может объясняться значительно более слабой способностью связываться с этим рецептором (фиг. 6).
Пример 6. Антивирусная активность пептида КК-45 в легких лабораторных животных.
После того как была установлена антивирусная активность пептида КК-45 в экспериментах in vitro мы провели исследования антивирусных свойств пептида на лабораторных животных.
Мыши самки, линии BALB/c весом 20-22 г возрастом 10-12 недель был разделены на пять групп (по 10 мышей в каждой). Животных с 1 по 4 группы инфицировали (интраназально) РСВ А2 однократно в объеме 50 мкл PBS («ПанЭко», Россия) в дозе 5×106 ТЦД50/мышь. Сухой пептид разводили в деионизованной воде, после чего терапия полученной композицией осуществлялась интраназально в объеме 50 мкл/мышь. Отдельные группы животных получали пептиды КК-45, КК-44 и D12 в дозе 0,0045 мкМ/мышь, что соответствует 10 мкг/мышь, 6 мкг/мышь и 4,7 мкг/мышь соответственно. Терапия длилась 5 дней по одному интраназальному введению в сутки. Животные 5-ой группы (Норма) никаким манипуляциям не подвергались. На 6-й день эксперимента мышей забивали методом цервикальной дислокации и отбирали образцы бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) для последующего определения вирусной нагрузки. Правое легкое отбирали и замораживали для выделения РНК и определения вирусной нагрузки методом количественной ПЦР.
Для получения БАЛ вскрывали грудную клетку мышей и сепарировали трахею, далее с использованием стерильного шприца (2 мл) промывали легкие через трахею 1 мл культуральной среды PRMI1640 (300 мг/л L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина, 25 мМ HEPES). Образцы БАЛ центрифугировали 350g 7 минут, после чего отбирали надосадок для последующего титрования вируса на монослое клеток. В итоге вирусная нагрузка в легких оценивалась двумя методами: количественной ПЦР гомогенатов легких и титрованием образцов БАЛ на монослое клеток.
Для оценки вирусной нагрузки методом количественного ПЦР из гомогенатов легких выделяли общую РНК набором RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) согласно протоколу производителя. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически с использованием NanoDrop2000. Синтез кДНК проводили набором «Реверта-L» №К3-4-100 в соответствии с методикой производителя. Полимеразная цепная реакция в реальном времени проводилась набором «Синтол» ПЦР-Микс №М-428 по методике производителя. Количество копий рассчитывали по калибровочной кривой и нормализовали по концентрации общей РНК. Вирусную нагрузку выражали как количество копий РНК вируса на 1 мкг общей РНК.
Для количественного определения вирусной нагрузки методом титрования БАЛ готовили монослой чувствительных клеток МА-104. За день до эксперимента клетки засевали в 96-лучночный планшет (SPL Lifesciences, Южная Корея) в количестве 15000 клеток/лунку в 100 мкл полной среды Игла-MEM. После ночной инкубации, непосредственно перед титрованием, клетки промывали физиологическим раствором, и вносили в лунки 100 мл бессывороточной среды Игла-MEM. Далее осуществляли десятичное титрование БАЛ и в качестве позитивного контроля использовали РСВ А2 с известным титром. После чего клетки инкубировали при +37С в 5% атмосфере СО2 в течение 4 часов и меняли среду в лунках на полную питательную среду Игла-MEM. После чего клетки инкубировали при +37С в 5% атмосфере СО2 в течение 1 суток и меняли полную питательную среду Игла -MEM на среду OverLay (0,6% агароза в бессывороточной среде Игла-MEM). Инкубировали при +37С в 5% атмосфере СО2 в течение 5-6 суток. Далее осуществляли фиксацию клеток формалином (10% нейтральный забуференный) по 100 мкл/лун в течение ночи. На следующий день для удаления агарозной среды из лунок аккуратно промывали планшеты под проточной водой и вытряхивали среду из лунок до полного удаления среды. После фиксации монослоя осуществляли 3 последовательных отмывки буфером PBS-T (на 1 л PBS/ 0,5 мл Tween 20). Далее в планшеты вносили по 200 мкл блокирующего буфера (1 л PBS/ 0,5 мл Tween 20+25 г сухого обезжиренного молока) на лунку, после чего инкубировали их в течение 30 минут на шейкере при комнатной температуре. После инкубации плейты трехкратно отмывали и вносили 100 мкл раствора антител РСВ Fusion Protein Monoclonal Antibody (Invitrogen) в буфере для разведения образцов в разведении 1/50. После инкубации планшеты трехкратно отмывали и вносили 100 мкл раствора антител, меченных биотином против rat biotin-ani-mouse-IgG1 (BD) в разведении 1/1000. Затем планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего последовательно отмывали их три раза и вносили 100 мкл раствора конъюгата пероксидазы хрена со стрептовидином SR-HRP (BD) в разведении 1/1000. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение часа. После инкубации планшеты отмывали 4 раза и вносили в них по 50 мкл на лунку субстрата (ТМБ мембранный, Sigma, США). Далее планшеты инкубировали в темноте до проявки (в среднем 25-30 минут). Для остановки реакции использовали 50 мкл дистиллированной воды. Окрашенный синцитий подсчитывали методом световой микроскопии. Вирусную нагрузку выражали как количество синцитиев в 1 мл БАЛ.
Методом количественной ПРЦ показано снижение числа копий вирусной РНК у мышей, получавших все три пептида КК-45, D-12 и КК-44 (фиг. 8А). Количество копий vRNA на 1 мкг РНК в группе, получавший пептид КК-44, уменьшилось в 1,5 раза по сравнению с группой РСВ. Самый высокий элиминирующий эффект в отношении vRNA продемонстрировал пептид КК-45, почти в 3 раза меньше копий по сравнению с группой РСВ/PBS. Применение короткого дендримерного пептида D12 также приводит к снижению вирусной нагрузки, но не так значительно, приблизительно в 1,8 раза. Полученные данные в целом подтверждают результаты исследований in vitro, проведенных на предыдущем этапе, в которых дендримерный пептид КК-45 проявлял самую высокую антивирусную активность.
Следовательно, эти дендримерная структура пептида обладает более эффективным профилем биологической активности, в сравнении с линейными пептидами.
Методом титрования БАЛ показано, что интраназальное применение дендримерного пептида КК-45 в наибольшей степени уменьшало количество синцитиев в БАЛ в 13 раз. Применение короткого дендримерного пептида D12 также приводит к снижению вирусной нагрузки, но не так значительно в 2,2 раза, в то время как линейный пептид КК-44 не оказывает антивирусного эффекта (фиг. 8Б). Различия в полученных данных объясняются особенностью методов детекции; методом титрования выявляются жизнеспособные вирионы, в то время как ПЦР дополнительно выявляет аберрантные вирионы и внутриклеточную РНК вируса.
Пример 7. Оценка влияния пептида КК-45 на воспалительную реакцию легких и гиперреактивность дыхательных путей.
Помимо оценки вирусной нагрузки в легких также оценивалась выраженность воспалительных реакций в этом органе: для этого оценивали клеточный состав БАЛ, гистологические изменения в ткани легких, а также гиперреактивность бронхов.
При оценке клеточного состава БАЛ дыхательные пути через трахею с помощью шприца промывались дважды 1 мл бессывороточной среды Игла-MEM. После чего измеряли клеточность БАЛ на автоматическом гематологическом анализаторе Abacus Junior Vet (Diatron, Австрия). Результат выражали в количестве клеток в 1 мл БАЛ. После измерения клеточности образцы центрифугировали 10 мин при 150g. Осажденные клетки наносились на предметное стекло, высушивались и фиксировались в метаноле в течение 10 минут, после чего окрашивались азуром и эозином. Подсчет клеточного состава БАЛ проводили методом световой микроскопии.
В проведенном эксперименте мы оценивали воспаление по изменению количества клеток в образцах БАЛ. Мы показали, что происходит статистически значимое снижение общего количества клеток в БАЛ у животных, получавших пептиды D-12 и КК-45 на 45% и 50%, соответственно (фиг. 9А). Это снижение достигается за счет двукратного уменьшения количества инфильтрирующих макрофагов (фиг. 9Б) и лимфоцитов (фиг. 9В). Нейтрофилы и эозинофилы были представлены единичными клетками (данные не представлены). В то же время интраназальное введение линейного пептида КК-44 не приводит к уменьшению общего количества клеток и макрофагов в БАЛ, но при этом количество лимфоцитов уменьшалось в 2 раза по сравнению с мышами контрольной группы (фиг. 8). Эти данные показывают, что дендримерный пептид КК-45, снижая вирусную нагрузку в легких, тем самым способствуют уменьшению воспаления респираторного тракта.
Для гистологического анализа отбирали левое легкое для приготовления микропрепаратов и помещали его в 10% формалин, обезвоживали путем проводки по спиртам и заливали образцы в парафин. Микротомированием парафиновых блоков получали срезы легких толщиной 2-4 мкм. Полученные препараты окрашивали гематоксилином и эозином (Bio-Optica, Италия) для идентификации эозинофилов, нейтрофилов и лимфоцитов. Гистологическое исследование микропрепаратов легких осуществляли на световом микроскопе (Olympus, Япония). Толщину бронхиального эпителия измеряли в пикселях с использованием микрофотографий ткани легкого при увеличении в 200 раз и программного обеспечения Altami Studio (Альтами, Россия). Анализировали 5 бронхов у каждого экспериментального животного.
Проведенный гистологический анализ ткани легких подтвердил уменьшение количества инфильтрирующих клеток; площадь перибронхиальных инфильтратов и количество в них клеток было существенно снижено у мышей, получавших пептиды КК-44, D-12 и КК-45; при этом максимальное уменьшение этих показателей было в группе животных, которым интраназально вводили дендримерный пептид КК-45 (фиг. 10А, 10Б). Значения толщины стенки бронхов статистически значимо отличалось только в группе норма (фиг. 10В). Эти данные подтверждают снижение РСВ-индуцированного воспаления легких.
Оценивали также гиперактивность бронхов (ГРБ) с использованием прибора для неинвазивной плетизмографии - FinePointe NAM (Buxco, США). ГРБ определяли при появлении бронхоспазма у экспериментальных мышей, вызванного аэрозольным введением метахолина (Sigma-Aldrich, США) в возрастающих концентрациях (6,25; 12,5; 25 мг/мл), после чего в автоматическом режиме оценивали удельную сопротивляемость дыхательных путей (ее выражали в см вод. ст. × с).
Воспаление, вызванное РСВ - инфекцией, приводит к нарушению дыхательной функции легких, что выражается в увеличении сопротивляемости бронхов. Мы измерили этот показатель методом неинвазивной плетизмографии и установили, что инфицирование мышей РСВ в дозе 107 TCID50 значительно увеличивает удельную сопротивляемость бронхов (sRaw) на 25%-35% в сравнении с неинфицированными животными. В то же время интраназальное введение пептидов КК-45, D12 и КК-44 не приводит к восстановлению этого показателя несмотря на снижение уровня воспаления (фиг. 11). Скорее всего сопротивляемость бронхов в большей степени вызвана иными факторами, связанными с протеканием инфекции, а не с воспалением.
Пример 8. Определение антивирусной активности пептида КК-45 в отношении вируса гриппа.
Учитывая, что оболочечные вирусы имеют сходство в строении вириона и в механизмах проникновения в клетку, было важно изучить обладает ли разработанный пептид КК-45 специфичным эффектом в отношении РСВ или его спектр антивирусной активности более широкий. Для этого были изучены его антивирусные свойства в отношении вируса гриппа в экспериментах in vitro.
Для исследования противовирусной активности пептидов в отношении вируса гриппа традиционной моделью является инфекция в культуре клеток MDCK. В связи с поставленной целью в задачи исследования входило:
1) Оценить цитотоксичность предоставленных образцов in vitro, а именно определение ЦТД50% (цитотоксической дозы 50%) и МПД (максимально переносимой дозы) катионных пептидов в культуре клеток MDCK;
2) Оценить противовирусную эффективность предоставленных образцов in vitro, а именно определение ИК50 (ингибирующей концентрации 50%) пептидов в отношении вируса гриппа при лечебно-профилактической схеме добавления.
В качестве препарата сравнения использовали Умифеновир. Клетки MDCK (Madin Darby canine kidney) - перевиваемая культура клеток почки собаки). Штамм вируса гриппа А/Калифорния/04/2009 (пндм H1N1 2009), полученный из ВОЗ). Вирус выращивали в аллантоисной полости 9-дневных куриных эмбрионов, аликвоты вируса были заморожены и хранились при температуре -80°С. Титр стока составлял не менее 106-107 ЭИД50/мл или 105-106 БОЕ/мл. Во всех трех экспериментах использовали одну и ту же аликвоту из одного стока.
Использовали стандартный МТТ-текст для определения жизнеспособности клеток MDCK после их культивирования с пептидами в течение 3 суток. Каждая точка эксперимента была поставлена в 4 повторностях. Максимальная концентрация препарата, не изменяющая жизнеспособность клеток по сравнению с контролем принималась за максимально переносимую концентрацию (МПК). Концентрация субстанций, уменьшающая значение оптической плотности на 50% по сравнению с контролем, принималась за 50% цитотоксическую дозу (ЦТД50), вычисление которой проводили при построении кривой зависимости (выживания) с использованием пакета "drc" в Rstudio.
Изучение противовирусной активности образцов проводили методом ИФА, модифицированном для определения активности препаратов в культуре клеток как рекомендовано разрешительными органами РФ [Методические указания по изучению ИЛП: Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2012].
Клетки MDCK рассаживали в 96-луночные планшеты для культивирования клеток с плоским дном (35000 клеток/лунку) и выращивали до полного монослоя в КС. Перед заражением вирусом клетки 2 раза промывали средой MEM без сыворотки. Далее исследуемые соединения добавляли в концентрациях, указанных в таблицах 2 и 3 в объеме 100 мкл/лунку PC (среда MEM с двойным набором аминокислот и витаминов без сыворотки с 10 мМ глутамина и антибиотиков). Часть лунок использовали для контроля вируса и клеток. Каждая точка эксперимента была поставлена в 4 повторностях. Далее были проведены две модификации опытов. В первой модификации (количество экспериментов n=3) после инкубации клеток с исследуемыми препаратами в течение 2 часов при 37°С в лунки, исключая клеточный контроль, добавляли вирус на PC (100 мкл), при этом множественность заражения составляла приблизительно 0,01 БОЕ/ на клетку.
Во второй модификации экспериментов (количество экспериментов n=1) после инкубации препаратов с клетками, препараты удаляли, в лунки добавляли вирус на PC (100 мкл), множественность заражения составляла приблизительно 0,1 БОЕ на клетку. После инкубации в течение 1 часа, вирус удаляли и к клеткам опять добавляли препараты на PC (100 мкл), а затем к каждой лунке с препаратами добавляли по 100 мкл PC. В лунки клеточного и вирусного контроля добавляли по 200 мкл PC. Далее в обоих модификациях планшеты инкубировали в течение 24 часов в атмосфере 5% СО2 при 37°С. После чего клетки планшета просматривали под инвертированным микроскопом, чтобы убедиться в отсутствии в них цитотоксических и цитопатических изменений.
Далее среду удаляли, клетки фиксировали 80% ацетоном на буфере 0,01М PBS (20 минут), высушивали и отмывали 3 раза PBS с 0,05% Твин-20. Все дальнейшие процедуры проводили в соответствии с техникой постановки ИФА для выявления антигена. К клеткам добавляли по 100 мкл раствора PBS с 1% фетальной сывороткой и 0,05% Твин-20 и инкубировали при 37°С в течение 30 минут. После удаления раствора к клеткам добавляли по 100 мкл моноклональных антител (МКА) к внутренним белкам вируса гриппа A (NP+M1), разведенным 1:1000 на ИФА-растворе. После инкубации с антителами в течение 1 часа при 37°С и последующей 3-х-кратной промывки в лунки вносили по 100 мкл IgG козы против IgG мыши, меченных пероксидазой хрена (Sigma) в разведении 1:5000 и инкубировали еще 1 час при 37°С. После 4-кратной промывки связанную пероксидазу выявляли добавлением в лунки 100 мкл 0,05% раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина в 0,003% цитратном буфере рН=5,0, содержащем 0,003% Н2О2. Планшеты выдерживали 15-30 минут в темноте до появления окраски, реакцию останавливали добавлением 50 мкл 4Н H2SO4, далее оптическую плотность (ОП) измеряли на спектрофотометре для измерения оптического поглощения в 96-луночных планшетах при длине волны 450 нм. В качестве клеточного контроля использовали лунки, не зараженные вирусом. Процент ингибирования вирусной репродукции изучаемым соединением определяли по формуле:
Ингибирование, %=100 - ((ОПопыт - ОПкл.контр)/(ОПвир.контр - ОПкл.контр)) Для одной точки опыта использовали 4 лунки планшета, из которых определяли среднее значение, далее строили кривую доза- ответ, используя программу RStudio. Концентрация препарата, уменьшающая значение величины ОП на 50%, принималась за ингибирующую концентрацию 50 (ИК50) и также определялась автоматически с использованием пакета "drc" в RStudio. Индекс селективности (ИС) определяли по следующей формуле ЦТД50/ИК50.
Цитотоксичность в культуре MDCK
На основании полученных данных с использованием количественного метода МТТ были построены кривые зависимости выживаемости клеток от концентрации препаратов, которые обобщены в Таблице 2. По результатам трех экспериментов для КК-45 была выявлена ЦТД50=318,45±36,74 мкг/мл, МПК, (максимально переносимая концентрация), при которой не было изменения клеток по сравнению с клеточным контролем для КК-45 составляла 200 мкг/мл.
Антивирусная активность в отношении вируса гриппа
Изучение противовирусного действия препаратов в культуре клеток MDCK было проведено методом ИФА, модифицированном для определения активности препаратов в культуре клеток. Для начального исследования (опыт 1) был выбран диапазон концентраций, которые были изучены при определении цитотоксичности, для второго опыта основываясь на данных по цитотоксичности были выбраны концентрации ниже ЦТД50, а также концентрация 1 мкг/мл. В опытах для заражения клеточной культуры была использована множественность заражения клеток вирусами гриппа А/Калифорния/04/09 (пндм H1N1) - 0.01 БОЕ/на клетку. В качестве препарата сравнения был использован умифеновир в концентрациях 5 и 10 мкг/мл.
Полученные результаты представлены в Таблицах 2 и 3. Специфическим (селективным) считали подавление вирусной репродукции выше 30%, и при том, что эффективность подавления увеличивалась с увеличением концентрации. Из полученных данных в обоих опытах видно, что в нетоксических концентрациях КК-45 специфически ингибировал репродукцию вируса гриппа, ингибирование увеличивалось пропорционально с увеличением концентрации. Активность умифеновира, взятого в качестве препарата сравнения, также увеличивалась с увеличением его концентрации, соответствуя его активности в ранее проведенных исследованиях [Leneva и др., 2009; Y S Boriskin, I A Leneva, E-I Pecheur, 2008].
Поскольку изученные нами в 1 и 2 опытах некоторые концентрации являются токсическими, в следующей серии опытов мы уменьшили область концентраций, увеличив их количество внутри этого диапазона. Из полученных данных (таблица 4) видно, что пептид КК-45 специфически ингибировал репродукцию вируса гриппа, поскольку ингибирование увеличивалось пропорционально с увеличением концентрации. Построение кривых доза-ответ по результатам, полученным в 1-3 серии опытов, представлены на Фиг. 12. ИК50, определенные из этих кривых, для КК-45 составляли 30,5 мкг/мл (Опыт 1), 17,77 мкг/мл (опыт 2) и 28,02 мкг/мл (Опыт 3).
Опыты 1-3, проведенные нами показали, что некоторые из пептидов в нетоксичных для клеток MDCK концентрациях оказывали невысокое ингибирующее действие на вирусную репликацию, при этом для них не была выявлена зависимость эффекта от их дозы (Таблица 5). Предполагается, что предоставленные для изучения пептиды блокируют вход вируса в клетки. В связи с вышесказанным для более детальной проверки наличия активности препаратов нами была проведена серия опытов, в которой используемый нами метод определения активности был модифицирован таким образом, чтобы выявить ингибиторы ранних стадий вирусной репликации. Исследуемые препараты инкубировали с клетками в течение 2 часов при 37°С, далее препараты удаляли, в лунки добавляли вирус и инкубировали в течение 1 часа. Далее вирус удаляли и к клеткам опять добавляли препараты и инкубировали в течение 24 часов. Данные, полученные при такой модификации, совпали с данными, полученными ранее. Из изученных препаратов только препарат КК-45 оказывал вирусоспецифическое действие, при его низких концентрациях (1-5 мкг/мл) ингибирования практически не наблюдалось, с увеличением концентрации (от 10 до 50 мкг/мл) процент ингибирования увеличивался (45%-75%), достигая практически полного ингибирования вирусной репликации при концентрациях 100-200 мкг/мл.
Построение кривой доза-ответ по результатам этого опыта представлено на Фиг. 13. ИК50, определенная из этой кривой, для препарата КК-45 составила 16,7 мкг/мл (Таблица 6). Используемый в качестве препарата сравнения умифеновир также как и в 1-3 опытах показал специфическую противовирусную активность, при этом процент ингибирования при изученных концентрациях не отличались от таковых, полученных в предыдущих исследования и входили в диапазон концентраций, оцениваемых как активных, для лабораторных и эталонных штаммов вирусов гриппа для умифеновира [Boriskin и др., 2008],[Leneva и др., 2009]. Выведенные из кривых доза-ответ для КК-45 значения ИК50 во всех опытах, обобщены в Таблице 6. Принимая во внимание полученные в опытах по цитотоксичности данные, можно вывести индекс селективности СИ, который для КК-45 составлял 13,8 (Таблица 6). Из представленных данных следует, что противовирусные эффективные концентрации пептида КК-45 для вируса гриппа сопоставимы с данными эффективной концентрации пептида в отношении РСВ.
Таким образом, полученное средство, содержащее эффективное количество синтетического пептида с дендримерной (разветвленной) структурой КК-45 обладает противовирусными свойствами в отношении респираторно-синцитиального вируса (РСВ) и вируса гриппа. Проведенные исследования показали, что пептид КК-45 демонстрирует противовирусную активность как в экспериментах in vitro, так и in vivo. Механизм антивирусного действия пептида КК-45 состоит в блокировании входа вируса в клетку как за счет связывания с клеточным рецептором нуклеолином, так и за счет связывания с лигандами (белком F) на поверхности РСВ. Ингибирование проникновения в вируса клетку позволяет использовать полученный пептид КК-45 для профилактики респираторной вирусной инфекции, вызванной Orthopneumovirus. Дендримерный пептид КК-45, в виду высокой протеолитической стабильности, являются перспективным соединением для создания новых противовирусных препаратов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Boriskin Y. S. и др. Arbidol: A Broad-Spectrum Antiviral Compound that Blocks Viral Fusion // Current Medicinal Chemistry. 2008. T. 15. C. 997-1005.
2. Donalisio M. и др. Inhibition of human respiratory syncytial virus infectivity by a dendrimeric heparan sulfate-binding peptide // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2012. T. 56. №10. C. 5278-5288.
3. Fjell C. D. и др. Designing antimicrobial peptides: Form follows function // Nature Reviews Drug Discovery. 2012. T. 11. №1. C. 37-51.
4. Greber K. E., Dawgul M. Antimicrobial Peptides Under Clinical Trials // Current Topics in Medicinal Chemistry. 2017. T. 17. C. 620-628.
5. Gwyer Findlay E., Currie S. M., Davidson D. J. Cationic host defence peptides: Potential as antiviral therapeutics // BioDrugs. 2013. T. 27. №5. C. 479-493.
6. Janai HK M. M. Z. M. S. HR. Ribavirin_adverse_drug_reactions,_1986_to_1988.13 // The Pediatric Infectious Disease Journal. 1990. T. 9. №3. C. 209-211.
7. Lambert D. M. и др. Peptides from conserved regions of paramyxovirus fusion (F) proteins are potent inhibitors of viral fusion.: Merck & Co., Inc, 1996. 2186-2191 c.
8. Leneva I. А. и др. Characteristics of arbidol-resistant mutants of influenza virus: Implications for the mechanism of anti-influenza action of arbidol // Antiviral Research. 2009. T. 81. №2. C. 132-140.
9. Osminkina L. А. и др. Porous silicon nanoparticles as scavengers of hazardous viruses // Journal of Nanoparticle Research. 2014. T. 16. №6.
10. Pretorius M. А. и др. The role of influenza, RSV and other common respiratory viruses in severe acute respiratory infections and influenza-like illness in a population with a high HIV sero-prevalence, South Africa 2012-2015 // Journal of Clinical Virology. 2016. T. 75. C. 21-26.
11. Y S Boriskin, I A Leneva, E-I Pecheur S. J. P. Arbidol a broad-spectrum antiviral compound that blocks viral fusion // Curr Med Chem. 2008. T. 15. №10. C. 997-1005.
12. Хаитов M.P. и др. Интерференция РНК. Новые подходы к разработке противовирусных препаратов // Иммунология. 2010. Т. 31. №2. С. 69-76.
13. Методические указания по изучению ИЛП: Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ: Elsevier Inc, 2012.
Claims (1)
- Применение способа интраназального введения пептида R4K2KQLLPIVNKQSC для лечения респираторной вирусной инфекции, вызванной респираторно-синцитиальным вирусом или вирусом гриппа, где R - аргинин; K - лизин; Q - глутамин, L - лейцин, Р - пролин, I - изолейцин, V - валин, N - аспарагин, S - серин, С - цистеин.
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2022111711A RU2022111711A (ru) | 2023-10-30 |
| RU2810986C2 true RU2810986C2 (ru) | 2024-01-09 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2451026C2 (ru) * | 2006-10-30 | 2012-05-20 | Сентро Де Инхеньерия Хенетика И Биотекнолохия | Химерные пептидные молекулы с противовирусными свойствами в отношении вирусов семейства flaviviridae |
| RU2609857C1 (ru) * | 2015-11-02 | 2017-02-06 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Использование композиции, состоящей из катионного пептида LTP и молекул РНК против респираторных вирусов |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2451026C2 (ru) * | 2006-10-30 | 2012-05-20 | Сентро Де Инхеньерия Хенетика И Биотекнолохия | Химерные пептидные молекулы с противовирусными свойствами в отношении вирусов семейства flaviviridae |
| RU2609857C1 (ru) * | 2015-11-02 | 2017-02-06 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Использование композиции, состоящей из катионного пептида LTP и молекул РНК против респираторных вирусов |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Shilovskiy I. P. at al "Dendrimeric form of the peptide from antigenic zero-site of F protein exhibit antiviral effect against respiratory syncytial virus", Allergy, 2020, Volume 75: Abstracts from the European Academy of Allergy and Clinical Immunology Digital Congress, 06-08 June 2020, Abstract 0471, p.140, https://doi.org/10.1111/all.14506. * |
| Shilovskiy I. P. at al "Prospects For the Use of Peptides against Respiratory Syncytial Virus", Molecular Biology, 2019, Vol. 53, No. 4, pp. 484-500. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2769317C2 (ru) | Способы лечения гриппа | |
| RU2672888C1 (ru) | Противовирусное иммунотропное средство для лечения ОРВИ | |
| KR101660363B1 (ko) | 인플루엔자를 억제하는 조성물 및 방법 | |
| Al-Azzam et al. | Peptides to combat viral infectious diseases | |
| CN102268072B (zh) | 流感病毒血凝素蛋白结合多肽的结构和用途 | |
| RU2810986C2 (ru) | Катионный разветвленный пептид для ингибирования респираторных вирусов | |
| US9221874B2 (en) | Antiviral peptides against influenza virus | |
| AU2017350304B2 (en) | Influenza virus neutralizing compounds | |
| US20090234096A1 (en) | Influenza inhibiting compositions and methods | |
| JP6921002B2 (ja) | ペプチド模倣化合物を中和するインフルエンザウイルス | |
| CN108822190B (zh) | 多肽及其药物组合物和用途 | |
| WO2022174768A1 (en) | Anti-viral peptides and compositions and methods of use thereof | |
| EA039991B1 (ru) | Соединения-пептидомиметики, нейтрализующие вирус гриппа |