ES2576678T3 - Polipéptidos ligandos de e-selectina/l-selectina de células hematopoyéticas y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Polipéptidos ligandos de e-selectina/l-selectina de células hematopoyéticas y métodos de uso de los mismos Download PDF

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Abstract

Una proteina de fusion de inmunoglobulina que comprende un polipeptido glicosilado, comprendiendo dicho polipeptido glicosilado una cadena principal del polipeptido CD44 que muestra glicanos sialilados y fucosilados y se une a la E-selectina y a la L-selectina.

Description

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antígeno asociado al linfocito cutáneo. La unión de HCELL a HECA-452 disminuye después del tratamiento con Nglucosidasa-F, sialidasa o fucosidasa. Además, la actividad de HCELL, por ejemplo, unión a E-selectina y a Lselectina, también disminuye con el tratamiento con N-glucosidasa-F, sialidasa o fucosidasa, lo que demuestra la importancia de los glicanos unidos a N sialofucosilados en la función de HCEL. En contraste, la sialilación de CD44
5 inhibe la unión de CD44 al ácido hialurónico. Además la unión de CD44 al hialuronato aumenta mediante la sulfatación, pero la sulfatación no es necesaria para la actividad E-selectina y L-selectina de HCELL.
Preferentemente, el polipéptido CD44 es la isoforma estándar o hematopoyética de CD44 (CD44H). Como alternativa, el polipéptido CD44 es la isoforma R1 (CD44R1) o R2 (CD44R2). Por ejemplo, un polipéptido HCELL
10 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. (Gen Bank, con número de registro CAA40133; Tabla 1) Un polipéptido HCELL es al menos aproximadamente 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, o 95 % idéntico a la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 1.
Tabla 1
15 1 mdkfwwhaaw glclvplsla qidlnitcrf agvfhvekng rysisrteaa dlckafnstl 61 ptmaqmekal sigfetcryg fieghvvipr ihpnsicaan ntgvyiltsn tsqydtycfn 121 asappeedct svtdlpnafd gpititivnr dgtryvqkge yrtnpediyp snptdddvss 181 gssserssts ggyifytfst vhpipdedsp witdstdrip atnmdsshst tlqptanpnt 241 glvedldrtg plsmttqqsn sqsfstsheg leedkdhptt stltssnrnd vtggrrdpnh 301 segsttlleg ytshyphtke srtfipvtsa ktgsfgvtav tvgdsnsnvn rslsgdqdtf 361 hpsggshtth gsesdghshg sqeggantts gpirtpqipe wliilaslla lalilavcia 421 vnsrrrcgqk kklvinsgng avedrkpsgl ngeasksqem vhlvnkesse tpdqfmtade 481 trnlqnvdmk igv (SEQ ID NO:1)
Polipéptidos de HCELL
Los inventores describen glucoproteínas de HCELL aisladas y porciones biológicamente activas de las mismas, o
20 derivados, fragmentos, análogos u homólogos de las mismas. También se describen fragmentos de polipéptidos apropiados para su uso como inmunógenos para generar anticuerpos anti-HCELL. En una realización, las glucoproteínas de HCELL nativas se pueden aislar de células o tejidos mediante un esquema de purificación adecuado usando técnicas estándar de purificación de proteínas.
25 En otra realización, las glucoproteínas de HCELL se producen por técnicas de ADN recombinante. De forma alternativa a la expresión recombinante, una glucoproteína o polipéptido de HCELL se pueden sintetizar químicamente usando técnicas de síntesis peptídica estándar.
Una proteína “aislada” o “purificada” o una porción biológicamente activa de la misma está sustancialmente libre de
30 material celular o de otras proteínas contaminantes de la fuente celular o tisular de la que la glucoproteína HCELL deriva o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. La expresión “sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones de glucoproteína HCELL en las que la proteína está separada de los componentes celulares de las células de las que se aísla o produce de forma recombinante. En una realización, la expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye
35 preparaciones de glucoproteína HCELL que tienen menos de aproximadamente 30 % (en peso seco) de glucoproteína no HCELL (también denominada en el presente documento como una "proteína contaminante"), más preferiblemente menos de aproximadamente 20 % de glucoproteína no HCELL, aún más preferiblemente menos de aproximadamente 10 % de glucoproteína no HCELL, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 5 % de glucoproteína no HCELL. Cuando la glucoproteína HCELL o la o una porción biológicamente activa de la misma se
40 producen de forma recombinante, están, preferentemente, sustancialmente libres de medio de cultivo, es decir el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20 %, más preferiblemente menos de aproximadamente 10 %, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 5 % del volumen de la preparación de proteína.
La expresión "sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas" incluye preparaciones de
45 glucoproteína HCELL en las que la proteína es separada de precursores químicos u otras sustancias químicas que están implicados en la síntesis de la proteína. En una realización, la expresión "sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas" incluye preparaciones de glucoproteína HCELL que tienen menos de aproximadamente 30 % (en peso seco) de precursores químicos o sustancias químicas no HCELL, más preferiblemente menos de aproximadamente 20 % de precursores químicos o sustancias químicas no HCELL, aún
50 más preferiblemente menos de aproximadamente 10 % de precursores químicos o sustancias químicas no HCELL, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 5 % de precursores químicos o sustancias químicas no HCELL.
Las porciones biológicamente activas de una glucoproteína HCELL incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente homólogas a, o derivadas de, la secuencia de aminoácidos de la glucoproteína 55 HCELL, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, que incluye menos aminoácidos de las glucoproteínas HCELL de longitud completa, y exhiben al menos una actividad de una glucoproteína HCELL, por ejemplo reactividad frente al anticuerpo HECA-452, reactividad frente al anticuerpo anti-CD44, unión a E
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Células y tratamientos
% Unión media control a linfocitos2
+ Neur. + DMSO
103,3 ± 12,3
+ Neur. + Tunicamicina (15 µg/ml)
34,3 ± 9,8*
Células HL60 + mocarhagina
50,0 ± 2,0*
+ OSGE
12,5 ± 0,2*
+ PL–1
62,5 ± 1,0**
Controles negativos3
< 0,5 ± 0,3*
11Usando la cámara de flujo de placas paralelas, se perfundieron linfocitos de los conductos torácicos (10 ml / ml H / H con Ca++) sobre monocapas fijados con glutaraldehído de las células tratadas con mocarhagina (10 µg / ml; 1 hora a 37 ºC), OSGE (60 µg / ml; 1 hora a 37 ºC), PL-1 (10 µg / ml; 30 minutos en hielo.) a una tensión de corte definida de 4. 4 dinas / /cm2 . 2Unión media de los linfocitos de 5 campos de visión de muestras por triplicado y un mínimo de 3 experimentos se dividió por la unión media de los linfocitos de las células control no tratadas para cada grupo de tratamiento respectivo. 3Los grupos de control negativo consistieron en EDTA 5 mM que contiene medio de ensayo y linfocitos de rata tratados con el anticuerpo anti-L-selectina (HRL-1; 10 µg / ml). 4La digestión con mocaragina se verificó por la incapacidad de del anticuerpo monoclonal anti-PSGL-1 PSL-275 para reconocer el determinante de la unión a la P- y L-selectina o epítopo sensible a mocaragina sobre PSGL-1 por citometría de flujo. 5La actividad OSGE se confirmó por la incapacidad de anti-CD34 QBEND-10 para reconocer su epítopo sensible en OSGE sobre CD34 mediante citometría de flujo. 'Diferencia estadísticamente significativa en la unión de los linfocitos en comparación con las células control no tratadas; prueba t de Student pareada, p <0,001. ‘'Diferencia estadísticamente significativa en la unión de los linfocitos en comparación con las células control no tratadas; prueba t de Student pareada, p <0,002.
Para investigar adicionalmente actividades de ligando para L-selectina de HCELL y PSGL-1 expresadas en células
hematopoyéticas humanas, se realizaron ensayos de Stamper-Woodruff de la adherencia linfocitaria mediada por L
selectina a monocapas de células hematopoyéticas fijadas con glutaraldehído. Las células KG1a poseían actividad
5 de ligando a HCELL desde >40-120 rpm, la cual fue máxima a 80 rpm, mientras que las células HL60 exhibieron
actividad de ligando a L-selectina predominantemente a 80 rpm (Figura 12C). Además, la adherencia linfocitaria a
células KG1a mediada por L-selectina fue 10 veces más alta que la de las células HL60 a 80 rpm, y no hubo
evidencia de unión de linfocitos a las células K562 y RPMI-8402 (Figura 12 C). Dado que el ligando primario para L
selectina en las células HL-60 es PSGL-1 y su expresión es equivalente en células KG1a y HL60, estos datos 10 sugieren además que, basándose en una célula, la actividad HCELL en KG1a posee una capacidad más alta para
funcionar como ligando sobre un rango más amplio de tensión de corte.
Aunque el nivel de expresión de PSGL-1 es equivalente entre células KG1a y HL60, se examinó si PSGL-1 en las
células KG1a era funcionalmente equivalente a PSGL-1 en las células HL-60. Dado que el determinante de unión N15 terminal crítico de PSGL-1 para selectina-P se solapa con el determinante (s) de unión estructural para L-selectina
(Snapp, K.R., Ding, H., Atkins, K., Warnke, R., Luscinskas, F.W y Kansas, G.S. (1998) Blood 91, 154-164; De Luca,
M., Dunlop, L.C., Andrews, R.K., Flanner y, J.V., Ettling, R., Cumming, D.A., Veldman, G.M. and Berndt, M.C. (1995)
J. Biol. Chem. 270 (45), 26734-26737), se razonó que las capacidades de KG1a y de HL60 para unirse a selectina-P se correlacionan con la eficacia de unión de PSGL-1 a L-selectina. Así, se realizaron experimentos en la cámara de 20 flujo de la actividad de ligando a selectina-P utilizando células de ovario de hámster chino transfectadas con ADNc que codifica selectina-P humana de longitud completa (CHO-P). Tanto las células HL60 como las KG1a sostuvieron un rodamiento equivalente de CHO-P mediado por PSGL-1, las células K562 y RPMI-8402 no poseían ninguna actividad (Figura 13A). La actividad de ligando a selectina-P de las células KG1a y HL60 se eliminó mediante tratamiento con mocarhagin (Figura 13B). Distinto a la diferente a la capacidad de sostener actividad de ligando para 25 L-selectina entre las células KG1a y las HL60, estos datos sugieren que la PSGL-1 nativa como se expresa en la membrana celular era similar estructural y funcionalmente en estas líneas celulares. Debe hacerse notar que PSGL1 de RPMI-8402 no fue funcional como ligando para L-selectina ni para selectina-P, lo que concuerda con el hallazgo de que PSGL-1 en ciertas células linfoides no es funcional debido a la falta de actividad de α1, 3 fucosiltransferasas y del núcleo 2β1, 6 N-acetilglucosaminiltransferasas requeridas para la creación de un ligando
30 bioactivo (Vachino, G., Chang, X. J., Veldman, G.M., Kumar, R., Sako, D., Fouser, L.A., Berndt, M.C. y Cumming,
D.A.
(1995) J. Biol. Chem. 270 (37), 21966-21974).
C.
HCELL es el ligando preferido para L-selectina sobre las CH Humanas
35 La diferencia en la actividad de ligando para L-selectina entre HCELL y PSGL-1 en células enteras puede reflejar diferencias en la densidad de superficie y/o topografía de la expresión de estas moléculas. Para comparar las
31
imagen29
Ligando para Lselectina celular
Número medio de linfocitos unidos2
CD34 (control molecular)
4,0 ± 2,0**
L–selectina (control molecular)
0,5 ± 0,6**
Control de isotipo
8,5± 3,5
HL60 CD44
6,5± 3,6
Control de isotipo
5,4± 2,3
PSGL–1
11,0± 2,1*
Control de isotipo
3,1± 2,9*
LMA (M1) CD44
425,3 ± 9,5
N–glicosidasa–F CD44
23,4± 6,1*
Control de isotipo
34,3± 4,1*
PSGL–1
141,5± 22,6**
Control de isotipo
19,5± 6,2*
1Los linfocitos de conducto torácico de rata (1 x 107/ml) se cubrieron en puntos fijados con glutaraldehído de CD44 purificado por inmunoafinidad (Hermes-1), CD44 tratado con N-glicosidasa F, CD34 (QBEND-10), Lselectina (LAM 1-3) o control de isotipo (IgG de rata o IgG de ratón) (cada uno a 0,75 µg/ / punto), o PSGL-1 (PL-2) (1 µg/ / spot) y se incubaron en un agitador a 80 rpm a 4 ºC. 2El número medio de linfocitos unidos de 5 campos de visión a un aumento de 100X, de portaobjetos por duplicado y un mínimo de tres experimentos. Cada experimento incluyó linfocitos tratados con anticuerpo antiL-selectina (HRL-1; 10 µg / ml) o tratados con PMA y grupos de medio de ensayo que contienen EDTA 5 mM o puntos tratados con neuraminidasa de Vibrio cholerae (ligando), todos los cuales eliminaron por completo la unión de linfocitos (<0,8 número medio de linfocitos unidos). 'Diferencia estadísticamente significativa en la unión de linfocitos al inmunoprecipitado de tratamiento o isotipo en comparación con cada molécula de células sin tratar respectivas; prueba t de Student, p < 0,001. "Diferencia estadísticamente significativa en la unión de linfocitos a estos grupos en comparación con la unión de los linfocitos a CD44 de KG1a y LMA (M1); prueba t de Student, p < 0,001.
Para profundizar en la mayor capacidad de HCELL para unirse a L-selectina en comparación con la de PSGL-1, se examinó la expresión de estructuras fucosiladas y sialiladas (reconocidas por el AcMo de rata HECA-452) en CD44 y en PSGL-1, la cual se correlaciona con la capacidad de unión a L-selectina. El análisis mediante SDS-PAGE e
5 inmunotransferencia con HECA-452 de cantidades equimolares de CD44 y PSGL-1 inmunoprecipitado de proteínas de membrana de KG1a revelaron que CD44 fue distintivamente más reactivo a HECA-452 que PSGL-1 (Figura 16), lo que sugiere que HCELL contiene un número mayor de epítopos HECA-452 que PSGL-1, lo que podría ser la explicación de su mayor actividad hacia L-selectina.
10 Ejemplo 11: Purificación por inmunoafinidad de HCELL y PSGL1
Se inmunoprecipitaron HCELL y PSGL-1 de células hematopoyéticas humanas. El procedimiento de inmunoprecipitación se siguió como está descrito (Dimitroff, C.J., Lee, J.Y., Fuhlbrigge, R.C. y Sackstein, R. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (25), 13841-13846). Brevemente, las proteínas de membrana de células hematopoyéticas 15 humanas (Dimitroff, C.J., Lee, J.Y., Fuhlbrigge, R.C. and Sackstein, R. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (25) 1384113846) se solubilizaron primero en NP-40 al 2 % y preaclararon en Proteína G-agarosa (Life Technologies). Luego la proteína de membrana se cuantificó usando la prueba de proteína de Bradford (Sigma). Las preparaciones de membrana preaclaradas y solubilizadas (incluyendo proteínas de membrana y lisados de células enteras radiomarcadas con [35S]-metionina (Dimitroff, C.J., Lee, J.Y., Fuhlbrigge, R.C. and Sackstein, R. (2000) Proc. Natl. 20 Acad. Sci. 97 (25), 13841-13846) se incubaron con Ac PL-2 anti-PSGL-1 o con Ac monoclonal Hermes-1 anti-CD44 (una relación de 100 µg de proteína: 3 µg de anticuerpo) durante 18 horas a 4 ºC en rotación. También se realizaron inmunoprecipitaciones con anticuerpo QBEND-10, anti-CD34, anticuerpo (LAM1-3) anti-selectina-1 o controles de isotipo IgG de ratón/IgG de rata, para servir como controles negativos. La mezcla de lisado-anticuerpo se añadió a Proteína G-Agarosa y se incubó durante 1 hora bajo rotación constante. Para el SDS-PAGE/transferencia Western, 25 los inmunoprecipitados se lavaron 5 veces con tampón de lisis/NP-40 al 2 %/SDS 1 %/BSA 1 % y 3 veces con tampón de lisis sin BSA, y hervidos en tampón de muestra reductor para su análisis. Para la valoración funcional de CD44 o PSGL-1 en pruebas de adherencia, los inmunoprecipitados respectivos se lavaron 5 veces con tampón de lisis/NP-40 al 2 %/SDS al 1 %/BSA al 1 % y tres veces con tampón de lisis sin NP-40, SDS o BSA, luego
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