ES2565809T3 - Métodos mejorados de secuenciación de ácidos nucleicos - Google Patents

Abstract

Un método de etiquetar dúplex de ácido nucleico que comprende las etapas de: (a) suministrar una transposasa y una composición de transposón; (b) suministrar uno o más dúplex de ácido nucleico y movilizado sobre un soporte; (c) poner en contacto la transposasa y la composición de transposón con los uno o más dúplex de ácido nucleico bajo condiciones en donde los uno o más dúplex de ácido nucleico y la composición de transposón sufren una reacción de transposición para producir uno o más dúplex de ácido nucleico etiquetados, en donde la composición de transposón comprende una molécula de ácido nucleico de doble cadena que comprende una cadena transferida y una cadena no transferida.

Description

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Metodos mejorados de secuenciacion de acidos nucleicos Antecedentes

Se han desarrollado tecnicas de secuenciacion para secuenciar acidos nucleicos que incluyen ARN. Las tecnicas de secuenciacion incluyen, por ejemplo, la secuenciacion mediante smtesis. La secuenciacion mediante smtesis o la secuenciacion en ciclo se pueden lograr mediante la adicion en etapas de nucleotidos que contienen, por ejemplo, una etiquete de tinte separable o fotolixiviable como se describio, por ejemplo, en la Patente U.S. 7, 427, 673; la Patente U.S. 7, 414, 116; la WO 04/018497; la WO 91/06678; la WO 07/123744; y la Patente U.S. No. 7, 057, 026.

De manera alternativa, se pueden emplear tecnicas de pirosecuenciamiento. El pirosecuenciamiento detecta la liberacion de pirofosfato inorganico (PPi) en la medida en que se incorporan nucleotidos particulares en la cadena insipiente (Ronaghi et al., (1996) “Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release.” Analytical Biochemistry 242 (1), 84-9; Ronaghi, M. (200 1) “Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing.” Genome Res. 1 1(1), 3-1 1; Ronaghi, M., Uhlen, M. and Nyren, P. (1998) “A sequencing method based on real-time pyrophosphate.” Science 28 1(5375), 363; Patente de los Estados Unidos No. 6, 2 10, 89 1; Patente de los Estados Unidos No. 6,258,568; and Patente de los Estados Unidos No. 6,274,320, . El pirosecuenciamiento, se puede detectar el PPi liberado al ser inmediatamente convertido a adenosm trifosfato (ATP) mediante ATP sulfurilasa, y el nivel del ATP generado se detecta por via de los fotones producidos por la luciferasa.

Las tecnicas de secuenciacion tambien incluyen secuenciacion mediante tecnicas de ligado. Tales tecnicas utilizan ADN ligasa para incorporar oligonucleotidos e identificar la incorporacion de tales oligonucleotidos y se describen en la Patente U.S. No 6, 969,488; La Patente U.S. No. 6, 172, 218; y la Patente U.S. No. 6, 306, 597.

Otras tecnicas de secuenciacion incluyen, por ejemplo, secuenciacion in situ fluorescente, (FISSEQ), y Secuenciacion Masivamente Paralela de la Firma (MPSS).

La preparacion de muestras de ADN para secuenciacion pueden ser relativamente directas e incluir el uso de reacciones de transposicion para fragmentar y agregar secuencias del adaptador a los fragmentos de ADN, lo que simplifica el proceso de preparacion de la muestra. Ver, por ejemplo, Publicacion Internacional No. WO 2010/048605, que describe un metodo de transposicion in vitro que ambos ADN de etiquetas y fragmentos, pero no describe el etiquetado del transposon de un blanco inmovilizado. En contraste, los protocolos habituales para secuenciacion de muestras de ARN emplean un metodo de preparacion de muestra que convierte el ARN en la muestra en un formato de cADN de doble cadena antes de la secuenciacion. Asf, la preparacion de las muestras de ARN para secuenciacion es un trabajo mas intensivo. Ademas, los protocolos corrientes son menos que optimos por su capacidad para preservar la informacion espedfica de cadena. Mas espedficamente, la mayona de los metodos no pueden preservar la informacion de la cadena en relacion con la direccion de la molecula de ARN de cadena simple original despues de ser convertida a una cADN de cadena doble. Preservar la informacion espedfica de la cadena es importante para la anotacion de nuevos genes y para determinar los niveles de expresion del gen. Algunos metodos intentan preservar la informacion espedfica de cadena mediante los adaptadores de ligado en los extremos de las moleculas de ARN de cadena unica. Los adaptadores pueden tener secuencias que suministran informacion distinguible para ambos extremos del cADN de cadena doble generado por las moleculas de ARN. Sin embargo, este metodo tiene desventajas. Por ejemplo, si se fragmentan las moleculas de ARN, despues de que la fragmentacion de las partes internas de las moleculas pierden su informacion direccional (es decir, espedfica de la cadena).

Resumen

Se suministra aqrn un metodo para etiquetar duplex de acido nucleico. El metodo incluye las etapas de suministrar una transposasa y una composicion de transposon, suministrando uno o mas duplex de acido nucleico inmovilizado sobre un soporte, y poner en contacto la transposasa y la composicion de transposon con uno o mas duplex de acido nucleico bajo condiciones en donde el uno o mas duplex de acido nucleico y la composicion de transposon sufre una reaccion de transposicion para producir uno o mas duplex de acido nucleico etiquetado, en donde la composicion de transposon comprende una molecula de acido nucleico de cadena doble que comprende una cadena transferida y una cadena no transferida. El metodo tambien se puede efectuar al etiquetar los duplex de ADN: ADN o ADN: ARN que son inmovilizados sobre un soporte solido.

Los detalles de una o mas realizaciones se establecen en los dibujos que la acompanan y en la descripcion de adelante. Otras caractensticas, objetos, y ventajas seran evidentes de la descripcion y los dibujos, y de las reivindicaciones.

Descripcion de los dibujos

La Figura 1 es un esquema que muestra un metodo de ejemplo suministrado aqrn. El mARN con una cola de poliA se captura sobre un soporte por via de hibridacion a una sonda de captura de poliT ADN o al cebador acoplado a la superficie de un soporte. La cadena poliT es luego extendida con una polimerasa de transcriptasa inversa para hacer una molecula de cadena doble que comprende un duplex de ADN: ARN. Luego, el complejo del transposoma (por ejemplo, una transposasa Tn5 unida con una secuencia de extremo de mosaico (ME) y secuencias complementarias a los cebadores de amplificacion de superficie) se agregan al soporte, que sufre una reaccion de transposicion y

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fragmenta el duplex, ligando un oligo adaptador de ADN al extremo 5' de la cadena de ARN. Una polimerasa que desplaza la cadena (por ejemplo, la Bst polimerasa) se puede entonces utilizar para extender el extremo 3' de la cadena de ADN, desplazando la cadena no transferida del complejo de transposoma y copiando la cadena de ARN a su extremo quimerico de ADN 5'. La molecula de cadena doble se puede entonces amplificar (por ejemplo, amplificacion de un conjunto) y secuenciada con el cebador de secuenciacion. El cebador comprende parcialmente la secuencia ME y la secuencia de adaptador corriente arriba. De manera alternativa, en otro extremo de la molecula (el extremo poli T) se puede secuenciar con un cebador que hibrida corriente arriba la secuencia poliT y se extiende con un nucleotido dATP natural antes de comenzar los ciclos de secuencia mediante la qufmica de sfntesis (SBS).

La Figura 2 es un esquema que muestra un metodo de ejemplo suministrado aquf. El ARN se fragmenta y trata con una fosfatasa. Una molecula adaptadora de cadena unica se liga al extremo 3' de cada fragmento de ARN que comprende el complemento de un cebador unido a la superficie. Los fragmentos se agregan entonces a un soporte y se capturan por via de hibridacion. Las moleculas de ARN hibridadas se convierten a un duplex de ADN: ARN con una polimerasa de transcriptasa inversa. El complejo de transposoma o la composicion que comprende una transposasa y un duplex adaptador (es decir, el transposon) de un ME con P5 se utiliza para tagmentar el duplex. Luego de la extension de la cadena de ADN al extremo con una polimerasa que desplaza la cadena, las moleculas se pueden amplificar (por ejemplo, amplificacion de conjunto) y secuenciar.

La Figura 3 es un esquema que muestra un metodo de ejemplo suministrado aquf. Se utiliza un soporte que contiene dos cebadores injertados de superficie: un cebador de injerto estandar (por ejemplo P5) y un cebador de injerto modificado (por ejemplo P7) que tiene una secuencia de captura especifica de blanco en su lado cor riente abajo (3'). Un ejemplo de una secuencia especifica blanco es una secuencia oligo complementaria a la transcriptasa inversa retroviral (por ejemplo la VIH polimerasa). El ARN viral purificado se agrega al soporte, capturado por via de hibridacion, copiado con transcriptasa inversa y tagmentado. La secuenciacion se puede lograr con un cebador hibridado al adaptador tagmentado o al otro extremo de la sonda de captura.

La Figura 4 es un esquema que muestra un metodo de ejemplo suministrado aquf. Los transcriptos de ARN se generan de un plasmido que contiene la secuencia de transcripcion de la Protefna Fluorescente Verde (GFP) y la secuencia complementaria al cebador de union de superficie (por ejemplo, la secuencia P7'). Los transcriptos se hibridan a un soporte que comprende los cebadores que comprenden, por ejemplo, una secuencia P7. Las moleculas de ARN hibridadas se convierten a un duplex de ADN: ARN con una polimerasa de transcriptasa inversa. Un complejo de transposoma se utiliza para tagmentar el duplex. Luego de la extension de la cadena de ADN al extremo con una polimerasa que desplaza la cadena y la remocion de la cadena de ARN, las moleculas se pueden amplificar (por ejemplo amplificacion de conjunto y secuenciar).

La Figura 5 es una fotograffa de un gel que muestra los transcriptos de ARN generados de un plasmido que contiene Protefna Fluorescente Verde (GFP) y, opcionalmente, tratada con DNasa para remover el ADN (es decir, plasmido). Ningun ADN residual (es decir, plasmido) fue visible luego del tratamiento con DNasa del transcripto de ARN.

La Figura 6 muestra fotograffas de conjuntos tenidos con verde SYBR. Los carriles 1-4 Los carriles 1- 4 contenfan ADN PhiX y los carriles 5- 8 contenfan ARN GFP. Los carriles 5 y 6 contenian ARN que fue pretratado con DNasa para remover el ADN. Los carriles 7 y 8 contenfan ARN que fue pretratado con DNasa y tratado con RNasa como un control adicional. La primera extension se llevo a cabo utilizando la Transcriptasa Inversa del Virus de la Mieloblastosis de aves (AMV - RT) (carriles 2, 4, 6 y 8) o la ADN polimerasa de Fusion (carriles 1, 3, 5, y 7). Los carriles 3- 8 fueron tagmentados con un adaptador P5. La amplificacion del conjunto isotermico se llevo a cabo de manera estandar y los conjuntos se tineron con un verde SYBR.

Las Figuras 7A y 7B muestran graficas de lotes de cubrimiento de los datos de secuenciacion alineados provenientes de la secuenciacion de los carriles 1- 8 tal como se describio para la Figura 6.

La Figura 8 es un esquema que muestra un metodo de ejemplo suministrado aquf para el etiquetado del duplex de ADN: ADN. El ADN de cadena unica (ssADN) se fragmenta y los fragmentos se marcan con polinucleotidos mediante la desoxinucleotidil transferasa terminal. Los fragmentos son luego agregados a un soporte y capturados por via de hibridacion de la cola poliT con su complemento inmovilizado sobre el soporte solido. Las moleculas de ssADN hibridadas se convierten a un duplex de ADN: ADN con una ADN polimerasa. El complejo o composicion de transposoma que comprende una transposasa y un duplex adaptador (es decir, transposon) de una secuencia P5-seq se utiliza para tagmentar el duplex. Luego de la extension de la cadena de ADN al extremo con una polimerasa que desplaza la cadena, las moleculas se pueden amplificar (por ejemplo amplificacion de conjunto) y secuenciar.

La Figura 9 muestra fotograffas de conjuntos tenidos con Verde SYBR de un experimento disenado para generar datos que utilizan la muestra de transcripto de mARN completa. El carril 1 es una biblioteca estandar PhiX donde no existe tagmentacion. El carril 2 es un control negativo donde no se efectuo la adicion de cola y el carril 8 es un control negativo del dsADN. Los carriles 3 y 4 son el mismo experimento, exceptuando que los cebadores fueron diluidos para el carril 4. Los carriles 5 y 6 son el mismo experimento, excepto que los cebadores se diluyeron para el carril 6. El carril 7 utiliza hexameros de ARN aleatorios en lugar de hexameros de ADN aleatorios.

La Figura 10 muestra una fotograffa del cubrimiento de lecturas de secuenciacion alineadas para el GAPDH que sigue el metodo de la Figura 1. La captura del 3' superior demuestra la captura, fragmentacion, conjunto y alineada de un

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control de una muestra de mARN con cola poliA. El transcripto completo de fondo demuestra que el alineamiento del mARN de una muestra de mARN que fue enriquecida de un complejo de muestra de UHR ARN total, fragmentado enzimaticamente y poliadenilado para demostrar el cubrimiento del transcripto de mARN completo utilizando los metodos de la presente descripcion.

Descripcion detallada

Los protocolos habituales para secuenciacion de las muestras de ARN emplean todas una preparacion de muestra que convierte el ARN en la muestra en un formato de cADN de doble cadena antes de la secuenciacion. Se suministran aquf metodos para secuenciar muestras de ARN que evitan una preparacion de la fase de solucion de un cADN de cadena doble intermedio. Los metodos suministrados tambien dan como resultado la preservacion de la informacion encadenada durante la secuenciacion. Sin embargo, los metodos descritos aquf se podrfan utilizar para marcacion y secuenciacion para marcar y secuenciar ADN.

Se suministra aquf un metodo para etiquetar duplex de ADN: ARN. El metodo incluye las etapas de suministrar una composicion de transposasa y transposon, suministrando uno o mas duplex de ADN: ARN inmovilizados en un soporte, y poniendo en contacto la composicion de transposasa y transposon con el uno o mas duplex de ADN: ARN bajo condiciones en donde uno o mas duplex de ADN: ARN y la composicion de transposon sufren de una reaccion de transposicion para producir uno o mas duplex de ADN: ARN etiquetados. La composicion de transposon comprende una molecula de acido nucleico de doble cadena que comprende una cadena transferida y una cadena no transferida. Aunque se pueden ejemplificar los siguientes ejemplos utilizando duplex de ADN: ARN, ellos tambien podrfan ser responsables por los duplex de ADN:ARN donde sea apropiado (ver Figura 8).

Opcionalmente, los uno o mas duplex de ADN: ARN se etiquetan en el extremo 5' de la cadena de ARN. Opcionalmente, la cadena transferida comprende una etiqueta para preservar la informacion de la cadena. La reaccion de transposicion da como resultado una cadena de ARN etiquetada en 5' que comprende la cadena transferida y la composicion de transposon y el espacio entre el extremo 3' de la cadena de ADN y la cadena no transferida de la composicion de transposon. Opcionalmente, el metodo comprende ademas poner en contacto los uno o mas duplex de ADN: ARN etiquetados con la enzima que modifica el acido nucleico bajo condiciones para extender el extremo 3' de la cadena de ADN para copiar la cadena de ARN a su extremo 5'. La enzima que modifica el acido nucleico puede desplazar la cadena no transferida de la composicion de transposon.

La Figura 1 es un esquema que muestra un metodo de ejemplo suministrado aquf. En resumen, el mARN con una cola de poliA es capturado sobre un soporte (por ejemplo “flowcell”) por via de hibridacion a una sonda de captura de ADN poliT (o cebador) acoplada a la superficie del soporte. La cadena poliT se extiende luego polimerasa de transcriptasa inversa para hacer una molecula de cadena doble que comprende un duplex de ADN: ARN. Luego, una secuencia de complejo de transposoma (por ejemplo Tn5 unido con un transposon (por ejemplo, extremo de mosaico (ME)) y las secuencias complementarias a los cebadores de amplificacion de superficie (se agregan al soporte, los cuales “tagmentan” el duplex, ligando el oligo adaptador de ADN al extremo 5' de la cadena de ARN). Un polimerasa que desplaza la cadena (por ejemplo una polimerasa Bst) se puede utilizar para extender el extremo 3' de la cadena de ADN, desplazando la “cadena no transferida” del transposoma y copiando la cadena de ARN a su extremo quimerico de ADN 5'. La molecula de cadena doble se puede entonces amplificar (por ejemplo en conjunto) y secuenciar con un cebador de secuenciacion que comprende parcialmente la secuencia ME y la secuencia adaptadora corriente arriba. De manera alternativa, el otro extremo de la molecula (el extremo poliT) se puede secuenciar con un cebador que hibridiza corriente arriba la secuencia de poliT y se extiende con un nucleotido dATP natural antes de comenzar los ciclos de la qufmica SBS. La secuenciacion del extremo pareado tambien se posibilita mediante este metodo.

Cuando se suministra ssADN para secuenciacion se puede utilizar una aproximacion similar. Por ejemplo, el extremo 3' de los poli nucleotidos de ADN de cadena unica se pueden agregar a los nucleotidos al utilizar una desoxinucleotidil transferasa (TdT) terminal y cualquier dNTP tal como el dATP o el dTTP. Se podrfa utilizar cualquier metodo para agregar una cadena de nucleotidos al extremo de una molecula de ssADN. La Figura 8 es un ejemplo donde el poliA que contiene sondas de captura se inmoviliza sobre la superficie de soporte y se capturan las moleculas con una adicion de cola de ssADN- poliT. Cualquier secuencia de captura, que incluye aquella del extremo ssADN, se podrfa utilizar en tanto que las secuencias complementarias se suministran mediante la sonda de captura sobre el soporte y los nucleotidos del ssADN de tal manera que podrfa ocurrir la hibridacion. La extension de la sonda de captura para crear el dsADN mediante una polimerasa de aDn para crear el duplex de ADN: ADN, la ligadura transposicional de los adaptadores oligos y la amplificacion del desplazamiento de la cadena como se describio previamente se podrfan efectuar al suministrar moleculas de doble cadena para la formacion del conjunto. La molecula de doble cadena se podrfa amplificar (por ejemplo amplificacion de conjunto) y secuencial.

Por via de otro ejemplo (Figura 2) el ARN (total o enriquecido con poliA) se fragmenta, tratado con una fosfatasa, luego la molecula adaptadora de cadena simple se liga al extremo 3' de cada fragmento que comprende el complemento del cebador unido a la superficie P7. Los fragmentos son entonces agregados a un soporte (por ejemplo, “flowcell”) se capturan por via de hibridacion. Las moleculas de aire ARN hibridadas se convierten a un duplex de aDn: ARN con una polimerasa de transcriptasa inversa. El complejo de transposoma que comprende una transposasa y un duplex adaptador (transposon) de una secuencia ME con una secuencia cebadora P5 se puede utilizar para tagmentar el

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duplex. Luego de la extension de la cadena de ADN al extremo con una polimerasa que desplaza la cadena, las moleculas se pueden amplificar y secuenciar.

Por via de un ejemplo adicional (Figura 3), se utiliza un soporte especial (por ejemplo “flowcell”) que contiene dos cebadores injertados de superficie: un cebador de injerto estandar (por ejemplo P5) y un cebador de injerto modificado (por ejemplo P7) que tiene una sonda de captura especifica de blanco a su lado (3') corriente abajo. Un ejemplo de una sonda especifica de blanco es una secuencia oligo complementaria a una transcriptasa inversa retroviral (por ejemplo la VIH polimerasa). Se agrega el ARN viral purificado a un soporte, capturado por via de hibridacion, copiado con transcriptasa inversa y tagmentado. Se puede lograr la secuenciacion con un cebador hibridado al adaptador tagmentado o en el otro extremo de la sonda de captura. Opcionalmente, el soporte especial contiene multiples diferentes sondas de captura especfficas de blanco para posibilitar la captura simultanea para muchos diferentes blancos de ARN.

El uso de una reaccion de transposicion in vitro para etiquetar los duplex de ADN: ADN o de ADN: ARN para generar los duplex de ADN: ADN o de ADN: ARN etiquetados involucra una transposasa, una composicion de secuencia de transposon, y unas condiciones de reaccion adecuadas.

Como se utiliza en todo el documento, el termino transposon se refiere a un ADN de cadena doble que contiene las secuencias de nucleotido que son necesarias para formar el complejo con la transposasa o la enzima integrasa que es funcional en una reaccion de transposicion in vitro. Un transposon forma un complejo o un complejo sinaptico o un complejo de transposoma. El transposon tambien puede formar una composicion de transposoma con una transposasa o integrasa que reconoce y se une a la secuencia de transposon, y cuyo complejo es capaz de insertar o transponer el transposon en el ADN blanco con el cual este se incuba en una reaccion de transposicion in vitro. Un transposon exhibe dos secuencias complementarias que consisten de una secuencia de transposon transferida o una cadena transferida o una secuencia de transposon no transferida, o una cadena no transferida. Por ejemplo, un transposon que forma un complejo con una transposasa de Tn5 hiperactiva (por ejemplo, la Transposasa EZ- Tn5TM, EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI, USA) que esta activa en una reaccion de transposicion in vitro comprende la cadena transferida que exhibe una secuencia de transposon transferida de 5' AGATGTGTATAAGAGACAG 3', (SEQ ID NO: 1) y una cadena no transferida que exhibe una secuencia de transposon no transferida de 5'

CTGTCTCTTATACACATCT 3'. (SEQ ID NO: 2). El extremo 3' de una cadena transferida se une o se transfiere a el acido nucleico blanco en una reaccion de transposicion in vitro. La cadena no transferida, que exhibe la secuencia extrema de transposon que es complementaria a la secuencia extrema de transposon transferida, no se une o se transfiere al acido nucleico blanco en una reaccion de composicion in vitro. La composicion de transposon, como se utiliza aquf, se refiere a una composicion que comprende un transposon (es decir, el segmento de ADN de doble cadena mfnimo que es capaz de actuar con una transposasa para sufrir una reaccion de transposicion), que incluye opcionalmente secuencias adicionales. Por ejemplo, la composicion de transposon comprende dos oligonucleotidos de transposon que contienen el oligonucleotido de transposon transferido con la cadena transferida y el oligonucleotido de cadena no transferida o la cadena no transferida, la cual, en combinacion, exhiben las secuencias del transposon. Una o ambas cadenas pueden comprender la secuencia adicional. El transposon puede incluir oligonucleotidos de ocurrencia natural y/o de ocurrencia no natural y enlaces de estructura natural o no natural. Opcionalmente, el transposon puede tambien incluir una o mas porciones unidas a uno o mas nucleotidos que conforman el trasposon. Por ejemplo, una o ambas cadenas del transposon pueden ser biotiniladas o pueden contener una etiqueta, por ejemplo una etiqueta fluorescente.

Los terminos oligonucleotido de transposon transferido y cadena transferida se utilizan de manera intercambiable y se refieren a la porcion transferida de tanto los transposones como las composiciones de transposon, es decir, sin importar si el extremo de transposon se une a una etiqueta o a otra secuencia o porcion. De manera similar, los terminos oligonucleotidos de transposon no transferido y cadena no trasferida se utilizan intercambiablemente y se refieren a la porcion no transferida de tanto los transposones como las composiciones de transposon.

En algunas realizaciones, la composicion de transposon comprende o consiste de al menos un transposon con una o mas de otras secuencias de nucleotido ademas de las secuencias de transposon. Asf, en algunas realizaciones, la composicion de transposon comprende una cadena transferida con una o mas de otras secuencias 5' de nucleotido de la secuencia de transposon transferida, por ejemplo, una secuencia de etiqueta. Ademas de la secuencia de transposon transferida, la etiqueta puede tener una o mas porciones de etiqueta o dominios de etiqueta.

Como se utiliza aquf, una “etiqueta” se refiere a un componente de acido nucleico, generalmente ADN, que suministra unos medios para identificar o dirigir un fragmento de acido nucleico al cual este se une. Por ejemplo, una etiqueta comprende una secuencia de nucleotido que permite la identificacion, reconocimiento, y/o manipulacion molecular o bioqufmica del ADN al cual se une la etiqueta (por ejemplo, al suministrar un sitio para hibridar un oligonucleotido, tal como un cebador para la extension del ADN polimerasa, al suministrar un oligonucleotido para la captura o para una reaccion de ligado, o al suministrar la identificacion del acido nucleico como originario de una fuente particular, y similar) . El proceso de unir la etiqueta a una molecula de acido nucleico se denomina algunas veces aquf como “etiquetado” y los acidos nucleicos que sufren el etiquetado o que contienen la etiqueta se denominan como “etiquetado” (por ejemplo “ARN etiquetado”)

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Como se utiliza en toda la especificacion, el termino encadenamiento o informacion especffica de cadena se refiere a la preservacion del conocimiento en la direccion de la molecula de cadena unica original. Este se preserva en los metodos suministrados ya que se sabe que la cadena de ADN es complementaria a la cadena de ARN en los duplex de ADN: ARN. Asf, cuando se secuencia la cadena de ADN, la secuencia sera la secuencia de la cadena de ARN que preserva la informacion especffica de la cadena y permite la identificacion correcta de la molecula de ARN y/o su nivel de expresion. Los metodos para preservar la informacion especffica de cadena tambien se describen en la WO 2011/003630.

Sin embargo, el metodo descrito en la WO 2011/003630 requiere a una conversion de las moleculas de ARN en moleculas de cADN de cadena doble, el cual, como se describen aquf, no es tan eficiente como los metodos suministrados en la presente solicitud. Ademas, el metodo descrito en la Wo 2011/003630 requiere una etiqueta con el fin de preservar la informacion de cadena. En los metodos suministrados aquf, no se requiere una etiqueta para preservar la informacion especffica de cadena o el encadenamiento. En realizaciones donde la cadena de ADN (es decir, la primera cadena de ADN) de los duplex de ADN: ARN se amplifica para producir las primeras u segundas cadenas de ADN amplificadas. Se mantiene el encadenamiento mediante el conocimiento de que la primera cadena de ADN es complementaria a la cadena de ARN original y la segunda cadena de ADN es la misma secuencia que la cadena de ARN original (con la excepcion del Ts en la secuencia en lugar del Us). Asf, aunque una etiqueta (por ejemplo, una secuencia de etiqueta se puede incluir en la cadena transferida del transposon) se puede utilizar para preservar el encadenamiento, esta no se requiere.

Como se utiliza aquf, una porcion de etiqueta o un dominio de etiqueta significa una porcion o dominio de una etiqueta que exhibe una secuencia para un proposito o aplicacion pretendida deseada. Una porcion de etiqueta o un dominio de etiqueta es el dominio de transposon, cuya porcion de etiqueta o dominio de etiqueta exhibe la secuencia de trasposon transferida. En algunas realizaciones en donde la cadena transferida tambien exhibe una o mas secuencias de nucleotido, la etiqueta tambien tiene uno o mas de otros dominios de etiqueta, cada uno de cuyos dominios de etiqueta se suministra para cualquier proposito deseado. Por ejemplo, una composicion de transposon puede comprender (i) una cadena transferida que exhibe una o mas secuencias adicionales (ademas de la secuencia de transposon) que puede comprender un dominio de etiqueta seleccionado de entre una o mas de un dominio de etiqueta de sitio de restriccion, un dominio de etiqueta de captura, un dominio de etiqueta de secuenciacion, un dominio de etiqueta de amplificacion, un dominio de etiqueta de deteccion, un dominio de etiqueta de direccion, y un dominio promotor de transcripcion; y (ii) una cadena no transferida que exhibe la secuencia de transposon no transferida.

Si se utiliza una descripcion para un dominio de etiqueta, los nombres y las descripciones de los diferentes dominios de etiqueta son por conveniencia, tal como para hacer mas facil el entendimiento y discutir los propositos pretendidos y las aplicaciones de las diferentes porciones o dominios de la etiqueta en las diferentes realizaciones. Sin embargo, estos nombres y descripciones no pretenden limitar el uso o las aplicaciones de la etiqueta o de ninguno de sus dominios de etiqueta de ninguna manera. Asf, cualquier etiqueta particular o dominio de etiqueta se puede utilizar para cualquier proposito ademas de, o en lugar del proposito o la aplicacion primaria pretendida. Tambien, un dominio de etiqueta puede comprender dos o mas de otros dominios de etiqueta (por ejemplo, un dominio de etiqueta de secuenciacion puede comprender tanto el dominio de etiqueta de captura como un dominio de etiqueta de amplificacion) o un dominio de etiqueta puede suministrar las funciones o los propositos o aplicaciones de dos o mas diferentes dominios de etiqueta (por ejemplo, un dominio de etiqueta de captura tambien puede suministrar la funcion o proposito de secuenciar el dominio de etiqueta y/o un dominio de etiqueta de amplificacion para una aplicacion particular). Aun adicionalmente, la etiqueta no requiere ser descrita en terminos de uno o mas diferentes dominios con el fin de ser utilizada para cualquier proposito o aplicacion o funcion particular.

Como se utiliza en toda la especificacion, el termino transposasa se refiere a una enzima que es capaz de formar un complejo funcional con una composicion que contiene transposon (por ejemplo transposones, composiciones de transposon) y la insercion catalizadora o la transposicion de la composicion que contiene transposon en el acido nucleico blanco de doble cadena con el cual se incuba en una reaccion de transposicion in vitro. Una transposasa de los metodos suministrados tambien incluye integrasas provenientes de retrotransposones y retrovirus. Transposasas de ejemplo que se pueden utilizar en los metodos suministrados incluyen el tipo silvestre o las formas mutantes de la transposasa Tn5 y la transposasa MuA.

Una “reaccion de transposicion” es una reaccion en donde uno o mas de los transposones se insertan en los acidos nucleicos blanco en sitios aleatorios o casi en sitios aleatorios. Los componentes esenciales en la reaccion de transposicion son una transposasa y los oligonucleotidos de ADN que exhiben las secuencias de nucleotido de un transposon, incluyendo la secuencia de transposon transferida y su complemento (es decir, el transposon y la secuencia no transferida) asf como tambien otros componentes necesarios para formar una transposicion funcional o un complejo de transposoma. El metodo de esta invencion se ejemplifica al emplear un complejo de transposicion formado por una transposasa Tn5 hiperactiva y un extremo del transposon tipo Tn5 o por medio de una transposasa MuA o HYPERMu y un extremo de transposon Mu que comprende las secuencias de extremo R1 y R2 (See e.g., Goryshin, I. and Reznikoff, W. S., J. Biol. Chem., 273: 7367, 1998; and Mizuuchi, K., Cell, 35: 785, 1983; Savilahti, H, et al., EMBO J., 14: 4893, 1995; las cuales se incorporan aquf como referencia en su totalidad). Sin embargo, cualquier Sistema de transposicion que sea capaz de insertar un extremo del transposon de una manera aleatoria o casi aleatoria con suficiente eficiencia para etiquetar los acidos nucleicos blancos para su proposito pretendido se pueden utilizar en los metodos suministrados. Otros ejemplos de los sistemas de transposicion conocidos que se podrfan utilizar en los metodos

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suministrados incluyen pero no estan limitados a Staphilococuus aureus Tn552, Tyl, el Transposon Tn7, Tn/O y IS10, la transposasa Maruner, Tcl, el Elemento P, Tn3, las secuencias de insercion bacteriana, los retrovirus, y el retrotransposon de levadura (See, e.g., Colegio O R et al., J. Bacteriol., 183: 2384-8, 2001; Kirby C et al., Mol.

Microbiol., 43: 173-86, 2002; Devine S E, and Boeke J D., Nucleic Acids Res., 22: 3765-72, 1994; International Patent Application No. WO 95/23875; Craig, N L, Science. 27 1:1512, 1996; Craig, N L, Review in: Curr Top Microbiol Immunol., 204: 27-48, 1996;

Kleckner N, et al., Curr Top Microbiol Immunol., 204: 49-82, 1996; Lampe D J, et al., EMBO J., 15: 5470-9, 1996; Plasterk R H, Curr Top Microbiol Immunol, 204: 125-43,

1996; Gloor, G B, Methods Mol. Biol., 260: 97-1 14, 2004; Ichikawa H, and Ohtsubo E., J Biol. Chem. 265: 18829-32, 1990; Ohtsubo, F and Sekine, Y, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204: 1-26, 1996; Brown P O, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 2525-9,

1989; Boeke J D and Corces V G, Annu Rev Microbiol. 43: 403-34, 1989;

El metodo para insertar un transposon en la secuencia blanco se puede llevar a cabo in vitro utilizando cualquier sistema de transposon adecuado para lo cual esta disponible un sistema de transposicion in vitro adecuado o se puede desarrollar con base en el conocimiento de la tecnica. En general, un sistema de transposicion in vitro adecuado para uso en los metodos de la presente invencion requiere como mfnimo una enzima transposasa de pureza suficiente, concentracion suficiente, actividad de transposicion in vitro suficiente un transposon con el cual la transposasa forme un complejo funcional con la respectiva transposasa que sea capaz de catalizar la reaccion de transposicion. La secuencia del transposon de transposasa adecuadas que se pueden utilizar en la invencion incluye pero no estan limitadas a la tipo silvestre, las secuencias de transposon derivadas o mutantes que forman un complejo con la transposasa seleccionada de entre el tipo silvestre, la forma derivada mutante de la transposasa.

En los metodos suministrados, los duplex de ADN: ARN se pueden suministrar en una variedad de maneras. Por via de ejemplo, el soporte puede comprender una pluralidad de cebadores y los duplex de ADN: ARN se suministran al hibridar una o mas moleculas de ARN a los cebadores inmovilizados sobre el soporte y extendiendo los cebadores hibridados a las moleculas de ARN utilizando las moleculas de ARN como plantillas para producir los uno o mas duplex de ADN: ARN. Opcionalmente, se suministra una pluralidad de duplex de ADN: aRn al hibridar una pluralidad de moleculas de ARN a los cebadores inmovilizados sobre el soporte y extendiendo los cebadores hibridados a las moleculas de ARN utilizando las moleculas de ARN como plantilla para producir la pluralidad de duplex de ADN: ARN.

Como se establecio anteriormente, los metodos pueden comprender suministrar un soporte con una pluralidad de cebadores; los cebadores o un subconjunto de los mismos comprenden una secuencia capaz de unir a una o mas moleculas de ARN. Por ejemplo, los cebadores inmovilizados pueden incluir una secuencia de poliT y el ARN puede incluir una secuencia de poliA capaz de hibridar la secuencia de poliT. Alternativa o adicionalmente, la pluralidad de cebadores inmovilizados pueden incluir cebadores especfficos blanco capaces de hibridar a una o mas de las moleculas de ARN en la pluralidad de moleculas de ARN. Asf, la cadena de ARN de los uno o mas duplex de ADN: ARN comprende una secuencia complementaria a al menos una porcion de uno o mas de los cebadores inmovilizados. Opcionalmente, la pluralidad de cebadores inmovilizados comprende un primer subconjunto de cebadores de una primera secuencia y un segundo subconjunto de cebadores de una segunda secuencia. El primer o segundo subconjunto de cebadores puede comprender la secuencia poliT.

Opcionalmente, se puede agregar un adaptador 3' a la pluralidad de moleculas de ARN, el adaptador 3' comprende una secuencia complementaria a la pluralidad de cebadores inmovilizados o un subconjunto de los mismos. Tales moleculas de ARN ligadas al adaptador 3' se pueden entonces hibridar a los cebadores inmovilizados.

Asf, los cebaderos inmovilizados o un subconjunto de los mismos pueden comprender una secuencia poliT, una secuencia especffica blanco de ARN o una secuencia complementaria a un adaptador ligado a la molecula de ARN. Opcionalmente, la pluralidad de cebadores comprende al menos dos subconjuntos de cebadores, el primer subconjunto comprende una secuencia poliT, una secuencia especffica blanco de ARN o una secuencia complementaria a un adaptador ligado a la molecula de ARN, y el segundo subconjunto de cebadores comprende una secuencia que es capaz de unirse a una secuencia sobre la cadena de ADN de los duplex de ADN: ARN. Tal secuencia puede ser, por ejemplo, la misma secuencia que la secuencia de la cadena transferida del transposon. Como se describio en toda la especificacion, despues de la transposicion, habra un bache entre el extremo de la cadena de ADN y la cadena no transferida del transposon. La cadena de ADN se puede extender para copiar la cadena de ARN. La copia incluira copiar las secuencias de la cadena transferida del transposon. La cadena de ADN incluira entonces las secuencias complementarias a las secuencias de la cadena transferida del transposon y, asf, los cebadores o el subconjunto de los mismos sobre la superficie de soporte. En otras palabras, si uno o mas de los cebadores comprende una secuencia igual o similar a la cadena transferida del transposon, la cadena de ADN en los duplex de ADN: ARN sera capaz de hibridar a los cebadores ya que la cadena de ADN contiene una secuencia complementaria al cebador.

Se conocen las enzimas que modifican el acido nucleico adecuado capaces de extender el extremo 3' de las cadenas de ADN para copiar las cadenas de ARN a su extremo 5' y desplazar la cadena no transferida del transposon. En resumen, algunas ADN polimerasas son capaces de desplazar la cadena complementaria a la cadena de plantilla como

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una nueva cadena de ADN y sintetizada mediante la polimerasa. Este proceso se denomina desplazamiento de cadena y las ADN polimerasa que tienen esta actividad se denominan aquf como polimerasas de ADN que desplazan la cadena. En general, la polimerasa de ADN especifica de la plantilla de ADN utilizada para los metodos suministrados sintetiza eficientemente el ADN de una longitud adecuada para el proposito pretendido sin desacoplarse de la plantilla (o terminar la sfntesis del ADN), lo cual se denomina como la procesividad de la enzima. La capacidad de una ADN polimerasa para desplazar la cadena se puede determinar facilmente utilizando la polimerasa en un ensayo de replicacion de circulo rodante como se describio por Fire and Xu (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4641 -4645, 1995).

El desplazamiento de la cadena y la procesividad de la ADN polimerasa se puede ensayar utilizando los metodos descritos en Kong et al. (J. Biol. Chem. 268: 1965-1975, 1993).

La transferasa terminal tambien se define como una ADN polimerasa aquf, cuya ADN polimerasa se utiliza como una composicion en algunas realizaciones de los metodos suministrados. La transferasa terminal se puede utilizar porque esta cataliza la adicion independiente de la plantilla de los dNTP a los 3'-hidroxil terminales de ADN.

En los metodos suministrados aquf, el metodo puede ademas comprender secuenciar al menos una porcion de las cadenas de ADN y/o amplificar al menos una porcion de las cadenas de ADN. Opcionalmente, las cadenas de ARN provenientes de los duplex de ADN: ARN se pueden remover antes de secuenciacion y/o amplificacion. A manera de ejemplo, el metodo ademas comprende retirar las cadenas de ARN de los duplex de ADN: ARN y secuenciar al menos una porcion de las cadenas de ADN (es decir las primeras cadenas de ADN). El metodo tambien puede incluir copiar al menos una porcion de las cadenas de ADN para producir una segunda cadena de ADN complementaria a la cadena de ADN (es decir, la primera cadena de ADN) de los duplex de ADN: ARN. La segunda cadena de ADN complementaria se puede secuenciar, si se desea. Opcionalmente, la primera cadena de ADN de los duplex de ADN: ARN se puede retirar antes de secuenciar la segunda cadena de ADN complementaria.

En los metodos suministrados, opcionalmente, despues de retirar la cadena de ARN de los duplex de ADN: ARN, las cadenas de ADN se pueden amplificar para producir una pluralidad de moleculas de ADN de cadena doble que comprenden primeras y segundas cadenas amplificadas. Opcionalmente, la amplificacion produce un conjunto, descrito con mas detalle adelante.

En algunas realizaciones, cuando las cadenas de ADN han sido amplificadas para producir una pluralidad de moleculas de ADN de cadena doble, una o ambas cadenas se pueden secuenciar. Por via de ejemplo, los metodos pueden incluir retirar las primeras cadenas amplificadas seguidas al secuenciar al menos una porcion de las segundas cadenas amplificadas. Opcionalmente, las primeras cadenas amplificadas se pueden generar al copiar al menos una porcion de las segundas cadenas amplificadas. Las segundas cadenas amplificadas se pueden entonces retirar con el fin de secuenciar al menos una porcion de las primeras cadenas amplificadas. Opcionalmente, las lecturas de secuencia de una porcion o todo de uno o ambos de las primeras y segundas cadenas amplificadas se puede efectuar sin retirar todo o una porcion de cualquier cadena.

Se pueden utilizar varios protocolos para generar acidos nucleicos amplificados, por ejemplo, acidos nucleicos amplificados sobre un soporte. Por ejemplo, se pueden amplificar acidos nucleicos mediante PCR de emulsion, o PCR de puente (Mitra & Church Nucleic Acids Res. 27, e34 (1999); Dressman et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 100, 88 178822 (2003); Adessi, C. et al. Nucleic Acids Res. 28, e87 (2000); Fedurco et al. Nucleic Acids Res. 34, e22 (2006).

En las realizaciones que utilizan PCR de emulsion, los acidos nucleicos pueden ser amplificados mediante PCR en una emulsion de agua en aceite. En una realizacion, se utiliza un par cebador simple. Uno de los cebadores de PCR esta atado a la superficie (unido a 5') de un soporte (por ejemplo globulos a micro escala) y el otro cebador esta en solucion. Opcionalmente, el soporte comprende cebadores de mas de una secuencia, los cebadores son cebadores especfficos blanco capaces de hibridar a una o mas moleculas de ARN blanco y el cebador en solucion es la misma secuencia (por ejemplo una secuencia complementaria a la secuencia agregada a la cadena de ADN al copiar la cadena de ARN etiquetada a su extremo 5'). En general, una concentracion de plantilla baja da como resultado en la mayona de los compartimentos que contienen globulos que tienen cero o una molecula de plantilla presente. En los compartimentos de emulsion productiva (donde tanto el globulo como la molecula de plantilla esta presente), las moleculas de ARN se pueden capturar y/o el correspondiente complemento del ADN de la molecula de ARN amplificada a la superficie del globulo. Despues de descomponer la emulsion, los productos de amplificacion que llevan globulos se pueden enriquecer selectivamente. Cada globulo amplificado clonalmente llevara sobre su superficie los productos de PCR que corresponden a la amplificacion de una molecula unica proveniente de una biblioteca de plantilla. Varias realizaciones de los metodos PSR de emulsion que son utiles se establecen en las Publicaciones de las Solicitudes de Patente U.S. 2005/0042648 A1; 2005/0079510 A 1 y 2005/0130173 A 1, y WO 05/010145.

En las realizaciones que utilizan PCR puente, tambien conocidas como formacion de conjunto, los acidos nucleicos provenientes de la biblioteca de plantillas se pueden amplificar utilizando los cebadores recubiertos sobre la superficie de un soporte. Los cebadores se pueden unir a sus extremos 5' mediante un ligador flexible. Los productos de amplificacion que se originan de cualquier miembro dado de la biblioteca de plantilla permanecen localmente atados cerca al punto de origen. A la conclusion del PCR, cada conjunto clonal contiene varias copias de un miembro unico de la biblioteca de plantilla. Los metodos suministrados, cada duplex de ADN: ARN forma el origen de un conjunto clonal. Luego de la remocion de la cadena de ARN la cadena de ADN se puede copiar utilizando los cebadores unidos al soporte para generar copias amplificadas de la cadena de ADN para producir los conjuntos clonales. Varias

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realizaciones de los metodos PCR puente que son utiles se establecen en las Publicaciones de las Solicitudes de Patente U.S. No. 2007/0128624 A1, WO 07/010251, Patente U.S. No. 6, 090,592 y la Patente U.S. No.5, 641,658. Los metodos para llevar a cabo la amplificacion se describen en la Publicacion U.S. No. 2009/0226975; WO 98/44151; WO 00/18957; WO 02/46456; WO 06/064 199; y WO 07/0 10251.

Los metodos establecidos aquf pueden hacer o utilizar arreglos que tengan caracterfsticas de una cualquiera de una variedad de densidades que incluyen, por ejemplo, al menos aproximadamente 10 caracterfsticas /cm2, 100 caracterfsticas/cm2, 500 caracterfsticas /cm2, 1.000 caracterfsticas/cm2, 5.000 caracterfsticas/cm2, 10.000 caracterfsticas/cm2, 50.000caracteristicas/cm2, 100.000 caracterfsticas/cm2, 1.000.000 caracterfsticas/cm2, 5.000.000 caracterfsticas/cm2, o mas.

Como se utiliza aquf, el termino “acido nucleico” se puede utilizar para referirse a al menos dos monomeros de analogo de nucleotido ligados. Un acido nucleico puede contener enlaces de fosfodiester, sin embargo, en algunas realizaciones, el acido nucleico puede ser un analogo que tenga otros tipos de estructuras, que comprenden, por ejemplo, fosforamida, fosforotioato, fosforoditioato, estructuras de peptido de acido nucleico y enlaces, estructuras positivas, o estructuras no ionicas. Un acido nucleico puede incluir una porcion de pentosa tal como ribosa (actualmente en ARN de ocurrencia natural), desoxirribosa (presente en ADN de ocurrencia natural) o didesoxirribosa . En algunas realizaciones un acido nucleico puede tener una porcion no pentosa o un azucar carbocfclico en lugar de una ribosa o una porcion desoxirribosa. Un acido nucleico puede tener una o mas diferentes porciones base que incluyen, pero no estan limitadas a, adenina, (A), guanina (G), timina (T), uracilo (U), citosina (C), inosina, xantanina, hipoxantanina, isocitosina, isoguanina, nitropirrol (que incluye 3- nitropirrol) y/o nitroindol (que incluye 5-nitroindol). Un acido nucleico utilizado aquf puede incluir bases nativas o no nativas. Asf, un acido nucleico puede incluir nucleotidos de ocurrencia natural y/o de ocurrencia no natural y enlaces de estructuras naturales y no naturales. Los acidos nucleicos pueden ser de cadena simple o de cadena doble, tal como se especifico, o contener porciones de secuencias tanto de cadena doble como de cadena sencilla. El acido nucleico puede ser ADN (por ejemplo ADN genomico o cADN), ARN o un hfbrido.

Como se utiliza aquf, el termino “arreglo” significa una poblacion de diferentes moleculas que estan unidas a uno o mas soportes de tal manera que se pueden diferenciar diferentes moleculas una de la otra de acuerdo a su ubicacion relativa. Un arreglo puede incluir diferentes moleculas que se ubican cada una en diferentes ubicaciones dirigibles (por ejemplo una caracterfstica) sobre un soporte. De manera alternativa, un arreglo puede incluir soportes separados que lleva cada uno una molecula diferente, en donde las moleculas de sonda diferentes se pueden identificar de acuerdo a las ubicaciones de los soportes sobre una superficie a la cual los soportes se unen o de acuerdo a las ubicaciones de los soportes en ilfquido tal como una corriente de fluido. Las moleculas del arreglo pueden ser, por ejemplo, cebadores de acido nucleico, sondas de acido nucleico, plantillas de acido nucleico o enzimas de acido nucleico tal como polimerasas. Por ejemplo, en realizaciones particulares los acidos nucleicos blanco se pueden unir a una superficie de un detector o a una capa (por ejemplo una capa de acrilamida) que esta presente en la superficie del soporte. Los hidrogeles son particularmente utiles tal como aquellos establecidos en la Publicacion de Patente US No. 2011/0059865 A 1.

Como se utiliza aquf el termino “arreglo de acido nucleico” significa un soporte solido que tenga una pluralidad de acidos nucleicos espacialmente distinguibles dispuestos sobre este o en este. Los acidos nucleicos se pueden disponer en un patron de caracterfsticas ordenado o aleatorio. Una caracterfstica individual puede ser, por ejemplo, una molecula de acido nucleico espacialmente aislada, o un ensamble de moleculas de acido nucleico tal como un conjunto. Un arreglo puede ser un arreglo compuesto que comprenda una pluralidad de arreglos individuales configurados para permitir el procesamiento de multiples muestras. Los arreglos individuales denominados aquf como “subarreglos”, incluyen grupos de caracterfsticas de acido nucleico. Los subarreglos aparecen en distintas regiones con un arreglo mayor. Los subarreglos mismos se pueden ordenar o no ordenar. Tales subarreglos pueden ser dirigibles espacialmente de manera opcional. Los subarreglos pueden incluir conjuntos de acidos nucleicos identicos. Un ejemplo de un arreglo compuesto en subarreglos individuales es una placa de microtftulo que tiene pozos en cada placa como un todo es un arreglo de acidos nucleicos (o un arreglo de compuesto) en el cual cada pozo individual representa un subarreglo dentro del arreglo de compuesto mayor.

Como se utiliza aquf el termino “soporte” se refiere a un sustrato para inmovilizar un arreglo de acidos nucleicos. Un “soporte” es un material que tiene una superficie rfgida o semirrfgida a la cual el arreglo de acido nucleico se puede unir o a la cual los acidos nucleicos se pueden sintetizar y/o modificar. Los soportes pueden incluir cualquier resina, microglobulo, vidrio, vidrio poroso controlado (CPG), soporte de polfmero, membrana, papel, plastico, tubo o tableta plastica, globulo plastico, globulo de vidrio, lamina, ceramica, chip de silicio, placa multipozo, membrana de nylon, fibra optica, y membrana de PVDF.

Un soporte puede incluir cualquier sustrato similar a galleta plana y los sustratos planos que tengan pozos, tales como las placas de microtftulo, que incluyen placas de 96 pozos. Los sustratos planos de ejemplo incluyen chips, laminas, sustratos grabados, placas de microtftulo, y reactores de celda de flujo, que incluyen reactores de celda de flujo multicarril que tienen multiples canales de microfluido, tales como la celda de flujo de 8 canales utilizada en la estacion de trabajo de secuenciacion cBot (Ilumina, Inc., San Diego, CA). Las celdas de flujo de ejemplo que se pueden utilizar tambien se describen en la WO 2007/123744.

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Un soporte tambien puede incluir globulos, que incluyen globulos magneticos, globulos huecos, y globulos solidos. Los globulos se pueden utilizar en conjunto con soportes planos, tales soportes planos opcionalmente tambien contienen pozos. Los globulos o alternativamente las microesferas, se refieren de manera general a un cuerpo pequeno hecho de un material rfgido o semirrfgido. El cuerpo puede tener una forma caracterizada, por ejemplo, una esfera, oval, microesfera, u otra forma de partfcula reconocida sea que tenga dimensiones regulares o irregulares. Los tamanos de los globulos, en particular, incluyen, sin limitacion, aproximadamente un 1 pm, aproximadamente 2 pm, aproximadamente 3 pm, aproximadamente 5 pm, aproximadamente 10 pm, aproximadamente 20 pm, aproximadamente 30 pm, aproximadamente 40 pm, aproximadamente 60 pm, aproximadamente100 pm, aproximadamente 150 pm, o aproximadamente 200 pm de diametro. Se pueden utilizar otras partfculas de manera similares a aquellas descritas aquf para los globulos y las microesferas.

La composicion de un soporte puede variar, dependiendo por ejemplo, del formato, la qufmica y/o el metodo de union y/o el metodo de sfntesis del acido nucleico. Los materiales de soporte que se pueden utilizar de acuerdo con la presente descripcion incluyen, pero no estan limitados a, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, nylon, metales, y otros materiales adecuados. Las composiciones de ejemplo incluyen soportes, y funcionalidades qufmicas impartidas a estos, utilizadas en el polipeptido, polinucleotido y/o las sfntesis de porciones organicas. Tales composiciones incluyen, por ejemplo, plasticos, ceramicas, vidrio, poliestireno, melamina, metilestireno, polfmeros acrflicos, materiales paramagneticos, sol toria, grafito de carbono, dioxido de titanio, latex, o dextranos reticulados tales como cefarose™, celulosa, nylon, micelas reticuladas y teflon, asf como tambien otros materiales que se pueden encontrar descritos en, por ejemplo, “Microsphere Detection Guide" de Bangs Laboratories, Fishers IN.

Una partfcula de soporte se puede hacer de un almidon reticulado, dextranos, celulosa, protefnas, polfmeros organicos que incluyen polfmeros de estireno que incluyen poliestireno y metilestireno asf como tambien otros copolfmeros de estrireno, plasticos, vidrio, ceramicas, polfmeros acrflicos, materiales de respuesta magnetica, coloides, toreasol, grafito de carbono, dioxido de titanio, nylon, latex o TEFLON® “Microsphere Detection Guide" de Bangs Laboratories, Fishers IN. Es una gufa de ayuda. Soportes de ejemplo adicionales dentro del alcance de la presente descripcion incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en la Publicacion de la Solicitud US No.2012/0102578 y de la Patente U.S. No. 6, 429, 027.

La union de un acido nucleico a un soporte, sea rfgida o semirrfgida, puede ocurrir por via covalente o de enlaces no covalentes. Los enlaces de ejemplo se establecen en la patente U.S. Nos. 6, 737, 236; 7,259, 258; 7, 375, 234 y 7, 427, 678; y la Publicacion de Patente US No. 2011/0059865 A1. En algunas realizaciones, un acido nucleico u otro componente de reaccion se puede unir a un gel u otro soporte semisolido que a su vez este unido o adherido a un soporte de fase solida. En tales realizaciones, el acido nucleico u otro componente de la reaccion se entendera como la fase solida.

Opcionalmente, el soporte es un globulo o una pluralidad de globulos. Opcionalmente, el soporte es un soporte plano. Opcionalmente, se suministran una pluralidad de globulos, cada globulo comprende uno o mas duplex de ADN: ARN. Si un globulo comprende mas de un duplex de ADN: ARN, los duplex pueden ser de la misma secuencia o de diferente secuencia. Opcionalmente, se suministra una pluralidad de globulos cada globulo comprendiendo un duplex de ADN: ARN. Los globulos en la pluralidad de globulo pueden comprender el mismo o diferentes duplex de aDN: ARN. Por ejemplo, un primer subconjunto de globulos en la pluralidad de globulos puede comprender un duplex de ADN: ARN de una primera secuencia mientras que el segundo subconjunto de globulos en la pluralidad de globulos puede comprender un duplex de ADN: ARN de una segunda secuencia.

Cualquiera de una variedad de protocolos de secuenciacion y los respectivos reactivos se pueden utilizar en cualquier metodo o dispositivo establecido aquf. Las tecnicas mediante sfntesis de secuenciacion (SBS) generalmente involucra la extension enzimatica de una cadena de acido nucleico naciente a traves de la adicion iterativa de nucleotidos contra la cadena de la plantilla. El SBS puede utilizar monomero de nucleotido que tengan una porcion terminadora o aquellos que les falta las porciones terminadoras.

Los metodos que utilizan monomeros que tienen terminadores incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en la WO 04/018497, US 7,057,026, WO 91/106678, WO 07/ 123744, US 2007/0166705, US 2006/0188901, US 2006/0240439, US 2006/0281109, WO 05/065814, US 2005/0100900, WO 06/064199 o WO 070 1025 1.

Tambien son utiles los metodos SBS que estan comercialmente disponibles de Illumina, Inc., San Diego CA.

Las tecnicas SBS pueden utilizar monomeros de nucleotido que tengan una porcion de rotulo. De acuerdo con esto, los eventos de incorporacion se pueden detectar con base en las caracterfsticas del rotulo, tal como la fluorescencia del rotulo; una caracterfstica del monomero del nucleotido tal como el peso molecular o la carga; un subproducto de incorporacion del nucleotido, tal como la liberacion del pirofosfato o los protones; o similares. Los diferentes nucleotidos pueden ser distinguibles uno del otro, o alternativamente, los dos o mas diferentes rotulos pueden ser indistinguibles bajo las tecnicas de deteccion que sean utilizadas. Por ejemplo, los diferentes nucleotidos presentes en un reactivo de secuenciacion pueden tener diferentes rotulos y ellos se pueden distinguir utilizando opticas apropiadas como las ejemplificadas por medio de los metodos de secuenciacion desarrollados por Solexa (ahora IIlumina, Inc.). Sin embargo, tambien es posible utilizar el mismo rotulo para los dos o mas diferentes nucleotidos presentes en un reactivo de secuenciacion o para utilizar las opticas de deteccion que no distinguen necesariamente los rotulos diferentes.

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Los metodos que utilizan los monomeros de nucleotidos a los que le faltan los terminadores son tambien utiles incluyendo, por ejemplo, pirosecuenciacion. La pirosecuenciacion detecta la liberacion del pirofosfato inorganico (PPi) en la medida en que nucleotidos particulares se incorporan en la cadena naciente. (Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M. and Nyren, P. (1996) “Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release.” Analytical Biochemistry 242 (1), 84-9; Ronaghi, M. (200 1) “Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing.” Genome Res. 11 (1), 3-1 1; Ronaghi, M., Uhlen, M. and Nyren, P. (1998) “A sequencing method based on real-time pyrophosphate.” Science 28 1(5375), 363; Patente US No. 6, 210, 891; Patente Us No. 6, 258,568 y Patente US No. 6, 274,320.

En la pirosecuenciacion, el PPi liberado se puede detector al ser convertido a adenosina trifosfato (ATP) mediante ATP sulfurilasa, y el nivel del ATP generado se detecta por via de los fotones producidos por luciferasa.

Se pueden utilizar algunas realizaciones secuenciando mediante tecnicas de ligado. Tales tecnicas utilizan ADN ligasa para incorporar los oligonucleotidos. Los sistemas SBS de ejemplo y los metodos que se pueden utilizar con los metodos y sistemas descritos aquf se describen en la Patente U.S No. 6, 969, 488, la Patente Us No. 6, 172, 218, y la Patente U.S. No. 6, 306, 597.

Algunas realizaciones pueden utilizar metodos que involucran la vigilancia en tiempo real de la actividad de la ADN polimerasa. Las incorporaciones del nucleotido se pueden detectar a traves de interacciones de transferencia de energfa con resonancia de fluorescencia (FRET) entre la polimerasa que lleva el fluoroforo y los nucleotidos rotulados con y-fosfato como se describio, por ejemplo, en la Patente U.S. No. 7, 329, 492 y la Patente U.S. No. 7, 211, 414, o las incorporaciones de nucleotido se pueden detectar con gufas onda de modo cero como se describio, por ejemplo, en la Patente U.S. No. 7, 315, 019; y utilizando analogos de nucleotido fluorescente y polimerasas desarrolladas con ingenierfa como se describio, por ejemplo, en la Patente U.S. No. 7, 405, 281 y la Publicacion de la Solicitud de Patente No. 2008/0108082.

La iluminacion se puede restringir a un volumen de escala de zeplolitro alrededor de polimerasas atadas a la superficie de tal manera que la incorporacion de los nucleotidos rotulados fluorescentemente se pueden observar con bajo trasfondo (Levene, M. 1. et al. “Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations.” Science 299, 682-686 (2003);

Lundquist, P.M. et al. “Parallel confocal detection of single molecules in real time.” Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008); Korlach, J. et al. “Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures.” Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 105, 1 176-1181 (2008).

Se describieron materiales, composiciones y componentes que pueden ser utilizados para, se puede utilizar en conjunto, o se pueden utilizar en la preparacion para, o son productos de los metodos y composiciones descritos. Estos y otros materiales se describen aquf, y se entiende que cuando combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos y otros materiales se describen aquf, y se entiende que cuando se describen las combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos materiales que aunque no se describa de manera explfcita una referencia especffica de cada una de las varias combinaciones individuales y colectivas y permutaciones, cada una se contempla especfficamente y se describe aquf. Por ejemplo, si un metodo se describe y se discute y se puede hacer un numero de modificaciones a las etapas del metodo que se discuten, cada una de las combinaciones y permutaciones de las etapas del metodo y las modificaciones que son posibles se contemplan especfficamente a menos que especfficamente se indique lo contrario. De manera similar, cualquier subconjunto o combinacion de estos es tambien contemplada y descrita especfficamente. Este concepto aplica a todos los aspectos de esta descripcion. Asf, si existe una variedad de etapas adicionales que se puedan efectuar se entiende que cada una de estas etapas adicionales se puede efectuar con alguna de las etapas del metodo especfficas o combinaciones de las etapas de los metodos descritos, y que cada una de tales combinaciones o subconjunto de combinaciones se contempla especfficamente y se debe considerar descrita.

Se han descrito un numero de realizaciones. Sin embargo, se entendera que se pueden hacer varias modificaciones.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Secuenciacion de ARN que emplea reaccion de tagmentacion de un duplex de ADN: ARN.

Se efectua un experimento de ejemplo con un transcripto de ARN adaptado a P7', cuyo esquema se esboza en la Figura 4. Los transcriptos de ADN se generaron de un plasmido que contiene Protefna Fluorescente Verde (GFP) que utiliza el kit del sistema de transcripcion In vitro Riboprobe® de Promega (Madison, WI) siguiendo el protocolo del fabricante.

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La secuencia del cartucho de expresion GFP se muestra adelante (SEQ ID NO: 3). MU aa^tclacactctlteoctftcacft&cflctctticceatcttefl tacgflctea eta taegcaattttaa

ctttadtaai’pai’aatLcuccjafFaaaMJg^cMJgjgcij^ijgGACTACAAAGACGATGACGACAAGtt

egatcgtgagc&flgggcgasgafiCtfiTtcaccggfigtggrgeceatcetgBtcgagctggacggcgacgiaaacggccaca

agttcagcgtgtccggcggggcgagggcgatgceacaacggcaagclgaccclgaagltjcatctgcaccaccggcaagctg

cccgt gcc ctggcoc sccctc gtgacc ac c ctgacctacggcgtgcagtgcttca gc c gctaccc gaccacatgaagca gcac

gacttcttcaag(ccgccatgcccaaaggtlac:glccaggagcgcat(;atci[cltt:aa.ygacgatggcaactacaagacceg

cgHJCgaggLgaagtKgagggcgaaccttggigaaccgoatcgagctgaagggGatcgacttcaaggaggacggcoacatc

ct ggggca«!Bgctgga gtacaac tflcaacagccacaacgtaatalcatg gccgacaagcag aagaacgcatoaggtgaa

CttcaSigattC^CCajea&CHtcgHggaeggcHgcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacaoccccatcggcgacgE

ccccgtgctBctgicccgiBcaflccBotocctgBgcciccagtccgeectgageBaagaccccaaegagaagcgcgflilcacalgg

totget ggagttcgtgaccgpcgccgggatcfcctclcgggal ggacg a aciEtacaaataaclisctiJtxacc act eaeaataa

cf^rtffoffgcccftejgggcricfflflflcjgggfctfgflgggeJffJtfgaeatciiaaaBaacesaiEaftcaflitaatecccaaac

CgatcTCGTATGCCGTC TTCTGCTTG (SEQ !D NO:3)

El plasmido basado en pMA-T contiene P5 (subrayado), un promotor de polimerasa T7 (resaltado), un codon de inicio (resaltado y en italica), y una etiqueta His (en italica y subrayada), una etiqueta FLAG (en letras mayusculas) y una secuencia GFP, un codon de parada TAA (subrayado y resaltado), un terminador T7 (resaltado, en italica y subrayado), y P7' (en letras mayusculas y resaltado).

El transcripto de ARN se debe extender desde la secuencia promotora a la secuencia de terminacion T7. Sin embargo, el terminador T7 no detiene la transcripcion completamente y asf algunos de los transcriptos de ADN resultantes son His_FLAG_GFP_P7'. El transcripto de ARN se trato con DNasa para remover el ADN que de otra manera formana conjuntos. Con el fin de revisar que el tratamiento de DNasa fuera efectivo, se efectuo una reaccion y se analizo sobre un gel para sondear que el tratamiento de DNasa fuera efectivo al retirar el ADN. No fue visible ADN residual (es decir, plasmido) luego del tratamiento con DNasa del transcripto de ARN. (Figura 5).

Una biblioteca de ADN PhiX y los transcriptos de ARN GFP- P7' tratada con DNasa se hibridaron sobre diferentes carriles de un “flowcell” siguiendo el protocolo de conjunto estandar para la hibridacion de plantilla. Los carriles 1- 4 contenfan el ADN PhiX y los carriles 5 - 8 contenfan el ARN GFP. Los carriles 5 y 6 contenfan ARN que fue pretratado con DNasa para retirar el ADN. Los carriles 7 y 8 contenfan ARN que fue pretratado con DNasa y tratado con RNasa sobre el “flowcell” como un control adicional. La biblioteca de ADN PhiX se puede hibridar por via de P5 o P7 en la medida en que ambas secuencias y sus complementos esten presentes en la plantilla. En contraste, las plantillas de ARN GFP-P7' hibridan sobre los cebadores de superficie P7 solo en razon de su “encadenamiento” y la falta de una secuencia P5.

La primera extension se llevo a cabo utilizando transcriptasa Inversa del Virus de Mieloblastosis Avian (AMV - RT) (carriles 2, 4, 6, Y 8) o ADN polimerasa de fusion (carriles 1, 3, 5 y 7). El AMV- RT puede generar una cadena de cADN de cualquier plantilla de ARN o ADN, mientras que el “Phusion” solo puede generar una cadena de ADN de una plantilla de ADN.

Algunos carriles fueron transpuestos utilizando un complejo de transposoma que contiene la secuencia adaptadora P5 de la secuencia del transposon (carriles 3 - 8). Los baches dejados en la secuencia de ADN despues del evento de transposicion fueron llenados al utilizar una reaccion de extension de desplazamiento de cadena que contiene la ADN polimerasa Bst. El evento de transposicion se requiere en los carriles que contienen ARN GFP_P7' para agregar el adaptador P5 para generar una plantilla que pueda hacer conjuntos. La amplificacion del conjunto isotermico se llevo a cabo de manera estandar y los conjuntos se tineron con Verde SYBR. Las fotografias de los conjuntos se muestran en la Figura 6.

El carril 1 se controlo para generacion de conjuntos en la medida en que este contiene una muestra de ADN con formato estandar extendida con ADN polimerasa PHUSION. La generacion exitosa de conjuntos resulto como se muestra en la Figura 6.

El carril 2 demostro que las plantillas de ADN podfan ser extendidas de manera exitosa mediante una transcriptasa inversa (que genera un duplex de ADN: ADN) y hace los conjuntos bajo condiciones estandar (Figura 6).

Los carriles 3 y 4 demostraron que los duplex de ADN: ADN (extendidos con una ADN polimerasa PHUSION o un AMV - RT) se pueden tagmentar con un adaptador Tn5 y generar conjuntos (Figura 6).

El carril 5 no se esperarfa que generara conjuntos por que la ADN polimerasa PHUSION ha sido previamente reportada por no extenderse opuesta a una cadena de ARN. El numero pequeno de conjuntos observado puede ser debido a la plantilla de ADN residual utilizada para generar el ARN a pesar del tratamiento de DNasa, o algun grado de extension mediante la ADN polimerasa PHUSION del ARN opuesto al ADN (Figura 6).

5 Los carriles 7 y 8 no se esperarfan que exhibieran ninguna formacion de conjunto por que las plantillas han sido tratadas con RNasa y DNasa. Como se vio en el carril 5, el numero pequeno de conjuntos observado se puede deber a la plantilla de ADN residual utilizada para generar el ARN a pesar del tratamiento con DNasa (Figura 6).

El carril 6 de la Figura 6 demuestra la extension de la cadena de ADN contra la plantilla de ARN tal como se espero. No se esperara que se formaran estas plantillas extendidas de los conjuntos ya que ellos no poseen una secuencia P5. Sin 10 embargo, luego de la tagmentacion con el adaptador P5 (q. e. d. carril 6), ellos forman conjuntos. El numero pequeno de conjuntos en los carriles 5, 7 y 8 sugiere que existe un bajo nivel de contaminacion de ADN en la muestra de ARN, pero muestra que la mayorfa de los conjuntos en el carril 6 se generaron del ARN.

Los conjuntos del “flowcell” fueron entonces secuenciados. La Tabla 1 muestra los resultados de la secuenciacion.

Tabla 1. Resumen de secuenciacion

Carr il Rendimie nto del carril Conjunt os (bruto) Conjunt os (PF) 1mer Ciclo Int PF) % de Intensid ad despues de 20 ciclos (PF) %PF conjunt o % de alineaci on (PF) Calificacion de alineacion (PF) % de tasa de error (PF)

PhiX

1 116 177455 +/- 11971 161186 +/- 10237 289+ /-9 86080+/ -0.97 90388 +/-1.64 98.28+/- 0.22 166.43+/- 0.00166.03 +/-0.11 0.04+ /-0.00

PhiX

2 78 116338 +/-3547 108649 +/-3484 282+ /-8 86.4+/- 0.75 93.39+ /-0.37 98.11+/- 0.07 166.03+/- 0.11 0.05+ /-0.01

PhiX+Tn

3 40 63725+/ -1557 55752+/ -1477 289+ /-4 87.78+/- 1.13 87.49+ /-0.34 58.26+/- 0.25 96.55+0.39 0.28+ /-0.00

PhiX+Tn

4 23 42441+/ -1497 32075+/ -1307 267+ /-16 88.48+/- 1.77 75.56+ /-0.76 35.54+/- 0.63 57.81+/- 0.99 0.49+ /-0.02

RNA+Tn

5 3 13608+/ -731 4332+/- 510 295+ /-54 121.18+ /-17.78 32.00+ /-4.62 55.95+/- 15.91 49.00+/- 24.03 2.76+ /-0.37

RNA+Tn

6 4 20916+/ -1519 5701+/- 1642 179+ /-35 219.02+ /-82.12 26.98+ /-6.47 25.45+/- 8.27 19.48+/- 13.01 2.77+ /-0.70

RNA+Tn+RN Asa

7 1 22597+/ -4274 1627+/- 317 190+ /-65 104.24+ /-35.64 7.43+/- 1.99 12.12+/- 6.14 3.69+/-2.40 3.45+ /-0.83

RNA+Tn+RN Asa

8 1 45904+/ -10022 1033+/- 156 178+ /-22 108.42+ /-12.14 2.26+/- 0.35 41.32+/- 9.19 46.18+/- 19.94 1.47+ /-0.72

15

Carriles 1, 3, 5 y 7 se amplificaron con Phusion, no se asumio para amplificar ARN.

Los carriles 2, 4, 6, y 8 se amplificaron con AMV-RT, el cual amplifico el ADN y el ARN.

La secuenciacion para los carriles 1 y 2 no traspuestos con SBS3+T, para los carriles transpuestos 3-8 con cebador Nx- R1

20 La matriz y la fase ajustada, carriles 5 - 8 alineados a GFP.

Como se espero, mas del 90% de los conjuntos pasaron los filtros de castidad para el carril 1 y 2 y de estos mas del 98% se alinearon con PhiX tal como se espero (Tabla 1). Los carriles 3 y 4 que contenfan los duplex de ADN: ADN tagmentado exhibieron 10 - 20% de reduccion en los conjuntos que pasaron el filtro, de los cuales 75 - 87% de los conjuntos se alinearon a PhiX. Dado que esa tagmentacion puede reducir la longitud de una plantilla, en algunos casos 25 a una longitud demasiado corta para alinearse efectivamente, no se espera una reduccion en los conjuntos que pasen los filtros y alineacion. Los conjuntos en los carriles 7 y 8 no deben secuenciarse bien ya que no debe haber ninguna plantilla presente (con la excepcion de las plantillas de ADN contaminantes o tocones de ARN no digeridos). Como se espero muy pocos conjuntos pasaron los filtros. Menos del 7% de los conjuntos pasaron los filtros de los cuales solamente el 12% se alineo para las plantillas extendidas de ADN polimerasa PHUSION el 41% se alineo para las 30 plantillas extendidas AMV-RT. Cuando no se hizo un tratamiento con RNasa, solamente la DNasa y la ARN extendida con Phusion 32% de los conjuntos pasaron los filtros de los cuales 56 +/-16% se alinearon (carril 5, Tabla 1). Esto se puede deber a la combinacion de las plantillas de ADN residual y alguna extension del ARN opuesto al ADN mediante la ADN polimerasa PHUSION. En contraste, aproximadamente el 50% mas de los conjuntos de observaron en el carril,

5

10

15

20

25

30

donde la plantilla de ARN tratada con DNasa se extendio con el AMV - RT y de los cuales un porcentaje similar paso el filtro (~ 27%) al carril 6 con el 25% de alineacion.

Los datos alineados se utilizaron para generar graficas de cubrimiento (Figura 7). Los carriles 1 - 4 dieron el cubrimiento del genoma completo del PhiX tal como se espero. Los carriles que contenfan ADN tagmentado (carriles 3 y 4) dieron mas cubrimiento no homogeneo. Los carriles 5 - 8, que contenfan muestras de ARN tagmentado mostraron todos cubrimiento parcial del GFP, que indica que la tagmentacion de la plantilla ha generado conjuntos. Dado que algunos de estos se pueden derivar de la plantilla de ADN residual, el carril 6 muestra el cubrimiento mas amplio de la plantilla GFP, que indica que las moleculas de ARN extendidas con AMV - RT han sido tagmentadas exitosamente.

Ejemplo 2. Secuenciacion de ARN que emplea una reaccion de tagmentacion de muestras humanas.

Un “flowcell” con 8 carriles se preparo comprendiendo cebadores capaces de hibridar a las moleculas de ARN que comprenden una cola de poliA como sigue. El carril 1 fue injertado con una mezcla oligo estandar que comprende solamente los oligos P5 y P7 y los carriles 2 - 8 fueron injertados con una mezcla estandar (oligos P5 y P7) mas el oligo de captura (es decir el cebador que comprende una secuencia poliT para unirse a las moleculas de ARN que comprenden una cola PoliA). Despues del injerto del cebador, el “flowcell” se almaceno a 4°C hasta que se utilizo.

Para los carriles 1 y 2, 5 pM de las muestras de biblioteca de control PhiX se prepararon y agregaron al “flowcell” para hibridacion. Para cada carriel 3 - 8, se prepararon 400 ng de una muestra de ARN y se agregaron al “flowcell” para hibridacion. Los carriles 3 y 4 contenfan aRn humano de Clontech (Mountain View, CA) Los carriles 5 y 6 contenfan ARN humano del cerebro. Los carriles 7 y 8 contenfan ARN de referencia humana universal (UHR). Despues de la hibridacion de la plantilla, se administro el amortiguador a traves del “flowcell”, para retirar la plantilla no hibridada. Las plantillas hibridadas se extendieron utilizando AMV - RT (NEB, Ipswich, MA) en todos los carriles, que produjeron duplex de ADN: ARN en los carriles 3 - 8.

Mientras que los carriles 3- 8 fueron conectados con los complejos de transposoma, los carriles 1 y 2 fueron puestos en contacto con un volumen equivalente de amortiguador de lavado. Se prepararon complejos de transposoma mezclas de dos diferentes concentraciones. Las mezclas para los carriles 3, 5 y 7 se prepararon con 1.25 pl del complejo de transposoma, 100 pl de amortiguador y 400 pl de agua. La mezcla para los carriles 4, 6 y 8 se preparo con 0.625 pl de complejo de transposoma, 100 pl de amortiguador y 400 pl de agua. 95 pl de mezclas de complejo de transposoma se agregaron a los carriles 3- 8 del “flowcell” para tagmentacion. Para retirar la transposasa despues de la tagmentacion, se agrego amortiguador caotropico a los carriles 3- 8 del “flowcell” y se incubo durante 2 minutos. Los carriles del “flowcell” fueron entonces lavados dos veces. Despues de lavado, se utilizo la enzima Bst para extension de desplazamiento de cadena de los duplex de ADN: ARN tagmentados para remover la cadena no transferida del transposon y hacer la cadena de ADN de los duplex de ADN: ARN de longitud completa para formar conjuntos. Las cadenas de ARN fueron removidas y los conjuntos fueron entonces generados utilizando amplificacion isotermica. Los conjuntos fueron entonces secuenciados. La Tabla 2 muestra los resultados de la secuenciacion.

Tabla 2. Resumen de la secuenciacion

Carril

Muestra Conjuntos (bruto) Conjuntos (PF) 1 Ciclo Int (PF) % int despues de 20 ciclos (PF) % PF conjuntos % de alineacion (PF) % de tasa de error (PF)

1

ADN PhiX Cebador 2 73569+/- 8007 68422+/- 7981 284+/-13 87.51+/- 2.89 92.94+/- 0.77 97.99+/- 0.23 0.06+/- 0.00

2

ADN PhiX Cebador 3 18553+/- 2932 11200+/- 2451 206+/-10 99.83+/- 6.39 60.00+/- 4.34 1.55+/- 1.36 8.78+ 1.60

3

Clontech 1x Tn5 187046+/- 29545 164971+/- 26054 209+/-13 85.35+/- 2.94 88.23+/- 1.30 73.27+/- 0.46 0.30+/- 0.00

4

Clontech 0.5x Tn5 109889+/- 13109 99558+/- 13108 211+/-10 87.58+/- 4.32 90.49+/- 1.19 73.91+/- 0.56 0.27+/- 0.02

5

Cerebro 0.5 xTn5 226164+/- 31941 198031+/- 28192 218+/-6 84.55+/- 2.36 87.55+/- 0.97 75.27+/- 0.36 0.36+/- 0.20

6

Cerebro 0.5x Tn5 125939+/- 21818 113273+/- 18279 212+/-12 86.85+/- 30.9 90.06+/- 1.20 75.91+/- 0.13 0.24+/- 0.00

7

UHR 1X Tn5 310276+/- 21976 269047+/- 17778 195+/-7 96.77+/- 2.14 86.75+/- 1.68 67.70+/- 0.38 0.27+/- 0.04

5

10

15

20

25

8

UHR 0.5X 195323+/- 172838+/- 211+/-16 86.70+/- 86.47+/- 68.14+/- 0.36+/-

Tn5 16530 15327 1.77 0.67 0.52 0.30

Los resultados de la secuenciacion se compararon con los resultados obtenidos para la secuenciacion de ARN estandar del ARN de cerebro humano y el ARN de referencia humana universal, que se llevo a cabo de acuerdo con los metodos de secuenciacion Illumina estandar utilizando los reactivos de secuenciacion Illumina estandar. Tales metodos se describen en la gufa de reparacion de muestra de ARN TruSeq y la Gufa de Usuario HiSeq2000. Las gufas y los reactivos estan disponibles de Illumina, Inc. (San Diego, CA). Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Comparacion del metodo de tagmentacion con el metodo de secuenciacion de ARN estandar

ARN Clontech ARN UHR ARN de cerebro Secuenciacion Estandar de ARN

Lectura 1 Lect Lectura 1 Lect Lectura 1 Lect UHR UH Cerebr Cere

ura ura ura R o bro

2 2 2

Conjuntos

16.000 16.000 16.000

Totales

.000 .000 .000

PFClusters

14.113 100 100 14.008 100 100 13.957 100 100 78.895 100 80.670. 100

.235 % % .505 % % .990 % % .928 % 795 %

usableClus

9.005. 63. 62.6 8.756. 62. 60.9 8.956. 64. 61.1 59.010 74. 59.821. 74.2

ters

973. 8% % 482 5% % 350 2% % .700 8% 123. %

noMatch

622.29 4.4 2.2 600.13 4.3 2.7 484.15 3.5 3.1 1.352. 1.7 1.503.3 1.9%

4 % % 8 % % 8 % 439 % 46

repeatMas

4.484. 31. 35.1 4.651. 33. 36.4 4.517. 32. 35.7 18.525 23. 19.342. 24%

ked

041 8% % 421 2% % 061 4% % .758 5% 556

spliceUsab

9.058 0.1 4.9 6.427 0% 3.3 22.719 0.2 7.0 9.357. 11. 6.959.6 8.6%

le

% % % % % 715 9% 93

genomeUs

8.996. 63. 57.8 8.750. 62. 57.6 8.933. 64 54.1 49.652 62. 52.861. 65.5

able

915 7% % 055 5% % 631 % % .985 9% 430. %

chrM.fa

2.045. 14. 14.1 2.570. 18. 17.9 737.70 5.3 5.3 5.710. 7.2 10.414. 12.9

187 5% % 314 3% % 6 % % 330 % 460 %

humRiboso

9.409 0.1 0.1 7.248 0.1 0.1 8.839 0.1 0.1 1.789. 2.3 2.349.2 2.9%

mal.fa

% % % % % % 882 % 50

Los resultados muestran una distribucion de alineamiento normal para las muestras de ARN secuenciadas utilizando el metodo de tagmentacion suministrado aquf. Los resultados muestran mayores conjuntos enmascarados repetidos probablemente debido a los mayores numeros de secuencia de poliA y mas repetidos en las regiones UTR3' de las muestras de ARN analizadas mediante el metodo de tagmetacion. Las lecturas utilizables fueron aproximadamente 10% inferiores que el protocolo de secuenciacion de ARN estandar de nuevo probablemente debido a mas repeticiones en el ARN que fue analizado. La cantidad de ARN ribosomico es baja como se esperarfa ya que el mARN se aislo y secuencio en el metodo de tagmentacion suministrado aquf. El ARN mitocondrial esta dentro de los lfmites normales.

Ejemplo 3: Secuenciacion de ARN que emplea una reaccion de tagmentacion y un lisado de celula.

Este ejemplo demuestra que las plantillas de acido nucleico se pueden capturar, tagmentar y secuenciar sobre un soporte solido utilizando un lisado de celula cruda. En resumen, celulas de raton fueron lisadas utilizando una solucion de Triton- X y Proteinasa K. El lisado se aplico a un “flowcell”, el mARN se capturo y tagmento, y los conjuntos fueron creados y secuenciados. Como un control y para comparacion, tambien se capturo, tagmento, se puso en conjunto y se secuencio ARN total de Referencia Humana Universal (UHR). La Tabla 4 hace un resumen de los resultados de las lecturas duplicadas para cada tipo de muestra.

Tabla 4. Comparacion de los datos de secuenciacion entre UHR y mARN de lisado.

UHR Lisado de celula de raton

R1 R2 R1 R2

Lecturas totales

4.726.081 1.905.434

%PF

86.89% 84.59% 83.94% 84.79%

5

10

15

20

25

UHR Lisado de celula de raton

R1 R2 R1 R2

Alineado (de las lecturas % PF)

61.14% 73.97% 49.17% 68.16%

No alineado (de las lecturas %PF)

28.42% 12.00% 34.01% 8.45%

Abundante (de las lecturas %PF)

10.44% 14.03% 16.82% 23.39%

Alineamientos empalmados (% de bases alineadas )

0.80% 11.14% 0.62% 10.73%

Alineamientos empalmados (de las lecturas %PF)

0.4893% 8.2435 0.3054 7.3138

Ribosoma humano

0.21% 0.04% 3.98% 4.88%

5Sr humano

0.01% 0.01% 0.02% 0.17%

Inserto mediano

135 129

Inserto SD

67.99% 66.97 30

duplicados

41.66% 45.54

La Tabla 4 demuestra que la secuencia se obtuvo directamente del mARN capturado de un lisado crudo de celula de raton. El porcentaje de las lecturas alineadas cayo solo aproximadamente el 10% cuando se capturo el mARN directamente de los lisados crudos de celula comparados con la muestra de ARN UHR (alineados de las lecturas % PF). Datos de secuenciacion adicionales que comparan el control UHR con el lisado de raton derivado del mARN reportaron que se capturo la cadena correcta y que se alineo al > 97% tanto para el UHR como para el mARN de lisado de raton. Ademas, el cubrimiento fue comparable entre el control de UHR y el mARN del lisado; aproximadamente el 65% de la region no traducida (UTR), aproximadamente el 16% de la region codificante, aproximadamente el 13% de la region intergenica, y pequenos porcentajes de lectura sintronicos. Como tal, los presentes metodos pueden ser utilizados para capturar, tagmentar, hacer conjuntos y secuenciar mARN de los listados de crudo.

Ejemplo 4. Secuenciacion de ARN que emplea una reaccion de tagmentacion del transcripto de mARN completo.

Este experimento se efectuo para demostrar que la muestra de mARN que presenta un transcripto completo se puede capturar y tagmentar sobre un soporte solido para suministrar informacion de secuencia siguiendo los metodos descritos aquf. En resumen, el enriquecimiento del ARN poliA se efectuo de 50ug de ARN total UHR (Agilent) que utiliza el kit Puris PoliA (Ambion). La fragmentacion del ARN y el mARN enriquecido con poliA fue hecho en 25 ul de amortiguador 1X T4 PNK (Epicentre) con 100ng de ARN poliA, donde la muestra se calento a 95°C durante 5 min y se enfrio sobre hielo. El ARN fragmentado se fosforilo con PNK T4 y los fragmentos fueron puestos en cola con poliA utilizando 4 unidades de polimerasa poliA de E. coli en 50 ul de amortiguador de polimerasa PoliA 2X que contiene 2mM de ATP de (Epicentre). El mARN fragmentado poliadenilado se purifico utilizando un kit de limpieza y concentracion de ARN (Zymo Research). Los controles incluyeron un control PhiX para validar el desempeno de la qufmica de secuenciacion y una muestra poliadenilada derivada del mARN no total que se capturo y tagmento para comparar con el transcripto completo del mARN capturado de la agrupacion UHR de ARN total complejo.

Los datos de secuenciacion del replicado 1 (R1) de 2 se reporta en la Tabla 5 para el control (ctrl) pHIx, la muestra mARN de control (captura 3') y el mARN derivado de la muestra de ARN total (transcripto completo).

Tabla 5. Resumen de la secuencia de replicado para el transcripto mARN completo

R1

Rendimi ento de muestra (Mb) Conjunt os (bruto) Conjunt os (PF) Prim er ciclo Int (PF) % de intensi dad despue s de 20 ciclos (PF) % de conjun tos (PF) % de alineac ion (PF) Calificaci on de alineami ento (PF) % tasa de no coincide ncia (PF) % >= base s Q 30(P F) SCor e Calid ad Medi a (PF)

Control

317 7.079.8 10 6.343.6 92 268 86.78 89.6 97.89 251.82 015 98.3 5 39.12

Captura 3'

1.077 28.753. 789 21.543. 617 290 85.17 74.92 57.15 75.08 0.74 92.3 4 36.58

5

10

15

20

25

R1

Rendimi ento de muestra (Mb) Conjunt os (bruto) Conjunt os (PF) Prim er ciclo Int (PF) % de intensi dad despue s de 20 ciclos (PF) % de conjun tos (PF) % de alineac ion (PF) Calificaci on de alineami ento (PF) % tasa de no coincide ncia (PF) % >= base s Q 30(P F) SCor e Calid ad Medi a (PF)

Transcri pto complet o.

752 19.474. 750 15.040. 807 323 83.03 77.23 49.85 70.27 1.63 91.8 9 36.51

La Tabla 5 reporta que el porcentaje de lecturas alineadas fue comparable sin importar la fuente del mARNA (% de alineacion (PF)) con una generacion de conjunto alta. Adicionalmente, los datos de secuencia mostraron que el cubrimiento del transcripto del mARN de control (captura 3') fue de aproximadamente 70 %UTR, 19% de la region codificante seguida por el cubrimiento de la region intergenica e intronica. El cubrimiento del transcripto del mARN derivado del ARN total del complejo fue de aproximadamente 43% UTR, 37% codificante y relativamente similar para las regiones intergenica e intronica. La Figura 10 demuestra el cubrimiento del transcripto alineado para un gen representativo, GAPDH; el mARN de control (captura 3') muestra el cubrimiento principalmente en la region 3' del gen tal como se esperaba, mientras que el cubrimiento del mARN derivado del ARN total (transcripto completo) mostro mas cubrimiento completo de ambas regiones la exonica como la UTR. Como tal, aunque las secuencias mARN de control alineadas a aquellas regiones asociadas con el extremo 3' del transcripto (region de cola poliA), el cubrimiento del mARN derivado del ARN total demostro ser mas completo, lecturas del transcripto total, demostrando de esta manera la utilidad de los metodos para obtener la informacion del transcripto completo de una muestra.

Un flujo de trabajo alternativo se efectuo para enriquecer el mARN de la muestra de ARN total UHR para la secuenciacion del transcripto completo. El cADN de cadena doble se preparo de 500ng del ARN total UHR y 50 ng de hexameros de ADN aleatorio. Los cebadores en exceso fueron degradados al agregar 20 unidades de Exonucleasa 1 (Epicentro), incubando a 37°C durante 30 min seguidos por inactivacion con calor de la enzima. El ARN se removio y la mezcla de enzima de un U de RNasa I/10 U Hibridaza (RNasa H, Epicentro) a 55°C durante 10 min. La reaccion se purifico utilizando volumenes iguales de globulos AMpure (Agencourt) y el ADN se eluyo en 10 mM de amortiguador Tris HCL (pH 8.0). EL cADN se le coloco una cola poliA utilizando 20 U de Transferasa Terminal (New England Biolabs), 1mM de ATP y 1X de amortiguador de Transferasa, incubando a 37°C durante 10 min. Seguido por inactivacion con calor. Para algunas de las muestras, se utilizo una dilucion 1:10 de los hexameros de ADN aleatorios. Ademas, para algunas de las muestras se omitio la etapa de la Exonucleasa I. Las muestras fueron entonces aplicadas a un “flowcell” capturadas, tagmentadas, puestas en conjunto y secuenciadas. Los controles incluyeron el control (ctrl) PhiX , el cADN sin cola (ctrl sin cola), un control negativo dsADN, una muestra de mARN purificada que siguio el mismo metodo como se describio anteriormente excepto utilizando los examenes de ARN aleatorio y omitiendo la etapa de la Exonucleasa I.

La Tabla 6 resume las primeras dos corridas de secuenciacion de replica

Tabla 6. Resumen de secuencia de replica para el transcripto de mARN completo alternativo.

R1

Rendimie nto (Mb) Conjun to (crudo) Conjun to (PF) 1er cicl o Int (P F) % intensid ad despue s de 20 ciclos (PF) % de conjunt os (PF) % de alineamie nto (PF) Calificaci on de alineamie nto (PF) % de fndice de no coincide ncia (PF) % >= Q30 bas es (PF) SCor e de calid ad medi a (PF)

Carril 1-

227 7.040.9 6.480.3 31 89.58 92.04 98.16 165.52 0.08 98.2 38.8

ctrl

39 17 7 5 8

PhiX

Carril 2-

3 773.38 76.281 24 84.82 9.86 0.15 0.05 5.04 42.1 20.1

ctrl sin

4 6 1 3

cola

Carril 3-

62 3.504.5 1.783.4 42 75.32 50.89 20.14 13.65 1.29 85.9 34.5

ARNas

36 82 0 6 7

a, AMP,

cola

Carril 4-

15 1.353.5 429.35 33 91.53 31.72 8.37 6.38 1 62.0 27.8

1:10

20 2 9 2 8

5

10

15

20

25

R1

Rendimie nto (Mb) Conjun to (crudo) Conjun to (PF) 1er cicl o Int (P F) % intensid ad despue s de 20 ciclos (PF) % de conjunt os (PF) % de alineamie nto (PF) Calificaci on de alineamie nto (PF) % de fndice de no coincide ncia (PF) % >= Q30 bas es (PF) SCor e de calid ad medi a (PF)

CARRI L 5- Exo, ARNas a, AMP, cola

97 4.922.1 87 2.774.8 12 37 3 83.4 56.37 40.74 27.62 1.47 86.6 8 34.8

Carril 61:10

7 844.73 1 198.05 2 31 7 79.07 23.45 13.09 6.81 1.38 42.7 6 21.1 5

Carril 7- cebado res de ARN

29 2.164.6 33 840.37 3 37 7 92.34 38.82 17.28 13.89 0.7 79.1 4 32.8 8

Carril 8- ds cADN

8 852.45 0 219.35 6 31 1 97.61 25.73 1.3 0.32 2.61 48.1 5 23.6

La Tabla 6 demuestra que el metodo de preparacion de tratar una muestra con nucleasas, Exo 1 y RNasa H e I, seguido por purificacion de globulo y colocacion de cola poliA (Exco, ARNasa, AMP, cola) se puede utilizar para suministrar la muestra de transcripto de mARN completa para secuenciacion. La Figura 9 muestra fotograffas de puestas en conjunto sobre el “flowcell” con respecto a las diferentes condiciones identificadas en la Tabla 6. Los carriles 1-8 en la Tabla 1 corresponden a los carriles 1- 8 en la Figura 9. El control positivo PhiX muestra un gran numero de conjuntos que corresponden al mas alto rendimiento del conteo del conjunto en los datos de secuenciacion. Los carriles 2 y 8 de control negativo, que muestran menor numero de conjuntos tambien corresponden a dos de los tres rendimientos mas bajos y los conteos de conjuntos en los datos de secuenciacion. Diluir los cebadores de examen o de ADN aleatorio 1: 10, sin importar la digestion de la exonucleasa en el metodo de preparacion, no fue optimo para la secuenciacion, lo que muestra un bajo conteo de conjunto en la Tabla 6 soportado por mas pocos conjuntos vistos en la Figura 9. El metodo que utiliza la RNsa H e I con Exonulceasa 1 durante la preparacion de la muestra de los transcriptos del mARN completo dieron como resultado el mas grande numero de conjuntos generados asf como tambien el porcentaje de alineacion despues del control positivo PhiX, seguido por el metodo d preparacion donde no se practico la digestion de la Exonucleasa 1. Ademas, el porcentaje de lecturas alineadas (% de alineacion (PF)) son las mas altas para el carril 5 y el carril 3, respectivamente, entre los carriles de prueba. Los resultados demuestran que el metodo alternativo descrito en este ejemplo para generar cADN se puede utilizar para suministrar la informacion del transcripto de mARN completa al secuenciar utilizando los metodos de captura y tagmentacion descritos en esta solicitud.

Las opciones adicionales para la preparacion de la muestra incluyen, pero no estan limitadas a, utilizar los metodos descritos para secuenciar ARN de especies que no tengan ARN poliadenilado, tal como mARN bacteriano. En este caso, el ARN ribosomico se puede primero remover y el mARN que permanece se puede fragmentar y poner la cola poliA como se describio previamente. El mARN podrfa entonces ser capturado, tagmentado, puesto en conjunto amplificado y secuenciado como se describio anteriormente.

Estos resultados muestran que una variedad de los diferentes tipos de muestras de ARN y muestras de ADN derivadas de las muestras de ARN se pueden secuenciar utilizando los metodos suministrados aquf en que los metodos suministrados aquf suministran aproximadamente resultados de secuencia equivalentes a los protocolos de secuenciacion de ARN estandar corriente.

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   Reivindicaciones

   1. Un metodo de etiquetar duplex de acido nucleico que comprende las etapas de:

   (a) suministrar una transposasa y una composicion de transposon;

   (b) suministrar uno o mas duplex de acido nucleico y movilizado sobre un soporte;

   (c) poner en contacto la transposasa y la composicion de transposon con los uno o mas duplex de acido nucleico bajo condiciones en donde los uno o mas duplex de acido nucleico y la composicion de transposon sufren una reaccion de transposicion para producir uno o mas duplex de acido nucleico etiquetados, en donde la composicion de transposon comprende una molecula de acido nucleico de doble cadena que comprende una cadena transferida y una cadena no transferida.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde los uno o mas son los duplex de ADN: ARN y en donde los duplex de ADN: ARN son etiquetados sobre el extremo 5' de la cadena de ARN, o, en donde los duplex de acido nucleico son los duplex de ADN: aDn y en donde una de las cadenas del duplex de ADN: ADN esta etiquetada en el extremo 5' de la cadena de ADN.
3. 3. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el soporte comprende una pluralidad de cebadores inmovilizados, y opcionalmente, en donde la cadena de ARN de los uno o mas duplex de ADN: ARN o de la cadena de ADN de los duplex de ADN: ADN comprende la secuencia complementaria a al menos una porcion de uno o mas de los cebadores inmovilizados.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 3, en donde los duplex de ADN: ARN o los duplex de ADN: ADN se suministran al hibridar una o mas moleculas de ARN o moleculas de ADN de cadena simple a los cebadores inmovilizados sobre el soporte y extendiendo los cebadores hibridados a las moleculas de ARN o a las moleculas de ADN de cadena sencilla utilizando las moleculas de ARN o las moleculas de ADN de cadena sencilla como plantilla para producir los uno mas duplex de ADN: ARN o los duplex de ADN: ADN.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 3, en donde la pluralidad de los duplex de ADN: ARN o de los duplex de ADN: ADN se suministran al hibridar la pluralidad de las moleculas de ARN o las moleculas de ADN de cadena sencilla a los cebadores inmovilizados sobre el soporte y extendiendo los cebadores civilizados a las moleculas de ARN o a las moleculas de ADN de cadena sencilla utilizando las moleculas de ARN o las moleculas de ADN de cadena sencilla como plantilla para producir la pluralidad de duplex de ADN: ARN o moleculas de ADN: ADN.
6. 6. El metodo de la reivindicacion 3, en donde la pluralidad de cebadores inmovilizados comprende un primer subconjunto de cebadores en una primera secuencia y un segundo subconjunto de cebadores de una segunda secuencia, y opcionalmente, en donde el primer subconjunto de cebadores comprende una secuencia poliT.
7. 7. El metodo de la reivindicacion 3, que comprende ademas agregar un adaptador 3' a la pluralidad de moleculas de ARN o las moleculas de ADN de cadena sencilla, el adaptador 3' que comprende una secuencia complementaria a la pluralidad de cebadores inmovilizados o un subconjunto de los mismos; e hibridar las moleculas de ARN ligadas al adaptador 3' o a las moleculas de ADN de cadena sencilla a los cebadores inmovilizados.
8. 8. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1- 7, en donde la reaccion de transposicion da como resultado una cadena de ARN etiquetada 5' o una cadena de ADN etiquetada 5' que comprende la cadena transferida de la composicion del transposon y un bache entre el extremo 3' de la cadena de ADN complementaria y la cadena no transferida de la composicion de transposon, el metodo opcionalmente comprende ademas poner en contacto los uno o mas duplex de ADN: ARN etiquetado o los duplex de aDn: ADN con una enzima que modifica el acido nucleico bajo condiciones para extender el extremo 3' de las cadenas de ADN para copiar las cadenas de ARN a su extremo 5' o copiar las cadenas de ADN de cadena sencilla a sus extremos 5'.
9. 9. El metodo de la reivindicacion 8, que comprende ademas secuenciar al menos una porcion de las cadenas de ADN, y opcionalmente ademas comprende copiar al menos una porcion de las cadenas de ADN para producir una segunda cadena de ADN complementaria a la cadena de ADN de los duplex de ADN: ARN, y opcionalmente ademas que comprende secuenciar la segunda cadena de ADN complementaria, en donde la cadena de ADN de los duplex de ADN: ARN se remueve opcionalmente antes de secuenciar la segunda cadena de ADN complementaria.
10. 10. El metodo de la reivindicacion 8, que comprende ademas amplificar las cadenas de ADN para producir una pluralidad de moleculas de ADN de doble cadena que comprende primeras y segundas cadenas amplificadas, opcionalmente ademas que comprende remover las primeras cadenas amplificadas, y opcionalmente ademas que comprende secuenciar al menos una porcion de las segundas cadenas amplificadas.
11. 11. El metodo de la reivindicacion 10, que comprende ademas copiar al menos una porcion de las segundas cadenas amplificadas para regenerar las primeras cadenas amplificadas, opcionalmente ademas que comprende remover las segundas cadenas amplificadas, y opcionalmente, ademas que comprende secuenciar al menos una porcion de las primeras cadenas amplificadas.
12. 12. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el soporte es un globulo o una pluralidad de globulos, o en donde el soporte es un soporte plano.
13. 13. El metodo de la reivindicacion 12, en donde se suministra una pluralidad de duplex, cada duplex ubicado sobre una cadena sobre un globulo simple.
14. 14. El metodo de la reivindicacion 10, en donde la amplificacion produce un conjunto de amplicones
15. 15. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la cadena transferida comprende una 5 etiqueta para preservar la informacion de cadena.