CN104160040A

CN104160040A - 核酸测序的改进方法

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Publication number: CN104160040A
Application number: CN201380012596.0A
Authority: CN
Inventors: 尼尔·安东尼·葛姆雷; 路易斯·弗雷泽; 保拉·科克-冈萨雷斯
Original assignee: Illumina Cambridge Ltd
Current assignee: Illumina Cambridge Ltd
Priority date: 2012-03-06
Filing date: 2013-03-06
Publication date: 2014-11-19
Anticipated expiration: 2033-03-06
Also published as: US9574226B2; US11834699B2; DK3037552T3; JP6068517B2; US20150087534A1; CA2864276A1; EP3037552B1; DK3037552T5; US20190324042A1; EP3037552A1; US10267804B2; TR201807138T4; AU2013229533B2; HK1226105B; US20170212123A1; JP6341984B2; DK2823058T3; WO2013131962A1; HK1206072A1; NO2694769T3

Abstract

本文提供一种使用转座来改进RNA分子测序方法的方法。本文提供了一种将核酸双链体，如DNA:RNA双链体或DNA:DNA双链体加标签的方法。该方法包括以下步骤：提供转座酶和转座子组合物，提供固定在支持物上的一个或更多个核酸双链体，并使所述转座酶和转座子组合物与一个或更多个核酸双链体在其中一个或更多个核酸双链体与转座子组合物进行转座反应的条件下接触，以产生一个或更多个加标签的核酸双链体，其中所述转座子组合物包含包含转移链和非转移链的双链核酸分子。

Description

核酸测序的改进方法

本申请要求2012年3月6日提交的美国临时专利申请序列号61/607,418的优先权，其通过引用全文并入本文。

背景

已经开发出对核酸包括RNA进行测序的测序技术。测序技术包括，例如，合成测序。合成测序或循环测序可以通过逐步加入含有例如可裂解或可光漂白的染料标记的核苷酸来实现，如在例如，美国专利号7,427,673；美国专利号7,414,116；WO 04/018497；WO 91/06678；WO 07/123744和美国专利号7,057,026中描述的，其公开内容通过引用全文并入本文。可选地，焦磷酸测序技术可以被采用。焦磷酸测序法检测特定的核苷酸被掺入到新生链时无机焦磷酸(PPi)的释放(Ronaghi等,(1996)“Real-time DNAsequencing using detection of pyrophosphate release.”Analytical Biochemistry242(1),84-9；Ronaghi,M.(2001)“Pyrosequencing sheds light on DNAsequencing.”Genome Res.11(1),3-11；Ronaghi,M.,Uhlen,M.and Nyren,P.(1998)“A sequencing method based on real-time pyrophosphate.”Science281(5375),363；美国专利号6,210,891；美国专利号6,258,568和美国专利号6,274,320，其公开内容通过引用全文并入本文)。在焦磷酸测序中，释放的PPi可以通过立即被ATP硫酸化酶转化为三磷酸腺苷(ATP)来检测，产生的ATP水平通过萤光素酶产生的光子被检测到。

测序技术还包括连接测序技术。这种技术使用DNA连接酶掺入寡核苷酸并鉴定此类寡核苷酸的掺入，描述在美国专利号6,969,488；美国专利号6,172,218和美国专利号6,306,597中，其公开内容通过引用全文并入本文。其它测序技术包括，例如，荧光原位测序(FISSEQ)，和大规模平行信号测序(Massively Parallel Signature Sequencing,MPSS)。

制备测序用的DNA样品可以是相对简单的，包括使用转座反应来片段化，并向DNA片段添加衔接子(adaptor)序列，这简化样品制备过程。见，例如，国际公布号WO 2010/048605，其通过引用全文并入本文。相比之下，目前用于对RNA样品进行测序的方法采用在测序前将样品中的RNA转化成双链cDNA形式的样品制备方法。因此，制备测序用的RNA样品是更加劳动密集型的。此外，当前的方法在保留链特异性信息方面绝非最佳。更具体地，大多数方法在转化成双链cDNA后不能够保留有关原始单链RNA分子的方向的链信息。保存链特异性信息对于注释新基因和确定基因表达水平非常重要。某些方法试图通过在单链RNA分子的末端连接衔接子以保留链特异性信息。该衔接子可具有对从RNA分子产生的双链cDNA的两端提供可区分的信息的序列。然而，这种方法也有缺点。例如，如果所述RNA分子是片段，片段化后分子的内部部分失去其方向(即，链特异性)信息。

概述

本文提供将DNA:RNA双链体加标签的方法。该方法包括以下步骤：提供转座酶和转座子组合物，提供固定在支持物上的一种或更多种DNA:RNA双链体，并且使转座酶和转座子组合物与一种或更多种DNA:RNA双链体在其中一种或更多种DNA:RNA双链体和转座子组合物进行转座反应的条件下接触，以产生一种或更多种加标签的DNA:RNA双链体，其中所述转座子组合物包含包含转移链和非转移链的双链核酸分子。本方法还可用于将被固定在固体支持物上的DNA:DNA双链体加标签。

一个或更多个实施方案的细节阐述于附图和以下描述中。其他特征、目的和优点，从说明书和附图，以及从权利要求书，将是明显的。

附图说明

图1是展示本文所提供的示例性方法的示意图。加polyA尾的mRNA通过与偶联到支持物表面上的polyT DNA捕获探针或引物杂交而被捕获到支持物上。接着该ployT链被逆转录酶聚合酶延伸，产生包含DNA:RNA双链体的双链分子。接着，转座体复合物(例如，Tn5转座酶与镶嵌末端(mosaic end，ME)序列和与表面扩增引物互补的序列结合)被加入到支持物上，其进行与双链体的转座反应并给双链体加标签，连接DNA衔接子寡核苷酸到RNA链的5'末端。然后链置换聚合酶(例如，Bst聚合酶)可以被用来延伸DNA链的3'末端，取代转座体复合物的非转移链，并且将RNA链复制到其5'DNA的嵌合端(chimeric end)。然后双链分子可以被扩增(例如，簇扩增(cluster amplification))，通过测序引物进行测序。引物部分地包含ME序列和上游衔接子序列。可选地，在合成测序(SBS)化学循环开始前，分子的另一端(polyT端)可以通过在polyT序列上游退火的引物被测序，并且通过天然dATP核苷酸延伸。

图2是展示本文所提供的示例性方法的示意图。RNA被片段化并用磷酸酶处理。单链衔接子分子连接到包括表面结合的引物的互补序列的每个RNA片段的3'末端。该片段然后被加入到支持物上，并通过杂交被捕获。杂交的RNA分子被逆转录酶聚合酶转化为DNA:RNA双链体。转座体复合物或含有转座酶和ME与P5的衔接子双链体(即转座子)的组合物用于给双链体加标签。用链置换聚合酶将DNA链延伸到末端后，分子可以被扩增(例如，簇扩增)和测序。

图3是展示本文所提供的示例性方法的示意图。使用支持物，其包含两种表面接枝引物：标准接枝引物(例如，P5)和修饰的接枝引物(例如，P7)，修饰的接枝引物在其下游(3')侧具有靶标特异性捕获序列。靶标特异性序列的例子是与逆转录病毒逆转录酶(如HIV聚合酶)互补的寡核苷酸序列。纯化的病毒RNA被添加到支持物上，通过杂交被捕获，通过逆转录酶复制并被加标签。测序可以通过退火到加标签的衔接子上的引物，或在另一端退火到捕获探针来实现。

图4是展示本文所提供的示例性方法的示意图。从含有绿色荧光蛋白(GFP)转录本序列和与表面结合引物互补的序列(例如，P7'序列)的质粒产生RNA转录本。将转录本与包含引物包括例如P7序列的支持物杂交。杂交的RNA分子被逆转录酶聚合酶转化为DNA:RNA双链体。转座体复合物被用来使双链体加标签。通过链置换聚合酶将DNA链延伸到末端和除去RNA链后，分子可以被扩增(例如，簇扩增)和测序。

图5是一张凝胶照片，显示从含有绿色荧光蛋白(GFP)的质粒产生，并任选地，用DNA酶处理除去DNA(即质粒)的RNA转录本。用DNA酶处理RNA转录本后，无可见的残留DNA(即质粒)。

图6显示用SYBR Green染色的簇的照片。泳道1-4含有PhiX DNA和泳道5-8含有GFP的RNA。泳道5和6中包含用DNA酶预处理以除去DNA的RNA。泳道7和8含有DNA酶预处理、和RNA酶处理作为另外的对照的RNA。第一延伸使用禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(AMV-RT)(泳道2、4、6和8)或Phusion DNA聚合酶(泳道1、3、5和7)进行。泳道3-8用P5衔接子加标签。等温簇扩增标准地进行，用SYBR Green对簇进行染色。

图7A和7B显示来自如图6中所描述的泳道1-8的测序的比对测序数据的覆盖图的图表。

图8是展示本文所提供的用于DNA:DNA双链体加标签的示例性方法的示意图。单链DNA(ssDNA)被片段化，片段被末端脱氧核苷酸转移酶用多核苷酸标记。该片段然后加到支持物上并通过polyT尾与固定在固体支持物上的其互补序列杂交被捕获。杂交的ssDNA分子被DNA聚合酶转化为DNA:DNA双链体。转座体复合物或包括转座酶和P5-seq序列的衔接子双链体(即转座子)的组合物被用来对双链体加标签。通过链置换聚合酶将DNA链延伸到末端后，分子可以被扩增(例如，簇扩增)和测序。

图9显示了SYBR Green染色的簇的照片，其来自设计为使用全mRNA转录本样品产生数据的实验。泳道1是PhiX标准文库，其中没有加标签。泳道2是阴性对照，其中没有进行加尾，且泳道8是dsDNA阴性对照。泳道3和4是相同的实验，除了泳道4的引物被稀释。泳道5和6是相同的实验，除了泳道6的引物被稀释。泳道7使用随机RNA六聚体代替随机DNA六聚体。

图10显示按图1的方法，比对的测序读数对GAPDH的覆盖度图片。上部3’捕获证明来自对照polyA加尾的mRNA样品的捕获、加标签、簇和序列比对。底部全转录本证明，从复杂的UHR总RNA样品富集、酶促片段化和聚腺苷酸化的mRNA样品的mRNA比对，证明使用本公开内容的方法的全mRNA转录本覆盖度。

详述

目前对RNA样品测序的实验方案都采用在测序前将样品中的RNA转化成双链cDNA形式的样品制备。本文提供了用于RNA样品测序的方法，避免双链cDNA中间体的溶液相制备。所提供的方法还导致在测序过程中保留链型信息。然而，本文描述的方法也可用于DNA标记和测序。

本文提供了将DNA:RNA双链体加标签的方法。该方法包括以下步骤：提供转座酶和转座子组合物，提供固定在支持物上的一种或更多种DNA:RNA双链体，并且使转座酶和转座子组合物与一种或更多种DNA:RNA双链体在其中一种或更多种DNA:RNA双链体与转座子组合物进行转座反应的条件下接触，产生一种或更多种加标签的DNA:RNA双链体。转座子组合物包含包含转移链和非转移链的双链核酸分子。虽然以下的实施例可使用DNA:RNA双链体示例，它们在适当情况下也可适用于DNA:DNA双链体(参见图8)。

任选地，所述一种或更多种DNA:RNA双链体在RNA链的5'末端被加标签。任选地，转移链包含保留链信息的标签。转座反应产生5'加标签的RNA链，所述5'加标签的RNA链包含转座子组合物的转移链和DNA链的3’末端与转座子组合物的非转移链之间的缺口。任选地，所述方法还包括使一种或更多种加标签的DNA:RNA双链体与核酸修饰酶在延伸DNA链的3'末端的条件下接触以复制RNA链到它们的5'末端。核酸修饰酶可置换转座子组合物的非转移链。

图1是显示本文所提供的示例性方法的示意图。简言之，加polyA尾的mRNA通过与偶联到支持物表面的polyT DNA捕获探针(或引物)杂交而被捕获在支持物(例如，流动池(flowcell))上。然后该polyT链被逆转录酶聚合酶延伸，以产生包含DNA:RNA双链体的双链分子。然后，转座体复合物(例如，Tn5与转座子(例如，镶嵌末端(ME))序列以及与表面扩增引物互补的序列结合)被加入到支持物上，将双链体“加标签”，连接DNA衔接子寡核苷酸到RNA链的5'末端。然后链置换聚合酶(例如，Bst聚合酶)可被用来延伸DNA链的3'末端，取代转座体的“非转移链”和复制RNA链到5'DNA的嵌合端。然后双链分子可以被扩增(例如，簇扩增)和用部分包含ME序列和上游衔接子序列的测序引物测序。可选地，所述分子的另一端(polyT端)可以使用与polyT序列上游退火的引物被测序，并且在SBS化学反应周期开始前利用自然的dATP核苷酸延伸。通过该方法也能够双端测序。

当提供ssDNA用于测序时，可以采用类似的方法。例如，单链DNA多核苷酸的3'末端可以通过使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和任何dNTP如dATP或dTTP添加核苷酸。在ssDNA分子的末端添加一串核苷酸的任何方法可以使用。图8是一个例子，其中含有polyA的捕获探针被固定在支持物的表面，poly T加尾的ssDNA分子被捕获。可以使用任何捕获序列，包括ssDNA末端的捕获序列，只要支持物上的捕获探针和ssDNA上的核苷酸提供互补序列，使得可以发生杂交。捕获探针被DNA聚合酶延伸产生dsDNA，产生DNA:DNA双链体，可进行如前所述的衔接子寡核苷酸的转座连接和链置换扩增，以提供双链分子用于簇生成。双链分子可以然后被扩增(例如，簇扩增)和测序。

通过另一个举例的方式(图2)，RNA(总的或polyA富集的)被片段化，用磷酸酶处理，然后单链衔接子分子被连接到包括P7表面结合引物的互补序列的每个片段的3’末端。该片段然后被加入到支持物(例如，流动池)并通过杂交被捕获。杂交的RNA分子被逆转录酶聚合酶转化为DNA:RNA双链体。包括转座酶和ME序列的衔接子双链体(如转座子)及P5引物序列的转座体复合物，可以用来将双链体加标签。利用链置换聚合酶延伸DNA链到末端后，该分子可被扩增和测序。

通过进一步举例的方式(图3)，使用一种特殊支持物(例如，流动池)，其包含两个表面接枝引物：标准的接枝引物(例如，P5)和修饰的接枝引物(例如，P7)，其下游(3’)侧具有靶标特异性捕获探针。靶标特异性探针的例子是与逆转录病毒逆转录酶(如HIV聚合酶)互补的寡核苷酸序列。纯化的病毒RNA被添加到支持物上，通过杂交捕获，通过逆转录酶复制和加标签。可利用与加标签的衔接子退火或在另一端与捕获探针退火的引物来实现测序。任选地，所述特殊支持物包含多个不同的靶标特异性捕获探针，使得能够同时捕获许多不同的RNA靶标。

采用体外转座反应来对靶标DNA:DNA或DNA:RNA双链体加标签以产生加标签的DNA:DNA或DNA:RNA双链体涉及转座酶、转座子序列组合物、以及合适的反应条件。

如通篇使用的，术语转座子是指包含与在体外转座反应中有功能的转座酶或整合酶形成复合物所必需的核苷酸序列的双链DNA。转座子形成复合物或联会复合物(synaptic complex)或转座体复合物。转座子还可以与识别并结合到转座子序列的转座酶或整合酶形成转座体组合物，该复合物能够将转座子插入或转置到在体外转座反应中与其一同孵育的靶标DNA中。转座子呈现为由转移转座子序列或转移链和非转移链或非转移链组成的两个互补序列。例如，与超活性的Tn5转座酶(如EZ-Tn5^TM转座酶，EPICENTRE Biotechnologies,Madison,WI,USA)形成在体外转座反应中有活性的复合物的转座子，包括呈现为转移的转座子序列5'AGATGTGTATAAGAGACAG 3'(SEQ ID NO:1)的转移链，和呈现为非转移的转座子序列5'CTGTCTCTTATACACATCT 3'(SEQ ID NO:2)的非转移链。转移链的3'末端在体外转座反应中被接合或转移到靶标核酸。非转移链，其呈现为与转移的转座子末端序列互补的转座子末端序列，在体外转座反应中不被接合或转移到靶标核酸。如本文所使用的转座子组合物，是指包含转座子(即能够与转座酶作用进行转座反应的最小双链DNA区段)的组合物，任选地包括另外的序列。例如，转座子组合物包含两个转座子寡核苷酸，两个转座子寡核苷酸包括转移的转座子寡核苷酸或转移链和非转移链寡核苷酸，或者非转移链，其组合呈现转座子的序列。一条或两条链可包含另外的序列。转座子可包括天然存在的和/或非天然存在的核苷酸和天然或非天然的主链键合。任选地，转座子还可包括连接到构成转座子的一个或更多个核苷酸的一个或更多个部分。例如，转座子的一条或两条链可以被生物素化，或包含标记，例如荧光标记。

术语转移的转座子寡核苷酸(transferred transposon oligonucleotide)和转移链(transferred strand)可互换使用，是指转座子和转座子组合物二者的转移部分，也就是，与转座子末端是否连接到标签或其它序列或部分无关。类似地，术语非转移转座子寡核苷酸和非转移链可互换使用，是指转座子和转座子组合物二者的非转移部分。

在一些实施方案中，转座子组合物包含或者由具有除转座子序列外的一种或更多种其它核苷酸序列的至少一种转座子组成。因此，在一些实施方案中，转座子组合物包含在转移转座子序列的5’具有一种或更多种其他核苷酸序列，例如，标签序列的转移链。除了转移转座子序列，标签可具有一个或更多个其他标签部分或标签结构域。

如本文中所使用的，“标签”是指一种核酸成分，通常是DNA，它提供一种鉴定或寻址与它接合的核酸片段的手段。例如，标签包括允许鉴定、识别、和/或分子或生物化学操作连接至标签粘贴的DNA的核苷酸序列(例如，通过提供与寡核苷酸退火的位点，例如用于通过DNA聚合酶延伸的引物，通过提供用于捕获或连接反应的寡核苷酸，或通过提供核苷酸来源于特定来源的鉴定，以及类似)。向核酸分子加入标签的方法有时在本文中称为“加标签”，且经受加标签或含有标签的核酸被称为“加标签的”(例如，“加标签的RNA”)。

如通篇使用的，术语链型或链特异性信息指的是关于原始单链分子的方向的知识的保留。这在所提供的方法中被保存，因为已知DNA链与DNA:RNA双链体中的RNA链互补。因此，当测序DNA链时，该序列将是保留链特异性信息的RNA链的序列，并允许正确鉴定RNA分子和/或其表达水平。保留链特异性信息的方法也于WO2011/003630中描述，其通过引用全文并入本文。然而，在WO2011/003630中描述的方法仍然需要将RNA分子转化成双链cDNA分子，其如本文中所描述的，没有本申请中提供的方法有效。此外，在WO2011/003630描述的方法需要标签来保留链的信息。在本文提供的方法中，不需要标签来保留链特异性信息或链型。在其中DNA:RNA双链体的DNA链(即，第一DNA链)被扩增用于产生第一和第二扩增DNA链的实施方案中，链型的保持是通过以下知识：第一DNA链与原始RNA链互补，且第二DNA链是与原始RNA链相同的序列(除了序列中的T代替U)。因此，尽管标签(例如，标签序列可被包括在转座子的转移链中)可用于保留链型，它不是必需的。

如本文使用的，标签部分或标签结构域是指标签的呈现用于期望的预期目的或应用的序列的部分或结构域。一个标签部分或标签结构域是转座子结构域，该标签部分或标签结构域呈现转移转座子序列。在其中转移链还呈现一种或更多种其它核苷酸序列的一些实施方案中，标签还具有一个或更多个其他标签结构域，其中每个标签结构域为了任何期望的目的提供。举例来说，转座子组合物可包括(i)转移链，其呈现一种或更多种另外的序列(除了转座子序列)，可包含选自以下一种或更多种的标签结构域：限制性位点标签结构域、捕获标签结构域、测序标签结构域、扩增标签结构域、检测标签结构域、地址标签结构域、和转录启动子结构域；和(ii)非转移链，其呈现非转移转座子序列。

如果对标签结构域使用描述，不同标签结构域的名称和描述是为了方便，例如以使更易于理解和讨论不同实施方案中标签的不同部分或结构域的预期用途和应用。但是，这些名称和描述不预期以任何方式限制标签或其标签结构域的任一种的用途或应用。因此，任何特定的标签或标签结构域可以用于除了或代替预期或主要的目的或应用的任何目的。同样的，一种标签结构域可包含两种或更多种其他标签结构域(例如，测序标签结构域可包含捕获标签结构域和扩增标签结构域二者)，或者一种标签结构域可提供两种或更多种不同标签结构域的功能或目的或应用(例如，对于特定应用，捕获标签结构域还可提供测序标签结构域和/或扩增标签结构域的功能或目的)。更进一步地，为了任何特定目的或应用或功能使用，标签不必以一种或更多种不同的结构域来描述。

如通篇使用的，术语转座酶是指一种酶，其能够与含有转座子的组合物(例如，转座子、转座子组合物)形成功能性复合物，和在体外转座反应中催化含有转座子的组合物插入或转座到与其一起孵育的双链靶标核酸中。所提供的方法的转座酶还包括来自逆转录转座子和逆转录病毒的整合酶。在所提供的方法中可使用的示例性转座酶包括Tn5转座酶和MuA转座酶的野生型或突变体形式。

“转座反应”是一种反应，其中一种或更多种转座子在随机位点或几乎随机位点插入靶标核酸。转座反应中的必要组分是转座酶和呈现转座子核苷酸序列的DNA寡核苷酸，转座子核苷酸序列包括转移的转座子序列及其互补序列(即，非转移转座子末端序列)，以及形成有功能的转座或转座体复合物所需要的其他组件。本发明的方法通过采用由超活性的Tn5转座酶和Tn5型转座子末端或由MuA或HYPERMu转座酶和包括R1和R2末端序列的Mu转座子末端形成的转座复合物来示例(见如Goryshin,I.和Reznikoff,W.S.,J.Biol.Chem.,273:7367,1998；和Mizuuchi,K.,Cell,35:785,1983；Savilahti,H,等,EMBO J.,14:4893,1995；其通过引用全文并入本文)。然而，能够为了预期目的以随机的或几乎随机的方式以足够的效率插入转座子末端来将靶标核酸加标签的任何转座系统，都可用于所提供的方法中。可用于所提供的方法中的已知的转座系统的其他例子，包括但不限于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Tn552、Ty1、转座子Tn7、Tn/O和IS10、Mariner转座酶、Tc1、P元件、Tn3、细菌插入序列、逆转录病毒和酵母逆转录转座子(参见，例如，Colegio O R等,J.Bacteriol.,183:2384-8,2001；Kirby C等,Mol.Microbiol.,43:173-86,2002；Devine S E,和Boeke J D.,Nucleic Acids Res.,22:3765-72,1994；国际专利申请号WO95/23875；Craig,N L,Science.271:1512,1996；Craig,N L,Review in:CurrTop Microbiol Immunol.,204:27-48,1996；Kleckner N,等,Curr TopMicrobiol Immunol.,204:49-82,1996；Lampe D J,等,EMBO J.,15:5470-9,1996；Plasterk R H,Curr Top Microbiol Immunol,204:125-43,1996；Gloor,GB,Methods Mol.Biol.,260:97-114,2004；Ichikawa H,和Ohtsubo E.,J Biol.Chem.265:18829-32,1990；Ohtsubo,F和Sekine,Y,Curr.Top.Microbiol.Immunol.204:1-26,1996；Brown P O,等,Proc Natl Acad Sci USA,86:2525-9,1989；Boeke J D和Corces V G,Annu Rev Microbiol.43:403-34,1989；其通过引用全文并入本文)。

将转座子插入靶标序列的方法可以使用任何合适的转座子系统体外实现，对其合适的体外转座子系统是可用的，或者可以基于本领域的知识开发出来。在一般情况下，用于本发明的方法的合适的体外转座子系统至少要求，具有足够纯度、足够浓度和足够的体外转座活性的转座酶，和与转座酶形成有功能的复合物的转座子，且相应的转座酶能够催化转座反应。可用于本发明的合适的转座酶转座子序列，包括但不限于与选自转座酶的野生型、衍生型或突变型的转座酶形成复合物的野生型、衍生型或突变型转座子序列。

在所提供的方法中，DNA:RNA双链体可以以多种方式来提供。通过示例的方式，支持物可包括多个引物，且DNA:RNA双链体通过以下来提供：将一种或更多种RNA分子与支持物上固定的引物杂交，并以RNA分子为模板延伸杂交到RNA分子上的引物，以产生一种或更多种DNA:RNA双链体。任选地，多个DNA:RNA双链体通过以下来提供：将多个RNA分子与支持物上固定的引物杂交，并使用RNA分子作为模板延伸杂交到RNA分子上的引物，以产生多个DNA:RNA双链体。

如上所述，该方法可包括：提供具有多个引物的支持物；引物或其子集包含能够结合到一种或更多种RNA分子的序列。例如，固定的引物可包括polyT序列且RNA可包括能够与polyT序列杂交的polyA序列。可选地或另外地，所述多个固定的引物可包括能够与多个RNA分子中的一个或更多个RNA分子杂交的靶标特异性引物。因此，所述一个或更多个DNA:RNA双链体的RNA链包括与一个或更多个固定的引物的至少一部分互补的序列。任选地，所述多个固定的引物包括第一序列的第一引物子集和第二序列的第二引物子集。所述第一或第二引物子集可包括polyT序列。

任选地，3'衔接子可以被添加到多个RNA分子，所述3'衔接子包括与多个固定的引物或其子集互补的序列。这种3'-衔接子连接的RNA分子然后可以杂交到固定的引物上。

因此，固定的引物或其子集可包括polyT序列、RNA靶标特异性序列或与连接至RNA分子的衔接子互补的序列。任选地，所述多个引物包括至少两个子集的引物，所述第一子集包括polyT序列、RNA靶标特异性序列或与连接至RNA分子的衔接子互补的序列，第二引物子集包括能够与DNA:RNA双链体的DNA链上的序列结合的序列。这样的序列可以是，例如，与转座子的转移链序列相同的序列。如全文所述，转座后，在DNA链的末端和转座子的非转移链之间会有缺口。然后DNA链可被延伸，以复制RNA链。复制将包括复制转座子的转移链序列。然后DNA链将包括与转座子转移链序列互补的序列，且因此包括支持物表面上的引物或其子集。换句话说，如果一条或更多条引物包括与转座子的转移链相同或相似的序列，则DNA:RNA双链体中的DNA链将能够与引物杂交，因为DNA链含有与引物互补的序列。

能够延伸DNA链的3'末端以复制RNA链到其5'末端并置换转座子的非转移链的合适的核酸修饰酶是已知的。简单地说，一些DNA聚合酶能够随着该聚合酶合成一条新的DNA链，置换模板链的互补链。这个过程被称为链置换，且具有这种活性的DNA聚合酶在本文中称为链置换DNA聚合酶。在一般情况下，所提供的方法中使用的DNA模板特异性DNA聚合酶为预期的目的有效地合成合适长度的DNA而不脱离模板(或终止合成DNA)，这被称为酶的持续合成能力(processivity)。DNA聚合酶进行链置换的能力可以利用聚合酶在滚环复制分析中容易地确定，如Fire和Xu所描述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4641-4645,1995)，其通过引用全文并入本文。链置换和DNA聚合酶的持续合成能力还可使用在Kong等人描述的方法进行测定(J.Biol.Chem.268:1965-1975,1993)，其通过引用全文并入本文。末端转移酶在本文也被定义为DNA聚合酶，所述DNA聚合酶在所提供的方法的一些实施方案中作为组合物使用。末端转移酶可以使用，因为它催化dNTP向DNA的3'-羟基末端的不依赖模板的加入。

在本文提供的方法中，该方法可还包括测序DNA链的一部分和/或扩增DNA链的至少一部分。任选地，DNA:RNA双链体的RNA链可以在测序和/或扩增之前除去。通过示例的方式，所述方法还包括从该DNA:RNA双链体除去RNA链和测序至少一部分DNA链(即，第一DNA链)。该方法还可包括复制至少一部分DNA链以产生与DNA:RNA双链体的DNA链(即，第一DNA链)互补的第二DNA链。如果需要，第二互补DNA链然后可以被测序。任选地，所述DNA:RNA双链体的第一DNA链可以在第二互补DNA链测序之前除去。

在所提供的方法中，任选地，从DNA:RNA双链体除去RNA链后，DNA链可以被扩增以产生多个包括第一和第二扩增链的双链DNA分子。任选地，所述扩增产生簇，在下文中更详细地描述。

在一些实施方案中，当DNA链已被扩增以产生多个双链DNA分子，一个或两个链可以被测序。通过示例的方式，该方法可包括除去第一扩增链后对第二扩增链的至少一部分进行测序。任选地，所述第一扩增链可通过复制第二扩增链的至少一部分被再生。第二扩增链然后可以被除去，以对第一扩增链的至少一部分测序。任选地，可以进行第一和第二扩增链的一部分或全部的序列读取而不除去任一链的全部或部分。

多种实验方案可以被用于产生扩增的核酸，例如，在支持物上扩增的核酸。例如，核酸可以通过乳液PCR或桥式PCR扩增(Mitra&ChurchNucleic Acids Res.27,e34(1999)；Dressman等Proc.Natl.Acad.Sci.USA100,8817-8822(2003)；Adessi,C.等Nucleic Acids Res.28,e87(2000)；Fedurco等Nucleic Acids Res.34,e22(2006)，其每一篇通过引用并入本文)。

在使用乳液PCR的实施方案中，核酸可以在水包油乳液中被PCR扩增。在一个实施方案中，使用单个引物对。一条PCR引物被拴系在支持物(例如，微米级的珠)的表面(5'-连接)，另一条引物在溶液中。任选地，所述支持物包含多于一种序列的引物，该引物为能够杂交到一种或更多种靶标RNA分子的靶标特异性引物，溶液中的引物具有相同的序列(例如，与通过复制加标签的RNA链到DNA链的5'末端添加到DNA链上的序列互补的序列)。通常，低模板浓度导致大多数含珠的区室具有零个或一个模板分子。在生产性乳液区室(其中存在珠和模板分子)中，RNA分子可以被捕获和/或RNA分子相应的DNA互补序列在珠表面被扩增。破坏乳液后，携带扩增产物的珠可被选择性地富集。每个克隆扩增的珠在其表面上携带对应于模板库中的单个分子的扩增的PCR产物。有用的乳液PCR方法的各种实施方案列在美国专利申请公布号2005/0042648 A1；2005/0079510 A1和2005/0130173 A1和WO05/010145中，其每一个通过引用并入本文。

在使用桥式PCR，也被称为簇生成的实施方案中，来自模板库的核酸可使用涂敷在支持物表面的引物被扩增。引物可在其5'末端被柔性连接体连接。源自模板库中的任何给定成员的扩增产物保持局部拴系在接近来源的点。在PCR结束时，每个克隆簇包含模板库的单个成员的多个拷贝。在所提供的方法中，每一个DNA:RNA双链体形成克隆簇的来源。除去RNA链后，DNA链可使用附着于支持物上的引物进行复制，产生DNA链的扩增拷贝并产生克隆簇。有用的桥式PCR方法的各种实施方案列在美国专利申请公布号2007/0128624 A1、WO07/010251、美国专利号6,090,592和美国专利号5,641,658，其每一个通过引用并入本文。进行扩增的方法也在美国公布号2009/0226975；WO 98/44151；WO 00/18957；WO 02/46456；WO 06/064199；和WO07/010251中描述；其通过引用全文并入本文。

本文所提出的方法可产生或使用具有多种密度的任一种的阵列，所述密度包括，例如，至少约10个特征/cm²、100个特征/cm²、500个特征/cm²、1000个特征/cm²、5000个特征/cm²、10,000个特征/cm²、50,000个特征/cm²、100,000个特征/cm²、1,000,000个特征/cm²、5,000,000个特征/cm²、或更高。

如本文所用，术语“核酸”可用于指连接在一起的至少两个核苷酸类似物单体。核酸可包含磷酸二酯键，但在一些实施方案中，核酸可以是具有其它类型主链的类似物，所述其它类型主链包括，例如，磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、肽核酸主链和键合、正电荷主链(positive backbones)、或非离子主链。核酸可包括戊糖部分，如核糖(存在于天然产生的RNA)、脱氧核糖(存在于天然产生的DNA)或双脱氧核糖。在一些实施方案中，核酸可具有非戊糖部分或碳环糖代替核糖或脱氧核糖部分。核酸可以具有一个或更多个不同的碱基部分，包括但不限于：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、硝基吡咯(包括3-硝基吡咯)和/或硝基吲哚(包括5-硝基吲哚)。本文所用的核酸可包括天然或非天然的碱基。因此，核酸可包含天然产生的和/或非天然产生的核苷酸和天然或非天然的主链键合。核酸可以是单链或双链的，如指定的，或者含有双链和单链序列二者的部分。核酸可以是DNA(例如，基因组DNA或cDNA)、RNA或杂合体。

如本文所用，术语“阵列”是指不同分子的群体，其被连接到一个或更多个支持物，使得不同的分子可以根据它们的相对位置来彼此区分。阵列可包含各自位于支持物上不同的可寻址位置(如特征)的不同分子。可选地，阵列可包括各自携带不同的分子的独立的支持物，其中不同的探针分子可如下鉴定：根据支持物被连接的表面上支持物的位置，或根据支持物在液体例如液体流中的位置。阵列的分子可以是，例如，核酸引物、核酸探针、核酸模板或核酸酶如聚合酶。例如，在具体实施方案中，靶标核酸可以被连接到检测器的表面或存在于支持物表面上的层(例如，丙烯酰胺层)。水凝胶是特别有用的，例如在美国专利公布号2011/0059865 A1中所描述的那些，其通过引用并入本文。

如本文所用的术语“核酸阵列”是指在其上或在其中具有多个空间上可区分的核酸的固相支持物。核酸可以按特征的有序或随机模式布置。单独的特征可以是，例如，在空间上分离的核酸分子、或者核酸分子的系综(ensemble)，例如簇。阵列可以是包括多个单独阵列的复合阵列，其构造为允许处理多个样品。单独阵列，在本文中称为“子阵列”，包括核酸特征的组。子阵列出现在更大阵列的不同区域。子阵列本身可以有序或无序。任选地，这样的子阵列可以是空间可寻址的。子阵列可包括相同核酸的簇。含有单独子阵列的复合阵列的例子是具有孔的微量滴定板，其中该板整体作为核酸阵列(或复合阵列)，而每个单独的孔作为较大的复合阵列的子阵列。

本文所用的“支持物”是指用于固定核酸阵列的基底。“支持物”是具有刚性或半刚性表面的材料，核酸阵列可以向其连接或核酸可在其上被合成和/或修饰。支持物可包含任何树脂、微珠、玻璃、可控多孔玻璃(CPG)、聚合物支持物、膜、纸、塑料、塑料管或板、塑料珠、玻璃珠、载玻片、陶瓷、硅片、多孔板、尼龙膜、光纤、和PVDF膜。

支持物可包括任何平面晶片状基底和具有孔的平面基底，诸如微量滴定板，包括96孔板。示例性平面基底包括芯片、载玻片、蚀刻基底、微量滴定板、和流动池式反应器，包括具有多个微流体通道的多泳道流动池反应器，如在cBot测序工作站使用的八通道流动池(Illumina,Inc.,SanDiego,CA)。可使用的示例性的流动池也在WO 2007/123744中描述，其通过引用全文并入本文。

支持物还可包括珠，包括磁珠、空心珠和固体珠。珠可与平面支持物，例如任选地也含有孔的扁平支持物联合使用。珠、或者可选地微球，通常指的是由刚性或半刚性材料制成的小的主体。主体可具有表征为例如球体、椭圆形、微球的形状，或其他公认的颗粒形状，无论具有规则或不规则的尺寸。珠的大小，特别地，包括，但不限于，约1μm、约2μm、约3μm、约5μm、约10μm、约20μm、约30μm、约40μm、约60μm、约100μm、约150μm或约200μm的直径。其它颗粒可以类似于本文对珠和微球描述的方式使用。

支持物的组成可以变化，这取决于例如，连接的形式、化学反应和/或方法和/或核酸合成的方法。根据本公开内容可使用的支持物材料包括，但不限于，聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、尼龙、金属和其他合适的材料。示例性组成包括合成多肽、多核苷酸和/或有机部分中使用的支持物、和对其赋予的化学官能性(functionality)。此类组成包括，例如，塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、三聚氰胺、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、顺磁材料、氧化钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、胶乳或交联葡聚糖如Sepharose^TM、纤维素、尼龙、交联胶束和Teflon^TM、以及可在例如Bangs Laboratories，Fishers IN的“Microsphere Detection Guide”中发现描述的任何其他材料，其通过引用并入本文。支持物颗粒可由以下制成：交联淀粉、葡聚糖、纤维素、蛋白质、有机聚合物，包括苯乙烯聚合物，包括聚苯乙烯和甲基苯乙烯以及其它苯乙烯共聚合物、塑料、玻璃、陶瓷、丙烯酸聚合物、磁性响应材料、胶体、氧化钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、尼龙、胶乳、或者Bangs Laboratories，Fishers,Inc.的“Microsphere Detection Guide”是有益的指导，通过引用全文特此并入。本公开内容的范围内进一步示例性的支持物包括，例如，在美国申请公布号2002/0102578和美国专利号6,429,027中描述的那些，两者通过引用全文并入本文。

核酸向无论是刚性或半刚性的支持物的附着，可通过共价或非共价键合发生。示例性的键合列于美国专利号6,737,236；7,259,258；7,375,234和7,427,678；和美国专利公布号2011/0059865 A1，其每一个通过引用并入本文。在一些实施方案中，核酸或其它反应组分可以被附着到凝胶或其它半固体支持物，其转而被附着或粘附到固相支持物。在这样的实施方案中，核酸或其它反应组分将被理解为是固相。

任选地，所述支持物是一个或更多个珠。任选地，所述支持物是平面支持物。任选地，多个珠被提供，每个珠包括一个或更多个DNA:RNA双链体。如果珠包括多于一个的DNA:RNA双链体，该双链体可具有相同的序列或不同的序列。任选地，多个珠被提供，每个珠包括DNA:RNA双链体。多个珠中的珠可包含相同或不同的DNA:RNA双链体。例如，多个珠中的第一子集珠可包括第一序列的DNA:RNA双链体，而多个珠中的第二子集珠可包含第二序列的DNA:RNA双链体。

多种测序方案的任一种和相应的试剂可以在本文所阐述的任何方法或装置中使用。合成测序(SBS)技术一般包括针对模板链，通过反复添加核苷酸来酶延伸新生核酸链。SBS可利用具有终止部分的核苷酸单体或没有任何终止部分的那些。利用具有终止部分的单体的方法包括，例如，在WO04/018497、US7,057,026、WO 91/106678、WO 07/123744、美国US2007/0166705、US 2006/0188901、US 2006/0240439、US 2006/0281109、WO05/065814、US 2005/0100900、WO06/064199或WO07010251中描述的那些，其公开内容通过引用全文并入本文。还有用的是可从Illumina,Inc.,San Diego CA商业获得的SBS方法。

SBS技术可利用具有标记部分的核苷酸单体或缺乏标记部分的那些。因此，掺入事件可基于以下检测：标记的特性，如标记的荧光；核苷酸单体的特性，如分子量或电荷；掺入核苷酸的副产物，如焦磷酸盐或质子的释放；或类似物。不同的核苷酸可彼此区分，或可选地，两个或更多个不同的标记可以是根据所使用的检测技术不可区分的。例如，存在于测序试剂中的不同核苷酸可具有不同的标记，并且它们可以用适当的光学区分，如通过Solexa(现在Illumina,Inc.)开发的测序方法来示例。然而，对测序试剂中存在的两种或更多种不同的核苷酸使用相同的标签，或使用不必区分不同的标记的检测光学也是可能的。

利用缺少终止子的核苷酸单体的方法也是有用的，包括，例如，焦磷酸测序。焦磷酸测序法检测随着特定的核苷酸被掺入到新生链时无机焦磷酸(PPi)的释放(Ronaghi,M.,Karamohamed,S.,Pettersson,B.,Uhlen,M.和Nyren,P.(1996)"Real-time DNA sequencing using detection ofpyrophosphate release."Analytical Biochemistry 242(1),84-9；Ronaghi,M.(2001)"Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing."Genome Res.11(1),3-11；Ronaghi,M.,Uhlen,M.和Nyren,P.(1998)"A sequencing methodbased on real-time pyrophosphate."Science 281(5375),363；美国专利号6,210,891；美国专利号6,258,568和美国专利号6,274,320，其公开内容通过引用全文并入本文)。在焦磷酸测序中，释放的PPi可通过被ATP硫酸化酶转化成三磷酸腺苷(ATP)来检测，且产生的ATP水平通过萤光素酶产生的光子被检测到。

一些实施方案可利用连接技术测序。这样的技术利用DNA连接酶来掺入寡核苷酸。可用于本文所述的方法和系统的示例性的SBS系统和方法，在美国专利号6,969,488、美国专利号6,172,218和美国专利号6,306,597中描述，其公开内容通过引用全文并入本文。

一些实施方案可利用包括DNA聚合酶活性的实时监测的方法。核苷酸掺入可通过荧光团载运聚合酶和y磷酸标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用来检测，例如，在美国专利号7,329,492和美国专利号7,211,414中描述的(其每一个通过引用并入本文)，或核苷酸的掺入可通过零模式波导(zero-mode waveguide)检测，例如，在美国专利号7,315,019中描述的(其通过引用并入本文)，并使用荧光核苷酸类似物和工程化的聚合酶，例如，在美国专利号7,405,281和美国专利申请公布号2008/0108082中描述的(其中每一个通过引用并入本文)。光照可以被限制到围绕表面拴系的聚合酶的仄升级体积，使得荧光标记的核苷酸的掺入可以在低背景下观察(Levene,M.1.等"Zero-mode waveguides forsingle-molecule analysis at high concentrations."Science 299,682-686(2003)；Lundquist,P.M.等"Parallel confocal detection of single molecules in realtime."Opt.Lett.33,1026-1028(2008)；Korlach,J.等"Selective aluminumpassivation for targeted immobilization of single DNA polymerase moleculesin zero-mode waveguide nanostructures."Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 105,1176-1181(2008)，其公开内容通过引用全文并入本文)。

公开了可用于所公开的方法和组合物、可与所公开的方法和组合物联合使用、可以用于制备所公开的方法和组合物、或者是所公开的方法和组合物的产品的材料、组合物和组分。这些和其他材料在本文中公开，并且应当理解的是，当这些材料的组合、子集、相互作用、组等被公开时，虽然可能没有明确地公开每种不同的单独和集体组合和排列的具体的引用，每一种被具体地涵盖和在本文描述。例如，如果一种方法被公开并被讨论，且讨论了可对该方法步骤进行的许多修改，方法步骤的每个和每一个组合和排列，以及可能的修改被具体地涵盖，除非具体地相反说明。同样，这些的任何子集或组合也被具体涵盖和公开。这个概念适用于本公开内容的所有方面。因此，如果存在可进行的多种另外步骤，应当理解的是这些另外的步骤的每个可以与所公开的方法的任何特定的方法步骤或方法步骤的组合一起进行，并且每个这样的组合或组合的子集被具体地涵盖并应视为公开。

在整个本申请中，引用了多种出版物。这些出版物的公开内容通过引用特此全文并入本申请。

描述了多个实施方案。然而，应当理解的是，各种修改可以做出。因此，其它实施方案在以下权利要求的范围之内。

实施例

实施例1.采用DNA:RNA双链体的加标签反应的RNA测序

使用P7'衔接的RNA转录本进行示例性的实验，它的原理在图4中列出。RNA转录本按照制造商的方案利用Promega(Madison,WI)的体外转录系统试剂盒从含有绿色荧光蛋白(GFP)的质粒产生。

GFP的表达盒的序列如下所示(SEQ ID NO：3)：

aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctgcaattttaactttactaaggagaattcaccaaaGACTACAAAGACGATGACGACAAGgcgatcgtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcggggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctacccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgaaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacgcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagccccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagctgctgccaccgctgagaataaagatcggaagagcggttcagcaggaatgccgagaccgatc(SEQ ID NO：3)

基于PMA-T的质粒含有P5(加下划线)、T7聚合酶启动子(粗体)、起始密码子(粗体和斜体)、His标签(斜体和加下划线)、FLAG标签(大写字母)、GFP序列、TAA终止密码子(加下划线和粗体)、T7终止子(粗体、斜体和加下划线)和P7′(大写字母和粗体)。

RNA转录本应当从启动子序列延伸到T7终止序列。然而，T7终止子并没有完全停止转录，因此一些所得的RNA转录本是His_FLAG_GFP_P7′。RNA转录本用DNA酶处理以除去DNA，否则将形成簇。为了检查DNA酶处理是否有效，进行了反应并在凝胶上分析，以证明DNA酶处理有效除去DNA。无残留的DNA(即质粒)在DNA酶处理RNA转录本后可见(图5)。

PhiX DNA文库和DNA酶处理后的GFP-P7′RNA转录本根据用于模板杂交的标准簇方案在流动池的不同泳道上进行杂交。泳道1-4含有PhiXDNA和泳道5-8含有GFP的RNA。泳道5和6含DNA酶预处理以除去DNA的RNA。泳道7和8含有用DNA酶预处理然后在流动池上用RNA酶处理作为另外的对照的RNA。PhiX DNA文库可通过P5或P7杂交，因为这两个序列和它们的互补序列存在于模板中。与之相比，GFP-P7′RNA模板仅能与P7表面引物杂交，因为它们的“链型”和缺乏P5序列。

第一延伸使用禽成髓细胞白血病病毒逆转录酶(AMV-RT)(泳道2、4、6和8)或Phusion DNA聚合酶(泳道1、3、5和7)进行。AMV-RT可以从RNA或DNA模板产生cDNA链，而Phusion只能从DNA模板生成DNA链。

有些泳道用含有转座子序列P5衔接子序列的转座体复合物进行转座(泳道3-8)。转座事件后留下的DNA序列中的缺口使用含有Bst DNA聚合酶的链置换延伸反应填充。转座事件在含有GFP_P7'RNA的泳道中是需要的，以添加P5衔接子产生可生成簇的模板。等温簇扩增按照标准进行，簇通过SYBR Green染色。簇的图像显示于图6。

泳道1是簇生成的对照，因为它包含用PHUSION DNA聚合酶延伸的标准形式的DNA样品。成功的簇生成结果如图6所示。

泳道2显示DNA模板可以成功地利用逆转录酶延伸(产生DNA:DNA双链体)，并在标准条件下生成簇(图6)。

泳道3和4表明DNA:DNA双链体(使用PHUSION DNA聚合酶或AMV-RT延伸)可以被Tn5衔接子加标签，并生成簇(图6)。

泳道5预计不会产生簇，因为PHUSION DNA聚合酶此前已有报道不能延伸相对的RNA链。观察到的少数簇可能是由于尽管用DNA酶处理，仍然残留用于产生RNA的DNA模板，或DNA被PHUSION DNA聚合酶相对RNA一定程度的延伸(图6)。

泳道7和8预期不会显示任何簇生成，因为模板已经被RNA酶和DNA酶处理。如在泳道5所见，观察到的少数簇可能是由于尽管用DNA酶处理，仍然残留用于产生RNA的DNA模板(图6)。

图6的泳道6显示如预期的，DNA链相对RNA模板的延伸。这些延伸的模板预计不会形成簇，因为它们不具备P5序列。但是，在用P5衔接子加标签后(q.e.d泳道6)，它们形成簇。泳道5、7和8中的少数簇表明RNA样品中有低水平的DNA污染，但显示了泳道6中多数簇是从RNA生成的。

然后对流动池上的簇进行测序。表1显示了测序结果。

如预期的，泳道1和2的90％以上的簇通过chastity过滤器且其中超过98％的如预期的比对到PhiX(表1)。泳道3和4包含加标签的DNA:DNA双链体，显示出通过过滤器的簇的10-20％减少，其中75-87％之间的簇可比对到PhiX。鉴于加标签可以减少模板的长度，在某些情况下的长度太短而无法有效地比对，通过过滤器的簇和比对的减少并不意外。泳道7和8中的簇应不能很好地测序，因为不应有任何模板存在(除污染的DNA模板或未消化的RNA残留)。如预期，几乎没有簇通过过滤器：小于7％的簇通过过滤器，其中只有12％的对PHUSION DNA聚合酶延伸的模板比对和41％的对AMV-RT延伸的模板比对。在没有进行RNA酶处理、只有DNA酶且RNA用Phusion延伸时，32％的簇通过过滤器，其中56+/-16％可比对(泳道5，表1)。这可能是由于残余的DNA模板和由PHUSION DNA聚合酶相对RNA对DNA的一些延伸的组合。与之相比，泳道6中观察到多约50％的簇，其中DNA酶处理的RNA模板被AMV-RT延伸，其中与泳道6类似的通过过滤器％(～27％)及25％比对。

比对的数据被用于生成覆盖图(图7)。泳道1-4如预期提供PhiX完全基因组覆盖。含有加标签的DNA的泳道(泳道3和4)提供更不均匀的覆盖。含加标签的RNA样品的泳道5-8，都表现出GFP的部分覆盖，说明模板的加标签已经产生簇。鉴于其中的一些可能来自残留的DNA模板，泳道6显示GFP模板的最宽覆盖，说明AMV-RT延伸的RNA分子已成功被加标签。

实施例2.采用人类样品的加标签反应的RNA测序。

准备具有八个泳道的流动池，其包含如下能够杂交到含polyA尾的RNA分子的引物。对泳道1接枝仅包括P5和P7寡核苷酸的标准寡核苷酸混合物，对泳道2-8接枝标准混合物(P5和P7寡核苷酸)以及捕获寡核苷酸(即含有polyT序列、用于结合包含polyA尾的RNA分子的引物)。引物接枝后，流动池保存在4℃直至使用。

对于泳道1和2，5 pM PhiX对照文库样品被制备并加入到流动池用于杂交。对于泳道3-8的任一个，400 ng RNA样品被准备并添加到流动池用于杂交。泳道3和4包含来自Clontech(Mountain View,CA)的人类RNA。泳道5和6包含来自脑的人RNA。泳道7和8包含人类通用参考(UHR)RNA。模板杂交后，洗涤缓冲液通过流动池给予以除去未杂交的模板。在所有泳道中，杂交的模板使用AMV-RT(NEB,Ipswich,MA)延伸，在泳道3-8中产生DNA:RNA双链体。

泳道3-8与转座体复合物接触，泳道1和2与等体积的洗涤缓冲液接触。制备两种不同浓度的转座体复合物混合物。泳道3、5和7的混合物以1.25μl转座体复合物、100μl缓冲液和400μL水制备。泳道4、6和8的混合物以0.625μl转座体复合物、100μl缓冲液和400μL水制备。将95μl转座体复合物混合物加入到流动池的泳道3-8进行加标签。加标签后为了除去转座酶，将离液缓冲液(chaotropic buffer)加入流动池的3-8泳道，并孵育2分钟。流动池的泳道然后被洗涤两次。洗涤后，Bst酶被用于对加标签的DNA:RNA双链体进行链置换延伸，以除去转座子的非转移链，并使DNA:RNA双链体的DNA链成为全长用于簇生成。除去RNA链和然后用等温扩增生成簇。然后簇被测序。表2显示测序结果。

测序结果与对人脑RNA和通用人类参照RNA的标准RNA测序获得的结果进行比较，标准RNA测序根据标准的Illumina测序方法，使用标准的Illumina测序试剂进行。这种方法在TruSeq RNA Sample PreparationGuide and HiSeq2000 User Guide中描述。指南和试剂可从Illumina Inc.(SanDiego,CA)获得。结果显示于表3。

结果表明，使用本文提供的加标签方法测序的RNA样品具有正态的比对分布。结果表明更高的重复序列掩蔽的簇，可能由于由加标签方法分析的RNA样品具有较高数目的polyA序列和在3’UTR区域存在更多重复序列。有用的读数比标准RNA测序方案的低约10％，再次可能由于在所分析的RNA中更多的重复序列。核糖体RNA的量是如所期望的低，因为，在本文提供的加标签方法中mRNA被分离和测序。线粒体RNA在正常范围内。

实施例3.采用加标签反应和细胞裂解物的RNA测序

本实施例证明，使用粗细胞裂解物，在固定支持物上核酸模板可以被捕获、加标签和测序。简言之，将小鼠细胞使用Triton-X和蛋白酶K溶液裂解。将裂解物施加到流动池，mRNA被捕获和加标签，以及生成簇并测序。作为对照和为了比较，通用人类参考总RNA(UHR)也被捕获、加标签、生成簇和测序。表4简介每个样品类型的两个重复读数结果。

表4.UHR和裂解物mRNA的测序数据比较

表4显示序列是从捕获自粗小鼠细胞裂解物的mRNA直接得到的。与UHR RNA样品相比，当直接从粗细胞裂解物中捕获mRNA时，比对的读数的百分比降低仅仅约10％(比对的％PF读数)。比较UHR对照和小鼠裂解物获得的mRNA的进一步测序数据表明，对于UHR和小鼠裂解物获得的mRNA二者，捕获了正确的链且比对>97％。此外，UHR对照和裂解物来源的mRNA的覆盖度是可比较的；大约65％的非翻译区(UTR)、大约16％的编码区、大约13％的基因间区域、和小百分比的内含子读数。因此，本方法可用于粗裂解物来源的mRNA的捕获、加标签、簇生成和测序。

实施例4.采用来自全mRNA转录本的加标签反应的RNA测序

进行本实验以证明，按照本文公开的方法，代表全转录本的mRNA样品可以在固体支持物上被捕获并加标签，以提供序列信息。简单地说，polyARNA从50 ug UHR总RNA(Agilent)的富集使用PolyA Purist Kit(Ambion)进行。富集的polyA mRNA的RNA片段化在25μL 1X T4 PNK缓冲液(Epicentre)中用100 ng polyA RNA进行，其中样品被加热至95℃5分钟，然后在冰上冷却。片段化的RNA用T4 PNK磷酸化，并将片段用4单位的大肠杆菌polyA聚合酶在50μl含有2 mM ATP的2 X polyA聚合酶缓冲液(Epicentre)中加polyA尾。聚腺苷酸化的片段化的mRNA用RNA Cleanand Concentration kit(Zymo Research)纯化。对照包括PhiX对照以验证测序化学性能，和非总mRNA产生的聚腺苷酸化的样品，其被捕获和加标签，用于与从复杂总RNA UHR池捕获的mRNA全转录本进行比较。

PhiX对照(对照)对照mRNA样品(3'捕获)和总RNA样品衍生的mRNA(全转录本)的2个重复中的重复1(R1)的测序数据被报告在表5中。

表5报告了比对的读数的百分比是可比的，不管mRNA来源(％比对(PF))和高簇生成。另外，序列数据表明，对照mRNA(3'捕获)的转录本覆盖度是大约70％UTR、19％编码区，随后是基因间和内含子区域的覆盖度。从复杂的总RNA产生的mRNA的转录本覆盖度是约43％UTR、37％编码区，基因间和内含子区域相对接近。图10展示了典型基因GAPDH的比对的转录本覆盖度；对照mRNA(3'捕获)显示如预期的主要在基因的3'区域的覆盖度，而从总RNA衍生的mRNA(全转录本)的覆盖度显示更加完整的对外显子和UTR区域的覆盖度。如此，尽管对照mRNA序列比对到与转录本的3'末端相关联的那些区域(polyA加尾区域)，从总RNA衍生的mRNA的覆盖度表现更加完整、完全的转录本读数，从而显示该方法用于从样品中获取全转录本信息的用途。

还进行了另一种工作流，从UHR总RNA样品富集mRNA用于全转录本测序。双链cDNA从500 ng UHR总RNA和50 ng随机DNA六聚体制备。过量引物通过加入20单位的核酸外切酶I(Epicentre)，在37℃下孵育30分钟，随后酶热失活而降解。通过1单位RNA酶I/10单位Hybridase(RNA酶H，Epicentre)的酶混合物在55℃10分钟除去RNA。用等体积的AMPure珠(Agencourt)将反应纯化，在10 mM Tris盐酸(pH 8.0)缓冲液中洗脱DNA。cDNA如下被加polyA尾：用20单位末端转移酶(NewEngland Biolabs)、1 mM ATP和1X转移酶缓冲液，37℃孵育10分钟，然后进行热失活。对于一些样品，使用1:10稀释的随机DNA六聚体。此外，对于某些样品，核酸外切酶I步骤被省略。然后将样品施加到流动池，捕获、加标签、生成簇和测序。对照包括PhiX对照(对照)、非加尾的cDNA(非加尾对照)、dsDNA阴性对照和按照如上所述同样的方法的纯化的mRNA样品，除了采用随机RNA六聚体，并省略了核酸外切酶I步骤。

表6概述了两个重复测序运行的第一个。

表6表明，用核酸酶核酸外切酶I和RNA酶H和I处理样品，随后珠纯化和加polyA尾(核酸外切酶，RNA酶，AMP，加尾)的制备方法，可用于提供用于测序的全mRNA转录本样品。图9显示对于表6中标出的不同条件，流动池上的簇生成的图片。表1中泳道1-8对应于图9中的泳道1-8。PhiX阳性对照显示大量的簇，其对应于测序数据中的最高产率和簇计数。阴性对照泳道2和8，其显示少量的簇，也对应于测序数据中3个最低产量和簇计数中的2个。1：10稀释随机DNA六聚体引物，不论制备方法中外切核酸酶消化与否，对于测序不是最佳的，在表6中显示低簇计数，由图9中所见到的较少簇支持。在全mRNA转录本样品制备过程中使用RNA酶H和I以及外切核酸酶I的方法，导致继PhiX阳性对照后最大数量的簇生成以及％比对，其次是没有实施外切核酸酶I消化的制备方法。此外，在所有测试泳道中，比对的读数的百分比(％比对(PF))分别在泳道3和5中最高。结果表明，在本实施例中描述的用于产生cDNA的替代方法可用于通过利用本申请中所描述的捕获和加标签的方法测序来提供全mRNA转录本信息。

用于样品制备的另外的选择包括，但不限于，使用所公开的方法对来自不具有聚腺苷酸化的RNA的物种的RNA如细菌mRNA测序。在这种情况下，核糖体RNA可首先被除去，剩下的mRNA可如先前所描述的被片段化和polyA加尾。然后mRNA可以被捕获、加标签、簇扩增和测序，如上所述。

这些结果表明，各种不同类型的RNA样品和从RNA样品衍生的DNA样品可以使用本文提供的方法进行测序，并且本文提供的方法提供与当前标准RNA测序方案几乎相当的测序结果。

Claims

1.一种将核酸双链体加标签的方法，包括以下步骤：

(a)提供转座酶和转座子组合物；

(b)提供固定在支持物上的一种或更多种核酸双链体；和

(C)使所述转座酶和转座子组合物与所述一种或更多种核酸双链体在其中所述一种或更多种核酸双链体与所述转座子组合物进行转座反应的条件下接触，以产生一种或更多种加标签的核酸双链体，其中所述转座子组合物包含包含转移链和非转移链的双链核酸分子。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或更多种核酸双链体是DNA:RNA双链体，并且其中所述DNA:RNA双链体在RNA链的5'末端上被加标签。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸双链体是DNA:DNA双链体，并且其中所述DNA:DNA双链体的一条链在该DNA链的5'末端被加标签。

4.如权利要求1至3中所述的方法，其中所述支持物包含多个固定的引物。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述一种或更多种DNA:RNA双链体的所述RNA链或所述DNA:DNA双链体的所述DNA链包括与所述固定的引物中的一种或更多种的至少一部分互补的序列。

6.如权利要求4或5所述的方法，其中所述DNA:RNA双链体或所述DNA:DNA双链体通过以下提供：使一种或更多种RNA分子或单链DNA分子与所述支持物上所述固定的引物杂交，并利用所述RNA分子或单链DNA分子作为模板使杂交到所述RNA分子或单链DNA分子上的引物延伸，以产生所述一种或更多种DNA:RNA双链体或DNA:DNA双链体。

7.如权利要求4或5所述的方法，其中多个DNA:RNA双链体或DNA:DNA双链体通过以下提供：使多个RNA分子或单链DNA分子与所述支持物上所述固定的引物杂交，并利用所述RNA分子或单链DNA分子作为模板使杂交到所述RNA分子或单链DNA分子上的引物延伸，以产生所述多个DNA:RNA双链体或DNA:DNA分子。

8.如权利要求4-7中任一项所述的方法，其中所述固定的引物包含polyT序列。

9.如权利要求4所述的方法，其中所述多个固定的引物包含第一序列的第一引物子集和第二序列的第二引物子集。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述第一引物子集包含polyT序列。

11.如权利要求4所述的方法，其中所述多个固定的引物包含能够与所述多个RNA分子中的一种或更多种RNA分子杂交的靶标特异性引物。

12.如权利要求4所述的方法，还包括将3'衔接子添加到所述多个RNA分子或单链DNA分子上，所述3'衔接子包含与所述多个固定的引物或其子集互补的序列；并且使3’衔接子连接的RNA分子或单链DNA分子与所述固定的引物杂交。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述转座反应产生5'加标签的RNA链或5'加标签的DNA链，所述5'加标签的RNA链或5'加标签的DNA链包含所述转座子组合物的转移链和互补DNA链的3'末端与所述转座子组合物的非转移链之间的缺口。

14.如权利要求13所述的方法，还包括使所述一个或更多个加标签的DNA:RNA双链体或DNA:DNA双链体与核酸修饰酶在使所述DNA链的3'末端延伸的条件下接触，以将所述RNA链复制到其5'末端或将所述单链DNA链复制到其5'末端。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述核酸修饰酶置换所述转座子组合物的非转移链。

16.如权利要求14所述的方法，还包括从所述DNA:RNA双链体除去RNA链。

17.如权利要求16所述的方法，还包括对所述DNA链的至少一部分进行测序。

18.如权利要求16或17所述的方法，还包括复制所述DNA链的至少一部分以产生与所述DNA:RNA双链体的DNA链互补的第二DNA链。

19.如权利要求18所述的方法，还包括对所述第二互补DNA链进行测序。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述DNA:RNA双链体的DNA链在对所述第二互补DNA链进行测序之前被除去。

21.如权利要求16所述的方法，还包括扩增所述DNA链以产生多个包括第一扩增链和第二扩增链的双链DNA分子。

22.如权利要求21所述的方法，还包括除去所述第一扩增链。

23.如权利要求22所述的方法，还包括对所述第二扩增链的至少一部分进行测序。

24.如权利要求23所述的方法，还包括复制所述第二扩增链的至少一部分以再生所述第一扩增链。

25.如权利要求24所述的方法，还包括除去所述第二扩增链。

26.如权利要求25所述的方法，还包括对所述第一扩增链的至少一部分进行测序。

27.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述支持物是珠或多个珠。

28.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述支持物是平面支持物。

29.如权利要求27所述的方法，其中多个双链体被提供，每个双链体位于单个珠上。

30.如权利要求21所述的方法，其中所述扩增产生扩增子的簇。

31.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述转移链包括标签以保留链信息。