ES2338757T3 - Polipeptidos ligandos para selectina-e/selectina-l de la celula hematopoyetica y metodos de utilizacion de los mismos. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido glucosilado sustancialmente purificado, dicho polipéptido glucosilado comprende un eje polipéptido CD44 en el que dicho polipéptido glucosilado comprende glicanos fucosilados y modificados con ácido siálico y se une a selectina-E y selectina-L.

Description

Polipéptidos ligandos para selectina-E/selectina-L de la célula hematopoyética y métodos de utilización de los mismos.

Declaración como investigación subvencionada federalmente

Este invento se realizó con la ayuda del gobierno de los Estados Unidos con las becas NHLBIRO1 y CA84156 de los "National Institutes of Health". El gobierno tiene ciertos derechos en el invento.

Campo del invento

El invento proporciona un polipéptido glucosilado purificado sustancialmente, dicho polipéptido glucosilado incluye un polipéptido central CD44 e incluye glucanos que contienen Fucosa y Ácido Siálico, y se une a selectina-E y selectina-L.

Fundamento del invento

La citoarquitectura especializada del microambiente hematopoyético está creada por interacciones discretas de adherencia célula-célula y célula-matriz extracelular, que están estrechamente reguladas por la expresión de moléculas de adhesión específicas de línea. Las células progenitoras hematopoyéticas (CPHs) más inmaduras se caracterizan por la ausencia de marcadores específicos de línea y la expresión de la molécula de superficie CD34. Varias moléculas de adhesión se expresan en las CPHs, incluyendo CD44 (el "receptor del ácido hialurónico", también conocido como H-CAM), miembros de la superfamilia de las integrinas (v.g. LFA-1, VLA-4) y de las inmunoglobulinas (por ejemplo ICAM1), y un miembro de la familia de las selectinas, la selectina-L. La selectina-L (CD62L) es una proteína de unión a carbohidratos dependiente del calcio, miembro de una familia de moléculas de adhesión que también incluye la selectina-E (CD62E), expresada en el endotelio vascular activado, y la selectina-P (CD62P), que se encuentra tanto en las plaquetas activadas como en las células endoteliales. Las interacciones mediadas por las selectinas son críticas, no sólo para el reclutamiento rápido y eficaz de los leucocitos a los lugares de lesión, sino para la migración tejido-específica como se ilustra en: (1) "homing" de los linfocitos a los ganglios linfáticos periféricos, (2) tropismo cutáneo de las células T y (3) la entrada de la célula progenitora hematopoyética (CPH) en la médula ósea.

Resumen del invento

El invento caracteriza un nuevo polipéptido glucosilado expresado en células progenitoras hematopoyéticas humanas normales y en blastos leucémicos llamado ligando para selectina-E/selectina-L de la célula hematopoyética - "hematopietic cell E-selectin/L-selectin ligand (HCELL)". Los polipéptidos de HCELL se refieren aquí también como "CD44 KG1a". HCELL es una nueva forma glucosilada de CD44 que contiene N-glucanos fucosilados y modificados con ácido siálico que reaccionan con HECA-452. El polipéptido HCELL es un ligando tanto para selectina-L como para selectina-E.

También se describe aquí un método para identificar células madre haciendo que la población celular a estudio contacte con uno o más agentes que se unen específicamente a HCELL bajo unas condiciones suficientes para formar un complejo entre el agente y la célula madre. El complejo se detecta, y si está presente indica que la célula es una célula madre. Los agentes apropiados incluyen un anticuerpo anti-CD44 o un anticuerpo con una especificidad de unión como la del anticuerpo monoclonal HECA-452.

La célula madre también se puede identificar colocando un polipéptido selectina, por ejemplo, selectina-E o selectina-L inmobilizadas en una fase sólida y haciendo contactar esta fase sólida con una muestra de fluido que contenga en suspensión las células a analizar. La célula madre se identifica mediante la observación de las células que se adhieren a la fase sólida. La célula a identificar puede ser, por ejemplo, de sangre o de médula ósea.

También se describen aquí diversos métodos para aislar una célula madre (por ejemplo, una célula madre pluripotente) de una población de células. Una célula madre se aísla haciendo contactar una población de células con uno o más agentes que se unen específicamente al polipéptido HCELL bajo las condiciones suficientes para formar un complejo entre esos agentes y la célula madre. La formación del complejo se detecta y se extrae de la población de células, aislando de esta forma la célula madre de la población celular. Adicionalmente, el complejo célula madre/agente queda desunido.

Alternativamente, una célula madre es aislada mediante un polipéptido selectina, por ejemplo, selectina-E o selectina-L inmovilizada en una fase sólida y haciendo contactar esta fase sólida con una muestra fluida que contiene células en suspensión. La fase sólida entra en contacto con la muestra de fluido de manera que se alcance una presión de cizalla
en la superficie de la fase sólida. Las células madre son aisladas recuperando las que están adheridas a la fase sólida.

También se describen métodos para tratar enfermedades del sistema hematopoyético, cáncer y otras enfermedades tributarias de ser tratadas con células madre (por ejemplo, terapia con células madre) en mamíferos, lo que incluye administrar al mamífero un compuesto que contenga las células aisladas de acuerdo con los métodos descritos arriba.

Además se describe un método para aumentar la afinidad de una célula por la selectina-E y/o selectina-L, por medio de hacer contactar la célula con uno o más agentes que aumenten la expresión o actividad del polipéptido HCELL en la superficie celular, y así aumentar la afinidad de la célula por la selectina-E y/o selectina-L. Los agentes apropiados incluyen por ejemplo, un ácido nucleico que codifique CD44, una glucosiltransferasa o un polipéptido glucosidasa.

También se describen métodos para aumentar el potencial de implante de una célula madre, tomando una célula madre y poniéndola en contacto con uno o más agentes que aumenten la expresión en la superficie celular o la actividad en la célula del polipéptido HCELL, y de esta forma aumentar el potencial de implante de la célula madre.

Alternativamente, el potencial de injerto de una población celular se aumenta proporcionando un polipéptido selectina, por ejemplo, selectina-E o selectina-L inmovilizados en una fase sólida y contactando la fase sólida con una muestra de fluido que contenga la población celular. La fase sólida entra en contacto con la muestra fluido de forma que se alcance una presión de cizalla en la fase sólida. Las células que se adhieren a la fase sólida se recuperan.

Los niveles de células madre implantadas en un sujeto se aumentan administrándole un agente que incremente la expresión del polipéptido HCELL.

Los agentes apropiados incluyen, por ejemplo, un ácido nucleico que codifique CD44, glucosiltransferasa o un polipéptido glucosidasa. Alternativamente, los niveles de células madre implantadas en un sujeto se aumentan administrando al sujeto un compuesto que contenga células aisladas de acuerdo a los métodos descritos arriba.

También se describen métodos para tratar trastornos hematopoyéticos, por ejemplo leucemia, en un sujeto. La enfermedad hematopoyética se trata administrando al sujeto un agente que disminuya la expresión de polipéptido HCELL en el sujeto. Alternativamente, el trastorno hematopoyético se trata tomando sangre del sujeto y poniéndola en contacto con uno o más agentes que se unan específicamente al polipéptido HCELL en las condiciones necesarias para formar un complejo entre los agentes y la célula sanguínea. El complejo se detecta, si está presente se retira de la sangre. La sangre es reintroducida en el sujeto.

Adicionalmente, un trastorno hematopoyético se trata colocando sangre del sujeto y un polipéptido selectina, por ejemplo selectina-E o selectina-L inmobilizados en una fase sólida y poniendo en contacto la fase sólida con la sangre. La fase sólida entra en contacto con la muestra de sangre alcanzando una presión de cizalla en la superficie de la fase sólida. La sangre es entonces reintroducida en el sujeto.

Además la enfermedad hematológica se puede tratar administrando al sujeto un agente que se una específicamente a la glucoproteína HCELL.

El invento también caracteriza el uso de una glucoproteína como se describe aquí en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno inflamatorio.

También se describe un método para diagnosticar o determinar la susceptibilidad de una persona a padecer un trastorno hematológico, poniendo en contacto una población de células derivada del sujeto con uno o más agentes que se unan específicamente a una glucoproteína HCELL bajo las condiciones necesarias para formar un complejo entre el agente y la célula, y detectar el complejo. La presencia del complejo indica la susceptibilidad del sujeto a sufrir la enfermedad hematológica.

Adicionalmente se describe un método para determinar el pronóstico o eficacia del tratamiento de una enfermedad hematológica en un sujeto, poniendo en contacto una población celular del sujeto con uno o más agentes que se unan específicamente a la glucoproteína HCELL bajo las condiciones necesarias para formar un complejo entre el agente y la célula y detectando el complejo.

A menos que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos que se usan aquí tienen el mismo significado que normalmente tienen para las personas que habitualmente trabajan en el ámbito al cual pertenece el invento. Aunque los materiales y métodos similares o equivalentes a aquellos descritos aquí pueden usarse en la práctica o comprobación del presente invento, los materiales y métodos apropiados serán descritos a continuación. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Otras características y ventajas del invento serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las afirmaciones.

Breve descripción de las ilustraciones

Fig. 1A es una fotografía de "Western Blot" que muestra la expresión de los epitopos reactivos a HECA-452 en varias líneas celulares hematopoyéticas humanas.

Fig. 1B es un gráfico de barras que muestra el contacto y rodamiento (tethering and rolling) de líneas celulares hematopoyéticas (presión de cizalla de 2,8 dinas/m^{2}) sobre monocapas fijadas con gluteraldehído. Los datos se representan como media\pmDE. Rodamiento de células CHO-E por campo X 5 campos, mínimo de tres experimentos.

Fig. 2 es un gráfico de barras que muestra el rodamiento de células hematopoyéticas humanas sobre células endoteliales de la médula ósea humana aisladas en fresco.

Fig. 3A es un diagrama de barras que muestra los resultados de un "blot rolling assay" de actividad ligando para selectina-E.

Fig. 3B es una fotografía de un Western Blot mostrando el efecto del tratamiento con N-glucosidasa-F en la tinción con HECA-452.

Fig. 3C es una fotografía de "Western Blot" mostrando expresión de PSGL-1 en células KG1a.

Fig. 3D es una fotografía de una membrana de un "Blot Rolling Assay" que muestra el efecto del tratamiento con N-glucosidasa-F sobre la actividad ligando para selectina-E.

Fig. 4A es una fotografía de una membrana de un "Blot Rolling Assay" mostrando la actividad de unión para selectina-E de HCELL inmunoprecipitada exhaustivamente con el anticuerpo anti-CD44 (Hermes-1). (Pre-Ippt): lisado total de KG1a 10 \mug; (línea 1): primera ronda de inmunoprecipitación con Hermes-1; (línea 2): segunda ronda de inmunoprecipitación con Hermes-1; (línea 3): tercera ronda de inmunoprecipitación con Hermes-1; (línea 4): lisado residual después de las 3 rondas de inmunoprecipitación con Hermes-1.

Fig. 4B es una fotografía de una membrana de un "Blot rolling assay" mostrando la actividad de unión para selectina-E de HCELL inmunoprecipitada exhaustivamente con anticuerpo anti-CD44 (Hermes-1) y teñido con el anticuerpo HECA-452. (Pre-Ippt): lisado total de KG1a 10 \mug; (línea 1): primera ronda de inmunoprecipitación con Hermes-1; (línea 2): segunda ronda de inmunoprecipitación con Hermes-1; (línea 3): tercera ronda de inmunoprecipitación con Hermes-1; (línea 4): lisado residual después de las 3 rondas de inmunoprecipitación con Hermes-1.

Fig. 5A es un gráfico de barras de rodamiento de células CHO-E mediado por selectina-E. El rodamiento se observó a 2,8 dinas/cm^{2} sobre CD44 KG1a, pero fue significativamente más bajo sobre KG1a PSGL-1 a 2,8 dinas/cm^{2} (p<0,001). CD44 KG1a tratada con N-glucosidasa-F y L-fucosidasa, y el tratamiento de las proteínas de membrana de KG1a con neuraminidasa de Vibrio cholerae eliminaron el rodamiento de las células CHO-E (p<0,001).

Fig. 5B es un gráfico de barras mostrando rodamiento de células CHO-P. El rodamiento se observó sobre PSGL-1 KG1a pero no sobre CD44 KG1a (2,8 dinas/cm^{2}). No se observó rodamiento sobre controles negativos (células CHO-Mock y células CHO-P pretratadas bloqueando la función con el anticuerpo monoclonal AK-4 (10 \mug/ml) bloqueante anti-selectina-P.

Fig. 6A es una fotografía de una membrana de un "Blot rolling assay" mostrando la actividad HCELL de varias células hematopoyéticas. (1) Células mononucleadas de médula ósea humana (10^{8} células), (2) células CD34-/línea+ (10^{7} células), (3) células CD34+/línea- (10^{7} células), (4) células CD34-/línea+ (10^{8} células).

Fig. 6B es una fotografía de un Western Blot ilustrando el efecto del tratamiento con N-glucosidasa-F sobre la actividad HECA-452 en blastos circulantes de una leucemia mieloide aguda (LMA).

Fig 6C es una fotografía de una membrana mostrando resultados de "blot rolling assay" de proteína de membrana (50 \mug) de LAM (M5) inmunoprecipitada con control isotipo o con anticuerpo monoclonal Hermes-1, e inmunoprecipitados con Hermes-1 tratados con N-glucosidasa-F.

Fig. 6D es una fotografía mostrando una tinción con HECA-452 de un inmunoprecipitado con CD44 de preparaciones de membrana (50 \mug) de una LMA (M0), LMA (M1) y LMC atípica (bcr/abl negativa) y de una línea de células endoteliales de médula ósea humana (BMEC-1 100 \mug de proteína total) que se evaluaron para la actividad ligando de selectina-E. La actividad ligando de selectina-E se correlaciona con la intensidad de la tinción con HECA-452 de la banda de 100 kDa.

Fig. 6E es una fotografía de un "Western Blot" mostrando la expresión de CD44 de BMEC-1.

Fig. 7A es un fotografía de un "Western Blot" de proteínas de membrana reactivas a HECA-452 (30 \mug/línea) de líneas de leucemia humana K562 (línea 1), RPMI-8402 (línea 2), HL-60 (línea 3), KG1a (línea 4), KG1a tratada con neuraminidasa (línea 5), KG1a tratada con OSGE (línea 6).

Fig. 7B es una fotografía de "Western Blot" mostrando la re-expresión de proteínas de KG1a reactivas a HECA-452 después de ser tratadas con neuraminidasa y seguidamente con tunicamicina. Líneas: 1, no tratadas; 2, neuraminidasa; 3, neuraminidasa y posteriormente recuperación durante 24 h con DMSO; y 4, neuraminidasa y posteriormente recuperación durante 24 h con tunicamicina.

Fig. 7C es una fotografía de una autorradiografía de proteínas de membrana radiomarcadas metabólicamente con 2-[^{3}H]-manosa resuelto en un SDS-PAGE 6% en condiciones de reducción.

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Fig. 7D es un gráfico de barras mostrando un "tethering and rolling" (contacto y rodamiento) de linfocitos dependiente de selectina-L sobre una membrana bajo condiciones hidrodinámicas de flujo (2,3 dinas/cm^{2}) sobre las proteínas de 98, 120 y 130 kDa de KG1a que contienen HECA-452.

Fig. 8 es una fotografía de "Western Blot" mostrando la reactividad del fragmento de gel de 98 kDa proveniente del tercer paso del esquema de purificación SDS-PAGE de 3 pasos (6 a 9% bis/acrilamida), con HECA-452 (0,4 \mug/ml) o con anticuerpos monoclonales anti-CD44 (A3D8 o Hermes-1 (1 \mug/ml).

Fig. 9 es una fotografía de una membrana mostrando los resultados de un "blot rolling assay" mediado por selectina-L de KG1a inmunoprecipitado con CD44 y teñido con Hermes-1 (izquierda) o HECA-452 (derecha).

Fig. 10A es una fotografía de una membrana mostrando los resultados de un "blot rolling assay" del tratamiento con N-glucosidasa-F sobre la actividad ligando de selectina-L del inmunoprecipitado con CD44 de células KG1a.

Fig. 10B es una fotografía de una membrana mostrando los resultados de un "blot rolling assay" del tratamiento con N-glucosidasa-F sobre la actividad ligando de selectina-L del inmunoprecipitado de blastos de LMA (M5).

Fig. 11A es una fotografía de un autorradiograma de inmunoprecipitado con CD44 de células KG1a radiomarcadas con [^{35}S]SO_{4} no tratadas y tratadas con clorato.

Fig. 11B es una fotografía de inmunoblots con HECA-452 de inmunoprecipitado de KG1a con CD44 de células KG1a tratadas con clorato (+) y no tratadas (-). La actividad ligando para selectina-L (media del número de linfocitos/campo de 200X/5 campos) fue equivalente en KG1a CD44 sulfatada y no sulfatada (tratada con clorato).

Fig. 12A es un gráfico de barras que muestra los resultados del rodamiento de linfocitos sobre líneas celulares hematopoyéticas fijadas con gluteraldehído KG1a, HL60, K562 y RPMI 8402, en un rango de presión de cizalla.

Fig. 12B es un diagrama de barras que muestra los resultados del rodamiento de neutrófilos sobre líneas celulares hematopoyéticas fijadas con gluteraldehído KG1a, HL60, K562 y RPMI 8402, en un rango de presión de cizalla.

Fig. 12C es un gráfico que muestra los resultados de la prueba de Stamper-Woodruff basada en cizallamiento, que evalúa la habilidad de las líneas celulares KG1a, HL60, K562 y RPMI 8402 en mantener la unión de los linfocitos mediada por selectina-L en un rango de rpm. La media de adherencia de linfocitos a las células KG1a fue 10 veces mayor que a las células HL60 (prueba de t-Student pareada; p<0.001). La adherencia de linfocitos mediada por selectina-L se eliminó pretratando los linfocitos con anticuerpos monoclonales anti-selectina-L (10 \mug/ml), utilizando linfocitos tratados con PMA, y o utilizando medio conteniendo EDTA 5 mM.

Fig. 13A es un gráfico de barras que muestra el rodamiento de células CHO-P o transfectantes falsos, mediado por selectina-P sobre monocapas de células hematopoyéticas fijadas con gluteraldehído, medido en una cámara de flujo de platos paralelos. Las células KG1a y HL60 soportaron un rodamiento celular similar de CHO-P mediado por selectina-P a 0.4 dinas/cm^{2}.

Fig. 13B es un gráfico que muestra interacciones de rodamiento de células CHO-P sobre células KG1a y HL60 que se midieron en un rango similar de presión de cizalla (shear stress) y se eliminaron en presencia de EDTA y fueron evitados pretratando las células con mocarhagin (10 \mug/ml).

Fig 14A es una fotografía de una autorradiografía de inmunoprecipitados Hermes-1 (CD44) y PL-2 (PSGL-1) y actividad ligando para selectina-L de HCELL y PSGL-1.

Fig. 14B es un gráfico que muestra los resultados de pruebas de Stamper-Woodruff realizadas con inmunoprecipitado de CD44 KG1a (1,5 \mug) y PSGL-1 (3 \mug).

Fig. 15 A-F son microfotografías de linfocitos unidos a CD44 o PSGL1 humanas en la prueba de Stamper-Woodruff. Se prepararon, CD44 de KG1a o de LMA (M1) (1,5 \mug), y PSGL-1 de KG1a (2 ó 6 \mug) purificados por inmunoafinidad según está descrito en los Métodos, y se analizó la adherencia de los linfocitos mediada por selectina-L mediante la prueba de Stamper-Woodruff. CD44 de KG1a o de LMA (M1) (paneles A y D, respectivamente) soportaron significativamente mayor número de linfocitos que las respectivas tratadas con N-glucosidasa-F (paneles B y E) y los inmunoprecipitados con control isotipo, anticuerpo monoclonal (Hermes-1) sólo o inmunoprecipitado con selectina-L. Los anticuerpos anti-selectina-L (10 \mu/ml), el medio conteniendo EDTA 5 mM o el tratamiento de los linfocitos con PMA (50 ng/ml), inhibieron completamente la adherencia de los linfocitos (también indicado en paneles C y F de células KG1a y LAM (M1) respectivamente), verificando la especificidad de la selectina-L en esta prueba.

Fig 16 es una fotografía de un Western Blot mostrando epitopo(s) en CD44 KG1a y PSGL-1.

Fig. 17A-B son fotografías que muestran la expresión de glucosiltransferasas (FucTIV, FucTVII y ST3GalIV) en líneas celulares hematopoéticas humanas. (Panel A) análisis de expresión por RT-PCR de FucTIV y FucTVII. Línea 1: FucTIV, línea 2: FucTVII, línea 3: \beta-actina, y línea 4: ddH_{2}O. (Panel B) análisis de expresión por RT-PCR de ST3GalIV. Línea 1: ST3Gal IV, Línea 2: \beta-actina, y línea 3: ddH_{2}O.

Descripción detallada

El presente invento se basa en parte en el descubrimiento de un nuevo polipéptido glucosilado expresado en las células progenitoras hematopoyéticas humanas y en los blastos leucémicos denominado ligando para selectina-E/selectina-L de la célula hematopoyética (HCELL). Los polipéptidos de HCELL también se refieren aquí como "KG1a CD44". Usando la técnica de "blot rolling assay" se demostró que HCELL es una nueva forma glucosilada de CD44 que contiene N-glucanos sialilados y fucosilados que reaccionan con HECA-452. El polipéptido HCELL es un ligando para ambos, selectina-L y selectina-E. La actividad de HCELL frente a selectina-L y selectina-E requiere glucanos sialofucosilados mediante uniones -N que son reconocidos por el anticuerpo monoclonal de rata HECA-452 y esta unión es independiente de sulfatación.

CD44 es una glucoproteína de la superficie celular, ampliamente distribuida, que actúa como receptor del glucosamino glucano hialuronano (HA), que es un componente muy importante del espacio extracelular. Está expresado en una variedad muy diversa de tipos celulares incluyendo la mayoría de células hematopoyéticas, queratinocitos, condrocitos, muchos tipos de células epiteliales, y algunas células endoteliales y neurales. Es sabido que CD44 participa en una amplia variedad de funciones celulares, incluyendo la agreagación célula-célula, retención de matriz pericelular, señalización matriz-célula y célula-matriz, internalización/degradación de hialuronano mediada por receptor, y la la migración celular. Todas estas funciones son dependientes de interacciones hialuronano-CD44 y es dependiente de la sulfatación.

El gen que codifica CD44 está compuesto de 20 exones (19 exones según la literatura anterior, los exones 6a y 6b han sido reclasificados como exones 6 y 7, que dan el total de 20 exones). Aunque un único gen localizado en el brazo corto del cromosoma 11 codifica CD44, se han identificado múltiples tránscritos de mRNA que surgen del splicing alternativo de 12 de los 20 exones. La forma estándar y más prevalente de CD44 (denominada CD44s) se compone de una proteína codificada por los exones 1-5, 16-18, y 20. Esta forma es la más predominante en las células hematopoyéticas, y es conocida también como CD44H. CD44s presenta los dominios extracelulares (exones 1-5 y 16), el dominio transmembrana altamente conservado (exón 18), y el dominio citoplásmico (exón 20). Los 1482 pb de la pauta abierta de lectura del mRNA del CD44s humano da como resultado la traducción de un polipéptido de \sim 37 kDa. La adición post-traducción de oligosacáridos mediante uniones -N o -O contribuye al peso molecular de \sim 85 kDa de la proteína final CD44 como se estima por SDS-PAGE.

La isoforma estándar o hematopoyética de CD44 (CD44H) es una molécula transmembrana de tipo 1 compuesta por \sim 270 aminoácidos (aa) de dominio extracelular (incluyendo 20 aa de la secuencia líder, un dominio transmembrana de 21 aa y un dominio intracitoplásmico de 72 aa. Los \sim 180 aa amino terminales están conservados en las especies de mamíferos (homología \sim 85%). Esta región contiene 6 cisteínas conservadas y 6 regiones consenso conservadas para N glucosilación. Cinco regiones consenso conservadas para N-glucosilación están localizadas en los 120 aa aminoterminales de CD44. Las 5 posiciones parecen ser utilizadas en líneas celulares humanas y murinas. Varios estudios han mostrado que la N-glucosilación específica de la célula puede modular la función de unión al HA de CD44. Líneas celulares y células-B normales mostraron diferencias en N-glucosilación asociada a diferentes estados de unión a HA. En particular, CD44 de células que se unen a HA tenían menos glucosilación que aquellas que no se unían a HA. Adicionalmente, la eliminación de ácidos siálicos (tanto de la superficie celular como de las proteínas de fusión CD44-Ig), aumenta la unión a HA. Así la glucoforma de CD44 HCELL del invento es diferente a cualquier CD44 descrita previamente.

En contraste, la región no-conservada (\sim 183 a 256 aa) muestra sólo \sim 35% de similitud entre las especies de mamíferos. Esta región contiene posiciones potenciales para numerosas modificaciones de CD44 con carbohidratos y la posición de splicing alternativo que permite la inserción de la secuencia de aminoácidos extra de los exones variables del gen CD44.

Un polipéptido HCELL comprende una secuencia de aminoácidos de CD44 y se une a un anticuerpo que tiene la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal HECA-452 (ATCC Número: HB-11485). HECA-452 reconoce el antígeno asociado al linfocito cutáneo. La unión de HCELL a HECA-452 decrece después del tratamiento con N-glucosidasa-F, sialidasa o fucosidasa. Además, la actividad de HCELL, por ejemplo, unión a selectina-E y selectina-L, también disminuye con el tratamiento con N-glucosidasa-F, sialidasa o fucosidasa, lo que demuestra la importancia de los glucanos con uniones -N sialofucosilados en la función de HCELL. En contraste, la sialilación de CD44 inhibe la unión de CD44 al ácido hialurónico. Además la unión de CD44 al hialuronato es inhibida por la sulfatación, pero la sulfatación no es necesaria para la actividad selectina-E y selectina-L de HCELL.

Preferentemente, el polipéptido CD44 es la isoforma estándar o hematopoyética de CD44 (CD44H). Alternativamente, el polipéptido CD44 es la isoforma R1 (CD44R1) o R2 (CD44R2). Por ejemplo, un polipéptido HCELL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 (Gen Bank Acc.CAA40133; Table1). Un polipéptido HCELL es al menos alrededor de 30%, 50%, 70%, 80%, o 95% idéntico a la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO:1.

TABLA 1

1

Polipéptidos de HCELL

Un aspecto del invento concierne a las glucoproteínas de HCELL aisladas. También se describen los fragmentos de polipéptido apropiados para el uso como inmunógenos para generar anticuerpos anti-HCELL. Por ejemplo se pueden aislar, glucoproteínas HCELL nativas de células o de tejidos mediante un esquema de purificación adecuado usando técnicas estándar de purificación de proteínas.

En otro ejemplo, glucoproteínas de HCELL están producidas por técnicas de DNA recombinante. Alternativamente a la expresión recombinante, una glucoproteína o polipéptido de HCELL puede sintetizarse químicamente usando técnicas estándar de síntesis de péptidos.

Una proteína "aislada" o "purificada" o porción activa biológicamente de la misma está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes provenientes de la célula o del tejido de los que se deriva la glucoproteína HCELL, o sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente. La expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de glucoproteína HCELL en las que la proteína es separada de los componentes celulares de las células de las cuales es aislada o producida recombinantemente. En un ejemplo, la expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de glucoproteína HCELL que tengan menos de alrededor de 30% (por peso seco) de glucoproteína no-HCELL (también referido aquí como una "proteína contaminante"), más preferible menos de alrededor de 20% de glucoproteína no-HCELL, aún más preferible menos de alrededor de 10% de glucoproteína no-HCELL, y lo más preferible menos de 5% de glucoproteína no-HCELL. Cuando la glucoproteína HCELL o una porción biológicamente activa de la misma se produce recombinantemente, es también preferible que esté sustancialmente libre de medio de cultivo, e.g, que el medio de cultivo represente menos de alrededor del 20%, más preferible menos de alrededor del 10%, y lo más preferible menos de alrededor del 5% del volumen de la preparación de proteína.

La expresión "sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas" incluye preparaciones de glucoproteína HCELL en las que la proteína es separada de precursores químicos u otras sustancias químicas que están implicados en la síntesis de la proteína. En la práctica, la expresión "sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas" incluye preparaciones de glucoproteína HCELL que tengan menos de alrededor de 30% (por peso seco) de precursores químicos o sustancias químicas no-HCELL, más preferible menos de alrededor de 20% de precursores químicos o sustancias químicas no-HCELL, aún más preferible menos de alrededor de 10% de precursores químicos o sustancias químicas no-HCELL, y lo más preferible menos de 5% de precursores químicos o sustancias químicas no-HCELL.

Las porciones biológicamente activas de una glucoproteína HCELL incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente homólogas a, o derivadas de, la secuencia de aminoácidos de la glucoproteína HCELL, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1, que incluye menos aminoácidos de los que tiene la longitud completa de glucoproteínas HCELL, y exhibe al menos una actividad de la glucoproteína HCELL, por ejemplo reactividad frente al anticuerpo HECA-452, reactividad frente al anticuerpo anti-CD44, unión a selectina-E o unión a selectina-L. Típicamente, las porciones biológicamente activas comprenden un dominio o porción con al menos una actividad de la glucoproteína HCELL, por ejemplo posiciones para glucosilación mediante uniones -N. Una porción biológicamente activa de una glucoproteína HCELL puede ser un polipéptido que tenga, por ejemplo, 10,25,50, 100 o más aminoácidos de longitud. Preferiblemente la porción biológicamente activa de una glucoproteína HCELL incluye la secuencia de aminoácidos del domino N-terminal de 4un polipéptido CD44.

En un ejemplo, la glucoproteína HCELL tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1.

Proteínas de fusión y quiméricas

También están descritas proteínas de fusión o quiméricas HCELL. Como se emplea aquí, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" HCELL comprende un polipéptido de HCELL unido operativamente a un polipéptido no-HCELL. Un "polipéptido HCELL" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a HCELL, mientras que un polipéptido "no-HCELL" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una proteína que no es sustancialmente homóloga a la glucoproteína HCELL, por ejemplo, una proteína que es diferente a la glucoproteína HCELL y que se deriva del mismo organismo o de uno diferente. En una proteína de fusión HCELL, el polipéptido HCELL puede corresponder a todo o a una porción de una glucoproteína HCELL. En un ejemplo, una proteína de fusión HCELL comprende al menos una porción biológicamente activa de una glucoproteína HCELL. Por ejemplo, una proteína de fusión HCELL comprende al menos dos porciones biológicamente activas de una glucoproteína HCELL. En otro ejemplo, una proteína de fusión HCELL comprende al menos tres porciones activas biológicamente de una glucoproteína HCELL. En la proteína de fusión, el término "unido operativamente" pretende indicar que el polipéptido HCELL y el polipéptido no-HCELL están fusionados el uno al otro siguiendo una pauta determinada. El polipéptido no-HCELL puede fusionarse al extremo N-terminal o C-terminal del polipéptido HCELL. Por ejemplo, una proteína de fusión HCELL comprende un dominio de unión a anti-CD44 HCELL unido operativamente al domino extracelular de una segunda proteína. Tales proteínas de fusión se pueden utilizar posteriormente para ensayos de prueba de compuestos que modulen la actividad de HCELL.

Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser una proteína de fusión GST-HCELL en la que las secuencias de HCELL están fusionadas al extremo C-terminal de las secuencias GST (por ejemplo, glutation S-transferasa). Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de HCELL recombinante. En otro ejemplo, la proteína de fusión es una glucoproteína de HCELL que contiene una secuencia de señal heteróloga en su extremo N-terminal. Por ejemplo, la secuencia de señal de HCELL nativa puede ser extraída y sustituida por una secuencia de señal de otra proteína. En ciertas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamíferos), la expresión y/o la secreción de HCELL puede estar aumentada a través del uso de una secuencia de señal heteróloga.

Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser una proteína de fusión HCELL-inmunoglobulina en la que la secuencia de HCELL o fragmentos de la misma se fusionan a secuencias derivadas de un miembro de la familia de proteínas de las inmunoglobulinas. Las proteínas de fusión HCELL-inmunoglobulina del invento pueden ser incorporadas a compuestos farmacéuticos y administrados a sujetos para inhibir la interacción en la superficie de la célula entre un ligando para HCELL y una glucoproteína HCELL, y así suprimir in vivo la transducción de la señal mediada por HCELL. Las proteínas de fusión HCELL-inmunoglobulina pueden usarse para afectar la biodisponibildad de un ligando afín para HCELL. La inhibición de la interacción HCELL/ligando para HCELL puede ser útil en el tratamiento de procesos proliferativos y diferenciativos, así como modular (por ejemplo, promoviendo o inhibiendo) la supervivencia celular.

Además, las proteínas de fusión HCELL-inmunoglobulina del invento se pueden usar como inmunógenos para producir anticuerpos anti-HCELL en un sujeto, para purificar ligandos HCELL, y en los ensayos para identificar moléculas que inhiban la interacción de HCELL con un ligando de HCELL.

Una proteína de fusión o quimérica de HCELL puede ser producida por técnicas de DNA recombinante estándar. Por ejemplo, fragmentos de DNA que codifican las diferentes secuencias de polipéptidos están ligados juntos de forma constante de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, empleando terminaciones romas o escalonadas para la unión, digestión enzimática de restricción para proporcionar los terminales adecuados, rellenando los extremos cohesivos apropiadamente, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar enlaces indeseables, y unión enzimática. En otro ejemplo, el gen de fusión puede ser sintetizado por técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de DNA automatizados. Alternativamente, una amplificación de fragmentos de genes por PCR puede llevarse a cabo usando primers de anclaje que den origen a hélices complementarias entre dos fragmentos de genes consecutivos que posteriormente pueden ser emparejados y reamplificados para generar una secuencia quimérica de genes (ver, por ejemplo, Ausubel et al. (eds) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992). Además, muchos vectores de expresión que codifican una molécula de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST) ya están disponibles comercialmente. Un ácido nucleico codificante de HCELL puede ser clonado dentro de un determinado vector de expresión de forma que la molécula de fusión se una en una pauta determinada a la glucoproteína HCELL.

Agonistas y antagonistas de HCELL

También se describen variantes de glucoproteínas HCELL que funcionan bien como agonistas (miméticos) de HCELL o como antagonistas de HCELL. Se pueden generar variantes de la glucoproteína por mutagénesis, por ejemplo puntos específicos de mutación o truncamiento de la glucoproteína HCELL. Un agonista de la glucoproteína HCELL puede mantener sustancialmente las mismas, o una parte de, las actividades biológicas de las que posee la forma natural de la glucoproteína HCELL. Un antagonista de la glucoproteína HCELL puede inhibir una o más de las actividades de las que posee la forma natural de la glucoproteína HCELL mediante, por ejemplo, unión competitiva uno de los miembros de la vía descendente o ascendente de una cascada de señalización celular que incluya la glucoproteína HCELL. Así, se pueden provocar efectos biológicos específicos mediante tratamiento con una variante de función limitada. Por ejemplo, tratando a un sujeto con una variante que posea una parte de las actividades biológicas de las que posee la forma natural de la glucoproteína pero con menos efectos adversos que el tratamiento con la forma natural de la glucoproteína HCELL.

Variantes de la glucoproteína que funcionan bien como agonistas (miméticos) de HCELL o como antagonistas de HCELL se pueden buscar revisando bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo, mutantes truncantes de la glucoproteína HCELL que den origen a una actividad agonista o antagonista de la glucoproteína HCELL. En un ejemplo, una abigarrada biblioteca de variantes de HCELL se genera por mutagénesis combinatoria a nivel del ácido nucleico y se codifica por una abigarrada biblioteca de genes. Una biblioteca abigarrada de variantes de HCELL se puede producir, por ejemplo, enzimáticamente ligando una mezcla de oligonucleótidos para formar secuencias de genes tales que un conjunto degenerado de secuencias potenciales de HCELL sean expresables como polipéptidos individuales, o alternativamente, como un conjunto de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo para mostrar a fagocitos) que contengan un conjunto de secuencias de HCELL en su interior. Hay una variedad de métodos que se pueden usar para producir bibliotecas de variantes potenciales de HCELL a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. La síntesis química de una secuencia degenerada de genes se puede realizar en un sintetizador automático de DNA, y el gen sintético ligarlo posteriormente a un vector de expresión adecuado. El uso de un conjunto degenerado de genes permite la provisión, en una mezcla, de todas las secuencias que codifican el conjunto deseado de secuencias potenciales de HCELL. Los métodos para sintetizar oligonucleótidos son conocidos en el ámbito de trabajo (ver, por ejemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu Rev Biochem 53:323 Itakura et al. (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucl Acid Res 11:477.

Anticuerpos anti-HCELL

También se describen anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, como (F_{ab})_{2} que se unen de forma específica a cualquiera de los polipéptidos del invento. Una proteína HCELL aislada, o una porción o fragmento de la misma, puede usarse como inmunógeno para generar anticuerpos que se unan a HCELL utilizando técnicas estándar para la preparación de anticuerpos monoclonales o policlonales. Se puede utilizar la longitud completa de la glucoproteína HCELL, o alternativamente, el invento proporciona fragmentos peptídicos de HCELL para ser usados como inmunógenos. El péptido antigénico de HCELL comprende al menos 4 residuos aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1 y engloba un epitopo de HCELL tal que un anticuerpo generado contra el péptido forma un inmunocomplejo específico con HCELL. Preferiblemente, el péptido antigénico comprende al menos 6,8,10,15,20 ó 30 residuos aminoácido. Péptidos antigénicos más largos son preferibles algunas veces a péptidos antigénicos más cortos, dependiendo del uso y de los métodos bien conocidos por la persona entrenada en el ámbito que se trata. Más preferentemente el péptido antigénico debe comprender al menos una posición de glucosilación de unión tipo -N.

Por ejemplo, que al menos un epitopo englobado por el péptido antigénico esté en una región de HCELL que se localice en la superficie de la proteína, por ejemplo, como una región hidrofílica. Como medios para dirigir la producción de anticuerpo, se pueden generar curvas de hidropatía que muestren regiones de hidrofilia e hidrofobia, mediante cualquier método bien conocido en el arte, por ejemplo, los métodos Kyte Doolittle o Hopp Woods, con o sin transformación de Fourier. Ver, por ejemplo, Hopp and Woods, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78:3824-3428; Kyte and Doolittle 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-142, cada uno incorporado aquí con la referencia completa.

Como se ha revelado aquí, la secuencia de la glucoproteína HCELL, o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de la misma pueden ser utilizados como inmunógenos en la generación de anticuerpos que se unan inmunoespecíficamente a estos componentes proteicos. El término "anticuerpo" es utilizado aquí para referirse a moléculas de inmunoglobulina y a porciones inumológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un lugar de unión a antígeno que se une específicamente a (inmunorreacciona con) un antígeno, como es HCELL. Tales anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, policlonales, monoclonales, quiméricos, cadenas simples, fragmentos F_{ab}, y F_{(ab)2} y una biblioteca de expresión de F_{ab}. De forma específica, se desvelan anticuerpos específicos frente a glucoproteína HCELL humana. Varios procedimientos conocidos en el ámbito de conocimiento se pueden utilizar para la producción de anticuerpos policlonales o monoclonales frente a una secuencia de glucoproteína HCELL de SEQ ID NO: 1, o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de la misma. Algunas de estas proteínas se discuten a continuación.

Para la producción de anticuerpos policlonales, varios animales huésped son adecuados (por ejemplo, conejo, cabra, ratón u otro mamífero) para ser inmunizados con una inyección de la proteína nativa, o una variante sintética de la misma, o una derivada de la anterior. Una preparación inmunogénica apropiada puede contener, por ejemplo, glucoproteína HCELL expresada recombinantemente o un polipéptido HCELL sintetizado químicamente. La preparación puede incluir además un adyuvante. Varios adyuvantes utilizados para aumentar la respuesta inmunológica incluyen, pero no se limitan a, Freund's (completo e incompleto), geles minerales (por ejemplo, hidróxido de aluminio), sustancias activas en superficie (por ejemplo, lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, dinitrofenol, etc.)adyuvantes humanos como Bacille Calmette-Guerin y Corynebacterium parvum, o agentes inmunoestimuladores similares. Si se desea, las moléculas de anticuerpo dirigidas contra HCELL se pueden aislar de los mamíferos (por ejemplo, de la sangre) y posteriormente purificarse mediante técnicas bien conocidas, como cromatografía de proteína A para obtener la fracción IgG.

El término "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se utiliza aquí, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen sólo una especie de un lugar de unión a antígeno capaz de reaccionar con un epitopo particular de HCELL. Una composición de anticuerpo monoclonal así típicamente muestra una única afinidad de unión para una glucoproteína HCELL en particular con la que inmunorreacciona. Para preparar anticuerpos monoclonales dirigidos contra una glucoproteína HCELL particular, o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de la misma, se puede utilizar cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por un cultivo continuo de una línea celular. Tales técnicas incluyen, pero no se restringen a, la técnica del hibridoma (ver Kholer & Milstein, 1975 Nature 256: 495-497); la técnica del trioma; la técnica del hibridoma de célula-B humana (ver Kozbor, et al., 1983 Inmunol Today 4: 72) y la técnica del hibridoma de VEB para producir anticuerpos monoclonales humanos (ver Cole, et al., 1985 en: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Se pueden utilizar anticuerpos monoclonales humanos en la práctica del presente invento y se pueden producir usando hibridomas humanos (ver Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) o transformando in vitro células-B humanas con Virus de Epstein Barr (ver Cole, et al., 1985 en: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp 77-96). Cada una de las citas anteriores se ha incorporado aquí con la referencia en su totalidad.

Se pueden adaptar técnicas para la producción de anticuerpos de cadena simple específicos frente a una glucoproteína HCELL (ver, por ejemplo, Patente U.S. No. 4.946.778). Además se pueden adaptar metodologías para la construcción de bibliotecas de expresión de F_{ab} (ver, por ejemplo, Huse et al., 1989 Science 246: 1275-1281) para permitir la identificación rápida y efectiva de fragmento F_{ab} monoclonales con la especificidad deseada frente a una glucoproteína HCELL o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de la misma. Anticuerpos no-humanos pueden ser humanizados mediante técnicas bien conocidas en el ámbito de trabajo de que se trata. Ver, por ejemplo, Patente U.S. No 5.225.539. Fragmentos de anticuerpo que contienen idiotipos frente a una glucoproteína HCELL se pueden producir mediante técnicas bien conocidas en el arte incluyendo, pero no restringidas a: (i) un fragmento F_{(ab)2} producido por digestión de una molécula de anticuerpo con pepsina; (ii) un fragmento F_{ab} generando mediante la reducción de puentes disulfato de un fragmento F_{(ab)2}; (iii) un fragmento F_{ab} generado por el tratamiento de una molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor y (iv) fragmentos F_{v}.

Adicionalmente, se describen anticuerpos recombinantes anti-HCELL, como anticuerpos monoclonales humanizados y quiméricos, incluyendo ambas porciones humana y no-humana, los cuales pueden ser fabricados usando técnicas de DNA recombinante estándar conocidas en el ámbito de trabajo, por ejemplo usando métodos descritos en International Application No. PCT/US86/02269; European Patent APPlication No 184.187; European Patent Application No 171.496; European Patent Application No. 173.494; PCT International Publication No. 125.023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J Immunol 139:3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; Shaw et al. (1988) J Natl Cancer Inst 80:1553-1559; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Bio Techniques 4:214; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; y Beidler et al. (1988) J Immunol 141:4053-4060.

Por ejemplo, metodologías para la investigación de anticuerpos que posean la especificidad deseada incluyen, ELISA (enzyme-linked immunoorbent assay) y otras técnicas mediadas inmunológicamente conocidas en el arte. En un ejemplo específico, la selección de anticuerpos que son específicos frente a un dominio particular de una glucoproteína HCELL se facilita mediante la generación de hibridomas que se unan al fragmento de la glucoproteína HCELL que posee tal dominio. También se proveen aquí los anticuerpos que son específicos para un lugar de glucosilación con unión de tipo -N, o derivados, fragmentos, análogos u homólogos del mismo.

Se pueden utilizar anticuerpos anti-HCELL en métodos conocidos en el ámbito de trabajo relacionados con la localización y/o cuantificación de una glucoproteína HCELL (por ejemplo, para el uso de cuantificación de niveles de glucoproteína HCELL en muestras fisiológicas apropiadas, para el uso en métodos diagnósticos, para uso en visualizar la proteína, y similares). Anticuerpos frente a proteínas HCELL, o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de las mismas, que contengan el dominio de unión derivado del anticuerpo, son utilizados como compuestos farmacológicamente activos (ver en "terapéutica").

Un anticuerpo anti-HCELL (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) se puede usar para aislar HCELL mediante técnicas estándar, como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Un anticuerpo anti-HCELL puede facilitar la purificación de HCELL natural a partir de células y de HCELL producido recombinantemente expresado en células huésped. Además, un anticuerpo anti-HCELL puede ser utilizado para detectar glucoproteína HCELL (por ejemplo, en un lisado celular o sobrenadante de células) con el objeto de evaluar la abundancia y el patrón de expresión de la glucoproteína HCELL. Se pueden utilizar anticuerpos anti-HCELL desde el punto de vista diagnóstico para monitorizar niveles de proteína en tejido como parte de un procedimiento de prueba clínica, como por ejemplo determinar la eficacia de un régimen de tratamiento administrado. Alternativamente se usan anticuerpos anti-HCELL para tratar o diagnosticar leucemia. La detección se puede facilitar emparejando (por ejemplo conectando físicamente) el anticuerpo con la sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radioactivos. Ejemplos de enzimas apropiadas son peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos apropiados incluyen estreptavidina/biotina y avidina biotina; ejemplos de materiales fluorescentes apropiados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína diclorotriacinilamina, cloruro de dansil o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente es el luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y ecuorina, y ejemplos de materiales radioactivos apropiados incluyen ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S o ^{3}H.

Vectores de Expresión Recombinantes de HCELL

También se describen vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica polipéptidos de HCELL, polipéptidos de fusión, o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de la misma. Como se utiliza aquí, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido unido. Un tipo de vector es un "plásmido", el cual es una hélice de DNA de doble hebra a la que se pueden unir segmentos adicionales de DNA. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que segmentos adicionales de DNA se pueden unir al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se han sido introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores mamíferos episómicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no-episómicos) se integran en el genoma de una célula huésped al introducirse en la célula huésped, y así se replican al mismo tiempo que el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales han sido unidos operativamente. Tales vectores son referidos aquí como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de DNA recombinante están frecuentemente en la forma de plásmidos. En la presente explicación, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente ya que el plásmido es la forma de vector utilizada más frecuentemente. También se pueden utilizar otras formas de vector, como vectores virales (por ejemplo, retrovirus con defectos en la replicación, adenovirus y virus asociados a adenovirus), los cuales tienen funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinantes comprenden un ácido nucleico del invento en una forma apropiada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo cual significa que los vectores de expresión recombinantes incluyan una o más secuencias regulatorias, seleccionadas en base a las células huésped que vayan a ser utilizadas para la expresión, la cual está operativamente unida a la secuencia de ácido nucleico que será expresada. En un vector de expresión recombinante, "operativamente unido" se intenta que la secuencia de nucleótido de interés se una a la secuencia(s) reguladora de forma que permita la expresión de la secuencia de nucleótido (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector se introduce en la célula huésped).

El término "secuencia regulatoria" está pensado para incluir promotores, ampliadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótido en muchos tipos de célula huésped y aquellos que dirigen la expresión de una secuencia de nucleótido sólo en ciertas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido). Sería de agradecer para aquellos entrenados en el arte, que el diseño del vector de expresión pueda depender de factores como la elección de la célula huésped que será transformada, el nivel de expresión de la proteína deseado, etc. Los vectores de expresión pueden ser introducidos en las células huésped y de esa forma producir proteínas o péptidos, incluyendo proteínas de fusión o péptidos, codificados por ácidos nucleicos como se describe aquí.

Se pueden designar los vectores de expresión recombinantes para la expresión de polipéptidos de HCELL o polipéptidos de fusión en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, polipéptidos de HCELL o polipéptidos de fusión pueden expresarse en células bacterianas como Escherichia coli, células de insectos (usando vectores de expresión baculovirus), levaduras o células de mamíferos. Las células huésped apropiadas se discuten con más detalle en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede ser transcrito y traducido in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras promotoras T7 y polimerasa T7.

La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo normalmente en Escherichia coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o de no-fusión. Los vectores de fusión añaden un número de aminoácidos a una proteína codificada allí, usualmente al extremo amino terminal de la proteína recombinante. Estos vectores de fusión tienen típicamente tres objetivos: (i) aumentar la expresión de la proteína recombinante; (ii) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y (iii) ayudar a la purificación de la proteína recombinante actuando como un ligando en la purificación por afinidad. Frecuentemente, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un punto de rotura proteolítica en la unión de la molécula de fusión con la proteína recombinante para facilitar la separación de la proteína recombianante de la molécula de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento relacionadas, incluyen Factor Xa, trombina y enterocinasa. Los vectores de expresión de fusión incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) que fusionan glutation S-transferasa (GST), proteína de unión maltosa E, o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana.

Ejemplos de vectores de expresión de no-fusión inducibles por E. coli apropiados incluyen pTrc (Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315) y pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185; Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89).

Una estrategia para maximizar la expresión de proteína recombinante en E coli es expresar la proteína en una bacteria huésped con una capacidad alterada para romper proteolíticamente la proteína recombinante. Ver, por ejemplo, Gottesman, Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128. Otra estrategia es alterar la secuencia de ácidos nucleicos del ácido nucleico que se inserta en el vector de expresión de manera que los codones individuales para cada aminoácido sean aquellos utilizados preferentemente en E. coli (ver, por ejemplo, Wada, et al., 1992. Nucl. Acid Res. 20:2111-2118). Tales alteraciones de las secuencias de ácidos nucleicos del invento se pueden llevar a cabo por técnicas estándar de síntesis de DNA.

Por ejemplo los polipéptidos de HCELL o vectores de expresión de polipéptidos de fusión pueden ser un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores de expresión en levadura Saccharomyces cerevisae incluyen pYepSecl (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, 1982. Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987. Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif), y picZ (In Vitrogen Corp, San Diego, Calif.).

Alternativamente, se pueden expresar polipéptidos de HCELL o polipéptidos de fusión en células de insecto usando vectores de expresión baculovirus. Los vectores baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto en cultivo (por ejemplo, células SF9) incluyen la serie pAc (Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) y la serie pVL (Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39).

Por ejemplo, un ácido nucleico del invento se expresa en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Ejemplos de vectores de expresión mamíferos incluyen pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195). Cuando se usan en células de mamíferos, las funciones de control de los vectores de expresión son proporcionados frecuentemente por elementos reguladores virales. Por ejemplo, promotores que se usan comúnmente se derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus, y virus del simio 40. Para otros sistemas de expresión apropiados tanto para células procariotas como eucariotas ver, por ejemplo, capítulos 16 y 17 de Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

Por ejemplo el vector de expresión mamífero recombinante es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo celular particular (por ejemplo, se usan elementos reguladores específicos de tejido para expresar el ácido nucleico). Se conocen en el ámbito de trabajo elementos reguladores específicos de tejido. Ejemplos no limitantes de promotores específicos de tejido apropiados incluyen promotor de albúmina (hígado-específico); Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277), promotores linfoides específicos (Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275), en particular promotores de receptores de célula T (Wimoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733) e inmunoglobulinas (Banerji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748), promotores específico de neurona (por ejemplo, el promotor de neurofilamento; Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl Acda. Sci. USA 86: 5473-5477), promotores específicos de páncreas (Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916) y promotores específicos de glándula mamaria (por ejemplo, promotor de suero de leche; U.S. Pat No. 4.873.316 y European Application Publication No. 264,166). También se engloban promotores regulados desarrolladamente, por ejemplo, los promotores murinos hox (Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379) y el promotor de \alpha-fetoproteína (Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546).

También se describe un vector de expresión recombinante que comprenda una molécula de DNA como se describe aquí, clonada en un vector de expresión con una orientación antisentido. Esto es, la molécula de DNA está unida operativamente a una secuencia reguladora de un modo que permite la expresión (por transcripción de la molécula de DNA) de una molécula de RNA que es antisentido a los polipéptidos de HCELL o al mRNA de los polipéptidos de fusión. Se pueden elegir secuencias reguladoras unidas operativamente a ácidos nucleicos clonados en orientación antisentido que dirijan la expresión continua de la molécula RNA antisentido en una variedad de tipos celulares, por ejemplo se pueden elegir promotores virales y/o amplificadores que dirijan la expresión constitutiva, tejido específica o tipo celular específica de RNA antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar en forma de un plásmido recombinante, fagémido o virus atenuado en el que los ácidos nucleicos antisentido están producidos bajo el control de una región reguladora de alta eficacia, la actividad de la cual puede estar determinada por el tipo celular en el que el vector es introducido. Para discusión sobre la regulación de la expresión de gen utilizando genes antisentido ver, por ejemplo, Weintraub, et al., "Antisense RNA as a molecular tool for genetic análisis", Reviews-Trends in Genetics, Vol.1 (1) 1986.

También están descritas células huésped en las que ha sido introducido un vector de expresión del invento. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se usan aquí indistintamente. Se entiende que tales términos se refieren no sólo a la célula sujeto particular sino también a la progenie o potencial progenie de dicha célula. Dado que pueden suceder ciertas modificaciones debido a mutación o a influencias ambientales, tal progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula parental, pero estar todavía incluida dentro del ámbito del término que se utiliza aquí.

Una célula huésped puede ser procariota o eucariota. Por ejemplo, polipéptidos de HCELL o polipéptidos de fusión, se pueden expresar en células bacterianas como E. coli, células de insecto, levaduras o células de mamífero (tales como humana, células de ovario de hamster chino (CHO) o células COS). Otras células huésped adecuadas son conocidas por aquellos entrenados en este ámbito de trabajo.

Se puede introducir DNA vector en células procariotas o eucariotas vía transformación convencional o por técnicas de transfección. Como se usan aquí, los términos "transformación" y "transfección" están pensados para referirse a una variedad de técnicas reconocidas para introducir ácidos nucleicos extraños (por ejemplo, DNA) dentro de una célula huésped, incluyendo coprecipitación con fosfato cálcico o cloruro cálcico, transfección mediada por dextrano DEAE, lipofección, electroporación. Se pueden encontrar métodos adecuados para trasformar o transfectar células huésped en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), y otros manuales de laboratorio.

Para la transfección estable de células de mamífero, es conocido que, dependiendo del vector de expresión y de la técnica de transfección utilizada, sólo una pequeña fracción de células pueden integrar el DNA extraño dentro de su genoma. Para identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador exclusivo (por ejemplo, la resistencia a antibióticos) se introduce generalmente dentro de la célula huésped junto al gen de interés. Varios marcadores exclusivos incluyen aquellos que confieren resistencia a drogas, como G418, higromicina y metotrexato. Se puede introducir ácido nucleico que codifica un marcador selectivo dentro de una célula huésped en el mismo vector que codifica polipéptidos HCELL o polipéptidos de fusión o puede ser introducido en un vector separado. Se pueden identificar por selección farmacológica células transfectadas establemente con el ácido nucleico introducido (por ejemplo, células que han incorporado el gen marcador selectivo sobrevivirán, mientras que otras células morirán).

Una célula huésped como una célula procariota o eucariota en cultivo, puede utilizarse para producir (por ejemplo, expresar) polipéptidos HCELL o polipéptidos de fusión. En consecuencia, también están descritos métodos para producir polipéptidos HCELL o polipéptidos de fusión usando las células huésped del invento. Por ejemplo, los métodos incluyen cultivar la célula huésped del invento (en la que ha sido introducido un vector de expresión recombinante que codifica polipéptidos HCELL o polipéptidos de fusión) en un medio apropiado de manera que se produzcan polipéptidos HCELL o polipéptidos de fusión. En otro ejemplo, el método también incluye aislar polipéptidos HCELL o polipéptidos de fusión del medio o de la célula huésped.

Métodos de identificación de células madre

También están descritos varios métodos para identificar y/o aislar células madre. Una célula madre es una célula pluripotente de origen mesodérmico, ectodérmico o endodérmico. Preferentemente, una célula madre es de origen mesodérmico. Más preferentemente, una célula madre es una célula hematopoyética progenitora.

Una célula madre se identifica poniendo en contacto una población celular a analizar con uno o más agentes, por ejemplo, una proteína, un polipéptido o una molécula pequeña, que se una específicamente a HCELL. Preferentemente, un agente es un anticuerpo o un fragmento del mismo. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal. Por ejemplo, un agente es un anticuerpo frente a HCELL. Alternativamente, un agente es un anticuerpo anti-CD44, o un anticuerpo HECA-452.

Unir específicamente significa que la interacción entre la célula y el agente es suficiente para formar un complejo. Es detectado un complejo célula/agente. La presencia del complejo indica que la célula analizada es una célula madre. En un método alternativo, la célula madre se aísla de la población celular a analizar extrayendo el complejo de la población celular a analizar. El complejo se puede separar de la población celular a analizar por métodos conocidos en el ámbito de trabajo, por ejemplo, como la citometría de flujo. Adicionalmente, la célula madre puede ser aislada posteriormente separando la célula madre del agente(s) destruyendo el complejo. El complejo puede ser destruido por ejemplo mediante quelación de iones con EDTA diluido.

Alternativamente, una célula madre se puede identificar proporcionando un polipéptido selectina, por ejemplo, selectina-E o selectina-L, inmovilizado en una fase sólida, por ejemplo, vidrio, plástico o membrana y poniendo en contacto la fase sólida con una muestra fluida que contenga en suspensión las células a analizar. En algunos aspectos la muestra fluida se mueve. Una muestra fluida en movimiento quiere decir que la muestra fluye a través de la superficie de la membrana de un modo unidireccional. Las intereacciones entre la muestra fluida en flujo y el ligando inmovilizado se pueden examinar bajo un amplio rango de condiciones de flujo definidas, que van desde incubación estática hasta niveles fisiológicos de flujo de cizalla (shear flow), condiciones estáticas y aplicación seriada de condiciones estáticas o de cizalla, y en niveles suprafisiológicos de cizalla. Por ejemplo, una condición de presión de cizalla es una fuerza de flujo mayor de 0,6 dinas/cm^{2}. Alternativamente, condición de presión de cizalla es una fuerza de flujo de al menos 2,8 dinas/cm^{2}. Adicionalmente es una fuerza de al menos 9,0 dinas/cm^{2}. En algunos aspectos, el fluido se mueve a través de la membrana de forma que se alcanza una presión de cizalla fisiológica en la superficie. Entonces se determina la interacción entre la fase sólida y las células. La interacción entre las células del fluido y la fase sólida indica que la célula es una célula madre.

También está descrito un método para aislar células madre. El método incluye proveer un polipéptido selectina en una fase sólida y poniendo en contacto la fase sólida con una muestra fluida conteniendo células en suspensión. Las células adheridas a la fase sólida son recuperadas después. Las células unidas se pueden recuperar por cualquiera de los métodos conocidos en el ámbito de trabajo (por ejemplo, como la quelación de iones con EDTA diluido y/o aplicación de una fuerza de cizalla alta). Las células unidas se pueden recuperar de la superficie del blot y recolectarse para analizar su fenotipo o sus funciones biológicas después de su dilución. El ligando inmobilizado en la matriz puede ser reutilizado para comparar interacciones dentro de varios grupos de células o manipuladas in situ para definir las características de la población celular que se investiga.

La interacción entre las células y la fase sólida puede ser, por ejemplo, rodamiento, unión firme o interacción específica. En algunos aspectos, la interacción específica se determina por el coeficiente de afinidad. Por ejemplo, una interacción específica es una interacción que tiene un K_{d} en el rango de 0,1 mM a 7 mM. Preferiblemente, la K_{d} tiene que ser mayor de 1 mM.

Una interacción célula/agente o alternativamente interacción célula/fase sólida puede determinarse por ejemplo, por inspección visual al microscopio, colorimétricamente, fluorométricamente, por citometría de flujo o usando una prueba de cámara de flujo de platos paralelos. Alternativamente, la interacción se analiza marcando las células, el polipéptido HCELL o el agente usando marcadores fluorescentes, biotina, enzimas como la fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano o beta-galactosidasa, isótopos radioactivos u otros marcadores conocidos en el ámbito de trabajo. El marcador puede ser añadido a las células, al polipéptido HCELL o al agente antes o subsecuentemente a poner en contacto la población celular a estudio con el agente. La membrana o fase sólida puede ser objeto de análisis espectrofotométrico o radiográfico para cuantificar el número que interacciona con el polipéptido selectina de la fase sólida.

También están descritos métodos para tratar alteraciones celulares como trastornos hematopoyéticos, cáncer, o trastornos susceptibles de ser tratados con células madre (es decir, terapia con células madre) como infarto de miocardio, enfermedad de Parkinson, diabetes, distrofias musculares congénitas, accidentes cerebrovasculares, trastornos genéticos/congénitos (por ejemplo, osteogénesis imperfecta) y alteraciones del hígado en mamíferos, por ejemplo, humanos administrando células aisladas mediante los métodos descritos anteriormente.

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Métodos para aumentar la afinidad ligando para selectina-E/selectina-L

También está descrito un método para aumentar la afinidad de una célula para selectina-E y/o selectina-L, proporcionando y poniendo en contacto la célula con uno o más agentes que aumenten la expresión o la actividad del polipéptido HCELL en la superficie celular.

La célula puede ser cualquier célula capaz de expresar el polipéptido HCELL. Por ejemplo la célula puede ser una célula madre (por ejemplo, una célula pluripotente). Una célula puede ser de origen mesodérmico, ectodérmico o endodérmico. Preferentemente, una célula de origen mesodérmico. Más preferentemente, la célula debe ser una célula progenitora hematopoyética. La población celular que se expone a, es decir, contacta con, el compuesto puede ser cualquier número de células, es decir, una o más células, y puede ser provista in vitro, in vivo o ex vivo.

Agentes apropiados pueden ser, por ejemplo, un polipéptido, un ácido nucleico. Por ejemplo puede ser un polipéptido CD44, glucosiltransferasa o glucosidasa, un ácido nucleico que codifique un polipéptido CD44, glucosiltransferasa o glucosidasa y, derivados, fragmentos, análogos u homólogos de los mismos. Un ácido nucleico que aumente la expresión de un ácido nucleico que codifique un polipéptido CD44, glucosiltransferasa o glucosidasa, incluye, por ejemplo, promotores, amplificadores. El ácido nucleico puede ser endógeno o exógeno.

Fuentes apropiadas de ácidos nucleicos que codifiquen polipéptido CD44 incluyen por ejemplo el ácido nucleico humano CD44 (y las secuencias proteicas codificadas) disponibles como GenBank Accesion Nos. LO5407 y CAA40133, respectivamente. Otras fuentes incluyen ácido nucleico humano CD44 y secuencias de proteínas y se muestran en GenBank Accesion No. U35632 y P160079, respectivamente, y se refieren aquí con la referencia en su integridad. Fuentes adecuadas de ácidos nucleicos que codifican polipéptido glucosiltransferasa incluyen por ejemplo el ácido nucleico glucosiltransferasa humano (y las secuencias de proteínas codificadas) disponibles como GenBank Accesion Nos. AJ276689 y CAB81779, respectivamente. Fuentes apropiadas de ácidos nucleicos que codifican polipéptido glucosidasa incluyen por ejemplo el ácido nucleico glucosidasa humano (y las secuencias de proteína codificadas) disponible como GenBank Accesion Nos. AJ278964 y CAC08178, respectivamente. El uso de otros polipéptidos CD44 glucosiltransferasa o glucosidasa, de CD44 y ácidos nucleicos conocidos en el arte están también en el ámbito de este invento.

El agente se puede exponer a la célula directamente (es decir, la célula es expuesta directamente al ácido nucleico o al vector que contiene el ácido nucleico) o indirectamente.

La expresión de HCELL puede medirse a nivel del ácido nucleico o de la proteína. La expresión de los ácidos nucleicos puede medirse a nivel del RNA usando cualquier método conocido en el ámbito de trabajo. Por ejemplo, se puede realizar análisis por "northern hybridization" para determinar la expresión de genes usando sondas que reconozcan específicamente una o más secuencias. Alternativamente, la expresión se puede medir usando pruebas de tipo RT PCR. La expresión se puede medir también a nivel de proteína, es decir, midiendo los niveles de polipéptidos codificados por los productos de los genes. Dichos métodos son bien conocidos en el arte e incluyen, por ejemplo, inmunoensayos basados en anticuerpos frente a proteínas codificadas por los genes.

La actividad de HCELL puede medirse por ejemplo por la actividad de unión a selectina-L o selectina-E.

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Métodos para aumentar el potencial de injerto de una célula

También están descritos métodos para aumentar el potencial de injerto de una célula. Se entiende por aumentar el potencial de injerto el que la célula tenga una mayor tasa de supervivencia después del trasplante en comparación con una célula no tratada.

Una célula puede ser de origen mesodérmico, ectodérmico o endodérmico. Un ejemplo de célula sería la célula progenitora hematopoyética.

Está descrito un método para aumentar el potencial de injerto de una célula, disponiendo esa célula y poniéndola en contacto con uno o más agentes que aumenten la expresión de HCELL en la superficie celular o aumenten la actividad de este polipéptido en la superficie de la célula. Está descrito un método para aumentar los niveles de células madre implantadas en un sujeto, por ejemplo, humano, mediante la administración al sujeto de un agente que aumente la expresión de HCELL en la superficie celular en una o más células madre del sujeto. El agente puede administrarse in vivo, ex vivo o in vitro.

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También está descrito un método de aumentar el potencial de injerto de una población celular suministrando a la célula un polipéptido, por ejemplo, selectina-E o selectina-L inmobilizadas sobre una fase sólida, por ejemplo, una fase vidrio, plástico o membrana y haciendo contactar la fase sólida con una muestra fluida que contenga las células en suspensión. En algunas ocasiones la muestra fluida estaría en movimiento. Se entiende por una muestra fluida en movimiento que la muestra fluye a través de la superficie de la membrana de una forma unidireccional. Las interacciones entre la muestra fluida fluyendo y el ligando inmovilizado pueden ser examinadas bajo un amplio rango de condiciones de flujo definidas, que van desde la incubación estática pasando por niveles fisiológicos de flujo de cizalla, condiciones estáticas y aplicación seriada de condiciones estáticas y de flujo de cizalla, y hasta niveles de cizalla suprafisiológicos. Por ejemplo, una condición de flujo de cizalla es una fuerza de flujo superior a 0,6 dinas/cm^{2}. Alternativamente, una condición de flujo de cizalla es una fuerza de flujo de al menos 2,8 dinas/cm^{2}. Adicionalmente, una condición de flujo de cizalla es una fuerza de flujo de al menos 9,0 dinas/cm^{2}. En algunos casos, el el fluido se mueve de un lado a otro de la membrana de forma que se alcanza una presión de cizalla fisiológica en la superficie. Seguidamente, las células que se adhieren a la fase sólida se recuperan. Las células unidas se pueden retirar por cualquier método conocido en el ámbito de trabajo (por ejemplo, por quelación de iones con EDTA diluido y/o aplicación de una fuerza de cizalla alta). Las células recuperadas de la superficie de la membrana pueden entonces recolectarse y analizar su fenotipo o sus funciones biológicas después de diluirlas. El ligando inmovilizado en la matriz puede reutilizarse para comparar interacciones entre varios grupos de células o ser manipulado in situ (como se explica después) para definir las características de la población celular que se investiga. También está descrito un método de aumentar los niveles de células madre implantadas en un sujeto, administrando a un sujeto una composición que incluya las células aisladas de acuerdo a los métodos que se han explicado más arriba.

Agentes apropiados pueden ser, por ejemplo, un polipéptido, un ácido nucleico. Por ejemplo un agente puede ser un polipéptido CD44, glucosiltransferasa o glucosidasa, un ácido nucleico que codifique un polipéptido CD44, un polipéptido glucosiltransferasa o un polipéptido glucosidasa o un ácido nucleico que aumente la expresión de un ácido nucleico que codifique un polipéptido CD44, un polipéptido glucosiltransferasa o un polipéptido glucosidasa y, derivados, fragmentos, análogos y homólogos de los mismos. Un ácido nucleico que aumente la expresión de un ácido nucleico que codifique un polipéptido CD44, un polipéptido glucosiltransferasa o un polipéptido glucosidasa incluye, por ejemplo, promotores, amplificadores. El ácido nucleico puede ser endógeno o exógeno.

Fuentes apropiadas de ácidos nucleicos que codifiquen el polipéptido CD44 incluyen por ejemplo el ácido nucleico humano CD44 (y las secuencias proteicas codificadas) disponibles como GenBank Accesion Nos. LO5407 y CAA40133, respectivamente. Otras fuentes incluyen ácido nucleico humano CD44 y secuencias de proteínas y se muestran en GenBank Accesion No. U35632 y P160079, respectivamente, y se refieren aquí con la referencia en su integridad. Fuentes adecuadas de ácidos nucleicos que codifican polipéptido glucosiltransferasa incluyen por ejemplo el ácido nucleico glucosiltransferasa humano (y las secuencias de proteínas codificadas) disponibles como GenBank Accesion Nos. AJ276689 y CAB81779, respectivamente. Fuentes apropiadas de ácidos nucleicos que codifican polipéptido glucosidasa incluyen por ejemplo el ácido nucleico glucosidasa humano (y las secuencias de proteína codificadas) disponible como GenBank Accesion Nos. AJ278964 y CAC08178, respectivamente. El uso de otros polipéptidos CD44 glucosiltransferasa o glucosidasa, de CD44 y ácidos nucleicos conocidos en éste ámbito científico están también en el ámbito de este invento.

El sujeto es preferentemente un mamífero. El mamífero puede ser, e.g, un humano, un primate no humano, ratón, rata, perro, gato, caballo, o vaca. Adicionalmente, el sujeto sufre de o está en riesgo de desarrollar una proceso hematológico, (por ejemplo, leucemia), cáncer, o procesos inflamatorios, incluyendo procesos inflamatorios crónicos, (por ejemplo, artritis reumatoide).

Un mamífero que sufre de o está en riesgo de desarrollar una trastorno hematológico (por ejemplo, leucemia), cáncer, o procesos inflamatorios, incluyendo procesos inflamatorios crónicos, (e.g, artritis reumatoide) puede ser identificado mediante la detección de un factor de riesgo, por ejemplo, género, edad, historia previa de tabaquismo, predisposición familiar, atribuidos al proceso particular. Alternativamente, un mamífero que sufre de o está en riesgo de desarrollar un trastorno hematológico, (por ejemplo leucemia), cáncer, o procesos inflamatorios, incluyendo procesos inflamatorios crónicos, (por ejemplo, artritis reumatoide) puede ser identificado mediante métodos conocidos en el arte para diagnosticar el proceso particular.

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Métodos para tratar trastornos hematopoyéticos

También está descrito un método para tratar procesos hematopoyéticos, (por ejemplo, la leucemia, anemia aplásica, linfoma no Hodgkin, leucemia mieloide crónica, mieloma múltiple, leucemia linfocítica crónica, varios síndromes mielodisplásicos), en un sujeto, administrando un agente que disminuya el polipéptido HCELL en la superficie celular o la expresión del polipéptido HCELL, en el sujeto.

Además está descrito un método de tratar trastornos hematopoyéticos en un sujeto tomando sangre de un sujeto y poniéndola en contacto con uno o más agentes que se unan específicamente al polipéptido HCELL bajo las condiciones suficientes para formar un complejo en la sangre entre el agente y una célula sanguínea. Preferentemente la célula sanguínea es cancerosa. Más preferentemente la célula sanguínea es una célula leucémica. Se detecta la formación del complejo y el complejo es retirado de la sangre y por lo tanto la célula. La sangre es posteriormente reintroducida en el sujeto.

Agentes apropiados incluyen, una proteína, un polipéptido o molécula pequeña, que se una específicamente al polipéptido HCELL. Preferentemente el agente tiene que ser un anticuerpo o fragmento del mismo. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal. Por ejemplo, un agente es un anticuerpo HCELL. Alternativamente, un agente es un anticuerpo anti-CD44, o anticuerpo HECA-452. Específicamente, se quiere decir con unión que la interacción entre la célula y el agente es suficiente para formar un complejo. El complejo se puede separar de la sangre por métodos conocidos en el ámbito de trabajo, por ejemplo, la citometría de flujo.

También está descrito un método para tratar trastornos hematopoyéticos en un sujeto por medio de sangre de un sujeto y un polipéptido selectina, por ejemplo, selectina-E o selectina-L inmovilizada en una fase sólida, por ejemplo, vidrio, plástico o una membrana y poniendo en contacto la fase sólida con la sangre. En algunos casos la sangre está en movimiento. Se entiende por muestra de sangre en movimiento el que la muestra fluya de un lado a otro de la superficie de la membrana de una forma unidireccional. Las interacciones entre la muestra de sangre fluyendo y el ligando inmovilizado se pueden analizar bajo un amplio rango de condiciones de flujo definidas, que van desde incubación estática, pasando por niveles fisiológicos de flujo de cizalla, condiciones estáticas y aplicación seriada de condiciones estáticas y de flujo de cizalla, y hasta niveles de cizalla suprafisiológicos. Por ejemplo, una condición de flujo de cizalla es una fuerza de cizalla superior a 0,6 dinas/cm^{2}. Alternativamente, una condición de flujo de cizalla es una fuerza de flujo de al menos 2,8 dinas/cm^{2}. Adicionalmente, una condición de flujo de cizalla es una fuerza de cizalla de al menos 9,0 dinas/cm^{2}. En algunos casos, el fluido se mueve de un lado a otro de la membrana de forma que se alcanza una presión de cizalla fisiológica en la superficie. La sangre entonces es reintroducida en el
sujeto.

La extracción y reinfusión de la sangre en el sujeto se lleva a cabo mediante técnicas de plasmaféresis conocidas en el ámbito de trabajo.

También están descritos métodos para tratar procesos en un sujeto administrando al sujeto un agente que se una específicamente a la glucoproteína HCELL. El agente puede ser por ejemplo un polipéptido o una molécula pequeña. Preferentemente, el agente es un anticuerpo HCELL. Específicamente se quiere decir con Unión que la interacción entre la glucoproteína HCELL y el agente es suficiente para formar un complejo. Mediante la formación del complejo, el agente puede activar el complemento o mediar toxicidad celular, (por ejemplo, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) u otros efectos inmunológicos directos.

Alternativamente, un trastorno hematopoyético puede ser tratado administrando al sujeto un agente que incluya un primer y un segundo dominios. El primer dominio incluye un compuesto que se une específicamente a la glucoproteína HCELL. Preferentemente el primer dominio es un anticuerpo HCELL o fragmento del mismo. El segundo dominio incluye una toxina conectada por una unión covalente, por ejemplo, unión a péptido, al primer dominio. Una toxina incluye un compuesto capaz de destruir o matar selectivamente una célula con la que entra en contacto. Por "matar selectivamente" se entiende matar aquellas células a las que se une el primer dominio. Ejemplos de toxinas incluyen, toxina diftérica (DT) exotoxina Pseudomonas (PE), ricina A (RTA), gelonina, proteína pokeweed antiviral, y dodecandron.

El primer y segundo dominios se pueden presentar en cualquier orden y el agente puede incluir uno o más de cada dominio.

El sujeto es preferentemente un mamífero. El mamífero puede ser, por ejemplo, un humano, primate no humano, ratón, perro, gato, caballo o vaca.

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Métodos para diagnosticar o determinar la susceptibilidad a un trastorno hematológico

También está descrito aquí un método para diagnosticar o determinar la susceptibilidad a un trastorno hematológico en un sujeto por medio de poner en contacto una población celular derivada del sujeto con uno o más agentes que se unen específicamente a la glucoproteína HCELL. Específicamente unión significa que la interacción entre la célula y el agente es suficiente para formar un complejo. Se detecta un complejo célula/agente. La presencia de un complejo indica la presencia o la susceptibilidad a un trastorno hematológico en el sujeto.

Procesos hematológicos que se pueden detectar por este método incluyen por ejemplo, anemia, neutropenia, trombocitosis, procesos mieloproliferativos o neoplasias hematológicas.

El sujeto es preferiblemente un mamífero. El mamífero puede ser, por ejemplo, un humano, primate no humano, ratón, rata, perro, gato, caballo, o vaca.

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Métodos para determinar el pronóstico o eficacia del tratamiento de un trastorno hematológico

También está descrito aquí un método para determinar el pronóstico o la eficacia del tratamiento de un proceso hematológico en un sujeto poniendo en contacto una población celular derivada de un sujeto con uno o varios agentes que se unen específicamente a una glucoproteína HCELL. Específicamente unión significa que la interacción entre la célula y el agente es suficiente para formar un complejo. Se detecta un complejo célula/agente. La ausencia del complejo indica un pronóstico favorable o tratamiento eficaz del trastorno hematológico en el sujeto. La presencia del complejo indica un pronóstico desfavorable o tratamiento no-eficaz del trastorno hematológico en el sujeto.

Por "eficaz" se entiende que el tratamiento ha conseguido disminuir el proceso hematológico en el sujeto. Cuando el tratamiento se aplica profilácticamente, "eficaz" significa que el tratamiento retrasa o previene el trastorno hematológico.

Trastornos hematológicos que se pueden detectar por este método incluyen por ejemplo, anemia, neutropenia, trombocitosis, procesos mieloproliferativos o neoplasias hematológicas.

El sujeto es preferentemente un mamífero. El mamífero puede ser, por ejemplo, un humano, primate no humano, ratón, rata, perro, gato, caballo o vaca.

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Método para tratar trastornos inflamatorios

También descrito aquí está un método para tratar trastornos inflamatorios en un sujeto, administrando al sujeto una glucoproteína HCELL o fragmento de la misma.

Trastornos inflamatorios incluyen, por ejemplo, artritis reumatoide (AR), enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y asma.

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Compuestos farmacéuticos incluyendo polipéptidos HCELL, polipéptidos de fusión o ácidos nucleicos que codifican los mismos

Los polipéptidos HCELL, o moléculas de ácido nucleico que codifican estas proteínas de fusión y células aisladas como se describe aquí (también referido aquí como "Terapéutica" o "compuestos activos") y derivados, fragmentos, análogos y homólogos de los mismos, pueden ser incorporados a composiciones farmacéuticas adecuadas para ser administradas. Tales compuestos típicamente comprenden la molécula de ácido nucleico, proteína, célula o anticuerpo y un portador aceptable farmacéuticamente. Como se usa aquí, "portador aceptable farmacéuticamente" pretende incluir cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y agentes antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y los similares, compatibles con la administración farmacéutica. Se describen portadores apropiados en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciencies, un tratado de referencia en este campo, cuya referencia se incorpora aquí. Ejemplos preferidos de estos portadores o diluyentes incluyen, pero no se limitan a, agua, salino, soluciones de Ringer, solución dextrosa, y seroalbúmina humana al 5%. También se pueden usar liposomas y vehículos no acuosos como aceites fijados. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es perfectamente conocido en el ámbito de trabajo. Excepto en la medida en que un medio convencional o agente sea incompatible con el compuesto activo, el uso del mismo está contemplado. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios a las composiciones.

Los agentes activos puestos de manifiesto aquí también pueden ser formulados como liposomas. Los liposomas se preparan por métodos conocidos en el ámbito de trabajo, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688(1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); y U.S. Pat. Nos. 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con tiempo de circulación aumentado están desvelados en U.S. Patent No. 5.013.556.

Se pueden generar liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación fase-reversa con una composición de lípido que comprende fosfatidilcolina, colesterol, y PEG-derivada posfatidiletanolamida (PEG-PE). Los liposomas se extruden a través de unos filtros con un tamaño de poro definido para obtener unos liposomas con el diámetro deseado.

Un compuesto farmacéutico se formula para ser compatible con la vía de administración deseada. Ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (por ejemplo, tópica), transmucosa, y rectal. Soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: diluyente estéril como agua para inyección, solución salina, aceites fijados, polietilen glicoles, glicerina, propilen glicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos como alcohol benzilo metil parabenos; antioxidantes como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes como ácido etilendiamintetraacético (EDTA); tampones como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, como ácido hidroclórico o hidróxido sódico. La preparación parenteral se puede incluir en ampollas, jeringas desechables o viales multidosis hechos de cristal o de plástico.

Los compuestos farmacéuticos apropiados para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando sea soluble en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables o dispersión. Para administración intravenosa, portadores apropiados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL^{TM} (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tampón fosfato (PBS). En todos los casos el compuesto debe ser estéril y debería ser fluido con el propósito de que sea fácilmente cargable con jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe estar preservado contra la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o que contenga un medio de dispersión, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propileno, glicol y polietilen glicol líquido, y similares), y mezclas apropiadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, usando una cubierta como lecitina, para el mantenimiento del tamaño requerido de la partícula en el caso de la dispersión y por el uso de surfactantes. La prevención de la acción de microorganismos se puede conseguir mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabenos, clorambutol, fenol, ácido ascórbico, trimerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos en la composición, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como manitol, sorbitol o cloruro sódico. La absorción prolongada de compuestos inyectables se puede conseguir incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Se pueden preparar soluciones inyectables activas incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida a un solvente apropiado con uno o con una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido de una esterilización por filtrado. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables, los métodos de preparación son el secado por aspiración y el secado por congelación que resulta en un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional de una solución del mismo previamente filtrada estérilmente. Los compuestos orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Pueden incluirse en cápsulas de gelatina o comprimirse en pastillas. Para el objetivo de la administración terapéutica oral, se pueden incorporar excipientes al compuesto activo y usarse en forma de pastillas, comprimidos o cápsulas. Los compuestos orales pueden prepararse también usando un portador fluido para uso como elixir, cuando el compuesto en el portador fluido se aplique oralmente y realizar enjuagues en la boca y expectorarlo o tragarlo. Los agentes de unión compatibles farmacéuticamente, y/o materiales adyuvantes se pueden incluir como parte del compuesto. Las pastillas, píldoras, cápsulas, pastillas y similares cualquiera de los ingredientes siguientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante como celulosa microcristalina, chicle o gelatina; un excipiente como almidón o lactosa, un agente desintegrante como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz, un lubricante como estearato de magnesio o Sterodes; un deslizante como dióxido de silicona coloide; un agente edulcorante como sucrosa o sacarina; o un agente aromatizante como menta, metil salicilato o aroma de naranja.

Para la administración por inhalación, los compuestos se administran en la forma de un spray aerosol en un contenedor presurizado o un dispensador que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, en la formulación se utilizan penetrantes apropiados para atravesar la barrera. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en el arte, e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares, y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosa puede llevarse a cabo con el uso de sprays nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan como pomadas, ungüentos, geles o cremas como se conocen generalmente en el ámbito de trabajo.

Los compuestos también se pueden preparar en forma de supositorios (por ejemplo, con ingredientes convencionales de supositorios como mantequilla de cacao y otras glicerinas) o enemas de retención para la administración rectal.

Por ejemplo, los compuestos activos se preparan con portadores que protegerán el compuesto contra la rápida eliminación por el organismo, tales como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulada. Se pueden usar polímeros biodegradables, biocompatibles, como acetato de vinilo etileno, polianhidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de estas formulaciones serán evidentes para aquellos entrenados en el ámbito de trabajo. Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Suspensiones liposómicas (incluyendo liposomas dirigidos a infectar células con anticuerpos monoclonales frente a antígenos virales) también se pueden usar como portadores aceptados farmacéuticamente. Estos se pueden preparar de acuerdo a métodos conocidos por aquellos entrenados en el ámbito de trabajo, por ejemplo, como se describe en la U.S. Patent No. 4.522.811.

En algunos casos, los compuestos orales o parenterales están formulados en forma de unidad de dosis para facilidad de administración y uniformidad de las dosis. Forma de unidad de dosis, como se usa aquí, se refiere a unidades diferenciadas físicamente como dosis unitarias para el sujeto que va a ser tratado; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de unidad de dosis del invento están dictadas por y dependen directamente de las características singulares del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a alcanzar, y las limitaciones inherentes en el arte de componer tal compuesto activo para el tratamiento de
individuos.

Las moléculas de ácido nucleico del invento pueden ser insertadas en vectores y usadas como vectores de terapia génica. Se pueden administrar vectores de terapia génica a un sujeto mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, administración local (ver, por ejemplo, U.S. Patent No. 5.328.470) o por inyección estereotáxica (ver, por ejemplo, Chen, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia génica puede incluir el vector de terapia génica en un diluyente aceptable, o puede incluir una matriz de liberación lenta en la que se adsorbe el vehículo de administración del gen. Alternativamente, en los casos en que el vector de liberación del gen completo se pueda producir intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que produzcan el sistema de liberación del gen.

Se pueden preparar, si se desea, preparaciones de liberación continua. Ejemplos de preparaciones de liberación continua incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos configurados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación continua incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato), o poli(vinilalcohol), poliláctidos (U.S. Patent No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma etil-L-glutamato, etilen-vinil acetato no degradable, copolímeros ácidos de ácido glicólico láctico degradable como el LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero ácido de ácido glicólico láctico y acetato leuprolido), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras los polímeros como el acetato de etilen-vinilo y el ácido de ácido glicólico láctico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteína durante períodos de tiempo más cortos.

Los compuestos farmacéuticos se pueden meter en un contenedor, paquete, o dispensador junto a las instrucciones para su administración.

El invento será descrito más en detalle en los siguientes ejemplos, los cuales no limitan el campo del invento descrito en las afirmaciones.

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Ejemplo 1 Identificación de glucoproteínas en la membrana celular reactivas a HECA-452

Se realizó un SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) y análisis por Western blot de la presencia de epitopo(s) reactivos a HECA-452 en proteínas de la membrana de varias líneas celulares hematopoyéticas humanas.

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Preparación de las células

Se propagaron líneas celulares hematopoyéticas humanas (KG1a, HL60, RPMI-8402 y K562) y la línea celular endotelial de médula ósea BMEC-1 (Candal et al, 1996) en RPMI 1640/10%FBS/1%penicilina-estreptomicina (Life Technologies, Unc., Grand Island, NY). Se aislaron blastos circulantes en fresco de sangre periférica de pacientes en los que estos representaban >80% de todos los leucocitos circulantes, mediante centrifugación por gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque (1,077-1,0800 g/ml) (ICN Biomedicals, Inc; Aurora, OH). Se extrajeron células de médula ósea normales de los cuerpos vertebrales de donantes de órganos de cadáver obtenidas con el consentimiento de las familias y con la cooperación de el New England Organ Bank (Newton, MA). Las células monocucleares de la médula ósea se aislaron mediante centrifugación por gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque (1,077-1,0800 g/ml). Las células de la médula ósea se separaron en subpoblaciones CD34+ y línea+/CD34- usando una columna de enriquecimiento de progenitores humanos para selección negativa StemSepTM (Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver, BC Canada) o alternativamente, usando selección positiva para células CD34+ o para otras subpoblaciones de médula ósea (monocitos CD14+), granulocitos (CD15+), células B (CD19+) o células T (CD3+) mediante separación por microesferas inmunomagnéticas (Milteny Bistec, Auburn, CA). Se separaron poblaciones celulares CD34+/CD44+, CD34+/CD44- y CD34-/CD44+ mediante separación (sorting) en un aparato MoFlo (Cytomation) usando un anticuerpo monoclonal anti-CD34 (HPCA-2) (Beckton-Dickinson) conjugado con fluorocromo y anticuerpo monoclonal anti-CD44 (Hermes-1) (regalo de la Dra. Brenda Sandmaier, Fred Hutchinson Cancer Research Center).

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SDS-PAGE y Western Blots

Se aislaron preparaciones de membrana de HPCs como se ha descrito previamente (Sackstein y Dimitroff, 2000). Para SDS-PAGE y Western blotting, las preparaciones de membrana se diluyeron en tampón de muestra reductor (reducing sample buffer) y separadas en geles SDS-PAGE 6-9%. En los casos indicados, las proteínas de membrana también se trataron con N-glucosidasa F (Roche Molecular Biomedicals) (8 U/ml durante 24 h) o neuraminidasa de Vibrio Cholerae (Roche Molecular Biomchemicals (0,1 U/ml H/H/Ca++ durante 1 hora a 37ºC) como se ha descrito previamente (Sackstein y Dimitroff, 2000). Las proteínas de membrana resueltas se transfirieron a una membrana PVDF Sequi-blot^{TM} (Bio-rad, Inc., Hercules, CA) y bloqueadas con PBS/Tween-20/20%FBS durante 1 hora a 4ºC. Las membranas se incubaron con anticuerpo monoclonal de rata HECA-452 (Pharmingen, San Diego, CA) (1,2 \mug/ml PBS) o anticuerpo monoclonal 4H10 anti-PSGL-1 (Genetics Institute) durante 1 hora a Tª ambiente. Se realizaron inmunoblots de control isotipo con IgM de rata o IgG de ratón en paralelo para evaluar proteínas reactivas no específicas. Después de 3 lavados con PBS/0,1% Tween-20, las membranas se incubaron con anticuerpo secundario IgM anti-rata de conejo conjugado con PA (1:400) o con IgG anti-ratón de cabra conjugado con PA (1:8000) según el anticuerpo primario. Después se añadió el sustrato para PA, Western Blue® (Promega, Madison, WI), para revelar los blots.

Como se ilustra en la Figura 1A, se detectaron numerosas y distintas bandas reactivas a HECA-452 en el SDS-PAGE de las proteínas de membrana aisladas de células KG1a. A pesar de haber cargado 10 veces menos proteína de membrana de KG1a que de proteína de membrana de HL60, RPMI-8402 o K562, las células KG1a contenían marcadamente más tinción de HECA-452 mostrada como varias bandas de proteína. Sólo se detectó una amplia banda de aproximadamente 140 kDa en las células HL60, la cual corresponde a la especie de monómero de PSGL-1 por inmunoblot (Figura 1A). No hubo proteínas de membrana reactivas a HECA-452 en las células RPMI-8402 o H562, aunque se detectó PSGL-1 en Western Blots de estas células usando anticuerpo anti-PSGL-1, 4H10 (Dimitroff et al., 2000). Este hallazgo sugirió que estas células carecían del epitopo apropiado para la unión de HECA-452 y, como mínimo, la especie de PSGL-1 de unión a selectina-E.

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Ejemplo 2 Valoración de la unión a selectina-E de células hematopoyéticas humanas bajo condiciones de flujo de

\hbox{cizalla definidas}

Para examinar si la expresión de HECA-452 por líneas celulares hematopoyéticas humanas se correlaciona con la actividad ligando de selectina-E, se realizaron estudios en cámara de flujo de platos paralelos para valorar la unión a selectina-E bajo condiciones de flujo definidas.

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Utilizando Monocapas de Células

Se examinaron interacciones de adhesión mediadas por selectina-E, bajo presión de cizalla definida, entre monocapas de células hematopoyéticas y suspensiones de células CHO-E (células de ovario de hamster chino transfectadas con cDNA de longitud completa que codifica selectina-E humana) en flujo. CHO-E y constructor vacíos de vector (CHO-Mock) se mantuvieron en MEM 10%PBS/1% penicilina/estreptomicina (Life Technologies, Inc.) y HAM's F-12 (Cellgro, Inc.)/5%FCS/1%penicilina/estreptomicina, respectivamente. Se visualizó el contacto y rodamiento ("Tethering and rolling") de las células CHO-E sobre las monocapas de células hematopoyéticas en tiempo real por video microscopio usando la cámara de flujo de platos paralelos. Antes de la experimentación, las células CHO-E fueron recolectadas con EDTA 5 mM, lavadas 2 veces con HBSS y suspendidas 1x10^{7}/mL en HBSS/10 mM HEPES/2 mMCaCl_{2} (H/H/CC). Se prepararon grupos control negativos mediante la adición de EDTA 5 mM al tampón ensayo H/H (para quelar el Ca++ requerido para la unión), tratando células CHO-E con anticuerpos anti-selectina-E (clona 68-5H1 1; Pharmingen) (10 \mug/ml, o usando transfectantes vacíos de vector (células CHO falsas o CHO-Mock). Para preparar monocapas de células hematopoyéticas confluentes >90%, se centrifugaron células (KG1a, HL60, K562, o RPMI 8402) a 2x10^{6}/ml en RPMI1640 sin BicarbonatoNa/2%FBS en platos de 6 pocillos a 5x10^{6}/pocillo y luego fijadas con gluteraldhido al 3%. Los grupos aldehído reactivos se bloquearon con lisina 0,2M, y las células sembradas se suspendieron H/H/Ca++. En paralelo, también se pretrataron células con neuraminidasa de Vibrio Cholerae (0,1 \mug/ml H/H/Ca++ durante 1 hora a 37ºC) o con endopeptidasa O-sialoglucoproteína (OSGE) (60 \mug/ml H/H/Ca++ durante 1 hora a 37ºC; Achúrate Chemicals, Westbury, NY), respectivamente. Se colocaron monocapas de células en una cámara de flujo de platos paralelos y se prefundieron células CHO-E/Mock dentro de la cámara. Después de dejar que las células CHO-E o CHO-Mock entraran en contacto con las monocapas celulares, la tasa de flujo se ajustó para ejercer una presión de cizalla de 2,8 dinas/cm^{2}. El número de células CHO-E/Mock en rodamiento sobre cada monocapa se midió en un marco de 5 campos independientes a un aumento de 10X en múltiples experimentos. Se realizaron un mínimo de 3 experimentos y los resultados se expresaron como media\pmdesviación estándar.

Alternativamente, usando BMEC (células endoteliales de médula ósea) primarias humanas aisladas en fresco cultivadas como se ha descrito previamente (Rafii et al., 1994), se sembraron BMEC de subcultivos de no más de 5 pases se sembraron a x10^{5} células/pocillo en platos de 6 pocillos hasta llegar a 90-100% de confluencia, estimuladas con IL-1\alpha (40 U/ml) durante 4 horas para activar la expresión de selectina-E (la expresión de la cual se midió por análisis de citometría de flujo). Los cultivos en vivo se colocaron entonces en la cámara de flujo de platos paralelos y se prefundieron las células hematopoyéticas (10^{7}/ml en H/H/Ca++) en la cámara sobre las BMEC. El "tethering and rolling" (contacto y rodamiento) de las células hematopoyéticas se visualizó a 2,8 dinas/cm^{2}. BMEC no activadas con IL-1\alpha y BMEC activadas con IL-1\alpha tratadas con 10 \mug/ml de anticuerpo monoclonal anti selectina-E (clona 68-5H11) sirvieron como controles para confirmar la especificidad de la adhesión mediada por selectina-E. El rodamiento celular se cuantificó y expresó como se ha descrito anteriormente.

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Utilizando Inmunoprecipitados Inmobilizados

Se imunoprecipitó CD44 de lisados celulares no tratados o de lisados tratados con N-glucosidasa-F (0,8 U/ml), neuraminidasa de Vibrio Cholerae (0,1 U/ml) o una fucosidasa-L (80 mU/ml), y se inmunoprecipitó PSGL-1 de lisados celulares no tratados como se ha descrito previamente (Sackstein y Dimitroff, 2000; Dimitroff et al., 2000).

Los inmunoprecipitados de CD44 o PSGL-1 se pulverizaron en unas placas de petri, fijados con gluteraldehído al 3% e incubados en lisina 0,2M para bloquear los grupos aldehído no reactivos, y posteriormente la unión inespecífica se previno incubando en FBS al 100% durante 1 hora a Tª ambiente. Las gotas de inmunoprecipitado fijadas se trataron también con neuraminidasa de Vibrio cholerae (en medio de ensayo 0,1 U/ml), que se colocó cubriendo las gotas y se incubó a 37ºC durante 1 hora. Los platos con las proteínas se colocaron en la cámara de flujo de platos paralelos y se perfundieron células (2 x 10^{6}/ml H/H/Ca++) CHO-E, CHO-P (CHO transfectadas establemente con cDNA humano que codifica selectina-P de longitud completa), células CHO-P con anticuerpo monoclonal con función de bloqueo anti-selectina-P (clona AK-4; Pharmingen) (10 \mug/ml), células CHO-E tratadas con anticuerpos con función de bloqueo anti-selectina-E (10 \mug/ml) (clona 68-5H1 1) o transfectantes falsos, a una velocidad de flujo de 0,2 ml/min hasta que las células contactaron con el sustrato. Entonces se incrementó la velocidad de flujo hasta alcanzar una presión de cizalla de 2,8 dinas/cm^{2}. Se determinó la frecuencia de células rodando por campo de aumento 100x, y los datos se expresaron como media\pmdesviación estándar de 8 campos visualizados de un mínimo de 3 experimentos.

Se observó la toma de contacto y rodamiento (tethering and rolling) de células de ovario de hamster chino expresando selectina-E (CHO-E) en monocapas de células KG1a y HL60 fijadas con gluteraldheído a 2,8 dinas/cm^{2} (Figura 1B). Células CHO transfectadas en falso (CHO-mock) no mostraron rodamiento. El rodamiento de las células CHO-E fue 2 veces mayor sobre las células KG1a que sobre las células HL60 y se inhibió completamente añadiendo EDTA 5 mM al medio de ensayo, preincubando las células CHO-E con anticuerpos anti-selectina-E o pretratando las células KG1a o HL60 con neuraminidasa de Vibrio cholerae (que elimina los ácidos siálicos terminales). No hubo actividad ligando en las líneas celulares RPMI-8402 y K562, cuyas proteínas de membrana no contienen epitopos HECA-452. Sorprendentemente, la actividad ligando para selectina-E de las células KG1a y HL60 no se inhibió incubando las células con HECA-452 a 50 \mug/ml y no se eliminó mediante pretratamiento con OSGE (Figura 1B), aunque la bioactividad de OSGE se confirmó por la desaparición del epitopo OSGE-sensible, QBEND-10, en las células CD34 KG1a medido por citometría de flujo.

Para analizar la interacción entre HPCs humanas y selectina-E expresada naturalmente en células de importancia fisiológica, se utilizaron células endoteliales de la microvasculatura de la médula ósea aisladas en fresco (BMEC). Se observó bajo condiciones de flujo, el rodamiento de células KG1a y HL60 sobre monocapas de BMECs activadas con IL-1\alpha. Coherente con los resultados de los experimentos usando células CHO-E para demostrar la actividad ligando de selectina-E de HPC, las células KG1a poseían una capacidad para rodar sobre selectina-E en BMECs activadas con IL-1\beta\alpha 4 veces mayor que HL60, mientras que células RPMI-8402 y K562 poseían una mínima actividad ligando selectina-E (Figura 2). La actividad ligando para selectina-E de las células KG1a y HL60 no se observó sobre BMEC activadas con IL-1\beta\alpha o sobre BMEC activadas con IL-1\alpha tratadas con un anticuerpo monoclonal con función bloqueante anti-selectina-E.

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Ejemplo 3 Valoración de glucoproteínas ligandos para selectina-E en células hematopoyéticas humanas usando la prueba de blot rolling assay

Para examinar la actividad ligando de todas las proteínas de membrana de KG1a reactivas a HECA-452, se evaluaron las interacciones entre células enteras que expresan selectina y proteínas inmovilizadas en Western blots bajo condiciones de flujo (Dimitroff et al., 2000).

La prueba de blot rolling se realizó como se ha descrito previamente (Dimitroff et al., 2000). Brevemente, se aislaron transfectantes CHO-E, CHO-P o CHO-Mock como se ha descrito arriba, se lavaron 2 veces con HBSS y suspendieron a 10^{7}/ml en HBSS/HEPES 10 mM/CaCl_{2}2 mM (H/H/Ca++)/glicerol 10%. Los Western blots preparados en membranas HPC teñidas con HECA-452 se volvieron transparentes incubándolos en H/H/Ca++/glicerol 10%. Los membranas se colocaron luego en la cámara de flujo de platos paralelos, y se prefundieron los transfectantes CHO (2x10^{6}/ml) en la cámara. Después de dejar que las células entraran en contacto con las membranas teñidas, la tasa de flujo se ajustó para ejercer una presión de cizalla de 3,8 dinas/cm^{2}. Se consideró la viscosidad del medio de ensayo con glicerol al 10% para calcular los valores de presión de cizalla. El número de células en rodamiento sobre cada región de bandas y entre bandas inmunoteñidas fue cuantificado con un aumento de 100x dentro de cada campo de visión en un monitor de vídeo usando marcadores de peso molecular (Kaleidoscope Molecular Weight Markers, Bio-Rad Lab.; See Blue® de Novex, Inc.) como guías para ayudar a alinear y visualizar los pesos moleculares aparentes de las proteínas de interés. Se realizaron un mínimo de 3 experimentos y los resultados se expresaron como media\pmDE de células en rodamiento/campo de 100x aumentos. Se prepararon controles negativos mediante alguno de los siguientes métodos: añadiendo EDTA 5 mM a medio CHO-E H/H para quelar el Ca++ necesario para la unión, pretratando células CHO-E con anticuerpos anti selectina-E (clona 68-5H1 1; 10 \mug/ml) o valorando la capacidad de las células CHO-Mock para interaccionar con las proteínas inmovilizadas.

Se observó actividad ligando para selectina-E en las bandas teñidas con HECA-452 en 100, 120, 140, 190 y 220 kDa, pero no a 74 kDa (Figura 3A). Los transfectantes CHO-Mock no mostraron interacciones con ninguna banda. Se demostró la especificidad de selectina-E por la eliminación del rodamiento de las células CHO-E en presencia de EDTA 5 mM o anticuerpos bloqueantes de la función de selectina-E. En las células HL60, el rodamiento de CHO-E se observó solamente sobre la amplia banda de 145 kDa teñida con HECA-452 (por ejemplo, PSGL-1/CLA). Para determinar si los determinantes de unión a selectina-E residen en glucanos-N, la proteína de membrana de KG1a se trató con N-glucosidasa-F. Las proteínas De-N-glucosiladas se separaron por SDS-PAGE y se analizaron para reactividad con HECA-452 y actividad ligando para selectina-E. El tratamiento con N-glucosidasa-F disminuyó marcadamente la tinción con HECA-452 (Figura 3B) y suprimió completamente el rodamiento de células CHO-E sobre todas las proteínas en la membrana, indicando que en las células KG1a todos los determinantes de glucoproteínas para la unión con selectina-E están expresados exclusivamente en los N-glicanos.

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Ejemplo 4 Identificación y caracterización de HCELL

Se buscó la expresión de epitopos HECA-452 en la proteína de membrana de 98 kDa de KG1a después de escisiones secuenciales con geles SDS-PAGE con diferentes porcentajes de acrilamida. Después de cada ronda de purificación SDS-PAGE, la proteína de 98 kDa mantenía su capacidad de sostener el rodamiento de linfocitos en la prueba de flujo hidrodinámico basada en blot. Después de tres rondas de purificación con SDS-PAGE, se observó una tenue banda a \sim190 kDa teñida con HECA-452, añadida a la banda de 98 kDa, lo que sugiere que alguna agregación de la proteína de 98 kDa debe ocurrir en el procedimiento de aislamiento. El fragmento de gel de 98 kDa teñido con azul Coomassie se remitió para análisis de fragmentos de péptidos digeridos con tripsina mediante espectrometría de masas. El mapa del péptido primario correspondía con el de la forma estándar de CD44, previamente mostrada expresada en células KG1a. Usando Acs monoclonales frente a CD44 (A3D8 IgG de ratón, o Hermes-1 IgG de rata) junto a HECA-452, se tiñó la banda de 98 kDa después del tercer aislamiento del gel con HECA-452, A3D8 o Hermes-1 (Fig 8). Cada anticuerpo detectó la especie de 98 kDa así como la débil banda a \sim190 kDa, que se piensa que representa proteína agregada. La correlación entre los anticuerpos monoclonales HECA-452 y anti-CD44 indicaba que la glucoforma de CD44 en KG1a contiene los determinante(s) carbohidratos HECA-452.

Para distinguir la banda PSGL-1/CLA celular de KG1a de otras bandas reactivas, se tiñeron blots de PSGL-1 y de otras proteínas de membrana de KG1a purificados por inmunoafinidad con HECA-452 o con anti-PSGL-1 (Figura 3C). Las células KG1a expresan las isoformas monómero y dímero de PSGL-1, representadas por las proteínas reactivas a HECA-452 de 140 y 220 kDa (Figura 3C). Así, las bandas a 100, 120 y 190 kDa reactivas a HECA-452 que sostienen el rodamiento de células CHO-E, corresponden a proteínas no-PSGL-1.

Para determinar si las modificaciones de CD44 de tipo N-glucano específicas confieren actividad ligando para selectina-E, se evaluaron CD44 purificados por inmunoafinidad de proteínas de KG1a para comprobar su capacidad de actuar como ligando para selectina-E en ensayos de blot rolling. Como se muestra en la figura 3D, CD44 KG1a mostró reactividad frente a HECA-452 y poseía actividad ligando para selectina-E. El tratamiento de CD44 con N-glucosidasa-F redujo marcadamente la reactividad a HECA-452 y suprimió completamente el rodamiento de células CHO-E (Figura 3D). La inmunoprecipitación exhaustiva de CD44 (3 rondas) resultó en la desaparición de la molécula de CD44 teñible a 100 kDa (Hermes-1 inmunoblot y HECA-452 inmunoblot) y de toda la actividad ligando para selectina-E en las bandas de 100 kDa y 190 kDa (Figuras 4A y 4B). Además hubo un descenso del 55% en la actividad ligando para selectina-E en la banda de 120 kDa después de tres rondas de inmunoprecipitación (Figura 4B).

Notablemente, no hubo diferencia en la tinción con HECA-452 ni en la actividad ligando a selectina-E de la especie monómero de PSGL-1 de 140 kDa después de la extracción de CD44.

Para explorar más la actividad ligando a selectina-E de CD44, inmunoprecipitamos directamente CD44 de líneas celulares hematopoyéticas humanas y analizamos la unión de células CHO-E en la cámara de flujo de platos paralelos. Mientras el CD44 aislado de líneas celulares hematopoyéticas humanas HL60, K562 y RPMI 8402 no sostuvo ningún rodamiento de células CHO-E, CD44 de KG1a exhibió actividad ligando para selectina-E en un rango de flujo. Significativamente, se observó mayor rodamiento sobre CD44 de KG1a no tratada, que sobre CD44 KG1a tratada con N-glucosidasa-F, sobre CD44 KG1a tratada con L-fucosidasa, sobre proteína de membrana de KG1a tratada con neuraminidasa de Vibrio Cholerae o inmunoprecipitados con Ac isotipo (control) (Figura 5A). Además, comparado con una cantidad equivalente molecular de inmunoprecipitado KG1a PSGL-1, CD44 mostró marcadamente mayor actividad ligando para selectina-E a 2,8 dinas/cm^{2} (p<0,001) (Figura 5A). Sin embargo a una presión de cizalla menor, de 0,6 dinas/cm^{2}, el rodamiento de células CHO-E sobre PSGL-1 fue equivalente al de CD44. Estos datos sugieren que PSGL-1 y CD44 tienen contribuciones solapadas para la unión a selectina-E que se superponen a presión de cizalla baja, pero el enlace de CD44 a selectina-E predomina a presión de cizalla fisiológica más alta. Hay que hacer notar que células CHO transfectadas con selectina-P rodaron sobre PSGL-1 de KG1a, pero no sobre CD44KG1a, indicando que CD44 no es un ligando para selectina-P (Figura 5B). En todos los experimentos, células CHO control negativas (transfectantes CHO falsos y células CHO-E o CHO-P tratadas con AcsMo anti-selectina-E o anti-Selectina-P, respectivamente bloqueantes de función) no entraron en contacto ni rodaron sobre ninguna de las
proteínas.

Para determinar si el CD44 expresado de forma natural en HPCs funciona como un ligando de selectina-E, investigamos la distribución de reactividad HECA-452 y la actividad ligando para selectina-E de CD44 expresadas en células inmaduras de médula ósea humana CD34+ y más maduras (CD34-/línea+) (incluyendo poblaciones enriquecidas para monolitos (CD14+), granulocitos (CD15+), y linfocitos (células B (CD19+) y células T(CD3+). Sorprendentemente, aunque los inmunoprecipitados de KG1a con Hermes-1 en SDS-PAGE revelaban 3 bandas (100, 120 y 190 kDa), sólo se inmunoprecipitó una banda simple de 100 kDa con CD44 teñida con HECA-452 de las células CD34+ y que funcionó como ligando para selectina-E (Figura 6A). Se obtuvieron resultados similares si las células CD34 se enriquecían por selección negativa o selección positiva. Se utilizó incluso proteína de membrana de células de línea + 10 veces en exceso para inmunoprecipitación con CD44, y todavía no se obtuvo ni tinción de CD44 con HECA-452 ni actividad ligando de CD44 para selectina-E (Figura 6A). Además, inmovilizados en plástico; sólo los inmunoprecipitados de células CD34+/CD44+ sostuvieron el rodamiento de células CHO-E mientras que el inmunoprecipitado con CD44 de células CD34- no poseía ninguna actividad ligando para selectina-E.

Para analizar mejor la expresión y estructura del CD44 reactivo a HECA-452 en las células hematopoyéticas humanas, se evaluó la expresión de HCELL en blastos leucémicos nativos. Se detectaron cuatro bandas teñidas con HECA-452 (74, 100, 140 y 190 kDa) en blastos de leucemia mieloide aguda (LMA) (subtipo M5) (Figura 6B). La tinción con HECA-452 se eliminó por completo en la región de 100 kDa después del tratamiento con N-glucosidasa-F, mientras que las bandas de 74 y 140 kDa tenían una tinción persistente y la banda de 100 kDa se tiñó a un peso molecular aparentemente más reducido (Figura 6B). Cuando el inmunoprecipitado de CD44 de proteína de membrana de LMA (M5) se trató con N-glucosidasa-F, la reactividad con HECA-452 así como la actividad ligando para selectina-E se abolieron completamente. De forma similar al inmunoprecipitado de KG1a con CD44, CD44 de LMA (M5) mostró una isoforma menor a 120 kDa detectada con HECA-452, pero la banda principal y proteína activa biológicamente fue la isoforma de 100 kDa de CD44. También se inmunoprecipitó CD44 de blastos de LMA indiferenciada (M0), una LMA con maduración (M1) y una forma atípica de leucemia mieloide crónica (LMC) (BCR/ABL-). Hay que hacer notar que la expresión de epitopos reactivos a HECA-452 en el inmunoprecipitado de CD44 se correlacionaba directamente con la capacidad de sostener el rodamiento de células CHO-E (Figura 6D). La expresión de CD44 (AcMo Hermes-1) en estas leucemias fue equivalente (>90% células positivas teñidas para citotometría de flujo), lo que indica además que la capacidad para interaccionar con selectina-E dependía de la elaboración de glucosilaciones reactivas para HECA-452. Ademas, dado que CD44 se expresa también en células no hematopoyéticas, analizamos CD44 expresado en la línea celular de endotelio de médula ósea humana BMEC-1. Aunque BMEC-1 expresaba niveles de CD44 altos (Figura 6E), el CD44 de estas células no tenía reactividad HECA-452 y no poseía ninguna actividad ligando para selectina-E (Figura 6D).

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Ejemplo 5 Valoración de glucoproteínas ligandos para selectina-L de células hematopoyéticas humanas usando un blot rolling assay

Para examinar la actividad ligando para selectina-L de todas las glucoproteínas de membrana de KG1a reactivas a HECA-452, se valoró la interacción adhesiva bajo flujo de cizalla entre células que expresan selectina y proteínas inmobilizadas en Western Blots.

Se aislaron linfocitos que expresan selectina-L como se ha descrito previamente (Oxley, S.M. & Sackstein, R. (1994). Blood. 84: 3299-3306, Sackstein, R., Fu, L. y Allen, K.L. (1997) Blood. 89: 2773-2781), lavados dos veces con HBSS y suspendidos a 2x10^{7} en HBSS/HEPES 10 mM/CaCl_{2} 2 mM (H/H/Ca++)/glicerol 10%. El material celular lisado se separa por SDS-PAGE y se transfiere a una membrana PVDF bajo condiciones estándar de blotting. Los Western blots de las preparaciones de membrana de KG1a teñidos con HECA-452, A3D8 o Hermes-1 se convirtieron en transparentes, al incubarlos en H/H/Ca++/glicerol 10%. Para estudiar las interacciones de adhesión mediadas por selectina-L, las membranas se colocaron en la cámara de flujo de platos paralelos y se prefundieron los linfocitos dentro de la cámara con una presión de cizalla de 2,3 dinas/cm^{2} y las interacciones de adhesión se observaron por videomicroscopio y se analizaron a tiempo real.

Se cuantificó el número de linfocitos rodando sobre y entre las regiones de bandas en 5 campos diferentes bajo un aumento de 200x en un monitor de vídeo, utilizando marcadores de peso molecular como guías para alinear y visualizar las proteínas de interés. Se prepararon controles negativos añadiendo EDTA 5 mM al tampón de ensayo de los linfocitos para quelar el Ca++ requerido para la unión, usando linfocitos tratados con PMA (50 ng/ml, el cual induce el desprendimiento de selectina-L (Oxley, S.M. & Sackstein, R. (1994). Blood. 84: 3299-3306), o tratando los linfocitos con AcsMo anti-selectina-L 810 \mug/ml) para bloqueo funcional para verificar la intervención exclusiva de selectina-L.

Se perfundieron los Western blots de proteínas de membrana de KG1a teñidos con HECA-452 (Oxley, S.M. & Sackstein, R. (1994). Blood. 84: 3299-3306, Sackstein, R., Fu, L. y Allen, K.L. (1997) Blood. 89: 2773-2781) sobre las membranas para evaluar la actividad ligando para selectina-L sobre las bandas separadas inmunoteñidas. Se observó contacto y rodamiento de los linfocitos dependiente de flujo (a fuerza de cizalla de 2,3 dinas/cm^{2}) sobre las bandas teñidas con HECA-452 de 98, 120 y 130 kDa que fue dependiente de selectina-L. Para confirmar que el contacto y rodamiento dependiente de flujo de los linfocitos era dependiente de selectina-L, el experimento también se realizó en presencia de EDTA 5 mM, y pretratando los linfocitos con Acs monoclonales bloqueantes anti-selectina-L o PMA (Fig 7D). No se demostró ninguna actividad ligando para selectina-L en ninguna de las zonas de la membrana no teñidos con HECA-452 (Fig 7D). La banda de 98 kDa teñida con HECA-452 mostraba la mayor actividad ligando para selectina-L (tanto como 6 veces más alta comparado con las otras bandas), y esta banda es también la principal proteína portadora de N-glicanos expresada en células KG1a (Fig. 7C). Varias de las bandas reactivas a HECA-452 no poseían actividad ligando para selectina-L, sugiriendo las modificaciones estructurales asociadas a estas proteínas a estas proteínas reactivas a HECA-452 no eran suficientes para la actividad ligando para selectina-L. La actividad ligando para selectina-L estaba ausente en los Western blots de proteínas de membrana de HL60, K562 y RPMI 8402, a pesar de la evidencia de bandas reactivas a HECA-452. La tinción con HECA-452 no interfirió con la adherencia de linfocitos mediada por selectina-L a proteínas relevantes de KG1a inmobilizadas en ensayos de Western blot de flujo hidrodinámico.

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Ejemplo 6 Actividad ligando para selectina-L del inmunoprecipitado CD44 de KG1a (CD44)

Los inmunoblots de CD44 KG1a en lisado celular total de células KG1a usando el AcMo Hermes-1 mostraron una banda de 98 kDa, así como bandas de 120 y 130 kDa las cuales pueden reflejar las isoformas que previamente se designaban CD44R2 y CD44R1, respectivamente (Fig. 9) (Dougherty, G.J., Lansdorp, P.M., Cooper, D.L. & Humphries, R.K. (1991). J. Exp. Med. 174:1-5). Una señal débil a 190 kDa que se detectó con Hermes-1 y A3D8, la cual puede reflejar una forma condroitín sulfato de CD44 modificada (Fig 9) (Jalkanen, S.T., Jalkanen, M., Bargatze, R., Tammi, M., & Butcher, E.C. (1988). J. Immunol.141: 1615-1623). Para analizar si esta glucoforma de CD44 exhibía actividad ligando para selectina-L, se inmunoprecipitó KG1aCD44 de células KG1a con AcMo Hermes-1 y luego se realizaron blot rolling assays sobre inmunoblots de CD44 teñidos con Hermes-1 o con HECA-452. Sorprendentemente, el CD44 inmunoprecipitado con Hermes-1 que luego se inmunotiñó con Hermes-1 sólo mostró las especies de 98 kDa y 190 kDa, pero no las especies de 120 y 130 kDa. Por otro lado, CD44 inmunoprecipitado con Hermes-1 que se inmunotiñó con HECA-452 ilustró no sólo las especies de 98 kDa, sino también las especies de 120, 130 y 190 kDa (Fig 9). En todos los casos sin embargo, sólo la proteína de 98 kDa reactiva a HECA-452, reactiva a Hermes-1 sostuvo interacciones ligando para selectina-L (Fig 9).

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Ejemplo 7 Dependencia de N-glucosilación para la actividad ligando a selectina-L y para la inmunodetección mediante HECA-452

Para examinar la dependencia de la actividad ligando a selectina-L de la N-glucosilación, la inmunoprecipitación de KG1a CD44 con Hermes-1 se realizó también en proteínas de membrana KG1a pretratadas con N-glucosidasa-F. Como se representa en la Fig. 10A, el tratamiento con N-glucosidasa-F eliminó por completo la tinción con HECA-452 de la especie de 98 kDa y abolió todo el contacto y rodamiento (tethering and rolling) de los linfocitos sobre la membrana mediado por selectina-L. Se evaluó la actividad ligando de todos los rangos de peso molecular en la muestra tratada con N-glucosidasa-F y se observó algún cambio en el peso molecular con la des-N-glucosilación de la glucoproteína. Después de la des-N-glucosilación no hubo bandas para demostrar la actividad ligando para
selectina-L.

Para analizar más la actividad ligando para selectina-L de CD44, realizamos ensayos de Stamper-Woodruff usando inmunoprecipitados de células KG1a inmunoprecipitadas con CD44 o con control isotipo (IgG de rata) que fueron colocados sobre portaobjetos como se ha descrito (Sackstein, R. & Dimitroff, C.J. (2000). Blood. 96, 2765-2774). Sirvieron como controles negativos los experimentos utilizando CD44 tratado cop neuraminidasa de Vibrio cholerae, linfocitos tratados con AcMo anti-selectina-L (HRL-1 para linfocitos de rata; LAM1-3 para linfocitos humanos), o co-incubación con EDTA 5 mM. Inmunoprecipitado, KG1a CD44 sostuvo adherencia linfocitaria mediada por selectina-L (362\pm15 células unidas/campo, contados 5 campos, 3 portaobjetos por experimento, 2 experimentos), mientras que no se observó unión con inmunoprecipitado con control isotipo o con inmunoprecipitado de KG1a CD44 tratado con neuraminidasa o tratamientos con EDTA/anti-selectina-L (<10 células/campo). HECA-452 no bloqueó la adherencia de linfocitos a CD44 aislado de KG1a, células intactas KG1a o proteínas de membrana de KG1a, a pesar de concentraciones tan altas como 100 \mug/ml. Estos resultados corroboraron y confirmaron los datos de los estudios con la cámara de flujo de platos paralelos arriba descritos.

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Ejemplo 8 Funciones de CD44 KG1a (HCELL) como un ligando de selectina-L en células hematopoyéticas humanas aisladas en fresco

Se examinó la actividad HCELL en las células monocucleares de la médula ósea mediante la prueba de Stamper-Woodruff de poblaciones separadas de células CD34+/CD44+, CD34+/CD44-, CD34-/CD44+ y CD34-/CD44-. La actividad HCELL estaba ausente en todos los subtipos CD44-, pero estaba presente en más del 80% de células CD34+/CD44+ y sólo \sim1% de células CD34-/CD44+. Dado que los estudios bioquímicos de CD44 en células de médula ósea CD34+ humanas normales estaban limitados por las dificultades para adquirir cantidades suficientes de células para dichos análisis, se examinó la actividad HCELL de CD44 aislada de blastos en los que se conocía la expresión de HCELL (Sackstein, R. & Dimitroff, C.J. (2000). Blood. 96, 2765-2774). Se analizaron blastos de 11 leucemias: nueve mielodes (dos indiferenciadas (M0), dos sin maduración (M1), una con maduración (M2), dos mielomoníticas (M4) y dos monolíticas (M5)), una linfoide aguda (pre-B) y una bifenotípica. Con excepción de una M0, todos los blastos mostraron actividad HCELL. Se analizó la actividad ligando para selectina-L de CD44 aislado de blastos de cinco de las leucemias descritas arriba: una M0 con carencia de actividad HCELL y las otras con actividad HCELL (la leucemiabifenotípica, la otra M0, una M4, y una M5). En pruebas de blot rolling de proteína de membrana total, se observó contacto y rodamiento de linfocitos sobre la banda de 98 kDa en todas las leucemias que expresaban HCELL, pero no se observó rodamiento sobre ninguna proteína de membrana en la M0 con ausencia de actividad HCELL. Se inmunoprecipitó CD44 de cada una de estas células, y, similar a CD44 de KG1a, la isoforma predominante fue una especie de 98 kDa. Un ejemplo representativo de estos datos, de una leucemia M4, se muestra en la Fig 10B. Se verificó el requerimiento de estructuras N-glucosiladas en CD44 para la reactividad HECA-452 y la actividad ligando para selectina-L mediante pretratamiento de las proteínas de membrana de las leucemias con N-glucosidasa-F (Fig. 10B). A la inversa, aunque los blastos M0 HCELL(-) poseían CD44 equivalente a aquellos especímenes de leucemia HCELL(+) (como se determinó por citometría de flujo y por Western blot usando el Ac Hermes-1), el CD44 de estas células no fue reactivo con HECA-452 y no exhibía actividad ligando para selectina-L. En conclusión, estas observaciones indicaban que la glucoforma de CD44 que exhibe actividad HCELL no era una característica exclusiva de la línea celular KG1a, sino que representaba una modificación fisiológica de CD44 presente en blastos de algunos subtipos de leucemias. Estas observaciones añadieron más evidencia al componente de N-glucanos expresados en CD44.

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Ejemplo 9 La actividad ligando para selectina-L de KG1a es independiente de sulfatación

Para determinar si CD44 está sulfatado en las células KG1a, se marcaron células en cultivo KG1a metabólicamente con [^{35}S]-SO_{4}. El inmunoprecipitado CD44 de estas células estaba de hecho sulfatado (Fig 11A). Para probar si la sulfatación era crítica para la actividad ligando para selectina-L de CD44, se pretrataron células KG1a con bromelina 0,1%, una proteasa que elimina toda la actividad HCELL de KG1a (Sackstein, R. & Dimitroff, C.J. (2000). Blood. 96, 2765-2774) y también elimina CD44 de la superficie celular (Hale, L.P. & Haynes, B.F. (1992). J. Immunol 149: 3809-3816). Después de la digestión con bromelina, la reexpresión de HCELL requiere síntesis proteica de novo, y la proteína sintetizada en presencia de clorato (un inhibidor metabólico de proteína y de sulfatación de carbohidratos) no está sulfatada (Sackstein, R., Fu, L. y Allen, K.L. (1997). Blood. 89: 2773-2781). Por lo tanto, se trató KG1a con bromelina y se confirmó la eliminación de CD44 por citometría de flujo. Las células KG1a se cultivaron en ausencia o presencia de clorato sódico 10 mM durante 24 horas y las células se radiomarcaron metabólicamente durante las últimas 8 horas de incubación con [^{35}S]-SO_{4} en medio CRCM-30 deficiente en sulfato. Como se ilustra en Fig 11A, la incorporación de [^{35}S]-SO_{4} en el inmunoprecipitado CD44 (Hermes-1) se inhibió completamente en las células tratadas con clorato. Este efecto del clorato fue específico para la incorporación de sulfato y no una inhibición general de la síntesis de la proteína CD44, ya que el radiomarcaje metabólico [^{35}S]-metionina/cisteína de CD44 fue idéntico en las poblaciones celulares tratadas y no tratadas con clorato.

Se realizaron entonces pruebas de blot rolling sobre inmunoprecipitado CD44 de células control y tratadas con clorato. Se comprobó la actividad ligando para selectina-L de CD44 sulfatado y no sulfatado (Fig 11B). Estos datos experimentales confirmaron los resultados de nuestros estudios previos que demuestran la independencia de sulfatación de la actividad de HCELL (Sackstein, R., Fu, L., y Allen, K.L. (1997). Blood. 89: 2773-2781). Sorprendentemente, no se evitó el reconocimiento de CD44 libre de sulfato por HECA-452 (Fig 11B). Estos datos muestran que la sulfatación no era una característica crítica para que el epitopo CD44 de KG1a sea reconocido por el anticuerpo monoclonal
HECA-452.

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Ejemplo 10 Actividades diferenciales de adherencia a selectina-L de ligandos de selectina-L de células hematopoyéticas humanas, HCELL y PSGL-1 A. Métodos generales

Células, Anticuerpos y Enzimas. Líneas celulares hematopoyéticas humanas KG1a (leucémica mieloide, HCELL+/PSGL-1+), HL60 (leucemia promielocítica, HCELL-/PSGL-1+, RPMI 8402 (leucemia linfoide, HCELL-/PSGL-1+) y K562 (leucemia eritroide, HCELL-/PSGL-1-), y blastos circulantes de una leucemia mieloide aguda (LMA) sin maduración (M1) de novo (HCELL+/PSGL-1+) se mantuvieron en RPMI-1640/FBS 10%/Penicilin-Estreptomicina 1% (Life Technologies, Inc). Células de ovario de hamster chino (CHO) transfectadas con cDNA de longitud completa que codifica selectina-P (CHO-P; clona E4I) y CHO-vector vacío (CHO-Mock) se obtuvieron de Robert C. Fuhlbrigge (Harvard Medical School), y se mantuvieron en MEM/FBS 10%/Penicilina-Estreptomicina 1% (Life Technologies, Inc.) y HAM's F-12/Glutamina 5 mM/FCS10%/Penicilina-Estreptomicina 1%. Se prepararon linfocitos humanos (PBMC) a partir de sangre total como se ha descrito previamente (Oxley, S.M. y Sackstein, R. (1994) Blood 84 (10), 3299-3306). Linfocitos de ducto torácico de rata (TDL) que expresan niveles altos de selectina-L, la cual funciona idénticamente a la selectina-L de linfocito humano, se obtuvieron por canulación del ducto torácico de la rata como se ha descrito previamente (Oxley, S.M. y Sackstein, R. (1994) Blood 84 (10), 3299-3306). Se prepararon neutrófilos humanos de sangre periférica total, recolectados en tampón citrato ácido/dextrano 0,6% y se dejaron separar los hematíes por gravedad durante 30 minutos a Tª ambiente. El plasma rico en leucocitos se diluyó 1:1 en PBS sin Ca++/Mg++ y los granulocitos se separaron mediante centrifugación por gradiente con Ficoll-Hypaque (1,077-1,0800 g/ml). Para destruir los hematíes residuales en los pellets celulares, las células fueron expuestas a una solución hipotónica durante 30 segundos y después neutralizado con NaCl hipertónico. Este procedimiento dio como resultado un enriquecimiento de granulocitos>98%. Los blastos leucémicos de un paciente con una leucemia mieloide aguda sin maduración (M1) se aislaron de la sangre periférica mediante centrifugación por gradiente con Ficoll-Hypaque (1,077-1,0800 g/ml).

Los anticuerpos monoclonales anti-PSGL-1 PL-1 y PL-2, anti-CD45-FITC, y anti-CD34 QBEND, se compraron de Coulter-Immunotech, Marsella, Francia. El anticuerpo monoclonal anti-PSGL-1 PSL-275 fue un regalo del Dr. Ray Camphausen (Genetics Institute, Cambridge, MA). Los anticuerpos anticuerpo monoclonal anti-sialyl Lewis X (CSLEX-1), anti-CD44 (clona L178) y anti CD43 se compraron de Beckton Dickinson, San Jose, CA. El anticuerpo monoclonal anti-CD Hermes-1 (IgG2a de rata) fue caracterizado originalmente por Jalkanen et al. (Jalkanen, S.T., Bargatze, R.F., Herron, L.R. y Butcher, E.C. (1986) Eur. J. Immunol. 16, 1195-1202). Anticuerpo monoclonal de rata anti-CLA humano (HECA-452), anti-selectin-L de rata (HRL-1; anticuerpo bloqueante de unión), anti-slectina-P humana (clona AK-4) y anti-selectina L humana (LAM1-3) se compraron a Pharmingen, San Diego, CA. Todos los anticuerpos secundarios conjugados a fluorocromos y los controles isotipo se obtuvieron de Zymed, San Francisco, CA.

OSGE se compró de Accurate Chemicals, Westbury, NY y la neuraminidasa de Vibrio cholerae y la N-glucosidasa-F se obtuvieron de Roche Molecular Biochemicals, Indianápolis, IN. La metaloproteasa de veneno de cobra, mocarhagin (Spertini, O., Cordey, A.S., Monai, N., Giuffre, L. y Schapira, M. (1996) J.Cell Biol. 135 (2), 523-531; De Luca, M., Dunlop, L.C., Andrews, R.K., Flannery, J.V., Ettling, R., Cumming, D.A., Veldman, G.M. y Berna, M.C. (1995) J. Biol. Chem. 270(45), 26734-26737), fue un regalo del Dr. Ray Camphausen (Genetics Institute, Cambridge, MA). El inhibidor metabólico, tunicamicina, y otros compuestos químicos se compraron de Sigma, Inc. (St. Louis, MO).

Análisis Citofluorimétrico. Se realizó un análisis citofluorimétrico en células hematopoyéticas humanas utilizando métodos de tinción por inmunofluorescencia directa e indirecta. Todas las células utilizadas para estos experimentos se lavaron dos veces con PBS/FBS 2%, suspendidas a 10^{7}/ml PBS/FBS 1%. Anticuerpos primarios, anti-CLA, -CD15s, -CD34, -CD43, -CD44, -CD62L, -PSGL-1 (PSL-275, y PL-1) junto con los controles isotipo apropiados, se incubaron en hielo con las células durante 30 minutos. Después de 2 lavados con PBS/FBS 2%, las células se resuspendieron en PBS/FBS1% y se incubaron con los correspondientes anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromo (2 \mul) durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron dos veces con PBS/FBS2%, resuspendidas en PBS y se llevó a cabo la citometría de flujo en un aparato FACScan equipado con láser de argon sintonizado a 488 nm (Becton Dickinson).

Radiomarcaje de Proteínas de Membrana de Células Hematopoyéticas Humanas, SDS-PAGE y Western Blotting. Los cultivos celulares (1-2x10^{6} células/ml) se incubaron con [^{35}S]-EasyTag^{TM}-L-Metionina (150 \muCi/ml) (NEN^{TM}, Boston, MA) en medio RPMI-1640 sin metionina durante 8 horas antes de la preparación de las proteínas de membrana. Las proteínas de membrana se prepararon como se ha descrito previamente. Para el SDS-PAGE y Western blotting, las preparaciones de membrana o inmunoprecipitados se diluyeron en tampón de muestra reductor y fueron separadas en geles SDS-PAGE de 7%. Para la autorradiografía, los geles para separar los inmunoprecipitados marcados con [^{35}S] se secaron y fueron expuestos a una película Kodak BioMax MR (Fisher Scientific) durante 3 horas. Para el Western blotting, las proteínas de membrana separadas se transfirieron a una membrana PVDF Sequi-blot^{TM} (Bio-Rad, Inc., Hercules, CA) y bloqueadas con PBS/Tween-20 0,1%/FBS 60% durante 2 h a 4ºC. Las membranas se incubaron con IgM de rata anti-CLA humano HECA-452 (1,2 \mug/ml), IgG de rata anti-CD44 humano Hermes-1 (1 \mug/ml) o anticuerpo anti-PSGL-1 humano PL-2 (1 \mug/ml) durante 1 hora a Tª ambiente. En paralelo se realizaron inmunoblots con control isotipo usando IgM de rata, IgG de rata o IgG de ratón para evaluar las proteínas reactivas no-específicas. Después de tres lavados con PBS/Tween-20 0,1%, las membranas se incubaron con los respectivos anticuerpos secundarios, PA-conjugados Acs de conejo anti-IgM de rata (1:400), de cabra anti-IgG de rata o de cabra anti-IgG de ratón (1:8000) (Zyned Labs. Inc., San Francisco, CA). Se añadió sustrato PA, Western Blue® (Promega, Madison, WI) para revelar las membranas.

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Análisis en Cámara de Flujo de Platos Paralelos Hidrodinámica Interacciones de Adhesión Mediadas por Selectina-L

Usando la cámara de flujo de platos paralelos bajo unas condiciones de presión de cizalla definidas, se estudiaron las interacciones de adhesión mediadas por selectina-L entre células hematopoyéticas humanas y la selectina-L expresada en los leucocitos de forma natural (Lawrence, M.B., McIntire, L.V., y Eskin, S.G. (1987) Blood 70 (5), 1284-1290). El contacto y rodamiento (tethering and rolling) de los leucocitos sobre las monocapas de células hematopoyéticas humanas se visualizó en tiempo real en un videomicroscopio usando la cámara de flujo de platos paralelos preparada de la siguiente forma. Antes de realizar los experimentos, se lavaron los leucocitos dos veces con HBSS y suspendidos a 10^{7}/ml en HBSS/HEPES 10 mM/CaCl_{2} 2 mM (H/H/Ca++). Se prepararon grupos control negativos tratando las células con PMA (50 ng/ml H/H/Ca++ durante 1 hora a 37ºC) para inducir la separación de selectina-L de la superficie celular, pretratando con AcMo HRL-1 (10 \mug/ml) para bloquear la unión de selectina-L, o incubando con EDTA 5 mM para quelar el Ca++ requerido para la unión de selectina-L. Para preparar las monocapas de células hematopoyéticas humanas (confluentes 100%), se sembraron suspensiones de células hematopoyéticas humanas (KG1a, HL60, RPMI 8402, K562) a 2x10^{6}/ml en RPMI-1640 sin Bicarbonato Na+/FBS2% en platos de 6 pocillos a 5x10^{6}/pocillo, centrifugados para formar una capa con las células y luego fijarlas con gluteraldehído al 3%. Los grupos aldehído reactivos se bloquearon con lisina 0,2M. y las células en el plato se suspendieron en H/H/Ca++. Para asegurar la dependencia de la unión de residuos de ácido siálico a la selectina-L, se pretrataron las células con neuraminidasa de Vibrio cholerae (0,1 U/ml H/H/Ca++ durante 1 hora a 37ºC). Para examinar la influencia de las sialomucinas (incluyendo PSGL-1) y PSGL-1 sola, se realizaron tratamientos con OSGE (60 \mug/ml H/H/Ca++ durante 1 hora a 37ºC) o mocarhagin (10 \mug/ml durante 20 minutos a 37ºC), respectivamente. Además, dado que HCELL se expresa en células KG1a y las N-glucosilaciones con ácido siálico sobre HCELL son críticas para la actividad ligando a selectina-L (Sackstein, R. y Dimitroff, C.J. (2000) Blood 96, 2765-3774) la contribución de HCELL en las células KG1a se distinguió en primer lugar, separando todos los residuos ácido siálico de la superficie de la célula con neuraminidasa de Vibrio cholerae (0,1 U/ml durante 1 hora a 37ºC) y posteriormente incubando las células con un inhibidor metabólico de la N-glucosilación, tunicamicina (15 \mug/ml durante 24 horas a 37ºC, CO_{2} 5%), para evitar la síntesis de N-glicanos de novo (es decir, epitopos HECA-452 en CD44/HCELL). El pretratamiento con neuraminidasa eliminó de la superficie de la célula toda la actividad HCELL residual, y por lo tanto, este tratamiento permitió la evaluación de HCELL sintetizado nuevamente en la superficie celular. Se prepararon muestras de células hematopoyéticas mediante citocentrifugación en platos multi-pocillo como se ha descrito arriba. La cámara de flujo de platos paralelos se colocó encima de las monocapas de células y los leucocitos se prefundieron en el interior de la cámara. Después de dejar contactar los leucocitos con las monocapas de células a una presión de cizalla de 0,5 dinas/cm^{2} (a la cual no establecen fenómenos de adhesión) ajustamos la tasa de flujo de acuerdo para ejercer una presión de cizalla de 1 a >30 dinas/cm^{2}. Se cuantificó el número de leucocitos rodando en un marco de cinco campos independientes bajo un aumento de 200X a una presión de cizalla de 0,2, 0,4, 0,8, 2,2, 4,4, 8,8, 17,6 7 26,4 dinas/cm^{2}. Se realizaron un mínimo de 3 experimentos
utilizando todo el rango de presiones de cizalla y los resultados se expresaron en forma de media\pmdesviación estándar.

Interacciones de Adhesión Mediadas por Selectina-P. En estos experimentos, se prepararon monocapas de células hematopoyéticas fijadas con gluteraldehído en placas de 6 pocillos como se ha descrito arriba, y, cuando estaba indicado, las células se pretrataron con mocarhagin (10 \mug/ml) durante 30 minutos, y lavadas abundantemente con RPMI 1640 sin Bicarbonato Na+/FBS2% antes de ser fijadas. Para estudiar las interacciones de adhesión a selectina-P, se utilizaron células CHO que expresaban selectina-P en su longitud completa de forma estable (CHO-P) o vector vacío (CHO-Mock) extraídas de frascos con EDTA 5 mM, lavadas abundantemente y resuspendidas a 2x10^{6}/ml para su utilización en la cámara de flujo de platos paralelos. La expresión de selectina-P en las células CHO-P se confirmó por análisis de citometría de flujo. Suspensiones de células conteniendo EDTA 5 mM o AcsMo anti-selectina-P (10 \mug/ml durante 30 minutos en hielo) se utilizaron como controles negativos para confirmar la unión dependiente de calcio. Las células se prefundieron en el interior de la cámara y se las dejó caer sobre las monocapas de células antes de iniciar la evaluación de la adhesión de selectina-P a 0,2, 0,4, 0,8, y 2,2 dinas/cm^{2}. El contacto y rodamiento (tethering and roling) celular se visualizó a un aumento de 100X y se cuantificó y analizó como se ha descrito arriba.

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Prueba de Stamper-Woodruff

Adherencia Linfocitaria a HCELL y a PSGL-1 mediada por Selectina-L. Equivalentes molares de HCELL o PSGL-1 purificados por inmunoafinidad (0,75 \mug de HCELL reducido (100 kDa) y 1 \mug de PSGL-1 completamente reducida (140 kDa) fueron pulverizados sobre portaobjetos y dejados secar. Estas manchas de proteínas se fijaron con gluteraldhído al 3%, los grupos gluteraldehído no reactivos se bloquearon con lisina 0,2M y se colocaron las preparaciones en RPMI-1640 sin Bicarbonato Na+ hasta que estuvieran listas para las pruebas. Linfocitos (10^{7}/ml RPMI-1640 sin Bicarbonato Na+/FBS5%) se colocaron cubriendo estos inmunoprecipitados fijados y se incubaron en un agitador orbital a 80 rpm durante 30 minutos a 4ºC. El número de linfocitos adherentes se cuantificó mediante un microscopio óptico usando un ocular con cuadrícula bajo un aumento de 100X (un mínimo de 5 campos/preparación, 2 preparaciones/experimento, y 3 experimentos separados). Los datos se presentaron como la media de los linfocitos unidos\pmdesviación estándar. Inmunoprecipitados control de KG1a CD34 y selectina-L se evaluaron también de esta forma. Para verificar la dependencia del ácido siálico se pretrataron las muestras con neuraminidasa de Vibrio cholerae (0,1 U/ml RPMI 1640 sin Bicarbonato Na+/FBS 2% durante 1 hora a 37ºC). Además, para verificar que la adhesión celular era dependiente de selectina-L, todos los ensayos incluyeron controles negativos, en los que los linfocitos se trataron con PMA (50 ng/ml durante 30 minutos a 37ºC) o anticuerpos bloqueantes funcionales (AcMo anti-selectina-L de rata HRL-1 o AcMo anti selectina-L humana LAM1-3; 10 \mug/ml, o suspensiones de linfocitos conteniendo EDTA 5 mM.

Adherencia Linfocitaria a Células Hematopoyéticas humanas mediada por Selectina-L. Para el análisis de la actividad celular ligando para selectina-L de células hematopoyéticas humanas, se prepararon por citocentrifugación células KG1a, HL60, RPMI-8402 y K562, y blastos de leucemia de novo, se fijaron con gluteraldehído al 3%, bloqueados con lisina 0,2M y cubiertos con linfocitos (10^{7}/ml RPMI-1640 sin Bicarbonato Na+/FBS 5%) sobre un agitador orbital a 80 rpm durante 30 minutos a 4ºC. Las preparaciones fueron lavadas cuidadosamente con PBS y los linfocitos unidos fueron fijados con gluteraldehído 3%. Todas las pruebas incluyeron controles negativos como se ha descrito arriba. Los datos se presentaron como la media\pmDE del número de linfocitos unidos evaluados a un aumento de 100X por un mínimo de 5 campos/laminilla en laminillas duplicadas de 3 experimentos separados.

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B. HCELL es capaz de unirse a selectina-L en un amplio rango de presión de flujo

El objetivo de este estudio fue valorar la capacidad de HCELL y PSGL-1 de las células hematopoyéticas humanas de sostener la actividad de unión para selectina-L dependiente de flujo de cizalla en un rango de presiones de cizalla. Se analizaron las características de unión a selectina-L de cada una de estas moléculas realizando sistemas de prueba de adherencia basada en el flujo de cizalla usando células hematopoyéticas humanas que expresen HCELL y/o PSGL-1: KG1a (HCELL+/PSGL-1+), HL60 (HCELL-/PSGL-1+), RPMI 8402 (HCELL-/PSGL-1+), K562 (HCELL-/PSGL-1-) y una leucemia mieloide aguda (LMA) sin maduración (M1) de novo (HCELL+/PSGL-1+) (tabla 2) (Oxley, S.M. y Sackstein, R. (1994) Blood 84(10), 3299-330; Sackstein, R., Fu, L. y Allen, K.L. (1997) Blood 89(8), 2773-2781; Sackstein, R. y Dimitroff, C.J. (2000) Blood 96, 2765-2774).

TABLA 2 Análisis mediante Citometría de flujo de los sialoglicoconjugados en líneas celulares hematopoyéticas

2

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Usando la cámara de flujo de platos paralelos bajo presión de flujo hidrodinámica, se observó el contacto y rodamiento (tethering and rolling) de leucocitos sobre monocapas de células hematopoyéticas humanas fijadas con gluteraldehído. Todos los experimentos incluyeron controles negativos par verificar la contribución exclusiva de selectina-L en la mediación de la adherencia célula-célula. Se requirió un umbral de presión de cizalla de \sim0,5 dinas/cm^{2} en este sistema para establecer interacciones de adhesión mediadas por selectina-L como se había demostrado previamente (Lawrence, M.B., Kansas, G.S., Kunkel, E.J. and Ley, K. (1997) J Cell Biol. 136 (3), 717-727; Finger, E.B., Puri, K.D., Alon, R., Lawrence, M.B., von Adrian, U.H. and Springer,T.A. (1996) Nature 379(6562): 266-269) (Figure 12A). Después de alcanzar este nivel de presión de cizalla, el contacto y rodamiento de los leucocitos se enumeró en un amplio rango de presión de cizalla. Se observó rodamiento de linfocitos humanos dependiente de selectina-L y de TDL de rata sobre células HL60 en un rango de presión de cizalla de 0,4 dinas/cm^{2} hasta un máximo de 10 dinas/cm^{2} (Figura 12A). Sin embargo, no hubo evidencia de rodamiento sobre células K562, y, a pesar de la expresión de PSGL-1, las células RPMI 8402 tampoco mostraron actividad ligando para selectina-L (Figura 12A y Tabla 2). En contraste, se observó rodamiento de linfocitos mediado por selectina-L y de TDL de rata sobre monocapas de células KG1a a presiones de cizalla en exceso de 26 dinas/cm^{2}, mientras, sobre células HL60, el rodamiento de linfocitos humanos/TDL estuvo ausente a partir de 17 dinas/cm^{2} (Figura 12A). Además, la frecuencia de linfocitos rodando sobre células KG1a fue 5 veces mayor a lo largo de todo el amplio rango de presión de cizalla que el rodamiento sostenido mediado por selectina-L sobre las células HL60 (figura 12A). La disparidad entre la alta actividad ligando para selectina-L en las células KG1a y la baja actividad en las células HL60 también se observó utilizando neutrófilos humanos, los cuales expresan niveles equivalentes de selectina-L por análisis de citometría de flujo: las células KG1a sostuvieron 4 veces más rodamiento de neutrófilos mediado por selectina-L que las células HL60 (Figura 12B). Estos datos muestran que las células KG1a poseen una capacidad mayor de sostener adherencia de leucocitos mediada por selectina-L sobre un amplio rango de presión de flujo y que la selectina-L expresada nativamente en los linfocitos y en los neutrófilos
exhibe una actividad de unión a HCELL o a PSGL-1, expresadas en células hematopoyéticas humanas, comparable.

Para diferenciar la contribución de la actividad de PSGL-1 de la actividad de HCELL en las células KG1a, se realizó la digestión de las células con OSGE o mocarhagina, o se incubaron las células con un Ac bloqueante funcional PL-1, que ambos hacen que PSGL-1 sea incapaz de unirse a selectina-L (Spertini, O., Cordey, A.S., Monai, N., Giuffre, L. and Schapira, M. (1996) J. Cell Biol. 135(2), 523-531; Guyer, D.A., Moore, K.L. Lyman, E.B., Schammel, C.M.G., Rogelj, S., McEver, R.P. and Sklar, L.A. (1996) Blood 88, 2415-2421; Tu, L., Chen, A., Delahunty, M.D., Moore, K.L., Watson, S.R., McEver, R.P. and Tender, T.F. (1996) J. Immunol. 157, 2995-4004; De Luca, M., Dunlop, L.C., Andrews, R.K., Flannery, J.V., Ettling, R., Cumming, D.A., Veldman, G.M. and Berndt, M.C. (1995) J. Biol. Chem. 270 (45), 26734-2637 14-16). Alternativamente, para diferenciar la contribución de la actividad de HCELL sobre las células KG1a (la cual se expresa exclusivamente en N-glicanos modificados con ácido siálico), se pretrataron células KG1a y blastos de una leucemia de novo con neuraminidasa y luego se incubaron con tunicamicina. Concordantemente, la actividad ligando para selectina-L de las células KG1a fue resistente a la digestión enzimática con OSGE o mocarhagina, y a los tratamientos con anticuerpo PL-1 (Tabla 3). Sin embargo, la actividad ligando a selectina-L de KG1a se eliminó siguiendo la digestión enzimática con neuraminidasa, la reexpresión de la actividad ligando estuvo reducida marcadamente después del tratamiento con tunicamicina, mientras que las células tratadas sólo con DMSO (control) reresaron a valores basales (p<0,001) (tabla 3). Estos datos muestran que HCELL dependiente de N-glicanos es el mediador primario de la unión a selectina-L en células KG1a. En contraste, la actividad ligando para selectina-L de las células HL60 fue eliminada completamente mediante digestión con OSGE (p<0,001) (Tabla 3), e inhibida significativamente después de la digestión con mocarhagina (p<0,001) y mediante el tratamiento con anticuerpo bloqueante de función anti-PSGL-1 PL-1 (p<0,002) (Tabla 3). La efectividad de los tratamientos con OSGE y mocarhagin se confirmó por análisis de citometría de flujo de los epitopos sensibles en CD34 y PSGL-1con AcMo QBEND-10 y AcMo PSL-275, respectivamente. De forma interesante, el hecho de que la actividad ligando para selectina-L en las células HL60 se eliminara por completo después de la digestión con OSGE, pero no por los tratamientos con AcMo PL-1 o con mocarhagina, sugiere que las células HL60 expresan otros ligandos O-sialoglucoproteína para selectina-L diferentes a PSGL-1. Estos datos concuerdan con estudios previos que demuestran la expresión de ligando(s) para selectina-L diferentes a PSGL-1, sensibles a OSGE, en células HL60 (Ramos, C., Smith, M.J., Snapp, K.R., Kansas, G.S., Stickney, G.W., Ley, K. and Lawrence, M.B. (1998) Blood (91), 1067-1075).

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TABLA 3 Actividad ligando para L-selectina de células KG1a y HL60 que se someten a tratamientos enzimáticos o de bloqueo con anticuerpos bajo flujo de cizalla hidrodinámico^{1}

3

Para investigar más las actividades ligando para selectina-L de HCELL y PSGL-1 expresadas en células hematopoyéticas humanas, se realizaron pruebas de Stamper-Woodruff de la adherencia linfocitaria mediada por selectina-L a monocapas de células hematopoyéticas fijadas con gluteraldhído. Las células KG1a poseían actividad ligando a HCELL desde >40-120 rpm, la cual fue máxima a 80 rpm, mientras que las células HL60 exhibieron actividad ligando a selectina-L predominantemente a 80 rpm (Figura 12C). Además, la adherencia linfocitaria a células KG1a mediada por selectina-L fue 10 veces más alta que la de las células HL60 a 80 rpm, y no hubo evidencia de unión de linfocitos a las células K562 y RPMI-8402 (Figura 12 C). Dado que el ligando primario para selectina-L en las células HL-60 es PSGL-1 y su expresión es equivalente en células KG1a y HL60, estos datos sugieren además que, en base a una célula, la actividad HCELL en KG1a posee una capacidad más alta para funcionar como ligando sobre un rango más amplio de estrés de cizalla.

Aunque el nivel de expresión de PSGL-1 es equivalente entre células KG1a y HL60, se examinó si PSGL-1 en las células KG1a era funcionalmente equivalente a PSGL-1 en las células HL-60. Dado que el determinante de unión N-terminal crítico de PSGL-1 para selectina-P se solapa con el determinante(s) de unión estructural para selectina-L (Snapp, K.R., Ding, H., Atkins, K., Warnke, R., Luscinskas, F.W and Kansas, G.S. (1998) Blood 91, 154-164; De Luca, M., Dunlop, L.C., Andrews, R.K., Flannery, J.V., Ettling, R., Cumming, D.A., Veldman, G.M. and Berndt, M.C. (1995) J. Biol. Chem. 270(45), 26734-26737), se razonó que las capacidades de KG1a y de HL60 para unirse a selectina-P se correlacionan con la eficacia de unión de PSGL-1 a selectina-L. Así, se realizaron experimentos en la cámara de flujo de la actividad ligando a selectina-P utilizando células de ovario de hamster chino transfectadas con cDNA que codifica slectina-P humana de longitud completa (CHO-P). Tanto las células HL60 como las KG1a sostuvieron un rodamiento equivalente de CHO-P mediado por PSGL-1, las células K562 y RPMI-8402 no poseían ninguna actividad (Figura 13A). La actividad ligando a selectina-P de las células KG1a y HL60 se eliminó mediante tratamiento con mocarhagin (Figura 13B). Distinto a la diferente a la capacidad de sostener actividad ligando para selectina-L entre las células KG1a y las HL60, estos datos sugieren que la PSGL-1 nativa como se expresa en la membrana celular era similar estructural y funcionalmente en estas líneas celulares. Debe hacerse notar que PSGL-1 de RPMI-8402 no fue funcional como ligando para selectina-L ni para selectina-P, lo que concuerda con el hallazgo de que PSGL-1 en ciertas células linfoides no es funcional debido a la falta de actividad de \alpha1,3 fucosiltransferasas y core 2\beta1,6 N-acetilglucosaminiltransferasas requeridas para la creación de un ligando bioactivo (Vachino, G., Chang, X.-J., Veldman, G.M.,
Kumar, R., Sako, D., Fouser, L.A., Berndt, M.C. and Cumming, D.A. (1995) J. Biol. Chem. 270(37), 21966-21974).

C. HCELL es el ligando preferido para selectina-L en las células Hematopoyéticas Humanas

La diferencia en la actividad ligando para selectina-L entre HCELL y PSGL-1 en células enteras puede reflejar diferencias en la densidad de superficie y/o topografía de la expresión de estas moléculas. Para comparar las capacidades de unión de HCELL y PSGL-1, se realizaron pruebas convencionales de Stamper-Woodruff basadas en flujo de cizalla de la adherencia linfocitaria a equivalentes molares de HCELL o PSGL-1 purificadas por inmunoafinidad de células KG1a y HL60, y de LMA (M1) de novo.

Para aislar HCELL y PSGL-1 para experimentos de unión celular, se purificaron por inmunoafinidad KG1a CD44 (Hermes-1 IgG de rata) y PSGL-1 (PL-2 IgG de ratón) a partir de preparaciones de proteínas de membrana. Las autorradiografías de los inmunoprecipitados de Hermes-1 y PL-2 obtenidos de lisados celulares totales de células KG1a metabólicamentes radiomarcadas con [^{35}S] mostraron la especificidad de Hermes-1 y PL-2 para sus respectivos antígenos (Figura 14A), revelando que la forma de CD44 de 100 kDa fue la principalmente aislada y que fueron aislados ambas isoformas de PSGL-1, el dímero (\sim220 kDa) y el monómero (\sim140 kDa) (Figura 14A). Hubo una forma de proteína menor contaminante de 30 kDa, inmunoprecipitada con Hermes-1, la cual fue eliminada mediante ulterior filtrado de los inmunoprecipitados a través de un filtro de un límite de 50 kDa. Para normalizar la equivalencia molar de la proteína purificada utilizada en las pruebas de Stamper-Woodruff, se comparó la densidad óptica densitométrica (OD) de CD44 y de PSGL-1 marcado con metionina-[^{35}S] (cada uno pasado por un filtro de límite de 50 kDa) en autorradiogramas de material purificado por inmunoafinidad colocado sobre un cristal. Se encontró que la OD de 1 \mug de PSGL-1 fue 2 veces mayor que la OD de 0,75 \mug de CD44. Dado que el monómero de PSGL-1 (140 kDa) tiene \sim1,4 veces mayor PM que CD44 (100 kDa) y dado que PSGL-1 tiene 2 veces más residuos metionina que CD44 (13 vs 6), la señal dos veces mayor de PSGL-1 indicaba que 0,75 \mug de CD44 y 1 \mug de PSGL-1 representan cantidades equimolares de las respectivas proteínas. Usando estas cantidades equimolares, a 80 rpm CD44 sostenía una unión de linfocitos 10 veces mayor comparado con PSGL-1, y de 40 a 100 rpm, sostenía una adherencia linfocitaria 5-10 veces mayor comparado con PSGL-1 (Figura 14B). CD34 y selectina-L inmunoprecipitados de células KG1a (controles moleculares negativos) no sostuvieron ninguna adherencia linfocitaria mediada por selectina-L (Figura 14B). Estos datos comparando directamente las eficacias relativas de unión a selectina-L de CD44 y PSGL-1 purificadas fueron similares a los resultados obtenidos de un análisis de células enteras.

Para explorar si las actividades ligando para selectina-L dispares de HCELL y PSGL-1 estaban presentes también en células humanas hematopoyéticas, se investigó la actividad ligando para selectina-L de HCELL y PSGL-1 de un paciente con LMA sin maduración (M1). En pruebas de Stamper-Woodruff preliminares de actividades de células enteras de LMA (M1), las células LMA (M1) mostraron una actividad ligando para selectina-1 comparable a las células KG1a, y la expresión de CD44 y PSGL-1 (medida por citometría de flujo) fue también similar a la de KG1a. Se inmunoprecipitó CD44 y PSGL-1 de estas células y se examinó su capacidad de unión mediante la prueba de Stamper-Woodruff (80 rpm). En paralelo, también se evaluaron las actividades ligando para selectina-L de HCELL y PSGL-1 de células KG1a y HL60, y se realizaron digstiones con N-glucosidasa-F y OSGE para análisis comparativo. CD44 tanto de KG1a como de AML (M1) sostuvieron una adherencia linfocitaria mediada pro selectina-L significativamente mayor que PSGL-1 de KG1a, HL60 o LMA (M1) (media de linfocitos unidos a CD44 3 veces mayor que a PSGL; p<0,001) (Tabla 4). Además, ni CD44 de HL60 inmunoprecipitados control isotipo, inmunoprecipitados CD34 y selectina-L, o inmunoprecipitados de KG1a con CD44 y PSGL-1 tratados con neuraminidasa (Tabla 4)poseían ninguna actividad ligando a selectina-L. De forma similar a que CD44 de células KG1a tratada con N-glucosidasa-F, la actividad de unión a selectina-L de CD44 de LMA (M1) tratada con N-glucosidasa-F estuvo marcadamente reducida (a niveles de origen) (Tabla 4). De forma interesante, PSGL-1 aislada de células KG1a y blastos de LMA (M1) poseía una capacidad de unirse a selectina-L mayor que PSGL-1 de células HL60 (Tabla 4), aunque la unión a PSGL-1 nativa mediada por selectina-P fue idéntica entre células KG1a y HL60 (Figuras 13A y 13B). Fotomicrofotografías de linfocitos unidos a CD44 o PSGL-1 en pruebas de Stamper-Woodruff ilustraron las diferencias características entre en el rango de actividad ligando para selectina-L de CD44 KG1a y CD44 LMA (M1) (Figuras 15A y 15D, respectivamente) comparado con PSGL-1 KG1a (Figura 15G); incluso con un exceso 3 veces molar de PSGL-1 KG1a (Figura 15H), la actividad ligando para selectina-L de CD44 (Figura 15A) fue todavía mayor que la de PSGL-1. Los tratamientos con N-glucosidasa-F (Figuras 15B y 15E) y OSGE (Figura 15I) disminuyeron marcadamente la unión de linfocitos de forma comparable a los niveles de control isotipo (Figuras 15C y 15F) confirmando las contribuciones relevantes de N-glicanos y O-glicanos en HCELL y PSGL-1, respectivamente.

TABLA 4 Actividad ligando para selectina-L de inmunoprecipitados CD44 y PSGL-1 de KG1a, células HL60 y blastos de LMA (M1) en el ensayo Stamper-Woodruff^{1}

4

Para profundizar en la mayor capacidad de HCELL para unirse a selectina-L comparado con la de PSGL-1, se examinó la expresión de estructuras fucosiladas y modificadas con ácido siálico (reconocidas por el AcMo de rata HECA-452) en CD44 y en PSGL-1, la cual se correlaciona con la capacidad de unión a selectina-L. El análisis mediante SDS-PAGE e inmunoblot con HECA-452 de cantidades equimolares de CD44 y PSGL-1 inmunoprecipitado de proteínas de membrana de KG1a revelaron que CD44 fue distintivamente más reactivo a HECA-452 que PSGL-1 (Figura 16), sugiriendo que HCELL contiene un número mayor de epitopos HECA-452 que PSGL-1, lo que podría ser la explicación de su mayor actividad hacia selectina-L.

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Ejemplo 11 Purificación por inmunoafinidad de HCELL y PSGL-1

Se inmunoprecipitaron HCELL y PSGL-1 de células hematopoyéticas humanas. El procedimiento de inmunoprecipitación se siguió como está descrito (Dimitroff, C.J., Lee, J.Y., Fuhlbrigge, R.C. and Sackstein, R. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (25), 13841-13846). Brevemente, las proteínas de membrana de células hematopoyéticas humanas (Dimitroff, C.J., Lee, J.Y., Fuhlbrigge, R.C. and Sackstein, R. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (25) 13841-13846) se solubilizaron primero en NP-40 al 2% y preaclararon en Proteína G-agarosa (Life Technologies). Luego la proteína de membrana se cuantificó usando la prueba de proteína de Bradford (Sigma). Las preparaciones de membrana preaclaradas y solubilizadas (incluyendo proteínas de membrana y lisados de células enteras radiomarcadas con [^{35}S]-metionina (Dimitroff, C.J., Lee, J.Y., Fuhlbrigge, R.C. and Sackstein, R. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (25), 13841-13846) se incubaron con Ac PL-2 anti-PSGL-1 o con Ac monoclonal Hermes-1 anti-CD44 (una relación de 100 \mug de proteína: 3 \mug de anticuerpo) durante 18 horas a 4ºC en rotación. También se realizaron inmunoprecipitaciones con anticuerpo QBEND-10, anti-CD34, anticuerpo (LAM1-3) anti-selectina-1 o controles isotipo IgG de ratón/IgG de rata, para servir como controles negativos. La mezcla de lisado-anticuerpo se añadió a Proteína G-Agarosa y se incubó durante 1 hora bajo rotación constante. Para el SDS-PAGE/Western blotting, los inmunoprecipitados se lavaron 5 veces con tampón de lisis/NP-40 2%/SDS 1%/BSA 1% y 3 veces con tampón de lisis sin BSA, y hervidos en tampón de muestra reductor para su análisis. Para la valoración funcional de CD44 o PSGL-1 en pruebas de adherencia, los inmunoprecipitados respectivos se lavaron 5 veces con tampón de lisis/NP-40 2%/SDS 1%/BSA 1% y tres veces con tampón de lisis sin NP-40, SDS o BSA, luego suspendidos en PBS y hervidos durante 5 minutos para disociar CD44 o PSGL-1 de los inmunocomplejos. Luego se pasaron los eluídos a través de filtros Nicrocon® con un límite de 50 kDa (Fihser Scientific, Inc.). La concentración de proteína del retenido se midió por la prueba de determinación de proteína de Bradford.

Se realizaron experimentos paralelos se realizaron donde se incubaron los respectivos anticuerpos con Proteína G-agarosa, y se hirvieron los inmunoprecipitados en PBS como se ha mencionado arriba. Los eluídos analizados por SDS-PAGE y teñidos con azul Coomasie revelaron que >99% del anticuerpo estaba todavía unido a Proteína G-agarosa después de hervir en PBS y, por lo tanto contribuían insignificantemente a los niveles de proteína cuantificados. Además, con la excepción de una banda menor contaminante a 30 kDa en los inmunoprecipitados de Hermes-1, otras proteínas no -CD44 y no-PSGL-1 no se aislaron por inmunoprecipitación usando Hermes-1 y PL-2 (ver autorradiogramas de inmunoprecipitados obtenidos de lisados de células enteras (7) de células KG1a radiomarcadas metabólicamente con [^{35}S], Figura 14A). El uso de un filtro de límite de 50 kDa retiró la proteína contaminante de 30 kDa inmunoprecipitada por Hermes-1, produciendo CD44 KG1a pura.

Para confirmar la contribución de los N-glicanos en HCELL o O-sialoglicanos en PSGL-1, las preparaciones de membrana se trataron primero con N-glucosidasa-F (0,8 U/ml) o OSGE previamente a la inmunoprecipitación como se ha descrito (Dimitroff, C.J., Lee, J.Y., Fuhlbrigge, R.C. and Sackstein, R. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (25), 13841-13846). El material purificado por inmunoafinidad (0,75-3 \mug/gota) se esparció sobre portaobjetos para el análisis mediante la prueba de Stamper-Woodruff (ver abajo para la descripción de la prueba). Para el análisis autorradiográfico del inmunoprecipitado de CD44 y PSGL-1 radiomarcados con [^{35}S]-metionina, se esparcieron los inmunoprecipitados sobre portaobjetos, se dejaron secar y se expusieron a una película Kodak BioMax-MR durante 12 horas a -80ºC. El análisis densitométrico (densidad óptica) de los autorradiogramas se realizó con un escáner Hewlett-Packard Scanjet 5200 y con el programa de procesamiento y análisis NIH Image.

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Ejemplo 12 Análisis por RT-PCT de \alpha1,3 fucosiltransferasas (FucTIV Y FucTVII) y \alpha2,3 sialiltransferasa (ST3GALIV)

Dado que la expresión de HECA-452 es dependiente de sialofucosilaciones críticas en las cadenas core poli-N-acetillactosaminil, se investigó si la diferencia relativa en la expresión del epitopo HECA-452 y la actividad ligando para selectina-L era una consecuencia de la activación de \alpha2,3 sialiltransferasa (ST\cdotGal IV) y las \alpha1,3 fucosiltransferasas leucocitarias (FucTIV y FucTVII), las cuales se requieren para la síntesis del epitopo HECA-452 (Sasaki, K., Watanabe, E., Kawashima, K., Sekine, S., Dohi, T., Oshima, M., Hanai, N., Nishi, T. and Hasegawa, M (1993) J. Biol. Chem. 268(30), 22782-22787; Fuhlbrigge, R.C., Kieffer, D., Armending, D. and Kupper, T.S. (1997) Nature 398, 978-981; Zollner, O. and Vestweber, D.M. (1996) J. Biol. Chem. 271, 33002-33008; Goelz, S., Kumar, R., Potvin, B., Sundaram, S., Brickelmaier, M. and Stanley, P. (1994) J. Biol. Chem. 269, 1033-1040).

Se extrajo RNA total con el reactivo Trizol® LS de acuerdo al protocolo del fabricante (Gibco, Life Sciences) y utilizó en el sistema Titan^{TM} One Tube RT-PCR System (Roche Molecular Biochemicals). Primers de ST3Gal sentido5'-ctctccgatatctgttttattttcccatcccagagagaagaagaaggag-3' y anti-sentido 5'-gattaaggtaccaggtcagaaggacgtgaggttcttctt-3' y condiciones de ciclado termal [RT a 52ºC durante 45 minutos, 1 ciclo a 94ºC durante 2 minutos, 30 ciclos a 94ºC durante un minuto, 57ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, y un ciclo de 68ºC durante 7 minutos] se usaron para amplificar un fragmento de cDNA de ST3GalIV de 0,96 kb. Para amplificar un fragmento de FucTVII (GenBank, Accn#U08112), se utilizaron primers específicos, sentido 5'-cccaccgtggcccagtaccgcttct-3' y anti-sentido 5'-ctgacctctgtgcccagcctcccgt-3' y condiciones de ciclado termal termal [RT a 52ºC durante 45 minutos, 1 ciclo a 94ºC durante 2 minutos, 30 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 45 segundos y 72ºC durante 1 minuto, y un ciclo de 68ºC durante 7 minutos]. Usando idénticos RT y condiciones de ciclado termal, se generó un fragmento de de cDNA de FucTIV de 0,50 kb de primers sentido 5'-cgggtgtgccaggctgtacagagg-3' y anti-sentido 5'-tcgggaacagttgtgtat
gagatt-3' (GenBank, Accn#M58597).

El análisis por RT-PCR de la expresión de genes de FucTIV y FucTVII y de ST3GalIVen KG1a, HL60, K562 y RPMI-8402 mostró que la expresión de FucTIV fue relativamente similar en todas las líneas celulares (Figuras 17ª y 17B), pero la expresión de FTVII fue la más alta en las células HL60 y KG1a (línea 1, FucTIV, y línea 2, FucTVII; Figura 17ª). De forma interesante, ST3Gal IV (línea 1; Figura 6B) se expresó a un nivel alto en células KG1a y a muy bajo nivel en todas las otras líneas, sugiriendo que el nivel inherente de ST3GalIV puede ayudar a regular la expresión de estructuras reactivas a HECA-452 y determinantes de unión para selectina-L en CD44 y/o PSGL-1.

La expresión de HECA-452 es dependiente de silofucosilaciones críticas en las cadenas core poliacetillactosaminil. La diferencia en la expresión de epitopos HECA-452 y actividad ligando para selectina-L fue una consecuencia de la activación de \alpha2,3 sialiltransferasa (ST3GalIV) y leucocitarias \alpha1,3 fucosiltransferasas (FucTIV y FucTVII), las cuales se requieres para la biosíntesis de epitopos HECA-452. El análisis de la expresión génica por RT-PCR de FucTIV y FucTVII y de ST3Gal IV en las células KG1a, HL60, K562 y RPMI-8402 mostró que la expresión de FucTVII fue más alta en las células HL60 y KG1a (línea 1, FucTIV, y línea 2, FucTVII; Figura 17A). De forma interesante, ST3Gal IV (línea 1; Figura 17B) se expresó a un nivel alto en células KG1a y a un nivel muy bajo en las otras líneas celulares, sugiriendo que el nivel inherente de ST3Gal IV puede ayudar a regular la expresión de estructuras relevantes reactivas a HECA-452 y determinantes de unión para selectina-L críticos en CD44 KG1a y/o PSGL-1.

Equivalentes

De la descripción previa detallada de los conjuntos específicos del invento, debería ser evidente que se han descrito las composiciones y aplicaciones novedosas.

Aunque los documentos particulares han sido puestos de manifiesto aquí en detalle, esto se ha hecho en forma de ejemplo con el único propósito de ilustrar, y no se pretende poner límites al alcance de afirmaciones añadidas que se puedan aportar.

Claims (4)

1. Un polipéptido glucosilado sustancialmente purificado, dicho polipéptido glucosilado comprende un eje polipéptido CD44 en el que dicho polipéptido glucosilado comprende glicanos fucosilados y modificados con ácido siálico y se une a selectina-E y selectina-L.

2. El polipéptido glucosilado del documento 1, en el que dicho eje CD44 comprende la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 1.

3. El uso del polipéptido glucosilado del documento 1 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una alteración inflamatoria en dicho sujeto.

4. El polipéptido glucosilado del documento 1 para el uso en el tratamiento de una alteración inflamatoria.