JP2015512376A - ネイティブライゲーション法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、セレニウム基により官能化されたペプチドを用いる１以上のネイティブライゲーション工程を含む、ポリペプチドの合成方法に関する。本発明はさらに、セレニウムおペプチド及び化合物に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、セレニウム含有基により官能化されたペプチドを用いての少なくとも１つのネイティブ（native）ライゲーション工程を含む、ポリペプチドの生成方法に関する。本発明はまた、ペプチド、及びセレニウムを基礎とする化合物にも関する。本発明はまた、ペプチドの合成のための合成キットにも関する。
従来の固相法、アミノ酸によるポリペプチドの合成は、合成されるポリペプチドが大きい場合、低収率に限られている。この欠点を克服するためには、より長いポリペプチドを生成することを目的として、化学的ライゲーション（ligation）により２種のポリペプチドをアセンブルすることは知られている。
ポリペプチドの全合成は、明確に定義された構造を有するタンパク質を調製するか、又は天然の修飾、例えば翻訳後修飾、又は非天然の修飾を担持するために、ますます有用である。化学的ライゲーション法は、この必要性に応えるものである；しかしながら、それらはそれらの使用及びそれらの産業的用途において制限されていることが示されている。
一般的に、当該方法においては、ライゲーションによってアセンブリされるポリペプチド間の結合が天然型であることが望ましく、すなわち、ポリペプチドの天然の構造に対応することが望ましい。
現在、既存の主要なネイティブライゲーション法は、例えば国際公開第９６／３４８７８号及び９８／２８４３４号に記載されるKent及びDawsonの方法である。この方法は、（Ｃ末端）ペプチドチオエステルとシステイニル−ペプチドとの間の化学選択的反応に基づく。にもかかわらず、この方法の主要な欠点は、複雑な化学工程を必要とするペプチドチオエステルの生成である。従来技術のそれらの方法は、それらが必然的に分離するのに困難である混合物を導出し、結果として得られる最終生成物の純度に影響を及ぼし、収率の必然的な損失をもたらすため、不十分である。
別の方法は、国際公開第０１／６８５６５号及び０１／８７９２０号に記載されるStaudinger反応として知られているライゲーションである。この方法は、アミド結合を形成するための、ホスフィノチオエステルとアジドとの反応、及び組み合わされた試薬の加水分解を含む。この方法は、工業的スケールで適用するのは難しい。
国際公開第２００７／０３７８１２号に記載される別の方法は、脱カルボキシル縮合反応におけるＮ−アルコキシアミンとα−ケト酸との反応に基づく。しかしながら、ケト酸は、生成及びペプチド中への組込みが困難な分子である。さらにこの第三の方法は、複雑な有機合成を実施する手段を備えていないペプチド合成研究室で適用することは困難である。
国際公開第２０１１／０５１９０６号は、チオール化合物を含むネイティブライゲーション法を記載している。この方法は非常に満足の行くものではあるが、このチオール化合物の反応速度は、特に２種のペプチド間の結合の周囲のアミノ酸が嵩高い場合、しばしば遅くなる。
従って、依然として２種の嵩高いアミノ酸間での結合の形成によるペプチドの連結を促進するために急速な反応速度を提供するネイティブライゲーション法が必要である。
本発明は、特定のアミドペプチド、ＳｅＥＡペプチド及びシステイニルペプチドの使用を基礎とするライゲーション法の開発に基づく。それらの２種のペプチドが水溶液中で接触した状態に置かれる場合、天然型（native)ペプチド結合が、２種のフラグメント間で形成される。ライゲーションは非常に効率的且つ非常に高収率で生じる。それは広いｐＨ範囲に亘って働く。
該ライゲーションそれらの２種の連結の性質と、フランス特許出願第０９５７６３９号に記載されるＳＥＡライゲーションと類似性を有するが、ＳｅＥＡ及びＳＥＡセグメントの性質との間には有意な相違が存在する。
実際、ＳｅＥＡ連結の速度は、硫黄含有類似体ＳＥＡにより得られるＳＥＡ連結の速度、又はペプチドチオエステルの使用に基づくネイティブ化学的連結（ＮＣＬ）の速度よりも非常に顕著に優れている。
ＳｅＥＡの速度の優位性は、ＳＥＡ連結の有用性を、いかなる手段でも低下させない。それどころか、ＳＥＡ連結又はＮＣＬ（チオエステル化学）の他の技法により生成されることが困難である結合形成を可能にすることによりそれを補うものである。
本出願においては、ＳＥＡ基は−Ｎ（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−Ｇ4）2基を表し、ここでＧ4はＨ又は硫黄保護基又はジスルフィド結合を表す。
本発明の第１の主題は、
ａ）式（Ｉ）：Ｘ1−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＳｅＨ）2のペプチド；又は
ｂ）下記式（Ｉ’）：
Figure 2015512376
のペプチド、
［式中、Ｘ1はペプチドフラグメントを表し、
−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＳｅＨ）2基又は
Figure 2015512376
の基は、Ｃ末端位置に存在するペプチドフラグメントＸ1のアミノ酸残基のＣ＝Ｏ末端と共にアミド結合を形成する］
から選択される官能化ペプチドに関する。
実施形態によれば、Ｘ1は、２〜３００個のアミノ酸残基、好ましくは５〜１００個のアミノ酸残基、より好ましくは８〜５０個のアミノ酸残基を含む。
本発明の別の主題は、
ａ１）下記式（II）：
（II）Ｘ1−ＯＨ
のポリペプチドを提供するためのペプチド合成工程であって、好ましくは、末端カルボン酸官能基以外の、そのアミノ基及びカルボン酸官能基上に保護基を含み、
ｂ１）段階a)で得られたポリペプチドの官能化工程であって、以下の工程を含み：
−式（ＩＩ）のポリペプチドを、下記式：
(IIIa) ＮＨ（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓｅ−Ｇ1）2
Figure 2015512376
[式中、Ｇ1は、セレニウム保護基又は水素原子である]
から選択されたアミン化合物と、式（Ｉａ）Ｘ1−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2−Ｓｅ−Ｇ1）2、又は(I’)ポリペプチドを得ることを目的として、液相中で反応させる工程；
−任意に、式（Ｉ）の化合物を生成することを目的として、式（Ｉａ）のポリペプチドの脱保護、
又は下記工程ａ２）及びｂ２）：
ａ２）
−下記式（ＩＶ）又は（ＩＶ''）：
（ＩＶ）Ｘ1 − Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−Ｈ）2；
Figure 2015512376
の化合物の使用、又は
−チオエステル官能基（ＩＶ'）＝Ｘ1−ＳＲを担持する基により官能化され、Ｒは任意に置換されたアリール又はアルキル基を表す、ペプチドの使用、
ｂ２）式（ＩＶ）又は（ＩＶ''）の化合物、又は式（ＩＶ'）の化合物と、下記式（III'）又は（III''）：
Figure 2015512376
のアミン化合物との間で、式（Ｉ）又は（Ｉ'）のペプチドを形成することを目的として、液相中で反応させる工程を含む、本発明の官能化ペプチド（Ｉ）又は（Ｉ'）を得るための製造方法に関する。
本発明の別の主題は、
ａ）下記式（III'）：
Figure 2015512376
の化合物、
ｂ）下記式（III''）：
Figure 2015512376
の化合物から選択される、本発明の官能化ペプチドを入手するための製造方法に使用できる化合物に関する。
本発明はまた、本発明の式（III'）及び式（III''）の化合物の生成方法であって、金属水素化物による処理反応であって、ＮａＢＨ4の場合以下の図に示される反応であり、但しＬｉＡｌＨ4又はＬｉＢＨ4もまた使用することが可能である：
Figure 2015512376
続いて、下記反応：
Figure 2015512376
を含む方法に関する。
本発明の別の主題は、
下記工程：
ａ）下記構造式（Ｖ）：
Figure 2015512376
又は下記構造（Ｖ'）：
Figure 2015512376
[構造中、□は、固体支持体を表し、
Ｔｒｔは、特に置換基、塩素、メトキシ、メチル、フッ素及びシアノから選択された、１又は２以上の置換基により任意に置換されたトリフェニルメチル基を表す]により官能化されたポリマー樹脂の供給工程、
ｂ）下記構造（ＶＩ）：
Figure 2015512376
又は下記構造（ＶＩ'）：
Figure 2015512376
[構造式中、□及びＴｒｔは化合物（Ｖ）又は（Ｖ'）と同じ意味を有し、
ＡＡは、１又は２以上の保護基を任意に含むアミノ酸残基を表し；
Ｇ3は、水素原子、又はＡＡのＮ−末端アミン官能基の保護基を表す]
の化合物を製造するために、段階ａ）で得られた官能基化ポリマー樹脂上へのアミノ酸をグラフト化する工程、
ｃ）下記式（ＶII）又は（ＶII'）：
Figure 2015512376
Figure 2015512376
[式中、□は、固相支持体を表し、
Ｔｒｔは、特に置換基、塩素、メトキシ、メチル、フッ素及びシアノから選択された、１又は２以上の置換基により任意に置換されたトリフェニルメチル基を表し、
Ｘ1は、ペプチドフラグメントを表す]
の化合物を製造するために、アミノ酸ＡＡを出発原料とするペプチド合成段階、
ｄ）化合物（Ｉ）又は（Ｉ'）を生成するために、ＴｒｔとＳｅとの間の結合を切断する工程を含む、本発明の官能化ペプチド（Ｉ）又は（Ｉ'）を得るための製造方法に関する。
上記方法の実施形態によれば、ポリマー樹脂上へのアミノ酸のグラフト化が、官能化樹脂（Ｖ）又は（Ｖ'）を、アミノ酸ハロゲン化物、又はアミノ酸、及び活性化剤、好ましくはＨＡＴＵ、ＰｙＢＯＰ、ＢＯＰ，ＰｙＢＲＯＰ、特により好ましくはＨＡＴＵから選択された活性化剤と接触させた状態に置くことを含む。
本発明の別の主題は、
下記構造（Ｖ）：
Figure 2015512376
又は下記構造（Ｖ'）：
Figure 2015512376
[構造式中、
□は、固相支持体を表し、
Ｔｒｔは、特に置換基、塩素、メトキシ、メチル、フッ素及びシアノから選択された、１又は２以上の置換基により任意に置換されたトリフェニルメチル基を表す]
とともに、本発明の方法において使用することができる、官能化ポリマー樹脂に関する。
本発明の別の主題は、
下記式（ＶII）又は（ＶII'）：
Figure 2015512376
Figure 2015512376
[式中、
□は、固体支持体を表し、
Ｔｒｔは、特に置換基、塩素、メトキシ、メチル、フッ素及びシアノから選択された、１又は２以上の置換基により任意に置換されたトリフェニルメチル基を表し、
Ｘ1は、ペプチドフラグメントを表す]
に対応するペプチドフラグメントを含む、ポリマー樹脂に関する。
実施形態によれば、前記固体支持体□は、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、セルロース、ポリエチレン、ポリエステル、ラテックス、ポリアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール −ポリスチレンコポリマー、ポリエチレングリコール −ポリアクリルアミドコポリマー及びそれらの誘導体から選択される。
本発明の別の主題は、
ａ）−Ｔｒｔ又は−ＮＨ−ＣＯ−Ｔｒｔ基による官能化された固相支持体の提供；
ｂ）式（III）：ＮＨ（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓｅ−Ｈ）2のアミン化合物と、前記固体支持体のＴｒｔ官能基との反応
[ここで、Ｔｒｔは、上記と同じ定義を有する]
を含む、本発明のポリマー樹脂の生成方法に関する。
本発明の別の主題は、
下記式（VIII）：
(VIII) Ｘ1−Ｃ1−Ｘ2−Ｃ2−…−Ｃi-1−Ｘi−…-Ｃn-1−Ｘn
[式中、
Ｘ1, Ｘ2,…, Ｘｉ,…, Ｘｎは、ペプチドフラグメントであり、
Ｃ1, Ｃ2, …, Ｃi-1, …, Ｃn-1は、チオール又はセレノールを担持するアミノ酸残基であり、
ｎは、２又はそれ以上の整数であり、
ｉは、１〜ｎの範囲の何れかの整数である]
のポリペプチドの製造方法に関し、該製造方法は、
下記式（ＩＸｉ）：
（ＩＸi） Ｘ'i - Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2−Ｓｅ−Ｈ）2
[式中、
Ｘ'1は、Ｘ1を表し、
Ｘ'iは、Ｃi-1−Ｘiを表し、ｉ＞１である]の化合物と、
下記式（Ｘi+1）：
（Ｘi+1） Ｃi−Ｘi+1−…−Ｃn-1−Ｘn
の化合物との間の反応の１又は２以上の工程を含み、
下記式（Ｘｉ）：
(Ｘｉ) Ｘ'ｉ−Ｃｉ−Ｘｉ＋１−…−Ｃｎ−１−Ｘｎ
の化合物を形成することを目的とする。
実施形態によれば、化合物（ＩＸi）が、下記式（ＩＸi'）：
Figure 2015512376
を出発原料とし、ジセレニウム結合を還元する少なくとも１つの化合物と接触させた状態に置くことにより形成される。
実施形態によれば、化合物（ＩＸ'i）が、下記式（ＸＩi）、(ＸＩ'i) 又は (ＸＩ''i)：
(ＸＩi) Ｘ'i −Ｓ − Ｒ1
下記式：
Figure 2015512376
(ＸＩ''i) Ｘ'i − Ｎ（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−Ｈ）2
[式中、Ｘ'iは、Ｃi−Ｘi形のペプチドフラグメントであり、ｉ＞１であり、
Ｘ’は、Ｘ1を表し、
Ｒ1は、任意に置換されたアリール又はアルキル基を表す]の化合物と、本発明の式（III'）又は式（III''）の化合物との間の反応により得られる。
実施形態によれば、上記方法は、
下記式（ＸII）：
(ＸII) Ｘ1− Ｃ1−Ｘ2 −Ｃ2 −Ｘ3
により表されるポリペプチドの生成に対し、下記段階を含む製造方法が行われる：
ａ）下記式（ＸIII）又は（ＸIII'）の化合物：
（ＸIII）Ｒ2 − Ｘ1 −Ｎ（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓｅ−Ｈ）2
下記式：
Figure 2015512376
及び、下記式（ＸＩＶ）又は（ＸＩＶ'）の化合物：
（ＸＩＶ）Ｈ − Ｃ1 −Ｘ2 −Ｎ（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−Ｈ）2
下記式：
Figure 2015512376
との間の反応工程であって、
下記式（ＸＶ）又は（ＸＶ'）：
（ＸＶ）Ｒ2−Ｘ1−Ｎ（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓｅ−Ｈ）2
下記式：
Figure 2015512376
の化合物を形成することを目的とし、
ｂ）式（ＸＶ）又は（ＸＶ'）の化合物、及び、
式（ＸＶＩ）：
（ＸＶＩ）Ｈ − Ｃ2 −Ｘ3
のポリペプチドとの反応段階を含み、式（ＸII）の化合物を形成することを目的とし、
[式中、Ｒ2は、Ｈ、又はＸ1のＮ−末端官能基の保護基を表し；Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3は互いに独立して、ペプチドフラグメントを表し；Ｃ1及びＣ2は互いに独立して、チオール又はセレノール官能基を担持するアミノ酸残基を表す]。
本発明の別の主題は、
下記式（ＸＶII）：
Figure 2015512376
[式中、Ｘ2は、ペプチドフラグメントを表し、そして
Ｃ1は、チオール又はセレノール官能基を含むアミノ酸残基を表す]の環状ペプチドの製造方法に関し、ここで前記方法は、
下記式（ＸＶIII）のポリペプチド：
（ＸＶIII）Ｈ −Ｃ1−Ｘ2 −Ｎ（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓｅ−Ｈ）2
の、それ自体との連結反応（ligation)の、少なくとも１つを含む。
本発明の環状ポリペプチドを生成するための方法の実施形態によれば、
連結反応（ligation)が、下記式（ＸＶIII）：
Figure 2015512376
のポリペプチドを、ジセレニウム結合を還元する少なくとも１つの化合物に接触させた状態に置くことにより実施される。
本発明の別の主題は、本発明の連結反応（ligation)の方法において使用することができる式（ＩＸi）又は（ＩＸ'i）の１又は２以上のペプチド、又は本発明の少なくとも１つの化合物（III'）又は（III''）を含む、ポリペプチド合成キットに関する。
本発明の有利な点は、以下の通りである：
−本発明のネイティブライゲーション法は困難な接合、例えば立体的に嵩高い(hindered)結合の形成を可能にし、
−本発明のネイティブライゲーション法の速度は非常に早く、
−本発明のネイティブライゲーション法は、異なった速度を有する他の連結法と組合せることができ、
−本発明のネイティブライゲーション法は実施が簡便であり、
−ＳｅＥＡペプチドは固相支持体から生成することができ、
−ＳｅＥＡペプチドは溶液中で、ＳＥＡセグメント又はチオエステルから製造することができ、
−本発明のネイティブライゲーション法は固相又は液相下で調製することができるペプチドフラグメントを出発原料として実施することができ、
−本発明のネイティブライゲーション法は多くの連続したライゲーション法を含むワンポット法について、従来技術の他のタイプのネイティブライゲーション法と組合せることができ、
−本発明のネイティブライゲーション法は、特定のセレニウム含有化合物の反応混合物への単純な添加により、従来技術のライゲーション法を実現することにより実施することができる。
本発明の他の特徴及び利点は、実施例の方法及び添付図面の参照による、以下の本発明の好適な実施例の記載を読むことにより明らかにされる。
図１ａは、本発明のセレニウム含有化合物のＨＰＬＣクロマトグラムを表す。 図１ｂは、本発明のセレニウム含有化合物の質量スペクトルを表す。
図２ａは、本発明のセレニウム含有化合物のＨＰＬＣクロマトグラムを表す。 図２ｂは、本発明のセレニウム含有化合物の質量スペクトルを表す。
図３ａは、本発明の官能化ペプチドの合成をモニターするためのＨＰＬＣクロマトグラムを表す。 図３ｂは、本発明の官能化ペプチドの合成をモニターするためのＨＰＬＣクロマトグラムを表す。
図３ｃは、本発明の官能化ペプチドの質量スペクトルを表す。
図４ａは、本発明の官能化ペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを表す。 図４ｂは、本発明の官能化ペプチドの質量スペクトルを表す。
図５ａは、精製後の本発明の官能化ペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを表す。 図５ｂは、精製後の本発明の官能化ペプチドの質量スペクトルを表す。
図６ａは、本発明のライゲーション法により得られるポリペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを表す。 図６ｂは、本発明のライゲーション法により得られるポリペプチドの質量スペクトルを表す。
図７は、本発明及び従来技術のライゲーション法の反応速度の測定図を表す。
図８は、本発明及び従来技術のライゲーション法の反応速度の測定図を表す。
図９ａは、本発明の方法により得られる官能基化ポリペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを表す。 図９ｂは、本発明の方法により得られる官能基化ポリペプチドの質量スペクトルを表す。
図１０ａは、本発明の方法により得られるポリペプチドのクロマトグラムを表す。 図１０ｂは、本発明の方法により得られるポリペプチドの質量スペクトルを表す。
図１１ａは、精製後の本発明の方法により得られるポリペプチドのクロマトグラムを表す。 図１１ｂは、精製後の本発明の方法により得られるポリペプチドの質量スペクトルを表す。
図１２は、本発明及び従来技術のライゲーション法の反応速度の測定図を示す。
図１３は、本発明の官能化ペプチドの合成に起因する溶液のＨＰＬＣクロマトグラムを表す。
図１４ａは、本発明の官能化ペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを表す。 図１４ｂは、本発明の官能化ペプチドの質量スペクトルを表す。
ここで、本発明は、以下の記載においてより詳細に、及び非限定的に記載される。
「ペプチド又はポリペプチド」（peptide or polypeptide）とは、本出願においては、ペプチド結合により連結される直鎖のアミノ酸残基（２又はそれ以上の数の）を意味する。従って、本出願の意味における「ペプチド又はポリペプチド」は、例えば、当該用語の従来の許容によれば、オリゴペプチド、ペプチド又はタンパク質であってもよい。本発明のポリペプチドに存在するアミノ酸残基は、タンパク質原性又は非タンパク質原性アミノ酸残基から選択することができる。好ましくは、それらは２０個のタンパク質原性アミノ酸残基及びセレノシステインから選択される。
ポリペプチドの表記は、Ｎ末端からＣ末端に向かって行われる。通常の１文字又は３文字コードが、ポリペプチド鎖に沿って存在するアミノ酸残基の表記のために使用される。アミノ酸残基は、式−ＮＨ−（ＣＨ−Ｒ）−（Ｃ＝Ｏ）−のポリペプチドフラグメントであり、式中、Ｒはアミノ酸ごとに異なる側鎖を表す。
「ペプチドフラグメント」（peptide fragment）とは、本出願においては、少なくとも１つのアミノ酸残基を含むポリペプチドの一部を意味する。従って、ペプチドフラグメントが本出願において意味するところは、例えば次のものであることができる：ペプチドフラグメントがポリペプチドのＮ末端もＣ末端も含まない場合、アミノ酸残基の配列（例えば、−ＡＨＧ−又は−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−）；又はペプチドフラグメントがポリペプチドのＮ末端を含む場合、そのＮ末端に基を有するアミノ酸残基の配列（例えば、Ｈ−ＡＨＧ−又はＨ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−）；又はペプチドフラグメントがポリペプチドのＣ末端を含む場合、そのＣ末端に基を有するアミノ酸残基の配列（例えば、−ＡＨＧ−ＯＨ又は−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ）。
官能化ペプチド
本発明の第１の主題は、
ａ）式（Ｉ）：Ｘ1−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＳｅＨ）2のペプチド；又は
ｂ）下記式（Ｉ'）：
Figure 2015512376
のペプチド；
［式中、Ｘ1はペプチドフラグメントを表し、
−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＳｅＨ）2基又は
Figure 2015512376
の基は、Ｃ末端位置に存在するペプチドフラグメントＸ1のアミノ酸残基のＣ＝Ｏ末端と共にアミド結合を形成する］から選択されるセレニウム基により官能基化されたペプチドに関する。
ペプチドフラグメントＸ1は、Ｙ1−ＡＡ1−ＡＡ2−…−ＡＡｎの形で存在し、ここでＹ1は、Ｎ末端基、好ましくは水素原子であるが、しかし任意にはまた、当業者に知られている第一級又は第二級アミンにより置換される任意の基、例えばアシル基及び特にアセチル基であり；ｎは２又はそれ以上の整数であり；ＡＡ1−ＡＡ2−…−ＡＡｎは互いに独立して、アミノ酸残基を表す。
式（Ｉ）又は（Ｉ'）のポリペプチドは、好ましくは２〜３００個のアミノ酸残基、好ましくは５〜１００個のアミノ酸残基、より好ましくは８〜５０個のアミノ酸残基を含む。
式（Ｉ）又は（Ｉ'）のポリペプチドは、好ましくは、２０個のタンパク質原性アミノ酸残基及びセレノシステインから選択されたアミノ酸残基のみを含む。しかしながら、特定の実施形態によれば、式（Ｉ）又は（Ｉ'）のポリペプチドは、１又は２以上の非タンパク質原性アミノ酸残基を含む。
式（Ｉ）又は（Ｉ'）のポリペプチドのアミノ酸残基は、任意に側鎖保護基により保護されることができる。
式（III'）及び（III''）のアミン化合物
本発明の別の主題は、下記式（III'）及び（III''）のアミン化合物及びそれらの製造方法に関する。
化合物（III'）及び（III''）は、下記式：
Figure 2015512376
に対応する。
化合物（III'）及び（III''）は、下記工程ａ）：
Figure 2015512376
 続いて、下記工程ｂ）
Figure 2015512376
を含む工程に従って行われる。
上記第１段階（段階ａ）は、好ましくは窒素雰囲気下で行われる。好ましくは、試薬は冷却下に導入され、次いで混合物は還流される。
別の実施形態によれば、工程ａ）においては、ＮａＢＨ4は、別の金属水素化物、例えばＬｉＡｌＨ4又はＬｉＢＨ4により代替される。前記２種の金属水素化物の場合、化合物Ｌｉ2Ｓｅ2及びＬｉ2Ｓｅ3が形成される。次に、それらの２種の化合物Ｌｉ2Ｓｅ2及びＬｉ2Ｓｅ3が次の工程ｂ）に使用される。
好ましくは、第２工程（工程ｂ）は、室温で実施される。
好ましくは、生成物（III'）及び（III''）を含む有機相は、例えば高性能液体クロマトグラフィーにより、工程の最後で精製される。
液相下で化合物（Ｉ）及び（Ｉ′）を得るための製造方法
本発明の別の主題は、第１工程のペプチド合成及び第２工程の官能基化を包含する、液相下での官能化ポリペプチド（Ｉ）又は（Ｉ'）を得るための方法に関する。
第１段階（ペプチド合成段階）は、下記式：
（II）Ｘ1−ＯＨ
のポリペプチドの入手を可能にする。
このペプチド合成段階は、当業者に周知の何れかの方法に従って行うことができる。特に、液相、又は好ましくは固相下で行うことができる。
原則的に、ペプチド合成は、プライマー（最初のアミノ酸又はペプチドフラグメントは、先行するアミノ酸付加の結果としてもたらされる）から出発する、及び脱保護から出発するアミノ酸の連続的カップリングを含む。より正確には、ペプチド合成は連続的に以下を含む：
（ａ）保護されていないＮ末端を有するペプチドフラグメント及びそのＮ末端において保護されたアミノ酸の提供；
（ｂ）前記ペプチドフラグメントのＮ末端で、アミノ酸とペプチドフラグメントとの間のペプチド結合の確立；
（ｃ）前記段階（ａ）のペプチドフラグメントを供給するために、連結されたアミノ酸のＮ末端の脱保護。
異なるカップリング反応中、トリアゾール（例えば、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール又は１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール）、又は非求核性アニオンのホスホニウム又はウロニウム塩（例えば、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＴＢＴＵ又はＰｙＢＯＰ）の存在下で、活性剤化合物、特にカルボジイミド（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド又はジイソプロピルカルボジイミド）を使用することが；又は酸ハロゲン化物、例えば酸フッ化物の形で、活性化されたアミノ酸を使用することが好ましい。
異なるカップリング反応中、アミノ酸のＮ末端は、保護基、好ましくはＦｍｏｃ基（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）又はｔ−Ｂｏｃ基（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）又はＮＳＣ基（２−（４−ニトロフェニルスルホニル）エトキシカルボニル）により、好適に保護される。
同様に、アミノ酸残基の側鎖は、好ましくは、異なるカップリング反応中、１又は２以上の適切な保護基、例えばｔｅｒｔ−ブチル基により、カルボン酸官能基を担持する鎖のために保護される。
この場合、最後のアミノ酸カップリング反応が実施されると、側鎖の脱保護反応を行うことができる。しかしながら、官能化段階のために、すべての保護（但し、Ｃ末端でのＣＯＯＨ官能基の任意の保護を除く）を保持することが好ましいことに留意すべきである。
官能化
官能化段階は下記を連続的に含む：
−任意に、カルバメート、アミド又はアルキル基のファミリーから、好適に選択された保護基、特にｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（ｔ−Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）、トリフルオロアセチル又はトリフェニルメチルによる、式（II）のポリペプチドのＮ末端の保護。
−任意にはまた、式（II）のポリペプチドのアミノ酸残基の側鎖の官能基の保護、及びさらに特には、アミン官能基（好ましくは、上記保護基による）及びカルボン酸官能基（例えば、ｔｅｒｔ−ブチル基による）の保護。
−他の方法として、及びより単純な実施形態によれば、すべてのアミン及びカルボン酸官能基が保護されている形で、式（II）のポリペプチドを、Ｃ末端のＣＯＯＨ官能基の選択的脱保護により、直接的に提供することが可能である。
−下記化合物（IIIａ）及び（III'）：
(IIIa)＝ ＮＨ（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓｅ−Ｇ1）2
下記式：
Figure 2015512376
[式中、Ｇ1は、セレニウム−保護基を表す]から選択されたアミン化合物と、式（II）のポリペプチドとの液相カップリング反応。
−任意には、ポリペプチドの脱保護。
実施形態によれば、化合物（IIIａ）の保護基Ｇ1は、トリフェニルメチル及びベンジル型の基、及び特にパラ−メチルベンジル又はパラ−メトキシベンジルから選択される。
化合物（IIIａ）が化合物（II）とのカップリングのための出発試薬として使用される場合、後に基Ｇ1の脱保護工程が、化合物（Ｉ）又は（Ｉ'）を得るために提供される。好ましくは、脱保護は、酸、例えばトリフルオロ酢酸又は弗化水素酸、又は酸化剤、例えばヨウ素による処理により行われる。
活性剤、例えばベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）又はブロモ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＲＯＰ）が、カップリング反応中、有利に存在し、又はアミノ酸Ｃ末端自体がハロゲン化された誘導体の形で（特に、アミノ酸弗化物又はアミノ酸塩化物の形で）活性化され、後者は当業者に知られている適切な試薬を用いて、予め形成されるか又は系内で(in situ)形成することができる。アミノ酸ハロゲン化合物のうち、アミノ酸弗化物が好ましく、１，３，５−トリフルオロトリアジンとの反応により予め形成されるか、又はＴＦＦＨ（テトラメチルフルオロホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート）を用いて系内で（in situ)形成される。
一般的に、当業者に知られているアミノ酸のカルボン酸官能基の活性化を可能にする何れかの試薬、例えばＨＢＴＵ、ＴＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＢＯＰ等を想定することもまた可能である（例えば、Chemical approaches to the synthesis of peptides and proteins by Lloyd-Williams, P., Albericio, F., Giralt, E., 1997, CRC Pressを参照のこと）。ＰｙＢＯＰ、ＰｙＢＲＯＰ、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウム）ヘキサフルオロホスフェート、又はより一般的には、ホスホニウムが好ましい。
本発明の官能基化ポリペプチド（Ｉ）又は（Ｉ'）は、第２の変法に従って得られる。
ＳｅＥＡセグメントは、構造（III'）又は（III''）の試薬を用いて、Ｘ1−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−Ｇ4）2又はＸ1−Ｓ−Ｒ1チオエステル型であるＳｅＥＡセグメントから出発して、交換により別々に形成されることができ、ここで、Ｇ４は水素原子、チオール官能基保護基又はジスルフィド結合を表し、そしてＲ１は水素原子又は任意に置換されたアルキル又はアリールに基を表す。
ＳｅＥＡセグメントはまた、試薬（III'）又は（III''）を用いて、Ｘ1−ＳＥＡのＳＥＡセグメント又はＸ1−ＳＲ1チオエステル型から出発して、連結を交換する間、系内で（in situ)形成されることもできる。溶液に存在するＨ−Ｃｙｓ−Ｘ2のセグメントは、交換により形成されるＸ1−ＳｅＥＡセグメントを消費する。一般的に、系内で（in situ)形成されるＸ1−ＳｅＥＡセグメントは、それがＨ−Ｃｙｓ−Ｘ2セグメントと非常に急速に反応するので、観察されない。急速な交換反応及び急速なＳｅＥＡライゲーションのために、試薬（III'）又は（III''）が連結反応媒体中に導入されるとすぐに、ライゲーション反応が顕著に加速される結果となった。
従って、第二の変法によれば、化合物（I）及び（I'）は、次の連続的工程により得られる：
ａ２）
−下記式（ＩＶ）又は（ＩＶ''）：
（ＩＶ）＝Ｘ1 − Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−Ｈ）2；
Figure 2015512376
に対応するチオール官能基を担持する基によりそのＣ末端上で官能化されたペプチド、又は
−チオエステル官能基（ＩＶ'）＝Ｘ1−ＳＲを担持する基により官能化され、Ｒは任意に置換されたアリール又はアルキル基を表す、ペプチドの製造工程、
ｂ２）式（ＩＶ）又は（ＩＶ''）の化合物、又は式（ＩＶ'）の化合物と、下記式（III'）又は（III''）：
Figure 2015512376
のアミン化合物との間で、任意には、化合物式（ＩＶ''）が使用される場合、ジスルフィド結合を還元する化合物の存在下で、液相中で反応させる工程。
特に、式（ＩＶ）又は式（ＩＶ''）の化合物は、国際公開第２０１１／０５１９０６号に記載されるプロトコルに従って、入手することができる。
式（ＩＶ'）において、Ｒ基は好ましくは、任意に置換されたＣ１−Ｃ１２アルキル又は任意に置換されたＣ６−Ｃ１２アリールを表す。そのような化合物は、国際公開第９６／３４８７８号及び第９８／２８４３４号に記載されている。
実施形態によれば、ジスルフィド結合を還元する化合物は、チオール化合物、例えば４−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、チオフェノール及びその誘導体、アルキルチオール（特にベンジルメルカプタン）、セレノール化合物、例えばセレノフェノール又はジフェニルセレニド、又はホスフィン、例えばトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、又はそれらの混合物から選択されてもよい。
前記のカップリング反応の最後で、化合物（Ｉ'）が得られる。化合物（Ｉ）は、ジセレニウム又はトリセレニウム結合を還元する化合物と化合物（Ｉ'）を接触した状態に置くことにより得られる。
ジセレニウム又はトリセレニウム結合を還元する既知化合物の中で、以下のものが挙げられる：トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、還元性チオール、例えば４−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）、チオフェノール、ベンジルメルカプタン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、セレノフェノール又はジフェニルセレニド及びジセレニウム結合還元剤、金属亜塩、及び水素化物、例えばＮａＢＨ4、ＬｉＢＨ4、ＮａＢＨ3ＣＮ、 ＮａＢＨ（ＯＡｃ）3。
官能化段階の最後で、式（Ｉ）又は（Ｉ'）のポリペプチドが得られる。この段階で、例えば液体クロマトグラフィーによる、化合物の精製段階を提供するのが有利である。
官能化ポリマー樹脂
本発明の別の主題は、下記構造（Ｖ）又は（Ｖ'）に対応する官能基化ポリマー樹脂に関する：
Figure 2015512376
[構造式中、□は、固相支持体を表し、
Ｔｒｔは、特に置換基、塩素、メトキシ、メチル、フッ素及びシアノから選択された、１又は２以上の置換基により任意に置換されたトリフェニルメチル基を表す]。
次に、それらのポリマー樹脂は、官能化ＳｅＥＡペプチドを調製するために使用される。
固体支持体□として、可溶性又は不溶性ポリマーが使用され、前記不溶性ポリマーは好ましくは、粒子（beads）の形で存在する。（好ましくは）ポリスチレンに基づく樹脂、又はポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、セルロース、ポリエチレン、ポリエステル、ラテックス、ポリアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール−ポリスチレンコポリマー、ポリエチレングリコール―ポリアクリルアミドコポリマー、又はそれに由来する樹脂を使用することが可能である。
官能化固体支持体□−Ｚの例として、トリチル塩化物、２−クロロトリチル塩化物、４−メチルトリチル塩化物又は４−メトキシトリチル塩化物リンカー基を有するポリスチレン樹脂が言及されることができる。そのような固体支持体は、例えばGlycopepから市販されている。
別の実施形態によれば、官能化固体支持体□−Ｚは、トリチル−アルコール型の基であるリンカー基、すなわちＯＨ−Ｔｒｔ−ＣＯ−ＮＨ−基を有し、前記基中、トリフェニルメチル（Ｔｒｔ）は、特に塩素、メトキシ、メチル、弗素及びシアノから選択された１又は２以上の置換基により任意に置換される。そのようなリンカー基を有する固体支持体は例えば、Quibell, JACS 1995, 117, 11656-11668に記載されており、そして固体ポリエチレングリコール支持体の範囲で、ChemMatrix（登録商標）として市販されている。
このタイプの固相支持体の使用は、下記による固相支持体を活性化する前工程を必要とする：
−Ｂｒ−Ｔｒｔ−ＣＯ−ＮＨ−形でのリンカー基を修飾するために臭素化剤（特に、臭化アセチル）による；
−又はＣｌ−Ｔｒｔ−ＣＯ−ＮＨ−形でのリンカー基を修飾するために塩素化剤（特に、塩化オキサリル）による；
−又はＨ2Ｏ+−Ｔｒｔ−ＣＯ−ＮＨ−形でのリンカー基を修飾するために酸、例えばトリフルオロ酢酸による；
−Singh, S. et al., J. Org. Chem. 2004, 69, 4551-4554に従ってＢＦ3：ＨＯ−Ｔｒｔ−ＣＯ−ＮＨ−形でのリンカー基を修飾するために、ＢＦ3．Ｅｔ2Ｏによる。
このタイプの活性化段階は、Harre et al., Reactive & functional polymers 1999, 41, 111-114に記載されている。
官能基化ポリマー樹脂の調製は、上記官能基化固相支持体□−Ｚにより、下記式：
（III） ＮＨ（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓｅ−Ｈ）2
のアミンをカップリングすることにより行われる。アミン化合物（III）は、式（IIIａ）の上記アミン化合物の脱保護により、それ自体を得ることができ、ここで、式中、Ｇ1はセレニウム保護基である。
カップリングは、第２級アミンが無保護になり、二次反応を導く危険性を制限するために、酸性媒体中で行われる。
好ましくは、過剰の塩化トリチル基は、例えばメタノールにより中和される。次に、形成されるＨＣｌを中和するために、塩基を添加することが重要である。
官能基化ポリマー樹脂の調製が式（Ｉ）及び（Ｉ'）のポリペプチドの固相生成工程の不可欠な部分を形成することを提供できる。
他方では、官能基化ポリマー樹脂は、式（Ｉ）及び（Ｉ'）のペプチドの固相生成工程内で容易に使用するために、事前に及び別々に調製されることができる。
このタイプの固体支持体の使用は、ポリスチレンタイプの樹脂よりも長いポリペプチドの調製のためにより適切な、ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール−ポリスチレン型の樹脂骨格の使用を可能にすることができる。
好ましくは、樹脂粒子は、１〜１０００μｍの間に含まれるＤｖ５０を有する。Ｄｖ５０は、粒子サイズ分布の第５０百分位数であると定義され、すなわち粒子の５０％がＤｖ５０よりも小さなサイズを有し、そして５０％がＤｖ５０よりも大きなサイズを有する。一般的に、Ｄｖ５０は粒子の粒度プロフィール（体積分布）の特徴であり、そしてそれは、レーザー粒度分布計（２００μｍよりも小さなサイズの場合）、又は篩い分け（２００μｍよりも大きなサイズの場合）により決定され得る。
本発明の別の主題は、構造式（ＶII）又は（ＶII'）：
Figure 2015512376
[式中、□は、固相支持体を表し、
Ｔｒｔは、特に置換基、塩素、メトキシ、メチル、フッ素及びシアノから選択された、１又は２以上の置換基により任意に置換されたトリフェニルメチル基を表し、
Ｘ1は、ペプチドフラグメントを表す]
を有する官能化ポリマー樹脂上にグラフト化されたペプチドに関する。
式（Ｉ）及び（Ｉ'）のペプチドを得るための固相法
本発明の別の主題は、前に記載されたペプチド（Ｉ）及び（Ｉ'）の固相合成法に関する。
この固相合成法は、官能化工程、続くペプチド合成工程を包含する。
第一工程は、下記構造式：
Figure 2015512376
又は下記構造（Ｖ'）：
Figure 2015512376
[構造中、
□は、固体支持体を表し、
Ｔｒｔは、特に置換基、塩素、メトキシ、メチル、弗素及びシアノから選択された、１又は２以上の置換基により任意に置換されたトリフェニルメチル基を表す]
を有する官能化ポリマー樹脂の供給を含む。
前記方法の第２段階は、
下記構造（ＶＩ）：
Figure 2015512376
又は下記構造（ＶＩ'）：
Figure 2015512376
[構造式中、□及びＴｒｔは化合物（Ｖ）又は（Ｖ'）と同じ意味を有し、
ＡＡは、１又は２以上の保護基を任意に含むアミノ酸残基を表し；
Ｇ3は、水素原子、又はＡＡのＮ−末端アミン官能基の保護基を表す]
の化合物を製造するために、第一段階で得られた官能基化ポリマー樹脂（Ｖ）又は（Ｖ’）上へのアミノ酸Ｇ3−ＡＡをグラフト化する工程を包含する。
好ましくは、アミノ酸ＡＡは、好ましくは２−（４−ニトロフェニルスルホニル）エトキシカルボニル（ＮＳＣ）又はＦｍｏｃ基から選択された、塩基の存在下で不安定である保護基Ｇ3により、そのＮ末端で保護されている。
アミノ酸ＡＡは、その側鎖上に存在する官能基の全部又は一部（好ましくは、全部）上に、及び特にカルボン酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、アミン（リシンのための）、アルコール（セリン又はトレオニンのための）、フェノール（チロシンのための）、チオール又はセレノール（システイン又はセレノシステインのための）、グアニジン（アルギンのための）、及びイミダゾール（ヒスチジンのための）官能基上に保護基を含む。そのような保護基は当業者に周知である。例えば、Protective groups in organic synthesis, 2nd edition, T. Greene and P. Wuts, John Wiley & Sons, Inc.を参照のこと。
好ましくは、アミノ酸は、ＨＡＴＵ（２−（１Ｈ−７−アザベンゾチリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートメタンアミニウム）、ＰｙＢＯＰ又はＢＯＰ、又はより好ましくは、ＰｙＢＲＯＰの存在下で、又はハロゲン化物、特にフッ化物（すなわち、フッ素原子はアミノ酸残基のアシル基に連結される）の形で、活性化される。
アミノ酸は、アミド結合を形成するために官能基化固相支持体上に存在する第２級アミン官能基と反応する。アミノ酸のカップリングの後、後者は任意に脱保護することができる。
従って、この実施形態によれば、官能化段階は、前に官能化された固相支持体からのプライマー固相支持体を作成することから成る。
第３段階は、下記化合物（ＶII）又は（ＶII'）を生成するためにポリマー樹脂上にグラフト化されたアミノ酸ＡＡを出発原料とするペプチド合成を包む：
Figure 2015512376
ペプチド合成段階は、液相ペプチド合成に関連し、最初のプライマーが固体支持体上にグラフト化されるアミノ酸ＡＡにより提供される、既に記載された工程に類似して行われる。
最終的に、ペプチド合成が完結されると、その支持体からのポリペプチドの分離（又は切断）反応が、化合物（Ｉ）又は（Ｉ'）を生成するためにＴｒｔとＳｅとの間の結合の切断により提供される。好ましくは、切断は、当業者に知られているカルボカチオントラップ、例えば水、トリイソプロピルシラン、チオフェノール、チオアニソール、アニソール、ジメチルスルフィド、等を含むトリフルオロ酢酸溶液により実施される。
アミノ酢の側鎖の適切な脱保護はまた、任意には、式（Ｉ）又は（Ｉ'）の官能基化ペプチドを得るために提供することができる。
液相法に関しては、この段階で、例えば液体クロマトグラフィーにより、化合物精製工程を提供するのに有利である。
ネイティブライゲーション法（Native ligation process）
本発明の別の主題は、
下記式（VIII）：
(VIII) Ｘ1−Ｃ1−Ｘ2−Ｃ2−…−Ｃi-1−Ｘi−…-Ｃn-1−Ｘn
[式中、
Ｘ1, Ｘ2,…, Ｘｉ,…, Ｘｎは、ペプチドフラグメントであり、
Ｃ1, Ｃ2, …, Ｃi-1, …, Ｃn-1は、チオール又はセレノールを担持するアミノ酸残基であり、
ｎは、２又はそれ以上の整数であり、
ｉは、１〜ｎの範囲の何れかの整数である]のポリペプチドの製造方法に関し、該製造方法は、
下記式（ＩＸｉ）：
（ＩＸi） Ｘ'i - Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2−Ｓｅ−Ｈ）2
[式中、
Ｘ'1は、Ｘ1を表し、
Ｘ'iは、ｉ＞１についてＣi-1−Ｘiを表す]の化合物と、
下記式（Ｘi+1）：
（Ｘi+1） Ｃi−Ｘi+1−…−Ｃn-1−Ｘn
の化合物との間の反応の１又は２以上の段階を含み、
下記式（Ｘｉ）：
(Ｘｉ) Ｘ'ｉ−Ｃｉ−Ｘｉ＋１−…−Ｃｎ−１−Ｘｎ
の化合物を形成することを目的とする、方法に関する。
残基Ｃｉは、チオール又はセレノール官能基を含むアミノ酸残基である。このチオール又はセレノール官能基は特に、β−アミノチオール官能基又はβ−アミノセレノール官能基（この場合、Ｃｉ残基は、好ましくはシステイン残基又はセレノシステイン残基を表す）、γ−アミノチオール又はγ−アミノセレノール官能基（この場合、Ｃｉ残基は、好ましくはホモシステイン又はホモセレノシステイン残基を表す）であってもよい。
本発明は、いくつかのライゲーション反応を連続的に実施することによりポリペプチドの製造を可能にする。これは、大きなサイズのポリペプチド、例えば約１００個以上のアミノ酸残基を含むポリペプチドを得るために適切であることを証明することができる。実際、そのような場合、直接的合成による式（ＩＸｉ）及び（Ｘｉ）のポリペプチドの生成は、低収率を有し、従って、約５０個以下のアミノ酸残基を含むポリペプチドのみの直接的合成のためには、２回又は２回以上の連続的連結を使用することが有利である。
一例として、２回の連続的連結の使用は、約５０個以上のアミノ酸残基を含むポリペプチドを直接的に合成することなく、約１５０個のアミノ酸残基を含むポリペプチドを得ることを可能にし；３回の連続的連結の使用は、約５０個以上のアミノ酸残基を含むポリペプチドを直接的に合成することなく、約２００個のアミノ酸残基を含むポリペプチドを得ることを可能にする。
式（ＶIII）のポリペプチドは、いくつかの連結法を用いることにより得られる。他の連結法は、国際公開第２０１１／０５１９０６号に記載されるように、チオエステルを含むか、又は特定の硫黄含有化合物を含む方法である。
本発明の式（ＶIII）のポリペプチドを生成する方法は、式（ＩＸi）の化合物と、式（Ｘi）の化合物との間に、少なくとも１つの反応段階を含む。
従って、本発明の方法は、式（ＶIII ）のポリペプチドの入手を可能にし；各Ｘi（ｉは１〜ｎの整数である）は、ペプチドフラグメントであり；そして各Ｃi（ｉは１〜ｎの整数である）はチオール又はセレノール官能基を含むアミノ酸残基、及び特に、特定の実施形態によれば、ｎ−１回の連続連結を用いてのシステイン又はセレノシステイン残基である。
本発明の実施形態によれば、化合物（ＩＸi）は、ジセレニウム及び／又はトリセレニウム結合を還元する少なくとも１つの化合物の存在下で、下記式（ＩＸ'i）：
Figure 2015512376
の化合物から得られる。実際、次に式（ＩＸ'i）のポリペプチドは系内で（in situ）還元され、そしてライゲーション反応のための式（ＩＸi）のポリペプチドを提供する。
実施形態によれば、還元化合物は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、４−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）、ベンジルメルカプタン、チオフェノール、ＤＴＴ、ナトリウム２−メルカプトエチルスルホネート（ＭＥＳＮａ）、セレノフェノールから選択される。
化合物（Ｉ）及び（Ｉ'）についてこれまで記載されたことに類似して、実施形態によれば、化合物（ＩＸi）及び（ＩＸ'i）は、任意にはジスルフィド及び／又はジセレニウム結合を還元する化合物の存在下で、構造（III'）又は（III''）のセレニウム含有化合物を用いて、構造Ｘ'i− Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−Ｇ5）2のＳＥＡセグメントから又は構造Ｘ'i−Ｓ−Ｒ1のチオエステルから出発して、交換により形成することができ、ここで前記構造式中、Ｇ5はＨ、チオール官能基の保護基、又はジスルフィド結合を表し、そしてＲ1はＨ又は硫黄の保護基を表す。
ｉが１に等しい場合、化合物（ＩＸi）及び（ＩＸ'i）はそれぞれ化合物（Ｉ）及び（Ｉ'）に対応する。
一般的に、試薬としての式（ＩＸ'i）のポリペプチドを出発原料とする連結反応は、式（ＩＸi）のポリペプチドによる直接的な連結反応よりも、実施するのにより実用的であり得る。実際、式（ＩＸi）のポリペプチドは、特に空気中の酸素の作用下で、式（ＩＸ'i）のポリペプチドに酸化する自然の傾向がある。例えば、開環形ポリペプチド（ＩＸi）は、それが凍結乾燥された形で貯蔵される場合、時間の経過とともに酸化される可能性がある。言い換えれば、式（ＩＸi）のポリペプチドの調製は、式（ＩＸ'i）のポリペプチドを一般的に、必然的に一部含む。それらの２種の形の存在は、同定及び精製を複雑にする。これは、式（ＩＸ'i）のポリペプチドを、式（Ｘi）のポリペプチドと接触して置くことにより、連結反応を実施するのにより単純になるからであり、ここで式（ＩＸ'i）の末端環状化を有するポリペプチドが式（ＩＸi）の開環ポリペプチドに系内（in situ)で還元される。
同じ理由から、連結反応が式（Ｘi）のポリペプチドと接触して式（ＩＸi）のポリペプチドを置くことにより直接実施される場合でさえ、反応の間、ジセレニウム結合を還元する、１又は２以上の上述の化合物を用いることが好ましい。
ライゲーション反応は、好ましくは、液相、及び特に水性媒体、例えばリン酸緩衝液下で生じる。この反応は、好ましくは４〜８．５のｐＨ、より好ましくは５〜７．５のｐＨ、及び理想的には５．５に近いｐＨで行われる。
ライゲーション反応は、好ましくは０〜５０℃の温度、及び理想的には約３７℃の温度で行われる。反応時間は、反応の試薬及び他の条件の選択により調節される。適切な時間はまた、反応の間、液体クロマトグラフィー−質量分析の結果に従っても調節することができる。適切な時間は、典型的には、数時間〜数日である。
式（ＩＸi）及び（Ｘi）の各ポリペプチドは、反応の間、好ましくは、０．０１〜５０ｍＭの濃度で存在する。式（ＩＸi）及び（Ｘi）のポリペプチド間のモル濃度比は、反応の間、好ましくは、２：３〜３：２である。
上記ライゲーション反応に続いて、例えば液体クロマトグラフィー又は何れかの他の通常の方法により、式（Ｘi）のポリペプチドの精製工程を行うことができる。
本発明のライゲーション速度は、国際公開第２０１１／０５１９０６号に記載される硫黄含有化合物、又はチオエステル、例えばKent and Dawsonらによる教示により得られるライゲーション速度よりも有意に卓越している。
ＳｅＥＡ連結の急速性のために、それはネイティブライゲーション反応に使用できる他のグループ、例えばＳＥＡ又はチオエステルセグメントの存在下で実施され得る。
ＳｅＥＡ及びＳＥＡライゲーションの組合せは、タンパク質の全合成のために非常に効果的なツールを構成する。いくつかのフラグメントの連結により合成されるタンパク質の生成に関しては、容易な接合のためのＳＥＡライゲーション、及び困難な接合のためのＳｅＥＡ連ライゲーションを実施することが可能である。実際、ＳｅＥＡライゲーションは、例えばＶａｌ−Ｃｙｓ接合のためには４時間で立体障害のある接合の容易な形成を可能にし、ところがこのタイプの接合は、ＳＥＡライゲーションの場合、９６時間又はＮＣＬ連結の場合、８時間の連結時間を必要とする。
ＳｅＥＡ及びＳＥＡライゲーションの別の有用な手段は、ワンポット連続ＳｅＥＡ−ＳＥＡライゲーションである。後者は、接合が類似する立体的障害を有する場合、単離及び中間精製を伴わないで（「ワンポット反応」として知られる）、それらのフラグメントを連結するために実施することができる。この変法の具体的例は、下記に説明される。
本発明の実施形態によれば、本発明の連結法は、
下記式（ＸII）：
(ＸII) Ｘ1− Ｃ1−Ｘ2 −Ｃ2 −Ｘ3
により表されるポリペプチドの、３種のペプチドフラグメントからの生成を可能にし、
前記ポリペプチドは、下記工程：
ａ）下記式（ＸIII）又は（ＸIII'）の化合物：
（ＸIII）Ｒ2 − Ｘ1 −Ｎ（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓｅ−Ｈ）2
Figure 2015512376
及び、下記式（ＸＩＶ）又は（ＸＩＶ'）の化合物：
（ＸＩＶ）Ｈ − Ｃ1 −Ｘ2 −Ｎ（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−Ｈ）2
Figure 2015512376
との間の反応工程であって、
下記式（ＸＶ）又は（ＸＶ'）：
（ＸＶ）Ｒ2−Ｘ1−Ｎ（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓｅ−Ｈ）2
下記式：
Figure 2015512376
の化合物を形成することを目的とし、
ｂ）式（ＸＶ）又は（ＸＶ'）の化合物、及び、
式（ＸＶＩ）：
（ＸＶＩ）Ｈ − Ｃ2 −Ｘ3
との間のポリペプチドとの反応段階を含み、式（ＸII）の化合物を形成することを目的とし、
[式中、Ｒ2は、Ｈ、又はＸ1のＮ−末端官能基の保護基を表し；Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3は互いに独立して、ペプチドフラグメントを表し；Ｃ1及びＣ2は互いに独立して、チオール又はセレノール官能基を担持するアミノ酸残基を表す]
を含む方法により、製造される。
化合物（Ｉ）及び（Ｉ'）を得るための、前記のものと類似の態様で、上記化合物（ＸIII）及び（ＸIII'）は、構造Ｒ2−Ｘ1−ＳＥＡのＳＥＡ化合物又は構造Ｒ2−Ｘ1−Ｓ−Ｒ1のチオエステル（前記構造中、Ｒ1はＨ又は任意に置換されたアルキル又はアリールを表す）の存在下で、(IIIａ）、（III'）又は（III''）の試薬を出発原料とし、交換により系内（in situ）形成され、従って、第２の連結段階の加速を可能にする。
このワンポット３種セグメントライゲーション反応は、接合部分が類似する立体的障害を有する場合、単離及び中間精製を伴わないで（「ワンポット反応」として知られる）、３種のフラグメントを連結するために実施されることができる。接合部分の立体障害は類似するので、化合物（ＸIII）又は（ＸIII'）と化合物（ＸＩＶ）又は（ＸＩＶ'）との間の連結は、分子内ＳＥＡ連結による化合物（ＸＩＶ）又は（ＸＩＶ'）の環化、又は分子間ＳＥＡ連結によるセグメント（ＸＩＶ）又は（ＸＩＶ'）の重合よりもより早い。分子内又は分子間ＳＥＡライゲーションは、国際公開第２０１１／０５１９０６号に記載されている。
ネイティブ自己ライゲーション（native self-ligation）による環状ポリペプチドの生成
上記ネイティブ連結のために使用される原理はまた、ポリペプチドのネイティブ自己ライゲーション（ポリペプチドの一端と同じポリペプチドの他端との連結）により、環状ポリペプチドを生成するためにも使用され得る。
本発明の別の主題は、
下記式（ＸＶII）：
Figure 2015512376
[式中、Ｘ2は、ペプチドフラグメントを表し、そして
Ｃ1は、チオール又はセレノール官能基を含むアミノ酸残基を表す]の環状ペプチドの製造方法に関し、
前記方法は、下記式（ＸＶIII）のポリペプチド：
（ＸＶIII）Ｈ −Ｃ1−Ｘ2 −Ｎ（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓｅ−Ｈ）2
の、それ自体との連結反応（ligation）の、少なくとも１つを含む。
式（ＸＶIII）のポリペプチドは好ましくは、２〜３００個のアミノ酸残基、好ましくは５〜１００個のアミノ酸残基、より好ましくは８〜５０個のアミノ酸残基を含む。
式（ＸＶIII）のポリペプチドは、Ｎ末端で水素原子及びＣ1残基を含み、ここでＣ1は上記に示される意味を有する。ここで、Ｘ2は、ＡＡ1ＡＡ2．．．ＡＡｎ形、ペプチドフラグメントを表し、ここで、ｎは１以上か又は１に等しく、各ＡＡｉはアミノ酸残基を表す。
式（ＸＶIII）のポリペプチドは、好ましくは、２０個のタンパク質原性アミノ酸残基から選択されたアミノ酸残基及びセレノシステインを含む。しかしながら、特定の実施形態によれば、式（ＸＶIII）のポリペプチドは、セレノシステイン以外に、１又は２以上の非タンパク質原性アミノ酸残基を含む。
式（ＸＶIII）のポリペプチドのアミノ酸残基は、任意には、側鎖保護基により保護することができる。
下記式（ＸＶIII'）：
Figure 2015512376
のポリペプチドを、好ましくは、上記に記載される、ジセレニウム結合を還元する少なくとも１つの化合物と接触して置くことにより、上記ライゲーション反応の実施が可能となる。実際、次に、式（ＸＶIII'）のポリペプチドは系内で（in situ）還元され、そしてライゲーション反応のために式（ＸＶIII）のポリペプチドを提供する。
一般的に、ライゲーション反応が式（ＸＶIII）のポリペプチドから直接的に実施される場合であっても、反応の間、ジセレニウム結合を還元する１又は２以上の上記の化合物を使用することが好ましい。
一般的に、式（ＸＶIII）のポリペプチドの環化は、反応が十分な希釈条件下で行われる場合、同時多量体化により妨げられない。例えば、０．０１〜５０ｍＭ、典型的には、約１ｍＭ（又は任意には、多量体化の危険性が高い場合、０．０１〜０．１ｍＭ）の濃度の式（ＸＶIII）のポリペプチドを使用することが可能である。
さらに、ライゲーション反応の実施のための好ましい条件は、式（ＩＸ）及び（Ｘ）のポリペプチドを出発原料とする反応について上記に記載されるそれらの条件と同じである。
上記に記載されるライゲーション反応に続いて、例えばクロマトグラフィー又は何れかの他の通常の技法により得られる式（ＸＶII）の環状ポリペプチドの精製工程を行う。
合成キット
本発明の別の主題は、１又は２以上の式（ＩＸi）又は（ＩＸ′i）又は（ＩＸ′i）のペプチド、又は少なくとも１つの式（III ′）又は（III ′′）の化合物、及び任意には、１又は２以上のカップリング、保護、脱保護試薬又は溶媒を含んで成るポリペプチド合成キットに関する。
実施例１：化合物１（Ｓｅ 2 ＥＡ）及び２（Ｓｅ 3 ＥＡ）の合成
Figure 2015512376
窒素フラッシング下で、無水エタノール（Ｖ＝１９ｍｌ）を、撹拌下で、氷浴において冷却された、セレニウムＳｅ（９４０ｍｇ、１１．９mmolmmolmmol、１．５当量）及び水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4）（３００ｍｇ、７．９mmol）の混合物に滴下する。激しい反応の後、反応媒体を１．５時間、還流する。溶液において形成されるナトリウム二セレニドＮａ2Ｓｅ2は、赤褐色である。
室温で、ＮａＯＨａｑ（０．５Ｍ）／ＥｔＯＨ（１／１）混合物（Ｖ＝３ｍｌ）中、ビス（２−クロロエチル）アミン塩酸塩（８４７ｍｇ、４．７mmolmmol、０．５当量）溶液を、Ｎａ2Ｓｅ2及びＮａ2Ｓｅ3の上記溶液に、１０分間にわたって滴下する。反応媒体を、室温で４５分間、撹拌する。
次に反応溶液を、ＮａＯＨａｑ（０．５Ｍ）の溶液により希釈し（Ｖ＝１０ｍｌ）、次に、ＣＨ2Ｃｌ2（３×３０ｍｌ）により抽出する。次いで有機相を組合せ、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、次いで濃縮し、全体の容積を１／３にする。
次に、得られる有機濃縮物を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１０％）の水溶液により抽出し、次いで、ＲＰ−ＨＰＬＣ: Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム(ｄ ＝ １．９ ｃｍ、Ｌ ＝ ２０ ｃｍ、１３０ Å、５ μｍ)、ＵＶ検出(λ =215 nm)、緩衝液Ａ:H2O/TFA (1:0.05% v/v)、緩衝液Ｂ: ＣＨ3ＣＮ/Ｈ2Ｏ/ＴＦＡ (４：１：０．０５％ v/v/v)、一定濃度（isocratic）: 緩衝液Ａ (３分)、次いで、濃度勾配（gradient）: 緩衝液Ｂ (９分間で０〜５０％、２５ ｍＬ/分)を用いて、直接、精製する。
凍結乾燥の後、化合物１（Ｓｅ2ＥＡ）２３０ ｍｇ (収率Ｙ=２１％)及び化合物２（Ｓｅ3ＥＡ）２４０ ｍｇ (収率Ｙ=1６％)を、黄色粉末の形で得る。
ＬＣ−ＭＳ分析、それぞれ化合物１（Ｓｅ2ＥＡ）及び２（Ｓｅ3ＥＡ）のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー
ＬＣ−ＭＳ：緩衝液Ａ： Ｈ2Ｏ/ＴＦＡ (１/０．１％ v/v)、緩衝液Ｂ: ＣＨ3ＣＮ/Ｈ2Ｏ/ＴＦＡ (４/１：０．１％ v/v/v)。
３０分間にわたる線状勾配０−１００％Ｂ、１ｍｌ／分の流速、ＵＶ検出（λ＝２１５ｍｍ）を用いる、XBridge BEH C18カラム (300 Å、3.5 μm、4.6 x 150 mm)上でのＲＰ−ＨＰＬＣ。
ＭＳ：エレクトロスプレーイオン化陽性モード、電圧コーン（voltage cone）３０Ｖ、四極分析器（quadripolar analyser）。
化合物１のクロマトグラム及び質量スペクトルは、それぞれ図１ａ及び１ｂに示される。
化合物２のクロマトグラム及び質量スペクトルは、それぞれ図２ａ及び２ｂに示される。
実施例２：ＳＥＡセグメントを出発原料とする、交換による本発明のＳｅＥＡセグメントの合成及び単離
ペプチド８：H-ILKEPVHGA-SEAの合成
このペプチドの合成方法は、Ollivier, N.; Dheur, J.; Mhidia, R.; Blanpain, A.; Melnyk, O. Organic letters 2010, 12, 5238-41文献に記載されている。
ペプチド９：H-ILKEPVHGA-SeEAの合成
Figure 2015512376
窒素雰囲気下で、グローブボックス（二酸素（dioxygen）濃度は５０ｐｐｍ未満である）において反応を行う。ＴＣＥＰの２００mmolmmol／ｌ溶液を、ｐＨ７．２での０．１Ｍリン酸緩衝液において調製する。得られるＴＣＥＰ／ＭＰＡＡ溶液のｐＨを、５．５に調節する。
ペプチド８（３．８ｍｇ、３μモル）及びＳｅ3ＥＡリンカー２（８．４ｍｇ、２８μモル、１０当量）を、ＴＣＥＰ（Ｖ＝２９７μｌ）の上記溶液に溶解する。反応媒体を、３７℃で２４時間、撹拌する。
反応の最後で、反応媒体を、ＴＦＡ（０．１％）の溶液により希釈し（Ｖ＝２ｍｌ）、次に逆相高性能液体クロマトグラフィー(ＲＰ−ＨＰＬＣ) (Ｃ１８ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ カラム (ｄ ＝ １ ｃｍ、Ｌ ＝ ２０ ｃｍ、120 Å、５ μｍ)、 ＵＶ 検出 (λ ＝ ２１５ ｎｍ)、緩衝液Ａ: Ｈ2Ｏ/ＴＦＡ (１：０．０５％ v/v)、緩衝液 Ｂ: ＣＨ3ＣＮ/Ｈ2Ｏ/ＴＦＡ (４：１：０．０５％ v/v/v)、 勾配: 緩衝液 Ｂ (５分間にわたって０ 〜２０％、次に６０分間にわたって２０ 〜４２％、６ ｍＬ/分))により直接、精製する。１．９６ｍｇのペプチド９を得る（収率６２％）。
ＬＣ−ＭＳ分析、ペプチド９のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム
ＬＣ−ＭＳ：緩衝液 Ａ: Ｈ2Ｏ/ＴＦＡ (１/０．１％ v/v)、 緩衝液 Ｂ: ＣＨ3ＣＮ/Ｈ2Ｏ/ＴＦＡ (４/１：０．１％ v/v/v)。
３０分間にわたっての線状勾配０−１００％Ｂ、１ｍｌ／分の流速、ＵＶ検出（λ＝２１５ｍｍ）を用いての、XBridge BEH C18 カラム (300 Å、3.5 μm、4.6 x 150 mm)上でのＲＰ−ＨＰＬＣ。
ＭＳ：エレクトロスプレーイオン化陽性モード、電圧コーン３０Ｖ、四極分析器。
図３ａは、０．８時間の反応時間ｔの後、溶液のクロマトグラムに対応する。ｔ＝０．８時間については、交換反応は完結されず、実際、ペプチド８に対応するピークは有意な量でまだ存在する。
図３ｂは、６時間の反応時間ｔの後、溶液のクロマトグラムに対応し、図３ｃはその対応する質量スペクトルである。このクロマトグラムは、交換反応が完結されることを示す。
図４ａ及び４ｂは、精製後のペプチド９のクロマトグラム及び質量スペクトルに対応する。
実施例２ａ：ＳＥＡセグメントを出発原料とする、交換による本発明の大型ＳｅＥＡセグメントの合成及び単離
ペプチド１５：H-IRNCIIGKGRSYKGTVSITKSGIK-SEAの合成
このペプチドの合成方法は、Ollivier, N.; Dheur, J.; Mhidia, R.; Blanpain, A.; Melnyk, O. Organic letters 2010, 12, 5238-41文献に記載されている。
ペプチド１６：H-IRNCIIGKGRSYKGTVSITKSGIK-SeEAの合成
Figure 2015512376
反応は窒素雰囲気下で行われる。ＴＣＥＰの２０mmol／ｌ溶液を、ｐＨ＝５．５、０．１Ｍの酢酸緩衝液下で調製する。得られるＴＣＥＰ溶液のｐＨを４．２に調節する。
ペプチド１５（４ｍｇ、１．４μmol）及びＳｅ3ＥＡリンカー２（４．４ｍｇ、１４．３μmol、１０当量）を、ＴＣＥＰ（Ｖ＝７１９μｌ）の上記溶液に溶解する。反応媒体を、３７℃で２４時間、撹拌する。
反応の最後で、反応媒体を、ＴＦＡ（０．１％）の溶液により希釈し（Ｖ＝３ｍｌ）、次いで、逆相高性能液体クロマトグラフィー(ＲＰ−ＨＰＬＣ) (Ｃ１８ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ カラム (ｄ ＝ １ ｃｍ、Ｌ ＝ ２０ ｃｍ、120 Å、５ μｍ)、 ＵＶ 検出 (λ ＝ ２１５ ｎｍ)、緩衝液Ａ: Ｈ2Ｏ/ＴＦＡ (１：０．０５％ v/v)、緩衝液Ｂ:ＣＨ3ＣＮ/Ｈ2Ｏ/ＴＦＡ (４：１：０．０５％ v/v/v)、 勾配: 緩衝液Ｂ(５分間で０ 〜２０％、次に６０分間で２０ 〜４２％、６ ｍＬ/分))により直接、精製する。１．８ｍｇのペプチド１６を得る（収率３８％）。
ＬＣ−ＭＳ分析、ペプチド１６のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム
ＬＣ−ＭＳ：緩衝液Ａ: Ｈ2Ｏ/ＴＦＡ (１/０．１％ v/v)、 緩衝液Ｂ: ＣＨ3ＣＮ/Ｈ2Ｏ/ＴＦＡ (４/１：０．１％ v/v/v)。
３０分間に亘る線状勾配０−１００％Ｂ、１ｍｌ／分の流速、ＵＶ検出（λ＝２１５ｍｍ）を用いる、XBridge BEH C18 カラム (300 Å、3.5 μm、4.6 x 150 mm)上でのＲＰ−ＨＰＬＣ。
ＭＳ：エレクトロスプレーイオン化陽性モード、電圧コーン３０Ｖ、四極分析器。
図１３は、２４時間の反応時間ｔ後の、溶液のクロマトグラムに対応する。ペプチド１６に対応するピークは明確に存在し、そして交換反応が完結したことを示す。
図１４ａ及び１４ｂは、それぞれ精製後のペプチド１６のクロマトグラム及び質量のスペクトルに対応する。
実施例３：本発明のセレニウム基の化合物又は従来技術の硫黄基の化合物によるネイティブライゲーション
ペプチド３、配列番号１Ac-GFGQGFGG-OHの合成
このペプチドの合成方法は、Ollivier, N.; Dheur, J.; Mhidia, R.; Blanpain, A.; Melnyk, O. Organic letters 2010, 12, 5238-41文献に記載される。
ペプチド４：Ac-GFGQGFGG-SeEAの合成
Figure 2015512376
ペプチド３（５０ｍｇ、０．０７mmol）及び分子１（３０ｍｇ、０．１３mmol、２当量）を、３．５ｍｌのＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）に溶解し、続いてベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）（６８ｍｇ、０．１４mmol、２当量）を添加、次にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（４５μｌ、０．２８mmol、４当量）を添加する。反応媒体を周囲温度で１．５時間、撹拌し、次に、ジエチルエーテル／ヘプタンの冷混合物（７５ｍｌ、１：１ ｖ／ｖ）から沈殿せしめ、遠心分離し、次に最少量の水に溶解し、凍結乾燥する。
未処理のペプチド４を、逆相高性能液体クロマトグラフィー(ＲＰ−ＨＰＬＣ) (Ｃ１８ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ カラム (ｄ ＝ １ ｃｍ、Ｌ ＝ ２０ ｃｍ、120 Å、５ μｍ)、 ＵＶ 検出 (λ ＝ ２１５ ｎｍ)、緩衝液Ａ: Ｈ2Ｏ/ＴＦＡ (１：０．０５％ v/v)、緩衝液Ｂ: ＣＨ3ＣＮ/Ｈ2Ｏ/ＴＦＡ (４：１：０．０５％ v/v/v)、濃度勾配: 緩衝液Ｂ(５分間で０ 〜２０％、次に６０分間で２０ 〜４２％、６ ｍＬ/分))により直接、精製する。１５ｍｇのペプチド４を得る（収率２４％）。
ＬＣ−ＭＳ分析、ペプチド４のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム
ＬＣ−ＭＳ：緩衝液Ａ: Ｈ2Ｏ/ＴＦＡ(１/０．１％ v/v)、緩衝液Ｂ:ＣＨ3ＣＮ/Ｈ2Ｏ/ＴＦＡ(４/１：０．１％ v/v/v)。
３０分間の線状勾配０−１００％Ｂ、１ｍｌ／分の流速、ＵＶ検出（λ＝２１５ｍｍ）を用いての、XBridge BEH C18 カラム (300 Å、3.5 μm、4.6 x 150 mm)上でのＲＰ−ＨＰＬＣ。
ＭＳ：エレクトロスプレーイオン化陽性モード、電圧コーン３０Ｖ、四極分析器。
図５ａ及び５ｂは、精製の後、それぞれ、ペプチド４のクロマトグラム及び質量のスペクトルに対応する。
ペプチド５：Ac-GFGQGFGG-SEAの合成
このペプチドの合成方法は、Ollivier, N.; Dheur, J.; Mhidia, R.; Blanpain, A.; Melnyk, O. Organic letters 2010, 12, 5238-41文献に記載される。
ペプチド６、配列番号２ H-CILKEPVHGA-NH2の合成
このペプチドの合成方法は、Ollivier, N.; Dheur, J.; Mhidia, R.; Blanpain, A.; Melnyk, O. Organic letters 2010, 12, 5238-41文献に記載される。
ペプチド７、配列番号３ Ac-GFGQGFGGCILKEPVHGA-NH2のＳｅＥＡライゲーションによる合成。ペプチド４ Ac-GFGQGFGG-SeEA及びペプチド５ Ac-GFGQGFGG-SEAの反応性の比較
Figure 2015512376
ａ−ペプチド４ Ac-GFGQGFGG-SeEAとペプチド６ H-CILKEPVHGA-NH2との連結速度及び収率
ペプチド４とペプチド６とのＳｅＥＡライゲーションを、窒素雰囲気下で、グローブボックス（５０ｐｐｍ未満の二酸素（dioxygen）濃度）において行う。グアニジンの３Ｍ溶液を、ｐＨ＝７．３で、０．２Ｍのリン酸緩衝液において調製する。次に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、２８．６ｍｇ、０．１mmol）及び３−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ、１６．８ｍｇ、０．１mmol）を添加する。得られるＴＣＥＰ／ＭＰＡＡ／グアニジン溶液を、ｐＨ＝７．２に調節する。
ペプチド４（４．９ｍｇ、５μＭ）及び６（１０．６ｍｇ、７．６μＭ、１．５当量）を、上記ＴＣＥＰ／ＭＰＡＡ／グアニジン溶液（１．５ｍｌ）に溶解する。反応媒体を、３７℃で２４時間、撹拌する。
ライゲーション反応が完結されると、反応媒体を水（Ｖ＝３ｍｌ）により希釈し、次にＴＦＡ（１０％）（Ｖ＝１ｍｌ）の溶液により酸性化し、次にＭＰＡＤを、エーテル６．５ｍｌを用いて、３度、抽出する。
水性相における連結生成物７を、逆相高性能液体クロマトグラフィー(ＲＰ−ＨＰＬＣ) (Ｃ１８ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ カラム (ｄ ＝ １ ｃｍ、Ｌ ＝ ２０ ｃｍ、120 Å、５ μｍ)、 ＵＶ 検出 (λ ＝ ２１５ ｎｍ)、緩衝液Ａ: Ｈ2Ｏ/ＴＦＡ (１：０．０５％ v/v)、緩衝液 Ｂ: ＣＨ3ＣＮ/Ｈ2Ｏ/ＴＦＡ (４：１：０．０５％ v/v/v)、濃度勾配: 緩衝液Ｂ (５分間で０ 〜２０％、次に６０分間で２０ 〜４２％、６ｍＬ/分))により直接、精製する。５．６ｍｇのペプチド７を得る（収率５４％）。
ＬＣ−ＭＳ分析、ペプチド７のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム
ＬＣ−ＭＳ：緩衝液Ａ:Ｈ2Ｏ/ＴＦＡ(１/０．１％ v/v)、 緩衝液Ｂ:ＣＨ3ＣＮ/Ｈ2Ｏ/ＴＦＡ (４/１：０．１％ v/v/v)。
３０分間にわたっての線状勾配０−１００％Ｂ、流速１ｍｌ／分、ＵＶ検出（λ＝２１５ｍｍ）を用い、XBridge BEH C18 カラム (300 Å、3.5 μm、4.6 x 150 mm)上でのＲＰ−ＨＰＬＣ。
ＭＳ：エレクトロスプレーイオン化陽性モード、電圧コーン３０Ｖ、四極分析器。
図６ａ及び６ｂは、それぞれ、精製後のペプチド７のクロマトグアム及び質量のスペクトルに対応する。
ｂ−ペプチド５ Ac-GFGQGFGG-SEAとペプチド６ H-CILKEPVHGA-NH2との連結速度
ペプチド５とペプチド６とのＳＥＡライゲーションの反応は、厳密に同じ条件下で行われる。
速度の比較
図７は、記号●により表される曲線である、本発明のセレニウム基の化合物（ペプチド４）、又は記号▲により表される曲線である、従来技術の硫黄基の化合物（ペプチド５）との、ペプチド７の形成のための連結反応の速度の比較を表す。
図７は、記号●により表される曲線である、本発明の連結反応について、高い反応速度を示す。
実施例４：ＳｅＥＡ、ＳＥＡ及びＮＣＬ（チオエステル化合物）方法についての連結速度の比較
ペプチド１５a：H-ILKEPVHGV-SEAの合成
このペプチドの合成方法は、Ollivier, N.; Dheur, J.; Mhidia, R.; Blanpain, A.; Melnyk, O. Organic letters 2010, 12, 5238-41文献に記載される。
ペプチド１５ｂ：H-ILKEPVHGV-SeEAの合成
ペプチド１５ａから出発して、ペプチド１５ｂの合成方法は、ペプチド９の合成のために使用される方法と厳密に同一である。
ペプチド１５ｃ：H-ILKEPVHGV-MPA (MPA = ３−メルカプトプロピオン酸)の合成
このペプチドの合成方法は、Dheur, J.; Ollivier, N.; Vallin, A.; Melnyk, O. Journal of Organic Chemistry 2010, 76, 3194-3202文献に記載される。
ＳｅＥＡ、ＳＥＡライゲーション及びＮＣＬ法について、ペプチド６ H-CILKEPVHGA-NH-2とペプチド15a/15b/15c H-ILKEPVHGV-Rとの連結速度の比較
Figure 2015512376
ペプチド１５ａ又は１５ｂ又は１５ｃ、及びペプチド６の異なるライゲーションを、窒素雰囲気下で、グローブボックス（[Ｏ2]＜５０ｐｐｍ）において、個別に実施する。ＴＣＥＰの２００mmol／ｌ溶液を、ｐＨ７．２で、０．１Ｍのリン酸緩衝液において調製する。次に、３−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ ３３ｍｇ、０．２mmol）を添加する。得られるＴＣＥＰ／ＭＰＡＡ溶液のｐＨを、７．２に調節する。
ペプチド１５ａ又は１５ｃ及び６（１５．当量）を、３mmol／ｌの濃度で、上記ＴＣＥＰ／ＭＰＡＡ溶液に個別に溶解する。反応媒体を３７℃で２４時間、撹拌する。連結生成物１６の形成速度を、ＨＰＬＣによりモニターする。
図１２は、ＳｅＥＡ、ＳＥＡライゲーション又はＮＣＬ（チオエステル化学）方法に従ってのペプチド１６の形成反応速度の比較を可能にする。
図１２においては、●により表される曲線は、ペプチド１５ｂからのペプチド１６の形成に対応し、■により表される曲線は、ペプチド１５ａからのペプチド１６の形成に対応し、そして◆により表される曲線は、ペプチド１５ｃからのペプチド１６の形成に対応する。
図１２は、ＳｅＥＡ連結反応速度（●により表される曲線）が、ＮＣＬ法（■により表される曲線）の連結反応速度よりも高く、ＳＥＡ法（◆により表される曲線）の連結反応速度よりもそれ自体有意に高いことを示す。
実施例５：同時交換及び連結によるＳｅＥＡセグメントの系内（in situ）形成−連結反応の触媒作用
ペプチド１０：H-ILKEPVHGY-SEAの合成
このペプチドの合成方法は、Ollivier, N.; Dheur, J.; Mhidia, R.; Blanpain, A.; Melnyk, O. Organic letters 2010, 12,5238-41文書に記載される。
ａ−ペプチド１１、配列番号４ H-ILKEPVHGYCILKEPVHGA-NH2を生成するための、Ｓｅ3ＥＡリンカー２の存在下でのペプチド６ H-CILKEPVHGA-NH-2とペプチド１０ H-ILKEPVHGY-SEAとの連結速度
Figure 2015512376
ペプチド６とペプチド１０とのＳＥＡ連結を、窒素雰囲気下で、グローブボックス（５０ｐｐｍ未満の二酸素（dioxygen）濃度）において行う。ＴＣＥＰの２００mmol／ｌ溶液を、ｐＨ７．２で０．１Ｍのリン酸緩衝液において調製する。
ペプチド１０（１ｍｇ、０．６μＭ）及び６（１．４ｍｇ、１μＭ、１．５当量）並びにＳｅ3ＥＡリンカー２（５．８ｍｇ、０．０２mmol、２８当量）を、ＴＣＥＰの上記溶液（９４μｌ）に溶解する。反応媒体を３７℃で２４時間、撹拌する。生成物１１の連結形成速度を、ＨＰＬＣによりモニターする。
ｂ−ＭＰＡＡの存在下での、ペプチド１０ H-ILKEPVHGY-SEAと、ペプチド６ H-CILKEPVHGA-NH-2との連結速度の比較
Figure 2015512376
ペプチド６とペプチド１０とのＳＥＡ連結を、窒素雰囲気下で、グローブボックス（５０ｐｐｍ未満の二酸素（dioxygen）濃度）において行う。ＴＣＥＰの２００mmol／ｌ溶液を、ｐＨ７．２で０．１Ｍのリン酸緩衝液において調製する。３−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ、３３ｍｇ、０．２mmol）を添加する。得られるＴＣＥＰ／ＭＰＡＡ溶液を、ｐＨ＝７．２に調節する。
ペプチド１０（１ｍｇ、５μＭ）及び６（１０．６ｍｇ、７．６μＭ、１．５当量）を、上記ＴＣＥＰ／ＭＰＡＡ溶液（９４μｌ）に溶解する。反応媒体を、３７℃で２４時間、撹拌する。連結生成物１１の形成速度を、ＨＰＬＣによりモニターする。
図８は、本発明の化合物２の存在か又は不在下で、ペプチド１１の形成の反応速度の比較を可能にする。
図８においては、●により表される曲線は、セレニウム含有化合物２の存在下でのペプチド１０の本発明のライゲーション反応に対応し、そして▲により表される曲線は、セレニウム含有化合物の不在下、但しＭＰＡＡの存在下での、従来技術のペプチド１０のライゲーション藩王に対応する。
図８は、化合物２が存在する場合、より高い反応速度であることを示す。
実施例６：ＳｅＥＡ及びＳＥＡ連結を用いての３種のセグメントのワンポット連続連結
ペプチド１２：H-C(StBu)HHLEPGG-SEAの合成
このペプチドの合成方法は、Ollivier, N.; Dheur, J.; Mhidia, R.; Blanpain, A.; Melnyk, O. Organic letters 2010, 12,5238-41文書に記載される。
セグメント４ Ac-GFGQGFGG-SeEA、１２ H-C(StBu)HHLEPGG-SEA及び６ H-CILKEPVHGA-NH2の連結による、
ペプチド１４ 配列番号５ Ac-GFGQGFGG-CHHLEPGG-CILKEPVHGA-NH2の合成
Figure 2015512376
−工程１
グアニジン塩酸塩（ＧｄｎＨＣｌ、５７３．１８ｍｇ、６mmol）を、０．１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ＝７．３（最終１ｍｌ、６Ｍ）に溶解する。
４−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ、３３．８３ｍｇ、０．２mmol）及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ、５７．３７ｍｇ、０．２mmol）を、この溶液（１ｍｌ）に溶解する。６ＭのＮａＯＨを添加し、溶液のｐＨを７．３７に調節する。
ペプチド４ Ac-GFGQGFGG-SeEA（５．３３ｍｇ、５．４μＭ）及び１２ H-C(StBu)HHLEPGG-SEA（７．５９ｍｇ、５．４μＭ）を、上記溶液（７８０μｌ）に、一緒に溶解する。反応媒体を、不活性雰囲気下、３７℃、温度調節浴に配置する。
連結を、ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８ カラム(４．６ｘ２５０ ｍｍ、３００Å,５μｍ) (２１５ｎｍ、１ｍＬ/分、３０℃、緩衝液Ａ ０．１％ ＴＦＡ含有水、緩衝液Ｂ０．１％ ＴＦＡ含有ＣＨ3ＣＮ/水 ４/１，３０分にわたって０−１００％ Ｂ)上でＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターする。このためには、反応媒体のアリコート（２μｌ）を、１０％水性ＴＦＡにより酸性化し、Ｅｔ2Ｏにより抽出し、分析前にＭＰＡＡを除去する。
溶液中のペプチド１３ Ac-GFGQGFGG-CHHLEPGG-SEAを、該方法で入手する。
図９ａ及び９ｂは、それぞれ、ペプチド１３のクロマトグラム及び質量スペクトルを表す。
−工程２
反応後４時間３５分で、ペプチド６ H-CILKEPVHGA-NH2（１１．０６ｍｇ、８．１μモル）を、反応媒体に固体形で添加する。反応を３７℃、不活性雰囲気下において行う。
ライゲーション反応を、ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８ カラム(４．６ ｘ ２５０ ｍｍ、３００ Å, ５ μｍ) (２１５ ｎｍ、１ ｍＬ/分、３０℃、緩衝液Ａ ０．１％ ＴＦＡ含有水、緩衝液Ｂ０．１％ ＴＦＡ含有ＣＨ3ＣＮ/水 ４/１，３０分間で０−１００％ Ｂ)上でＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターする。このために、反応媒体のアリコート（２μｌ）を、１０％水性ＴＦＡにより酸性化し、Ｅｔ2Ｏにより抽出し、分析の前、ＭＰＡＡを除去する。
反応完結後、反応媒体を水（４ｍｌ）により希釈し、そして１０％水性ＴＦＡ（１ｍｌ）を添加する。Ｅｔ2Ｏ（４×４ｍｌ）による４回の抽出の後、水性相をにアルゴンを吹き込むことにより、２分間、脱気する。ヌクレオシルＣ１８カラム、１２０Å、５μｍ（２１５ ｎｍ、１ ｍＬ/分、３０℃、 緩衝液Ａ ０．１％ ＴＦＡ含有水、緩衝液Ｂ ０．１％ ＴＦＡ含有ＣＨ3ＣＮ/水 ４/１，３０分で０−１００％Ｂ）上でのＲＰ−ＨＰＬＣによる精製の後、６ｍｇ（３６％）のペプチド１４ Ac-GFGQGFGG-CHHLEPGG-CILKEPVHGA-NH2を得る。
図１０ａ及び１０ｂは、それぞれ、精製前の、化合物１４のクロマトグラム及び質量スペクトルを表す。
図１１ａ及び１１ｂは、それぞれ、精製後の、化合物１４のクロマトグラム及び質量スペクトルを表す。

Claims (18)

  1. ａ）式（Ｉ）：Ｘ1−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＳｅＨ）2のペプチド；又は
    ｂ）下記式（Ｉ'）：
    Figure 2015512376
     のペプチド；
    ［式中、Ｘ1はペプチドフラグメントを表し、
    −Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＳｅＨ）2基又は
    Figure 2015512376
     の基は、Ｃ末端位置に存在するペプチドフラグメントＸ1のアミノ酸残基のＣ＝Ｏ末端と共にアミド結合を形成する］
    から選択される、官能化ペプチド。
  2. Ｘ1が、２〜３００のアミノ酸残基、好ましくは５〜１００のアミノ酸残基、より好ましくは８〜５０のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載の官能化ペプチド。
  3. 請求項１又は２に記載の官能化ペプチドを得るための製造方法であって、
    下記工程ａ１及びｂ１：
    ａ１）下記式（II）：
    （II）Ｘ1−ＯＨ
    のポリペプチドを提供するためのペプチド合成工程であって、好ましくは、そのＣ末端カルボン酸官能基以外の、そのアミン及びカルボン酸基上に保護基を含み、
    ｂ１）段階ａ）で得られたポリペプチドの官能基化工程であって、以下の工程を含み：
    −式（II）のポリペプチドを、下記式：
    (IIIa) ＮＨ（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓｅ−Ｇ1）2
    Figure 2015512376
     [式中、Ｇ1は、セレニウム保護基又は水素原子である]
    から選択されたアミン化合物と、式（Ｉａ）Ｘ1−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2−Ｓｅ−Ｇ1）2、又は(I’)ポリペプチドを得ることを目的として、液相中で反応させる工程；
    −任意に、式（Ｉ）の化合物を生成することを目的として、式（Ｉａ）のポリペプチドの脱保護、
    又は下記工程ａ２及びｂ２：
    ａ２）
    −下記式（ＩＶ）又は（ＩＶ''）：
    （ＩＶ）Ｘ1 − Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−Ｈ）2；
    Figure 2015512376
     の化合物の使用、又は、
    −チオエステル官能基（ＩＶ'）＝Ｘ1−ＳＲを担持する基により官能化され、Ｒは任意に置換されたアリール又はアルキル基を表す、ペプチドの使用、
    ｂ２）式（ＩＶ）又は（ＩＶ''）の化合物、又は式（ＩＶ'）の化合物と、下記式（III'）又は（III''）：
    Figure 2015512376
     のアミン化合物との間で、式（Ｉ）又は（Ｉ′）のペプチドを形成することを目的として、液相中で反応させる工程、
    を含む、方法。
  4. ａ）下記式（III'）：
    Figure 2015512376
     の化合物、
    ｂ）下記式（III''）：
    Figure 2015512376
     の化合物から選択される、請求項３に記載の方法に使用することができる、化合物。
  5. 請求項４に記載の式（III'）及び式（III''）の化合物の製造方法であって、金属水素化物であるＮａＢＨ4、ＬｉＢＨ4又はＬｉＡｌＨ4を用いる、以下の処理反応：
    Figure 2015512376
     続いて、下記反応：
    Figure 2015512376
     を含む、方法。
  6. 請求項１又は２に記載のペプチドを得るための製造方法であって、下記の工程：
    ａ）構造式（Ｖ）：
    Figure 2015512376
     又は構造式（Ｖ'）：
    Figure 2015512376
     [構造式中、□は、固相支持体を表し、
    Ｔｒｔは、特に置換基、塩素、メトキシ、メチル、フッ素及びシアノから選択された、１又は２以上の置換基により任意に置換されたトリフェニルメチル基を表す]
    により官能基化されたポリマー樹脂の供給工程、
    ｂ）構造式（ＶＩ）：
    Figure 2015512376
     又は下記構造（ＶＩ'）：
    Figure 2015512376
     [構造式中、
    □及びＴｒｔは化合物（Ｖ）又は（Ｖ'）と同じ意味を有し、
    ＡＡは、１又は２以上の保護基を任意に含むアミノ酸残基を表し；
    Ｇ3は、水素原子、又はＡＡのＮ−末端アミン官能基の保護基を表す]
    の化合物を製造するために、段階ａ）で得られた官能化ポリマー樹脂上へのアミノ酸をグラフト化する工程、
    ｃ）下記式（ＶII）又は（ＶII'）：
    Figure 2015512376
    Figure 2015512376
     [式中、□は、固相支持体を表し、
    Ｔｒｔは、特に置換基、塩素、メトキシ、メチル、フッ素及びシアノから選択された、１又は２以上の置換基により任意に置換されたトリフェニルメチル基を表し、
    Ｘ1は、ペプチドフラグメントを表す]
    の化合物を製造するために、アミノ酸ＡＡを出発原料とするペプチド合成工程、
    ｄ）化合物（Ｉ）又は（Ｉ'）を生成するために、ＴｒｔとＳｅとの間の結合の切断する工程、
    を含む、方法。
  7. ポリマー樹脂上へのアミノ酸のグラフト化が、官能化樹脂（Ｖ）又は（Ｖ'）を、アミノ酸ハロゲン化物、又はアミノ酸及び活性化剤、好ましくはＨＡＴＵ、ＰｙＢＯＰ、ＢＯＰ，ＰｙＢＲＯＰ、特により好ましくはＨＡＴＵから選択された活性化剤と接触させた状態に置くことを含む、請求項６に記載の方法。
  8. 下記構造式（Ｖ）：
    Figure 2015512376
     又は下記構造式（Ｖ'）：
    Figure 2015512376
     [構造式中、
    □は、固相支持体を表し、
    Ｔｒｔは、特に塩素、メトキシ、メチル、フッ素及びシアノ基から選択された、１又は２以上の置換基により任意に置換されたトリフェニルメチル基を表す]
    とともに、請求項６又は７に記載の方法において使用することができる、官能化ポリマー樹脂。
  9. 下記式（ＶII）又は（ＶII'）：
    Figure 2015512376
    Figure 2015512376
     [式中、
    □は、固体支持体を表し、
    Ｔｒｔは、特に置換基、塩素、メトキシ、メチル、フッ素及びシアノから選択された、１又は２以上の置換基により任意に置換されたトリフェニルメチル基を表し、
    Ｘ1は、ペプチドフラグメントを表す]
    に対応するペプチドフラグメントを含む、ポリマー樹脂。
  10. 前記固体支持体□が、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、セルロース、ポリエチレン、ポリエステル、ラテックス、ポリアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール−ポリスチレンコポリマー、ポリエチレングリコール−ポリアクリルアミドコポリマー及びそれらの誘導体から選択される、請求項８又は９に記載のポリマー樹脂。
  11. ａ）−Ｔｒｔ又は−ＮＨ−ＣＯ−Ｔｒｔ基による官能化固相支持体の提供；
    ｂ）式（III）：ＮＨ（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓｅ−Ｈ）2のアミン化合物と、前記固体支持体のＴｒｔ官能基との反応；
    [ここで、Ｔｒｔは、請求項８〜１０と同じ定義を有する]
    を含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のポリマー樹脂の製造方法。
  12. 下記式（VIII）：
    (VIII) Ｘ1−Ｃ1−Ｘ2−Ｃ2−…−Ｃi-1−Ｘi−…-Ｃn-1−Ｘn
    [式中、
    Ｘ1, Ｘ2,…, Ｘｉ,…, Ｘｎは、ペプチドフラグメントであり、
    Ｃ1, Ｃ2, …, Ｃi-1, …, Ｃn-1は、チオール又はセレノールを担持するアミノ酸残基であり、
    ｎは、２又はそれ以上の整数であり、
    ｉは、１〜ｎの範囲の何れかの整数である]
    のポリペプチドの製造方法であって、該製造方法は、
    下記式（ＩＸｉ）：
    （ＩＸi） Ｘ'i - Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2−Ｓｅ−Ｈ）2
    [式中、
    Ｘ'1は、Ｘ1を表し、
    Ｘ'iは、Ｃi-1−Ｘiを表し、ｉ＞１である]の化合物と、
    下記式（Ｘi+1）：
    （Ｘi+1） Ｃi−Ｘi+1−…−Ｃn-1−Ｘn
    の化合物との間の反応の１又は２以上の段階を含み、
    下記式（Ｘi）：
    （Ｘi） Ｘ‘i−Ｃi−Ｘi+1−…−Ｃn-1−Ｘn
    の化合物を形成することを目的とする、方法。
  13. 化合物（ＩＸi）が、下記式（ＩＸi'）化合物：
    Figure 2015512376
     を出発原料とし、ジセレニウム結合を還元する少なくとも１つの化合物を接触させた状態に置くことにより形成される、請求項１２に記載の方法。
  14. 化合物（ＩＸ'i）が、下記式（ＸＩi）、(ＸＩ'i)又は(ＸＩ''i)：
    (ＸＩi)Ｘ'i −Ｓ − Ｒ1
    下記式：
    Figure 2015512376
     (ＸＩ'’i) Ｘ'i − Ｎ（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−Ｈ）2
    [式中、Ｘ'iは、Ｃi−Ｘi形のペプチドフラグメントであり、ｉ＞１であり、
    Ｘ′は、Ｘ1を表し、
    Ｒ1は、任意に置換されたアリール又はアルキル基を表す]の化合物と、
    請求項４に記載の式（III’）又は式（III''）の化合物との間の反応により得られる、請求項１３に記載の方法。
  15. 下記式（ＸＩＩ）：
    (ＸＩＩ)Ｘ1−Ｃ1−Ｘ2−Ｃ2−Ｘ3
    により表されるポリペプチドの生成に対し、下記工程：
    ａ）下記式（ＸIII）又は（ＸIII'）の化合物：
    （ＸIII）Ｒ2 − Ｘ1 −Ｎ（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓｅ−Ｈ）2
    Figure 2015512376
     及び、下記式（ＸＩＶ）又は（ＸＩＶ'）の化合物：
    （ＸＩＶ）Ｈ − Ｃ1 −Ｘ2 −Ｎ（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−Ｈ）2
    Figure 2015512376
     との間の反応工程であって、
    下記式（ＸＶ）又は（ＸＶ'）：
    （ＸＶ）Ｒ2−Ｘ1−Ｃ１−Ｘ2−Ｎ（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−Ｈ）2
    Figure 2015512376
     の化合物を形成することを目的とし、
    ｂ）式（ＸＶ）又は（ＸＶ’）の化合物、及び、
    式（ＸＶI）：（ＸＶI）Ｈ − Ｃ2 −Ｘ3
    のポリペプチドとの反応段階を含み、式（ＸII）の化合物を形成することを目的とし、
    [式中、Ｒ2は、Ｈ、又はＸ1のＮ−末端官能基の保護基を表し；Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3は互いに独立して、ペプチドフラグメントを表し；Ｃ1及びＣ2は互いに独立して、チオール又はセレノール官能基を担持するアミノ酸残基を表す]
    を含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
  16. 下記式（ＸＶII）：
    Figure 2015512376
     [式中、Ｘ2は、ペプチドフラグメントを表し、そして
    Ｃ1は、チオール又はセレノール官能基を含むアミノ酸残基を表す]の環状ペプチドの製造方法であって、
    当該方法は、下記式（ＸＶIII）のポリペプチド：
    （ＸＶIII）Ｈ−Ｃ1−Ｘ2−Ｎ（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓｅ−Ｈ）2
    の、それ自体との連結反応（ligation）の、少なくとも１つを含む、方法。
  17. 前記連結反応（ligation）が、下記式（ＸＶIII'）：
    Figure 2015512376
     のポリペプチドを、ジセレニウム結合を還元する少なくとも１つの化合物に接触させて置くことにより実施される、請求項１６記載の方法。
  18. 請求項１２又は１３に記載の方法において使用することができる式（ＩＸi）又は（ＩＸ′i）の１又は２以上のペプチド、又は請求項４に記載の少なくとも１つの化合物を含む、ポリペプチド合成キット。
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