ES2556639T3 - Método para usar células no raras para detectar células raras - Google Patents

Abstract

Un método para detectar una célula tumoral en circulación de alta definición (HD-CTC) en una muestra procedente de un sujeto, que comprende: a) proporcionar una muestra sospechosa de tener al menos una CTC y al menos una no CTC que está presente a una concentración que es al menos veces la de la CTC, b) poner en contacto la muestra con más de un agente detectable, en el que los agentes detectables se unen a un marcador celular y son un marcador positivo y un marcador negativo, en el que el marcador positivo es citoqueratina o EpCAM y/o el marcador negativo es CD45, y opcionalmente un marcador nuclear y/o marcador de contenido; c) realizar toma de imágenes celulares en la muestra de (b) para generar una imagen celular; y d) detectar las HD-CTC en la muestra analizando la imagen de (c), en el que las HD-CTC expresan el marcador positivo, tienen un núcleo intacto, son morfológicamente distintas de glóbulos blancos normales (WBC) y no son positivas para el marcador negativo.

Description

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células raras adecuadas para detección. Las fuentes de muestras incluyen sangre completa, médula ósea, fluido pleural, fluido peritoneal, fluido cefalorraquídeo central, orina, saliva y lavados bronquiales. La muestra puede ser una muestra de sangre, incluyendo, por ejemplo, sangre completa o cualquier fracción o componente de la misma. Una muestra de sangre, adecuada para su uso con la presente invención puede extraerse de cualquier fuente conocida que incluya células sanguíneas o componentes de las mismas, tales como venosa, arterial, periférica, tisular, de cordón umbilical, y similares. Por ejemplo, una muestra puede obtenerse y procesarse usando métodos clínicos bien conocidos y rutinarios (por ejemplo, procedimientos para extraer y procesar sangre completa). Una muestra ejemplar puede ser sangre periférica extraída de un sujeto con cáncer.

La expresión "componente sanguíneo" pretende incluir cualquier componente de sangre completa, incluyendo glóbulos rojos, glóbulos blancos, plaquetas, células endoteliales, células mesoteliales o células epiteliales. Los componentes sanguíneos también pueden incluir los componentes del plasma, tales como proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y carbohidratos, o cualquier otra célula que pueda estar presente en la sangre, debido a embarazo, trasplante de órganos, infección, lesión, o enfermedad.

Como se usa en este documento, un "glóbulo blanco" es un leucocito, o una célula del linaje hematopoyético que no es un reticulocito o plaqueta. Los leucocitos pueden incluir células citolíticas naturales ("células AK") y linfocitos, tales como linfocitos B ("células B") o linfocitos T ("células T"). Los leucocitos también pueden incluir células fagocíticas, tales como monocitos, macrófagos, y granulocitos, incluyendo basófilos, eosinófilos y neutrófilos. Los leucocitos también pueden comprender mastocitos.

Como se usa en este documento, un "glóbulo rojo" o "RBC" es un eritrocito. Salvo que se denomine un "glóbulo rojo nucleado" ("nRBC") o "glóbulo rojo nucleado fetal", como se usa en este documento, "glóbulo rojo" se usa para indicar un glóbulo rojo no nucleado.

La presente invención proporciona un método por el cual puede ensayarse o examinarse una muestra biológica de muchos modos diferentes para detectar y caracterizar HD-CTC. Una muestra puede teñirse o marcarse con uno o más marcadores detectables y examinarse por microscopia fluorescente y/o microscopia óptica. A diferencia de los esquemas convencionales de enriquecimiento cuyo objetivo es eliminar las células no raras o no CTC de la evaluación, la presente invención depende de las no CTC presentes en la muestra para ayudar a la identificación y caracterización de las CTC. En el método actualmente descrito de no enriquecimiento, la muestra (por ejemplo, sangre u otro fluido corporal, incluyendo orina, fluido peritoneal, pleural, saliva, cefalorraquídeo, y similares) se procesa mínimamente, y las células raras, tales como CTC no se separan de otras células nucleadas (por ejemplo, no raras o no CTC).

Como se usa en este documento, las expresiones "célula no rara" y "células no raras", se refieren en líneas generales a cualquier célula que no sea una célula rara como se define en este documento. Asimismo, como se usa en este documento, las expresiones "célula no CTC" y "células no CTC", se refieren en líneas generales a cualquier célula que no sea una CTC como se define en este documento. Las células no raras y no CTC pueden incluir células nucleadas o enucleadas, tales como, en el caso de sangre, glóbulos blancos (también llamados leucocitos) incluyendo neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos, y monocitos; glóbulos rojos (también conocidos como eritrocitos); y plaquetas.

En el caso de sangre, aunque las CTC pueden no separarse de otras células nucleadas, los glóbulos rojos, que son típicamente los únicos nucleados encontrados en la sangre de recién nacidos, se retiran de la muestra antes de sembrar en placa. Esto se realiza habitualmente lisando los glóbulos rojos, aunque varios enfoques alternativos son bien conocidos en la bibliografía y pueden utilizarse con los presentes métodos, por ejemplo, eliminación de las células por filtración o centrifugación en gradiente de densidad. Después de retirar los glóbulos rojos, las células restantes pueden procesarse por centrifugación, resuspensión, y siembra en placa de las células en un soporte sólido que puede usarse en la formación de imágenes celulares.

Son bien conocidos en la técnica una diversidad de soportes sólidos e incluyen portaobjetos que pueden tratarse para promover la adhesión celular a la superficie del portaobjetos. El portaobjetos puede estar construido a partir de una diversidad de materiales suficientes para proporcionar un soporte para realizar un ensayo biológico. En un aspecto ejemplar, el soporte está compuesto de un material que puede recubrirse con un compuesto que promueve la interacción electrostática de material biológico con el soporte. Son bien conocidos en la técnica una diversidad de materiales de sustrato y son adecuados para su uso con la presente invención. Dichos materiales pueden incluir uno

o más de vidrio; organoplásticos tales como policarbonato y polimetilmetacrilato, poliolefinas; poliamidas; poliésteres; siliconas; poliuretanos; epoxis; acrílicos; poliacrilatos; poliésteres; polisulfonas; polimetacrilatos; policarbonato; PEEK; poliimida; poliestireno; y fluoropolímeros. En un aspecto ejemplar, el portaobjetos se fabrica a partir de vidrio

o plástico e incluye uno o más recubrimientos de interacción biológica.

Los portaobjetos pueden incluir una o más áreas activas definidas sobre la superficie de los mismos. Un campo activo, como se usa en este documento, pretende incluir áreas en que el portaobjetos se ha tratado química o eléctricamente, tal como con un recubrimiento de interacción biológica, por ejemplo para promover la adhesión de las células al portaobjetos. Por ejemplo, el portaobjetos puede tratarse de modo que la superficie esté positivamente

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combinación con CD45. Como se usa en este documento un "marcador negativo" también puede ser un marcador detectable que se une específicamente a subpoblaciones de células no raras o no CTC y es un selector negativo.

Además de marcadores detectables positivos y negativos para identificar CTC, pueden usarse marcadores detectables adicionales para teñir células, que se unen específicamente al núcleo de la célula, permitiendo la diferenciación de células de material no celular. Como se usa en este documento, un "marcador nuclear" es un marcador detectable que se une a un componente nuclear de una célula y permite la diferenciación de células de material no celular. El marcador nuclear más común para su uso en la presente invención es DAPI.

En diversos aspectos de la invención, los marcadores detectables usados para teñir las células incluyen uno o más marcadores detectables mencionados en este documento como "marcadores de contenido". Los marcadores de contenido típicamente pueden incluir sondas oligonucleotídicas marcadas de forma detectable, tales como sondas FISH o sondas de inmunohistoquímica. En una realización, los marcadores de contenido se aplican al portaobjetos al mismo tiempo que los marcadores positivos y negativos, o se aplican al portaobjetos después de los marcadores positivos y negativos y después de la identificación de las células raras mediante imágenes. Los marcadores de contenido incluyen marcadores detectables dirigidos a EGFR, HER2, ERCC1, CXCR4, EpCAM, E-cadherina, mucina-1, Citoqueratina, PSA, PSMA, RRM1, receptor de andrógenos, receptor de estrógenos, receptor de progesterona, IGF1, cMET, EML4, o receptor asociado a leucocitos (LAR). En algunos casos, un marcador de contenido también puede ser un marcador positivo.

La intensidad de señal a partir de un marcador positivo, o cualquier marcador, es detectable en una escala de intensidades, que basada en la metodología de la descripción, es muy cuantificable. La escala de intensidad permite una cuantificación enormemente mejorada y la clasificación de eventos detectables que posibilita una categorización adicional. Por ejemplo, una CTC que emite una señal de baja intensidad para citoqueratina puede ser una célula madre cancerosa; o el cambio en la cantidad de células de alta/baja intensidad de citoqueratina podría ser predictivo de respuesta o una lectura de respuesta (o curso de resistencia). Lo mismo es cierto para marcadores positivos, negativos y de contenido.

La presente invención utiliza marcadores detectables para facilitar la formación de imágenes celulares mediante el examen de las células por microscopía fluorescente y/o microscopía óptica. En una descripción las células mínimamente procesadas se tiñen con varios marcadores fluorescentes, y después se extraen imágenes usando un microscopio rápido automatizado. Típicamente, un portaobjetos preparado puede cargarse en un sistema automatizado o puede colocarse en un soporte de portaobjetos que aloja cualquier cantidad de portaobjetos adicionales. Los soportes de portaobjetos se cargan en un almacén de entrada del sistema automatizado. Un operario puede después introducir datos que identifican el tamaño, forma, y localización de un área de escaneo en cada portaobjetos o el sistema puede localizar automáticamente un área de escaneo para cada portaobjetos durante el procesamiento. Los parámetros de procesamiento del portaobjetos pueden identificarse por un código de barras presente en el portaobjetos o soporte de portaobjetos. En la activación del sistema, un soporte de portaobjetos está posicionado en una fase X - Y, el portaobjetos completo, o parte del mismo, se escanea rápidamente. Esto puede hacerse a aumento bajo o alto y puede repetirse a diversos niveles de aumento y/o para diversas regiones del portaobjetos. Las imágenes pueden almacenarse en un medio de apropiado de almacenamiento y analizarse usando un código ejecutable que es bien conocido en la técnica para realizar los diversos análisis analizados en este documento. Como se analiza en este documento, diversos parámetros pueden ajustar durante todo el proceso de formación de imágenes para facilitar la detección de células raras, por ejemplo CTC, usando datos respecto a células no raras o no CTC, tales como límites de exposición y ajustes de intensidad.

Como se usa en este documento, los términos "imagen" e "imagen de la muestra" se refieren en líneas generales a una imagen, digital o de otro modo, de una muestra mínimamente procesada que incluye diversas células, tales como células raras y CTC. Típicamente, una imagen de la muestra es una imagen de todo o una parte de un portaobjetos de muestra que tiene células adheridas a su superficie y opcionalmente teñidas con uno o más marcadores detectables.

Una ventaja de la presente invención, que permite especificidad/sensibilidad ajustable y se centra la reducción y el análisis de datos en lugar del enriquecimiento, es que se espera procesamiento mínimo para minimizar el sesgo. En técnicas alternativas que requieren enriquecimiento, las células raras se pierden invariablemente en el proceso. Específicamente, en el uso de inmunocaptura o filtración por tamaño para distinguir entre WBC y CTC, una variación en la expresión del antígeno abordado en el caso de inmunocaptura o una variación en el tamaño diferencial entre las WBC y CTC causa que algunas CTC se pierdan durante la fase de enriquecimiento. Esto puede conducir a (i) recuentos imprecisos de CTC; (ii) demasiado pocas CTC para caracterización corriente abajo o análisis de contenido; y (iii) la creación de un sesgo de selección ya que algunos tipos de CTC se pierden preferentemente en base a tu tipo de variación.

El desafío con el enfoque de procesamiento mínimo es que es difícil encontrar las células raras de baja frecuencia o CTC en el fondo de las células no raras o no CTC. La frecuencia baja puede ser 1 célula rara o CTC:1.000 células no raras o no CTC, 1:10.000, 1:100.000, 1:1.000.000, e incluso 1:10.000.000, o cualquier sitio entre esas proporciones. Lo que complica la capacidad de encontrar y caracterizar las células raras es que los marcadores

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distribución ideal, puede elegirse rechazar el portaobjetos de procesamiento adicional. Aunque se usa un marcador nuclear en este ejemplo, sería suficiente cualquier método para identificar las células, incluyendo imágenes de campo claro y tinción convencional tal como Wright Giemsa.

En otra realización, la co-localización del marcador nuclear y el marcador negativo se usa como método de control de calidad para evaluar si la alineación de diferentes imágenes es satisfactoria. En esta realización, el marcador nuclear y el marcador negativo deben tener superposición significativa.

En otra realización, la proporción entre eventos de marcador negativo y los eventos de marcador nuclear es una medida de la eficacia de la tinción del marcador negativo, donde es deseable que la proporción sea mayor sin exceder de 12. Un marcador negativo deseable puede tener una proporción de 0,8, 0,9, 1,0 o 1,1. En otra realización, la distribución, incluyendo la media, desviación típica y coeficiente de variación (CV) del marcador negativo sobre la población de las células no raras o no CTC se usa como parámetro de control de calidad, donde la distribución del marcador negativo es coherente con los patrones esperados de distribución de experimentos pasados y/o coherente con la distribución de los patrones de expresión normal de WBC.

En otra realización, la distribución, incluyendo la media, desviación típica y CV del marcador positivo sobre la población de las no CTC se usa como un parámetro de control de calidad, donde la distribución del marcador positivo es coherente con los patrones esperados de distribución de experimentos pasados.

Aunque los métodos de control de calidad descritos anteriormente describen métodos para evaluar la calidad global del portaobjetos, pueden usarse los mismos métodos para evaluar una imagen o un grupo de imágenes. En algunos casos, los parámetros derivados de una imagen o un grupo de imágenes en una región pueden compararse con los mismos parámetros calculados sobre el portaobjetos completo. En otro caso, los parámetros de control de calidad descritos anteriormente pueden compararse a través de diferentes portaobjetos.

En otra realización, la pérdida de células puede calcularse a partir del portaobjetos durante el procesamiento comparando la proporción de los eventos de marcador nuclear o los eventos de marcador negativo a la cantidad conocida de no CTC colocada en el portaobjetos, donde la cantidad conocida de no CTC se deriva del recuento de WBC y el volumen usado en el experimento.

Ajuste de los límites de corte de intensidad para la detección de CTC (minimización de falsos negativos)

Como se ha mencionado anteriormente, los desafíos en este enfoque para la detección de células raras y CTC son 1) que la frecuencia relativa de células raras, tales como CTC, a células no raras o no CTC es baja; y 2) la tinción imperfecta de los marcadores positivos y negativos para CTC y no CTC respectivamente. Sin embargo, el presente método acepta esos desafíos y los convierte en ventajas. En una realización, la señal de fondo procedente de los marcadores positivos en las no CTC muy abundantes se usa para calcular la media, desviación típica y CV. Esas métricas se usan posteriormente para determinar los puntos de corte de detección para separar células raras, tales como CTC de no CTC. En un aspecto, el factor de 10 multiplicado por la desviación típica y añadido a la media para la señal del marcador positivo de no CTC, se usa como punto de corte para distinguir las CTC, donde se determina que las supuestas células raras o CTC tienen una señal de marcador positivo mayor que ese punto de corte. En otros aspectos, la métrica usa un factor de 5, 7,5, 12,5, 15, 7,5, 20 o más, o cualquier número entre esos números. El cálculo de la métrica puede ajustar en una base de portaobjetos global. Como alternativa, puede ajustarse en una base de imagen o una base regional.

En otra realización, el punto de corte puede determinarse de forma dinámica dentro de cada imagen localizando una señal de los eventos superiores de marcador positivo, comparando después la señal con la desviación típica entre eventos adicionales de señal. En un aspecto ejemplar, el punto de corte puede determinarse de forma dinámica dentro de cada imagen localizando señales de los cinco eventos superiores de marcador positivo, comparando después esa señal con la desviación típica entre los siguientes cincuenta eventos de señal positiva. Los eventos de marcador positivo también pueden incluir múltiples marcadores positivos o la inclusión de marcadores positivos y la exclusión de eventos de marcador negativo. La cantidad 'cinco' podría variarse de 1 a 10 por campo de visión suponiendo un aumento 10x (es decir, suponiendo no más de 5 células raras o CTC por campo de visión o una concentración relativa de no más de 1 en 500). Este enfoque tiene la ventaja de ser completamente numérico y no estar basado en el análisis de forma. Se espera que reduzca de forma robusta y sustancial la cantidad de posibles eventos con riesgo mínimo de pérdida de eventos.

En otra realización, el punto de corte para la señal de marcador negativo se ajusta usando la media y desviación típica de las no CTC. En este caso, el punto de corte se deriva de un factor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 multiplicado por la desviación típica de la señal de marcador negativo para las no CTC y se resta de la señal media de marcador negativo. Las supuestas CTC tendrán una señal de marcador negativo por debajo de ese punto de corte. Como se ha descrito anteriormente, este punto de corte puede generarse de forma global usando la señal de todas las no CTC en el portaobjetos o en la imagen o a nivel regional usando la señal procedente solamente de las no CTC en esa imagen o esa región.

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Calibración del tamaño y la forma

En otra realización de la invención, el tamaño celular y la distribución de los tamaños celulares para las no CTC medidos en el portaobjetos se comparan con los tamaños y distribuciones publicados para las WBC en la bibliografía. Además, la distribución puede corregirse para diferencian individuales del paciente usando recuento diferencial de los subgrupos de los WBC obtenidos de un contador automatizado de células. La proporción ratio entre el tamaño publicado y el tamaño calculado de las no CTC puede usarse después como un factor de corrección para determinar un tamaño preciso para las CTC multiplicando esa proporción por el tamaño de la CTC medido en el portaobjetos. La calibración permite la normalización y comparaciones entre portaobjetos y entre tubos de sangre y entre pacientes y entre indicaciones.

En otra realización, se compara uno o más del tamaño nuclear, la distribución del tamaño nuclear, y los patrones de contorno para las no CTC medidos en una imagen o portaobjetos con el tamaño nuclear y patrón de contorno de una supuesta CTC y se aplican los valores de punto de corte para clasificar esa supuesta CTC como una HD-CTC válida.

Enumeración

La información de células no raras o no CTC puede usarse para calcular de forma precisa la concentración de células raras o CTC en un fluido corporal. En un ejemplo de esta realización, se determina la proporción de CTC a CTC + no CTC totales (todos los eventos de marcador nuclear) y después se divide eso por el volumen del fluido corporal original usado para ese experimento, y finalmente se multiplica eso por la concentración original de las células en el fluido corporal. La última medición puede obtenerse a través del uso de un contador automatizado convencional de células (o citómetro).

Evaluación del contenido

Como se ha mencionado anteriormente, puede evaluarse el nivel de expresión de la célula rara o CTC de un marcador de contenido. Sin embargo, a causa de la variabilidad del portaobjetos causada por la variación de procesamiento y formación de imágenes, es difícil proporcionar parámetros universales para determinar el nivel de expresión. Para mitigar este desafío, se determina primero el nivel de expresión del marcador de contenido y su distribución en células no raras o no CTC en una población de pacientes. Después, para el paciente individual con cáncer, se determina el nivel de expresión del marcador de contenido en células raras o CTC y en células no raras o no CTC. La proporción del nivel de expresión entre células raras o CTC y células no raras o no CTC se convierte en una medida relativa que normaliza la variación de un portaobjetos a otro. Además, multiplicando esa proporción por la media del nivel de expresión de células no raras o no CTC a partir de la población de control se proporciona un valor absoluto para la expresión de la célula rara o CTC corregido para la variación de un portaobjetos a otro.

La forma y tamaño nuclear es una potencial fuente rica de información. Se espera que dé información detallada acerca del tipo de célula en el caso de una célula sanguínea y acerca del estado de la célula en el caso de una célula rara o CTC. Por ejemplo, la forma nuclear podría dar una idea de la naturaleza maligna de la célula, podría dar una idea del estado de viabilidad celular y/o ciclo celular. Por ejemplo, un paciente que está experimentando una quimioterapia satisfactoria podía observar un repunte en las CTC pero la interpretación nuclear podría mostrar que estas CTC son no viables/apoptóticas.

Otra oportunidad potencial para usar el tamaño y forma nuclear sería similar a los análisis FACS usando la dispersión directa y la dispersión lateral como modos para caracterizar las células. Puede ser posible reunir suficiente información detallada acerca del núcleo y otros componentes celulares para recapitular la información de dispersión directa y lateral a partir de FACS.

En diversas realizaciones de la invención, puede utilizarse un único parámetro o combinación de parámetros para realizar el ensayo dependiendo, en parte, de los datos a determinar y la población de células raras que se está investigando. Además, pueden identificarse subpoblaciones de poblaciones específicas de células raras usando la metodología descrita. Por ejemplo, como se muestra en el Ejemplo 1, pueden identificarse subpoblaciones de CTC y diferenciarse definiendo adicionalmente parámetros específicos de ensayo. El Ejemplo describe la identificación y clasificación de una subpoblación de CDC mencionada como HD-CTC.

En la invención, mediante la definición adicional de parámetros del ensayo descrito, se estableció una clasificación estricta de las HD-CTC. Si el deseo de limitarse a teoría alguna, se cree que la subpoblación HD-CTC clasificada en este documento, incluye CTC que muestran el potencial mayor de convertirse en una célula tumoral intacta. Todas las demás CTC cumplen parcialmente los parámetros definidos pero carecen de uno o más de los estrictos criterios de inclusión. Las no HD-CTC son CTC que pueden ser menos fiables en la evaluación realizada en metodologías corriente abajo adicionales.

Una HD-CTC es una célula que comprende a) un marcador positivo; b) tiene un núcleo intacto; y c) es morfológicamente distinta de WBC normales, donde la célula es no positiva para un marcador negativo. Como se

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analiza en este documento, el marcador positivo es citoqueratina y/o EpCAM. Además, como se analiza en este documento, el marcador negativo es CD45 que se une preferentemente a WBC. La determinación de un núcleo intacto se determina típicamente por imágenes DAPI, pero también se conocen en la técnica otros marcadores nucleares adecuados. En una realización ejemplar, una HD-CTC es una célula que es a) positiva a citoqueratina; b) negativa a CD45; c) tiene un núcleo intacto; y d) es morfológicamente distinta de WBC normales.

En diversas realizaciones, el marcador positivo puede tener una intensidad que es mayor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces la de la intensidad de citoqueratina de glóbulos blancos nucleados. En diversas realizaciones, la intensidad del marcador negativo está en el mínimo del 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o menor de todos los eventos celulares.

En diversas realizaciones, el núcleo de una HD-CTC está intacto y es no apoptótico. Están aceptados cambios apoptóticos leves en el citoplasma, siempre que el núcleo no parezca apoptótico.

En diversas realizaciones las HD-CTC son morfológicamente distintas de WBC normales. Por ejemplo, las HD-CTC pueden tener una morfología que es coherente con una célula epitelial maligna por los criterios usados en citopatología diagnóstica convencional, predominantemente encarnada como de tamaño agrandado, pero que también puede incluir características citomorfológicas, tales como organización arquitectónica de núcleo y citoplasma, forma citoplasmática, y forma nuclear. Se presenta una galería de HD-CTC representativas en la Figura

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Aunque los métodos descritos en esta invención son útiles para detectar las HD-CTC usando datos derivados del análisis de no CTC, como se analiza minuciosamente, los métodos también son útiles en la caracterización de células raras. En particular, el uso de las diversas combinaciones de marcadores detectables y métodos computacionales para realizar imágenes y análisis de células permite la caracterización significativa útil en la evaluación de pronóstico de cáncer y en el control de la eficacia terapéutica para detección prematura de fallo del tratamiento que pueda conducir a recidiva de la enfermedad. Además, el análisis de las CTC de acuerdo con la invención posibilita la detección de recidiva prematura en pacientes presintomáticos que han completado un curso de terapia. Esto es posible porque la presencia de CTC se ha asociado y/o correlacionado con progresión y propagación tumoral, mala respuesta a terapia, recidiva de la enfermedad, y/o supervivencia disminuida sobre un periodo de tiempo. Por tanto, la enumeración y caracterización de CTC manifestadas proporciona métodos para estratificar pacientes por características basales que predicen el riesgo inicial y riesgo posterior en base a la respuesta a terapia.

El término "sujeto" como se usa en este documento se refiere a cualquier individuo o paciente en el que se realizan los presentes métodos. Generalmente el sujeto es humano, aunque como apreciarán los expertos en la materia, el sujeto puede ser un animal. Por tanto se incluyen otros animales, incluyendo mamíferos tales como roedores (incluyendo ratones, ratas, hámsteres y cobayas), gatos, perros, conejos, animales de granja incluyendo vacas, caballos, cabras, ovejas, cerdos, etc., y primates (incluyendo monos, chimpancés, orangutanes y gorilas) dentro de la definición de sujeto.

Por consiguiente, en otra realización, la invención proporciona un método para diagnosticar o pronosticar cáncer en un sujeto. El método incluye detectar las CTC como se describe en este documento. Las CTC después se analizan para diagnosticar o pronostica cáncer en el sujeto. Por tanto, los métodos de la presente invención pueden usarse, por ejemplo, para evaluar a los pacientes con cáncer y aquellos en riesgo de cáncer. En cualquiera de los métodos de diagnóstico o pronóstico descritos en este documento, la presencia o ausencia de uno o más indicadores de cáncer, tal como una célula cancerosa, o de cualquier otro trastorno, puede usarse para generar un diagnóstico o pronóstico.

En un aspecto, se extrae una muestra de sangre del paciente y se procesa para detectar las CTC como se describe en este documento. Usando el método de la invención, se determina la cantidad de CTC en la muestra de sangre y se caracterizan las CTC mediante análisis de los marcadores detectables y otros datos reunidos a partir de las imágenes de las células. Por ejemplo, puede realizarse análisis para determinar la cantidad y caracterización de las CTC en la muestra, y a partir de esta medición, puede determinarse la cantidad de CTC presentes en la muestra inicial de sangre.

En diversos aspectos, el análisis de la cantidad y caracterización de las CTC de un sujeto puede hacerse sobre un curso de tiempo particular en diversos intervalos para evaluar la progresión y patología del sujeto. Por ejemplo, puede realizarse análisis a intervalos regulares tales como un día, dos días, tres días, una semana, dos semanas, un mes, dos meses, tres meses, seis meses, o un año, para rastrear el nivel y caracterización de células epiteliales en circulación como una función del tiempo. En el caso de pacientes con cáncer existente, esto proporciona una indicación útil de la progresión de la enfermedad y ayuda a los profesionales médicos a tomar las elecciones terapéuticas apropiadas en base al aumento, disminución, o ausencia de cambio en las células epiteliales en circulación, tal como la presencia de CTC en el torrente sanguíneo del paciente. Cualquier aumento, sea de 2 veces, 5 veces, 10 veces o mayor, en la cantidad de CTC en el tiempo disminuye el pronóstico del paciente y es un indicador prematuro de que el paciente debe cambiar de terapia. Asimismo, cualquier aumento, sea de 2 veces, 5 veces, 10 veces o mayor, indica que un paciente debe experimentar ensayo adicional tal como imágenes para

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