CN104271589B - 自然连接方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制造多肽的方法，包括至少一个使用用硒基团官能化的肽的自然连接步骤。本发明进一步涉及硒肽和化合物。

Description

自然连接方法
技术领域
本发明涉及用于制造多肽的方法，其包括至少一个使用通过含硒基团官能化的肽的自然连接(native ligation)的步骤。本发明还涉及肽和基于硒的化合物。本发明还涉及用于肽的合成的合成试剂盒。
背景技术
通过常规固相方法即逐个氨基酸的多肽合成在所合成的多肽大时受低产率的限制。为了克服该限制，已知将两个多肽通过化学连接而组装以产生更长的多肽。
对于制备具有严格定义的结构或者带有天然(natural)修饰例如转译后修饰或非天然修饰的蛋白质而言，全(total)多肽合成越来越有用。化学连接方法响应该需要；但是在它们的用途和它们的工业应用方面它们证明是有限制的。
通常，在这些方法中，期望通过连接而组装的多肽之间的链接(link)是自然的，即与多肽的天然结构对应。
目前存在的主要的自然连接方法是Kent和Dawson的例如在国际申请WO 96/34878和WO 98/28434中描述的自然连接方法。该方法基于(C端)肽硫酯和半胱氨酰-肽之间的化学选择性反应。不过，该方法的主要缺点是需要复杂化学方法的肽硫酯的制造。现有技术的这些方法不令人满意，因为它们不可避免地导致可难以分离的混合物，从而影响所获得的最终产物的纯度，和导致产率不可避免的损失。
一种替代方法是国际申请WO 01/68565和WO 01/87920中所描述的被称作Staudinger反应的连接。这包括膦基硫酯与叠氮化物的反应和所组合的反应物的水解以形成酰胺键。然而，该方法难以在工业规模上应用。
描述于国际申请WO 2007/037812中的另一方法基于α-酮酸与N-烷氧基胺按照脱羧缩合反应的反应。然而，所述酮酸是难以制造和结合到肽中的分子。而且，该第三种方法在不具有用于实施复杂有机合成的手段的肽合成实验室中难以应用。
文献WO 2011/051906描述了涉及硫醇化合物的自然连接方法。虽然该方法是高度令人满意的，但是该硫醇化合物的反应动力学有时是缓慢的，特别是当两个肽之间的键周围的氨基酸受阻时。
因此仍然需要这样的自然连接方法，其具有快速的反应动力学以促进通过两个受阻氨基酸之间成键而进行的肽连接。
发明内容
本发明基于如下连接方法的开发：所述连接方法基于使用特定的酰胺肽即SeEA肽和半胱氨酰肽。当使这两种肽在水溶液中接触时，自然的肽键在这两个片段之间形成。该连接非常有效并且以优异的产率进行。其在宽的pH范围内起作用。
该连接与申请FR 09 57 639中描述的SEA连接具有相似性，不过在这两种连接的性质以及SeEA和SEA链段的性质方面存在显著差异。
实际上，SeEA连接的动力学非常显著地优于：用含硫类似物SEA获得的SEA连接的动力学，或者基于使用肽硫酯的自然化学连接(NCL)的动力学。
SeEA的动力学优越性绝对没有降低SEA连接的有用性。相反，其通过如下而对它进行补充：容许形成通过所述其它技术即SEA连接或NCL(硫酯化学)难以产生的接合物(junction)。
在本申请中，SEA基团表示-N(CH2-CH2-S-G4)2基团，其中G4表示H或者硫保护基团或者二硫键。
本发明的第一主题涉及选自如下的经官能化的肽：
a)式(I)：X1-N(CH2CH2SeH)2的肽；或者
b)式(I’)：的肽
其中X1表示肽片段且-N(CH2CH2SeH)2基团或与该肽片段X1的处于C端位置的氨基酸残基的C＝O末端形成酰胺键。
根据一种实施方式，X1包括2-300个氨基酸残基、优选5-100个氨基酸残基、更特别地优选8-50个氨基酸残基。
本发明的另一主题涉及用于获得根据本发明的经官能化的肽(I)或(I’)的方法，所述方法包括以下步骤a1和b1：
a1)用于提供式(II)的多肽的肽合成：
(II)X1-OH
所述多肽优选地在其胺官能团和除了其C端羧酸官能团之外的羧酸官能团上包括保护基团，
b1)步骤a)中获得的多肽的官能化，包括：
–式(II)的多肽与胺化合物在液相中反应以形成式(Ia)X1-N(CH2CH2-Se-G1)2、或(I’)的多肽，所述胺化合物选自：
(IIIa)NH(CH2-CH2-Se-G1)2
其中G1表示硒保护基团或氢原子；
–任选地将式(Ia)的多肽脱保护以产生式(I)的化合物，或者所述方法包括以下步骤a2和b2：
a2)使用
-式(IV)或(IV”)的化合物：
(IV)X1–N(CH2CH2-S-H)2；
或者
-通过带有硫酯官能团的基团官能化的肽(IV’)＝X1–SR，且R表示任选地被取代的芳基或烷基，
b2)式(IV)或(IV”)的化合物或者式(IV’)的化合物与式(III’)或(III”)的胺化合物之间在液相中反应以形成式(I)或(I’)的肽:
本发明的另一主题涉及能够在根据本发明的用于获得经官能化的肽的方法中使用的化合物，该化合物选自：
a)式(III’)：的化合物
b)式(III”)：的化合物
本发明还涉及制造根据本发明的式(III’)和(III”)的化合物的方法，包括：以下用金属氢化物的处理反应，其在NaBH4的情况下示于图中，但是也可使用LiAlH4或LiBH4：
金属
之后为以下反应：
本发明的另一主题涉及用于获得根据本发明的经官能化的肽(I)或(I’)的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供经官能化的聚合物树脂，其具有结构(V)：
或结构(V’)
其中，
□表示固体载体，
Trt表示任选地被一个或多个取代基取代的三苯基甲基，所述取代基特别地选自取代基氯、甲氧基、甲基、氟和氰基，
b)将氨基酸接枝到步骤a)中获得的经官能化的聚合物树脂上以产生结构(VI)或结构(VI’)的化合物：
其中，
□和Trt具有与化合物(V)或(V’)中相同的含义，
AA表示任选地包括一个或多个保护基团的氨基酸残基；
G3表示AA的N端胺官能团的保护基团或者氢原子，
c)从氨基酸AA开始肽合成以产生化合物(VII)或(VII’)：
其中，
□表示固体载体，
Trt表示任选地被一个或多个取代基取代的三苯基甲基，所述取代基特别地选自取代基氯、甲氧基、甲基、氟和氰基，
X1表示肽片段，
d)将Trt和Se之间的键切断以产生化合物(I)或(I’)。
根据以上方法的一种实施方式，将氨基酸接枝到聚合物树脂上包括使经官能化的树脂(V)或(V’)与氨基酸的酰卤(amino acid halide)或者与氨基酸和活化试剂接触，所述活化试剂优选地选自HATU、PyBOP、BOP、PyBROP，更特别地优选HATU。
本发明的另一主题涉及能够在根据本发明的方法中使用的经官能化的聚合物树脂，其具有具有结构(V)：
或结构(V’)：
其中，
□表示固体载体，
Trt表示任选地被一个或多个取代基取代的三苯基甲基，所述取代基特别地选自取代基氯、甲氧基、甲基、氟和氰基。
本发明的另一主题涉及对应于式(VII)或(VII’)的包括肽片段的聚合物树脂：
其中，
□表示固体载体,
Trt表示任选地被一个或多个取代基取代的三苯基甲基，所述取代基特别地选自取代基氯、甲氧基、甲基、氟和氰基，
X1表示肽片段。
根据一种实施方式，所述固体载体□选自聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、纤维素、聚乙烯、聚酯、乳胶、聚酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇-聚苯乙烯共聚物、聚乙二醇-聚丙烯酰胺共聚物、以及其衍生物。
本发明的另一主题涉及用于制造根据本发明的聚合物树脂的方法，包括：
a)提供通过–Trt或-NH-CO-Trt基团官能化的固体载体；
b)使所述固体载体的Trt官能团与式(III)：NH(CH2-CH2-Se-H)2的胺化合物反应
Trt具有与以上相同的含义。
本发明的另一主题涉及用于制造式(VIII)的多肽的方法：
(VIII)X1-C1-X2-C2-…-Ci-1-Xi-…-Cn-1-Xn
其中，
X1,X2,…,Xi,…,Xn为肽片段，
C1,C2,…,Ci-1,…,Cn-1为带有硫醇或硒醇官能团的氨基酸残基，
n为大于或等于2的整数，
i为1到n的任意整数，
该方法包括一个或多个如下步骤：式(IXi)的化合物和式(Xi+1)的化合物之间反应以形成式(Xi)的化合物：
(IXi)X’i-N(CH2CH2-Se-H)2
其中，
X’1表示X1
对于i>1，X’i表示Ci-1-Xi，
(Xi+1)Ci-Xi+1-…-Cn-1-Xn
(Xi)X’i-Ci-Xi+1-…-Cn-1-Xn
根据一种实施方式，化合物(IXi)由化合物(IX’i)通过与至少一种使二硒键还原的化合物接触而形成：
根据一种实施方式，化合物(IX’i)通过式(XIi)、(XI’i)或(XI”i)的化合物与根据本发明的式(III’)或式(III”)的化合物之间的反应而获得：
(XIi)X’i–S–R1
(XI”i)X’i–N(CH2-CH2-S-H)2
其中对于i>1，X’i为形式Ci-1-Xi的肽片段，和X’1表示X1，R1表示任选地被取代的烷基或芳基。
根据一种实施方式，实施以上方法以制造由式(XII)表示的多肽：
(XII)X1–C1–X2–C2–X3
其包括以下步骤：
a)式(XIII)或(XIII’)的化合物与式(XIV)或(XIV’)的化合物之间反应以形成式(XV)或(XV’)的化合物：
(XIII)R2–X1–N(CH2-CH2-Se-H)2
(XIV)H–C1–X2–N(CH2-CH2-S-H)2
(XV)R2–X1–C1–X2–N(CH2-CH2-S-H)2
b)式(XV)或(XV’)的化合物与式(XVI)的多肽之间反应以形成式(XII)的化合物：
(XVI)H–C2–X3，
其中，R2表示X1的N端官能团的保护基团或者H；X1、X2、X3彼此独立地表示肽片段；C1和C2彼此独立地表示带有硫醇或硒醇官能团的氨基酸残基。
本发明的另一主题涉及用于制造式(XVII)的环状多肽的方法：
X2表示肽片段，和C1表示包括硫醇或硒醇官能团的氨基酸残基，
所述方法包括至少一个如下反应步骤：式(XVIII)的多肽与自身连接：
(XVIII)H–C1–X2–N(CH2-CH2-Se-H)2。
根据该根据本发明的用于制造环状多肽的方法的一种实施方式，连接反应通过使式(XVIII’)的多肽与至少一种使二硒键还原的化合物接触而实施
本发明的另一主题涉及多肽合成试剂盒，其包括一种或多种能够在根据本发明的连接方法中使用的式(IXi)或(IX’i)的肽，或者至少一种根据本发明的化合物(III’)或(III”)。
本发明的优点如下：
-本发明的自然连接使得可实现困难的接合物(例如受阻的接合物)的结合，
-本发明的自然连接的动力学非常快速，
-本发明的自然连接可与具有不同动力学的其它连接方法组合，
-本发明的自然连接实施起来简单，
-可从固体载体制造SeEA肽，
-可从SEA链段或硫酯在溶液中制造SeEA肽
-本发明的自然连接可从可在固相中或在液相中制备的肽片段开始实施，
-本发明的自然连接可以以包括若干个相继(successive)连接的一锅法与现有技术的其它类型的自然连接组合，
-本发明的自然连接可通过如下实施：通过简单地将特定的含硒化合物添加至反应混合物而实施现有技术的连接方法。
附图说明
在阅读作为实例并且参照附图给出的本发明的优选实施方式的以下描述时，本发明的其它特征和优点将变得明晰。
图1a和1b分别表示根据本发明的含硒化合物的HPLC色谱图和质谱图。
图2a和2b分别表示根据本发明的含硒化合物的HPLC色谱图和质谱图。
图3a和3b表示用于监测根据本发明的经官能化的肽的合成的HPLC色谱图。
图3c表示根据本发明的经官能化的肽的质谱图。
图4a和4b分别表示根据本发明的经官能化的肽的HPLC色谱图和质谱图。
图5a和5b分别表示纯化之后的根据本发明的经官能化的肽的HPLC色谱图和质谱图。
图6a和6b分别表示通过根据本发明的连接方法获得的多肽的HPLC色谱图和质谱图。
图7表示测量根据本发明和根据现有技术的连接方法的反应动力学的图。
图8表示测量根据本发明和根据现有技术的连接方法的反应动力学的图。
图9a和9b分别表示通过根据本发明的方法获得的经官能化的多肽的HPLC色谱图和质谱图。
图10a和10b分别表示通过根据本发明的方法获得的多肽的色谱图和质谱图。
图11a和11b分别表示通过本发明的方法获得的在纯化之后的多肽的色谱图和质谱图。
图12表示测量根据本发明和根据现有技术的连接方法的反应动力学的图。
图13表示源自根据本发明的经官能化的肽的合成的溶液的HPLC色谱图。
图14a和14b分别表示根据本发明的经官能化的肽的HPLC色谱图和质谱图。
具体实施方式
现在在以下描述中更详细地且非限制性地描述本发明。
“肽或多肽”在本申请的上下文中指的是通过肽键链接的(数量大于或等于两个的)氨基酸残基的线型链。在本申请的意义内的“肽或多肽”可因此例如为寡肽、肽或蛋白质(与这些术语的常规认可一致)。根据本发明的多肽中存在的氨基酸残基可选自蛋白或非蛋白氨基酸残基。优选地，它们选自二十种蛋白氨基酸残基和硒代半胱氨酸。
多肽标记是从N端朝着C端进行的。对于沿着多肽链存在的氨基酸残基的标记，使用通常的单字母或三字母编码。氨基酸残基为式-NH-(CH-R)-(C＝O)-的多肽片段，其中R表示侧链，其从一个氨基酸到另一个氨基酸是不同的。
“肽片段”在本申请的上下文内指的是，多肽的包括至少一个氨基酸残基的部分。肽片段在本申请的意义内可因此例如为：如果肽片段既不包括多肽的N端也不包括C端的话，(例如-AHG-或-Ala-His-Gly-的)氨基酸残基的序列；或者如果肽片段包括多肽的N端的话，在其N端处具有基团的氨基酸残基的序列(例如H-AHG-或H-Ala-His-Gly-)；或者如果肽片段包括多肽的C端的话，在其C端处具有氨基酸残基的序列(例如-AHG-OH或-Ala-His-Gly-OH)。
经官能化的肽
本发明的第一主题涉及通过选自如下的硒基团而官能化的肽：
a)式(I)：X1-N(CH2CH2SeH)2的肽；
b)式(I’)：的肽
其中X1表示肽片段且-N(CH2CH2SeH)2基团或与该肽片段X1的处于C端位置的氨基酸残基的C＝O末端形成酰胺键。
肽片段X1为Y1-AA1-AA2-…-AAn形式，其中Y1为N端基团，优选为氢原子，但是任选地也可为本领域技术人员已知的对伯胺或仲胺取代的任何基团，例如酰基且特别是乙酰基；n为大于或等于2的整数；AA1、AA2、…、AAn彼此独立地表示氨基酸残基。
式(I)或(I’)的多肽优选地包括2-300个氨基酸残基、优选5-100个氨基酸残基、更特别地优选8-50个氨基酸残基。
式(I)或(I’)的多肽优选地仅包括选自二十种蛋白氨基酸残基和硒代半胱氨酸的氨基酸残基。然而，根据一种具体实施方式，式(I)或(I’)的多肽包括一种或多种非蛋白氨基酸残基。
式(I)或(I’)的多肽的氨基酸残基可任选地通过侧链保护基团保护。
式(III’)和(III”)的胺化合物
本发明的另一主题涉及下式(III’)和(III”)的胺化合物和它们的制造方法。
化合物(III’)和(III”)对应于下式：
化合物(III’)和(III”)可根据以下方法获得，所述方法包括以下步骤a)：
金属
以及随后的以下步骤b)：
以上第一步骤(步骤a)优选地在氮气气氛下实施。优选地，将反应物以冷状态引入，然后对混合物进行回流。
根据另一实施方式，在步骤a)中，将NaBH4用另外的金属氢化物例如LiAlH4或LiBH4代替。在所提及的这两种金属氢化物的情况下，形成了化合物Li2Se2和Li2Se3。这两种化合物Li2Se2和Li2Se3然后被用于随后的步骤b)中。
优选地，第二步骤(步骤b)在环境温度下实施。
优选地，在该过程结束时对包括产物(III’)和(III”)的有机相进行纯化，例如通过高效液相色谱法。
用于在液相中获得化合物(I)和(I’)的方法
本发明的另一主题涉及用于在液相中获得经官能化的多肽(I)或(I’)的方法，该方法包括肽合成的第一步骤和官能化的第二步骤。
该第一步骤(肽合成步骤)使得可获得下式的多肽：
(II)X1-OH
该肽合成步骤可根据本领域技术人员已知的任何方法实施。其可特别地在液相中或者优选地在固相中实施。
原则上，肽合成包括从引物(primer)(初始的氨基酸或者由之前的氨基酸加入得到的肽片段)和从脱保护开始的氨基酸的一连串偶联。更准确地，所述肽合成可相继包括：
(a)提供具有未被保护的N端的肽片段和在其N端处被保护的氨基酸；
(b)在所述肽片段的N端处在所述氨基酸和所述肽片段之间建立肽键；
(c)将所链接的氨基酸的N端脱保护，以提供下一步骤(a)的肽片段。
在不同的偶联反应期间，如下是有利的：使用活化剂化合物，特别是在三唑(例如1-羟基-苯并三唑或1-羟基-7-氮杂苯并三唑)存在下的碳二亚胺(例如二环己基碳二亚胺或二异丙基碳二亚胺)，或者非亲核阴离子的或脲(uronium)盐(例如HBTU、HATU、TBTU或PyBOP)；以及使用酰卤例如酰氟形式的经活化的氨基酸。
在不同的偶联反应期间，氨基酸的N端有利地通过保护基团、优选Fmoc基团(9H-芴-9-基甲氧基羰基)或叔-Boc基团(叔丁氧基羰基)或NSC基团(2-(4-硝基苯基磺酰基)乙氧基羰基)保护。
类似地，氨基酸残基的侧链优选地在不同的偶联反应期间通过一个或多个合适的保护基团保护，例如对于带有羧酸官能团的链通过叔丁基保护。
在此情况下，一旦已经实施了最后的氨基酸偶联反应，则可提供侧链的脱保护反应。然而，应注意，对于官能化步骤而言保持(除了在C端处的COOH官能团的任选保护之外的)所有的保护可为优选的。
官能化
所述官能化步骤相继地包括：
-任选地，将式(II)的多肽的N端用保护基团保护，所述保护基团优选地选自如下家族：氨基甲酸酯、酰胺或烷基基团，和特别地叔丁氧基羰基(t-Boc)、Fmoc(9H-芴-9-基甲氧基羰基)、三氟乙酰基或三苯基甲基。
-而且任选地，保护式(II)的多肽的氨基酸残基的侧链的官能团和非常特别地，胺官能团(优选地通过以上保护基团)和羧酸官能团(通过例如叔丁基)。
-替代地，且根据一种更简单的实施方式，可直接以其中全部的胺和羧酸官能团被保护的形式，通过提供C端的COOH官能团的选择性脱保护而提供式(II)的多肽。
-式(II)的多肽与选自化合物(IIIa)和(III’)的胺化合物的液相偶联反应，其中：
(IIIa)＝NH(CH2-CH2-Se-G1)2
其中G1表示硒保护基团，
-任选地，所述多肽的脱保护。
根据一种实施方式，化合物(IIIa)的保护基团G1选自三苯基甲基和苄基型的基团并且特别地选自对-甲基苄基或对-甲氧基苄基。
在其中使用化合物(IIIa)作为起始反应物用于与化合物(II)偶联的情况下，提供基团G1的后续脱保护步骤，以获得化合物(I)或(I’)。优选地，所述脱保护通过用酸例如三氟乙酸或氢氟酸、或氧化剂例如碘处理而实施。
在偶联反应期间有利地存在活化剂，例如六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基(PyBOP)或六氟磷酸三吡咯烷基溴化(三吡咯烷基溴化六氟磷酸盐)(PyBROP)，或者C端氨基酸自身被活化为卤化衍生物的形式(特别是氨基酸的酰氟或者氨基酸的酰氯的形式)，后者能够使用本领域技术人员已知的合适反应物预先形成或原位形成。在氨基酸的酰卤中，氨基酸的酰氟是优选的，其通过与1,3,5-三氟三嗪的反应预先形成或者使用TFFH(六氟磷酸四甲基氟代甲脒)原位形成。
通常，也可想到本领域技术人员已知的容许氨基酸的羧酸官能团的活化的任何试剂例如HBTU、TBTU、HATU、BOP等(可参见例如Chemical approaches to the synthesis ofpeptides and proteins,Lloyd-Williams,P.,Albericio,F.,Giralt,E.,1997,CRCPress)。PyBOP、PyBROP、BOP(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)-)或者更通常地所述是优选的。
根据本发明的经官能化的多肽(I)或(I’)可根据第二变型获得。
所述SeEA链段可单独地通过从X1-N(CH2CH2-S-G4)2的SEA链段或X1-S-R1硫酯类型开始，使用结构(III’)或(III”)的反应物进行交换而形成，G4表示氢原子、硫醇官能团保护基团或二硫键，和R1表示氢原子或者任选地被取代的烷基或芳基。
所述SeEA链段也可在从X1-SEA的SEA链段或X1-SR1硫酯类型开始，使用反应物(III’)或(III”)的交换连接期间原位形成。存在于溶液中的H-Cys-X2类型的链段消耗通过该交换而形成的X1-SeEA链段。通常，观察不到原位形成的X1-SeEA链段，因为其非常快速地与H-Cys-X2链段反应。由于所述交换和所述SeEA连接的快速性，一旦将反应物(III’)或(III”)引入到连接反应介质中，则这导致所述连接非常显著的加速。
因此，根据第二变型，化合物(I)和(I’)通过以下相继步骤获得：
a2)提供
-对应于式(IV)或(IV”)的在其C端上通过带有硫醇官能团的基团官能化的肽：
(IV)＝X1–N(CH2CH2-S-H)2
-通过带有硫酯官能团的基团官能化的肽(IV’)＝X1–SR，且R表示任选地被取代的芳基或烷基，
b2)式(IV)的化合物或式(IV”)的化合物或者式(IV’)的化合物与式(III’)或(III”)的胺化合物之间的液相反应：
在其中使用化合物(IV”)的情况下，所述液相反应任选地在使二硫键还原的化合物的存在下进行。
式(IV)或式(IV”)的化合物可特别地根据文献WO 2011/051906中描述的实验方案(protocol)获得。
在式(IV’)中，R基团优选地表示任选地被取代的C1-C12烷基或者任选地被取代的C6-C12芳基。这样的化合物特别地由WO96/34878和WO98/28434所描述。
根据一种实施方式，所述使二硫键还原的化合物可选自硫醇化合物，例如4-巯基苯基乙酸(MPAA)、二硫苏糖醇(DTT)、苯硫酚和其衍生物、烷基硫醇(特别是苄基硫醇)；硒醇化合物例如苯硒酚或者二苯基硒醚；或者膦例如三(2-羧基乙基)膦(TCEP)；或者其混合物。
在前一偶联反应结束时，获得化合物(I’)。通过使化合物(I’)与使二硒或三硒键还原的化合物接触而获得化合物(I)。
在已知的使二硒或三硒键还原的化合物中，可提及：三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、还原硫醇例如4-巯基苯基乙酸(MPAA)、苯硫酚、苄基硫醇、二硫苏糖醇(DTT)、苯硒酚或者二苯基硒醚加上二硒键还原剂、金属锌、和氢化物例如NaBH4、LiBH4、NaBH3CN、NaBH(OAc)3。
在官能化步骤结束时，获得式(I)或(I’)的多肽。在该步骤处提供化合物纯化步骤(例如，通过液相色谱法)是有利的。
经官能化的聚合物树脂
本发明的另一主题涉及对应于结构(V)或(V’)的经官能化的聚合物树脂：
其中，
□表示固体载体，
Trt表示任选地被一个或多个取代基取代的三苯基甲基，所述取代基特别地选自取代基氯、甲氧基、甲基、氟和氰基。
这些聚合物树脂然后被用于制备经官能化的SeEA肽。
作为固体载体□，使用可溶性的或者不溶性的聚合物，所述不溶性的聚合物优选为粒子(珠)的形式。可例如使用基于聚苯乙烯(优选)或者基于聚丙烯酰胺、聚乙二醇、纤维素、聚乙烯、聚酯、乳胶、聚酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇-聚苯乙烯共聚物、聚乙二醇-聚丙烯酰胺共聚物的树脂，以及由其衍生的树脂。
为了制备经官能化的聚合物树脂(V)或(V’)，使用带有合适官能团的固体载体□即□-Z，其中Z为链接体(linker)基团。优选地，所述固体载体具有氯代三苯基甲基(即氯代三苯甲基)基团，其中所述三苯基甲基任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基特别地选自取代基氯、甲氧基、甲基、氟和氰基。
作为经官能化的固体载体□-Z的实例，可提及具有三苯甲基氯、2-氯三苯甲基氯、4-甲基三苯甲基氯或4-甲氧基三苯甲基氯链接体基团的聚苯乙烯树脂。这样的固体载体可例如从Glycopep商购得到。
根据另一实施方式，经官能化的固体载体□-Z具有这样的链接体基团：其为三苯甲基-醇类型的基团，即，OH-Trt-CO-NH-基团，其中所述三苯基甲基(Trt)任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基特别地选自取代基氯、甲氧基、甲基、氟和氰基。具有这样的链接体基团的固体载体已经例如描述于Quibell,JACS 1995,117,11656-11668中并且可例如以系列的固体聚乙二醇载体商购获得。
该类型的固体载体的使用要求预先将固体载体如下活化的步骤：
–用溴化试剂(特别是乙酰溴)活化以将链接体基团改性为Br-Trt-CO-NH-形式；
–或者用氯化试剂(特别是草酰氯)活化以将链接体基团改性为Cl-Trt-CO-NH-形式；
–或者用酸例如三氟乙酸活化，以将链接体基团改性为H2O+-Trt-CO-NH-形式；
–或者用BF3.Et2O活化，以将链接体基团改性为BF3:HO-Trt-CO-NH-形式，所述改性根据Singh,S.等,J.Org.Chem.2004,69,4551-4554。
该类型的活化步骤例如描述于Harre等,Reactive&functional Polymers1999,41,111-114中。
所述经官能化的聚合物树脂的制备通过将式：
(III) NH(CH2-CH2-Se-H)2
的胺化合物与以上经官能化的固体载体□-Z偶联而实施。胺化合物(III)自身可通过将其中G1为硒保护基团的以上式(IIIa)的胺化合物脱保护而获得。
所述偶联在酸介质中实施以限制使仲胺暴露的风险，所述风险会导致副反应。
优选地将过量的三苯甲基氯基团中和，例如用甲醇中和。然后，重要的是加入碱以中和所形成的HCl。
可提供如下：所述经官能化的聚合物树脂的制备形成式(I)和(I’)的多肽的固相制造方法的组成部分。
替代地，可预先且单独地制备所述经官能化的聚合物树脂，以准备好在式(I)和(I’)的肽的固相制造方法的范围内使用。
该类型的固体载体的使用能够使得使用与聚苯乙烯类型的树脂相比更适合于制备长的多肽的聚乙二醇或聚乙二醇-聚苯乙烯类型的树脂骨架成为可能。
优选地，所述树脂粒子具有1-1000μm的Dv50。Dv50定义为粒度分布的50％，即，50％的粒子具有小于Dv50的尺寸且50％具有大于Dv50的尺寸。通常，Dv50为粒子的粒度分布(体积分布)的特性，并且其可通过激光粒度测定术(在小于200μm的尺寸的情况下)或者通过过筛(在大于200μm的尺寸的情况下)而测定。
本发明的另一主题涉及具有结构(VII)或(VII’)的接枝到经官能化的聚合物树脂上的肽：
其中，
□表示固体载体,
Trt表示任选地被一个或多个取代基取代的三苯基甲基，所述取代基特别地选自取代基氯、甲氧基、甲基、氟和氰基，
X1表示这样的肽片段：其在其C端上被官能化。
用于获得式(I)和(I’)的肽的固相方法
本发明的另一主题涉及前述肽(I)和(I’)的固相制造方法。
该固相方法包括官能化阶段以及随后的肽合成阶段。
第一步骤包括提供具有以下结构的经官能化的聚合物树脂：
或者
其中，
□表示固体载体，
Trt表示任选地被一个或多个取代基取代的三苯基甲基，所述取代基特别地选自取代基氯、甲氧基、甲基、氟和氰基。
该方法的第二步骤包括将氨基酸G3–AA接枝到第一步骤中获得的经官能化的聚合物树脂(V)或(V’)上，以产生结构(VI)或结构(VI’)的化合物：
其中，
□和Trt具有与化合物(V)或(V’)中相同的含义，
AA表示任选地包括一个或多个保护基团的氨基酸残基；
G3表示AA的N端胺官能团的保护基团或者氢原子。
优选地，氨基酸AA在其N端处通过在碱的存在下不安定的保护基团G3保护，所述保护基团G3优选地选自2-(4-硝基苯基磺酰基)乙氧基羰基(NSC)或Fmoc基团。
优选地，氨基酸AA在存在于其侧链上的全部或一些(优选全部)官能团并且特别是羧酸(天冬氨酸和谷氨酸)、胺(对于赖氨酸)、醇(对于丝氨酸或苏氨酸)、酚(对于酪氨酸)、硫醇或者硒醇(对于半胱氨酸或硒代半胱氨酸)、胍(对于精氨酸)和咪唑(对于组氨酸)官能团上包括保护基团。这样的保护基团是本领域技术人员已知的。可参考例如参考书Protective groups in organicsynthesis,2nd edition,T.Greene and P.Wuts,JohnWiley&Sons,Inc。
优选地，将所述氨基酸在HATU(2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)--1.1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐，Methanaminium)、PyBOP或BOP的存在下或者更特别优选地在PyBROP的存在下活化，或者此外，活化为卤化物、特别是氟化物(即，氟原子链接至氨基酸残基的酰基)。
所述氨基酸与存在于经官能化的固体载体上的仲胺官能团反应以形成酰胺键。在所述氨基酸的偶联之后，可任选地将后者脱保护。
因此，在该实施方式中，官能化步骤由如下组成：由之前官能化的固体载体产生引物固体载体。
第三步骤包括从接枝到聚合物树脂上的氨基酸AA开始肽合成以产生化合物(VII)或(VII’)：
该肽合成步骤与涉及液相肽合成的之前已经描述的肽合成步骤类似地实施，初始的引物由接枝到固体载体上的氨基酸AA提供。
最后，一旦肽合成完成，则通过将Trt和Se之间的键切断而提供将多肽从其载体分离(或切断)的反应，以产生化合物(I)或(I’)。优选地，所述切断用包括本领域技术人员已知的碳阳离子捕获剂例如水、三异丙基硅烷、苯硫酚、茴香硫醚、茴香醚、二甲基硫醚等的三氟乙酸溶液实施。
也可任选地提供氨基酸的侧链的合适的脱保护，以获得式(I)或(I’)的经官能化的肽。
如对于液相方法那样，在该阶段处提供化合物纯化步骤(例如通过液相色谱法)是有利的。
自然连接方法
本发明的另一主题涉及用于制造式(VIII)的多肽的方法：
(VIII)X1-C1-X2-C2-…-Ci-1-Xi-…-Cn-1-Xn
其中，
X1,X2,…,Xi,…,Xn为肽片段，
C1,C2,…,Ci-1,…,Cn-1为带有硫醇或硒醇官能团的氨基酸残基
n为大于或等于2的整数,
i为1到n的任意整数,
该方法包括一个或多个如下步骤：式(IXi)的化合物与式(Xi+1)的化合物之间反应以形成式(Xi)的化合物：
(IXi)X’i–N(CH2CH2-Se-H)2
其中：
X’1表示X1
和对于i>1，X’i表示Ci-1-Xi
(Xi+1)Ci-Xi+1-…-Cn-1-Xn
(Xi)X’i-Ci-Xi+1-…-Cn-1-Xn
残基Ci为包括硫醇或硒醇官能团的氨基酸残基。该硫醇或硒醇官能团可特别地为β-氨基硫醇官能团或者β-氨基硒醇官能团(在此情况下Ci残基优选地表示半胱氨酸残基或者硒代半胱氨酸残基)、γ-氨基硫醇或者γ-氨基硒醇官能团(在此情况下Ci残基优选地表示同型半胱氨酸或者同型硒代半胱氨酸残基)。
本发明使得通过相继地实施若干连接反应而制造多肽成为可能。这可证明为适合于获得大尺寸的多肽，例如，包括超过约100个氨基酸残基的多肽。实际上，在这样的情况下，通过直接合成而制造式(IXi)和(Xi)的多肽可具有低的产率，并且因此，使用两个或超过两个相继连接从而仅是必须直接合成包括例如少于约50个氨基酸残基的多肽是有利的。
例如，两个相继连接的使用使得可获得包括约150个氨基酸残基的多肽，而不必直接合成包括超过约50个氨基酸残基的多肽；三个相继连接的使用使得可获得包括约200个氨基酸残基的多肽，而不必直接合成包括超过约50个氨基酸残基的多肽。
式(VIII)的多肽可通过使用若干连接方法获得。其它连接方法为，例如，涉及硫酯或者涉及特定的含硫化合物的方法，如WO 2011/051906中描述的。
根据本发明的用于制造式(VIII)的多肽的方法包括至少一个在式(IXi)的化合物与式(Xi)的化合物之间反应的步骤。
因此，根据本发明的方法使得可使用n-1个相继连接而获得式(VIII)的多肽；对于作为在1和n之间整数的i，各Xi为肽片段；和对于作为在1和n之间整数的i，各Ci为包括硫醇或硒醇官能团的氨基酸残基且根据一个具体实施方式，特别是半胱氨酸或硒代半胱氨酸残基。
根据本发明的一种实施方式，化合物(IXi)可由化合物(IX’i)：
在至少一种使二硒和/或三硒键还原的化合物的存在下获得。实际上，式(IX’i)的多肽然后被原位还原并且提供式(IXi)的多肽用于连接反应。
根据一种实施方式，所述还原用化合物选自三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、4-巯基苯基乙酸(MPAA)、苄基硫醇、苯硫酚、DTT、2-巯基乙基磺酸钠(MESNa)、苯硒酚。
与之前对于化合物(I)和(I’)描述的内容类似地，根据一种实施方式，化合物(IXi)和(IX’i)可通过如下形成：从结构X’i–N(CH2CH2-S-G5)2的SEA链段或者从结构X’i–S–R1的硫酯开始，使用结构(III’)或(III”)的含硒化合物，任选地在使二硫和/或二硒键还原的化合物的存在下交换，G5表示H、硫醇官能团的保护基团或二硫键，和R1表示H或者硫的保护基团。
在其中i等于1的情况下，化合物(IXi)和(IX’i)分别与化合物(I)和(I’)对应。
通常，从式(IX’i)的多肽作为反应物开始的连接反应与直接用式(IXi)的多肽的连接反应相比对于实施而言可更为实用。实际上，式(IXi)的多肽具有氧化为式(IX’i)的多肽的自然趋势，特别是在空气的氧气的作用下。例如，如下是可能的：打开形式的(open-form)多肽(IXi)在其以经冻干的形式存储时随着时间流逝而氧化。换而言之，式(IXi)的多肽的制备通常必然部分地包含式(IX’i)的多肽。这两种形式的存在可使表征和纯化复杂化。这是为何通过使式(IX’i)的多肽与式(Xi)的多肽接触，式(IX’i)的具有环状末端的多肽原位还原为式(IXi)的打开的多肽而实施连接反应可更简单的原因。
由于相同的原因，即使当直接通过使式(IXi)的多肽与式(Xi)的多肽接触而实施连接反应时，在所述反应期间使用上述的使硒键还原的化合物的一种或多种也是优选的。
所述连接反应优选地在液相中并且特别是在水性(含水)介质中例如在磷酸盐缓冲液中进行。优选地，该反应以4-8.5的pH、更特别优选以5-7.5的pH和理想地以接近5.5的pH实施。
所述连接反应优选地在0-50℃的温度下和理想地在约37℃的温度下实施。该反应的持续时间是作为反应的反应物和其它条件的选择的函数而调节的。也可根据所述反应期间的液相色谱法–质谱法分析的结果调整合适的持续时间。合适的持续时间典型地为几小时-几天。
在所述反应期间式(IXi)和(Xi)的多肽各自优选地以0.01-50mM的浓度存在。在所述反应期间在式(IXi)和(Xi)的多肽之间的摩尔浓度比率优选为2:3-3:2。
上述连接反应之后可为所获得的式(Xi)的多肽的纯化(例如通过液相色谱法或者通过任何其它常用技术)的步骤。
根据本发明的连接动力学显著地优于用文献WO 2011/051906中描述的含硫化合物或者用硫酯例如Kent和Dawson教导的那些所获得的连接动力学。
由于SeEA连接的快速性，其可在能够参与自然连接反应的其它基团例如SEA或硫酯链段的存在下实施。
SeEA和SEA连接的组合构成用于蛋白质的全合成的非常有效的工具。为了制造必须通过若干片段的连接而合成的蛋白质，可例如对于容易的接合物实施SEA连接和对于困难的接合物实施SeEA连接。实际上，SeEA连接使得可容易地形成受阻的接合物，例如对于Val-Cys接合物在4小时内，而该类型的接合物在SEA连接的情况下需要96小时的连接时间或者在NCL连接的情况下需要8小时。
使用SeEA和SEA连接的另一可用途径是一锅顺序SeEA-SEA连接。可实施后者以在接合物具有类似的位阻时在没有分离和中间纯化的情况下链接三个片段(称作“一锅反应”)。以下解释该变型的实施方式实例。
根据本发明的一种实施方式，本发明的连接方法容许由三个肽片段制造由式(XII)表示的多肽：
(XII)＝X1–C1–X2–C2–X3
所述多肽通过包括以下步骤的方法获得：
a)式(XIII)或(XIII’)的化合物与式(XIV)或(XIV’)的化合物之间反应以形成式(XV)或(XV’)的化合物：
(XIII)＝R2–X1–N(CH2-CH2-Se-H)2
(XIV)＝H–C1–X2–N(CH2-CH2-S-H)2
(XV)＝R2–X1–C1–X2–N(CH2-CH2-S-H)2
b)式(XV)或(XV’)的化合物与式(XVI)的多肽之间反应以形成式(XII)的化合物：
(XVI)H–C2–X3
其中，
R2表示X1的N端官能团的保护基团，
X1、X2、X3彼此独立地表示肽片段，
C1和C2彼此独立地表示带有硫醇或硒醇官能团的氨基酸残基。
以与之前对于获得化合物(I)和(I’)所描述的方式类似的方式，以上化合物(XIII)和(XIII’)可通过从(IIIa)、(III’)或(III”)类型的反应物开始，在结构R2–X1–SEA的SEA化合物或结构R2–X1–S–R1的硫酯的存在下交换而原位形成，从而使得可加速第二连接步骤，其中R1表示H或者任选地被取代的烷基或芳基。
可实施该一锅三链段连接反应以在接合物具有类似的位阻时在没有分离和中间纯化的情况下链接三个片段(称作“一锅反应”)。由于接合物的阻碍类似，因此化合物(XIII)或(XIII’)与化合物(XIV)或(XIV’)之间的连接比化合物(XIV)或(XIV’)通过分子内SEA连接的环化或者链段(XIV)或(XIV’)通过分子间SEA连接的聚合快速。所述分子内或分子间SEA连接描述于WO2011/051906中。
通过自然自连接制造环状多肽
用于上述自然连接的原理也可用于通过多肽的自然自连接(多肽的一个末端与同一多肽的另一末端连接)而制造环状多肽。
本发明的另一主题涉及用于制造式(XVII)的环状多肽的方法：
X2表示肽片段，和C1表示包括硫醇或硒醇官能团的氨基酸残基，
所述方法包括至少一个如下反应步骤：式(XVIII)的多肽与自身连接：
(XVIII)H–C1–X2–N(CH2-CH2-Se-H)2。
式(XVIII)的多肽优选地包括2-300个氨基酸残基、优选5-100个氨基酸残基、更特别优选8-50个氨基酸残基。
式(XVIII)的多肽在N端处包括氢原子和C1残基，C1具有以上表明的含义。此处的X2表示形式AA1AA2...AAn的肽片段，其中n为大于或等于1的整数，且各AAi表示氨基酸残基。
式(XVIII)的多肽优选地仅包括选自二十种蛋白氨基酸残基和硒代半胱氨酸的氨基酸残基。然而，根据一种具体实施方式，式(XVIII)的多肽包括不同于硒代半胱氨酸的一种或多种非蛋白氨基酸残基。
式(XVIII)的多肽的氨基酸残基可任选地通过侧链保护基团保护。
可通过使式(XVIII’)：
的多肽与至少一种使二硒键还原的化合物(其优选地如上所述)接触而实施以上连接反应。实际上，式(XVIII’)的多肽然后被原位还原并且提供式(XVIII)的多肽用于连接反应。
通常，即使当直接由式(XVIII)的多肽实施连接反应时，在反应期间使用上述使二硒键还原的化合物的一种或多种也是优选的。
通常，如果所述反应在足够稀释的条件下实施，则式(XVIII)的多肽的环化未受到并发的多聚的阻碍。可例如使用0.01-50mM、典型地约1mM(或者任选地，在严重的多聚风险情况下0.01-0.1mM)浓度的式(XVIII)的多肽。
此外，用于实施所述连接反应的优选条件与以上对于从式(IX)和(X)的多肽开始的反应所描述的那些相同。
上述连接反应之后可为所获得的式(XVII)的环状多肽的纯化(例如通过液相色谱法或者通过任何其它常用技术)的步骤。
合成试剂盒
本发明的另一主题涉及多肽合成试剂盒，其包括一种或多种式(IXi)或(IX’i)的肽，至少一种式(III’)或(III”)的化合物，和任选地一种或多种偶联、保护、脱保护反应物、或溶剂。
实施例
实施例1：化合物1(Se2EA)和化合物2(Se3EA)的合成
在氮气冲洗下，在搅拌下将无水乙醇V＝19mL滴加至在冰浴中冷却的硒Se(940mg,11.9mmol,1.5eq)和硼氢化钠(NaBH4)(300mg,7.9mmol)的混合物。在剧烈反应之后，使反应介质回流1小时30分钟。在溶液中形成的二硒化钠Na2Se2为红褐色。
在环境温度下，将溶解在NaOH水溶液(0.5M)/EtOH(1/1)混合物V＝3mL中的二(2-氯乙基)胺盐酸盐(847mg,4.7mmol,0.5eq)在10分钟内滴加至Na2Se2和Na2Se3的以上溶液。将反应介质在环境温度下搅拌45分钟。
然后将反应介质用NaOH水溶液(0.5M)稀释至V＝10mL，然后用CH2Cl2(3×30mL)萃取。然后将有机相合并，用Na2SO4干燥，然后浓缩至总体积的1/3。
然后将所获得的有机浓缩物用三氟乙酸(TFA)水溶液(10％)萃取，然后直接通过如下而纯化：RP-HPLC:Xbridge C18柱(d＝1.9cm,L＝20cm,5μm)，UV检测(λ＝215nm)，缓冲液A:H2O/TFA(1:0.05％v/v)，缓冲液B:CH3CN/H2O/TFA(4:1:0.05％v/v/v)，等度洗脱(isocratic):缓冲液A(3分钟)，然后梯度洗脱:缓冲液B(经9分钟从0到50％，25mL/分钟)。
在冻干之后，获得黄色粉末形式的化合物1(Se2EA)230mg(产率Y＝21％)和化合物2(Se3EA)240mg(产率Y＝16％)。
化合物1(Se2EA)和2(Se3EA)分别的LC-MS分析、RP-HPLC色谱图
LC-MS:缓冲液A:H2O/TFA(1/0.1％v/v)，缓冲液B:CH3CN/H2O/TFA(4/1:0.1％v/v/v)。
RP-HPLC，在XBridge BEH C18柱(3.5μm,4.6x 150mm)上使用经30分钟从0到100％B的线性梯度，流速1mL/分钟，UV检测(λ＝215nm)。
MS:电喷雾电离正电荷模式，锥孔电压(voltage cone)30V，四极分析仪。
化合物1的色谱图和质谱图分别示于图1a和1b中。
化合物2的色谱图和质谱图分别示于图2a和2b中。
实施例2：通过从SEA链段开始的交换的根据本发明的SeEA链段的合成和分离。
肽8:H-ILKEPVHGA-SEA的合成
该肽的合成方法描述于文献Ollivier,N.；Dheur,J.；Mhidia,R.；Blanpain,A.；Melnyk,O.Organic letters 2010,12,5238-41中。
肽9:H-ILKEPVHGA-SeEA的合成
反应在处于氮气气氛下的手套箱(氧气浓度小于50ppm)中进行。在pH＝7.2的0.1M磷酸盐缓冲液中制备200mmol/L的TCEP溶液。将所获得的TCEP/MPAA溶液的pH调节为pH＝5.5。
将肽8(3.8mg,3μmol)和Se3EA链接体2(8.4mg,28μmol,10eq)溶解在以上的TCEP溶液V＝297μL中。将反应介质在37℃搅拌24小时。
在反应结束时，将反应介质用TFA(0.1％)溶液稀释至V＝2mL，然后直接通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC)(C18Nucleosil柱(d＝1cm,L＝20cm,5μm)，UV检测(λ＝215nm)，缓冲液A:H2O/TFA(1:0.05％v/v)，缓冲液B:CH3CN/H2O/TFA(4:1:0.05％v/v/v)，梯度洗脱：缓冲液B(经5分钟从0到20％，然后经60分钟从20到42％，6mL/分钟))纯化。获得1.96mg肽9(产率62％)。
肽9的LC-MS分析、RP-HPLC色谱图
LC-MS:缓冲液A:H2O/TFA(1/0.1％v/v)，缓冲液B:CH3CN/H2O/TFA(4/1:0.1％v/v/v)。
RP-HPLC，在XBridge BEH C18柱(3.5μm,4.6x 150mm)上使用经30分钟从0到100％B的线性梯度，流速1mL/分钟，UV检测(λ＝215nm)。
MS:电喷雾电离正电荷模式，锥孔电压30V，四极分析仪。
图3a对应于在0.8小时的反应时间t之后溶液的色谱图。对于t＝0.8小时，该交换反应没有完成，实际上，对应于肽8的峰仍然以显著的量存在。
图3b对应于在6小时的反应时间t之后溶液的色谱图，并且图3c为对应的质谱图。该色谱图显示，该交换反应完成。
图4a和4b对应于纯化之后的肽9的色谱图和质谱图。
实施例2a：通过从SEA链段开始的交换的根据本发明的大的SeEA链段的合成和分 离。
肽15:H-IRNCIIGKGRSYKGTVSITKSGIK-SEA的合成
该肽的合成方法描述于文献Ollivier,N.；Dheur,J.；Mhidia,R.；Blanpain,A.；Melnyk,O.Organic letters 2010,12,5238-41中。
肽16:H-IRNCIIGKGRSYKGTVSITKSGIK-SeEA的合成
反应在氮气气氛下进行。在pH＝5.5的0.1M乙酸盐缓冲液中制备20mmol/L的TCEP溶液。将所获得的TCEP溶液的pH调节为pH＝4.2。
将肽15(4mg,1.4μmol)和Se3EA链接体2(4.4mg,14.3μmol,10eq)溶解在以上TCEP溶液V＝719μl中。将反应介质在37℃搅拌24小时。
在反应结束时，反应介质用TFA(0.1％)溶液稀释至V＝3mL，然后直接通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC)(C18Nucleosil柱(d＝1cm,L＝20cm,5μm)，UV检测(λ＝215nm)，缓冲液A:H2O/TFA(1:0.05％v/v)，缓冲液B:CH3CN/H2O/TFA(4:1:0.05％v/v/v)，梯度洗脱:缓冲液B(经5分钟从0到20％，然后经60分钟从20到42％，6mL/分钟))纯化。获得1.8mg肽16(产率38％)。
肽16的LC-MS分析、RP-HPLC色谱图
LC-MS:缓冲液A:H2O/TFA(1/0.1％v/v)，缓冲液B:CH3CN/H2O/TFA(4/1:0.1％v/v/v)。
RP-HPLC，在XBridge BEH C18柱(3.5μm,4.6x 150mm)上使用经30分钟从0到100％B的线性梯度洗脱，流速1mL/分钟，UV检测(λ＝215nm)。
MS:电喷雾电离正电荷模式，锥孔电压30V，四极分析仪。
图13对应于在24小时的反应时间t之后溶液的色谱图。对应于肽16的峰清楚地存在并且表明该交换反应完成。
图14a和14b分别对应于纯化之后的肽16的色谱图和质谱图。
实施例3：使用根据本发明的基于硒的化合物或者根据现有技术的基于硫的化合 物的自然连接
肽3，SEQ ID NO:1Ac-GFGQGFGG-OH的合成
该肽的合成方法描述于文献Ollivier,N.；Dheur,J.；Mhidia,R.；Blanpain,A.；Melnyk,O.Organic letters 2010,12,5238-41中。
肽4:Ac-GFGQGFGG-SeEA的合成
将肽3(50mg,0.07mmol)和分子1(30mg,0.13mmol,2eq)溶解在V＝3.5mL的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中，之后加入六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基(PyBOP)(68mg,0.14mmol,2eq)。然后加入N,N-二异丙基乙基胺(DIEA)(45μL,0.28mmol,4eq)。将反应介质在环境温度下搅拌1.5小时，然后从冷的二乙基醚/庚烷混合物(75mL,1:1v/v)沉淀，离心，然后溶解在最低限度量的水中并且冻干。
粗制肽4直接通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC)(C18Nucleosil柱(d＝1cm,L＝20cm,5μm)，UV检测缓冲液A:H2O/TFA(1:0.05％v/v)，缓冲液B:CH3CN/H2O/TFA(4:1:0.05％v/v/v)，梯度洗脱:缓冲液B(经5分钟从0到20％，然后经60分钟从20到42％，6mL/分钟))纯化。获得15mg肽4(产率24％)。
肽4的LC-MS分析、RP-HPLC色谱图
LC-MS:缓冲液A:H2O/TFA(1/0.1％v/v)，缓冲液B:CH3CN/H2O/TFA(4/1:0.1％v/v/v)。
RP-HPLC，在XBridge BEH C18柱(3.5μm,4.6x150mm)上使用经30分钟从0到100％B的线性梯度洗脱，流速1mL/分钟，UV检测.(λ＝215nm)。
MS:电喷雾电离正电荷模式，锥孔电压30V，四极分析仪。
图5a和5b分别表示纯化之后的肽4的色谱图和质谱图。
肽5:Ac-GFGQGFGG-SEA的合成
该肽的合成方法描述于文献Ollivier,N.；Dheur,J.；Mhidia,R.；Blanpain,A.；Melnyk,O.Organic letters 2010,12,5238-41中。
肽6，SEQ ID NO:2H-CILKEPVHGA-NH2的合成
该肽的合成方法描述于文献Ollivier,N.；Dheur,J.；Mhidia,R.；Blanpain,A.；Melnyk,O.Organic letters 2010,12,5238-41中。
通过SeEA连接合成肽7,SEQ ID NO:3Ac-GFGQGFGGCILKEPVHGA-NH2。肽4Ac-GFGQGFGG-SeEA和肽5Ac-GFGQGFGG-SEA的反应性的比较
a-肽4Ac-GFGQGFGG-SeEA与肽6H-CILKEPVHGA-NH2的连接动力学和产率
肽4与肽6的SeEA连接在处于氮气气氛下的手套箱(氧气浓度小于50ppm)中实施。在pH＝7.3的0.2M磷酸盐缓冲液中制备3M的胍溶液。然后加入三(2-羧基乙基)膦(TCEP,28.6mg,0.1mmol)和3-巯基苯基乙酸(MPAA,16.8mg,0.1mmol)。将所获得的TCEP/MPAA/胍溶液的pH调节为pH＝7.2。
将肽4(4.9mg,5μmol)和6(10.6mg,7.6μmol,1.5eq)溶解在以上的TCEP/MPAA/胍溶液(1.5mL)中。将反应介质在37℃搅拌24小时。
一旦该连接反应完成，则将反应介质用水V＝3mL稀释，然后用TFA(10％)溶液V＝1mL酸化，然后用醚使用3次6.5mL萃取MPAA。
将水相中的连接产物7直接通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC)(C18Nucleosil柱(d＝1cm,L＝20cm,5μm)，UV检测缓冲液A:H2O/TFA(1:0.05％v/v)，缓冲液B:CH3CN/H2O/TFA(4:1:0.05％v/v/v)，梯度洗脱:缓冲液B(经5分钟从0到20％，然后经60分钟从20到42％，6mL/分钟)纯化。获得5.6mg肽7(产率54％)。
肽7的LC-MS分析、RP-HPLC色谱图
LC-MS:缓冲液A:H2O/TFA(1/0.1％v/v)，缓冲液B:CH3CN/H2O/TFA(4/1:0.1％v/v/v)。
RP-HPLC，在XBridge BEH C18柱(3.5μm,4.6x 150mm)上使用经30分钟从0到100％B的线性梯度洗脱，流速1mL/分钟，UV检测
MS:电喷雾电离正电荷模式，锥孔电压30V，四极分析仪。
图6a和6b分别表示纯化之后的肽7的色谱图和质谱图。
b-肽5Ac-GFGQGFGG-SEA与肽6H-CILKEPVHGA-NH2的连接动力学
肽5与肽6的SEA连接反应在严格相同的条件下实施。
动力学的比较
图7表示对于使用根据本发明的基于硒的化合物(肽4)(由符号●表示的曲线)、或者使用根据现有技术的基于硫的化合物(肽5)(由符号▲表示的曲线)形成肽7的连接反应的动力学的比较。
图7显示根据本发明的连接反应(由符号●表示的曲线)的反应速率更高。
实施例4：SeEA、SEA和NCL(硫酯化学)方法的连接动力学的比较
肽15a:H-ILKEPVHGV-SEA的合成
该肽的合成方法描述于文献Ollivier,N.；Dheur,J.；Mhidia,R.；Blanpain,A.；Melnyk,O.Organic letters 2010,12,5238-41中。
肽15b:H-ILKEPVHGV-SeEA的合成
从肽15a开始，肽15b的合成方法与用于合成肽9的方法严格相同。
肽15c:H-ILKEPVHGV-MPA(MPA＝3-巯基丙酸)的合成
该肽的合成方法描述于文献Dheur,J.；Ollivier,N.；Vallin,A.；Melnyk,O.Journal of Organic Chemistry 2010,76,3194-3202中。
对于SeEA、SEA连接和NCL方法，肽15a/15b/15c H-ILKEPVHGV-R与肽6H-CILKEPVHGA-NH2的连接动力学的比较
肽15a或15b或15c与肽6的不同连接分别在处于氮气气氛下的手套箱([O2]<50ppm)中实施。在pH＝7.2的0.1M磷酸盐缓冲液中制备200mmol/L的TCEP溶液。然后加入3-巯基苯基乙酸(MPAA 33mg,0.2mmol)。将所获得的TCEP/MPAA溶液的pH调节为pH＝7.2。
将肽15a或15b或15c和6(1.5eq)分别以3mmol/L的浓度溶解在以上TCEP/MPAA溶液中。将反应介质在37℃搅拌24小时。通过HPLC监测连接产物16的形成动力学。
图12容许根据SeEA、SEA连接或NCL(硫酯化学)方法的肽16的形成反应动力学的比较。
在图12中，由符号●表示的曲线对应于由肽15b形成肽16，由■表示的曲线对应于由肽15a形成肽16，和由◆表示的曲线对应于由肽15c形成肽16。
图12显示SeEA连接反应速率(由●表示的曲线)高于NCL方法的连接反应速率(由■表示的曲线)，NCL方法的连接反应速率自身显著高于SEA方法的连接反应速率(由◆表示的曲线)。
实施例5：通过同时交换和连接-连接反应的催化而原位形成SeEA链段
11-肽10:H-ILKEPVHGY-SEA的合成
该肽的合成方法描述于文献Ollivier,N.；Dheur,J.；Mhidia,R.；Blanpain,A.；Melnyk,O.Organic letters 2010,12,5238-41中。
a-肽10H-ILKEPVHGY-SEA与肽6H-CILKEPVHGA-NH2在Se3EA链接体2的存在下制造肽11,SEQ ID NO:4H-ILKEPVHGYCILKEPVHGA-NH2的连接动力学
肽10与肽6的SEA连接在处于氮气气氛下的手套箱(氧气浓度小于50ppm)中实施。在pH 7.2的0.1M磷酸盐缓冲液中制备200mmol/L的TCEP溶液。
将肽10(1mg,0.6μmol)和6(1.4mg,1μmol,1.5eq)以及Se3EA链接体2(5.8mg,0.02mmol,28eq)溶解在以上TCEP溶液(94μL)中。将反应介质在37℃搅拌24小时。通过HPLC监测产物11的连接形成动力学。
b-肽10H-ILKEPVHGY-SEA与肽6H-CILKEPVHGA-NH2在MPAA存在下的连接动力学的比较
肽10与肽6的SEA连接在处于氮气气氛下的手套箱(氧气浓度小于50ppm)中实施。在pH 7.2的0.1M磷酸盐缓冲液中制备200mmol/L的TCEP溶液。然后加入3-巯基苯基乙酸(MPAA 33mg,0.2mmol)。将所获得的TCEP/MPAA溶液的pH调节为pH＝7.2。
将肽10(1mg,5μmol)and 6(10.6mg,7.6μmol,1.5eq)溶解在以上TCEP/MPAA溶液(94μL)中。将反应介质在37℃搅拌24小时。通过HPLC监测连接产物11的形成动力学。
图8容许比较在存在或不存在根据本发明的化合物2的情况下形成肽11的反应动力学。
在图8中，由●表示的曲线对应于在含硒化合物2的存在下肽10的根据本发明的连接，和由▲表示的曲线对应于在没有所述含硒化合物的情况下但是在MPAA的存在下肽10的根据现有技术的连接。
图8显示当存在化合物2时反应速率更高。
实施例6：使用SeEA和SEA连接的三个链段的一锅顺序连接
肽12:H-C(StBu)HHLEPGG-SEA的合成
该肽的合成方法描述于文献Ollivier,N.；Dheur,J.；Mhidia,R.；Blanpain,A.；Melnyk,O.Organic letters 2010,12,5238-41中。
通过链段4Ac-GFGQGFGG-SeEA、12H-C(StBu)HHLEPGG-SEA和6H-CILKEPVHGA-NH2的连接合成肽14,SEQ ID NO:5Ac-GFGQGFGG-CHHLEPGG-CILKEPVHGA-NH2
-步骤1
将胍盐酸盐(GdnHCl,573.18mg,6mmol)溶解在pH＝7.3的0.1M磷酸盐缓冲液中(最终为1mL，6M)。
将4-巯基苯基乙酸(MPAA,33.83mg,0.2mmol)和三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl,57.37mg,0.2mmol)溶解在该溶液(1mL)中。加入6M NaOH以将该溶液的pH调节为7.37。
将肽4Ac-GFGQGFGG-SeEA(5.33mg,5.4μmol)和12H-C(StBu)HHLEPGG-SEA(7.59mg,5.4μmol)一起溶解在以上溶液(780μL)中。将反应介质置于处于氮气气氛下的在37℃的恒温控制的浴中。
通过在XBridge BEH C18柱上(4.6x250mm,5μm)的RP-HPLC(215nm,1mL/分钟,30℃,缓冲液A:包含0.1％TFA的水，缓冲液B:包含0.1％TFA的CH3CN/水4/1，经30分钟从0到100％B)监测连接。为此，将试样量(2μL)的反应介质用10％TFA水溶液酸化，用Et2O萃取以在分析之前除去MPAA。
以此方式获得在溶液中的肽13Ac-GFGQGFGG-CHHLEPGG-SEA。
图9a和9b分别表示肽13的色谱图和质谱图。
-步骤2
在反应4小时35分钟之后，将肽6H-CILKEPVHGA-NH2(11.06mg,8.1μmol)以固体形式加入到反应介质中。使反应处于氮气气氛下37℃下。
通过在XBridge BEH C18柱(4.6×250mm,5μm)上的RP-HPLC(215nm,1mL/分钟,30℃,缓冲液A:含0.1％TFA的水，缓冲液B:含0.1％TFA的CH3CN/水4/1，经30分钟从0到100％B)监测连接。为此，将试样量(2μL)的反应介质用10％TFA水溶液酸化，用Et2O萃取以在分析之前除去MPAA。
当反应完成时，将反应介质用水(4mL)稀释并且加入10％的TFA水溶液(1mL)。在用Et2O萃取4次(4×4mL)之后，通过使氩气鼓泡通过水相而对水相进行脱气2分钟。在通过在nucleosil C18柱,5μm上的RP-HPLC(215nm,6mL/分钟，缓冲液A:包含0.05％TFA的水，缓冲液B:包含0.05％TFA的CH3CN/水4/1，经5分钟从0到10％B，然后经150分钟从10到100％B)纯化之后，获得6mg(36％)肽14Ac-GFGQGFGG-CHHLEPGG-CILKEPVHGA-NH2。
图10a和10b分别表示纯化之前化合物14的色谱图和质谱图。
图11a和11b分别表示纯化之后化合物14的色谱图和质谱图。

Claims (19)

1.经官能化的肽，其选自：
a)式(I)：X1-N(CH2CH2SeH)2的肽；或者
b)式(I’)：的肽；
其中X1表示肽片段且-N(CH2CH2SeH)2基团或者基团与该肽片段X1的处于C端位置的氨基酸残基的C＝O末端形成酰胺键。
2.根据权利要求1的经官能化的肽，其中X1包括2-300个氨基酸残基。
3.用于获得根据权利要求1或根据权利要求2的经官能化的肽的方法，包括以下步骤a1和b1：
a1)用于提供式(II)的多肽的肽合成：
(II) X1-OH，
b1)步骤a1)中获得的多肽的官能化，包括
式(II)的多肽与选自如下的胺化合物在液相中反应以形成式(Ia)或(I’)的多肽：
(IIIa) NH(CH2-CH2-Se-G1)2
(III’)
其中G1表示硒保护基团或氢原子，所述式(Ia)为：
(Ia) X1-N(CH2CH2-Se-G1)2；
或者所述方法包括以下步骤a2和b2
a2)使用
-式(IV)或(IV”)的化合物：
(IV) X1–N(CH2CH2-S-H)2；
(IV”)
或者
-通过带有硫酯官能团的基团官能化的肽(IV’)X1–SR，其中R表示芳基或烷基，
b2)式(IV)或(IV”)的化合物或式(IV’)的化合物与式(III’)或(III”)的胺化合物之间在液相中反应以形成式(I)或(I’)的肽：
(III’)
(III”)
4.根据权利要求3的方法，其中将其中G1表示硒保护基团的式(Ia)的多肽进一步脱保护以产生式(I)的化合物。
5.在根据权利要求3的方法中使用的化合物，其选自：
a)式(III’)：的化合物
b)式(III”)：的化合物。
6.用于制造根据权利要求5的式(III’)和(III”)的化合物的方法，包括：以下用金属氢化物NaBH4、LiBH4或LiAlH4的处理反应
和随后的以下反应：
7.用于获得根据权利要求1或2的肽的方法，包括以下步骤：
a)提供经官能化的聚合物树脂，其具有结构(V)或结构(V’)：
(V)
(V’)
其中，
□表示固体载体，
Trt表示三苯基甲基，
b)将氨基酸接枝到步骤a)中获得的经官能化的聚合物树脂上以产生结构(VI)或结构(VI’)的化合物：
(VI)
(VI’)
其中，
□和Trt具有与化合物(V)或(V’)中相同的含义，
AA表示氨基酸残基；
G3表示AA的N端胺官能团的保护基团或者氢原子，
c)从氨基酸AA开始肽合成以产生化合物(VII)或(VII’)：
(VII)
(VII’)
其中，
□表示固体载体，
Trt表示三苯基甲基，
X1表示肽片段，
d)将Trt和Se之间的键切断以产生化合物(I)或(I’)。
8.根据权利要求7的方法，其中将氨基酸接枝到所述聚合物树脂上包括使经官能化的树脂(V)或(V’)与氨基酸的酰卤或者与氨基酸以及活化剂接触。
9.在根据权利要求7或8的方法中使用的经官能化的聚合物树脂，其具有结构(V)或结构(V’)：
(V)
(V’)
其中，
□表示固体载体，
Trt表示三苯基甲基。
10.对应于式(VII)或(VII’)的包括肽片段的聚合物树脂：
(VII)
(VII’)
其中，
□表示固体载体，
Trt表示三苯基甲基，
X1表示肽片段。
11.根据权利要求9或10的聚合物树脂，其中所述固体载体选自聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、纤维素、聚乙烯、聚酯、乳胶、聚酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇-聚苯乙烯共聚物、聚乙二醇-聚丙烯酰胺共聚物以及其衍生物。
12.用于制造根据权利要求9-11之一的聚合物树脂的方法，包括：
a)提供通过-Trt或-NH-CO-Trt基团官能化的固体载体；
b)所述固体载体的Trt官能团与式(III)：NH(CH2-CH2-Se-H)2的胺化合物反应，
Trt具有与权利要求9-11中相同的含义。
13.用于制造式(VIII)的多肽的方法：
(VIII) X1-C1-X2-C2-…-Ci-1-Xi-…-Cn-1-Xn
其中，
X1,X2,…,Xi,…,Xn为肽片段，
C1,C2,…,Ci-1,…,Cn-1为带有硒醇官能团的氨基酸残基，
n为大于或等于2的整数，
i为1到n的任意整数，
该方法包括一个或多个如下步骤：式(IXi)的化合物与式(Xi+1)的化合物之间反应以形成式(Xi)的化合物：
(IXi) X’i–N(CH2CH2-Se-H)2
其中，
X’1表示X1
对于i>1，X’i表示Ci-1-Xi
(Xi+1) Ci-Xi+1-…-Cn-1-Xn
(Xi) X’i-Ci-Xi+1-…-Cn-1-Xn。
14.根据权利要求13的方法，其中化合物(IXi)是从化合物(IX’i)开始，通过与至少一种使二硒键还原的化合物接触而形成的：
15.根据权利要求14的方法，其中化合物(IX’i)是通过式(XIi)、(XI’i)或(XI”i)的化合物与根据权利要求5的式(III’)或式(III”)的化合物之间的反应获得的：
(XIi) X’i–S–R1
(XI’i)
(XI”i) X’i–N(CH2-CH2-S-H)2
其中对于i>1，X’i为Ci-1-Xi形式的肽片段，且X’1表示X1，R1表示芳基或烷基。
16.根据权利要求14或15的方法，对于由式(XII)表示的多肽的制造：
(XII) X1–C1–X2–C2–X3
所述方法包括步骤：
a)式(XIII)或(XIII’)的化合物与式(XIV)或(XIV’)的化合物之间反应以形成式(XV)或(XV’)的化合物：
(XIII) R2–X1–N(CH2-CH2-Se-H)2
(XIII’)
(XIV) H–C1–X2–N(CH2-CH2-S-H)2
(XIV’)
(XV) R2–X1–C1–X2–N(CH2-CH2-S-H)2
(XV’)
b)式(XV)或(XV’)的化合物与式(XVI)的多肽之间反应以形成式(XII)的化合物：
(XVI) H–C2–X3
其中，R2表示X1的N端官能团的保护基团或者H；X1、X2、X3彼此独立地表示肽片段；C1和C2彼此独立地表示带有硒醇官能团的氨基酸残基。
17.用于制造式(XVII)的环状多肽的方法：
(XVII)
X2表示肽片段，和C1表示包括硒醇官能团的氨基酸残基，
所述方法包括至少一个如下的反应步骤：式(XVIII)的多肽与自身连接：
(XVIII) H–C1–X2–N(CH2-CH2-Se-H)2。
18.根据权利要求17的方法，其中所述连接反应是通过使式(XVIII’)的多肽与至少一种使二硒键还原的化合物接触而实施的：
(XVIII’)
19.多肽合成试剂盒，包括一种或多种在根据权利要求13或14的方法中使用的式(IXi)或(IX’i)的肽、或者至少一种根据权利要求5的化合物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2971509B1 (fr) * 2011-02-16 2013-02-22 Centre Nat Rech Scient Procede de preparation de peptides par assemblage de multiples fragments peptidiques
GB201409538D0 (en) * 2014-05-29 2014-07-16 Univ The Durham Cyclising peptides
CN112175042B (zh) * 2019-07-03 2022-05-31 深圳翰宇药业股份有限公司 Etelcalcetide的合成方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011051906A1 (fr) * 2009-10-29 2011-05-05 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Procede de ligation native de polypeptides

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR957639A (zh) 1950-02-23
PT832096E (pt) 1995-05-04 2002-01-30 Scripps Research Inst Sintese de proteinas atraves de ligacao quimica nativa
WO1998028434A1 (en) 1996-12-24 1998-07-02 The Scripps Research Institute General chemical ligation
EP1263771B1 (en) 2000-03-16 2006-06-14 The Regents Of The University Of California Chemoselective ligation by use of a phosphine
JP4694085B2 (ja) 2000-05-12 2011-06-01 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション アミド結合を形成するためのライゲーション方法及び試薬
US7667076B2 (en) 2005-09-14 2010-02-23 Regents Of The University Of California Amide forming chemical ligation
EP2590939A4 (en) * 2010-07-06 2016-06-08 Univ Nanyang Tech COMPOUND FOR USE IN A PEPTIDE SYNTHESIS

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011051906A1 (fr) * 2009-10-29 2011-05-05 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Procede de ligation native de polypeptides

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Selenocysteine synthase from Escherichia coli.analysis of the reaction sequence.;Forchhammer K.,;《J. Biol. Chem.》;19911231;第266卷;6324-6328 *
硒蛋白对氧化还原信号的调控作用;李春燕;《国 外 医 学 医 学 地 理 分 册》;20110630;第32卷(第2期);143-147 *

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