ES2578798T3 - Método de ligación nativa - Google Patents

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Abstract

Péptido funcionalizado elegido entre: a) el péptido de fórmula (I): X1-N(CH2CH2SeH)2; o b) el péptido de fórmula (I'):**Fórmula** en las que X1 representa un fragmento peptídico y el grupo -N(CH2CH2SeH)2 o**Fórmula** forma un enlace amida con la terminación C>=O del resto de aminoácido del fragmento peptídico X1 que está en posición C-terminal.

Description

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mediante la puesta en presencia de al menos un compuesto reductor de los enlaces diselenio. 10 De acuerdo con un modo de realización, el compuesto (IX’i) se obtiene por reacción entre un compuesto de fórmula (XIi), (XI’i) o (XI"i): (XIi) X’i-S-R1
15
20
imagen8
(XI"i) X’i-N(CH2-CH2-S-H)2
25 en las que X’i es un fragmento peptídico de la forma Ci-1-Xi para i > 1 y X’1 representa X1, R1 representa un grupo alquilo o arilo, opcionalmente sustituido, y un compuesto de fórmula (III’) o de fórmula (III") de acuerdo con la invención.
De acuerdo con un modo de realización, el método mencionado anteriormente se realiza para la preparación de un 30 polipéptido representado con la fórmula (XII):
(XII) X1-C1-X2-C2-X3
que comprende las etapas siguientes: 35 a) reacción entre un compuesto de fórmula (XIII) o (XIII’):
(XIII) R2-X1-N(CH2-CH2-Se-H)2
imagen9
45
y un compuesto de fórmula (XIV) o (XIV’):
(XIV)
H-C1-X2-N(CH2-CH2-S-H)2
50
imagen10
para formar el compuesto de fórmula (XV) o (XV’):
60
(XV)
R2-X1-C1-X2-N(CH2-CH2-S-H)2
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extremo C-terminal) en vista de la etapa de funcionalización.
Funcionalización
5 La etapa de funcionalización comprende de forma sucesiva:
-Opcionalmente, proteger el extremo N-terminal del polipéptido de fórmula (II) con un grupo protector, elegido preferentemente entre la familia de los carbamatos, amidas o grupos alquilo, y en particular un grupo tercbutoxicarbonilo (t-Boc), Fmoc (9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilo), trifluoroacetilo o trifenilmetilo.
-Opcionalmente también, proteger las funciones de las cadenas laterales de los restos de aminoácidos del polipéptido de fórmula (II), y en particular de las funciones amina (preferentemente por medio de los grupos protectores mencionados anteriormente) y funciones ácido carboxílico (por medio, por ejemplo, de grupos tercbutilo).
-Como alternativa, y de acuerdo con un modo de realización más sencillo, se puede proporcionar el polipéptido 15 de fórmula (II) directamente en una forma en la que el conjunto de las funciones amina los ácidos carboxílicos estén protegidos, en previsión de una desprotección selectiva de la función COOH del extremo C-terminal. -La reacción de acoplamiento en fase líquida del polipéptido de fórmula (II) con un compuesto de amina elegido entre los compuestos (IIIa) y (III’) en los que:
(IIIa) = NH(CH2-CH2-Se-G1)2
imagen15
en los que G1 representa un grupo protector del selenio, -Opcionalmente desproteger el polipéptido.
De acuerdo con un modo de realización, el grupo protector G1 del compuesto (IIIa) se elige entre los grupos de tipo trifenilmetilo y bencilo y en particular entre para-metilbencilo o para-metoxibencilo.
35 En el caso en el que el compuesto (IIIa) se usa como reactivo de partida para el acoplamiento con el compuesto (II), se prevé una etapa posterior de desprotección del grupo G1 con el fin de obtener el compuesto (I) o (I’). Preferentemente, la desprotección se realiza por tratamiento con un ácido tal como ácido trifluoroacético o ácido fluorhídrico, o un oxidante tal como yodo.
Un activador está presente de forma ventajosa durante la reacción de acoplamiento, por ejemplo hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonio (PyBOP) o hexafluorofosfato de bromo-trispirrolidinofosfonio (PyBROP) o el aminoácido C-terminal en sí mismo es activo en la forma de un derivado halogenado (en particular en forma de un fluoruro de aminoácido o cloruro de aminoácido), pudiéndose formar este previamente o formar in situ con la ayuda de reactivos apropiados conocidos por el experto la materia. Entre los halogenuros de aminoácidos, son preferentes
45 los fluoruros de aminoácidos, formados previamente por reacción con 1,3,5-trifluorotriazina o formados in situ con la ayuda de TFFH (hexafluorofosfato de tetrametilfluoroformamidinio).
De manera general, también se puede considerar cualquier reactivo que permita la activación de la función ácido carboxílico del aminoácido conocido por el experto en la materia, tal como HBTU, TBTU, HATU, BOP... (se podrá hacer referencia, por ejemplo, a Chemical approaches to the synthesis of peptides and proteins de Lloyd-Williams, P., Albericio, F., Giralt, E., 1997, CRC Press). Son preferentes PyBOP, PyBROP, BOP (hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitris-(dimetilamino)-fosfonio) o de manera más general los fosfonios.
El polipéptido funcionalizado (I) o (I’) de acuerdo con la invención se puede obtener de acuerdo con una segunda 55 variante.
Los segmentos de SeEA se pueden formar por separado mediante intercambio a partir de un segmento de SEA de tipo X1-N(CH2CH2-S-G4)2 o tioéster X1-S-R1 con la ayuda de los reactivos de estructura (III’) o (III"), G4 representando un átomo de hidrógeno, un grupo protector de las funciones tiol o un enlace disulfuro y R1 representando un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo o arilo, opcionalmente sustituido.
Los segmentos de SeEA también se pueden formar in situ, durante la ligación mediante intercambio a partir de un segmento de SEA de tipo X1-SEA o tioéster X1-SR1 con la ayuda de los reactivos (III’) o (III"). El segmento de tipo HCys-X2 presente en solución consume el segmento X1-SeEA formado por intercambio. En general, el segmento X165 SeEA formado in situ no se observa ya que reacciona muy rápidamente con el segmento H-Cys-X2. debido a la rapidez del intercambio y de la ligación de SeEA, como resultado se produce una aceleración de la ligación muy
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Preferentemente, el aminoácido AA comprende grupos protectores sobre la totalidad o una parte (preferentemente la totalidad) de las funciones presentes sobre su cadena lateral, y en particular las funciones ácido carboxílico (ácidos aspártico y glutámicos), amina (para la lisina), alcohol (para la serina o la treonina), fenol (para la tirosina), tiol o selenol (para la cisteína o selenocisteína), guanidina (para la arginina) e imidazol (para la histidina). El experto en la
5 materia conoce algunos grupos protectores de este tipo. Por ejemplo, se podrá hacer mencionar la obra de referencia Protective groups in organic synthesis, 2ª edición, T. Greene y P. Wuts, John Wiley & Sons, Inc.
Preferentemente, el aminoácido se activa en presencia de HATU (hexafluorofosfato de 2-(1H-7-Azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio Metanaminio), PyBOP o BOP o de manera más particularmente preferente en presencia de PyBROP, o incluso en forma de un halogenuro, en particular fluoruro (es decir, que un átomo de flúor está unido al grupo acilo del resto de aminoácido).
El aminoácido reacciona con la función amina secundaria presente sobre un soporte sólido funcionalizado para formar un enlace amida. Después del acoplamiento del aminoácido, se puede proceder opcionalmente a la
15 desprotección del mismo.
Por lo tanto, en este modo de realización, la etapa de funcionalización consiste en crear un soporte sólido iniciador a partir de un soporte sólido funcionalizado previamente.
La tercera etapa comprende la síntesis peptídica a partir del aminoácido AA injertado sobre la resina de polímero para producir el compuesto (VII) o (VII’):
imagen20
La etapa de síntesis peptídica se realiza de manera análoga a la que ya se ha descrito anteriormente, que se refiere la síntesis peptídica en fase líquida, siendo proporcionado el iniciador inicial por el aminoácido AA injertado sobre el soporte sólido.
45 Por último, una vez que la síntesis peptídica termina, se prevé una reacción de separación (o escisión) del polipéptido de su soporte, por corte del enlace entre Trt y Se para producir el compuesto (I) o (I’). Preferentemente, el corte se realiza con una solución de ácido trifluoroacético que comprende las trampas de carbocationes conocidas por el experto en la materia tales como agua, triisopropilsilano, tiofenol, tioanisol, anisol, dimetilsulfuro, etc...
Opcionalmente, también se pueden prever las desprotecciones adecuadas de las cadenas laterales de los aminoácidos para la obtención del péptido funcionalizado de fórmula (I) o (I’).
Al igual que para el método en fase líquida, en este estadio es ventajoso prever una etapa de purificación del 55 compuesto, por ejemplo, mediante cromatografía en fase líquida.
Método de ligación nativa
Otro objeto de la invención se refiere a un método de preparación de un polipéptido de fórmula (VIII):
(VIII) X1-C1-X2-C2-...-Ci-1-Xi-...-Cn-1-Xn
en la que,
65 X1, X2,..., Xi,..., Xn son fragmentos peptídicos, C1, C2, ..., Ci-1, ..., Cn-1 son restos de aminoácidos que portan una función tiol, o selenol
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Ejemplos Ejemplo 1: Síntesis de los compuestos 1 (Se2EA) y 2 (Se3EA)
imagen25
Con arrastre de nitrógeno, se añade etanol absoluto a V = 19 ml gota a gota, con agitación a una mezcla de selenio
20 Se (940 mg, 11,9 mmol, 1,5 eq) y borohidruro sódico (NaBH4) (300 mg, 7,9 mmol) enfriado en un baño de hielo. Después de una reacción enérgica, el medio de reacción se lleva a reflujo durante 1 h 30. El diseleniuro de sodio, Na2Se2, formado en solución es de color marrón-rojo.
A temperatura ambiente, le clorhidrato de bis(2-cloroetil)amina (847 mg, 4,7 mmol, 0,5 eq) en solución en una 25 mezcla de NaOH ac (0,5 M)/EtOH (1/1) a V = 3 ml se añade gota a gota durante 10 minutos sobre la solución de Na2Se2 y Na2Se3 precedente. El medio de reacción se agita 45 minutos a temperatura ambiente.
El medio de reacción a continuación se diluye a V = 10 ml con una solución de NaOH ac (0,5 M) a continuación se extrae con CH2Cl2 (3 x 30 ml). A continuación, las fases orgánicas se combinan, se secan con Na2SO4, y a 30 continuación se concentran hasta 1/3 del volumen total.
El concentrado orgánico obtenido se extrae a continuación con una solución acuosa de ácido trifluoroacético (TFA) (10 %) y a continuación se purifica directamente por RP-HPLC: Columna C18 X-bridge (d = 1,9 cm, L = 20 cm, 130 Å, 5 µm), detección de UV (λ = 215 nm), tampón A: H2O/TFA (1:0,05 % en v/v), tampón B: CH3CN/H2O/TFA
35 (4:1:0,05 % en v/v/v), isocrático: tampón A (3 min), a continuación gradiente : tampón B (de un 0 % a un 50 % en 9 min, 25 ml/min).
Después de liofilización, los compuestos 1 (Se2EA) 230 mg (Rendimiento R = 21 %) y los compuestos 2 (Se3EA) 240 mg (Rendimiento R = 16 %) se obtienen en forma de un polvo de color amarillo. 40
Análisis de LC-MS Cromatograma de RP-HPLC de los compuestos 1 (Se2EA) y 2 (Se3EA) respectivamente
LC-MS: Tampón A: H2O/TFA (1/0,1 % en v/v), Tampón B: CH3CN/H2O/TFA (4/1:0,1 % en v/v/v).
45 RP-HPLC sobre una columna C18 Xbridge BEH (300 Å, 3,5 µm, 4,6 x 150 mm) usando un gradiente lineal de un 0100 % de B en 30 min, caudal 1 ml/min, detección de UV (λ = 215 nm).
MS: Modo de Ionización por Electronebulización positivo, voltaje del cono 30 V, analizador cuadrupolar.
50 El cromatograma y el espectro de masas del compuesto 1 se representan en las figuras 1a y 1b respectivamente.
El cromatograma y el espectro de masas del compuesto 2 se representan en las figuras 2a y 2b respectivamente.
Ejemplo 2: Síntesis y aislamiento de los segmentos de SeEA de acuerdo con la invención por intercambio, a partir de 55 segmentos de SEA.
Síntesis del péptido 8: H-ILKEPVHGA-SEA
El método de síntesis de este péptido se describe en el documento Ollivier, N.; Dheur, J.; Mhidia, R.; Blanpain, A.; 60 Melnyk, O. Organic letters 2010, 12, 5238-41.
23
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Claims (3)

  1. imagen1
    imagen2
    imagen3
    imagen4
    imagen5
    para formar un compuesto de fórmula (Xi): (Xi) X’i-Ci-Xi+1-...-Cn-1-Xn
  2. 13. Método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el compuesto (IXi) se forma a partir del compuesto (IX’i):
    imagen6
    mediante la puesta en presencia de al menos un compuesto reductor de los enlaces diselenio. 15 14. Método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el compuesto (IX’i) se obtiene por reacción entre un compuesto de fórmula (XIi), (XI’i) o (XI"i): (XIi) X’i-S -R1
    imagen7
    25 (XI"i) X’i -N(CH2-CH2-S-H)2
    en las que X’i es un fragmento peptídico de la forma Ci-1-Xi; para i > 1 y X’i representa Xi, R1 representa un grupo alquilo o un grupo arilo opcionalmente sustituido,
    30 y un compuesto de fórmula (III’) o de fórmula (III") de acuerdo con la reivindicación 4.
  3. 15. Método de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, para la preparación de un polipéptido representado con la fórmula (XII): 35 (XII) X1-C1-X2-C2-X3 que comprende las etapas siguientes:
    a) reacción entre un compuesto de fórmula (XIII) o (XIII’): 40
    imagen8
    y un compuesto de fórmula (XIV) o (XIV’):
    (XIV) H -C1 -X2 -N(CH2-CH2-S-H)2
    imagen9
    60 para formar el compuesto de fórmula (XV) o (XV’):
    (XV) R2 -X1 -C1 -X2 -N(CH2-CH2-S-H)2
    65
    37
    imagen10
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