CN101848719A - 流感抑制组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于治疗或预防流感感染或预防流感感染的人到人传播的肽、肽类似物、肽衍生物和药物组合物。本发明的肽包含野生型流感血球凝集素2蛋白或其变体的融合起始区的流感病毒-细胞融合抑制部分(FIR)。在优选的实施方案中，本发明的肽由野生型流感血球凝集素2蛋白或其变体的一部分的8至40个连续的氨基酸残基组成，该蛋白部分包含蛋白的FIR以及FIR氨基端和羧基端侧上的至多5个氨基酸残基。
Description
相关申请的交叉参照
本申请要求2007年6月25日提交的U.S.临时申请系列No.60/937,120的权益，其是2004年11月3日提交的U.S.临时申请系列No.10/578,013的部分继续，其要求了2003年11月4日提交的U.S.临时申请系列No.60/517,181的权益，在此将每篇全部引入作为参考。
发明领域
本发明涉及包含肽的对预防或抑制由流感病毒引起的细胞的病毒感染有效的组合物，以及用其治疗或预防流感感染的方法。
发明背景
所有的病毒都必须结合并侵入到它们的目标细胞以进行复制。对于有包膜病毒，包括具有I类膜融合蛋白的RNA病毒，该过程包括(a)病毒体结合目标细胞，(b)病毒的包膜与原生质膜或内在细胞膜融合，(c)病毒包膜和细胞膜在融合区的去稳定作用以产生融合孔，(d)病毒RNA通过孔传递，和(e)通过病毒RNA的细胞功能的修饰。
上述步骤(b)和(c)，包括病毒膜和细胞膜的融合，通过病毒跨膜糖蛋白(融合蛋白)与目标细胞的表面蛋白和膜的交互作用来介导。这些交互作用引起了融合蛋白的构象变化，这导致了病毒融合肽插入目标细胞膜中。该插入后接着在融合蛋白内出现进一步的构象变化，这使得病毒胞膜和细胞膜变得接近，并且导致该两个膜双层的融合。
如果融合过程被破坏，病毒不能在其宿主中传播和繁殖。可以通过将肽和肽模拟物同源物定向到融合蛋白序列、识别融合蛋白的抗体、和对抗融合蛋白的其他因素来实现该融合过程的故意破坏。
血球凝集素2(HA2)是流感病毒的包膜蛋白，其是原型RNA病毒的I类融合蛋白，而流感病毒是一种正粘液病毒。HA2包含氨基端疏水区域，认为是融合肽，它在血球凝集素前体蛋白分裂过程中被暴露。逆转录病毒跨膜蛋白包含若干个除融合蛋白外与HA2已知结构相同的结构特性，包括延伸的氨基端螺旋(N-螺旋，通常称为“七肽重复区”或“亮氨酸拉链”)，羧基端螺旋(C-螺旋)和邻近跨膜结构域的芳香族基序。这五个结构域中至少存在四个就能将病毒包膜蛋白限定为I类融合蛋白。
图1显示了I类病毒六个科的融合蛋白中的五个之前所述的结构域。融合蛋白起始于疏水融合肽，终止于锚肽，并且结合了延伸的氨基端α螺旋(N-螺旋，通常称为“七肽重复区”或“亮氨酸拉链”)，羧基端α螺旋(C-螺旋)，以及有时邻近病毒包膜的芳香族基序。同时显示了各病毒科是第六个结构域，在此认为是融合起始区域(FIR)，这是本发明人所发现的，并且公开于U.S.系列No.10/578,013中。
每年约10至20％的美国民众遭受季节性流感。虽然大部分人在一至两周内复原，但是年弱的、年老的以及患有慢性病症的个人可能发展成为流感后肺炎和其它致命的并发症。流感的病原体是流感病毒，是一种正粘液病毒，其通过分段病毒基因组的再分布和突变过程容易发展成新的毒株。
甲型流感病毒的高毒性毒株可以产生传染病和流行病。近几年来，已经出现了能够引起高死亡率的禽类甲型流感病毒亚型H5N1的高致病毒株。由于流感病毒对公共卫生的威胁以及作为生物危害的潜在因素，发展治疗法以控制季节性流感和增加的大流行感冒的威胁是高度优先考虑的问题。
发明概述
本发明提供了用于治疗和预防流感感染和/或预防流感人到人传播的肽、肽类似物、肽衍生物和药物组合物。本发明的肽包含野生型流感血球凝集素2蛋白或其变体的融合起始区(FIR)的流感病毒-细胞融合抑制部分。通过在野生型血球凝集素2蛋白序列的氨基酸残基序列中的选定取代，变体不同于野生型蛋白。
在第一个实施方案中，本发明的分离肽由选定的野生型流感血球凝集素2蛋白或其变体的一部分的8至40个连续的氨基酸残基组成。血球凝集素2蛋白的该部分包含蛋白的融合起始区(FIR)和FIR的氨基端和羧基端上至多五个氨基酸残基。该部分还至少包括序列YNAELL(SEQ ID NO：1)或其不同于SEQ ID NO：1一个或多个氨基酸取代的变体，其一个或多个氨基酸取代选自Y1S、Y1T、Y1W、Y1A、N2Q、A3L、A3I、A3V、E4D、E4K、E4R、E4H、L5I、L5V、L5A、L6I、L6V和L6A。
在该第一个实施方案中，变体通过上述选定的野生型蛋白的一部分氨基酸序列中一个或多个氨基酸取代而不同于野生型序列。该取代可以选自其它野生型流感血球凝集素2蛋白的相应氨基酸残基或野生型残基的保守取代，优选地用于变体维持Wimley-White界面亲水性分布特征，变体在至少一个野生型血球凝集素2氨基酸序列的相应区域的Wimley-White界面亲水性分布特征的局部最大值和局部最小值的约5个氨基酸残基内的分布特征中具有局部最大值和局部最小值。优选地，选定的野生型序列的变体与野生型序列具有至少50％的序列同一性。
在第二个实施方案中，本发明的肽包含来自残基72至131区域中的蛋白片段的野生型甲型流感或乙型流感血球凝集素2蛋白的FIR的8至40个氨基酸残基部分，或其通过在野生型序列中一个或多个残基取代而不同于野生型序列的残基72-131的变体。变体中的取代选自其它野生型血球凝集素2蛋白相应的氨基酸残基或其保守取代，优选选择用于保持肽的Wimley-White亲水性分布特征的整体形态，即维持变体的Wimley-White亲水性分布特征，该变体在对应野生型血球凝集素2氨基酸序列的Wimley-White界面亲水性分布特征的局部最大值和局部最小值的约5个氨基酸残基的分布特征中具有局部最大值和局部最小值。优选，该实施方案中的变体通过保守取代不同于野生型序列。
在第三个实施方案中。本发明的肽由SEQ ID NO：2(EVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDS)或其变体的氨基酸序列的8至40个连续的氨基酸残基组成。SEQ ID NO：2包含野生型甲型流感亚型H3(SEQ ID NO：19)的血球凝集素2蛋白的氨基酸残基72-113。该8至40个氨基酸残基包含SEQ ID NO：2或其变体的至少氨基酸残基23至28。在该实施方案中，变体通过选自E1D、E1N、E1Q、V2G、V2S、V2T、V2I、V2L、V2A、V2M、V2C、E3D、E3N、E3Q、G4T、G4S、G4K、G4R、G4H、G4Q、G4N、R5K、R5H、R5Q、R5N、I6L、I6V、I6A、I6M、I6C、Q7N、Q7E、Q7D、Q7G、Q7S、Q7T、D8E、D8N、D8Q、D8M、D8C、L9I、L9V、L9A、L9M、L9C、E10D、E10N、E10Q、E10I、E10L、E10V、E10A、E10M、E10C、K11R、K11H、K11D、K11E、K11N、K11Q、Y12W、Y12K、Y12R、Y12H、V13I、V13L、V13A、V13G、V13T、V13S、V13M、V13C、E14D、E14K、E14R、E14H、D15E、D15R、D15N、D15Q、T16G、T16S、T16A、T16Q、T16N、K17F、K17R、K17M、K17C、K17I、K17V、K17L、K17A、I18L、I18V、I18A、I18T、I18S、I18G、I18Q、I18N、D19E、D19N、D 19Q、L20I、L20V、L20A、L20C、L20M、W21Y、W21A、S22T、S22G、S22A、S22M、S22C、Y23W、Y23S、Y23T、Y23A、N24Q、N24D、N24E、A25I、A25V、A25L、A25M、E26D、E26K、E26R、E26H、L27A、L27I、L27V、L27M、L28I、L28V、L28A、L28M、V29I、V29L、V29A、V29M、A30I、A30L、A30V、A30M、A30C、L31I、L31V、L31A、L31M、L31C、E32D、E32N、E32Q、N33Q、N33Q、Q34E、N33E、Q34E、Q34D、Q34G、Q34S、Q34T、H35K、H35R、H35N、H35Q、T36S、T36G、I37L、I37V、I37A、I37M、I37C、D38E、D38N、D38Q、L39F、L39I、L39V、L39M、L39C、L39A、L39E、L39D、L39N、L39Q、T40H、T40R、T40K、T40S、T40G、T40A、T40M、D41E、D41N、D41Q、S42G、S42T、S42I、S42L、S42V、S42A、S42M和S42C的一个或多个氨基酸取代不同于SEQID NO：2。
在一些优选的实施方案中，本发明的肽是由序列SEQ ID NO：3-13任意至少8个连续的氨基酸残基组成的肽，其代表了野生型甲型流感血球凝集素2(HA2)或乙型流感血球凝集素(HB)蛋白的FIR部分。在其他优选的实施方案中，肽由SEQ ID NO：3-13任一的变体的至少8个氨基酸连续残基组成。在该可选的实施方案中，变体通过类似于上述第三个实施方案中描述的一个或多个氨基酸取代，优选地保守取代，不同于选定的序列。
当本发明的肽，这里指的是流感抑制剂-3(F3)施用到白鼬的鼻腔时，可以有效地阻止动物中流感的发展，以及动物到动物的流感传播。F3的氨基酸序列与大多数甲型流感H3亚型病毒的残基84-99相同，包括当前在人类中传播的A/H3N2毒株。在体外，在低nM范围(＜5nM)内用IC50的免疫蚀斑分析中，F3还可以有效对抗重组体H5N1流感病毒和乙型流感的两个毒株(B/上海/361/2002和B/上海/10/2003)。已知这些不同甲流和乙流菌株的多样性，F3很可能能有效对抗大部分流感病毒。
在其它方面中，本发明提供了本发明肽的类似物(例如，环状肽，或包含非天然氨基酸的肽)，肽的衍生物，或者肽或类似物，其中肽或类似物包含结合肽残基的非-HA2-衍生基团(例如，脂质或非流感HA2肽序列)和对本发明的肽、类似物或衍生物特异性的分离抗体(即，能够特异性和选择性地结合)。
本发明的另一个方面是本发明的肽、类似物、衍生物或抗体在治疗或预防流感感染的治疗方法中的用途。该用途包括本发明的肽、类似物、衍生物或抗体用于制备治疗流感的药物的用途。本发明的肽、类似物、衍生物和抗体可以与药物学上可接受的载体结合包含于药物组合物中。
附图简述
图1显示了在先鉴定的I型病毒的6个科的融合蛋白区域，以及被认为是融合起始区(FIR)的第六个结构域。
图2显示了HA2变体H1(SEQ ID NO：17)、H2(SEQ ID NO：18)、H3(SEQ ID NO：19)、H4(SEQ ID NO：20)、H5(SEQ ID NO：21)、H6(SEQ ID NO：22)、H7(SEQ ID NO：23)、H9(SEQ ID NO：24)、H 10(SEQ ID NO：25)、H13(SEQ ID NO：26)、H14(SEQ ID NO：27)、H15(SEQ ID NO：28)和H16(SEQ ID NO：29)的序列对比。
图3显示了乙型流感血球凝集素2，B/Yamagata/16/1988(SEQ ID NO：30)的氨基酸残基序列。
图4显示了甲型流感和乙型流感血流凝集素2蛋白的残基72-113，特别是甲型流感亚型H1(SEQ ID NO：17)、H2(SEQ ID NO：18)、H3(SEQ ID NO：19)、H4(SEQ ID NO：20)、H5(SEQ ID NO：21)、H6(SEQ ID NO：22)、H7(SEQ ID NO：23)、H9(SEQ ID NO：24)、H10(SEQ ID NO：25)、H13(SEQ ID NO：26)、H14(SEQ ID NO：27)、H15(SEQ ID NO：28)、H16(SEQ ID NO：29)和乙型流感/Yamagata/16/1988血球凝集素2(SEQ ID NO：30)的残基72-113的比较。
图5显示了病毒-细胞融合的可能机理。
图6显示了受到甲流病毒A/Cal/07/04攻击的以及用本发明的肽或对照肽治疗的2组白鼬所观察到的病理反应。
图7显示了来自用本发明的肽或对照肽处理的以及受甲流病毒/Cal/07/04感染的白鼬的样品的病毒滴定度分析。
图8显示了甲型流感H1血球凝集素2的Wimley-White界面亲水性图。
图9显示了甲型流感H2血球凝集素2的Wimley-White界面亲水性图。
图10显示了甲型流感H3血球凝集素2的Wimley-White界面亲水性图。
图11显示了甲型流感H4血球凝集素2的Wimley-White界面亲水性图。
图12显示了甲型流感H5血球凝集素2的Wimley-White界面亲水性图。
图13显示了甲型流感H6血球凝集素2的Wimley-White界面亲水性图。
图14显示了甲型流感H7血球凝集素2的Wimley-White界面亲水性图。
图15显示了甲型流感H9血球凝集素2的Wimley-White界面亲水性图。
图16显示了甲型流感H10血球凝集素2的Wimley-White界面亲水性图。
图17显示了甲型流感H13血球凝集素2的Wimley-White界面亲水性图。
图18显示了甲型流感H14血球凝集素2的Wimley-White界面亲水性图。
图19显示了甲型流感H15血球凝集素2的Wimley-White界面亲水性图。
图20显示了甲型流感H16血球凝集素2的Wimley-White界面亲水性图。
优选实施方案的详述
本发明提供了用于治疗或预防流感感染或预防流感人到人传播的肽、肽类似物、肽衍生物、抗体和药物组合物。本发明利用了具有类似于野生型流感血球凝集素2蛋白的融合起始区部分的氨基酸序列的肽。本发明的肽可以抑制流感病毒-细胞的融合，从而治疗和/或预防流感感染。本发明的肽可以包含FIP部分中野生型流感病毒血球凝集素2蛋白的选定部分。变体通过野生型血球凝集素2蛋白序列的氨基酸残基序列中的选定取代不同于野生型蛋白。虽然不希望被理论所束缚，但认为本发明的肽通过干扰病毒融合肽的FIR结构域与目标细胞的正常交互作用来预防和治疗流感感染，例如，通过干扰激活或融合所需的蛋白聚集或构象变化。
在第一个实施方案中，本发明的分离肽由选定的野生型流感血球凝集素2蛋白或其变体的8至40个连续的氨基酸残基，优选9至16个连续的氨基酸残基组成，所述选定的野生型流感血球凝集素2蛋白包含蛋白融合起始区(FIR)和FIR氨基端和羧基端侧上至多5个氨基酸残基。该8至40个氨基酸残基至少包括序列YNAELL(SEQ ID NO：1)或其变体，该变体通过选自Y1S、Y1T、Y1W、Y1A、N2Q、A3L、A3I、A3V、E4D、E4K、E4R、E4H、L5I、L5V、L5A、L6I、L6V和L6A的一个或多个氨基酸取代而不同于SEQ ID NO：1。SEQ ID NO：1代表所有表征甲型流感血球凝集素2蛋白的FIR最高保守部分之一(即，甲型流感血球凝集素2序列的残基94至99)。FIR的氨基酸序列包括选定的野生型血球凝集素2蛋白的部分，其开始于蛋白N-螺旋中约残基77，终止于选定的野生型血球凝集素2蛋白的残基110至残基119范围内的残基。如在此所述的，流感FIR羧基端终止是紧挨着在残基104(N-螺旋的羧基端)之外的第一个残基之前的那个残基，其起始了增加Wimley-White界面疏水性的区域。在另一个方面，FIR的特征在于表现野生型血球凝集素2蛋白的Wimley-White界面亲水性分布特征峰值的、并且在N-螺旋(残基77上)开始、在N-螺旋的羧基端后约15个残基之内结束的氨基酸残基序列。峰值区域(即，FIR)的羧基端通过亲水性分布特征的局部最小值表征。紧邻FIR羧基末端上的区域最小值之后的残基起始了亲水分布特征的另一个峰值(即，增加的界面疏水性的区域)。
在该第一个实施方案中，变体通过上述选定的野生型蛋白的部分的氨基酸序列中一个或多个氨基酸取代不同于选定的野生型序列。这些取代选自其它野生型流感血球凝集素2蛋白的相应氨基酸或残基，或相应残基的保守取代，优选选择用于变体保持Wimley-White界面亲水性分布特征，该变体在至少一个野生型血球凝集素2FIR氨基酸序列的相应区域的Wimley-White界面亲水性分布特征的局部最大值和局部最小值的约5个氨基酸残基的分布特征中具有局部最大值和局部最小值。例如，野生型血球凝集素2可以来自选自甲型流感血球凝集素2(SEQ ID NO：17-29)的H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10、H11、H12、H13、H15和H16变体的亚型，或来自乙型流感血球凝集素2蛋白(SEQID NO：30)。甲型流感血球凝集素2亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10、H11、H12、H13、H15和H16的氨基酸序列显示于图2中，其中FIR区域有黑色轮廓框出。乙型流感血球凝集素2(SEQ ID NO：30)的氨基酸序列在图3中给出。优选地，选定的野生型序列的变体与野生型序列具有至少50％的序列同一性(例如，至少60％，至少70％或至少80％的序列同一性)。
在第二个实施方案中，本发明的肽包含野生型甲型流感或乙型流感血球凝集素2蛋白或其变体的FIR的残基72-113的8至40个，优选9至16个连续的氨基酸残基，其中变体通过一个或多个氨基酸残基取代不同于野生型序列的残基72-113。变体中的取代选自其它野生型血球凝集素2蛋白的相应氨基酸残基或其保守取代，优选地被选择用于保持野生型肽的Wimley-White亲水性分布特征(profile)的所有形态，即保持变体的Wimley-White亲水性分布特征，该变体在相应野生型血球凝集素2氨基酸序列的Wimley-White亲水性分布特征的局部最大值和局部最小值的约5个氨基酸残基之内具有局部最大值和局部最小值。例如，优选地，该实施方案中的变体包含某些野生型氨基酸残基的保守取代。
这里所用的，术语“保守取代”及其语法上的变形，指的是肽序列的氨基酸残基的存在不同于野生型残基的氨基酸，但是属于相同类型(即，非极性残基代替非极性残基，芳香族残基代替芳香族残基，极性不带电残基代替极性不带电残基，带电残基代替带电残基)。此外，保守取代可以包含具有与其代替的野生型残基相同信号和通常相似强度的界面亲水性值的残基。
如在此所用的，术语“非极性残基”指的是甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸和脯氨酸；术语“芳香族残基”指的是苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；术语“极性不带电残基”指的是丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，甲硫氨酸，天冬氨酸和谷氨酰胺；术语“带电残基”指的是负电荷带电氨基酸天门冬氨酸和谷氨酸，以及正电荷带电氨基酸赖氨酸，精氨酸和组氨酸。
图4比较了各自显示于图2中的甲型流感血流凝集素2亚型的残基72-113和乙型流感血流凝集素2的相应区域(即，SEQ ID NO：30的残基72-113)。如图4所示，这两个不同的血球凝集素亚型之间具有显著序列相似性。各甲型流感血球凝集素2亚型的残基72-113区域与H3亚型(即，SEQ ID NO：2)的相应区域具有50％或更多的序列同一性。SEQID NO：2和各种其它亚型的残基72-113的序列同一性百分比如下：H4和H14与SEQ ID NO：2具有约95.2％的序列同一性；H7和H15与SEQID NO：2具有约59.5％的序列同一性；H10和H16与SEQ ID NO：2具有约54.7％的序列同一性；H5和H6与SEQ ID NO：2具有约52％的序列同一性；以及H1、H2、H9和H13与SEQ ID NO：2具有约50％的序列同一性。乙型流感血球凝集素2的残基72-113与SEQ ID NO：2具有约30.9％的序列同一性；然而，SEQ ID NO：2和乙型流感蛋白的残基72-113之间的区别是占优势的保守取代。
如图2、图3和图4所示，已知野生型血球凝集素2蛋白全部在属于多于一类氨基酸的残基72-113区域中的位置上具有氨基酸残基。相应地，选定的野生型序列的变体与野生型序列具有至少50％的序列同一性(例如，至少60％，至少70％或至少80％的序列同一性)。
在第三个实施方案中，本发明的肽由SEQ ID NO：2(EVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDS)或其变体的氨基酸序列的8至40个连续的氨基酸残基，优选9至16个连续的氨基酸残基组成。SEQ ID NO：2是野生型甲型流感亚型H3血球凝集素2蛋白，并包含其氨基酸残基72至113的部分。在该实施方案中，肽至少包含SEQ ID NO：2或其变体的氨基酸残基23至28，该变体通过一个或多个氨基酸取代不同于SEQ ID NO：2。该一个或多个变体序列中的氨基酸取代选自表1所示取代的组。优选地，变体与SEQ ID NO：2具有至少50％的序列同一性(例如，至少60％，至少70％或至少80％的序列同一性)。在表1中，第一栏取代是优选的，第二栏取代是更优选的，并且相比第一栏中的那些是更保守的，第三栏的取代是可选的，其包含于本发明的肽中。
表1.SEQ ID NO：2.中的取代
| 位置 | 优选的取代 | 更优选的取代 | 可选优选的取代 |
| 1 | E1D，E1N，E1Q | E1D，E1N，E1Q | |
| 2 | V2G，V2S，V2T，V2I，V2L，V2A，V2M，V2C | V2S，V2T，V2I，V2L，V2A，V2M | |
| 3 | E3D，E3Q，E3N | E3D | |
| 4 | G4T，G4S，G4K，G4R，G4H，G4Q，G4N | G4T，G4S，G4K，G4R，G4H，G4Q，G4N |
| 位置 | 优选的取代 | 更优选的取代 | 可选优选的取代 |
| 5 | R5K，R5H，R5Q，R5N | R5K，R5Q，R5N | |
| 6 | I6L，I6V，I6A，I6M，I6C | I6L，I6V，I6A，I6M | |
| 7 | Q7N，Q7E，Q7D，Q7G，Q7S，Q7T | Q7N，Q7E，Q7D，Q7G | |
| 8 | D8E，D8N，D8Q，D8M，D8C | D8E，D8N，D8Q，D8M | |
| 9 | L9I，L9V，L9A，L9M，L9C | L9I，L9V，L9A，L9M | |
| 10 | E10D，E10N，E10Q，E10I，E10L，E10V，E10A，E10M，E10C | E10D，E10N，E10Q，E10I，E10L，E10V，E10A | |
| 11 | K11R，K11H，K11D，K11E，K11N，K11Q | K11R，K11D，K11E，K11N，K11Q | |
| 12 | Y12W，Y12K，Y 12R，Y12H | Y12W，Y12K，Y12R | |
| 13 | V13I，V13L，V13A，V13G，V13T，V13S，V13M，V13C | V13I，V13L，V13A，V13G，V13T，V13S，V13M | |
| 14 | E14D，E14K，E14R，E14H | E14D，E14K，E14R | E14D，E14R |
| 15 | D15E，D15R，D15N，D15Q | D15E | D15E，D15R |
| 16 | T16G，T16S，T16A，T16Q，T16N | T16G，T16S，T16Q，T16N， | I16A |
| 位置 | 优选的取代 | 更优选的取代 | 可选优选的取代 |
| 17 | K17F，K17R，K17M，K17C，K17I，K17V，K17L，K17A | K17F，K17M，K17I，K17V，K17L，K17A， | K17R |
| 18 | I18L，I18V，I18A，I18T，I18S，I18G，I18Q，I18N | I18L，I18V，I18A，I18T，I18S，I18Q，I18N | I18A |
| 19 | D19E，D19N，D19Q | D19E | D19E |
| 20 | L20I，L20V，L20A，L20M，L20C | L20I，L20V，L20A | L20A |
| 21 | W21Y，W21A | W21Y | W21Y，W21A |
| 22 | S22T，S22G，S22A，S22M，S22C | S22T，S22G，S22A，S22M | S22M |
| 23 | Y23W，Y23S，Y23T，Y23A， | Y23W，Y23S | Y23W，Y23A |
| 24 | N24Q，N24D，N24E， | N24Q | N24Q |
| 25 | A25I，A25V，A25L，A25M | A25I，A25V，A25L， | A25I |
| 26 | E26D，E26K，E26R，E26H， | E26D，E26K | E26D，E26R |
| 27 | L27A，L27I，L27V，L27M | L27A，L27I，L27V | L27A |
| 28 | L28I，L28V，L28A，L28M | L28I，L28V，L28A | L28A |
| 29 | V29I，V29L，V29A，V29M | V29I，V29L，V29A |
| 位置 | 优选的取代 | 更优选的取代 | 可选优选的取代 |
| 30 | A30I，A30L，A30V，A30M.A30C | A30I，A30L，A30V | |
| 31 | L31I，L31V，L31A，L31M，L31C | L31I，L31V，L31A，L31M | |
| 32 | E32D，E32Q，E32N | E32D | |
| 33 | N33Q，N33E，N33D | N33Q | |
| 34 | Q34G，Q34N，Q34E，Q34D，Q34T，Q34S | Q34G，Q34N，Q34E，Q34D | |
| 35 | H35K，H35R，H35N，H35Q | H35K，H35R | |
| 36 | T36S，T36G， | T36S | |
| 37 | I37L，I37V，I37A，I27M，I37C | I37L，I37V，I37A | |
| 38 | D38E，D38N，D38Q | D38E | |
| 39 | L39F，L39I，L39V，L39M，L39C，L39A，L39E，L39D，L39N，L39Q | L39F，L39I，L39V，L39M，L39A，L39E，L39D | |
| 40 | T40H，T40R，T40K，T40S，T40G，T40A，T40M， | T40H，T40S，T40G，T40A，T40M | |
| 41 | D41E，D41N，D41Q | D41E | |
| 42 | S42G，S42T，S42I，S42L，S42V，S42A，S42M，S42C | S42G，S42T，S42I，S42L，S42V，S42A |
在一些优选的实施方案中，本发明的肽是由表2中所示任一序列(SEQ ID NO：3-13)的至少8个连续的氨基酸残基组成的肽，其代表野生型甲型流感血球凝集素2(HA2)或乙型流感血球凝集素(HB)蛋白的FIR部分。在其它优选的实施方案中，肽是由SEQ ID NO：3-13任一个的变体的至少8个连续的氨基酸残基组成的肽。在该可选的实施方案中，变体通过一个或多个氨基酸取代而不同于选定的序列，取代优选为保守取代，更优选选自表1中所示各个肽位置上的相应取代残基。
此外，图2和图4中所示的序列以粗体字的形式表示了若干残基，其代表了在比对的血球凝集素2氨基酸序列的所示位置上的共有残基。如在此所用的，应用于氨基酸序列比对比较中的氨基酸残基的术语“共有”指的是在给定位置上大部分比对序列中出现的氨基酸。在图2中，共有残基是在图中所示的13个序列的至少7个给定位置上出现的那些氨基酸。在图4中，共有残基是在图中所示的14个序列的至少8个给定位置上出现的那些氨基酸。在图4中比较的血球凝集素2序列的残基72至113的区域中，共有残基是：V73、E74、R76、I77、L80、D86、D90、W92、S93、Y94、N95、A96、E97、L98、L99、V100、L101、L102、E103、N104、T107、D109、D112和S 113。优选，本发明的肽，包括在此所述的任一实施方案，在肽包括的HA2蛋白或其变体的片段内包括一个或多个这些共有残基，直至并包括所有这些共有残基。
表2
| 肽序列 | 序列识别号 | HA或HB变体 |
| VEDTKIDLWSYNAELL | SEQ ID NO：3 | A/H3，A/H4和A/H14的残基84-99 |
| VDDGFLDIWTYNAELLVLL | SEQ ID NO：4 | A/H1的残基84-102 |
| MEDGFLDVWTYNAELL | SEQ ID NO：5 | A/H5的残基84-99 |
| TRDSMTEVWSYNAELL | SEQ ID NO：6 | A/H7的残基84-99 |
| VDDQIQDIWAYNAELL | SEQ ID NO：7 | A/H9的残基84-99 |
| VDDLRADTISSQIELA | SEQ ID NO：8 | HB的残基84-99 |
| MEDGFLDVWTYNAELL | SEQ ID NO：9 | A/H2和A/H6的残基84-99 |
| TKDSITDIWTYNAELL | SEQ ID NO：10 | A/H10的残基84-99 |
| 肽序列 | 序列识别号 | HA或HB变体 |
| IDDAVTDIWSYNAKLL | SEQ ID NO：11 | A/H13的残基84-99 |
| TRDSLTEIWSYNAELL | SEQ ID NO：12 | A/H15的残基84-99 |
| VDDAVTDIWSYNAKLL | SEQ ID NO：13 | A/H16的残基84-99 |
所有表2中的序列除了乙型流感血球凝集素2肽(SEQ ID NO：8)以外都表现与SEQ ID NO：3具有超过50％的同一性，即，SEQ ID NO：4、5、9和13与SEQ ID NO：3具有62.5％的同一性，SEQ ID NO：6、7、9、10、11和12与SEQ ID NO：3具有56.2％的同一性。乙型流感血球凝集素2表现出与SEQ ID NO：3约31％的同一性，然后SEQ ID NO：8和SEQID NO：3之间的区别是占优势的保守取代。此外，由SEQ ID NO：3-13表示的各个肽包括一个或多个共有残基D86、D90、W92、S93、Y94、N95、A96、E97、L98、L99、V100、L101和L102。
在另一个方面，本发明提供了本发明肽的类似物。在一个实施方案中，该类似物包含至少两个含有共用二硫键(胱氨酸交联键)以形成环状结构的半胱氨酸残基。各半胱氨酸残基是肽的独立残基，或者是直接或者通过连接的肽序列或残基连结到肽氨基端的残基，或者是直接或者通过连接的肽序列或残基连结到肽的羧端的残基。认为环状肽结构可以提高许多肽的体内生物稳定性。
在另一个实施方案中，该类似物包含至少一个非天然氨基酸残基(例如，D-氨基酸残基，例如N-甲基缬氨酸、羟脯氨酸、氨酷酸的N-甲基化残基，等等)。已知特定的非天然氨基酸取代可以在很多肽化合物中给予对肽酶分裂的抗性(例如，D-氨基酸，前脯氨酸)，或者增加肽的α螺旋含量(例如，氨基丁酸)。
在另一个实施方案中，该类似物可以包括用一个或多个脯氨酸，甘氨酸或谷氨酸残基取代一个或多个肽氨基酸残基的天然氨基酸。如果需要或期望时，脯氨酸和甘氨酸残基可以破坏肽的α螺旋含量，而谷氨酸残基可以增加肽的α螺旋含量。
再一个方面中，本发明提供了本发明肽或类似物的衍生物，其中肽或类似物包括悬垂基团。在一个实施方案中，悬垂基团是脂质，如通过酯、酰胺、醚、硫代酯或硫醚键结合肽的C8至C20烷基或烷基羧酸酯基团。例如，衍生物可以包括脂肪烷基酯基团，例如结合肽残基的肉豆蔻酸酯基团。例如，脂质取代基可以增加肽的生物稳定性。
在另一个实施方案中，该衍生物包含悬垂于肽的一个或多个氨基酸残基侧链上的氨基、羟基或巯基取代的聚乙二醇(PEG)基团。该PEG衍生物通常可以提高蛋白代谢动力，例如，通过抑制器官如肝的摄取，这些器官包含显著水平的肽酶。
在另一个衍生物的实施方案中，该肽包括结合8至40个氨基酸肽的氨基端、肽的羧基端或两端的非HA2多肽序列。该非HA2序列可以是非HA2蛋白(例如，血清白蛋白)或非HA2蛋白的一部分，或者可以包含，例如，有助于使肽增溶的序列，如ASKSKSK(SEQ ID NO：15)或其变体，优选地添加在肽的羧基端。
本发明的另一个优选衍生物是分离的多肽，其包含由本发明肽组成的第一个肽片段(例如，来自野生型序列或其变体的残基72至113片段的野生型流感HA2蛋白部分的8至40个连续氨基酸残基)，以及至少一个附加肽部分，其包含结合第一个肽片段的氨基端、羧基端或氨基端和羧基端两端的非HA2肽序列。
在另一个方面中，本发明提供了对本发明的肽、类似物或衍生物特异的(即，能够特异性的和选择性地结合)分离的抗体。这些抗体可用作试剂来确定来自用本发明组合物治疗个体的生物样品中的本发明的肽、类似物、或衍生物的存在浓度。此外，靶向含有部分野生型血球凝集素2亚型的本发明肽的抗体还可以结合天然血球凝集素2蛋白。这种结合也可以提供一定水平的流感病毒-细胞融合过程的抑制作用。优选地，抗体是单克隆抗体，其可以是衍生自非人类动物例如鼠的抗体的嵌合抗体或人源化抗体。从给定蛋白或肽制备单克隆抗体的方法在本领域是公知的。制备嵌合抗体和人源化抗体的方法也是本领域技术人员公知的。
本发明的另一个方面是含有本发明的肽、类似物、衍生物或抗体的药物组合物，其可以用于治疗或预防流感感染的方法中。在特定的优选实施方案中，该组合物包括在药物学上可接受的介质或载体中的本发明的肽、类似物、衍生物或抗体，这些介质或载体适于将肽、类似物、衍生物或抗体传送至个体，例如，传送至鼻道或肺部气道。适于将活性成分传递给鼻道或肺部气道的介质和载体在本领域是公知的，包括盐水溶液，缓冲盐水，可吸入粉末等。载体还可以包括其他赋形剂成分，如表面活性剂、防腐剂、分散剂等等。该组合物可以作为气溶胶、非雾化液体、软膏或乳剂(例如，用于鼻部应用)等等来传递。本发明的药物组合物可以用作治疗或预防流感感染的方法的一部分，该方法通过给患有流感的个体施用流感抑制量的本发明的药物组合物来治疗或预防流感感染。
本发明的另一个方面是本发明的肽、类似物、衍生物、抗体或药物组合物用于治疗或预防流感感染的用途。其可以包括本发明的肽、类似物、衍生物、抗体或药物组合物用于制备治疗或预防流感感染的药物的用途。
流感病毒
甲型流感病毒具有多样的亚型。各种病毒亚型包括嵌入病毒的脂物膜包膜的两个糖蛋白模型的一个特异性组合。该两个亚型定义的糖蛋白是血球凝集素2(HA2)和神经氨糖酸苷酶。存在16个已知的HA2变体，其分别称为H1至H16，存在9个已知的神经氨糖酸苷酶变体，其分别称为N1至N9。各病毒亚型特异性的特征在于其血球凝集素2和神经氨糖酸苷酶变体编号。例如，甲型流感亚型H3N2是猪流感，而亚型H5N1是禽流感。
HA2是包括流感病毒的正粘液病毒科中所有病毒的融合蛋白。各流感病毒的FIR位于其HA2糖蛋白中。16个已知HA2变体中13个的氨基酸序列，H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16，显示于图2中(分别为SEQ ID NO：17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28和29)。H8、H 11和H12亚型的序列还不清楚。H3血球凝集素2的融合起始区现在已经鉴定为H3氨基酸序列(SEQ ID NO：19)的残基77至119，如2中所示。
在此称为流感抑制剂3(F3)的分离肽，其具体表现为氨基酸序列VEDTKIDLWSYNAELL，SEQ ID NO：3(SEQ ID NO：19的残基84-99；H3HA2)，发现具有有效的抗病毒特性。在随机杂混序列SWLVNKIYLTDDEVEL(SEQ ID NO：14)中含有相同16个氨基酸的分离肽未表现出可识别的抗病毒特性。F3的抗病毒特性包括病毒结合抑制作用，如通过血细胞凝集测试所证明的。F3还抑制病毒结合、融合和感染，如通过噬菌斑测试所证明的。
抗流感病毒活性
F3对抗广泛的H1、H3、H5和乙型流感病毒具有有效的感染抑制活性，这些病毒在它们各自的HA2蛋白的全部序列和结构中表现出显著的差异性。F3的广谱活性可能与，至少部分与FIR有关，特别是由所有已知流感病毒A亚型和乙型流感的残基84-99表示的FIR部分，该部分是HA2蛋白中最高保守区之一。虽然不希望被理论所束缚，但认为F3和野生型HA2相应区域(残基84-99)之间的序列相似性使得肽有效地结合或另外干扰遍布HA亚型的FIR相应部分。该相互作用能在融合过程中受HA蛋白的常规操作所干扰(例如，通过干扰融合过程进行必需的蛋白聚集或构象变化)。
已经通过使用标准FMOC化学品以克的含量在PEG-PS-PAL树脂上合成了F3。使用HPLC将批量肽产物纯化至＞95％，其残留的物质主要是较短的相关肽。将纯化的肽冷冻干燥以除去溶剂。冷冻干燥的粉末可以进一步加工，例如，通过将其溶解在六氟异丙醇中，并且用超纯氮(Praxair UHP，99.999％)蒸汽的蒸发溶剂。然后，将所得到的粉末在随后时间内通过将粉末溶解在含水缓冲液中来重建，缓冲液例如为10mM磷酸氢二钾或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。溶液中F3的浓度可以使用公式mg/ml＝(A280x mw)/e来确定，其中e表示在280nm处肽氨基酸序列中两个产色氨基酸的分子消光系数的总和，即5560(色氨酸)+1200(酪氨酸)的总和，e＝6760。
F3具有有效的和广基的甲型流感病毒抑制活性，并且在斑点减少测试中表现出皮摩尔浓度抑制作用。使用维晶纤维素作为外层的
免疫蚀斑分析(Matrosovich等，2006)，通过将单分子层固定，并用流感病毒核蛋白特异性的抗体染色来检测噬菌斑。在肽抑制测定中，用约100个病毒空斑形成单位(pfu)将肽预培养1小时，然后用于感染单分子层。两种条件用于培养：(1)标准条件，其中以预培养中所用的相同浓度将肽包含于外层中，或(2)其中肽不包含于外层的条件。
利用Madin-Darby Canine Kidney(“MDCK”)细胞噬菌斑测试来评估F3对甲型流感病毒多种亚型的抑制作用，使用甲型流感病毒的A/WSN/33(H1N1)和A/Udorn/72(H3N2)的亚型来进行了该测试。使用F3和随机杂混的对照肽(SEQ ID NO：14)的50：M到2.5：M的稀释度来评估这些肽在病毒感染性上的作用。测试了六个F3和对照肽对抗H1N1病毒亚型的稀释度；测试了另外六个各个肽对抗H3N2病毒亚型的稀释度。
在条件(1)下，F3通过若干不同的H1N1和H3N2甲型流感病毒菌株抑制正常大小噬菌斑的形成，IC50在约100-500皮摩尔(pM)范围内。在条件(2)下，对于F3，用于抑制正常大小噬菌斑的IC50为约10-100纳摩尔(nM)范围。在条件(1)的低nM浓度(＜10nM)下，或条件(2)的低μM(＜10μM)下，“迷你噬菌斑”的存在是明显的。
杂混对照肽在任何条件下都不能抑制甲型流感病毒噬菌斑的形成，这表明肽的氨基酸序列是重要的，并且非特异性作用不能说明抑制作用。
在体外免疫斑测定中，F3对抗重组体H5N1流感病毒和乙型流感的两个毒株(B/上海361/2002和B/上海/10/2003)也是有效的，具有低nM范围的IC50(＜5nM)。已知这些不同甲型和乙型流感毒株的多样性，F3有可能能有效对抗大多数流感病毒。
通过使用U.S.专利中请系列No.10/578,013中教导的方法，H1亚型甲型流感病毒的FIR已经鉴定为H1HA2序列的残基77至110(SEQ IDNO：17)。具有SEQ ID NO：4氨基酸序列的分离肽，在此称为流感抑制剂1(F1)，在噬菌斑测定中也具有对抗H1和H3甲型流感病毒的抗病毒活性。F1的氨基酸序列与H1FIR序列SEQ ID NO：17的残基84-102相匹配。
已经用不同的流感毒株进行了研究，以更好地了解本发明肽的作用机制，例如，用以确定病毒复制循环中的哪个步骤被F3、F1以及相关流感病毒抑制肽抑制。在最佳数量红血细胞和甲型流感A/PR/8/34(H1N1)的浓度下，F3和F1抑制流感病毒诱导的血球凝集的浓度为约10μM。在最佳细胞和病毒稀释(二者均为1∶8)下，F3抑制流感病毒诱导的血球凝集的浓度为12.5-6.25μM。使用其它H3和H1毒株也获得了类似的结果，其他毒株即H1N1毒株A/New Caledonia/20/99和A/WSN/33；和H3N2毒株A/California/07/2004，A/New York/55/04和A/Udorn/72。相反，具有SEQ ID NO：14氨基酸序列的对照肽，F3的杂混形式，在任何浓度下均没有抑制血细胞凝集。
更高浓度的病毒可以克制血凝抑制反应，这给出了一种推测性的机理。使用这种传统的病毒到细胞的结合测定的结果表明，本发明的肽直接与病毒体相互作用，从而抑制了与细胞的结合。相反，
抗HIV药物与短暂的融合中间产物相互作用，而非与病毒体结构相互作用(Debnath，2006；Platt，Durnin和Kabat，2005)。在病毒感染力测定中，对天然病毒体结构的直接作用可以说明，至少可以部分说明，F3和F1(对于正常大小的噬菌斑，大约为200pM)相对于
抗HIV药物(根据HIV-1株，4至280nM)的效能非常高。上述迷你噬菌斑可能是病毒体上HA重折叠作用的结果。
已经指出HA的重折叠作用是在暴露于已知与HA相互作用的甲型流感病毒的小分子抑制剂后发生的(Cianci等，1999；Luo，Colonno和Krystal，1996；Luo等，1997)。该输入抑制剂和其它物质(Hoffman等，1997)在90年代后期得到了相当显著的发展，这是因为它们是以HA作为重要的治疗目标。然而，这些小分子抑制剂迄今为止没有发展成为流感药物，这大多是因为它们相对低的功效，具有较低到中等μM浓度范围的IC50。在病毒进入型抑制剂的新兴领域中形成的一致意见是，小分子物质可能不能够有效地干扰在病毒进入过程期间HA和其它病毒融合蛋白经受的广泛的蛋白结构转变以及复杂的分子相互作用。
流感病毒病毒体-细胞融合过程的工作模型可以从数十年有关流感病毒和其它RNA病毒的深入研究中推知。这样的一个模型的图示显示于图5中。虽然在某些方面仍然只是假说，但是该模型可以突出甲型流感病毒糖蛋白的结构/功能基序的重要性，这可以作为药物发展的目标。在图5中，图A显示了流感血球凝集素1(HA1)蛋白与细胞受体的结合，受体是由涎类脂物或涎蛋白组成的。图B显示了流感病毒体进入到细胞内小泡中。称为M2病毒离子孔道蛋白的流感病毒蛋白降低了pH，从而触发了HA2蛋白螺旋结构域的重排。对应于F3氨基酸序列(SEQ IDNO：3)的HA2蛋白的序列位于亚稳“弹簧”序列的旁边。该重排使得HA2的融合肽部分干扰了小泡薄膜。图C和D说明HA2通过“leash-in groove”机理“很快恢复”，从而将病毒体和细胞膜靠近闭合。为了清楚的目的，HA1和涎受体在图C-E中没有显示。图C′显示了一种可选的机理，其中形成具有干扰双分子层薄膜能力的途径的HA2序列可以促进细胞和病毒体膜的混合。图片E显示了“融合孔”的形成和病毒的核蛋白部分进入到细胞。
活体动物实验
通常认为白鼬是最好的人流感病毒感染模型(Govorkova等，2005；Hampson，2006；Maher和DeStefano，2004；van Riel等，2007)。的确，流感疫苗效能的欧盟指导明确需要白鼬模型试验。老鼠以及其它小型哺乳动物可以被人甲型流感病毒毒株所感染，但是在季节性毒株的情况中，这通常需要对于新宿主的特殊适应。相反，白鼬可以被大多数人甲型流感病毒的毒株所感染而不需要特殊适应。老鼠中适应的甲型流感病毒的组织分布和发病机理与发生于人类疾病中的是不同的(Lu等，1999)。白鼬中甲型流感病毒的发病机理非常类似于人类中所观察到的。当对白鼬进行实验性鼻内接种时，病毒在上呼吸道发生了局部复制。白鼬呼吸道中唾液酸受体的分布与人类相似(van Riel等，2006；Yen等，2007)。
以与患有流感的人惊人相似的方式，白鼬表现出活动力下降，食欲不振，流鼻涕，打喷嚏，呼吸困难，腹泻，结膜炎，神经病症。白鼬和人类中发现的主要病理是具有纤毛的呼吸上皮的脱落以及鼻腔粘膜下层被浸润的炎症细胞所渗透。在白鼬被流感病毒感染后的48个小时中，呼吸上皮几乎全部被破坏，只剩下了基底膜。
白鼬中和人类中流感的主要区别是疾病显示出的病症的时间长度。白鼬在感染后1天就表现出了流感症状，但是在感染4天后就消除大部分已知症状(活动力下降，发热，食欲不振，鼻炎，打喷嚏等)。需要注意的是，许多人甲型流感病毒的毒株可以以不同程度感染白鼬的下呼吸道。在人类中，甲型流感病毒的高病原毒株可以在白鼬中从上呼吸道到大脑或从下呼吸道到循环系统以及其它器官中传播。当前甲型流感病毒的H5N1毒株可以在白鼬中形成致命的感染(Govorkova等，2005；Thiry等，2007；Vahlenkamp和Harder，2006)。
起初活体外研究集中在对应于目前在人体中循环的亚型(包括A/WSN/33(H1N1)，A/PR/8/34(H1N1)和A/Udorn/72(H3N2))的甲型流感病毒充分表征的实验室毒株上。肽F3和F1在噬菌斑减少测定中在对抗若干其它甲型流感病毒毒株上表现出相似的效力，所述毒株包括H1N1临床分离体(A/New Caledonia/20/99)和H3N2(A/NY/55/04；A/Cal/07/04)毒株，这些在实验室中均没有进行过广泛的评估。关于当前临床分离体的研究，对于例如确立目前引起人类中流感的病毒的治疗效力是很重要的。重要的是，这些毒株还引起了白鼬中的流感，这引起了鼻内接种后鼻腔和肺内的高滴定度。
对于所有的研究，病毒分离体使用标准程序在含胚的鸡蛋中增殖(得自Charles River Laboratories或Louisiana State University PoultrySciences Department)。在接种后一天从11天大的鸡蛋收集尿囊液，使用标准程序对病毒库进行对抗土耳其红血细胞(tRBC)(LampireLaboratories，USA)的血细胞凝集活性测定。阳性血细胞凝集(＞256HA单位)病毒库通过上述病毒噬菌斑测定进行滴定，并且在用于攻击研究之前储存在液氮中。在磷酸盐缓冲液中制备肽，该缓冲液通过使用移液管直接用于麻醉的白鼬的鼻道(鼻内给药途径)。
攻击研究1
在病毒暴露之前(第一天和第二天)，通过鼻内途径以约0.3mg/Kg的剂量用F3或肽(SEQ ID NO：14)的杂混对照形式对白鼬进行预处理，一天一次或一天两次。在最后一次处理后12小时，用约105pfu的H3N2甲型流感A/Cal/07/04毒株通过鼻内接种对动物进行感染，这是感染剂量发现研究中确定的最小感染剂量的至少100倍。在病毒体暴露后第0天的12小时以后，以及第1天和第2天，以0.3mg/Kg的剂量对白鼬再次给药。在第2天，所有用任意对照肽处理的白鼬都表现出显著的呼吸性窘迫(快速浅呼吸)，高烧和打喷嚏。相反地，用F3处理的动物都没有表现出严重的呼吸性窘迫，虽然有一部分(一天两次预处理剂量组中的2/5，一天一次预处理剂量组中的1/6)表现出带有低热的某些非常轻微的呼吸症状。在第3天，所有用F3处理的白鼬都没有表现出流感的临床症状，而50％用任意对照肽处理的白鼬仍然表现出瞌睡，100％用任意对照肽处理的白鼬表现出显著的鼻炎。清楚地，在该最初的攻击实验中，F3提供了显著的并且令人惊讶的有效治疗效果。
攻击研究2
在第二个任务研究中，F3处理组中包括12只白鼬，对照肽组中包括12只白鼬。用约105pfu的甲型流感A/Cal/07/04感染动物；然而，在该研究中，在第0天病毒体暴露后4小时后用0.3mg/Kg F3或对照肽处理白鼬，而没有预先的病毒体暴露处理。在第2天，所有用任意对照肽处理的12只白鼬都表现出显著的呼吸性窘迫，高烧。和打喷嚏。相反地，在该时间段，用F3处理的动物没有表现出呼吸性窘迫的任何症状或其它流感症状。附图6显示了研究期间白鼬中观察到的病理反应，这是在整个活体研究期间通过监视两个处理组的呼吸性窘迫(图A)，鼻炎(图B)和活动力(图C)获得的。
如图6表明的，相对于对照组，F3处理的动物表现出显著降低的病理反应。仅仅2只F3处理组的动物表现出流感的轻微症状，并且这发生在实验的第4天，也就是肽处理停止的两天以后。除了临床参数，在整个研究阶段，以每天的周期对鼻腔抽吸物以及肺和肺外组织进行采集用于研究病毒价、宏观病理学、和组织病理学分析。用F3处理的动物显示正常的肺部扫描。相反地，用对照肽处理的白鼬表现出炎症迹象。相比对照肽处理的动物，F3处理的白鼬的组织表现出显著降低的病状，对照肽处理的白鼬表现出具有流感感染的支气管渗出特性的渗透、支气管炎症。
流感病毒核蛋白基因的定量RT-PCR分析和保守引发剂提供了处理的并且感染的白鼬中组织匀浆中病毒染色体RNA水平的可靠分析。鼻腔抽吸物样品在研究时期期间从动物中收集。这些样品的病毒价显示在图7，图A中。来自本研究第一天的脑、气管活体、脾和血的白鼬组织匀浆的分析结果显示于图7的图B中。图A中的数据表明，白鼬鼻洗剂中流感病毒的峰值病毒价减少了大于2.0log10，以及在肺中减少了大于6.0log10。这些结果表明，F3显著降低了流感病毒在白鼬上呼吸道的复制。图B中的数据表明，F3有效地阻止了病毒传播到下呼吸道和其它器官。
流感FIR的鉴定
流感病毒FIR的羧基端可以定义为紧挨着在N-螺旋的羧基端(残基104)之外发现的呈现出正向增加Wilmley-White界面亲水性曲线中的界面疏水性的第一个肽序列之前的那个残基。下面的表3显示了Wimley和White 1996所述的蛋白在膜界面上的Wimley-White界面疏水性。该疏水性和亲水性度量是基于一个肽残基从一个疏水膜双分子层转移到一个水相中所需的自由能改变。在该度量中，正自由能(ΔG)，千卡每摩尔，表示了更多的疏水性残基(即，必须加入能量以将疏水性残基从疏水性膜转移到水中)。类似地，负自由能表示更多的亲水性残基。
在Wimley-White界面疏水性图中，FIR以亲水性的峰值区域表征(即，包括位于两个疏水性局部最小值之间的疏水性局部最大值的相对较高的疏水性的区域)。该峰值区域起始于HA2的N-螺旋中，并且终止于离N-螺旋约15个残基之内。
表3：Wimley-White界面疏水性度量
| X-残基 | pH | ΔG(kcal mol-1) |
| Ala | 8 | -0.17±0.06 |
| Arg | 2 | -0.81±0.11 |
| Asn | 8 | -0.42±0.06 |
| Asp | 8 | -1.23±0.07 |
| Asp | 2 | 0.07±0.11 |
| Cys | 8 | 0.24±0.06 |
| Gln | 8 | -0.58±0.08 |
| Glu | 8 | -2.02±0.11 |
| Glu | 2 | 0.01±0.15 |
| Gly | 8 | -0.01±0.05 |
| His | 8 | -0.17±0.06 |
| His | 2 | -0.96±0.12 |
| Ile | 8 | 0.31±0.06 |
| Leu | 8 | 0.56±0.04 |
| Lys | 2 | -0.99±0.11 |
| Met | 8 | 0.23±0.06 |
| Phe | 8 | 1.13±0.05 |
| Pro | 8 | -0.45±0.12 |
| X-残基 | pH | ΔG(kcal mol-1) |
| Ser | 8 | -0.13±0.08 |
| Thr | 8 | -0.14±0.06 |
| Trp | 8 | 1.85±0.06 |
| Tyr | 8 | 0.94±0.06 |
| Val | 8 | -0.07±0.05 |
计算机程序，例如得自网站：blanco.biomol.uci.edu/mpex的Membrane Protein Explorer(MPEx)，可以用来计算蛋白或多肽的界面亲水性分布。MPEx程序结合了Wimley-White亲水性度量，并且构成了确定这些肽序列界面疏水度的优选方法。MPEx计算机程序用于辅助表征图2中所示13个连续的HA2变体每一个的FIR羧基末端。MPEx计算机程序图示了蛋白和相关肽的Wimley-White界面亲水性值，这是通过将固定编号的连续氨基酸残基(优选地约19个残基)组成的窗口中所有残基的全残基亲水性值平均，然后将平均亲水值以窗口中中间残基亲水性数值的形式在该窗口中绘成图。然后窗口通过一个残基从氨基末端移到羧基末端方向进行变化，该过程进行重复直到各兴趣区中的残基的亲水性值得到确定。
图2中显示的所有13个HA2亚型的Wimley-White界面亲水性分布特征通过使用MPEx程序制得，其使用了19个氨基酸残基的窗口。FIR的氨基末端在蛋白N-螺旋内的点位上找到，其中界面亲水性在局部最小值(即，迄今为止验讫的HA2蛋白的残基77处)之后稳定增加。FIR的羧基末端是远离N-螺旋的紧挨第一个疏水性区域最小值之前的残基，即，紧挨远离N-螺旋羧基末端的具有阳性增加的界面疏水性的第一肽序列之前的残基。在附图2中所示的各个甲型流感HA2亚型中，N-螺旋终止于残基104。Wimley-White亲水性数值图不需要在零轴上方交叉以用于确定FIR羧基末端的位置，相对在前肽残基，这只是在亲水性数值上有增加。
图8-20显示了甲型流感的HA2融合蛋白的13个连续变体的MPExWimley-White亲水性分布特征(在这些附图中，“A”表示肽的FIR，由亲水性图中的峰值表征)。附图8-20中各FIR的羧基末端用“B”表示。通过分析，可以确定的是，各病毒HA2亚型的FIR的氨基末端起始于HA2序列的残基77。各病毒HA2亚型的FIR的羧基末端在残基110-119之间不同。FIR区域在附图2中以环绕残基77-110或119的黑色边界突出显示。
具有提高的活性的本发明的肽可以通过准备成套的肽得到鉴定，所述成套的肽相比活性目标抑制剂蛋白的FIR部分(例如，SEQ ID NO：2)要么较长(相应于HA的侧翼序列)要么较短。通过在肽的氨基或羧基端将目标HA氨基酸序列延伸3-6个氨基酸的肽进行针对流感病毒组的系统试验，以确定是否任意序列侧链上的氨基酸部分都能促成增加的感染性抑制。如果长于目标序列的以低于目标的IC50抑制了甲型流感的感染，那么可以对具有比目标少的附加氨基酸的肽进行系统试验以确定具有感染抑制活性的最小肽。对特殊型/或亚型特异性的亚型也可以用来试验对抗流感病毒相同型或亚型的若干其它毒株，从而确定抑制活性的宽度。例如，基于SEQ ID NO：5的目标肽应该以IC50＜100nM抑制多样的H5亚型。
其它适于试验的肽变体可以通过系统地将目标序列中的参加改变成丙氨酸残基而确定(这里指的是“丙氨酸扫描”)。丙氨酸修饰的肽和野生型肽的对照鉴定出对融合/感染抑制作用重要的残基。如果多于一个的氨基酸影响抑制作用，可以通过在各显著性残基上的改变来合成其它的肽。
推定的本发明的肽(例如，SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：13)定向的功能性区域是构型中的α-螺旋。改善或破坏螺旋的肽的变体可以改变作为甲型流感病毒融合/感染抑制剂的活性。相应地，活性肽的变体或类似物可以通过将有利于螺旋内容物的氨基酸，例如氨基丁酸(AIB)或谷氨酸取代成其它的氨基酸而制备。同样，将脯氨酸或甘氨酸加入到肽可以破坏α-螺旋内容物，这将有益地改善或者降低抑制活性。其它通过筛选组合库鉴定的具有提高结合HA2的类似肽也可以就流感病毒感染性抑制作用进行试验。
鼻腔或肺中的肽酶可能潜在地限制了体内平台治疗的利用。如果在噬菌斑减少测定中有活性的肽的变体退化了或者从呼吸组织中快速地被清除掉，那么可以执行其它用于增加肽稳定性和保留能力的改良。干燥粉末或配方的改变/添加可以改良肽的稳定性。具有两个添加的半胱氨酸以提供二硫化物环化的肽的环化肽类似物可以稳定二级结构，并且使肽更能抵抗分解。两个或多个残基的脯氨酸取代也可以显著增加合成肽的稳定性。各种对蛋白(例如，血清白蛋白)或类脂物(例如，肉豆蔻酸)氨基或羧基末端的修饰或结合也可以提高病毒抑制性肽活性的稳定性(Qureshi等，1990)，在肽切割位点引入非天然氨基酸(羟脯氨酸或D-氨基酸)可以起到相同作用。
如果抑制性肽在含水溶液中表现出低溶解性，肽变体可以以序列ASKSKSK(SEQ ID NO：15)的变体添加到羧基末端合成以提高肽的溶解性。该肽表现出提高了模型肽的溶解性，同时保护了二级结构。提高的溶解性还可以降低抑制流感病毒膜介导的融合的所需浓度。
保守残基序列
我们已经观察到，高保守序列，YNAELL(SEQ ID NO：1)，位于13个连续HA2亚型的11个中的FIR内，并且表现出在SEQ ID NO：1中单个氨基酸取代的相应序列YNAKLL(SEQ ID NO：16)出现在其它两个亚型中。13个连续的HA2变体中仅仅一个其它序列比YNAELL(SEQ ID NO：1)被更加高地保守取代。这个序列，AIAGFIE(SEQ ID NO：31，全长蛋白的残基5-11)，位于融合HA2蛋白的肽，或FP内。FP区域是现有已知5个一级病毒融合蛋白区域的一个，并且FP区域在病毒到细胞融合过程中起到重要作用也是现有已知的。
本发明所述上下文中(尤其是在下面权利要求的上下文中)的术语“一个”和“一种”和“该”和类似术语的使用解释为覆盖了单数和复数，除非这里有另有说明或与上下文中明显矛盾的。术语“包含”，“具有”，“包括”和“含有”解释为开放式术语(即，意为“包括，但是不限于”)，除非另有说明。这里的数值范围的描述只是为了用作单独涉及各落入该范围内单独数值的速记方法，除非这里另有说明，并且各单独数值结合于说明书中，似乎它们在这里是单独叙述的。这里所述的所有方法可以以任何合适的顺序完成，除非这里另有说明或明显与上下文内容矛盾的。这里提供的任何以及所有实施例，或示范性语言(例如，“例如”)的使用不是为了限定本发明的范围，除非另有说明。说明书中的语言都不应该解释为表示用于实践本发明的任何作为基础的未提出权利要求的要素。
在此描述了本发明优选的实施方案，包括发明人所知的用于进行本发明的最佳方式。在阅读了之前的描述后，那些优选实施方案的改变对于本领域技术人员来言是显而易见的。发明人希望本领域技术人员按照需要使用这些改变，并且发明人打算除了在此特定描述明的以外来实施本发明。因此，本发明包括通过适用的法律许可的所附权利要求中所述主题的所有改变和等价物。此外，本发明包括在其所有可能的改变中的上述元素的任何组合，除非在此另有说明或另外与上下文明显矛盾。
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Claims (30)
1.一种由选定的野生型流感血球凝集素2蛋白的一部分或其变体的8至40个连续的氨基酸残基组成的分离肽，选定的血球凝集素2蛋白的一部分包含蛋白的融合起始区(FIR)以及FIR氨基端和羧基端侧上至多5个氨基酸残基，并且至少包括序列YNAELL(SEQ ID NO：1)或其变体，该变体通过一个或多个选自Y1S、Y1T、Y1W、Y1A、N2Q、A3L、A3I、A3V、E4D、E4K、E4R、E4H、L5I、L5V、L5A、L6I、L6V和L6A的氨基酸取代而不同于SEQ ID NO：1；
FIR的氨基酸序列包含选定的野生型血球凝集素2(HA2)蛋白的一部分，该部分起始于蛋白的N-螺旋中约残基77，并且终止于选定的野生型血球凝集素2蛋白的残基110至残基119范围中的一个残基，FIR的羧基端是紧挨着在野生型序列残基104之外的开始增加Wimley-White界面疏水性区域的第一残基之前的那个残基；
变体通过选定的野生型蛋白部分的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代而不同于选定的野生型蛋白；该取代选自其它野生型流感HA2蛋白的相应氨基酸残基，并优选选择使得变体能保持Wimley-White界面亲水性分布特征，变体在至少一个野生型HA2蛋白的相应区域的Wimley-White界面亲水性分布特征的局部最大值和局部最小值的约5个氨基酸残基之内具有局部最大值和局部最小值。
2.权利要求1的方法，其中野生型流感血球凝集素2蛋白选自甲型流感HA2亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10、H13、H14、H15和H16。
3.权利要求1的方法，其中野生型流感血球凝集素2蛋白是乙型流感HA2蛋白。
4.权利要求1-3任一项的分离肽，其中血球凝集素2蛋白的部分由选定的野生型HA2蛋白的残基72-113组成。
5.权利要求1-4任一项的分离肽，其中肽由SEQ ID NO：2(EVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDS)或其变体的8-40个连续氨基酸残基组成，变体通过一个或多个氨基酸取代不同于SEQ ID NO：2；
其中肽至少包含SEQ ID NO：2或其变体的氨基酸残基23至28；并且其中一个或多个氨基酸残基取代选自：E1D、E1N、E1Q、V2G、V2S、V2T、V2I、V2L、V2A、V2M、V2C、E3D、E3N、E3Q、G4T、G4S、G4K、G4R、G4H、G4Q、G4N、R5K、R5H、R5Q、R5N、I6L、I6V、I6A、I6M、I6C、Q7N、Q7E、Q7D、Q7G、Q7S、Q7T、D8E、D8N、D8Q、D8M、D8C、L9I、L9V、L9A、L9M、L9C、E10D、E10N、E10Q、E10I、E10L、E10V、E10A、E10M、E10C、K11R、K11H、K11D、K11E、K11N、K11Q、Y12W、Y12K、Y12R、Y12H、V13I、V13L、V13A、V13G、V13T、V13S、V13M、V13C、E14D、E14K、E14R、E14H、D15E、D15R、D15N、D15Q、T16G、T16S、T16A、T16Q、T16N、K17F、K17R、K17M、K17C、K17I、K17V、K17L、K17A、I18L、I18V、I18A、I18T、I18S、I18G、I18Q、I18N、D19E、D19N、D19Q、L20I、L20V、L20A、L20C、L20M、W21Y、W21A、S22T、S22G、S22A、S22M、S22C、Y23W、Y23S、Y23T、Y23A、N24Q、N24D、N24E、A25I、A25V、A25L、A25M、E26D、E26K、E26R、E26H、L27A、L27I、L27V、L27M、L28I、L28V、L28A、L28M、V29I、V29L、V29A、V29M、A30I、A30L、A30V、A30M、A30C、L31I、L31V、L31A、L31M、L31C、E32D、E32N、E32Q、N33Q、N33Q、Q34E、N33E、Q34E、Q34D、Q34G、Q34S、Q34T、H35K、H35R、H35N、H35Q、T36S、T36G、I37L、I37V、I37A、I37M、I37C、D38E、D38N、D38Q、L39F、L39I、L39V、L39M、L39C、L39A、L39E、L39D、L39N、L39Q、T40H、T40R、T40K、T40S、T40G、T40A、T40M、D41E、D41N、D41Q、S42G、S42T、S42I、S42L、S42V、S42A、S42M和S42C。
6.权利要求1-5任一项的分离肽，其中变体与SEQ ID NO：2具有至少50％的序列同一性。
7.权利要求1-5任一项的分离肽，其中变体与SEQ ID NO：2具有至少60％的序列同一性。
8.权利要求1-5任一项的分离肽，其中变体与SEQ ID NO：2具有至少70％的序列同一性。
9.权利要求1-5任一项的分离肽，其中变体与SEQ ID NO：2具有至少80％的序列同一性。
10.权利要求5-9任一项的分离肽，其中SEQ ID NO：2的变体包括取代E26K
11.权利要求1-5任一项的分离肽，其中肽包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的氨基酸序列。
12.权利要求1-11任一项的肽的类似物，其中该类似物包括至少一种以下修饰：
(a)环状肽结构，包括：至少两个形成二硫键的半胱氨酸残基，每个半胱氨酸残基独立地是肽的残基，结合肽氨基端的残基，或结合肽羧基端的残基；
(b)肽的肽酶切割位点上的非天然氨基酸残基的取代；
(c)一个或多个脯氨酸残基代替肽序列中的残基；或
(d)一个或多个甘氨酸残基代替肽序列中的残基。
13.权利要求12的类似物，其中非天然氨基酸残基是D-氨基酸。
14.权利要求1-13任一项的肽或类似物的衍生物，其中肽或类似物包括结合肽的非HA2衍生基团。
15.权利要求14的衍生物，其中非HA2衍生基团包含至少一种以下基团：
(a)结合肽残基的脂质；
(b)结合肽残基的聚乙二醇基团；或
(c)结合肽的氨基端，羧基端或两端的非HA2肽序列。
16.对权利要求1-15任一项的肽、类似物或衍生物具有选择性的分离抗体。
17.一种药物组合物，所述药物组合物在药物学上可接受的载体中含有权利要求1-16任一项的肽、类似物、衍生物或抗体。
18.权利要求1-17任一项的肽、类似物、衍生物、抗体或组合物用于治疗流感感染的用途。
19.权利要求1-17任一项的肽、类似物、衍生物、抗体或组合物用于预防流感感染的用途。
20.权利要求1-17任一项的肽、类似物、衍生物、抗体或组合物用于制备治疗流感的药物的用途。
21.一种治疗流感感染的方法，所述方法包括给患有流感的个体施用流感抑制量的权利要求17的药物组合物。
22.权利要求21的方法，其中个体患有甲型流感亚型H1、H3或H5感染。
23.权利要求21的方法，其中个体患有乙型流感感染。
24.一种预防流感感染从流感感染个体传播至非流感感染个体的方法，所述方法包括给患有流感的个体施用流感抑制量的权利要求17的药物组合物。
25.权利要求24的方法，其中流感感染个体患有甲型流感亚型H1、H3或H5感染。
26.权利要求24的方法，其中流感感染个体患有乙型流感感染。
27.一种预防个体流感感染的方法，所述方法包括给个体施用流感抑制量的权利要求17的药物组合物。
28.权利要求27的方法，其中流感感染是甲型流感亚型H1、H3或H5感染。
29.权利要求27的方法，其中流感感染是乙型流感感染。
30.权利要求21-29任一项的方法，其中给药包括药物组合物的鼻内给药。
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