ES2563482T3 - Mejoras en nitrilasa microbiana inmovilizada para la producción de ácido glicólico - Google Patents

Mejoras en nitrilasa microbiana inmovilizada para la producción de ácido glicólico Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para producir un catalizador enzimático pretratado con glutaraldehído inmovilizado y reticulado, comprendiendo dicho procedimiento: (a) producir por fermentación un catalizador enzimático que tiene actividad de nitrilasa; (b) pretratar dicho catalizador enzimático con glutaraldehído; (c) inactivar opcionalmente el glutaraldehído sin reaccionar con bisulfito después del pretratamiento con glutaraldehído; (d) recuperar el catalizador enzimático de (b) o (c) e inmovilizar dicho catalizador enzimático en carragenina; (e) reticular el catalizador enzimático inmovilizado en carragenina resultante de (d) con glutaraldehído y polietilenimina; y (f) producir un catalizador enzimático pretratado con glutaraldehído, inmovilizado y reticulado, en donde dicho catalizador enzimático pretratado con glutaraldehído inmovilizado y reticulado tiene una mejor retención de la actividad específica inicial durante la conversión de glicolonitrilo en ácido glicólico en comparación con catalizadores enzimáticos no pretratados con glutaraldehído, inmovilizados y reticulados en las mismas condiciones de reacción; en donde dicho catalizador enzimático comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55 y 57.

Description

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La SEQ ID NO: 48 es la secuencia de nucleótidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codón que dió como resultado una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 168 (F168T; Phe → Thr).
La SEQ ID NO: 49 es la secuencia de aminoácidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 48) que comprende una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 168 (Phe168 → Thr) de la nitrilasa de
A. facilis 72W.
La SEQ ID NO: 50 es la secuencia de nucleótidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codón que dió como resultado una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 168 (F168V; Phe → Val).
La SEQ ID NO: 51 es la secuencia de aminoácidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 50) que comprende una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 168 (Phe168 → Val) de la nitrilasa de
A. facilis 72W.
La SEQ ID NO: 52 es la secuencia de nucleótidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codón que dió como resultado una única sustitución de aminoácidos en el residuo de la posición 168 (T210A; Thr → Ala).
La SEQ ID NO: 53 es la secuencia de aminoácidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 52) que comprende una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 210 (Thr210 → Ala) de la nitrilasa de
A. facilis 72W.
La SEQ ID NO: 54 es la secuencia de nucleótidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codón que dió como resultado una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 168 (T210C; Thr → Cys).
La SEQ ID NO: 55 es la secuencia de aminoácidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 54) que comprende una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 210 (Thr210 → Cys) de la nitrilasa de
A. facilis 72W.
La SEQ ID NO: 56 es la secuencia de nucleótidos de la nitrilasa de A. facilis 72W expresada en la cepa i SS1001 de E. coli (ATCC PTA-1177).
La SEQ ID NO: 57 es la secuencia de aminoácidos deducida de la nitrilasa mutante de A. facilis 72W expresada en la cepa SS1001 de E. coli (ATCC PTA-1177).
Depósitos biológicos
Los siguientes depósitos biológicos se han hecho en los términos del Tratado de Budapest sobre Reconocimiento internacional del Depósito de microorganismos para los fines del procedimiento en materia de patentes:
Referencia para identificación del Designación internacional del Fecha del depósito depositante depósito
Acidovorax facilis 72W ATCC 55746 8 de marzo 1996
E. coli SS1001 ATCC PTA-1177 11 de enero 2000
Como se usa en a presente memoria, "ATCC" se refiere al Organismo internacional para el depósito de microorganismos American Type Culture Collection domiciliado en ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, EE.UU. La "Designación del depósito Internacional" es el número de acceso al cultivo depositado en ATCC.
Los depósitos mencionados se mantendrán en el depósito internacional indicado durante al menos treinta (30) años y se pondrán a disposición del público tras la concesión de una patente que los describe. La disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar la presente invención en derogación de los derechos de patente concedidos por la acción gubernamental.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona un procedimiento para preparar un catalizador enzimático inmovilizado y reticulado que tiene actividad de nitrilasa para la hidrólisis de glicolonitrilo a ácido glicólico con retención mejorada de la actividad de catalizador inicial durante la conversión de glicolonitrilo en ácido glicólico, comprendiendo dicho procedimiento pretratar el catalizador enzimático con glutaraldehído antes de la inmovilización. catalizador enzimático pretratado con glutaraldehído inmovilizado tiene mejor retención de la actividad específica inicial, como se ha indicado anteriormente, en comparación con la retención de la actividad específica inicial de catalizadores enzimáticos no pretratados con glutaraldehído, inmovilizados y reticulados, durante la conversión de glicolonitrilo en
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Fuente de nitrilasa
Número de acceso en GenBank® Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: Secuencia del resto distintivo (posiciones de los residuos de aminoácidos)
Nocardia sp. C-14-1
AAX18182.1 8 GGLNCWEHFQPL (154-165)
Bordetella bronchiseptica RB50
NP_887662.1 9 GAVVCWENYMPL (161-172)
Arabidopsis thaliana
AAB60275.1 AAA19627.1 10 GAAICWENRMPL (175-186)
Synechococcus elongatus PCC 7942
YP_399857.1 11 GALACWEHYNPL (157-168)
Synechococcus elongatus PCC 6301
YP_171411.1 12 GALACWEHYNPL (157-168)
Synechocystis sp. PCC 6803
NP_442646.1 13 GALACWEHYNPL (165-176)
Pseudomonas entomophila L48
YP_6090481.1 14 GAAVCWENYMPL (161-172)
Zymomonas moblis
YP_162942.1 15 GAAICWENYMPV (161-172)
Bacillus sp. OxB-1
BAA90460.1 16 GGLQCWEHFLPL (158-169)
Comamonas testosteroni
AAA82085.1 17 GGLQCWEHALPL (159-170)
Synechococcus sp. CC9605
YP_381420.1 18 GALACWEHYNPL (156-167)
Pseudomonas fluorescens Pf-5
YP_260015.1 19 GAVICWENMMPL (161-172)
Nocardia farcinica IFM 10152
YP_119480.1 20 GALCCWEHLQPL (159-170)
Alcaligenes faecalis 1650
AAY06506.1 21 GALCCWEHLSPL (159-170)
Pseudomonas syringae pv. syringae B728a
AAY35081.1 22 GALCCWEHLQPL (157-168)
Bradyrhizobium sp. BTAil
ZP_00859948.1 23 GALCCWEHLQPL (163-174)
Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216
CAC88237 24 GALNCWEHFQTL (161-172)
Rhodococcus rhodochrous ATCC 39484™
N/A 25 GALNCWEHFQTL (161-172)
También se describe en la presente memoria el catalizador nitrilasa que comprende un polipéptido que tiene actividad de nitrilasa, aislado de un género seleccionado del grupo que consiste en Acidovorax, Rhodococcus, Nocardia, Bacillus y Alcaligenes. En otro ejamplo, el catalizador nitrilasa comprende un polipéptido que tiene actividad de nitrilasa aislado de un género seleccionado del grupo que consiste en Acidovorax y Rhodococcus.
5 En otra realización, el polipéptido que tiene actividad de nitrilasa procede de Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746)
o un polipéptido (que tiene actividad de nitrilasa) que es sustancialmente similar a la nitrilasa de Acidovorax facilis 72W (SEQ ID NO: 4) o la enzima derivada de A. facilis 72W representada por la SEQ ID NO: 51.
En una realización, el catalizador nitrilasa es una célula microbiana hospedante transformada para expresar al menos un polipéptido que tiene actividad de nitrilasa. En una realización, la célula hospedante transformada se 10 selecciona del grupo que consiste en: Comamonas sp., Corynebacterium sp., Brevibacterium sp., Rhodococcus sp., Azotobacter sp., Citrobacter sp., Enterobacter sp., Clostridium sp., Klebsiella sp., Salmonella sp., Lactobacillus sp., Aspergillus sp., Saccharomyces sp., Yarrowia sp., Zygosaccharomyces sp., Pichia sp., Kluyveromyces sp., Candida sp., Hansenula sp., Dunaliella sp., Debaryomyces sp., Mucor sp., Torulopsis sp., Methylobacteria sp., Bacillus sp., Escherichia sp., Pseudomonas sp., Rhizobium sp., y Streptomyces sp. En una realización preferida, la célula
15 microbiana hospedante se selecciona del grupo que consiste en Bacillus sp., Pseudomonas sp. y Escherichia sp. En una realización preferida, el catalizador es una célula hospedante de Escherichia coli que expresa recombinantemente uno o más de los polipéptidos que tienen actividad de nitrilasa.
También se describe en la presente memoria el catalizador nitrilasa que comprende un polipéptido que tiene actividad de nitrilasa, en donde dicho polipéptido que tiene actividad de nitrilasa tiene al menos 60% de identidad
20 con la SEQ ID NO: 51, preferiblemente al menos 70% de identidad con la SEQ ID NO: 51, incluso más preferiblemente al menos 80% de identidad con la SEQ ID NO: 51, e incluso más preferiblemente al menos 90% de identidad con la SEQ ID NO: 51, y lo más preferiblemente al menos 95% de identidad con la SEQ ID NO: 51.
En la presente memoria se describen ejemplos de trabajo de diversos catalizadores que tienen actividad de nitrilasa derivados de diversas fuentes, incluyendo un catalizador derivado de nitrilasa de A. facilis 72W. Se han descrito en 25 la técnica diversos mutantes derivados de la enzima nitrilasa de Acidovorax facilis 72W (Patentes de EE.UU.
7.148.051 y. 7.198.927).
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operación por lotes alimentados con glucosa al 50% p/p a un caudal predeterminado (Tabla 6), a aproximadamente 25 DO550 la alimentación se cambió a una solución de D-lactosa al 25% con un caudal predeterminado (Tabla 7).
La temperatura se controló a 35,0ºC, la presión en cabeza a 0,5 bares, el pH en la primera etapa (fase de glucosa) a 6,8 y en la segunda etapa (fase de lactosa) a 7,2, se utilizaron NH4OH (29% p/p) y H2SO4 (20% p/v) para el control 5 del pH, el Od se controló en la primera etapa al 25% de saturación en aire y en la segunda etapa al 10%, el Od se controló en primer lugar por agitación (250-450 rpm) y más tarde por aireación (25-35 litros estándares por minuto). Los niveles de glucosa y lactosa se monitorizaron durante la operación de alimentación y si los niveles de glucosa superaban 0,1 g/L o la lactosa estaba por encima de 1 g/L, se detendría o se reduciría temporalmente el programa de alimentación. La operación se terminó 40 horas después de la iniciación de la alimentación de lactosa, y las
10 células se recogieron por centrifugación o microfiltración o se mantuvieron en el recipiente para el tratamiento con glutaraldehído. La fermentación produjo aproximadamente 8 kg en peso de células secas con una actividad específica de nitrilasa de 2819 U de BZN/g pcs (1788 U de GLN /g pcs).
Tabla 7: Protocolo de alimentación
Intervalos de tiempo de alimentación, (h)
Caudal de alimentación, g/min Sustrato Etapa
0
6,13 50% p/p de glucosa 1ª
1
7,13 50% p/p de glucosa 1ª
2
8,28 50% p/p de glucosa 1ª
3
9,62 50% p/p de glucosa 1ª
4
11,18 50% p/p de glucosa 1ª
5
11,18 50% p/p de glucosa 1ª
6
11,18 50% p/p de glucosa 1ª
7
11,18 50% p/p de glucosa 1ª
8
11,18 50% p/p de glucosa 1ª
0
11,22 25% p/p de glucosa 2ª
2
24,42 25% p/p de glucosa 2ª
20
16,72 25% p/p de glucosa 2ª
30
18,7 25% p/p de glucosa 2ª
40
18,7 25% p/p de glucosa 2ª
Al final de la fermentación, la agitación se redujo hasta 150 rpm, se detuvo la aireación y la temperatura se mantuvo
15 a 35ºC. Se retiró parte del caldo de fermentación, dejando aproximadamente 180 kg en el fermentador. Este caldo remanente se tituló hasta pH 5,2 y se mantuvo a este pH con H2SO4 al 20% (20% p/p) y NaOH (50% p/p), mientras se añadían con agitación 9,0 L de glutaraldehído acuoso (GA, 10% p/p) a un caudal de ~90 mL/min; este caudal de adición era equivalente a 50 mg de glutaraldehído/L de caldo de fermentación/min, y la concentración final de glutaraldehído fue aproximadamente 5 g de glutaraldehído/L (0,035 g de glutaraldehído/DO550). Después de 5 h
20 desde el inicio de la adición de glutaraldehído al caldo, el pH se ajustó a 7,0 y se añadieron con agitación 1,8 L de bisulfito de sodio acuoso (10% p/p, pH 7) (aproximadamente 1 g de bisulfito de sodio/L de concentración final), y el caldo se agitó durante 15 minutos más. A continuación se disminuyó la temperatura del caldo hasta 10ºC y la agitación se disminuyó hasta 100 rpm. El caldo se concentró hasta 40 kg de suspensión celular usando una centrifugadora Diskstack (Alfa Laval), después se añadieron a la suspensión 50 kg de agua DI (20ºC) y la mezcla se
25 concentró por centrifugación para producir 40 kg de suspensión celular lavada. La suspensión (identificada como NIT 188A-C2) se conservó a 5ºC, y una porción de la suspensión celular se usó directamente para la preparación de un catalizador celular inmovilizado (Ejemplo 6). La actividad específica de nitrilasa durante cada etapa del procedimiento se resume en la Tabla 8.
Tabla 8: Actividad de nitrilasa durante las diferentes etapas del tratamiento con GA y bisulfito
Etapa de fermentación
U de BZN/g pcs
Pretratamiento con GA
2819
Postratamiento con GA
3300
Postratamiento con NaHSO3
2493
-22
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