ES2550853T3 - Conjugación de polisacárido con enterotoxina termolábil (LT) de E. coli desintoxicada usada como vacuna - Google Patents

Conjugación de polisacárido con enterotoxina termolábil (LT) de E. coli desintoxicada usada como vacuna Download PDF

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ES2550853T3 ES11817824.3T ES11817824T ES2550853T3 ES 2550853 T3 ES2550853 T3 ES 2550853T3 ES 11817824 T ES11817824 T ES 11817824T ES 2550853 T3 ES2550853 T3 ES 2550853T3
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Abstract

Un conjugado covalente de un polisacárido y una enterotoxina termolábil (LT) de E. coli desintoxicada, en el que la LT es una holotoxina y es una proteína mutante LTS61K que tiene una sustitución de lisina en la posición correspondiente a la posición 61 de SEC ID Nº: 5.

Description

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Conjugación de polisacárido con enterotoxina termolábil (LT) de E. coli desintoxicada usada como vacuna
Descripción
Antecedentes de la invención:
Las vacunas de polisacárido, cuando se preparan sin proteína transportadora, carecen de respuestas de memoria inmunitaria. Las vacunas conjugadas actualmente conocidas incluyen polisacáridos capsulares bacterianos tales como Haemophilus influenzae tipo b, Neisseria meningitidis grupo C y Streptococcus pneumoniae serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 19F, 23F. Estas vacunas están conjugadas covalentemente con una proteína transportadora, tal como el toxoide tetánico, toxoide diftérico, CRM197, una toxina diftérica no tóxica mutante, o proteína de la membrana externa de Neisseria meningitidis. Estas vacunas de conjugado de polisacárido podrían inducir respuesta dependiente de linfocitos T, especialmente en bebés por debajo de la edad de dos años; y podrían sensibilizar la memoria inmunológica a largo plazo, producir anticuerpo de alta afinidad y podrían reducir la tasa de colonización y transmisión nasofaríngea.
Sin embargo, la mayoría de las vacunas de conjugado de polisacárido bacterianas actualmente comercializadas aplicaron toxoide tetánico (TT) o toxoide diftérico (DT) como proteína transportadora. TT y DT, estas dos proteínas de toxoide, son vacunas habituales para bebés/niños; la vacunación de alta frecuencia de TT y DT dentro de un corto tiempo podría tener un impacto sobre la inmunogenicidad y seguridad (Reduced response to multiple vaccines sharing common protein epitopes that are administered simultaneously to infants. Infect. Immun. 1998; 66(5):20938; Immunogenicity and safety of a combination pneumococcalmeningococcal vaccine in infants: a randomized controlled trial. JAMA 2005; 293 (14): 17518). Por tanto, la presente invención proporciona un nuevo tipo de la proteína transportadora LTS61K para su uso en la vacuna de conjugado.
El documento EP 0 172 107 A1 desvela un conjugado de una subunidad de LTB no tóxico (LTBNT) y un polisacárido capsular bacteriano. El conjugado obtenido de LTBNT y polisacárido estuvo en forma agregada, y así se usó urea 5 M en el proceso de conjugación para eliminar los agregados. Como la urea es un desnaturalizante de proteínas, la utilización de urea afectaría la estructura y actividad de la subunidad de LTB, y así la subunidad de LTB tratada ya no se presenta como una estructura pentámera completa en su forma natural.
Resumen de la invención:
La presente invención incluye la conjugación de polisacáridos con una enterotoxina termolábil (LT) de E. coli desintoxicada en la que LT es una holotoxina y es una proteína mutante LTS61K que tiene una sustitución de lisina en la posición correspondiente a la posición 61 de SEC ID Nº: 5 útil como vacuna para proteger o inmunizar contra los efectos de bacterias infecciosas tales como Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae y aliviar la diarrea del viajero producida por E. coli enterotoxigénica.
Un aspecto de la presente invención se refiere a vacunas de polisacáridoLTS61 K covalentemente conjugadas aisladas en forma purificada. Estos productos conjugados tienen inesperadamente propiedades inmunogénicas y bactericidas superiores en mamíferos. Otro aspecto se refiere al uso de polisacáridoLTS61K conjugado para la preparación de una vacuna para un mamífero en necesidad de protección de Haemophilus influenzae tipo b (Hib). Las vacunas de la presente invención estimulan la respuesta de linfocitos T colaboradores, presentan fuerte respuesta al refuerzo tras la reexposición y tienen altos títulos de anticuerpos.
Todavía otro aspecto de la invención se refiere al método de producción de polisacáridoLTS61K conjugado por aminación reductora y aislamiento del producto conjugado purificado. Según la presente invención, se descubrió que el método preferido de conjugar polisacárido y LTS61K para preparar la vacuna de la presente invención es la oxidación con peryodato del PS nativo, seguido de aminación reductora.
La LTS61K empleada en los conjugados de la presente invención se describe en la solicitud PCT número PCT/US2007/075801, presentada el 13 de agosto de 2007; en las solicitudes de EE.UU. Números US 1 1/779419 presentada el 18 de julio de 2007, US 12/120.953 presentada el 15 de mayo de 2008 y US 12/729.649 presentada el 23 de marzo de 2010; y en la solicitud de patente de Taiwán Nº 95139707 presentada el 27 de octubre de 2006 y concedida en enero de 2009.
Breve descripción de las figuras:
La Figura 1 es una representación generalizada de una proteína transportadora LT.
La Figura 2 es la representación estructural de sacáridos de PRP de Hib.
La Figura 3 muestra varios métodos de conjugación.
La Figura 4 muestra un método de aminación reductora según la presente invención.
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La Figura 5 representa la conjugación de PRP y LTS61K por aminación reductora. La Figura 6 muestra el perfil de elución de HPLCSECRI de PRP oxidado después del tratamiento con NaIO4. La Figura 7 es un espectro de RMN de PRP oxidado. Esto confirma la formación de grupos aldehído sobre
PRP después de la oxidación con peryodato. La Figura 8 muestra espectros de CD de UV lejano que confirman que no hay diferencia en la estructura secundaria entre muestras de LTS61K y conjugadas de PRPLTS61K; y también espectros de fluorescencia
que confirman que no hay diferencia de la estructura terciaria máx [lambda] entre muestras de LTS61K y conjugadas de PRPLTS61K. La Figura 9 muestra análisis de aminoácidos que confirman la conjugación satisfactoria de PRP con LTS61K y
la formación de un enlace covalente.
La Figura 10 muestra el análisis de transferencia Western por SDSPAGE para confirmar la conjugación covalente entre PRP y LTS61K. La Figura 11 muestra conjugados de PRPLTS61K purificados analizados por IEF PAGE. La Figura 12 muestra la transferencia Western IEF para confirmar la conjugación covalente entre PRP y
LTS61K. La Figura 13 confirma la pureza de la vacuna de conjugado purificada mediante HPLCSECUVMALLSRI. La Figura 14 muestra los conjugados de PRPLTS61K purificados analizados por IEF PAGE para confirmar la
pureza de la vacuna de conjugado purificada.
La Figura 15 resume un estudio de inmunogenicidad de rata de conjugados de PRP de HibLTS61 de la presente invención. La Figura 16 resume un estudio de inmunogenicidad de conejo de conjugados de PRP de HibLTS61 K de la
presente invención. La Figura 17 ilustra los resultados de un estudio de inmunogenicidad de conejo de conjugados de PRP de Hib
LTS61K de la presente invención, resultados del ensayo de títulos bactericidas en sueros de conejo y títulos de Ab antiIgG de PRP. La Figura 18 ilustra información adicional sobre el estudio de inmunogenicidad de conejo. La Figura 19 ilustra resultados de un estudio de inmunogenicidad de conejo de conjugados de PRP de Hib
LTS61K de la presente invención, resultados de los títulos bactericidas en sueros de conejo (BA) y títulos de Ab
antiIgG de PRP (DO). La Figura 20 muestra resultados de ELISA de inmunogenicidad de conejo adicional de estudios de respuestas de anticuerpos antiPRP y antiLTS61K.
La Figura 21 muestra los resultados del ensayo bactericida en sueros de conejo adicional y Ab antiIgG de
PRP. La Figura 22 muestra resultados de ensayo bactericida en sueros de conejo adicional y Ab antiIgG de PRP después de una cuarta inmunización.
La Figura 23 muestra la inmunogenicidad en ratón sobre conjugados de PS de serotipo 14 neumocócicoLTS61K.
Descripción detallada de la invención: Los presentes inventores han descubierto ahora que las vacunas de polisacáridoLTS61K conjugadas hechas según la presente invención inducen sorprendentemente mayores títulos de anticuerpos IgG específicos de polisacárido y mayor actividad bactericida en sueros que las de polisacárido o polisacárido mezclado con LTS61K.
Una lista de abreviaturas empleada en el presente documento es la siguiente: CFU: unidad formadora de colonias ELISA: enzimoinmunoanálisis de adsorción
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Hib: tipo Haemophilus influenzae bIEF: isoelectroenfoque LT: enterotoxina termolábil MALLS: dispersión de luz láser a múltiples ángulos
5 DO: densidad óptica PNPS: polisacárido neumocócico PRP: polirribosil ribitol fosfato PS: polisacárido SDSPAGE: electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodiopoliacrilamida
10 SEC_HPLC: cromatografía líquida de alta presión de exclusión de tamaño RI: índice de refracción
La nueva proteína transportadora empleada en los conjugados de la presente invención es el mutante de la enterotoxina termolábil de E. coli recombinante desintoxicada LTS61K. En el mutante de LT, las subunidades A y B
15 forman una estructura de holotoxina AB5 típica. El mutante de LT desintoxicado (LTS61K) contiene una subunidad madura mutada A (LTA) que incluye K en la posición de aminoácido 61 y una subunidad B madura no mutada (LTB). LTS61K convierte el producto en significativamente menos tóxico que LT no mutante. La proteína transportadora se representa en la Figura 1 de los dibujos.
20 La invención de LTS61K se basa en el descubrimiento inesperado de que una LT que contiene una LTA mutada presenta toxicidad reducida en comparación con su homólogo no mutado mientras que retiene la inmunogenicidad. Esta LTA mutada tiene una sustitución de aminoácido en la posición correspondiente a la posición 61 de una LTA no mutada, cuya secuencia de aminoácidos, SEC ID Nº: 5, se muestra en las solicitudes de patente citadas. Por consiguiente, LTS61K caracteriza un polipéptido aislado que incluye una LTA mutada que contiene un residuo de
25 aminoácido distinto de S, T y F en la posición correspondiente a la posición 61 de SEC ID Nº: 5. El residuo de aminoácido de sustitución puede ser D, E, H, I, K, L, N, P, Q, R, Y o W. Puede ser un aminoácido que existe de forma natural o un aminoácido que existe de forma no natural, por ejemplo, un Daminoácido o un [beta]aminoácido. En un ejemplo, la LTA tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2, 4, 8 o 10. Una LT que contiene esta LTA mutada presenta toxicidad reducida, es decir, <105 veces la de una LT no mutada que contiene SEC ID Nº: 5 en las
30 solicitudes de patente anteriormente identificadas.
Según la presente invención, se cultivó Haemophilus influenzae tipo B y se purificó su antígeno de polisacárido capsular, polirribosil ribitol fosfato (PRP). El PRP es lineal, tiene una carga negativa y es hidrófilo. El sacárido de PRP de Hib con peso molecular 345 y fórmula 10C,18H,11O,1P se representa como en la Figura 2 de los dibujos.
35 PRP se conjuga sobre LTS61K por una reacción de aminación reductora química empleando relaciones molares apropiadas de polisacárido PRP con respecto a proteína (LTS61K) que producen vacunas de conjugado. Los intervalos de relaciones molares de PRP:LTS61K se muestran en la Tabla 1, a continuación. Preferentemente, el intervalo de relaciones molares de PRP:LTS61K está entre aproximadamente 3:1 y aproximadamente 60:1, y mol
40 /mol de IO4/PRP está entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 0,4.
Tabla 1. Diferentes relaciones de la prueba de conjugación de PRP/LTS61K
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PRP:LT S61K (w:w)
PRP:L T 61K (m:m) IO4/PRP Unidad repetida (m/m) Promedio Unidad repetida PRP (Ensayo Colorimétrico ) Tiempo de reacción PRP/ Proteina LTS61K (w/w) PRP/ Proteina LTS61K (m/m)
0.5:1
3:1 0.1 42 2 semanas 0.059 0.68
1:1
6:1 0.1 42 2 semanas 0.099 1.14
1.5:1
9:1 0.1 42 2 semanas 0.13 1.5
2:1
28:1 0.2 17.5 2 semanas 0.21 (10/48) 3
3:1
42:1 0.2 17.5 2 semanas 0.23 3.2
4:1
56:1 0.2 17.5 2 semanas 0.24 3.4
3:1
42:1 0.2 17.5 3 semanas 0.21 2.9
3:1
42:1 0.2 17.5 4 semanas 0.35 4.9
3:1
42:1 0.2 17.5 5 semanas 0.33 4.6
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PRP:LT S61K (w:w)
PRP:L T 61K (m:m) IO4/PRP Unidad repetida (m/m) Promedio Unidad repetida PRP (Ensayo Colorimétrico ) Tiempo de reacción PRP/ Proteina LTS61K (w/w) PRP/ Proteina LTS61K (m/m)
3:1
42:1 0.2 17.5 6 semanas 0.31 4.3
3:1
50:1 0.3 14.2 2 semanas 0.34 5.8
3:1
60:1 0.4 12.2 2 semanas 0.37(10/27) 0.5(10/20) 7.4
Adicionalmente según la presente invención, una variedad de diferentes tipos de los antígenos de polisacárido capsular bacteriano de Haemophilus influenzae tipo b y Streptococcus pneumoniae se conjugan químicamente con la proteína LTS61K por reacciones de aminación reductora. Se emplearon una variedad de diferentes relaciones molares de NaIO4:PRP como se muestra en la Tabla 1, anteriormente, para oxidar polisacáridos para producir longitudes cortas de polisacáridos con diferentes unidades de repetición. Tras la apropiada relación molar del polisacárido reaccionado con LTS61K, se obtuvieron los productos de conjugado de polisacáridoLTS61K satisfactoriamente conjugados y purificados. Los productos estuvieron en forma soluble y se evaluaron física y químicamente por SECHPLC, orcinol, SDSPAGE, transferencia Western, IEF, actividad de unión a GM1, dicroismo circular y ensayos fluorescentes para identificar la satisfactoria conjugación química del antígeno de polisacárido y la proteína transportadora LTS61K.
Ejemplo del procedimiento de preparación de polisacárido conjugado con LTS61K:
Se ilustra una variedad de posibles procesos de conjugación en la Figura 3 de los dibujos. Un diagrama de flujo generalizado del proceso de aminación reductora seleccionada según la presente invención se encuentra en Glyconjugate J. 1989,6:489 y se reproduce como la Figura 4 de los dibujos.
Según la presente invención, se escinde un polisacárido por oxidación con peryodato a fragmentos más pequeños para producir grupos terminales de aldehído. A partir de aquí, la conjugación del polisacárido oxidado con la proteína LTS61K se lleva a cabo por aminación reductora. Más específicamente, un ejemplo del proceso es el siguiente:
A. Activación de polisacárido (oxidación con peryodato): Se mezcla polirribosil ribitol fosfato nativo (PRP), que es polisacárido capsular purificado de Haemophilus influenzae tipo b, en una cantidad de 5 mg/ml con peryodato (IO4) 0,3 o 0,6 o 1,2 mg/ml (relación molar (m/m) de IO4con respecto a PRP = 0,1, 0,2, 0,4). Esta mezcla se dejó reposar a 4 ºC en la oscuridad durante 24 horas. A continuación se añadió glicerol para terminar la reacción. El PRP oxidado resultante se sometió a diálisis contra ddH2O usando membrana de 3,5 K para eliminar las impurezas. El producto resultante se esterilizó por filtración con un filtro de 0,22 um. El procedimiento de oxidación con peryodato proporcionó la fragmentación del polisacárido PRP en diferentes longitudes de cadena. El intervalo del número promedio de unidades de repetición de PRP fue aproximadamente 40 a 10.
B. Conjugación de polisacáridoLTS61K: Preparación del conjugado de PRP y LTS61K, mezcla de PRP oxidado obtenido de antes, LTS61K purificado (que se desveló en las patentes obtenidas previas/presentadas) y cianoborohidruro de sodio (NaBH3CN), en 10 mg/ml, 3 mg/ml y 10 mg/ml, respectivamente, la reacción se llevó a cabo durante 2 semanas a 4 ºC en la oscuridad. La reacción se terminó añadiendo borohidruro de sodio NaBH4 para extinguir los aldehídos sin reaccionar sobre PRP, la preparación se dializó entonces contra ddH2O con membrana de 10 K.
C. Caracterización de los productos de LTS61K conjugados con polisacárido: Tras la apropiada relación molar del polisacárido reaccionado con LTS61K, se obtuvieron los productos del conjugado de polisacáridoLTS61K satisfactoriamente conjugados y purificados. Los productos con forma soluble se evaluaron física, química y biológicamente por SECHPLC, orcinol, SDSPAGE, transferencia Western, IEF, actividad de unión a GM1, dicroismo circular y ensayos fluorescentes para confirmar la conjugación química satisfactoria del antígeno de polisacárido y la proteína transportadora LTS61K, relación de polisacárido con respecto a la proteína LTS61K, y su inmunogenicidad. La Figura 5 de los dibujos resume las condiciones de reacción y ensayos empleados según ejemplificación específica de la presente invención.
Ahora se hace referencia a las figuras de dibujos que se refieren a la confirmación de estructura y pureza de los conjugados y vacuna.
La Figura 6 muestra el perfil de elución de HPLCSECRI de PRP oxidado después del tratamiento con NaIO4. Esta figura ilustra el proceso de la invención y los resultados son fácilmente reproducibles.
La Figura 7 es un espectro de RMN de PRP oxidado. Esto confirma la formación de grupos aldehído sobre PRP
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después de la oxidación con peryodato. La Figura 8 muestra espectros de CD de UV lejano que confirman que no hay diferencia en la estructura secundaria entre muestras de LTS61K y conjugadas de PRPLTS61K; y también espectros de fluorescencia que confirman que 5 no hay diferencia de la estructura terciaria máx λ entre muestras de LTS61K y conjugadas de PRPLTS61K. La Figura 9 muestra análisis de aminoácidos que confirman la conjugación satisfactoria de PRP con LTS61K y la formación de un enlace covalente.
10 La Figura 10 muestra el análisis de transferencia Western por SDSPAGE para confirmar la conjugación covalente entre PRP y LTS61K. La Figura 11 muestra conjugados de PRPLTS61K purificados analizados por IEF PAGE.
15 La Figura 12 muestra la transferencia Western IEF para confirmar la conjugación covalente entre PRP y LTS61K. La Figura 13 confirma la pureza de la vacuna de conjugado purificada mediante HPLCSECUVMALLSRI. La Figura 14 muestra los conjugados de PRPLTS61K purificados analizados por IEF PAGE para confirmar la
20 pureza de la vacuna de conjugado purificada. La Tabla 2, a continuación, es el resultado de un ensayo de unión a GM1 que confirma que la proteína LTS61K retuvo su actividad de unión tras la conjugación. 25 Tabla 2
0.2/2w PRPLTS61K conjugado
0.2/4w PRPLTS61K conjugado 0.4/2w PRPLTS61K conjugado 0.4/4w PRPLTS61K conjugado
GM1actividad de unión(unidad=M)
5.19 x 1010 4.77 x 1010 4.23 x 1010 2.79 x 1010
Estudios preclínicos en mamífero que muestran la eficacia de los conjugados de polisacáridoLTS61K:
35 Se inmunizaron intramuscularmente tres veces, a intervalos de dos semanas, conejos blancos de Nueva Zelanda usando la dosis humana prevista del polisacárido, polisacárido mezclado con LTS61K o conjugado de polisacáridoLTS6K para evaluar la potencia de las vacunas de conjugado. Ninguna de las preparaciones de vacuna contuvo AlPO4 u otro adyuvante relacionado. Las respuestas inmunitarias de todas las vacunas se determinaron por ELISA para detectar títulos de antiIgG específica de antígeno de polisacárido y ensayo bactericida en sueros para detectar
40 la actividad funcional de los anticuerpos. Los resultados del estudio indicaron que solo vacunas de polisacáridoLTS61K satisfactoriamente conjugadas pudieron inducir mayores títulos de anticuerpos IgG específicos de polisacárido y mayor actividad bactericida en sueros que el polisacárido solo, o polisacárido mezclado con LTS61K solo. Los estudios de inmunogenicidad animal sugieren que la holotoxina de enterotoxina termolábil de E. coli desintoxicada que incluye la proteína LTS61K es útil como proteína transportadora de polisacárido para estimular
45 significativamente una respuesta inmunitaria específica de antígenos de polisacárido.
Ahora se hace referencia a figuras adicionales de dibujos que se refieren a los resultados de los estudios en mamífero iniciales.
50 La Figura 15 resume un estudio de inmunogenicidad de rata de conjugados de PRP de HibLTS61K de la presente invención.
La Figura 16 resume un estudio de inmunogenicidad de conejo de conjugados de PRP de HibLTS61K de la presente invención.
55 La Figura 17 ilustra los resultados de un estudio de inmunogenicidad de conejo de conjugados de PRP de HibLTS61K de la presente invención, resultados del ensayo de títulos bactericidas en sueros de conejo y títulos de Ab antiIgG de PRP. Solo los conjugados de PRPLTS61K fueron capaces de inducir títulos de Ab antiIgG de PRP. La LTS61K añadida adicional en los conjugados de PRPLTS61K no potenció los Ab antiIgG de PRP.
60 La Figura 18 ilustra información adicional sobre el estudio de inmunogenicidad de conejo.
La Figura 19 ilustra resultados de un estudio de inmunogenicidad de conejo de conjugados de PRP de HibLTS61K de la presente invención, resultados de los títulos bactericidas en sueros de conejo (BA) y títulos de Ab antiIgG de
65 PRP (DO).
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45
55
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Se realizaron estudios adicionales empleando los procedimientos y observando los resultados expuestos a continuación:
Se inmunizaron intramuscularmente tres veces y cuatro veces, a intervalos de dos semanas, conejos blancos de Nueva Zelanda usando la dosis humana prevista del polisacárido, polisacárido mezclado con LTS61K y conjugado de polisacáridoLTS61K para evaluar la potencia de las vacunas de conjugado. Ninguna de las preparaciones contuvo AlPO4 u otro adyuvante relacionado. Las respuestas inmunitarias de todas las vacunas se determinaron por ELISA para detectar títulos de antiIgG específica de antígeno de polisacárido y ensayo bactericida en sueros para mostrar la actividad funcional de los anticuerpos antipolisacárido. También se determinaron por ELISA las respuestas de títulos de antiIgG de LTS61K en suero y se usaron la inducción por AMPc de células Caco2 in vitro y el estudio de redondeo de la toxicidad de células suprarrenales Y1 para determinar la capacidad neutralizante de Ab antiLTS61K en suero con LT no mutante. Se realizaron estudios in vivo de exposición al asa ileal de conejo para examinar la función de los anticuerpos antiLTS61K. Los estudios de inmunogenicidad en animal sugieren que la holotoxina de enterotoxina termolábil de E. coli desintoxicada que incluye proteína LTS61K es útil como proteína transportadora de polisacárido para estimular significativamente una respuesta específica de antígenos de polisacárido. LTS61K, ella misma, puede usarse como inmunogén, y, produce eficazmente anticuerpos contra LT no mutante.
A. Estudios de inmunogenicidad de conejo. Inmunización de conejo intramuscular usando 10 ug de dosis de PRP, con artículos de prueba que incluyen: PRP, PRP conjugado con LTS61K y PRP mezclado con LTS61K; se administraron dos y tres refuerzos a intervalos bisemanales. Se recogieron muestras de sangre 14 días después de cada inmunización, y las muestras de suero recogidas se almacenaron a 80 ºC hasta uso.
B. Anticuerpos antipolisacárido y antiLTS61K determinados por ELISA. Se recubrió conjugado de PRPBSA sobre la placa de 96 pocillos en la concentración de PRP a 100 ng/pocillo para la determinación de anticuerpos antiPRP, y se recubrieron con LTS61K a 250 ng/pocillo para la determinación de anticuerpos antiLTS61K. Las placas recubiertas se incubaron durante 16 horas a 4 ºC, y a continuación se incubaron con 5% de leche desnatada como tampón de bloqueo durante una hora a 37 ºC. Los sueros de los animales se probaron a partir de una dilución de
1:50.
Se midieron anticuerpos específicos usando una IgG de cabra anticonejo conjugada con peroxidasa de rábano picante incubada durante 1 hora a 37 ºC, y los anticuerpos se revelaron añadiendo sustrato de TMB (tetrametilbencidina)peroxidasa, y después de 10 minutos, la reacción se terminó mediante la adición de 12% de H2SO4 y la absorbancia se leyó a DO (densidad óptica) 650450 nm (longitud de onda de referencia 650 nm). Los títulos de ELISA se expresaron como la inversa de la última dilución que dio DO 450 ≧ 0,5.
C.
Ensayo bactericida en sueros. Se realizó la actividad bactericida mediada por el complemento dependiente de anticuerpo para los títulos diluidos de suero que destruyeron más del 50% de las colonias de Haemophilus influenzae tipo b (Hib). Se pretrataron muestras de suero a 56 ºC durante 30 minutos para inactivar el complemento de suero de conejo. Se prepararon diluciones sucesivas dobles de las muestras de suero con volumen de 10 ul en placas de fondo en U de 96 pocillos. A continuación, se añadieron 20 ul del cultivo de Hib diluido que se preparó en 1000 UFC/20 ul. Las mezclas se incubaron adicionalmente a 37 ºC con 5% de CO2 durante 15 minutos, y se añadieron 50 ul de 1:1 de complemento de conejo bebé diluido en tampón de Hanks a cada pocillo, y la mezcla se incubó a 37 ºC con 5% de CO2 durante 60 minutos. Se sembraron 5 ul de la mezcla añadida con complemento de conejo bebé en las placas de agar de chocolate, y las placas se incubaron a 37 ºC con 5% de CO2 durante 16 horas. Se contaron las unidades formadoras de colonias de Hib y se determinaron los títulos de dilución de sueros que destruyeron más del 50% de las colonias de Hib. Todas las muestras de suero se comparan con el número recíproco de títulos de dilución en gráficas.
D.
Se realizó inducción del estudio de AMPc en células Caco2 por LT no mutante neutralizada con anticuerpo antisuero de LTS61K de conejo, usando un kit EIA de AMP cíclico (AMPc) (Enzo Life Science). Se incubaron diez nanogramos de LT no mutante con 150 ul de antisuero de conejo de LTS61K (dilución 1:100) a temperatura ambiente. Después de una hora de incubación, la mezcla se añadió a la placa de células Caco2 (5x104 célula/pocillo) y las células Caco2 se incubaron adicionalmente a 37 ºC con 5% de CO2 durante 2 horas. A continuación, las células se lavaron con PBS y se lisaron con HCl 0,1 M (200 ul por pocillo), y se neutralizaron con NaOH 0,1 M. Los productos de la lisis celular se recogieron por centrifugación a 660 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Las suspensiones resultantes se ensayaron para niveles de AMPc intracelular utilizando el kit de EIA comercial.
E.
Se examinó el estudio de neutralización de LT no mutante con diluciones importantes de antisuero de LTS61K de conejo sobre células de tumor suprarrenal de ratón Y1. Para el ensayo de células Y1, se premezclaron diluciones dobles sucesivas de sueros de conejo 50X, 100X a 102, 400X con LT no mutante 105 ug (que es la CE50, que es la concentración de toxina de LT no mutante para producir más del 50% de redondeo de células sobre células suprarrenales Y1), tras la mezcla se añadieron a célula suprarrenal Y1, 5 x 104 células/pocillo. Las células se observaron para cambios morfológicos (redondeo de células) después de 24 horas de incubación.
F.
Estudio de acumulación de fluido en el asa ileal de conejo: La neutralización del anticuerpo de conejo antisuero de LTS61K contra la LT no mutante se realizó en el ensayo de asa ileal de conejo. Se hicieron asas ileales de conejo
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con segmentos de 5,5 cm sobre los conejos después de ser inmunizados con PRP o PRP conjugado con LTS61K o PRP mezclado con LTS61K. Se administraron LT no mutantes en los intervalos de concentración de 0,01 a 1 ug a cada animal del estudio; la cantidad de fluido acumulado en cada segmento se midió después de 18 horas.
5 Resultados del efecto de inmunogenicidad del polisacárido conjugado con LTS61K: estudios preclínicos en mamífero que muestran la eficacia de los conjugados de polisacáridoLTS61K
Los resultados del estudio se describen a continuación con referencia a las Figuras 20 a 23 de los dibujos y las Tablas 3 a 5.
10 Se determinaron anticuerpos para PRP y para LTS61K por ELISA. Los resultados de inmunogenicidad en conejos se mostraron en la Figura 20; solo los conejos administrados con tres inyecciones de conjugados de PRPLTS61K provocan altos títulos de anticuerpos antiIgG de PRP y fueron 1000 veces superiores a PRP o PRP mezclado con LTS61K. La principal inmunoglobulina inducida por la vacuna de conjugado de PRPLTS61K fue IgG. La presencia
15 de alto título de anticuerpo antiIgG de LTS61K no interfirió con la respuesta inmunitaria de Ab antiIgG de PRP.
En la Figura 20, que muestra el ELISA de inmunogenicidad de conejo de los resultados de las respuestas de anticuerpos antiPRP y antiLTS61K, todos los animales recibieron un total de tres dosis intramusculares cada una de 10 ug de PRP conjugado a intervalos de 2 semanas. Se recogieron sueros y se ensayaron una semana después
20 de la dosis 1 (1WPD1), una semana después de la dosis 2 (1WPD2) y dos semanas después de la dosis 3 (2WPD3) como se representa en la Figura 20.
El potencial protector de los anticuerpos antiPRP inducido por los conjugados se evaluó probando la actividad bactericida de los sueros de conejo. Los títulos bactericidas se determinaron contra la cepa Eagen de Haemophilus 25 influenzae tipo b (Hib), los datos se presentaron como la inversa de la dilución del suero que destruyó más del 50% de las colonias de Hib. La Figura 21 muestra que los conejos después de inmunización intramuscular de tres veces, a intervalos de dos semanas, en PRP 10 ug por dosis, los títulos de Ab antiIgG de PRP y bactericidas fueron similares en los tres lotes de conjugados de PRPLTS61K preparados internamente, con las unidades de repetición promedio de PRP conjugado en 40 o 10, y las dosis de conjugados de PRPLTS61K 10 ug/48 ug a 10 ug/30 ug por
30 dosis. Mientras tanto, PRP y PRP mezclado con sueros de conejos inmunizados con LTS61K fueron incapaces de destruir Hib bacteriano, cuyos títulos recíprocos <2, y tampoco pudieron provocar anticuerpos antiIgG de PRP. Solo los conjugados de PRPLTS61K satisfactorios tienen un efecto bactericida con los altos títulos de anticuerpos antiPRP.
35 La Figura 21 muestra el ensayo bactericida en sueros de conejo y respuestas de anticuerpos antiIgG de PRP después de que los conejos recibieran tres dosis intramusculares cada uno de 10 ug de PRP conjugado a intervalos de 2 semanas. Los sueros probados se recogieron en el día 43, dos semanas después de la dosis 3.
Se realizó un estudio de refuerzo en conejos después de recibir una inmunización triple primaria de los conjugados
40 de PRPLTS61K. Los resultados se resumen en la Figura 22, que demostraron que los títulos bactericidas y los títulos de anticuerpos antiIgG de PRP disminuyeron gradualmente con el tiempo, aunque 6WPD3 (6 semanas después de la dosis 3) los títulos bactericidas en sueros de conejo fueron más bajos que en los sueros de conejo 2WPD3, los anticuerpos de conejo antiIgG de PRP de sueros y los títulos bactericidas pudieron potenciarse eficazmente después de una dosis posterior de conjugados de PRPLTS61K. Sin embargo, estos fenómenos no
45 pudieron observarse en PRP o PRP mezclado con conejos inmunizados con LTS61K.
Con respecto a la Figura 22, los conejos se inmunizaron con diferentes relaciones de conjugados de PRPLTS61K. Se obtuvieron sueros en diferentes momentos, y se realizaron ensayos de Ab antiIgG de PRP de ELISA y bactericidas. Los resultados demuestran correlaciones entre los anticuerpos antiIgG de PRP de suero y las
50 actividades bactericidas en suero, y que una 4ª inmunización en conejos con conjugados de PRPLTS61K refuerza eficazmente los Ab antiPRP.
La Tabla 3 muestra que la toxina LT no mutante a 10 ng fue incapaz de estimular un aumento de la liberación intracelular de los niveles de AMPc en células Caco2, solo cuando los sueros de conejo con altos anticuerpos anti
55 LTS61K; aquellos fueron conjugados de PRPLTS61K y PRP mezclado con sueros de conejos inmunizados con LTS61K. A diferencia, los sueros de conejo obtenidos de conejos inmunizados con PRP no previnieron que LT no mutante aumentara los niveles de AMPc en células Caco2.
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Tabla 3: Inducción del estudio de AMPc en células Caco2 por LT no mutante neutralizada con anticuerpo de conejo antisuero de LTS61K.
5
10
Muestras
Conejo inmunizado PRP/LTS61K (ug/ug) cAMP (pmol/mL)
PRPLTS61K conjugado
10/45 3.36
PRPLTS61K conjugado
10/53 2.68
PRP mezclado con LTS61K
10+45 3.31
PRP
10 19.1
Control positivo wt LT 10 ng
30.89
Control negativo PBS
3.09
15 Se realizó un estudio de neutralización de LT no mutante con diluciones sucesivas de conejo antisuero de LTS61K en células tumorales suprarrenales de ratón Y1. Los resultados en la Tabla 4 demuestran que solo aquellos sueros de conejo presentes con los anticuerpos antiLTS61K neutralizan eficazmente la toxicidad de LT no mutante, que se produjo en conjugados de PRPLT61K y PRP mezclado con sueros de conejos inmunizados con LTS61K, pero no
20 en sueros de conejos inmunizados con PRP.
Tabla 4: Estudio de neutralización
25
30
PRP
10 No neutralización
Muestras
Conejo inmunizado PRP/LTS61K (ug/ug) título Y1 neutralización célula adrenal
PRPLTS61K conjugado
10/45 3200 X
PRPLTS61K conjugado
10/53 3200 X
PRP mezclado con LTS61K
10+45 3200 X
Los datos en la Tabla 5 muestran que a la concentración de 0,01 ug por segmento de 5,5 cm del asa ileal la
35 acumulación de fluido de LT no mutante se indujo en el conejo sin anticuerpos antiLTS61K; sin embargo, en el conejo con anticuerpos antiLTS61K, no hubo acumulación de fluido. Estos resultados confirman aquellos previamente obtenidos de la inducción por AMPc de Caco2 in vitro y estudios de neutralización de células suprarrenales Y1, que los anticuerpos antiLTS61K del suero pueden neutralizar LT no mutante. Se observaron lesiones hemorrágicas graves en la mucosa del íleon en el conejo sin Ab antiLTS61K administrado con LT no
40 mutante en 0,5 y 1,0 ug por segmento.
Tabla 5: Estudio de acumulación de fluido en el asa ileal de conejo.
45
50
55
60
Conejo sin antiLTS61K Ab
Conejo Nº 1 con antiLTS61K Ab Conejo Nº 2 con antiLT Ab
Dosis LT Tipo salvaje (ug/segmento)
Acumulación de fluido (mL/segmento)* Lesiones en mucosa del íleon** Acumulación de fluido (mL/segmento) Lesiones en mucosa del íleon Acumulación de fluido (mL/segmento) Lesiones en mucosa del íleon
0
0.0 0.0 0.0
0.01
4.95 0.0 0.0
0.1
8.8 + 0.0 4.4
0.5
10.45 + + No finalizada No finalizada 11.0
1
12.1 + + + 11.0 + 11.0
* La acumulación de líquido se mide en cada segmento de 5,5 cm del asa ileal de conejo. ** Lesiones hemorrágicas severas en la mucosa del íleon se observaron en el conejo sin antiLTS61K Ab administrando LT tipo salvaje en dosis de 0,5 y 1,0 ug por segmento.
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Los resultados de un estudio de inmunogenicidad de animal como un ejemplo de serotipo 14 de polisacárido neumocócico conjugado covalentemente con LTS61K se muestran en la Figura 23. Los títulos de anticuerpos para 5 PNPS serotipo 14 se determinaron por ELISA. Las muestras fueron conjugados de PNPS 14LTS61K con unidades de repetición promedio de PS de 94 o 40, PNPS 14 solo, PNPS 14 mezclado con LTS61K, y PBS. Solo los productos conjugados fueron capaces de inducir altos anticuerpos antiIgG de PNPS 14. La presencia del adyuvante químico, hidróxido de aluminio, durante el programa de inmunización no benefició o mejoró significativamente los anticuerpos antiPNPS 14. 10 La Figura 23 muestra la inmunogenicidad en ratones en conjugados de PS neumocócico serotipo 14LTS61K. Solo los animales administrados con conjugados de PNPS 14LTS61K provocan altos títulos de anticuerpos antiIgG de PS y fueron 500 veces superiores a PNPS 14 o PNPS14 mezclado con LTS61K.
15
20
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45
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Claims (1)

  1. Reivindicaciones
    5 10 15 20 25 30
    1. Un conjugado covalente de un polisacárido y una enterotoxina termolábil (LT) de E. coli desintoxicada, en el que la LT es una holotoxina y es una proteína mutante LTS61K que tiene una sustitución de lisina en la posición correspondiente a la posición 61 de SEC ID Nº: 5. 2. El conjugado covalente de la reivindicación 1, en el que el polisacárido es polirribosil ribitol fosfato (PRP). 3. Una vacuna que comprende un conjugado covalente purificado de la reivindicación 1 o 2. 4. Uso de un conjugado covalente purificado de la reivindicación 1 o 2 en la fabricación de un medicamento para proteger o inmunizar mamíferos de los efectos de bacterias infecciosas. 5. Un método de preparación de un conjugado covalente de la reivindicación 1 o 2 que comprende oxidación con peryodato del polisacárido, seguido de aminación reductora del polisacárido resultante y la proteína mutante LTS61K, y aislamiento del conjugado resultante. 6. El método de la reivindicación 5, en el que el polisacárido es PRP. 7. El método de la reivindicación 6, en el que el intervalo de relaciones molares de PRP:LT está entre aproximadamente 3:1 y aproximadamente 60:1. 8. Uso de un conjugado covalente purificado de la reivindicación 1 o 2 en la fabricación de un medicamento para proteger o inmunizar mamíferos de los efectos de la diarrea del viajero. 9. Uso de un conjugado covalente purificado de la reivindicación 1 o 2 en la fabricación de un medicamento para proteger o inmunizar mamíferos de los efectos de la diarrea de E. coli enterotoxigénica. 10. Uso de un conjugado covalente purificado de la reivindicación 1 o 2 en la fabricación de un medicamento para proteger o inmunizar mamíferos de la infección de Haemophilus influenzae o Streptococcus pneumoniae.
    35
    40
    45
    50
    55
    11
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