PT86128B - Processo para a preparacao de composicoes para o tratamento do cancro utilizando anti-corpos monoclonais contra gangliosido gd3 junto com il-2 - Google Patents

Description

SLOAN-KETTERING INSTITUTE FOR CÂNCER RESEARCH

PROCESSO PARA a PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇffES PARA O TRATAMENTO

DO CANCRO UTILIZANDO ANTI-CORPOS MONOCLONAIS

CONTRA GANGLIOSIDO G^^ COM IL-2” ·

Sumário da invenção

O anticorpo monoclonal, ou a sua porção F(ab’)2, específico para o gangliosido Gp^ estimula a prolifracção de linfócitos em células T humanas.

Este efeito também demonstra a indução de receptores IL-2 e de secreção IL-2 pelos linfócitos, assim como um aumento na percentagem de células de G^yi-. Este efeito de estimulação das células T é aumentado por IL-2 exógeno, PHA e PMA.

Descrição resumida dos desenhos

A Figura 1, representa a coloração R24 de timóci tos, timo fetal, gânglios linfáticos de adultos e linfócitos. A Figura 2 representa a cromatografia em camada fina e o rastreio densitométrico de preparações de gangliosidos.

A Figura 3 representa a inibição da reactividade do mAB R24 pelos gangliosidos purificados.

A Figura 4 representa a proliferação de linfócitos E ⁺ com R24.

A Figura 5 representa o efeito mitogénico de diferentes concentrações de R24.

A Figura 6 representa uma análise, em citómetro de fluxo, de células E ⁺ estimuladas pelo anticorpo anti-CD3 (OKT-3) ou R24.

A Figura 7 representa o efeito do PHA do mBA anti -célula T e PMA sobre a proliferação de células E ⁺ induzida pelo mAB R24.

Memória descritiva

Descrição Pormenorizada dos Desenhos

Figura 1

Coloração imunofluorescente de timo fetal (a-c) e gãnglio linfático adulto (d) com mAB R24. 0 mAB R24 reage com os timócitos nas áreas sub-corticais (a) em torno dos vasos sanguíneos (b) e próximo dos corpúsculos de Hassal (c). 0 mAB colora aglumerados de linfócitos nas áreas paracorticais (d). Amplificação original, 200x.

Figura 2

Cromatografia em camada fina e rastreio densitomêtrico de preparações gangliosídicas. a) Estimularam-se células E ⁺ com mAB R24 (100 /ig/ml) durante 5 dias (jug = micrograma). Efectuou-se uma preparação de gangliosido de melanoma (MEL) a partir de um tumor metastásico de melanoma recente a partir de gânglios linfáticos axilares, b) Rastreio densitométrico da cromatografia de camada fina em a)_________,

Rastreio de uma preparação de gangliosido de células

Rastreio de uma calha normalizada G^. do G^.

A seta designa o pico

Figura 3

Inibição por gangliosidos purificados da reactividade do mAB R24 contra uma preparação de gangliosidos provenientes de células E ⁺ não estimuladas. As barras represen tam um desvio padrão.

Figura 4

Tempo de decurso da proliferação dos linfócitos de E ⁺ na presença (·) ou ausência (o) de mAB R24 (100 jig/ /ml).

~ 3

A proliferação foi medida pela libertação de H-timidina, conforme descrito a seguir. Apresentam-se os resultados como a média e os 100% de uma série de experiências independentes (e o desvio padrão e o acumulado da libertação de ^H-timidina dos meios de controlo estava dentro dos 10% de valores médios).

Figura 5

Efeito mitogénico de diferentes concentrações de mAB R24 (Fig. 5a) ou fragmentos F(ab’)2 de mAB R24 (Fig.

5b). Os resultados apresentam-se como a libertação de H-timidina durante 1 a 5 dias de cultura. Cada ponto representa o meio de culturas triplicadas. Os 100% da série estão compreendidos nos 15% da média. A Figura 5a representa a proliferação de células E ⁺ na ausência de anticorpos (meio de controlo). As concentrações de mAB R24 ou de fragmentos F(ab’)2 de mAB R24 encontram-se representadas na Figura: (200) = 200 jig/ml; (20) = 20 pg/ml; (2) = 2 jig/ml.

Figura 6

Análise por citometria de fluxo de células E ⁺ estimuladas com o anticorpo anti-CD3 (OKT-3) (2,5 mg/ml) ou de mAB R24 (100 jig/ml). Incubaram-se as células E ⁺ no início das culturas (dia 0) ou no dia 5 das culturas, com mAB R24 (10 pg/10 células), seguindo-se a incubação com imunoglobulina de cabra-anti-murganho marcada com FITC (GAMIgFITCi AnaliSaram-se as células com um FACS IV. A: Coloração com mAB R24 + GAMIgFITC de culturas estimuladas anti-CD3 (OKT-3) (18% de células R24⁺) (dia 5) ou coloração com apenas GAMIgFITC (controlo). B: Intensidade de fluorescência de células E ⁺ coradas com mAB R24 + GAMIgFITC no dia 0 (9,9% de células R24⁺) e no dia 5 (44% de células R24⁺) da cultura. A intensidade de fluorescência apresenta-se numa escala logarítmica.

Figura 7

Efeitos de PHA, anticorpos monoclonais anti-cêlula T (anti-CD2, anti-CD3, anti-CD8) e PL1A sobre a prolife** Z + ru raçao de células E induzida pelo mAB R24. A proliferação induzida apenas pelo mAB R24, conforme medida pela libertaçao de H-timidina, apresenta-se a 100% e corresponde a 63426 + 4729 cpm. As concentrações de mAB R24 foram de 100 jig/ml, PHA a 1% (v/v), OKT-3 250 jug/ml, OKT-11 1 /ig/ml e OKT-8 1 jig/ml, PMA 5 ng/ml. Mediu-se a proliferação no 5dia da cultura. Os resultados das experiências que se efectuaram nos dias 3 e 7 da cultura apresentaram o mesmo diagra ma das experiências realizadas no dia 5.

Os gangliosidos são uma classe de glicosfingolíΛ

- 5 pidos que contêm grupos oligossacáridos sialilados ligados a uma estrutura de núcleo lipidico. Apesar de não se conhecer a função exacta dos gangliosidos, tem sido sugerido que desempenham uma função na sinalização e reconhecimento celulares /Hakamori, S (1981) Ann. Rev. Biochem.” 50 : 733; Yu, R.K. e outros (1984) Adv. Exp. Med. Biol.” 174 í 8^7· Tem-se considerado os gangliosidos específicos como receptores de virus /Markwell, M.A.K., e outros (1981) ”Proc. Natl. Acad. Sei. USA” 78 : 5406; Bergelson, L.D. e outros Eur. J, Biochem. 128 : 467 (1982); Suzuki, Y. e outros (1985) J. Biol. Chem. 260 : 13627 e de toxinas /Éishman, P.H., (1982) J. Membr. Biol. 69 : 857. Outras provas sugerem que os gangliosidos podem modificar as funções do receptor de crescimento e alterar a afinidade destes receptores /Bremer, E.G., e outros (1984) J. Biol. Chem. 259 : 6818; Bremer, E.G. e outros (1986) J, Biol. Chem. 261 : 2434; Lacetti, P., e outros (1984) Adv. Exp. Med. Biol 174 : 3557. Tem-se prestado especial atenção à relação entre os gangliosidos e 0 crescimento e diferenciação de células de origem neuro-ectodéimica. Por exemplos os gangliosidos podem induzir a proliferação de células nervosas (los neurônios), aumentar a formação de neurite /Perrari G. e outros (1983) Brain Res. 284 : 215; Tsuji, S. e outros (1983) J. Biochem. (Tokyo) 94 : 303; Nakajuir.a, J. e outros (1986) Biochem. Bioplis. Acta. 876 : 657 e facilitar a adesão das células nervosas /Blackburr, C.C., e outros (1986) J. Biol. Chem. 261 : : 28737.

Provas experimentais sugerem que os gangliosidos e os anticorpos que se dirigem contra os gangliosidos podem

influenciar também as células do sistema imunológico /Marcus, D.M. (1984) ”Mol. Immunol.” 21 : 1083 Whisler, R.L., e outros (1980) J. Immunol.” 125 : 2106; Merrit, W.D. e outros (1984) Cell. Immunol.” 89 : 17. Descobertas recentes demonstraram que a ligação da subunidade B da toxina da cólera ao Gj^i da superfície celular pode induzir a proliferação de timócitos de ratos /Spiegel, S., e outros (1985) Science” 230 : 12857 e que os anticorpos monoclonais dirigidos contra o dissialogangliosido Gp^ pode aumentar a resposta dos linfócitos aos mitogênios /Hersey, P. e outros (1986) Aust. NZ. J. Med. 16 : 1527. Uma vez que estes resultados sugeriram que a ligação a gangliosidos específicos pode modular o crescimento de células linfociticas, calculou-se o efeito nas células linfóides dos anticorpos monoclonais para os gangliosidos Gp£, Gj)-} θ θΜ2* ^^rab^alhos anteriores demonstraram que os anticorpos monoclonais contra estes gangliosidos reagem principalmente com tipos de células derivadas da neuro-ectoderme /Real, E.X., e outros (1985) Câncer Res. 45 : 4401; Saito, M., e outros (1985) Biochem. Biophys. Res. Comm. 127 : 1; Natoli, E., e outros (1986) Câncer Res. 46 : 4116/. No estudo presente, demonstra-se que os anticorpos para o Gp^ também reagem com um subgrupo de timócitos de feto humano e com subpopulação de linfócitos nos gânglios linfáticos e no sangue periférico. A ligação polivalente de anticorpos monoclonais anti-Gp^ e de fragmentos F(ab’)2 para linfócitos T, activa uma subpopulação de células Gp^ positivas, induzindo a produção de IL-2, a expressão de receptores para o IL-2 e a proliferação celular.

f -7-Os exemplos seguintes servem para ilustrar a presente invenção sem a limitar aos exemplos específicos. Os equivalentes estão, também, englobados no âmbito da presente invenção,

Materiais e Métodos

Anticorpos Monoclonais e IL-2

Demonstrou-se que os anticorpos monoclonais de murganho (mAB) R24 (IgG3), (IgG3) θ K9 (I$O reagem com o Gpg /Dippold, W., e outros (1980) Proc. Natl. Acad. SCI. USA 77 : 6114; Rekel, C., e outros (1982) J. Exp. Med. 155 : 11337. 0 mAB 3F8 (IgG3) de murganho (uma revelação do Dr. Nai-Kong Cheung, Case-Western Reserve University, Cleveland, Ohio) reconhece 0 gangliosido G^ /Saito, M., e outros (1985) Biochem. Res. Comm. 127 : 17; 0 mAB 10-11 (IgM) de murganho, reconhece o G^ /Natoli, E., e outros (1986)Câncer Res. 46 : 41167 e 0 mAB P 36/22 (lgG3) de murganho reage com uma glicoproteína de peso molecular elevado da superfície celular, espressa pelas células do carcinoma da mama, mas não pelas células linfóides /Papsidero, L.D., e outros (1984) Câncer. Res. 44 : 46537· θ mAB R24 foi utilizado como sobrenadante de hibridoma ou foi preparado a partir de ascite de murganhos portadores de tumores de hibridoma. Purificaram-se as preparações de mABs R24, 3?θ, C5 e F 36/22 de ascites, por precipitação com uma solução saturada de sulfato de amónio que se adicionou para proporcionar a concentração final /ta» de 35% (p/v). Para purificação adicional fez-se a aplicaçao das preparações do anticorpo IgG3 a uma coluna de proteína A em Sepharose (Pharmacia, Inc., Piscataway, KJ) e eluiu-se /

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com tampão de citrato 0,5M/NaCl 0,15 M, a pH 4,0. As fracçÕes de proteína eluída passaram através de uma coluna de Sephadex G25 K (Pharmacia, Inc.) e eluiu-se com uma solução salina tamponada com fosfato (PBS), a pH 6,0. Os anticorpos monoclonais OKT-3, OKT-4, OKT-6, OKT-8 e OKT-11, conjugados ou não conjugados com FITC, foram adquiridos em ”Ortho Diagnostics Systems” Raritan, RJ). Os anticorpos OKT-3 e OKT-8 e OKT-11 foram intensamente dialisados antes de se utilizarem em ensaios de proliferação.

Os receptores anti-IL-2 dos anticorpos mono cl o -r nais marcados com FITC e Leu-2a, Leu-3a e Leu-4 conjugados com ficoeritrina (PE) foram adquiridos na Becton-Dickinson, Inc. Konntainview, CA”, 0 IL-2 recombinante foi amavelmente cedido por Cetus” (Emeryville, CA).

Produção de Fragmentos F(ab*)2

Os mABs R24 ou 3F8 purificados em citrato de sódio 0,05 M/cloreto de sódio 0,15 K, a pH 4,0, foram digeridos com pepsina a 37°C, durante 5 minutos. Utilizou-se pepsina em uma quantidade que proporcionasse a obtenção da proporção enzima: Anticorpo de 1 : 33, em peso. Interrompeu-se a reacção adicionando um terço do volume de Tris 3&, a pH 8,6. 0 produto da digestão foi eluído sobre uma coluna de proteína A em “Sepharose” (Pharmacia, Inc.), equilibrada previamente com PBS, a pH 7,0. Recolheram-se os fragmentos F(ab’)2 e armazenaram-se a 4°0. A electrofo.rese em gel com dodecil-sulfato de sóiio/poliacrilamida (SDS/PAGE) sob condi ? ões de não redução, revelou uma banda única de 122000 daltons. A coloração por imunofluorescéncia de um painel de linhas de célu/

-9-/ las R-24-positivas e R24-negativas (11 R24⁺ de melanomas e 11 R24” de carcinomas) confiimou que a especificidade das preparações de F(ab’)2 de R24 foi a mesma da globalidade de IgG R24.

Coloração de Tecidos Normais

Obtiveram-se os gânglios linfáticos humanos adul tos histologicamente normais, a partir de espécimes de patologia cirúrgica de pacientes sem cancro, ao fim de 1 - 2 horas após ressecção, Obtiveram-se os espécimes de timo fetal a partir de abortos escolhidos. A idade gestacional do feto foi determinada por medidas do perímetro cefálico, perímetro pélvico e de peso. Mergulharam-se os tecidos em isopentano, previamente arrefecido em azoto líquido, embeberam-se no com posto OTC em criomoldes (Miles labs, Inc. Naperville, IL) e armazenaram-se a 70°C.

As reacções de tecido de corte criostático (4-8 micra de espessura) utilizaram-se não fixas ou fixas com ace tona a 4-8°C, durante 10 minutos. Coaram-se as secções de tecido por imunofluorescência indirecta ou métodos de peroxidase, conforme descrito antes /Oordon-Cardo, C. e outros (1986) Int. J. Câncer 37 : 667/. Resumidamente, fez-se a incubação das secções de tecido em soro supressor de cabra (10% v/v) durante 20 minutos e depois em anticorpo primário durante 1 hora. Utilizou-se o mAB R24 em concentrações compreendidas entre 20 - 40 jig/ml sob a forma de sobrenadante de hibridoma ou de ascite de murganho purificada. Para coloração por imunofluorescência, fez-se a incubação das secções durante 45 minutos com um anticorpo secundário marcado por

fluorescência anti-IgG de murganho (Oappell Labs, Cochranvil le, PA) e examinou-se com um microscópio equipado com epi fluorescência com uma lâmpada de mercúrio de 100 watts. Para coloração com imunoperoxidase, os tecidos foram tratados com 0,01% de Η₂0₂ em PBS durante 10 minutos, fez-se o bloqueio com soro supressor e procedeu-se à incubação com o anticorpo primário, conforme descrito antes. Os anticorpos secundários foram conjugados com peroxidase de rábano bravo (horseadish peroxidase”) (Ortho Diagnostics, Inc. Raritan, NJ). Utilizou -se a diaminobenzidina como um cromogénio. Apôs coloração, as secções foram entrastadas com hematoxilina e procedeu-se à montagem.

Células Mononucleares do Sangue Periférico

Separaram-se as células mononucleares do sangue periférico (PB1IC) de doadores humanos, por centrifugação em gradiente de densidade num Ficollhypaque” /Boynm, A., (1976) Scand. J. Immun.” 5 (Suppl. 5) : 9/. Lavaram-se as células três vezes em meio RPLiI 1640 enriquecido com 2 niC de L-glutamina, 50 U/ml de penicilina, 50 ^ug/ml de estreptomicina e 10% de soro de feto de bovino inactivado pelo calor (PBS).

Conservaram-se as células neste meio durante todos os procedimentos de incubação e lavagem subsequentes.

No sentido de se recolherem as células aderentes, fez-se a incubação de até 3 x 10 PBIÚC durante 90 minutos a 37°C em 5% de CO^ num volume total de 10 ml, em recipientes de cultura de tecidos Falcon 3003 (Falcon Labware Div., Becton - Dickinson, Oxnard, CA). Separaram-se as células não aderentes rodando cuidadosamente os recipientes e pipetando /

/ r lentamente o meio. Lavaram-se os recipientes três vezes com o meio e recolheram-se as células aderentes utilizando uma espátula de borracha. A fracção de células aderentes continha mais do que 90% de monócitos/macrófagos, conforme se verificou por coloração com alfa-naftil-acetato-estearase.

Separação dos Linfócitos T

Para isolar as células T, tingiram-se de cor-de-rosa as PBMC não aderentes, com glóbulos vermelhos de ovelha tratados com neuraminidase, de acordo com um método modificado por V/einer e outros /Weiner, 16.S,, e outros (1973) Blood 42 í 9397· Esta fracção continha menos do que 2% de monócitos/macrófagos e mais do que 90% de células que reagiram com o anticorpo monoclonal OKT-3. Esta população celular designa-se por : células E⁺.

Análise dos Antigénios de Superfície dos Linfócitos

Para ensaios indirectos de imunofluorescência, ~ 6 fez-se a incubaçao de 10 PBMC em 0,1 ml com diluições apropriadas do anticorpo monoclonal não conjugado, durante 30 minutos em gelo, lavaram-se três vezes com PBS/2% de albumina de soro de bovino (BSA) frio e, depois, fez-se a incubação em gelo com 0,1 ml de uma diluição a 1 : 40 de anti-IgG F(ab*)2-FITC do murganho desenvolvida na cabra e purificada por afinidade (Cappel Lab, Cochranville, PA). Para duas análises de cor, lavaram-se mais três vezes as células e incubaram-se com 0,02 ml de anticorpo monoclonal marcado com PE, durante 30 minutos em gelo. Lavaram-se as células três vezes e ajustaram-se para uma concentração de 1 x 10 células/ml

ν para análise por citometria de fluxo. Determinou-se a fluorescência de contraste testando com anticorpos de murganho de controlo (adequadamente marcados) em vez do anticorpo de ensaio. Para fluorescência directa, fez-se a incubação de 10^ células durante 30 minutos com o anticorpo monoclonal directamente conjugado com FITO, lavaram-se três vezes e fez-se uma nova suspensão para análise.

Analisaram-se as células por citometria de fluxo, utilizando um citofluorografo H-50 (Ortho Diagnostic Systems, Inc. Raritan, NJ) ou um FACS IV (Becton-Dickinson). Gerou-se um citograma de fluorescência verde segundo um ângulo recto em função de um ângulo de dispersão desfasado com avanço, no sentido de demarcar a vizinhança da região com interesse (isto é, para diferenciar as células linfocíticas, monociticas e granulociticas) e excluir os detritos celulares e as células moribundas. Quando se utilizou o citofluorografo H-50, instalou-se na vizinhança das células linfocíticas um laser de ioes de a'rgon sintonizado para 488 nm na vizinhança da região demarcada. A partir desta região demaracada geraram-se histogramas de fluorescência verde (FITC). Para fluorescência a duas cores, determinou-se e analizou-se a fluorescência verde (FITC) em função da vermelha (PE). Analizaram-se para cada histograma um mínimo de 10 000 células e determinou-se a percentagem de células positivas por comparação com a marcaçao pelo anticorpo de controlo. Estimaram-se os dados utilizando um sistema computarizado Data General, modelo 2150.

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Ensaios de Proliferação

Faz-se a incubação separada de células PBMC ou E⁺ em micro-recipientes de cultura em triplicado (Costar 3595 placas, Costar Inc. Cambridge, LIA) na presença ou ausên cia de mAB R24. Outros factores avaliados nos ensaios de proliferação englobam o IL-2 recombinante (Cetus Corporation), fito-hemaglutinina (PHA) (Gibco Labs, Grand Island, NY), forbol-miristato-acetato (PMA) (Sigma Chemicals, St. Louis, MO), e proteína A (Pharmacia, Inc.). Em determinados momentos certos, removeram-se 100 pl de sobrenadante de cada recipiente para se ensaiar a actividade IL-2. Em momentos específicos, as culturas triplicadas foram batidas durante 4 horas em H-timidina (0,5 juCi/recipiente, New England Nuclear, ~ 3

Boston, MA) e mediu-se a libertação de H-timidina conforme descrito antes /Welte, K., e outros (1933) ”J. Immunol'’ 131 : 2356/.

Ensaio Para a Actividade IL-2

Para os ensaios de IL-2, utilizou-se uma linha de células citotóxicas T de murganho dependentes do IL-2, conforme descrito antes /Welte, K., e outros (1933) supra/. Neste ensaio uma unidade de actividade é equivalente a uma unidade de actividade do padrão IL-2 do programa Biological Response Modifier”, National Institutes of Health.

Lise Medida por Complemento das Células Positivas R24

- 14 <í ratura ambiente com diferentes concentrações de mAB R24 (100, 10, 1 pg/ml) durante 1 hora, lavaram-se e incubaram-se com uma fonte de complemento (soro humano, previamente rastreado, diluído a 1: 8 em meio tamponado com Veronal) a 37°C durante 2 horas. Lavaram-se três vezes as células e fez-se nova suspensão para utilização em ensaios de proliferação. Trataram-se as células de controlo com PBS, seguindo-se apenas a fonte complementar ou com mAB R24 (100 pg/ml) seguindo-se o meio tamponado com Veronal sem fonte do complemento.

Preparação e Avaliação dos Gangliosidos

Purificou-se o G

D3 ma humano e purificou-se o Gp₂ a partir de tecido de melanoa partir de cérebro humano, conforme descrito a seguir, 0 G^ foi adquirido em Sulpeco, Inc. (Bellafonte, PA). Preparou-se o G^₂ por tratamento do ^GM1 ^{com t}’^e‘^ta-S^alac'^fcosi(i^ase (do Dr. George V/. Jourdian, University of Michigan, Ann Arbor, MI) conforme descrito por

Cahan e outros/(Cahan, D.L., e outros (1982) Proc. Natl.

Acad. Sei. USA” 79 : 7629/. Verificou-se a pureza das prepa· rações gangliosídicas mediante cromatografia de camada fina.

Isolaram-se os glicolípidos por uma modificação do método descrito por Saito e Kahamori /Saito, T. e outros (1971) ”J. Lipid Res.” 12 : 257/. Resumidamente, homogenei zaram-se as células em clorofórmio: metanol (C:K) a 2 : 1 e extrairam-se num volume 100 vezes superior de C:M. Filtrou-se o homogeneto e tornou a extrair-se duas vezes em C:M, primeiro a 1 : 1, depois a 1 : 2. Evaporaram-se os filtrados num evaporador rotativo, acetilaram-se, fez-se o desenvolvimento numa coluna de florisil, desacetilaram-se e fez-se a

diálise em HgO durante 24 horas. Depois, fez-se uma nova evaporação e suspensão da amostra em C : M : HgO (30:60:80) e aplicou-se a uma coluna de Sephadex-DEAE” (Pharmacia, Inc.) equimibrada com C : ií : 0,8 M de acetato de sódio (30:60:8).

Para análise por cromatografia de camada fina, activaram-se placas de gel de sílica (Analtech, Newark, Delaware), aquecendo-as a 100°C durante 1 hora. Utilizou-se N-propanol : hidróxido de amónio : H^O (60:95:11,4) para desenvolver as cromatografias. Após o solvente ter migrado 12 cm a partir da origem, secaram-se as placas ao ar, colocaram-se em estufa durante 10 minutos a 120°C, arrefeceram-se até â temperatura ambiente e aspergiram-se com resorcinol-HC1. Avaliou-se a densitometria utilizando um cromatografo de camada fina Shimadan 05 - 930 (Kyoto, Japan).

Imuno-Ensaio ligado a Enzimas para a Reactividade do mAB com os Gangliosldos

Colocaram-se as preparações gangliosidicas a partir de células E⁺ em placas de microteste (Bellco Glass, Inc. Vineland, NJ). Secaram-se as placas ao ar durante duas horas e fez-se o bloqueio com BSA a 1%, durante 2 horas. Pez-se a incubação de 20 jig/ml de mAB R24 com diversas concentrações de preparações gangliosídicas durante 2 horas, e, depois, adicionaram-se às placas de microteste e fez-se a incubação durante uma hora à temperatura ambiente. Lavaram-se três vezes as placas e fez-se a incubação durante 45 minutos com anti-IgG de murganho conjugada com fosfatase alcalina (Sigma Chemical Corp., St. Louis, Liu) diluída a 1 : 200. Lavaram-se as placas e fez-se a incubação com substracto de dietanolamiΊ

- 16 na durante 20 minutos a 37°C. Avaliou-se a reactividade num leitor Artec Systems Corp., modelo 210 (Farmingdale, NJ).

Radio-imunoprecipitação e Marcação de Western

Testou-se a capacidade do mAB R24 para reagir com antigenos de proteína ou de glicoproteina de células E nao estimuladas ou de células E⁺ estimuladas com mAB R24 (100 jog/ml). Prepararam-se extractos a partir de células E⁺ solubilizadas com detergentes (em NP-40 a 0,05%, 0,01 M de Tris, pH 7,5, 0,15 M de NaCl e 2 mM de MgClg), ou a partir de extractos tratados por ultra-sons de preparações de membrana solubilizadas em SDS a 2% (p/v). Marcaram-se os extractos com 12¾ ρθιο método da cloramina T /Greenwood, F.C., e outros (1963) Biochem. J.” 89 : 1147· Fez-se a incubação durante 1 hora do mAB R24 anti-HLA A, B, C, anticorpo W6/32 /Bamstable, C. J., e outros (1978) Cell” 14 ^; 97, OKT-3 ou anti-soro de controlo (soro de murganho normal) com extractos marcados e anti-IgG de murganho desenvolvida no coelho, a 4°C, seguindo-se a imunoprecipitação com proteína A em Sepharose (Pharmacia, Inc.), conforme descrito antes /Lloid, K.O. e outros (1981) ”J. Immunol.” 126 : 24087. Eluiram-se os imunoprecipitados com SjS a 2% e analisaram-se em geles a 9% em SDS/PAGE.

Efectuou-se a marcarão de 'Western conforme descrito /Towbin, H. e outros (1979) Proc. líatl. Acad. Sei. USA 76 : 43507. Separaram -se os extractos por SDS/PAGE e transferiram-se para nitrocelulose (Schleicher e Schuell, Keene, NH) ou membranas Zeta Probe (BioRad Labs, Richmond,

CA) durante 1,5 - 3 horas a 70 V (230 mA) com arrefecimento. Secaram-se as membranas, incubaram-se com mAB R24, seguindo-se anti-IgG de murganho desenvolvida na cabra, marcada com peroxidase de rábano bravo e desenvolveram-se com diamino-benzidina/HgOg.

Os exemplos seguintes servem para ilustrar a invenção e não se pretende que esta fique limitada â especificidade dos exemplos.

Exemplo I mAB R24 reage com Timócitos e linfócitos

Descobriu-se que o mAB R24 reage com sub-populações de células nos tecidos do timo de três fetos de 12 - 14 semanas de idade. Os timócitos R24⁺ estão localizados nas áreas sub-cordicais e nos aglomerados na vizinhança dos vasos sanguíneos e dos corpúsculos de Hassal (Figura la - c).

Observaram-se resultados idênticos nos tecidos tingidos por técnicas de imunofluorescência e imunoperoxidase. No sentido de confirmar que o mAb R24 reagia com os timócitos, tingiram-se 4 micro-secções consecutivas com mAbs R24 ou OKT-6; demonstrou-se que as células R24⁺ reagem com o marcador de timócitos OKT-6. Nos Gãnglios linfáticos derivados de adultos saudáveis o mAb R24 tingiu pequenos cachos de linfócitos na vizinhança dos vasos sanguíneos, nas áreas interfoliculares e pericorticais (Figura ld).

mAb R.24 reagiu com 13,9 + 5,5% (desvio padrão S.D.) da PBMC de 13 indivíduos saudáveis (intervalo de 7,4 - 24,3% de células positivas R24). A análise por citometria

-^w-L· de fluxo bicolor para o PBLÍC demonstrou que o mAb R24 reagiu com a sub-população de linfócitos T. Nas restantes células T derivadas do sangue periférico de 13 pessoas saudáveis, o mAb R24 reagiu com 14,8 + 5,7% (S.D.) de células CD3⁺ (inter valo de 5,0 - 25,5%) com 20,1 + 11,7% (S.D.) de células CD8⁺ (intervalo de 7,0 - 44,0%) e com 14,0 + 6,7% (S.D.) de células T CD4⁺ (intervalo de 6,0 - 29,7%).

Exemplo II mAb R24 Reage com o Gangliosido

nos Linfócitos T

Para confirmar que o mAb R24 reagiu melhor com o G_D3 do que com outros componentes da superfícies das células T, demonstrou-se que o deteminante antigénico detectado pelo mAb R24 possuía as caracteristicas de um gangliosido. A reactividade do mAb R24 com as células E⁺ destruiu-se tratando previamente as células alvo com neuraminidase e etanol, con sistente com as propriedades de um glicolípido sililado mas, nao foi afectada pela protease e pela tripsina. Demonstrou

-se que o Gp^ era um componente gsngliosídico menor das preparações glicolípidas ácidas de células E⁺ do sangue periférico estimuladas com mAb R24 durante 5 dias (Figura 2a). I’as células E⁺ estimuladas, o Gp^ constitui 3-5% ios gangliosidos totais (Figura 2b), enquanto as células E⁺ não estimuladas contem níveis inferiores de Gp^· 0 mAb R24 reagiu com uma fracção gangliosidica purificada derivada das células T do sangue periférico e esta reactividade foi especificamente inibida por Gp^ purificado, mas não por G_T._O,

OU ^GD2 (Figura 3). Estes resultados demonstraram que o mAb R24 de19 ( tectou o gangliosido G^ nas células T e que o mAb R24 não reagiu com os outros gangliosidos presentes na preparação de células T. Finalmente, o mAb R24 não reagiu com os componentes prpteioos cbs células E⁺ do sangue periférico, por análise de marcação de Western ou por radio-imunoprecipitação dos extractos marcados com Ί pelo método da cloramina T.

Exemplo III mAb R24 Induz a Proliferação de Linfôcitos E⁺

Descobriu-se que o mAb R24 estimula o crescimento de células PBMC e de células E⁺. A cinética da libertação da ^H-timidina pelas células cultivadas na presença de 100 jig/ml de mAb R24 encontra-se representada na Figura 4· A proliferação máxima observou-se decorridos 5 a 7 dias de estimulação. A Figura 5a representa o efeito de diversas con centrações de mAb R24 sobre a proliferação de células E⁺ entre 2 e 5 dias de cultura. Observou-se a resposta de prolife ração dependente da dose em todos os pontos testados. Uma

I concentração de 20 pg/ml proporcionou um acréscimo significa ~ 3 tivo na libertação de H-timidina sobre o meio de cultura (em cultura apenas no meio) em todos os dias testados. Para concentrações tão baixas como 2 jig/ml, o mAb R24 ainda produziu um acréscimo detectável na proliferação.

Para determinar que a estimulação das células T era devida especificamente ao anticorpo que reage com G·^, ensaiou-se um segundo anticorpo IgG3 (mAb C5) e dirigiu-se um anticorpo IgM (mAb K9) contra o Gpy Ambos os anticorpos anti-Gp^ induziram a proliferação de células T (Tabela 1) [ (A proliferação induzida pelo mAb G5 foi idêntica aos resultados com o mAb R24) · Os anticorpos monoclonais que reconhecem outros gangliosidos, incluindo um IgG3 contra o G·^ ^{e 11111} IgM contra ο G^, ^{nao es}fi^mul^{aram as} células T. De modo idên tico, um IgG3 de controlo (mAb F36/22) que não reconhece gan gliosidos nem reage com células T, não estimulou as PBMC ou as células E⁺. Excluiu-se a possibilidade de os anticorpos ou substâncias de contaminação (por exemplo, proteína A) serem responsáveis pela estimulação de células T. 0 mAb R24 _| preparado por diversos métodos induziu níveis idênticos de proliferação de células E em concentrações proteicas equivalentes. A estimulação foi produzida por sobrenadantes a partir do hibridoma R24, de ascites não purificadas de murganhos portadores de hibridoma R24 e de ascites purificadas por precipitação com sulfato de amónio com ou sem cromatogra fia por afinidade de proteína A (Tabela 1). A própria proteí na A induziu apenas uma proliferação mínima de células E⁺ (2379 + 145 cpm, libertação de ^H-timidina ao 5² dia com 5 jag/ml de proteína A).

I

Exemplo IV

Os Fragmentos F(ab*)2 de R24 estimulam as Células T

Para excluir a possibilidade do mAb R24 estimular as células T através da porção Fc da molécula, isolaram-se fragmentos F(ab’)2 de mAB R24 per digestão com pepsina. A Figura 5b demonstra a libertação de ^H-timidina das PBL1C durante a estimulação para diferentes concentrações (2, 20 e 200 ug/ml) de fragmentos F(ab’)2 de mAb R24. A incubação f

Λ de células com fragmentos F(ab*)2 de um anticorpo monoclonal IgG3 de controlo, mAb 3P8 (anti-G^), não produziu acréscimo na proliferação. 0 nível de proliferação durante a estimulação com fragmentos F(ab’)2 foi de metade do nível da prolif£ ração induzida pela mesma concentração de moléculas de anticorpo R24 intactas Zpor exemplo, 30 000 cpm para 200 jig/ml de mAb R24 total contra 18 000 çpm com 200 Jig/ml de F(ab’)27.

Exemplo V mAb R24 Induz a Produção de IL-2 e a Expressão do Receptor para IL-2

Detectou-se a produção de IL-2 durante a estimulação de células E⁺ pelo mAb R24, numa cultura de sobrenadar tes entre o l² e o 5- dias (Tabela 2). Pelo 7² dia não havia IL-2 mensurável nos sobrenadantes da cultura. 0 tempo decorrido para a produção de IL-2 foi diferente do da indução por outros mitógenos em que se produz IL-2 durante os primeiros dias de estimulação /Welte, K., e outros (1983) J. Immunol. 131 í 23567. A Tabela 2 pormenoriza a percentagem de células E⁺ positivas receptoras de IL-2 até ao 7² dia em cultura. Detectou-se a expressão do receptor IL-2 por ensaios com anticorpo monoclonal, mas não se distinguiram os receptores de elevada afiniiade e de baixa afinidade. Os resultados de três experiências independentes efectuadas com células E⁺ de três doadores saudáveis diferentes, demonstraram que a percentagem de células positivas receptoras de IL-2 subiu desde menos do que 3% inicialmente até aproximadamente 50% pelo 7² dia.

Exemplo VI

A Estimulação pelo mAb R24 Aumenta a Proporção de Células R24

A estimulação de células E⁺ e de PBMC com o mAb R24 produziu um acréscimo na percentagem de células R24⁺. Análises sequenciais de células E⁺ estimuladas por citometria de fluxo demonstraram que a proporção de células R24⁺ subiu significativamente entre o 5² e o 7- dias (Tabela 1 e Figura 6). Na figura 6 apresenta-se a intensidade de coloração imunofluorescente de células estimuladas pelo mAb R24. A intensidade de coloração foi heterogénea; contudo, a coloração mais brilhante após estimulação observou-se, em grande extensão, nas células semelhantes a blastos quando se analisaram por 0 + e se dispersou a 90° por citometria de fluxo, sugerindo que foi a população de linfócitos R24 positiva que estava a proliferar e a expandir-se durante a estimulação. A análise das PBMC originou percentagens idênticas de células positivas R24 : 26% no 22 dia, 33% no 32 dia, 36% no 5dia e 39% no 7⁹ dia. Quando se utilizou como estimulador 0 anticorpo anti-CD3 (OKT-3), a percentagem de células R24⁺ não aumentou durante os 5 dias de cultura (Figura 6).

Exemplo VII

A Mitogenicidade Inluzida pelo mAb R24 Depende da Presença de Células R24⁺

A deplecção de células R24⁺ a partir de células

E por lise com 0 mAb R24 e complemento humano originou uma redução na proliferação induzida pelo mAb R24 (Tabela 3). 0

W

Γ - . . :' · Ί /

( . ' - 23 grau de diminuição na proliferação estava relacionado com a concentração de mAb R24 utilizada para a lise intermédia com plementar e com a proporção das restantes células R24⁺ da cultura. Quendo a lise das células R24⁺ estava virtualmente completa, houve uma anulação completa da estimulação de cêlu las E⁺ pelo mAb R24.

Exemplo VIII

A Proliferação Induzida pelo mAb R24 Ocorre em Culturas com Deplecção de Macrôfagos mAb R24 induziu estimulação equivalente nas culturas de PBMC contendo 10 - 20% de macrôfagos e culturas de células E⁺ com deplecção de macrôfagos (confirmado por análise de citometria de fluxo) conforme medido pela expressão dos receptores IL-2 e pelo nível de proliferação celular (Tabela 4). 0 PHA e o anti-mAb CD3, dois mitogênios que exigem células acessórias, não estimularam estas culturas E⁺ com deplecção de macrôfagos. Quando se adicionaram novamente macrôfagos às células E⁺ (até 5% e 10% do número final de cê lulas), não houve alteração na indução da proliferação pelo mAb R24 (Tabela 4).

Exemplo IX

Efeitos de Outras Células T Mitogênicas ou Co-estimuladas na Estimulação Induzida nas Células T pelo mAb R24

Avaliou-se a influência potencial de outras células T, que se demonstrou serem mitogénicas, na proliferação de células T induzida pelo R24. A Pigura 7 apresenta os re24 . /

J / í sultados de experiências representativas (ao 5^S dia de cultura). 0 PHA em concentrações de 1% (v/v) aumentou aproximadamente 1,5 vezes a proliferação de células E⁺ induzida pelo R24, embora o PHA a 1% apenas seja minimamente mitogénico (menos do que 10% do nível de proliferação atingido com PHA a 1% na presença de macrófagos). A estimulação com anti-CD3 (OKT-3) também está dependente da presença de macrófagos. 0 anti-CD3 em concentrações de 2,5 ng/ml, 25 ng/ml e 250 ng/ml não aumentou nem inibiu a estimulação de células E⁺ com deI plecção de macrófagos, induzida pelo R24 (Figura 7).

anti-CD2 (OKT-11) não induziu a estimulação de células E⁺ quando utilizado sozinho, mas o anti-CD2 inibiu a proliferação induzida pelo mAb R24 (60% de inibição a 1 pg/ml e 33% de inibição a 100 ng/ml) (Figura 7). 0 anti-CD8 (OKT-8), que pertence à mesma sub-classe do anti-CD2 e do anti-CD3 e é conhecido por inibir a produção de IL-2 e a proliferação induzida pelo anti-CD3 /Welte, K., e outros (1933) supra7 não inibiu nem aumentou a estimulação pelo mAb R24. 0 éster de forbol, PMA, um potente activador da proteoquinase C /Ííishizuka, Y (1986) Science 233 : 3057 e um co-estimulador para a proliferação induzida pelo anti-CD3 nas células T, com deplecção de monócitos /Hara, T., e outros (1985) ”J. Exp. Med.” 161 : 6417 aumentou em mais do dobro a proliferação induzida pelo R24 (Figura 7). A proliferação induzida pelo mAb R24, conforme medida por libertação de H-timidina, foi o resultado da produção de IL-2 e da expressão do receptor IL-2 (Tabela 1). Para se testar se o IL-2 exógeno podia aumentar a proliferação induzida pelo mAb R24, adicionou-se IL-2 recombinente (100 U/ml) a culturas estimuladas pelo

- 25 mAb R24. Conforme se apresenta na Tabela 5 o IL-2 exógeno aumentou substancialmente a proliferação de células E , quando comparado com a estimulação feita apenas pelo mAb R24.

Exemplo X

Demonstra-se na Tabela 6 seguinte nue a proteína

A (material recombinante de Pharmacia Corp., Piscataway, N.J.) também aumenta a proliferação de células T e pode servir com um agente estimulador, conforme indicado.

Tabela 6

Efeito da Proteína A na Proliferação de Linfócitos

Proliferação (libertação de H-timidina no 3- dia de cultura)

Meio	65	cpm
R 24 (100 jug/ml)	17443	cpm
Proteína A (5 pg/ml)	2426	cpm
Proteína A (0,5 jug/ml)	1558	cpm

Em referências anteriores demonstrou-se que o dissialogangliosido está expresso nos tipos de células derivadas da neuro-ectoderme, incluindo melanócitos, células de medula adrenal, glia, neurómios e nas células dos ilhéus do pâncreas Z^eal, F.X., e outros (1935) Câncer Res. 45 : 44017. Com a descoberta de que o G^ se exprime por uma sub-população de timócitos e linfócitos do sangue periférico, /

o Gpg junta-se a uma classe de antigénios partilhados pelas células da neuro-ectoderme e pelas células do sistema imunitário. Uma vez que ambas as linhagens são abundantes em célu las cuja junção primária é a comunicação célula a célula, é possível que o possa desempenhar um papel crucial na sinalização celular nestas vias de diferenciação. No estudo actual, demonstra-se que a ligação ao G^ induz a activação das células T, incluindo a expressão dos receptores IL-2, a produção de IL-2 e a proliferação celular. Podem estimular-se as células T por IgM, IgG e fragmentos F(ab*)2 que reagem com o Gpy Estes resultados são consistentes com a inter pretação de que a união e as ligações cruzadas do G^^ sobre a superficie das células I conduzem a um sinal para activação.

Como o soro contém Gp^, é possível que o G^^ da superfície dos linfócitos seja o resultado de adsorção passiva.

Contudo, diversas linhas de evidência sugerem que o G^g é sintetizado activamente pelas células T. Em primeiro lugar, o Gpg é expresso selectivamente em níveis elevados por apenas uma pequena sub-população de células T em vez de o ser por uma ampla população de células. Sm segundo

o número de células T que exprimem o ^GD3 aumenta substanciulmente em cultura de tecidos rr presença de anticorpos antí-Gpy Em terceiro lugar, o G·^ pode detectar-se nas células T de linhas celulares leucêmicas assim como em células linfóciticas leucémicas recentes. Demonstrou-se, a este respeito, que o nível de expressão de Gp^ pelas linhas celulares CEL de células T leucémicas, aumenta durante a es· timulação com o éster de forbol, PMA /Kignebi, K. e outros (1986) Câncer Res. 46 : 30277.

Demonstrou-se que os gangliosidos interferem nos sinais e receptores que influenciam 0 crescimento e diferenciação celulares. Descobriu-se que adicionando exogensmente gangliosidos às células em crescimento se altera a afinidade de ligação dos factores de crescimento para os seus receptores e se afecta o estado de fosforilação da tirosina dos receptores dos factores de crescimento /Bremer, E.G. e outros (1984) J· Biol. Chem. 259 : 6818; Bremer, E.G. e outros (1986) J. Biol. Chem. 261 : 2434/. Diversas moléculas glicoproteicas da superfície das células T, podem ser intermediárias na activação das células T, incluindo 0 receptor IL-2, 0 complexo molecular Ti/CD3 e 0 antigênio CD2 /Weiss, K.J. e outros (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 : 6836/. A activação por estes receptores exige, geralmente, células auxiliares receptoras positivas Pc, tais como macrófagos e componentes solúveis (por exemplo, IL-1) ou PMA /Hara, T. e outros (1985) J. Exp. Med. 161 : 6417. Uma excepção ê o receptor CD2 que se expressou permaturamente nas células T em diferenciação no timo /Mener, S.C. e outros (1984) Cell 36 : 8977· A activação por ligação a Gpp tal como a activação mediada por CD2, não parece depender d? células auxiliares. Apesar da diversidade de receptores da superfície celular disponíveis para activação supõe-se que existem apenas vias limitadas disponíveis por transdução de sinais no interior das células /Nishizuka, Y. (1986) Science 233 : 305; Imboden, J.B, e outros (1985) J. Exp. Med.” 161 : 446/. Não é evidente que a ligação do G^ pelo mAB inicie a acti vação ao nível dos conhecidos ligantes receptores superficiais ou através de um complexo receptor separado ainda não identificado. Diversas referências sugeriram que os gangliosiios extracelulares podiam ligar o IL-2, inibindo assim a proliferação de linfócitos induzida por um mitogénio /Robb, R.J. (1986) ”J. Immunol” 136 : 971; Parker J., e outros (1984) PEBS letters” 170 : 3917· Neste caso, os gangliosidos podem competir contra a reactividade IL-2, por remoção ou inactivação de IL-2. Para além da sua possível reactividade com a molécula IL-2 solúvel, Robb e outros /Robb, R.J. (1986) ”J. Immunol.” 136 í 9717 demonstraram que os gangliosidos são susceptíveis de diminuir a expressão do receptor IL-2 (antigênio Tac) nos blastos induzidos por PHA. Estes resultados sugerem que os gangliosidos celulares podem estar envolvidos na supressão da expressão do receptor IL-2 das restantes células T. Neste modelo, a ligação de IL-2 ou de anticorpos a gangliosidos críticos nas células T, poderão permitir a expressão total dos receptores IL-2. Isto também poderá ser compatível com a observação de que o IL-2 seja susceptível de regular muito bem o seu próprio receptor /Reem, G.H. e outros (1984) Science 225 : 429; Welte, K. e outros (1984) ”J. Exp. Med. 160 : 139Q7 e que um efeito proeminente do mAb R24 nas células seja a indução da expressão dos receptores IL-2. Isto também é suportado pelo acréscimo substancial na proliferação de células E⁺ estimuladas pelo mAb R24 na presença de IL-2 exógeno (Tabela 5). A estimulação das células T pelos anticorpos anti-G^^ pode ser aumentada por IL-2 exógeno, PHA e PLiA, mas não pelo mAb anti-CD3. A inibição da

- 29 activaçao mediada pelo Gpg pelos anticorpos monoclonais para

CD2 sugere que o

pode estar associado com a molécula CD3, mas existem outras explicações possíveis para esta descoberta, por exemplo, desregulação da activaçao mediada por CD3 por ligação a CD2 /Mener, S.C. e outros (1983) Science 222 : 1232/. Pensa-se que as células T de Gp^⁺ sejam essenciais para a activação inicial pelo mAb R24 uma vez que a de plecção desta população anula a resposta proliferativa. Embora seja possível que a estimulação possa conduzir ao recrutamento de células Gpg“ numa população Gp^⁺ , ê mais verosímil que a activaçao pelo anti-Gp^ conduza à expansão do agregado G-pg das células T : 1) as células T Gp^ são necessárias para estimulação; 2) a expansão do agregado G^ ê constituída essencialmente por células semelhantes a blasto, em proliferação; 3) a estimulação por outros mitogénios tais como o PHA ou o anti-CD3 não conduz a um acréscimo maior na proporção de células ^GD3 (Figura 6). Experiências com linhas de células T G^ e clonadas ajudarao a clarificar este ponto e permitirão uma análise funcional das células T Gp^ . As experiências demonstram que o mAb R24 reage com os linfócitos T3 e que a população em proliferação em culturas esti muladas por R24 englobam uma mistura de linfócitos T4 e T8.

mAb R24 pode aniquilar as células alvo por ci toxicidade me liada pelo complemento e ,ci toxicidade celular dependente do anticorpo. Com base na reactividade restrita e nos efeitos citotóxicos do mAb R24 in vitro, iniciou-se uma experiência clínica preliminar para avaliar o mAb R24 no tratamento de pacientes com melanomas metastásicos /Houghton, /

Α.Ν. e outros (1985) ”Proc. Natl. Acad. Sei. USA” 82 : 1242?. A infusão intravenosa de mAb R24 induziu sinais clínicos e sintomas de inflamação na vizinhança dos tumores e regressão ou desaparecimento das lesões em alguns pacientes. Foi evidente que o tratamento com o mAb R24 produziu deposição e infiltração complementar de células T (CD3⁺/CD8⁺/Ia⁺) nos tumores. Apesar de diversas propriedades biológicas do mAb R24 poderem contribuir para a sua actividade anti-tumor, a função potencial de activação das células T é particularmente intrigante. Este ponto de vista é suportado pela descoberta de que as células T se infiltram em tumores em regressão após tratamento com R24, mas não em biopsias de tumor antes do tratamento. Além disso, os clones de células citotóxicas T foram confirmados a partir de um paciente tratado com R24. Estes clones de células T aniquilam especificamente as células de melanoma do mesmo indivíduo e não tecidos normais ou melanomas alógenos. A possível activação de células T nos pacientes tratados ê um assunto complexo, uma vez que o mAb R24 pode também proporcionar a lise das células T alvo na presença de complemento humano e abolir, assim, a estimulação de células T (Tabela 3). A capacidade do mAb R24 para efectuar a lise das células hospedeiras, pode explicar parcialmente a observação de que as regressões de tumor apenas foram genericamente verificadas após o tratamento com doses reduzidas, mas não com doses elevadas de mAb R24 /fíoughton, Α.Γ., e outros (1985) ”Proc. Natl. Sei. USA” 82 : 12427. Será possível investigar esta questão, uma vez que os fragmentos F(ab’)2 de mAb R24 podem estimular as células T mas não medeiam a lise /

do complemento (P. Chapman, observação não publicada). Inves tigar-se-ão os fragmentos F(ab’)2 numa experiência clínica com o objectivo de avaliar a sua função potencial no tratamento do cancro.

Há uma teoria que admite que uma ponte” mAb tal com um braço do mAb R24 se liga às células T e as activa enquanto um braço diferente de mAb se liga ao tumor efectuando a aniquilação.

A proteína A recombinante é outro agente de esti mulação. Para o tratamento do cancro apenas, pode injectar-se Proteína A por via intravenosa ou pode remover-se o sangue de um corpo e passá-lo por proteína A e, depois, efectuar a re-infusão (ex vivo). Em qualquer dos casos de modelos animais observou-se regressão dos tumores.

Será mais aconselhável o uso de PHA ou PILA em tratamento ex vivo conjuntamente com IL-2 e/ou R24.

Também se observou a possibilidade de utilizar fragmentos F(ab )2 interligados com fragmentos Fc de imunoglobulina humana num anticorpo quimérico o qual pode influên ciar a tolerância melhorada para o mAb R24, em pacientes. Deste modo, é possível estimular cada uma das células T directamente in vivo, as quais são depois orientadas para o tumor, ou para estimular as células I de um paciente, no exterior do corpo, conforme demonstrado antes, e, depois, injectar estas células estimuladas para efectuar a citoxicidade do tumor em conjunto com o IL-2, Proteína A, R24, etc., adicionados.

intervalo de tratamento com IL-2 varia aproximadamente entre uma dose reduzida inferior a 1 milhão de uni

dades até uma dose elevada superior a 3 milhões de unidades de IL-2. Considera-se um intervalo médio quando varia aproxi madamente entre 1-3 milhões de unidades de IL-2.

Tabela 1

Análise da Estimulação de Células T por Anticorpos Monoclonais Contra Gangliosidos

Incorporação de

H-timidina

KAb

Concentração (CPK + SD)

R241 R241	100 pg/ml 30 pg/ml	28497 + 5390 +	6501 536
R24 sobrenadante
de hibridoma	30 }ig/ml	4899 +	951
K9 (IgM, anti-GD3)	100 pg/ml	10777 +	3982
10-11(IgM, anti-G^)	100 pg/ml	565 +	186
3F8(IgG3, anti-GD2)	100 jug/ml	610 +	79
F36/22(lgG3 controlo)	100 jug/ml	1137 +	55
Meio	-	733 +	415

Purificado a partir de ascite dias em cultura

- 34 Tabela 2

Produção àe IL-2, Receptor de IL-2 e Expressão de (L· pelas

Células E estimuladas com KAb R24

Dia	Produção	Células Positivas	Células
de	de IL-2	Receptoras de IL-2	R24+
Estimulação	(U/ml+SD)1	(% Positiva + SD)1	(% Positiva)
0	0	3	2 9,9^
1	1,4+3., 2	6,6+2,0	15,9
2	1,3	12,8+8,0	21,6
3	0,9+0,3	22,3+11	25,9
5	0,7+0,5	38,9+7,5	44,02
7	0	49,7+4,5	43,0

- Resultados de 3 experiências independentes (com excepção de uma única medição de produção de IL-2 no 2⁵ dia) utilizando o mAb R24 (100 jig/ml) para estimulação.

- Também apresentado na Figura 6

Tabela 3

Proliferação ias Células E⁺ iniuziia pelo B.24 após Deplecção

Intermédia Complementar de Células R24⁺^

Células E+ Tratadas com	Células	E+ Após	Tratamento
	%R24+ Libertação	3 de H-timidina
			(CPM)
		32 dia	52 dia
R24(100 jug/ml) + Complemento	<1	55	36
R24(1O pg/ml) + Complemento	3	320	1729
R24(l Jig/ml) + Complemento	7	977	4138
Apenas Complemento	15	4942	31330
Apenas R24(100 jug/ml)	15	4656	25069
1 As células E+ foram trata mento (ver Materiais and	das com ou Methods),	sem mAb R24/comple- ensaiadas para uma

percentagem de células R24⁺ e depois estimulaías com mAb R24C1OO pg/ml).

Tabela 4

Efeito à.a Deplecção âe Nacrófagos na Proliferação le Células

E⁺ induzida pelo R24

- 36 /

	Incorporação
Pracção Celular	3 de H-timidina
	(CPM)
Exp.l
E+	7235 + 775
E+ + 5% Macrófagos	5341 + 729
E+ + 10% Macrófagos	7486 + 1301

Exp. 2

E⁺

PBMG

15076 + 631

12240 + 710

1-3 dias de cultura estimulada com mAb R24 (100 pg/ml). Apresentam-se os resultados como média e desvio padrão de culturas triplicadas.

Tabela 5

Efeito do IL-2	m » 4* Exógeno na Proliferação de Células E Iuduzila
pelo mAb R24
Dia de		R24	Aumento
Estimulação	R24 Sozinho	2 + IL-2r	Vezes
3	17672 + 325	27710 + 2356	1,6
5	25069 + 1041	104402 + 2038	4,2
7	16667 + 2442	98007 + 10373	5,9
9	4461 + 930	45573 + 2443	10,2

- MAb R24 100 pg/ml

- MAb R24 100 pg/ml mais IL-2 100 U/ml. A libertação máxima de -Ή-timidina na presença de IL-2 apenas foi de

2536 + 11705 CPN no 7- dia de cultura.

Os resultados apresentara-se como média e desvio padrão de culturas triplicadas.

Claims (3)

.· REIVINDICAÇÕES

1) timocitos fetais em regiões subcorticais e vasos próximos

1. - Processo para a preparação de composições para o tratamento do cancro em seres humanos, e susceptíveis de induzir a activação de células T, caracterizado por se incorporar um anticorpo monoclonal que reage imunologicamente com gangliosido G^ junto com IL-2 em quantidades fisiologicamente activas.

2) linfócitos de nódulos de linfa em áreas interfoliculares e vasos próximos e 3) um pequeno subconjunto de células T no sangue periférico. Verificou-se que anticorpos monoclonais de murganho

Z dois IgGs, um IgM e fragmentos de F(ab')gJ7 que reagem com G_d3 estimulam a proliferação de células T derivadas de sangue periférico. Pode aumentar-se, a proliferação induzida por ligação a G_d3 de proteína A, PHA, PMA ou IL-2 exógeno.

Lisboa, 13 de Novembro de 1987

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Figura 2b

FigurA 3

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2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo monoclonal incluir o anticorpo IgG ou IgM.

3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se incorporar o fragmento F(ab’)₂ óo referido anticorpo monoclonal.

4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se incorporar um anticorpo monoclonal escolhido no grupo que consiste em R24 K9 e C5.

5. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se incorporar a porção Fíab’^ do referido anticorpo monoclonal.

6. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a activação de células T ser caracterizada pela expressão de receptores de IL-2, produção de IL-2, proliferação de células e aumento nas células T de

7Processo para a preparação de composições para o tratamento do cancro em seres humanos, em que as referidas composições são susceptíveis de activar células T, caracterizado por se incorporar um inticorpo monoclonal que reage imunologicamente com gangliosido G_d3 junto com proteína A, em quantidades fisiologicamente activas.

8.- Processo para a preparação de composições para o tratamento do cancro em seres humanos, em que as referidas composições são susceptíveis de activar células T, caracterizado por se incorporar um anticorpo monoclonal que reage imunologicamente com gangliosido G_d3 junto com PMA ou PHA ex vivo em quantidades fisiolo-40- /

gicamente activas,

Lisboa, 13 de Novembro de 1987

-41RESUMO

Processo para a preparação de composições para o tratamento do cancro utilizando anti-corpos monoclonais contra gangliosido junto com IL-2

Presume-se que os gangliosidos de superfície das células intervêm no crescimento e diferenciação das células. Assim, a presente invenção, que utiliza anticorpos monoclonais dirigidos contra G_d3, um disialogangliosido expresso predominantemente por células de origem neuro-ectodermal, verifica que G_d3 ê expresso por uma subpopulação de células do sistema imunológico que inclui:

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FigurA 7

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