ES2565641T3 - Compuesto polisacárido sulfatado y preparación y utilización del mismo - Google Patents

Abstract

Un método para la producción de moléculas de glucano sulfatado, en donde dichas moléculas comprenden: (A) Una o más unidades de beta-D-xilosa lineales conjugadas en 1-4; y (B) al menos una unidad de ácido 4-O-metil-ß-D-glucurónico unido a un carbono 2 de cada ocho a diez unidades de glucosa (por término medio), método que comprende: (a) llevar a cabo la sulfatación de xilano, mediante reacción con: (i) complejo de ácido clorosulfónico y piridina en DMF; (ii) complejo piridina SO3 en DMF; o (iii) una mezcla de (i) y (ii) anterior, para producir sulfato de piridinio xilano; (b) sustituir piridinio, con un contraión para formar una sal de sulfato de xilano sin piridinio; seguido de eliminación de piridina y DMF; (c) llevar a cabo la hidrólisis ácida de la sal de sulfato de xilano sin piridinio para ajustar su peso molecular relativo final; (d) llevar a cabo la ultrafiltración de la sal de sulfato de xilano sin piridinio para eliminar impurezas orgánicas y productos de degradación ; y (e) llevar a cabo al menos un ciclo de resulfatación/hidrólisis de la sal de sulfato de xilano sin piridinio, seguido de la conversión a un sales de sodio y eliminación de dicha piridina y DMF para formar un precipitado no fraccionado.

Description

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DESCRIPCION

Compuesto polisacarido sulfatado y preparacion y utilizacion del mismo Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un compuesto polisacarido sulfatado y a la preparacion y utilizacion del mismo, y en particular a un pentosano muy sulfatado, de bajo peso molecular de distribucion reducida (en este caso un xilano) denominado sulfato de glucuronoxilano (GXS).

La invencion se ha desarrollado principalmente para su utilizacion en el tratamiento de diversos cuadros clmicos. Sin embargo, se apreciara que la invencion no se limita este campo espedfico de utilizacion.

Problemas de la tecnica anterior

Subsulfatacion

Los glucanos y glucosaminoglucanos muy sulfatados (esteres de sulfato) forman una clase terapeutica significativa de productos farmaceuticos en medicina humana y veterinaria. Los esteres de sulfato demuestran una amplia gama de utilidad clmica en el tratamiento de diversas enfermedades, incluidas la osteoartritis, la isquemia miocardica, la cistitis intersticial, el cancer, y el control y tratamiento de enfermedades vmcas, incluidos el virus de la inmunodeficiencia humana y otros retrovirus.

El polisulfato de pentosano se ha utilizado en formulaciones farmaceuticas para el tratamiento de la osteoartritis, como anticoagulante o por otras enfermedades tales como la cistitis intersticial, la encefalopatfa espongiforme transmisible (TSE) y el virus de la inmunodeficiencia (tales como el VIH/SIDA o el virus de inmunodeficiencia felina (VIF)) en mamfferos, tales como seres humanos, productores de alimentos y animales de companfa (tales como felinos, caninos y equinos). El polisulfato de pentosano tambien puede utilizarse para tratar hematomas, hemorroides, congelacion, quemaduras y enfermedades multiparametricas tales como trombosis y aterosclerosis.

Los esteres de sulfato, incluidos la heparina, el sulfato de dextrano y PPS son semisinteticos. Su obtencion y smtesis han demostrado ser muy difmiles, siendo muy variables los resultados de la produccion. Esto se ha traducido en resultados clmicos inconsistentes. Si bien actualmente no existen ensayos clmicos publicados mirando las diferencias en los resultados clmicos de tratamiento de la artrosis utilizando PPS mas homogeneo y mucho mas sulfatado en comparacion con el PPS poco sulfatado, la prueba anecdotica sugiere variabilidad en el resultado clmico de los PPS poco sulfatados. Hay dos razones qmmicas principales que podnan estar detras de la variabilidad de los resultados:

(a) PPS con intervalos de peso molecular incoherentes; y

(b) PPS con una gran variacion en el grado de sulfatacion (14-17%).

En los documentos EP0406685 y WO 9842754 se describen ejemplos de procedimientos de sulfatacion.

Sin embargo, la patente de EE.UU. n° 4.713.373 apoya la reivindicacion de que las fracciones de cadenas de glucanos tales como PPS con mayores grados de sulfatacion tendran mucha mayor eficacia que las que tienen menor sulfatacion. En relacion a la heparina (un glucosaminoglucano), se sabe que el tipo y posicion de los grupos sulfato asf como el nivel de sulfatacion son importantes para la eficacia.

El refinamiento de la molecula de glucano o glucosaminoglucano (para el desarrollo, por ejemplo, de las heparinas de bajo peso molecular) ha sido bien documentado dando como resultado el desarrollo de moleculas con mayor coherencia y previsibilidad en los resultados clmicos. Sin embargo, en la practica, ha demostrado ser difmil de conseguir un nivel de sulfatacion consistentemente alto en posiciones constantes a lo largo de la cadena y en un intervalo de bajo peso molecular. Hasta la fecha nadie ha examinado la importancia del tipo y la ubicacion de los grupos sulfato o distinguido la estructura qrnmica de la molecula de PPS producida por un proceso de fabricacion de la producida por otro. Ademas, el grado de sulfatacion dentro de las formulaciones de PPS conocidas puede variar ampliamente, lo que tambien puede conducir a la variabilidad en la eficacia clmica.

El polisulfato de pentosano como acido libre o en forma de sal (generalmente con cationes inorganicos tales como sodio o de calcio) se describe en la tecnica anterior como una mezcla de oligosacaridos polisulfatados semisinteticos, generalmente obtenidos a partir de xilano de la madera de haya. El polisulfato de pentosano consiste en unidades lineales sulfatadas de beta-D-xilopiranosa conjugadas en 1-4 y tiene acido 4-O-metil-D-glucuronico unido al azar en cada ocho a diez unidades de xilosa (por termino medio).

El numero tfpico de unidades de xilosa en una mezcla de PPS publicado en la tecnica anterior ha sido de entre seis y treinta. Mezclas de PPS actualmente presentes en el mercado (cuando esta en forma de sal de sodio en todos los grupos SO3-) contienen generalmente 15 a 17% de sulfatacion. Aunque la tecnica anterior describe grados de

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sulfatacion del 15 al 20%, es evidente a partir de la teona y la experiencia que el 20% de sulfatacion de PPS no es teoricamente posible a menos que el sodio se sustituya por hidrogeno dando bisulfato de pentosano (en cuyo caso la sulfatacion maxima es de 21,9 %). El mayor grado posible de sulfatacion para PPS fisiologicamente activo es del 18,9 al 19%, dependiendo de la longitud de la molecula. De hecho hasta la fecha, no hay tampoco ninguna justificacion en la tecnica anterior de 19% de sulfatacion para PPS, y aun menos de mayores grados de sulfatacion.

Pueden resultar diferencias en el procedimiento de fabricacion (especialmente durante la hidrolisis y la sulfatacion) con diferencias moleculares de la molecula de PPS, tales como el grado de sulfatacion y la posicion de grupos sulfato en la cadena de glucano. Es bien sabido que la eficacia clmica de los carbohidratos sulfatados puede verse afectada por el

tipo y la posicion de los grupos SO3-, de ah la necesidad de controlar y caracterizar totalmente las moleculas. Esto es bien sabido en relacion a la heparina pero hasta la fecha este conocimiento no se ha aplicado adecuadamente a la(s) molecula(s) PPS.

Los analisis de RMN de la tecnica anterior de ls esteres de sulfato (tal como la Patente de EE.UU. n° 4.713.373) utilizan proporciones de picos de RMN para calcular los grados de sulfatacion. Sin embargo, las proporciones de los picos de RMN no indicaran necesariamente el grado de sulfatacion de la molecula a menos que el calculo se haga mediante el analisis de todo el espectro de RMN.

La tecnica anterior a PPS no caracteriza la posicion de los grupos SO3- (excepto para describir la sulfatacion completa teorica) o para exponer las subespecies moleculares. No ha habido ninguna descripcion en la tecnica anterior de donde no se encuentra el azufre a lo largo de la cadena de glucosaminoglucano o glucano cuando la sulfatacion no es completa. La tecnica anterior reconoce que las mezclas de PPS difieren, pero se centran solo en el nivel de sulfatacion y el peso molecular medio como factores que pueden afectar significativamente la eficacia fisiologica del material PPS.

Los estudios con heparina demuestran que la eficacia de la variacion de especies moleculares (de heparina) depende de la posicion de los grupos -OSO3 dentro de la molecula. Espedficamente, la relacion de la estructura qmmica a la actividad para la heparina se identifica con una secuencia de pentasacarido que comprende tres unidades de D-glucosamina y dos de acido uronico. La unidad central de D-glucosamina en esta secuencia contiene un resto 3-O-sulfato que es raro fuera de esta secuencia. Grupos sulfato en las D-glucosaminas se encuentran que son cnticos para retener gran actividad anticoagulante, mientras que la infrasulfatacion en lugares menos importantes parece no afectar la actividad anticoagulante.

Diferentes tecnicas de fabricacion conducen a diferentes tipos (estructuras qmmicas) de la heparina que se producen y estas estructuras diferentes se demuestra que tienen diferentes eficacias clmicas. A modo de analogfa, las especies moleculares de otras cadenas de glucano (incluido el PPS) vanan de acuerdo no solo con el grado de sulfatacion, sino tambien segun la posicion de los atomos de azufre. La tecnica anterior a PPS no se ocupa de esto en detalle.

Aunque el uso de PPS llego a generalizarse, y reducir variaciones entre lotes que podnan afectar a la eficacia farmaceutica, el problema fundamental a superar fue la produccion de una especie molecular del PPS con un contenido de azufre constante cerca de o en 18 a 19%, con un intervalo de peso molecular medio restringido que garantiza beneficios fisiologicos constantes y grupos sulfato constantemente unidos a posiciones que garanticen efectos fisiologicos. Hasta la fecha, no ha habido ninguna exposicion en la tecnica anterior en cuanto a la importancia relativa de las posiciones de los grupos sulfato en la cadena de glucosaminoglucanos o glucanos.

Peso molecular de amplio espectro

PPS se obtiene de fuentes naturales tales como xilano de la madera de haya. En su forma natural, PPS consiste en cadenas moleculares de distintas longitudes o pesos moleculares. Sin embargo, como la heparina, los efectos de PPS natural no fraccionado pueden ser diffciles de predecir.

La experiencia clmica con heparina ha descubierto que al modificar la heparina y hacer la mezcla de moleculas mas homogenea (con un intervalo mas estrecho de peso molecular), se puede conseguir mayor eficacia clmica, consistencia y seguridad. Experiencia similar ha surgido en el uso clmico de PPS.

Sin embargo, en la practica, ha sido difmil de conseguir consistencia de la mezcla heterogenea de los hidratos de carbono que componen PPS durante la produccion comercial. Esto es debido a que ha sido difmil de conseguir un peso molecular medio uniforme, un peso molecular uniformemente bajo y uniforme pero alto nivel de sulfatacion.

Objeto de la invencion

Es un objetivo de la presente invencion superar o mejorar al menos una de los inconvenientes de la tecnica anterior, o proporcionar una alternativa util.

Segun un aspecto de la invencion, se proporciona una molecula de glucano sulfatado (ester de sulfato) que tiene:

(a) una o mas unidades lineales de beta-D-xilosa conjugadas en 1-4; y

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(b) al menos una unidad de acido 4-O-metil-p-D-glucuronico unida al carbono 2 de cada aproximadamente ocho a diez (por termino medio) de dichas unidades de xilosa.

Segun otro aspecto de la invencion, se proporciona una molecula de glucano sulfatado (ester de sulfato) que tiene:

(a) una o mas unidades lineales de beta-D-xilosa conjugadas en 1-4; y

(b) al menos una unidad de acido 4-O-metil-p-D-glucuronico unida al carbono 2 de cada aproximadamente ocho a diez (por termino medio) de dichas unidades de xilosa,

en donde dicha molecula tiene la siguiente configuracion de grupos SO3- cuando esta completamente sulfatada:

(i) dos grupos SO3- de cada una de dicha(s) unidad(es) de acido glucuronico, independientemente de la posicion de dicha(s) unidad(es) de acido glucuronico lo largo de dicha molecula;

(ii) tres grupos SO3- en una unidad de xilosa terminal cuando dicha unidad de xilosa no tiene un grupo de acido glucuronico;

(iii) dos grupos SO3- en una unidad de xilosa terminal cuando dicha unidad de xilosa tiene un grupo de acido glucuronico;

(iv) dos grupos SO3- en una unidad de xilosa a mitad de la cadena cuando dicha unidad xilosa a mitad de la cadena no tiene un grupo de acido glucuronico;

(v) un grupo SO3- en una unidad de xilosa a mitad de la cadena cuando dicha unidad de xilosa mitad de la cadena tiene un grupo de acido glucuronico.

Segun todavfa otro aspecto de la invencion, se proporciona una molecula de glucano sulfatado (ester de sulfato) que tiene:

(a) una o mas unidades lineales de beta-D-xilosa conjugadas en 1-4; y

(b) al menos una unidad de acido 4-O-metil-p-D-glucuronico unida al carbono 2 de cada aproximadamente ocho a diez (por termino medio) de dichas unidades de xilosa,

en donde dicha molecula tiene la siguiente configuracion preferente de grupos NaSO3- cuando esta muy sulfatada:

(i) hasta dos grupos SO3- de cada una de dicha(s) unidad(es) de acido glucuronico, independientemente de la posicion de dicha(s) unidad(es) de acido glucuronico lo largo de dicha molecula;

(ii) hasta tres grupos SO3- en una unidad de xilosa terminal cuando dicha unidad de xilosa no tiene un grupo de acido glucuronico;

(iii) hasta dos grupos SO3- en una unidad de xilosa terminal cuando dicha unidad de xilosa tiene un grupo de acido glucuronico;

(iv) hasta dos grupos SO3- en una unidad de xilosa a mitad de la cadena cuando dicha unidad xilosa mitad de la cadena no tiene un grupo de acido glucuronico; y

(v) hasta un grupo SO3- en una unidad de xilosa a mitad de la cadena cuando dicha unidad de xilosa a mitad de la cadena tiene un grupo acido glucuronico,

de tal manera que no no hay mas de un total de dos grupos SO3- en un estado totalmente sulfatado.

Segun otro aspecto de la invencion se proporciona una mezcla que comprende moleculas de glucano sulfatado (ester de sulfato) en donde dichas moleculas tienen la siguiente estructura qmmica tfpica:

(a) una o mas unidades lineales de beta-D-xilosa conjugadas en 1-4; y

(b) al menos una unidad de acido 4-O-metil-p-D-glucuronico unida al carbono 2 de cada aproximadamente ocho a diez (por termino medio) de dichas unidades de xilosa.

Segun aun otro aspecto de la invencion, se proporciona una mezcla que comprende moleculas de glucano sulfatado (ester de sulfato) en donde dichas moleculas tienen la siguiente estructura qmmica tfpica:

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(a) una o mas unidades lineales de beta-D-xilosa conjugadas en 1-4; y

(b) al menos una unidad de acido 4-O-metil-p-D-glucuronico unida al carbono 2 de cada aproximadamente ocho a diez (por termino medio) de dichas unidades de xilosa,

en donde dicha unidad de acido glucuronico reside preferentemente en una unidad de xilosa del terminal izquierdo.

Segun aun un aspecto adicional de la invencion, se proporciona una mezcla que comprende moleculas de glucano sulfatado (ester de sulfato) en donde dichas moleculas tienen la siguiente estructura qmmica tipica:

(a) una o mas unidades lineales de beta-D-xilosa conjugadas en 1-4; y

(b) al menos una unidad de acido 4-O-metil-p-D-glucuronico unida al carbono 2 de cada aproximadamente ocho a diez (por termino medio) de dichas unidades de xilosa,

en donde dicha unidad de acido glucuronico reside preferentemente en una unidad de xilosa del terminal derecho.

Segun todavfa otro aspecto de la invencion, se proporciona una mezcla que comprende moleculas de glucano sulfatado (ester de sulfato) en donde dichas moleculas tienen la siguiente estructura qmmica tfpica:

(a) una o mas unidades lineales de beta-D-xilosa conjugadas en 1-4; y

(b) al menos una unidad de acido 4-O-metil-p-D-glucuronico unida al carbono 2 de cada aproximadamente ocho a diez (por termino medio) de dichas unidades de xilosa,

en donde dicha unidad de acido glucuronico reside preferentemente en una unidad de xilosa a mitad de la cadena.

Segun aun un aspecto adicional de la invencion se proporciona un metodo para la produccion de una mezcla que comprende moleculas de glucano sulfatado en donde dichas moleculas comprenden:

(a) una o mas unidades lineales de beta-D-xilosa conjugadas en 1-4; y

b) al menos una unidad de acido 4-O-metil-p-D-glucuronico unida al carbono 2 de cada aproximadamente ocho a diez (por termino medio) de dichas unidades de xilosa.

Segun un aspecto adicional de la invencion todavfa, se proporciona un metodo para el fraccionamiento de moleculas de glucano sulfatado (ester de sulfato) obtenidas de xilano utilizando un disolvente organico.

Segun aun otro aspecto de la invencion, se proporciona un metodo para la purificacion de una mezcla que comprende moleculas de glucano sulfatados (ester de sulfato), en donde dicha purificacion implica fraccionamiento utilizando un disolvente organico.

Segun todavfa otro aspecto de la invencion, se proporciona un metodo para la decoloracion de una mezcla que comprende moleculas de glucano sulfatado (ester de sulfato), en donde dicha decoloracion implica:

(a) carbon vegetal;

(b) cloro;

(c) peroxido;

(d) fraccionamiento empleando un disolvente organico; o

(e) cualquier combinacion de los anteriores.

Segun un aspecto adicional de la invencion todavfa, se proporciona una formulacion terapeutica de moleculas de glucano sulfatado (ester de sulfato) adecuada para administracion parenteral en la que dicha formulacion incluye moleculas de glucano sulfatado (ester de sulfato) en solucion acuosa.

Segun un aspecto adicional de la invencion todavfa, se proporciona una formulacion terapeutica de moleculas de glucano sulfatado (ester de sulfato) adecuada para administracion oral.

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Segun todav^a otro aspecto de la invencion, se proporciona un mecanismo para la administracion de una formulacion terapeutica de moleculas de glucano sulfatado (ester de sulfato), en donde dicho mecanismo de administracion es un dispositivo de suministro tipo pluma que permite:

(a) marcar en un dial la dosis;

(b) precarga con un cartucho de dosis unitaria;

(c) una combinacion de las anteriores.

Segun aun un aspecto adicional de la invencion, se proporciona una mezcla de moleculas de glucano sulfatado (ester de sulfato) adecuadas para su uso como antioxidante.

Segun otro aspecto adicional de la invencion, se proporciona un antioxidante que comprende moleculas de glucano sulfatado (ester de sulfato).

Breve descripcion de los dibujos

A continuacion se describira, a modo de ejemplo solamente, una realizacion preferida de la invencion con referencia a los dibujos adjuntos en los que:

La figura 1 es una representacion esquematica de una realizacion preferida de GXS que muestra los puntos de sulfatacion en las unidades de xilosa que componen la cadena de glucano y la presencia de una unidad de acido glucuronico en la unidad de xilosa del terminal izquierdo.

La figura 2 es un ejemplo de un resultado tfpico de espectrometna de RMN del compuesto A PPS de la tecnica anterior.

La figura 3 es un ejemplo de un resultado tfpico de espectrometna de RMN del compuesto B PPS de la tecnica anterior.

La figura 4 es un ejemplo de un resultado tfpico de espectrometna de RMN de la realizacion preferida, compuesto C.

La figura 5 es un ejemplo de un resultado tfpico de espectrometna de RMN de la realizacion preferida, compuesto C, pero con la adicion de acido trifluoroacetico a la solucion D2O de GXS, con el fin de mover el pico de agua que oscurece parcialmente el pico a 4,7 ppm.

La figura 6 es un ejemplo de un perfil tfpico de electroforesis capilar en zona del compuesto A PPS.

La figura 7 es un ejemplo de un perfil tfpico de electroforesis capilar en zona del compuesto B PPS.

La figura 8 es un ejemplo de un perfil tfpico de electroforesis capilar en zona de la realizacion preferida, compuesto C.

La figura 9 es un diagrama de flujo que esboza una realizacion preferida del metodo de doble sulfatacion.

La figura 10 es una tabla que contiene datos ilustrativos obtenidos en la cromatograffa de exclusion por tamano de GXS no fraccionado y GXS fraccionado (obtenidos en las concentraciones de etanol listadas).

La figura 11 es un cromatograma ilustrativo relativo a la muestra de GXS no fraccionado en la figura 10.

La figura 12 es un cromatograma ilustrativo que muestra un pico en seccion de una primera fraccion de GXS obtenido utilizando 40% de etanol como disolvente organico.

La figura 13 es un cromatograma ilustrativo que muestra un pico en seccion de una segunda fraccion de GXS obtenido utilizando 45% de etanol como disolvente organico.

La figura 14 es un cromatograma ilustrativo que muestra un pico en seccion de una tercera fraccion de GXS obtenido utilizando 50% de etanol como disolvente organico.

La figura 15 es un cromatograma ilustrativo que muestra un pico en seccion de una cuarta fraccion de GXS obtenido utilizando 55% de etanol como disolvente organico.

La figura 16 es un cromatograma ilustrativo que muestra un pico en seccion de una quinta fraccion de GXS obtenido utilizando 60% de etanol como disolvente organico.

La figura 17 es un cromatograma ilustrativo que muestra un pico en seccion de una sexta fraccion de GXS obtenido utilizando 65% de etanol como disolvente organico.

La figura 18 es un cromatograma ilustrativo que muestra un pico en seccion de una septima fraccion de GXS obtenido utilizando 70% de etanol como disolvente organico.

La figura 19 es un espectro ilustrativo de RMN obtenido a partir de un GXS del segundo ciclo de fraccionamiento (en 45% de etanol).

La figura 20 es un espectro ilustrativo de RMN obtenido a partir de un GXS del tercer ciclo de fraccionamiento (en 50% de etanol).

5 La figura 21 es un espectro ilustrativo de RMN obtenido a partir de un GXS del cuarto ciclo de fraccionamiento (en 55% de etanol).

Descripcion detallada

Una realizacion preferida de la presente invencion se describira a continuacion haciendo referencia a los dibujos. La siguiente descripcion detallada junto con las figuras proporciona el destinatario experto una comprension de la 10 invencion. Debe apreciarse, sin embargo, que la invencion no se limita a las aplicaciones descritas a continuacion.

Diccionario de terminos definidos

La Tabla 1 es un diccionario de terminos definidos segun la invencion. Los terminos definidos en la Tabla 1 se indican con el uso de mayusculas en todo el documento. Si un termino no se escribe con mayuscula entonces ha de interpretarse su significado corriente, a menos que se especifique lo contrario.

Tabla 1: Diccionario de terminos definidos

Termino

Descripcion

Grado de sulfatacion

Medicion de la composicion relativa de azufre en una molecula de glucano. Esta se mide como peso molecular relativo del azufre expresado en porcentaje del peso molecular de toda la cadena. Vease mas abajo las definiciones de sulfatacion "completa", "fuerte" y "parcial".

Sulfatacion completa, totalmente sulfatado, estado totalmente sulfatado

Saturacion de una molecula de glucano en la que el azufre ocupa todas las posiciones disponibles en las unidades de xilosa y unidades de acido glucuronico en la cadena de glucano. La sulfatacion completa de la cadena de glucano es del 18,9% (cuando el sodio no esta sustituido por hidrogeno, como se expone en problemas de la tecnica anterior).

GXS

Anion sulfato de glucuronoxilano y sus sales

PPS

Polisulfato de sodio y pentosano

Fuerte sulfatacion,

Fuerte sulfatacion de la cadena de glucano es una sulfatacion del 18% o mayor.

muy sulfatado, estado

muy sulfatado

Pm

Peso molecular de la parte superior de un pico de la cromatograffa por exclusion de tamano

Sulfatacion parcial, parcialmente sulfatado, estado parcialmente sulfatado

Sulfatacion parcial es menos del 18% de sulfatacion. En la practica, las moleculas PPS de la tecnica anterior (que son una cadena de glucano) no han superado 17% de sulfatacion a menos que el sodio se sustituya por hidrogeno, resultando bisulfato de pentosano en lugar de PPS.

Fraccionamiento selectivo

En este documento fraccionamiento selectivo significa fraccionamiento con un disolvente organico tal como etanol realizado en una solucion alcalina (p. ej., pH 9,0)

Los elementos de la invencion se describen a continuacion bajo los siguientes encabezamientos: Una realizacion preferida de un compuesto polisacarido sulfatado: GXS

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La presente invencion proporciona una nueva molecula de glucano sulfatado (ester de sulfato). La nueva molecula es la primera molecula conocida para conseguir fuerte y total sulfatacion de la cadena de xilano y se denominara sulfato de glucuronoxilano (GXS). GXS es distinto de las moleculas PPS conocidas, como se muestra por analisis qmmico y estudios clmicos de rendimiento (expuestos mas adelante en este documento). Ningun metodo descrito actualmente en la tecnica anterior es capaz de conseguir fuerte o total sulfatacion de la molecula de PPS.

Estructura qu^mica

Segun la tecnica anterior, PPS consiste en unidades lineales sulfatadas de beta-D-xilopiranosa conjugadas en 1-4 y tiene acido 4-O-metil-p-D-glucuronico unido al azar al carbono 2 en cada ocho a diez unidades de xilosa (por termino medio).

Una configuracion de la realizacion preferida es una mezcla de moleculas GXS en la que al menos el 10% de las moleculas en la mezcla estan completamente sulfatadas. El termino "sulfatacion completa" lo utiliza el solicitante para referirse a una configuracion de la molecula GXS como se ilustra en la figura 1, con la siguiente composicion de grupos SO3-:

(a) en la unidad de xilosa del terminal derecho ilustrada, hay tres grupos SO3-;

(b) en cada unidad de xilosa a mitad de la cadena, hay dos grupos SO3-; y

(c) en la unidad de xilosa del terminal izquierdo, hay una unidad de acido glucuronico (definida por una unidad carboxilo y un grupo -OCH3 [4-metoxi]) y dos unidades SO3-.

La configuracion anterior se basa en la bibliograffa cientffica (p. ej., Friedrich Cavagna, Hans Deger, Jurgen Puls, Carbohydrate Research 129 (1984) 1-8), que indica que el 97% de las moleculas en una mezcla de isomeros de glucano hidrolizados tendra la unidad de acido glucuronico en la pentosa del terminal izquierdo. Tambien es bien conocido que los grupos carboxilo en especies moleculares tales como enzimas a menudo participan indirectamente y grnan/catalizan la hidrolisis. Ademas, el programa de modelado 3D (en concreto, el programa comercial conocido como ACD/3D de Advanced Chemistry Development, Inc.) indica que en la macromolecula de xilano sulfatado no hidrolizado, unidades de xilosa modificadas con acido glucuronico estaran en la configuracion de barco retorcida, anadiendo motivos de configuracion y estericos a la hidrolisis dirigida (guiada por el acido glucuronico). Esto esta en contraste con la tecnica anterior de PPS que reivindica asignacion aleatoria de unidades de acido glucuronico en las unidades de xilosa de la cadena izquierda, derecha y media.

Las realizaciones preferidas permiten un alto rendimiento de glucanos muy y/o completamente sulfatados. Los isomeros de estos glucanos pueden separarse utilizando electroforesis, cromatograffa o tecnicas similares, produciendo con ello compuestos con eficacia farmaceutica o terapeutica potencialmente mayor.

En una primera realizacion preferida, el GXS se fracciona utilizando un disolvente organico. Ninguna de las moleculas de PPS conocidas extrafdas en xilano se fraccionan de esta manera. En una segunda realizacion preferida, el GXS no se fracciona. Todos los comentarios en la descripcion detallada se aplican a todas las realizaciones y configuraciones de la invencion, a menos que se indique espedficamente lo contrario.

En todas las configuraciones, la realizacion preferida es un GXS semisintetico con 18% o mas de sulfatacion, verificada por pruebas para grado de sulfatacion (expresado en porcentaje en peso de la composicion de la cadena de glucano). La tabla 1 contiene ejemplos de pruebas en tres lotes, que demuestran mas de 18% de sulfatacion de GXS sintetizado como una sal de sodio utilizando el metodo de la invencion:

Tabla 1. Grado de sulfatacion

% de sulfatacion

Lote 1

18,2

Lote 2

18,0

Lote 3

18,4

GXS es un anion y puede existir en una amplia gama de realizaciones practicas, uniendo a varios contraiones tales como metales inorganicos (p. ej., Na, K, Ca, Mg, Ag) o bases organicas. Se incluyen tambien mas ejemplos en el

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apartado "1.2 Conversion de la sal de piridinio en una sal de sodio, como configuracion ilustrativa de la realizacion preferida".

El grado de sulfatacion de la realizacion preferida se distingue de las cadenas de glucano conocidas procedentes del xilano (descritas en la tecnica anterior como moleculas PPS), que tienen menos de 17% de sulfatacion en la practica. El solicitante sugiere que esto es debido a una diferencia nueva en el metodo de preparacion de GXS en comparacion con PPS conocidos, como se describe mas adelante en este documento.

El grado de sulfatacion de GXS en comparacion con el PPS se ha comprobado por espectrometna de resonancia magnetica nuclear (RMN) de protones, llevada a cabo por un laboratorio independiente utilizando la misma metodologfa (50 mg/ml de D2O con o sin acido trifluoroacetico) y equipo (600 MHz) a traves de muestras de tres compuestos de glucanos diferentes, cada una obtenida a partir de xilano pero fabricada por un proveedor diferente. Los tres compuestos diferentes analizados fueron los siguientes:

(a) compuesto A (vease la figura 2) - un compuesto PPS;

(b) compuesto B (vease la figura 3 ) - un compuesto PPS; y

(c) el compuesto de la invencion (compuesto C - vease la figura 4): un compuesto de GXS.

En las figuras 2 a 4 se demuestran ejemplos del analisis de RMN de diferentes compuestos. El compuesto de la invencion, compuesto C, se diferencia de los compuestos de PPS de la tecnica anterior, indicados por los analisis de RMN (y otros analisis descritos a continuacion). Los desplazamientos exactos del pico de RMN diferiran segun las condiciones experimentales tales como la temperatura, la concentracion de la muestra, el disolvente utilizado, y asf sucesivamente. Por lo tanto, todos los desplazamientos del pico de RMN son aproximados y solamente indicativos.

Con referencia a la figura 2, la intensidad del pico visto a 5,1 ppm indica sulfatacion incompleta del compuesto A en la posicion 2 de las subunidades de xilosa. Para aclarar, el pico a 5,1 ppm se debe al desplazamiento en la RMN de protones a C1 de las unidades de xilosa cuando un grupo sulfato esta presente en C2 (lo que significa que el desplazamiento de este proton a C1 no sera a 5,1 ppm si no hay sulfatacion en C2). Por lo tanto, el pico a 5,1 ppm es una medida indirecta de sulfatacion en la posicion 2 de las unidades de xilosa.

El pico a aproximadamente 3,4 ppm se debe al grupo OCH3 de acido glucuronico. La presencia de un solo pico marcado a aproximadamente 3,4 ppm indica la sulfatacion consistente en ambas posiciones 2 y 3 de la unidad de acido glucuronico en el compuesto A.

Con referencia ahora a la figura 3, la intensidad y el aspecto de dos picos a 3,4 ppm indican sulfatacion desigual del compuesto B en las posiciones 2 y 3 de la unidad de acido glucuronico. Ademas, el programa de prediccion de RMN indico que las unidades de acido glucuronico completamente sulfatadas se presentaran con el pico a aproximadamente 5,3 ppm, mientras que la presencia del pico a 5,2 ppm es tfpica para el acido glucuronico parcialmente sulfatado (grupo SO3 que falta en la posicion 3). Por lo tanto, la presencia de dos picos a aproximadamente 3,4 y otros dos picos en la region de 5,2-5,3 ppm indico sulfatacion desigual del acido glucuronico del compuesto B.

Comparando ambas figuras 2 y 3, los espectros de RMN de ambos compuestos A y B no muestran trazas significativas de picos a 5,85 ppm y 5,7 ppm. Segun los calculos teoricos y las busquedas en bases de datos de estructuras qmmicas experimentales llevados a cabo por modelado de RMN y programa de prediccion (en concreto, el programa comercial conocido como ACD/C+H NMR Predictors y DB por Advanced Chemistry Development, Inc.):

(a) el pico de 5,85 ppm se relacionara con una xilosa del terminal derecho completamente sulfatada (con tres grupos sulfato); y

(b) el pico de 5,7 ppm indica que dos (probablemente en las posiciones 1 y 3) de cada tres posibles grupos sulfato en la xilosa del terminal derecho estaran presentes.

Por lo tanto, los picos a 5,85 ppm y 5,7 ppm indican una mezcla de moleculas completamente y parcialmente sulfatadas (en la xilosa del terminal derecho). Dado que ambos de estos picos son practicamente insignificante para el compuesto A y el compuesto B, esto indica que ninguno de los dos compuestos ha conseguido la sulfatacion teorica completa.

La figura 4 contiene un ejemplo de los datos de espectrometna de RMN de GXS. La RMN en la figura 4 demuestra la presencia importante de moleculas completamente sulfatadas y la existencia de grupos sulfato (SO3-) en todas las unidades de xilosa a lo largo de la cadena de glucano recien creada conocida como GXS.

Espedficamente, la sulfatacion completa de todas las unidades de xilosa en GXS viene indicada por la aparicion de picos a 5,1 ppm, 4,7 ppm (vease tambien la figura 5), 4,4 ppm y 3,8 ppm, como se muestra en la figura 4. El pico de RMN a 4.7 ppm se ve mas claramente en la figura 5, que ha sido recogida por la adicion de acido trifluoroacetico a la solucion de GXS en D2O, con el fin de mover el pico de agua (visible en la figura 4 a alrededor de 4,7 ppm) y muestra

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la sulfatacion completa de ese pico. Los demas picos se pueden ver totalmente en la figura 4. La adicion de TFA no es el modo preferido de recogida de espectros de RMN ya que la adicion de dicho acido fuerte podna afectar a la aparicion de algunos picos pequenos, pero importantes, o incluso provocar un pequeno cambio de la estructura de GXS que es propensa a la degradacion acida.

El unico pico marcado en la RMN a aproximadamente 3,4 ppm indica sulfatacion consistente y el pico de 5,3 ppm indica sulfatacion completa del acido glucuronico. Ademas, los picos a aproximadamente 5,85 ppm y 5,7 ppm indican una mezcla de una unidad de xilosa del terminal derecho completamente sulfatada y una unidad de xilosa del terminal derecho parcialmente sulfatada (con grupos SO3 en las posiciones 1 y 3). Por lo tanto, el modelado predictivo de los datos de RMN indico que el compuesto GXS de la invencion es una mezcla de moleculas completamente sulfatadas y muy sulfatadas, con gran numero de moleculas completamente sulfatadas.

Las figuras 6 y 7 contienen perfiles tfpicos de electroforesis capilar en zona de la muestra (CZE) de los compuestos A (Fig. 6) y B (Fig. 7), respectivamente. El compuesto B es el compuesto PPS pionero lanzado al mercado para su uso en la osteoartritis. El fabricante del compuesto A (fabricante A) lanzo posteriormente un compuesto (A) con perfil CZE en forma de campana mostrado en la figura 6 como un tipo de PPS. El fabricante B utilizo previamente la diferencia en los perfiles CZE (es decir, los picos de oligosacaridos mas cortos en el perfil CZE del compuesto A en comparacion con el compuesto B) al sostener que el PPS en forma de campana no es una copia generica de la molecula PPS que es el compuesto B.

El fabricante A es el solicitante de la solicitud de patente n°WO 2007/123800, en la que se opone a la importancia de picos de CZE bien definidos (oligosacaridos cortos). El componente de la curva en forma de campana del perfil de CZE representa un gran numero de especies moleculares. Por el contrario, los picos bien definidos en un perfil de CZE representan un numero menor de especies moleculares - en la figura 7, los picos se producen en la izquierda de la curva en forma de campana, lo que indica un menor numero de especies moleculares en el intervalo de peso molecular inferior. La curva en forma de campana para el compuesto del fabricante A tiene un perfil mas agudo que la del compuesto B (vease comparando las figuras 6 y 7). El fabricante A ha utilizado este para apoyar una deduccion de que el area bajo la curva representa un mayor numero de especies de bajo peso molecular.

La figura 8 contiene un perfil tfpico de CZE de la realizacion preferida no fraccionada. El perfil contiene un gran numero de picos bien definidos (oligosacaridos cortos) a la izquierda, continuando en la curva en forma de campana. Una interpretacion del perfil de CZE es que indica que la incidencia de las especies moleculares en el intervalo de peso molecular mas bajo para el compuesto C (GXS) es mayor que para los compuestos A y B.

Aunque los perfiles de CZE de GXS (compuesto C) y del compuesto B PPS tienen similitudes, los perfiles de RMN de los dos compuestos presentan ineqmvocamente diferencias muy importantes en la estructura qmmica entre las dos moleculas. La RMN es una tecnica mejor para distinguir la estructura molecular de los glucanos que CZE y RMN es ampliamente reconocida como una tecnica principal de firma qmmica. CZE no puede contar con la misma precision para determinar la firma qmmica de una molecula.

Un metodo de preparacion de GXS a partir de xilano: una realizacion preferida

Una realizacion preferida proporciona un nuevo metodo para la produccion de sulfatos de xilano (espedficamente, el GXS descrito anteriormente) a partir de xilano de madera de haya. El metodo de produccion incluye las etapas siguientes:

(a) realizacion de una nueva tecnica de doble sulfatacion utilizando complejo de piridina acido clorosulfonico en DMF, complejo piridina SO3 en DMF o una combinacion de estos en un disolvente;

(b) ultrafiltracion para eliminar las impurezas inorganicas (p. ej. cationes divalentes) y algunos de los productos de degradacion de mu bajos PM a partir del GXS. La ultrafiltracion puede ocurrir en una o mas etapas a lo largo del metodo de produccion; y

(c) en relacion con la realizacion de GXS fraccionada, la realizacion del fraccionamiento con un disolvente organico tal como etanol, para producir moleculas de GXS de bajo PM con distribucion restringida y como un medio novedoso para decoloracion. Ningun metodo conocido para la extraccion de moleculas de PPS de la tecnica anterior a partir de xilano conlleva una etapa de fraccionamiento utilizando un disolvente organico o una mezcla que incluye un disolvente organico. Ademas, el metodo de fraccionamiento del solicitante incluye las nuevas etapas de:

i. fraccionamiento selectivo de la mezcla de GXS (obtenido a partir del metodo de doble sulfatacion), utilizando un disolvente organico, para aumentar el rendimiento de moleculas de GXS muy y totalmente sulfatadas;

ii. modificacion del pH de la solucion molecula/disolvente para hacerla alcalina (por lo tanto precipitando selectivamente las moleculas de PM mas alto); y

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iii. empleo de fraccionamiento selectivo como medio para eliminar el color (un cambio de color desde una fraccion a la siguiente indica la degradacion qmmica que produce coloracion del precipitado).

1. Principio de sulfatacion

1.1 Produccion de la sal polisulfato de xilano piridina

El xilano reacciona en determinadas condiciones con acido clorosulfonico piridina, piridina SO3 o una combinacion para formar esteres sulfatados de xilano. El medio de reaccion contiene un aceptador de protones (N,N-dimetilformamida (DMF)), que puede ser un disolvente aprotico polar superior. Las ecuaciones incluyen:

ClSO3H + 2C5H5N ^ SO3C5H5N + C5H5NHCl

Xilano-OH + SO3C5H5N ^ Xilano-O-SO3HC5H5N

Xilano-OH + ClSO3H ^ Xilano-O-SO3H + HClt

En presencia de DMF, la reaccion cuantitativa de piridina con acido clorosulfonico, por ejemplo, produce inmediatamente SO3HC5H5N y un mol de cloruro de piridinio. El SO3HC5H5N reacciona con xilano para formar xilano-O- SO3HC5H5N, que tiene buena solubilidad en DMF. La DMF muy polar se asocia con los grupos hidroxilo del sustrato y los hace mas accesibles para el complejo SO3-piridina, que se utiliza como donante de sulfato. La utilizacion de piridina y DMF en exceso y la temperatura de sulfatacion inferior no solo puede evitar la degradacion sino que forma un sistema homogeneo, lo que da lugar a una reaccion mas completa.

El cloruro de hidrogeno formado en la mezcla de reaccion puede ser absorbido en el agua mediante un tubo con CaCl2. La temperatura (75°C) mantiene el xilano disuelto en el sistema de reaccion y da un mayor grado de sulfatacion. La sal de piridinio del xilano sulfatado se recupera y se purifica por precipitacion en metanol.

1.2. Conversion de la sal de piridinio en una sal de sodio, como ejemplo de configuracion de la realizacion preferida

La sal de piridinio se puede convertir en la sal de sodio al elevar el pH a un nivel donde la piridina no esta protonada, y se libera como piridina libre. Esta reaccion es reversible.

Xilano-O-SO3HC5H5N + NaOH ^ Xil-O-SO3Na + C5H5N

El pH alto acelera la conversion en la sal de sodio, pero puede causar degradacion. Un pH de 9,5-10 es adecuado. La piridina residual libre y DMF se eliminan por evaporacion rotativa a 50°C.

En configuraciones alternativas, la sal de piridinio se puede convertir en otras sales, uniendose a cualquier otro contraion adecuado, tal como un metal inorganico (p. ej., Na, K, Ca, Mg, Ag) o una base organica. Los ejemplos adecuados incluyen:

(I) Ester etflico de glicina (u otro ester de aminoacido)

(ii) Glucosamina

(iii) Procama

(iv) Tetracama

(v) Trietanolamina (utilizada en forma de salicilato de trietanolamina)

(vi) Benzatina

(vii) Colina (utilizada en forma de salicilato de colina)

(viii) Benorilato

(ix) Imipramina

(x) Penicilamina

(xi) Trimetoprima

(xii) Mesalamina

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(xiii) Meglumina (N-metilglucamina)

(xiv) 4-metil-2-hexanamina (metilhexanoamina)

(xv) acido p-amino hipurico

(xvi) 2-amino-2-metil-1,3-propanodiol

(xvii) 2-amino-4-picolina

(xviii) acido 4-amino salidlico

(xix) Pirilamina

(xx) Guanina.

1.3. Control de tamano molecular y decoloracion

El xilano de un proveedor comercial (p. ej. Sigma o Kaden) tiene un peso molecular mayor (10.000 a 50.000) que el requerido. Teoricamente, la sulfatacion completa hara que el peso molecular (PM) del xilano sulfatado final aumente 2,5 veces el del xilano de partida. Para asegurar un PM final de aproximadamente 1.000 a 6.000, pueden utilizarse tres metodos:

I. el xilano se sulfata directamente despues de la hidrolisis a un tamano molecular adecuado;

II. la reduccion del tamano molecular y decoloracion se pueden llevar a cabo de forma simultanea realizando la reaccion en medio acido que contiene peroxido de hidrogeno o cloro; o

III. el xilano se sulfata directamente, se hidroliza en medio acido a un tamano molecular adecuado, y el producto resultante se vuelve a sulfatar.

Se ha demostrado que los metodos (II) y (III) son metodos eficientes para obtener un GXS sulfatado de bajo peso molecular, de baja viscosidad. El producto sulfatado es muy soluble en agua en comparacion con el xilano natural por eso la despolimerizacion y la dialisis posterior son mas faciles de realizar. Sin embargo, ambos metodos (I) y (II) adolecen de inconvenientes.

En el metodo (II), aunque la sulfatacion seguida de la despolimerizacion es una manera conveniente de obtener el tamano molecular deseado, la hidrolisis acida a alta temperatura (80-100°C) tambien produce alguna desulfatacion. Como resultado, el espectro de RMN del producto final no es satisfactorio. Tambien hay un problema con el poder oxidante residual conferido por el peroxido de hidrogeno, por lo que se recomienda encarecidamente utilizar cloro.

En el metodo (I), aunque la despolimerizacion seguida de sulfatacion proporciona un contenido de sulfatacion satisfactorio, la etapa de despolimerizacion da bajos rendimientos debido a la baja solubilidad del polfmero natural en medio acido, lo que conduce a una reaccion heterogenea diffcil de reproducir. Ademas, no es facil desalar xilano despolimerizado, no sulfatado por dialisis debido a la baja solubilidad que conduce al bloqueo de la membrana.

Es sabido tambien que la exposicion de xilano sulfatado a condiciones extremas tales como medio acido y calor durante la hidrolisis podna conducir a la perdida de azufre y apertura de nuevas posiciones para la posible sulfatacion.

Los inconvenientes de los metodos (I) y (II) pueden superarse mediante la sulfatacion seguida de despolimerizacion, a continuacion el metodo de resulfatacion (III). La introduccion de grupos sulfato mejora en gran medida la solubilidad del xilano, y la etapa de despolimerizacion da rendimientos mas altos. La desulfatacion en la hidrolisis puede ser superada por la resulfatacion. El solicitante ha adoptado este metodo aunque es mas costoso de reactivos y consume mucho tiempo.

2. Metodo de doble sulfatacion para producir GXS no fraccionado pero muy sulfatado: una realizacion preferida

Los metodos de produccion de esteres de sulfato conocidos (PPS) a partir de xilano implican sulfatacion seguida de hidrolisis acida. Durante la etapa de hidrolisis, se produce una perdida de azufre y nuevos grupos OH se abren disponibles para la sulfatacion. De esta manera, la hidrolisis acida produce una reduccion en el grado de sulfatacion del producto final. Los metodos conocidos no abordan este inconveniente. El metodo de doble sulfatacion de la realizacion preferida introduce una segunda etapa de sulfatacion despues de la hidrolisis acida para reponer el azufre perdido durante la hidrolisis. Esto se describe a continuacion.

2.1. Sulfatacion de xilano

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Con referencia a la etapa 1 en la figura 9, una mezcla de volumenes iguales de piridina anhidra y DMF anhidro se agita mecanicamente durante media hora aproximadamente a 0°C en un bano con hielo. Por ejemplo, se anade una mezcla de 650 ml de piridina anhidra y 650 ml de DMF anhidra en un matraz de 5 l de fondo redondo de dos cuellos provisto de un agitador mecanico, un termometro (0-100°C) y un embudo de decantacion de 250 ml al que se conecta un tubo de secado con gel de sflice. Esta mezcla se agita mecanicamente durante media hora a 0°C en un bano con hielo.

Con referencia a la etapa 2 en la figura 9, despues de aproximadamente 30 minutos, acido clorosulfonico, complejo piridina SO3 o una combinacion de los dos (en este ejemplo, 167 ml de acido clorosulfonico) se anade lentamente a la solucion (por ejemplo 1 ml/min) a 0°C gota a gota con agitacion constante durante un penodo de aproximadamente 2 horas. La mezcla se agita a 0°C, hasta que todos los humos blancos de HCl desaparecen. La solucion es de un color blanco lechoso.

El bano con hielo se cambia a un bano de agua, y la temperatura del bano de agua se eleva gradualmente a 60°C mediante un calentador/agitador de temperatura controlada. En este momento, se anade xilano en polvo (es decir, 100 g en este ejemplo) en porciones a la solucion de la mezcla (vease la etapa 3 en la figura 9) a traves del tubo lateral del matraz mediante el embudo de cuello largo para dar una suspension parduzca homogenea. La mezcla de reaccion se eleva a 75°C y se mantiene a esta temperatura durante aproximadamente 4 horas (vease la etapa 4 en la figura 9), tras lo cual se retira el bano de agua.

La mezcla de reaccion se enfna a temperatura ambiente (vease la etapa 5 en la figura 9) con agitacion continua, y a continuacion el xilano sulfatado se precipita por adicion a (en este ejemplo) 6.000 ml de metanol preenfriado (en un bano de hielo) con agitacion vigorosa (vease la etapa 6 en la figura 9). El precipitado es una sal de piridinio blanca, amorfa, soluble en agua, y el sobrenadante es un lfquido de color marron. El precipitado se recoge (vease la etapa 7 en la figura 9) en este ejemplo en un embudo Buchner con la bomba de agua, el residuo se lava con metanol (x 3 veces) para eliminar la adhesion de reactivo de sulfatacion que no ha reaccionado.

2.2. Conversion de la sal de piridinio en la sal de sodio, como un ejemplo de configuracion de la realizacion preferida

Con referencia a la etapa 8 en la figura 9, el residuo se disolvio en agua destilada (en este ejemplo, 1,5 l) con agitacion vigorosa, y se ajusta el pH entre 3,8 y 10 (vease la etapa 9 en la figura 9) con NaOH 6 N (aproximadamente 230-250 ml, en este ejemplo) con el fin de convertir el sulfato de piridinio-xilano en sulfato de de sodio-xilano.

Para asegurar que el pH de la solucion se mantiene en este valor, es necesario comprobar el pH justo antes de la evaporacion rotatoria (etapa 10 en la figura 9). Una vez que la solucion se hace girar y se evapora a sequedad (color rojo-marron) el residuo solido (esencialmente libre de piridina y DMF) se redisuelve en agua destilada (vease la etapa 11 en la figura 9) Y el pH de la solucion se ajusta a 7.

En configuraciones alternativas, la sal de piridinio se puede convertir en otras sales, uniendose a cualquier otro contraion adecuado, tal como un metal inorganico (p. ej., Na, K, Ca, Mg, Ag) o a una base organica, como se describe en "1.2 Conversion de la sal de piridinio en una sal de sodio, como ejemplo de configuracion de la realizacion preferida", anteriormente.

2.3. Hidrolisis del xilano sulfatado

Con referencia a la etapa 12 en la figura 9, la solucion en este ejemplo se lleva hasta 1670 ml (color marron oscuro), es decir, 50 X por 3 ml, (X = xilano original en gramos). Esta solucion se transfiere a un matraz redondo de 3 l en este ejemplo y equipado con un condensador de reflujo y manta de calentamiento y se lleva a ebullicion suave. Se anade H2SO4 5 M (25 ml en este ejemplo) a la solucion de ester sulfatado de xilano a traves del tubo condensador, con agitacion, dejado aproximadamente 35 minutos a 100°C (vease la etapa 13 en la figura 9). El tiempo es un parametro importante, ya que determina el peso molecular del producto final. Se necesitara determinar independientemente el tiempo para cada tamano de lote. A continuacion la solucion se enfna rapidamente vertiendola en un bano de hielo. El pH de la solucion enfriada es de 0,9-1,0. El pH se ajusta a un pH de 7 (vease la etapa 14 en la figura 9), en este ejemplo, tomando 50-55 ml de solucion de NaOH 6 N.

2.4. Dialisis y secado del producto de hidrolisis

A fin de mantener un caudal razonable de penetracion a una presion segura y constante [es decir, 1,0-1,2 atm (15-20 psi)], la concentracion de la solucion de hidrolisis debe mantenerse a menos de 3-4% y preferiblemente a 1,5-2%. Esto proporciona un aumento de la tasa de recogida de filtrado, mas que compensando el aumento del volumen de partida.

Con referencia a las etapas 15 y 16 en la figura 9, esta solucion necesita ser filtrada utilizando un prefiltro y una membrana de acetato de celulosa de 0,45 pm, para evitar el bloqueo de la membrana de dialisis. La solucion se sometio a ultrafiltracion utilizando, por ejemplo, un cartucho Prep/sale-TFF 6ft2 (Millipore) que tiene un PM umbral nominal de 1.000 Daltons, con agua destilada (preferiblemente agua purificada BP). La presion de operacion [es decir, 1,0-1,2 atm (15-20 psi)] se mantiene con una bomba Amicon LP-1A por ejemplo. Despues de 5-6 * volumen de agua destilada (en relacion con el volumen de la solucion de procesamiento) se ha recogido como permeado, la solucion retenida (incluidos

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los lavados del sistema con, en este ejemplo, 500 a 600 ml de agua) se seca por evaporacion rotatoria generalmente a 50°C a presion reducida (vease la etapa 17 en la figura 9). El producto final (en este ejemplo, 160-180 g) se muele y pone en el desecador con P2O5 al vado.

2.5. Resulfatacion de xilano sulfatado

Haciendo referencia a la etapa 18 en la figura 9, el segundo metodo de sulfatacion es similar al primero, con una ligera modificacion. Una mezcla de volumenes iguales de piridina y DMF se agita mecanicamente. En este ejemplo, 650 ml de piridina y 650 ml de DMF se anaden a un matraz de fondo redondo de dos bocas de 5.000 ml provisto de un agitador mecanico, un embudo de decantacion de 250 ml equipado con un tubo de gel de sflice, ajustado en un bano de hielo. Cuando la temperatura del disolvente mixto esta cerca de 0°C, 167 ml (en este ejemplo) de acido clorosulfonico se deja caer lentamente en la solucion durante aproximadamente 2 horas con agitacion continua y enfriamiento para mantener la temperatura cerca de 0°C.

Despues de la adicion de acido clorosulfonico (en este ejemplo), la mezcla de reaccion se agita mas (en este ejemplo, durante 30 minuto mas). El bano de hielo se cambia a agua, y la temperatura se eleva a 60°C durante 1,2 a 1,5 horas. Se anade xilano sulfatado (en este ejemplo, 170 a 240 g) al disolvente de la reaccion por el tubo lateral del matraz redondo. La temperatura se eleva aun mas a 75°C, y luego se mantiene a esta temperatura con agitacion durante aproximadamente 1 hora. Se apaga el calentador y se drena el agua caliente o se sifona del bano de agua. Se deja enfriar la mezcla de reaccion a temperatura ambiente con agitacion. La solucion enfriada se vierte en metanol (en este ejemplo, 6.000 ml) con agitacion vigorosa. El precipitado es un solido de color blanco.

2.6. Conversion a la sal de sodio (como ejemplo de conUguracion) y eliminacion de piridina y DMF

Haciendo referencia a la etapa 19 en la figura 9, el precipitado se disuelve de nuevo en agua destilada (en este ejemplo, 1 l), siendo el pH 4,1 a 4,2. El pH de la solucion se ajusta a 10. En este ejemplo, se toman aproximadamente 120 a 140 ml de solucion de NaOH 6 N. Esta solucion se evaporo con rotacion a sequedad a 50°C (de color gris-blanco). El residuo se disuelve en agua destilada (en este ejemplo, 300 ml de agua destilada) y se vierte en metanol (en este ejemplo, 2.500 a 3.000 ml) con agitacion vigorosa (vease la etapa 20 en la figura 9). En esta etapa, debido a la presencia de una sal inorganica en gran cantidad, el precipitado puede formar facilmente grumos. El precipitado se recoge por filtracion bajo succion de la bomba de agua.

Como se describe en "1.2 Conversion de la sal de piridinio en una sal de sodio, como ejemplo de conUguracion de la realizacion preferida", configuraciones alternativas incluyen la sal preparada con cualquier otro contraion adecuado, tal como un metal inorganico (p. ej., Na, K, Ca, Mg , Ag) o una base organica.

2.7. Decoloracion de xilano resulfatado utilizando un cartucho de carbon

El precipitado anterior se disuelve de nuevo en agua destilada (en este ejemplo, en 2 l de agua destilada). La solucion es de color marron oscuro. El color puede eliminarse por circulacion repetida de la solucion a traves de un cartucho de carbono (p. ej., un filtro de agua APII de Aqua-Pure) a temperatura ambiente durante 2 horas (vease la etapa 21 en la figura 9). La solucion final se vuelve de color amarillo claro y se evapora con rotacion a sequedad.

Pueden experimentarse perdidas considerables (hasta del 30%) de sulfato de xilano "bueno" si se utiliza un cartucho de carbon con baja selectividad. Es preferible utilizar una buena calidad de carbon activado en polvo, en un proceso por lotes. La cantidad de carbono en relacion con el sulfato de xilano es de aproximadamente 20% peso/peso.

Alternativamente, la decoloracion puede tener lugar durante el fraccionamiento, como se describe a continuacion.

2.8. Dialisis y secado

Haciendo referencia a la etapa 22 en la figura 9, la solucion decolorada se filtro a traves de una membrana de acetato de celulosa de 0,45 pm con un prefiltro. El filtrado se desala a continuacion como se describio anteriormente (p. ej., utilizando un sistema de ultrafiltracion Millipore provisto de un cartucho Prep/Scale™-TFF (umbral de PM 1.000) utilizando agua purificada BP. La presion de operacion [0,68-1,36 atm (10-20 psi)] se mantiene con una bomba peristaltica Amicon LP-1A). Despues de recoger 10 * volumenes de la solucion de permeado, la solucion del proceso se concentra en el sistema de ultrafiltracion tanto como sea posible (por ejemplo, 3-4%). A continuacion se seca la solucion final, por ejemplo, por evaporacion rotatoria (vease la etapa 23 en la figura 9).

3. Fraccionamiento selectivo para producir un GXS muy sulfatado, de bajo PM y espectro restringido

Para la realizacion de GXS fraccionado, despues de la finalizacion del metodo de doble sulfatacion descrito anteriormente, los cristales resultantes se fraccionan con un disolvente organico tal como etanol utilizando el procedimiento descrito a continuacion. El solicitante se refiere a este procedimiento de fraccionamiento como "fraccionamiento selectivo", ya que utiliza la carga de la molecula GXS muy sulfatada para "enfocar" el proceso de fraccionamiento de modo que la precipitacion se produce utilizando la carga de la molecula, ademas del peso molecular.

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Utilizando el metodo de fraccionamiento selectivo (descrito a continuacion), es posible producir el compuesto GXS con un peso molecular siempre bajo y dentro de un espectro restringido de intervalos de peso, de 1.000 a 4.000.

El metodo de fraccionamiento selectivo es el siguiente:

(a) A rafz de la etapa 23 en la figura 9, los cristales se disuelven en H2O para preparar una solucion al 10%. En este ejemplo se disuelven 100 g de solidos en 1.000 ml de solucion total. Esta solucion tiene un pH de alrededor de 5,0, sin ajustar.

(b) El pH de la solucion se ajusta a alrededor de 9,0 mediante la adicion de NaOH. El ajuste del pH afecta a la carga de la molecula GXS y por lo tanto a su solubilidad en mezclas de agua/disolvente organico.

(c) Despues de ajustar el pH a alrededor de 9, el disolvente organico (en este ejemplo, etanol) se anade gota a gota (mientras se agita) para preparar una concentracion total de 40% en volumen. Se anade etanol porque las fracciones de alto peso molecular son los menos solubles y la adicion de un disolvente organico tal como etanol afectara a su solubilidad.

(d) Las fracciones de alto peso molecular seran las primeras en precipitar en la solucion. La primera fraccion se elimina y luego se centrifuga la solucion completa.

(e) Se anade disolvente organico (en este ejemplo, etanol) al sobrenadante (que todavfa incluye el GXS de menor PM) de la misma manera se prepara una concentracion total de 45% en volumen.

(f) Se retira el precipitante (segunda fraccion) y la solucion se centrifuga de nuevo como se describe en la etapa (d) anterior.

(g) Se repiten las etapas (d) a (f), aumentando la concentracion de etanol en un 5% en cada ciclo, hasta una concentracion de 70% en el ciclo final.

(h) Para cada fraccion, el precipitado se aclara aun mas utilizando mas etanol para eliminar el agua tanto como sea posible de los cristales.

La figura 10 es una tabla que presenta datos de las muestras obtenidos de la cromatograffa de exclusion por tamano (SEC) de GXS producido utilizando el metodo de doble sulfatacion descrito anteriormente. La segunda columna de la izquierda es de datos ilustrativos obtenidos a partir de un lote de GXS no fraccionado; las columnas restantes son para GXS fraccionado, utilizando el metodo de fraccionamiento selectivo descrito anteriormente.

Las figuras 11-18 muestran cromatogramas de los datos de la figura 10- a saber, las SEC ilustrativas de GSX no fraccionado y fraccionado. Cada cromatograma (figuras 11-18) muestra el mdice de refraccion (IR) frente al tiempo de retencion (TR). La fase movil utilizada fue agua pura con azida de sodio al 0,05%, con un caudal de 0,5 ml por minuto. Se utilizaron en el experimento SEC dos Phenomenex Biosep S2000 conectados en serie a una temperatura de 30°C. El instrumento era un Agilent 1100 con un detector de IR, calibrado con patrones de sulfonato de poliestireno. La concentracion de la muestra de GXS fue de 5 mg/ml.

Haciendo referencia a la segunda columna de la tabla en la figura 10 y a la figura 11, el GXS no fraccionado tema una sulfatacion media de 18% con un PM relativo maximo de 3.294, siendo el modo PM 2.759.

La primera fraccion (obtenida utilizando fraccionamiento en etanol con etanol en una concentracion de 40%), dio un rendimiento con una sulfatacion promedio de 18,1%. Se puede observar a partir del perfil % en peso en la tabla en la figura 10 que la primera fraccion elimina las moleculas de PM mas alto (22% de esta fraccion tiene un PM relativo mayor que 10.000). El perfil de % en peso de esta fraccion esta ilustrado en el cromatograma en la figura 12.

La segunda fraccion (en 45% de etanol), dio un rendimiento con una sulfatacion media de 18,2%, siendo el modo PM 2.000-3.000 (vease la figura 13 y en la tabla en la figura 10). La tercera fraccion (en 50% de etanol), dio un rendimiento con una sulfatacion media de 18,5%, siendo tambien el modo PM 2.000-3.000 (vease la figura 14 y la tabla en la figura 10). La cuarta fraccion (en 55% de etanol), dio un rendimiento con una sulfatacion media de 18,4%, siendo el modo PM tambien 2.000-3.000 (vease la figura 15 y la tabla en la figura 10). La quinta fraccion (en 60% de etanol), dio un rendimiento con una sulfatacion media de 17,8%, siendo el modo PM 1.500-2.000 (vease la figura 16 y la tabla en la figura 10). La sexta fraccion (en 65% de etanol), dio un rendimiento con una sulfatacion media de 16,9%, siendo el modo PM tambien 1.500-2.000 (vease la figura 17 y la tabla en la figura 10). La septima fraccion (en 70% de etanol), dio un rendimiento con una sulfatacion media de 17,1%, siendo el modo PM tambien inferior a 1.500 (vease la figura 18 y la tabla en la figura 10).

Estos datos indican que el segundo al cuarto ciclo de fraccionamiento dieron el mayor rendimiento de bajo PM, moleculas de GXS completamente sulfatadas. Sin embargo, el rendimiento puede verse afectado por el Pm de GXS no fraccionado de partida. Por lo tanto, el control estricto del peso molecular de GXS y la optimizacion de los parametros de

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fabricacion son cruciales para obtener un alto rendimiento, el nivel deseable de sulfatacion y el intervalo de peso molecular.

La realizacion preferida es una mezcla de moleculas de GXS que contiene al menos 10% de moleculas completamente sulfatadas, presentando las siguientes caractensticas de RMN (y como se muestra en los espectros ilustrativos de RMN obtenidos a partir del segundo al cuarto ciclo de fraccionamiento de GXS visto en las figuras 19 a 21):

(a) un unico pico OCH3 de acido glucuronico alrededor de 3,3 a 3,5 ppm;

(b) un pico de acido glucuronico totalmente sulfatado alrededor de 5,2 a 5,4 ppm;

(c) al menos un pico que se correlaciona con una unidad de xilosa del terminal derecho completamente sulfatada, visto en alrededor de 5,5 a 6,0 ppm; y

(d) la aparicion de un unico pico marcado a alrededor de cada uno de los siguientes 5,1 ppm, 4,7 ppm, 4,4 ppm y 3,8 ppm, que se correlaciona con las unidades de xilosa completamente sulfatadas.

4. Purificacion

El metodo de produccion incluye una o mas etapas de ultrafiltracion para eliminar las impurezas que pueden afectar a la calidad del producto final. La cromatograffa lfquida de alta resolucion del compuesto de la invencion, GXS, en comparacion con las moleculas PPS de la tecnica anterior demuestra una ausencia de picos en la cola del cromatograma, lo que indica la eliminacion de impurezas de bajo peso molecular, tales como productos de degradacion. Esto se logra ya sea mediante ultrafiltracion o mediante fraccionamiento con disolventes organicos, como se describio anteriormente.

5. La eliminacion de color por fraccionamiento

La coloracion oscura del producto final indica un cambio de la estructura qmmica. Por lo tanto, la eliminacion del color es importante como una forma para la eliminacion de productos de degradacion descoloridos.

La eliminacion del color se puede conseguir por perfusion con peroxido de hidrogeno o de cloro, como se describe en la etapa 1.3 anterior, o con carbon vegetal como se describe en la etapa 2.7. Estos metodos de eliminacion de color han demostrado ser la etapa mas diffcil en la produccion.

Una realizacion preferida del metodo de produccion utiliza fraccionamiento selectivo con disolvente organico como un medio para la eliminacion de color, porque las fracciones de peso molecular mas bajo son de aspecto mas oscuro. Esto tiene las ventajas de que no intervienen aditivos y de minimizar las etapas y costes en la produccion.

Metodo de uso de GXS: una realizacion preferida

El GXS muy sulfatado, de bajo peso molecular de la presente invencion se administra por via parenteral en una realizacion preferida (como por ejemplo por via intramuscular, subcutanea o intravenosa). La administracion puede ser mediante una jeringa hipodermica tradicional o mediante un dispositivo de administracion tipo pluma que permite marcar en un dial la dosis o la precarga con un cartucho de dosis unica de solucion acuosa de GXS.

Alternativamente, el GXS puede ser una formulacion de liberacion mantenida o controlada administrada por inyeccion de liberacion lenta. Esta puede tener un uso practico en animales no tratados actualmente para determinadas condiciones (tales como inflamacion de las articulaciones y otros trastornos).

Una realizacion alternativa se puede administrar por via oral, dependiendo del cuadro clmico que se esta tratando. Esto puede tener aplicacion mas practica para formulaciones que contienen GXS fraccionado en lugar de GXS no fraccionado, ya que la investigacion sugiere que la biodisponibilidad del compuesto fraccionado es mejor que para el compuesto no fraccionado.

La investigacion sugiere que GXS ejerce una funcion en el tratamiento de una amplia gama de cuadros clmicos en animales, incluidos los seres humanos, animales productores de alimentos y animales de comparua (tales como felinos, caninos y equinos). La gama de enfermedades en las que GXS puede ejercer una funcion en el tratamiento incluyen:

(a) enfermedades inflamatorias no infecciosas tales como la osteoartritis;

(b) isquemia;

(c) cancer;

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(d) el control y el tratamiento de enfermedades causadas por virus, incluidos el virus de la inmunodeficiencia (tales como el VIH/SIDA o el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF)) y de la gripe equina);

(e) cistitis intersticial;

(f) enfermedad de Crohn;

(g) colitis ulcerosa;

(h) smdrome de Reiter;

(i) enfermedades por priones, tales como la encefalopatia espongiforme transmisible (EET), la encefalopatfa espongiforme bovina (EEB) y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ) y su variante yatrogena en seres humanos;

(j) hematomas;

(k) hemorroides, congelacion, quemaduras; y

(l) enfermedades multiparametricas tales como la trombosis y la aterosclerosis.

Dosis que van desde 1 mg/kg a 10 mg/kg se han publicado en la bibliograffa para el uso de PPS de la tecnica anterior en diversas enfermedades. Los experimentos indican que dosis en el intervalo de alrededor de 1 mg/kg a 20 mg/kg para GXS sena de utilidad clmica en diversas enfermedades.

Por ejemplo, GXS es uno de una nueva generacion de farmacos conocidos como farmacos para osteoartritis modificadores de la enfermedad (DMOAD). GXS estimula la smtesis de proteoglucanos en las celulas del cartftago artrftico, y reduce la perdida de proteoglucanos en el cartftago mediante las enzimas inhibidoras que degradan el cartftago, modificando de este modo el proceso de la enfermedad. En una configuracion de una realizacion preferida, GXS es un medio para tratar la enfermedad degenerativa de las articulaciones tal como la osteoartritis y es clmicamente eficaz en la reparacion de dano en las articulaciones.

En otra configuracion de la realizacion preferida, GXS es un medio para la profilaxis en la enfermedad degenerativa de las articulaciones tal como la osteoartritis y es clmicamente eficaz en la prevencion de dano en las articulaciones.

Un metodo ilustrativo de uso incluye un regimen de administracion de alrededor de 1 a 10 mg/kg administrados por inyeccion intramuscular o subcutanea, una vez a la semana durante al menos cuatro semanas.

Las aplicaciones clmicas de la realizacion preferida se basan en experimentos que utilizan los regfmenes de administracion de alrededor de 3 mg/kg/semana durante un maximo de 12 semanas en adultos y caballos pura sangre de un ano. Los experimentos se han realizado utilizando GXS no fraccionado con 18% o mas de sulfatacion. Los estudios demuestran estadfsticamente una mejora significativa en el tratamiento y prevencion de la enfermedad degenerativa de las articulaciones, tal como la osteoartritis. Esto se midio evaluando las puntuaciones del cuadro clmico y los niveles de biomarcadores sericos tales como el epftopo CS846. Este epftopo es un indicador de la smtesis del proteoglucano agrecano, que se produce durante la reparacion del cartftago. En caballos adultos que recibieron GXS intramuscular, un aumento en los niveles de CS846 (p = 0,01) se vio mas de 12 semanas, lo que indica un aumento de la reparacion en la articulacion.

Los del ano presentan niveles naturalmente altos de CS846 debido al rapido crecimiento y la remodelacion constante de las articulaciones en este grupo de edad. Los del ano que recibieron gXs por via intramuscular (dosis semanales de 3 mg/kg IM como maximo hasta 12 semanas) presentaron una disminucion significativa en los niveles de CS846 (p = 0,05) durante 12 semanas, lo que indica un efecto protector contra el dano en las articulaciones de la enfermedad de la fase 1 (inicio de osteoartritis, sin signos clmicos visibles).

La investigacion de la tecnica anterior en caballos utilizando PPS conocidos a una dosis de 3 mg/kg y midiendo la efectividad clmica en la osteoartritis (tambien midiendo los niveles de epftopo CS846) no pudo demostrar un efecto estadfsticamente significativo. Esto confirma la conclusion del solicitante de que GXS (fraccionado o no fraccionado) es una entidad qmmica diferente al PPS de la tecnica anterior extrafdo en xilano.

Una realizacion preferida de una formulacion de GXS

En una realizacion preferida, el ingrediente activo GXS se formula en solucion acuosa para inyeccion parenteral (incluida intramuscular, subcutanea o intravenosa).

En una configuracion, la formulacion inyectable incluye un antioxidante adecuado para permitir que la formulacion acuosa permanezca sustancialmente estable (es decir para resistir la decoloracion y degradacion) sin refrigeracion. La patente WO 2007/123800 reivindica una formulacion con PPS con "un antioxidante en el grupo metabisulfito, bisulfato

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de sodio y ascorbato en una concentracion de aproximadamente 0,02% p/v hasta alrededor de 5,0% p/v" es estable sin refrigeracion. Sin embargo, los experimented realizados por el solicitante ponen de manifesto que muchos antioxidantes no son eficaces en GXS en una solucion acuosa. Por ejemplo, el ascorbato no actua como antioxidante, ya que en su presencia el GXS todavfa se disocia y se decolora. Esta observacion apoya la conclusion de que GXS es una entidad distinta al PPS de la tecnica anterior extrafdos en xilano.

Los experimented realizados por el solicitante han descubierto que solamente los antioxidantes que contienen azufre son adecuados para prevenir la degradacion y decoloracion de una formulacion con GXS inyectable a temperature ambiente durante al menos siete meses. La tabla 2 a continuacion enumera ejemplos de antioxidantes que contienen azufre que se encuentra que son adecuados para este uso.

Tabla 2. Ejemplos de antioxidantes a base de azufre que se ha encontrado que son adecuados

Denominacion

N° en CAS Ejemplo de concentracion eficaz *

Metabisulfito de sodio

7681-57-4 0,5% por peso/volumen

Bisulfito sodico ACS

Mezcla de 7681-57-4 y 7631-90-5 0,5% por peso/volumen

Reactivo

Hidroximetano-Sulfonato de sodio

149-44-0 1% por peso/volumen

Formaldelddo-Bisulfato de sodio

870-72-4 1% por peso/volumen

* Para conseguir una estabilidad sustancial de formulacion inyectable de GXS

La realizacion preferida puede envasarse en forma de una formulacion inyectable para administracion con una jeringuilla hipodermica tradicional o administracion mediante un dispositivo de suministro de administracion tipo pluma que permite marcar en un dial la dosis o la precarga con un cartucho de una sola dosis de la solucion acuosa de GXS.

En una realizacion adicional, el GXS es una formulacion de liberacion mantenida o controlada administrada por inyeccion de liberacion lenta. Esta formulacion puede adaptarse a su uso en animales no actualmente bajo supervision veterinaria regular - tal como ganado lechero, es decir, disminucion de la movilidad derivada de dolor en las articulaciones puede afectar a la salud en general, incluidas la produccion de leche y la reproduccion. Ya que el ganado vacuno no se requiere generalmente que se mueva rapidamente, el dolor de las articulaciones y la inflamacion en dichos animales pueden resultar desatendido. Esto esta en contraste con los animales tales como los caballos de pura sangre o perros que necesitan maxima movilidad y estan bajo asistencia muy regular de veterinarios. Una formulacion de liberacion lenta permitina a los animales que pueden estar sin tratar (p. ej., en enfermedades inflamatorias de las articulaciones) a tratarse con GXS sin que sea necesario asistencia regular (por ejemplo, semanal) de un veterinario, lo que puede tener importantes implicaciones tanto para la produccion como para el bienestar de los animales.

Una realizacion adicional es una formulacion de dosis unitaria solida de GXS para administracion oral; sin embargo, como biodisponibilidad de GXS no fraccionado es escasa cuando se toma por via oral, la dosis requerida para el efecto terapeutico puede hacer inadecuada la administracion oral de GXS no fraccionado para algunas indicaciones clmicas. La investigacion sugiere que la biodisponibilidad de GXS fraccionado sena mejor que la biodisponibilidad de GXS no fraccionado cuando se toma por via oral. Por lo tanto, una formulacion oral de GXS fraccionado puede tener uso clmico mas amplio que las formulaciones orales de GXS no fraccionado o de esteres de sulfato no fraccionadas de la tecnica anterior, tal como PPS (que estan indicados actualmente para la cistitis intersticial en los seres humanos).

Ejemplos de configuraciones de la realizacion preferida (GXS en solucion acuosa para administracion parenteral) pueden comprender GXS en una concentracion de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 500 mg/ml.

A modo de ejemplo, para una solucion de 100 mg/ml con un tamano de envase 10 ml, la formulacion puede incluir:

(a) alrededor de 100 mg de GXS;

(b) alrededor de 10 mg de alcohol bendlico como conservante

(c) alrededor de 0,8 mg de acido dtrico anhidro como tampon;

(d) alrededor de 15 mg de citrato trisodico deshidratado como tampon;

(e) a 1,0 ml de agua para inyectables como vehteulo.

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Un segundo ejemplo de configuracion de la realizacion preferida es una solucion de 250 mg/ml con un tamano de envase de 6 ml. La formulacion puede incluir:

(a) alrededor de 250 mg de GXS;

(b) alrededor de 10 mg de alcohol bendlico como conservante

(c) alrededor de 2 mg de acido dtrico anhidro como tampon;

(d) alrededor de 38 mg de citrato trisodico deshidratado como tampon;

(e) a 1,0 ml de agua para inyectables como el veidculo.

Para las formulaciones a temperatura ambiente de las configuraciones ilustrativas anteriores, se anade un antioxidante adecuado en una concentracion eficaz, cuyos ejemplos se proporcionan en la Tabla 2. Opcionalmente, el espacio de cabeza en las formulaciones a temperatura ambiente tambien puede r reemplazarse con nitrogeno.

Una realizacion alternativa: GXS como antioxidante nuevo o mejorado

Los experimentos realizados por el solicitante demuestran que GXS se oxida mas facilmente que algunos antioxidantes comunes (BHA, BHT, acido lipoico, acido glutamico, acido gendsico, metilsulfonilmetano, acido malico, acido nicotmico, ascorbatos). Esta observacion indica que GXS tiene excelentes propiedades antioxidantes por sf mismo. La bibliograda ciendfica indica que el OSO3 en la posicion 1 (tal como en la unidad de xilosa del terminal derecho en GXS) es generalmente muy labil, por lo tanto GXS se oxidaria con preferencia al acido ascorbico (o a los emas antioxidantes mencionados anteriormente).

Esta conclusion esta apoyada por la observacion (expuesta anteriormente) que solamente los antioxidantes que contienen azufre son adecuados para prevenir la degradacion de GXS, por que el azufre en el antioxidante se oxida preferentemente a OSO3 del terminal derecho u otras unidades de carbohidrato en GXS.

En una realizacion preferida, GXS es adecuado para su uso como antioxidante, como por ejemplo en preparaciones para uso clmico.

Aunque la invencion se ha descrito con referencia a ejemplos espedficos, los expertos en la tecnica apreciaran que la invencion puede realizarse de muchas otras formas diferentes.

Claims (8)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para la produccion de moleculas de glucano sulfatado, en donde dichas moleculas comprenden:

   (A) Una o mas unidades de beta-D-xilosa lineales conjugadas en 1-4; y

   (B) al menos una unidad de acido 4-O-metil-p-D-glucuronico unido a un carbono 2 de cada ocho a diez unidades de glucosa (por termino medio),

   metodo que comprende:

   (a) llevar a cabo la sulfatacion de xilano, mediante reaccion con:

   (i) complejo de acido clorosulfonico y piridina en DMF;

   (ii) complejo piridina SO3 en DMF; o

   (iii) una mezcla de (i) y (ii) anterior, para producir sulfato de piridinio xilano;

   (b) sustituir piridinio, con un contraion para formar una sal de sulfato de xilano sin piridinio; seguido de eliminacion de piridina y DMF;

   (c) llevar a cabo la hidrolisis acida de la sal de sulfato de xilano sin piridinio para ajustar su peso molecular relativo final;

   (d) llevar a cabo la ultrafiltracion de la sal de sulfato de xilano sin piridinio para eliminar impurezas organicas y productos de degradacion ; y

   (e) llevar a cabo al menos un ciclo de resulfatacion/hidrolisis de la sal de sulfato de xilano sin piridinio, seguido de la conversion a un sales de sodio y eliminacion de dicha piridina y DMF para formar un precipitado no fraccionado.
2. 2. El metodo de la la reivindicacion 1, en donde el contraion es un metal inorganico o una base organica.
3. 3. Un metodo para la produccion de una mezcla que comprende moleculas de glucano sulfatado en donde dichas moleculas comprenden:

   (A) una o mas unidades lineales de p-D-xilosa conjugadas en 1-4; y

   (B) al menos una unidad de acido 4-O-metil-p-D-glucuronico unida al carbono 2 de cada ocho a diez unidades de xilosa (por termino medio),

   metodo que comprende:

   (a) hidrolisis, en donde la hidrolisis se lleva a cabo al menos una vez durante el metodo y en donde la hidrolisis se lleva a cabo en:

   (i) xilano;

   (ii) sulfato de xilano; o

   (iii) uno de los dos anteriores en una etapa de hidrolisis por separado; y

   (b) sulfatacion, en donde la sulfatacion se lleva a cabo al menos dos ceces durante el procedimiento y en donde la sulfatacion se lleva a cabo en:

   (i) xilano;

   (ii) sulfato de xilano; o

   (iii) uno de los dos anteriores en una etapa de sulfatacion por separado.
4. 4. Una mezcla obtenida por el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las moleculas de glucano sulfatado tienen un peso molecular comprendido en el intervalo entre 1.000 y 6.000.
5. 5. La mezcla segun la reivindicacion 4, en donde las moleculas de glucano sulfatado tienen un peso molecular comprendido en el intervalo entre 1.000 y 4.000.
6. 6. Una formulacion terapeutica para administracion parenteral que comprende moleculas de glucano sulfatado en solucion acuosa preparadas segun el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
7. 7. La formulacion terapeutica de la reivindicacion 6, que es una formulacion de liberacion controlada.
8. 8. La formulacion terapeutica de la reivindicacion 6 o 7 para su utilizacion en el tratamiento de osteoartritis.

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