JPS5920226A - 動物用ワクチンおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は豚の大腸菌性下痢予防ツクチン、その製造法お
よびそれを用いた豚の大腸菌性下痢の予防法にかんする
。さらに詳しくは豚の下痢症由来大腸菌の産生ずるエン
テロトキシンおよびベロ細胞前と線毛を混合してなる不
活化ワクチン、その製造法およびこれを用いた豚、特に
哺乳子豚の大腸菌性下痢の予防方法にかんする。

豚、／ｌ’ｆ　Ｋ哺乳期の子豚の大腸菌性下痢は高Ｗ４
度に発生し、養豚経営に重大な問題である。

大腸菌による哺乳豚の下痢症の免疫についてはこれまで
に多くの研究がなされている。

０ｏ１１ｂａｃｉｌ：Ｌｏ日ＩＧの予防を目的としたワ
クチンはヨーロッパ諸国ではかなり古くから用いられて
きた。この場合の多くのものは、自家ワクチンあるいは
数種の検出頻度の高い血清型を混合した多価ワクチンが
用いられ、し１ずｉｔも死菌ワクブーンであった。これ
らのワクチンでは０１ブこ（ま■（抗原に対する抗体が
感染防御に開力するとさＡ１、−験的には主とし−Ｃ検
出頻度の高１／）血清型σ）株力（免疫ｎ］わｔ罪とし
て用いられていた〔Ｄａ＋ｎ、Ａ、　（１９６８、）　
、Ｎｏｒａ。

ｖｅｔ、　Ｍｅｄ、、　２０４４９　４５７　）、　Ｇ
ａｙ、　ｃ、ｃ、ｅ　（１９６４）。

Ｃａｎ、　Ｖｅｔ、Ｊ、、　５　、　２９７−３０８　
〕ｏし力）し、こｉｔらのワクチンによる予防は必１゛
シも一定した成ＩＮの得られない場合が多いという欠点
カミあつブこ。

近年毒素原性大腸菌の産生ずるＬＴ（易閉＼性毒素〕お
よびＳＴ（耐熱性毒素）力（−Ｆｕｌｌ因子として重視
されるに至り、これを用し１ブこワクブー／に１児１−
る報告が次第に多くなって（／する。たとえ（ま、Ｌ１
１ワクチンを皮下筐たは乳腺内に接１ｆｆｉして免疫−
リ−る方法（］Ｊｏｂｒｏ８ｃｕとＩ−１ｕｙｌ−１ｕ
ｙ　（１，９７３）、Ｚｅｎｔｒａ’ｂｌ。

ｖｅｔｅｔｌｎａｅｍｅｄ、、Ｔ３．　　且、　　２２
２−２２９　）、　　Ｉ）ｏｂｒｅｓｃａと　Ｚｙｇｒ
：１．ｉｃｈ　　（１９７６）Ｐｒｏｃ−ｐｉｇ、Ｖｅ
ｔ；　、Ｓｃ１．−、．１９７Ｇ（Ｊｏｎｇ、　、Ｌｏ
ｗｎ、　Ｕ、Ｓ、Ａ　］とＬ　Ｉｌｌ’ｌ’、Ｓ　１ｉ
１４＝閑体ワクブーンを用い−Ｃ母子免疫し、２０〜３
０日＋１１１σ）子ＩＨＫサラｖｃ　ｅｕｂ　免疫する
方法（１：’ｅｓｔｉ、　Ｌ−ａ　（１９７６）Ｐｒｏ
ｃ　、Ｉｎｔ　、Ｐｉｇ、Ｖｅｔ、Ｓｏｃ　ｊｌ　１９
７６０ｕｙｇ、、　Ｉｏｗａ、　Ｕ、Ｓ、Ａ：］が、そ
れぞれ有効であったと報告されている。

このようにエンテロトキシンのうち、ＬＴワクチンを用
いたものが多いが、Ｌ’ｌ’、ＳＴ　　株ワクチンでは
強力な免疫が得られるが、ＬＴ　、　　ＳＴ−株を用い
た場合には抗毒素の産生あるいは感染防御能も低かった
という報告もある（　Ｋ１．１ｐｅｔｅｉｎ、　Ｆ、Ａ
、５（１９８１）ＩｒｉｆｅｃｔＪｍｍｕｎ、、　３２
．１１００−１１０４］。

Ｓ′］１を用いたワクチンについての報告も次第に多く
なっているＣ　Ｍｙｅｒｓ、　Ｌ、Ｌ、ｓ’　（１９７
３）、　Ａｍ、Ｊ。

ＶｅＪＵＬｅｇ、、　３４．２９　３３）。

ペロ細胞毒は、豚の下痢材料からしばしば分離され、下
痢発生に何らかの役割を果たしているものと思われてい
る。

近年感染の初期の段階における菌の表層構造とｍ主ｍ織
の表面とのかかわり合いが重視されるようになり、とく
に線毛がそれへの接着因子として注目されるようになっ
た。

線毛保有株をワクチンとして用いた例としては、Ｋ９９
と９８７Ｐ線毛を用いたものがあり［Ｍｏｒｇａｎ。

１？、、Ｌ、ｅ’　（１９７８）、　Ｉｎｆｅｃｔ、］
、’ｍ＋ｎｕｎ、、　２２．７７１−７７７３、その有
効性が確認されたが、異種の線毛保有株に対しては感染
を防御せず免疫学的にはそれぞれの純毛の特異性が証明
された。

他方、線毛保有株の線毛を精製したワクチンを母豚の免
疫に用い、初乳を介して子豚を免疫したところ、子豚は
その攻撃をよく防御ｌ、たとしＡう報告もあるＩ：　Ｎ
ａｇ３’、　［（，９’　（１９７Ｂ　）、　Ｉｎｆｅ
ｃｌ；、１．ｍｍｕｎ。

２１．２６９−２７４）。

これらのエンテロトキ・／ン゛または腺毛を甲（／また
ワクブ〉・のほか生菌ワクチンとして０．０４％ホルマ
リン加弱毒ワクチンの母豚経口捜方による免疫が有効で
あるどいわれている［　Ｗｉｌｎｏｕと５ｖｅｎｄθθ
ｎ（１’）７１．）、　、Ａ＋ｎ、ＪＪｅｔ；、１Ｌｅ
ｅ、３２．８９１−８９８．その他１゜ 以」二のように、従来知られでいる１ｌｉｌｔ乳豚の大
腸菌性下痢症に苅するワクチンは、（１）検出頻度の高
いＯ抗原型を用いた多価ワクチン、（２）　Ｌ　’Ｌ’
またはＳ　ｉ’を用いたエンテロトキ／ンワクプーン、
（３）　Ｋ　８８　。

■（９９または９８７Ｐなどの線毛を用いた純毛ワクチ
ンの三つに要約で、Ｉｌる。

しかしながら、上記（１）の検出頻度の高いＯ抗原型を
用いた多価ワクチンは、必らずしも一定した予防効果が
得られない場合が多いといわれ、人の場合と異り、家蓄
下痢症からいわゆる病原性大腸と呼ばれている特定のＯ
抗原大腸菌が分離されることは貫れであり、家蓄の下痢
症の場合、検出頻度の高い０群を特定することが困難で
あるので、従って、家蓄の大腸菌性下痢症には必ずしも
有効でない場合が多かった。

また、（２）　Ｌ　’Ｌ’またはＳＴを用いたエンテロ
トキシンワクチンは、Ｌ’Ｉ’ｌたはＳＴの関与する下
痢症の場合についてはともかく、一般の家蓄大腸菌性下
痢症には必ずしも全て有効であるとは限らなｌ／１゜ 更に（３）Ｉ（８８，Ｋ　９９または９８７Ｐなどの純
毛を用いた線毛ワクチンは、これらの三線毛がそれぞれ
抗原性が異なり、かつそれぞれの線毛保有菌株が家蓄の
大腸菌性下痢症に分布していることから、従来のこれら
線毛の単独を使用したワクチンは効果が必ずしも高いと
は云えなかった。

これまでの大腸菌に関する研究の進歩のうちある過程で
は、ＬＴまたはＳＴエンテロトキシン保有菌株は、上述
のいずれかの純毛をもっていることが多いとされ、従っ
て、これらエンゾロトキシン（ＬＴまたはＳＴ）と線毛
、さらにペロ細胞毒を混合する必要性は思いもよらない
ことであった。

ところがエンゾロトキシンの産生性と線毛の保有とは必
ずしも深い関連のないことは下表に示すごとく本発明者
らの調査研究の結果からも明らかであり、従って、全て
の大腸菌性下痢症に有効なワクチンは、これらを全て保
有しなければならないであろうことが示されている。

エンテロトキシン、ペロ細胞毒および 純毛の関係 Ｍ　　１．、ｒ　Ｔ″−易熱性エンテロトキシン産生性
ＳＴ′□＋−耐Ｊ／ ＶＴ　　ヘロ細胞）Ｕｑ ＬＴ　　ＳＴ　ＶＴ−いずれも非産生 さらに本発明者らの野外におりる哺乳豚の大腸菌性下痢
症の発生状況の調査により、分娩後１週間以内の下痢の
発生がほとんどであることから、この時期における免疫
学的予防が最も頂要であることが判った。

また、従来報告されている線毛保有株に頻度の高いＯ抗
原型の存在［０１ｓｓｏｎ、　Ｅ。Ｏ′（１９８０）。

Ｐｒｏｃ、Ｉｎｔ、ＰｉｇＮｅｔ、　　Ｓｏａ、　　１
　９　８００ｏｎｇ＋＋　　Ｏｏｐｅｎｈａｇｅｎ。

Ｊ”１４３．：ｌ、ＳＴ保有株の多くが■（９９紳毛を
もつこと［０ｏｎｔｒｅｐｏｉｓ、　Ｍ、ｅ・（１９７
９）几ｅｃ、へ４ｅｄ、、　Ｖｅｔ、、。

１５５．５５３−５５８］　、Ｋ８８線毛保有株にＬＴ
青素産生株が多いこと〔几ｅｎａｎｌｔ、　ＪＪ、　ｎ
’　（１９８０）。

Ａｎｎ　、几ｅｃｈ、Ｖｄｔ、、　９．４２７−４３２
　）などは本発明者らの調査（前出表参照）では必ずし
もそうでなく、０・Ｋ　血清型、エンテロトキシン産生
性、線毛保有株などの間に４Ｊ直接の関連性がないこと
が判った。

さらに、従来の報告ではに８Ｂ＋％！毛保有株は豚下痢
症由来株に多く　、Ｋ　９９　線毛は牛−ｆ痢症由来株
に多いとされていたが、本発明者らは必ずしもそうでは
なく　９８７　Ｐ　純毛を含めて、これらのすべてが免
疫原として必要であることを見出した。

本発明は、このような知見に基いて完成されたものであ
り、その目的は、豚特にＩｌｌ乳子豚の大腸菌性下痢予
防のためのワクチン、その製造法およびそれを用いた原
管に子豚の大腸菌性下痢の予防方法を提供することにあ
る。

本発明において使用されるエンテロトキシンは易熱性毒
素（ＬＴ）および耐熱性毒素（ＳＴ）であって、豚の下
痢症由来大腸菌（０−５，０−１５３株などによって産
生される。ペロトギシン産生大腸菌株としてけ０−１１
２株などがある。また、線毛保有株としては、大腸菌株
ｖ　−ｓ　ｏ、　ｏ−１２６゜Ｃ−７２株などがあげら
れる。

これらの大腸菌株は、本発明者らが大腸菌性下痢症から
分離したＥ、ｃｏｌｉ　０　５　（受託書、［微工研菌
寄第６６１５号、■几ＭＰ−６６１５Ｊ）、Ｅ。

ｃｏｌｉＯ−７２（受託書、１−微工研菌寄第６６１４
号、Ｉ’Ｅ几Ｍ　Ｐ　−６６１４Ｊ）、Ｅ、　ｃｏｌｉ
　０−１１２　（受託書、「微工研菌寄第６６１３号、
ＦＥ几Ｍｌ）−６６１３Ｊ）、Ｅ、ｃｏ］、１０−１２
６　（受託■゛、［微工研菌寄第６６１２号、ＦＥＩＬ
Ｍ　Ｆ−６６１２ｊ　）、Ｅ、ｃｏｌｉＯ−１５３（受
託■、１−微工研菌寄第６６１６号、ＦＪｉＲＭ　Ｐ−
（ｉ６１６Ｊ）Ｊ６　　よ　び　Ｃｅｎｔｒａｌ　　Ｖ
ｅじｅｒｉｎａｒｙ　　Ｌａｂｏｒｓ七ｏｒｖ、Ｗｔ〕
ｙｂｒｉ〔］ｇｏ。

Ｅｎｇｌａ、ｎｄから分与されたｖ−５０株である。

エンテロ！・ギシン（Ｌ　’Ｊ’およびＳ　’ｆ’　）
およびベロ細胞毒産生大腸菌の培養４．１、通常の、７
１Ｊ素産生性の良い培地として多用されている培地例え
ばＩ弓ｖａｎｓ変法培地などを用いて行うことができる
。純毛保有大腸菌を培養１−る培地としでは、通常の線
毛の発育をよくする培地であればよく、例えばＭｉｎｃ
ａ変法培地などをあげることができる。

これら前記毒素や純毛の不活化は、ワクチンの不活化に
通常使用されるポルマリンなどによつ−Ｃ行われる。

ワクチンの効果を高める補助物質として、公知の効果増
強物質、たとえばアルミニウムゲルを加えるこ七も推奨
さ１する。

本発明において使用される豚の大腸菌性下痢予防用ワク
チンの１’ｊＪ造法の一態様を述べれは以下の通りであ
る。

エンテロトキシン（ＬＴおよび８Ｔ）およびベロ細胞毒
産性株をＥｖａｎｓ変法培地で３７℃２４時間撮トウ培
養（ホぼ８．０−４．５　Ｘ　１０　０ＦＵ／ｍｌの菌
数どなる）後、８０００ｒ、ｐ、ｍ　４５分遠心分離し
た上清を０．４５μｍのミリポアフィルタで洲過後、０
、５％にポルマリンを加え、３７℃２４時間ふ卵器にお
き、ときどき振とうしてエンテロトキシンおよびベロ細
胞毒を含む免疫原を得る。他方、Ｋ２Ｓ、に９９および
９８７Ｐなど線毛保有株をＭｉｎｃａ変法培地に３７℃
２４晴間培養後、ＰＢＳを加えて集菌し、ガー　ゼで濾
過後５　ＸＩＯ”　’ＯＦ　Ｕ　／　ｍｌ　（Ｃ菌撮度
を調製し、０．５％にポルマリンを加えて３７℃ふ卵器
に２４時間おき、ときどき振とうして線毛を含む免疫原
を得る。

次いで、上記２種の免疫原をそれぞれ等量に混合した後
、６〜７　ｍｇ　／　ｍｅにアルミニウムゲルを加えて
不活化ワクチンを調製した。

このようにして調製された本発明のワクチンの使用例の
態様を述べれば以下の通りである。

分娩予定のほぼ１か月前の妊娠母豚に本ワクチンを１週
問おきに２〜３回皮下またけ筋肉内に接ｆｉｌｉ　して
分娩後の１ＱＩｔ乳により初乳を弁じて子豚に抗体を得
さ・Ｕることができる。

このような大腸菌性下痢予防方法の別法としては、分娩
予定のほぼ１か月前の妊娠ｔＵ豚を前記不活化ワクチン
で免疫（１週問おきに２〜３回皮下または筋肉内注射）
して、分娩時の初乳中の抗体を子豚が哺乳することによ
り初乳を介した感染防御抗体を受動的に受りた１ｌｔｆ
ｉ乳子豚の抗体の持続は３〜４週＋１１Ｊであるので、
この時期の子豚に能動免疫（１週問おきに２〜３回、皮
下′または筋肉内ときに経口的に投与９を与えるという
方法を挙げることができる。

１だ、このワクチンは哺乳子豚ばかりでなく、疫学的に
大腸菌性下痢症の発生が疑われる場合、とくに幼若豚を
中心に育成中のあらゆる豚への応用も省えられる。

以下に本発明の詳細な説明するが、本発明はＵつしでそ
れのみに限定されるものではない。

実施例１ １、エンテロトキシンおよびベロ細胞７Ｕ生産用培地：
　［１ｉｖａｎｓ、　１．）、Ｇｅ’（Ｉｎｆｅｃｔ、
１ｍｍｕｎ、、　７．８７３−８８０．１９７３）の培
地に０．２５％にグルコースを加えた。

：Ｅｖａｎｎ変法（液体）培地を用いた。その組成は下
記のとおりである。

カザミノ酸（ＤＪｆｃｏ　Ｌａｂ、　）　　　　２０．
Ｏｆイーストエキス（”　　）　　　　　１．５ｒ食塩
　　　（関東化学ＫＫ）　　　’２．５ｒＫ２Ｂ１ＰＯ
ａ　（０，０５Ｍ）　　（・）　　　　　、）　　　　
　　　　　　８．７　１９グルコース　　（”　　　）
　　　　２．５ｆ微景塩溶鹸　　　　　　　　　　　’
１．．　Ｏｍｅ蒸留水　　　　　　　　　　　　　１．
０００　ｍ１ｐＪ１８．５ ＊微：ｆｆｉ：溶液の組成 Ｍｇ　ＳＯ４７Ｉ：Ｔ２０　　（関東化学１（Ｉ（）　
　１０．（ＩＭｎ　０１２４　Ｈ２０（和光紬薬工業Ｋ
Ｋ　）　　１．、　ＯｆＦｅＯＺ′３６Ｈｇｏ　　　　
　（）　　　０．１３５ｒＣａＣ１２２）１２０　　（
関東化学ＫＩ（）　　　０．４９蒸留水　　　　　　　
　　　　１．０００ｒｎ／２、線毛ワクチン生産用培地
　：　Ｇｕｉｎｅｅ、　Ｐ、、Ａ　、Ｍ。

ら（１，’ｎ、ｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、、　１５．６７
６−６７８．１’９７７　）とＧｒａａｆ、　Ｉｒ、に
−ｓ’　（Ｉｎｆｅｃｔ、１ｍｍｕｎ、、　２７．２１
６−２２１．１９８０）によるＭｉｎｃａ培地に０１９
６にイーストエギス（、’ＤｉｆｃｏＬａｂ。）と１９
６にｉｅｏ　−Ｖｉｔａｌｅｘ（、Ｂ、Ｔ３Ｌ）’１加
えたＭｉｎｃａ変法寒天平板培地を用いた。その組成は
下記のとおりである。

Ｋｉ（ｇＰＯａ　　（関東化学１Ｇ（）　　　’ｉ、ａ
６ｒＮａ２［（ＰＯａ２Ｉ（２０（Ｉｌ）　　　　１０
．１　？グルコース　（リ　　）　　　　　］、、ｌｌ
カザミノ酸　（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂ、　）　　　　　１
．Ｏｆイーストエキス（Ｉｌ）　　　　　１．ｏｒ寒　
　天　　　　　　（”　　　　）　　　　　１２．Ｏｆ
微量塩溶液＊１．　Ｏｍｌ １日ｏ　　−Ｖｉｔａｌｅｘ（Ｊ３ＢＬ　）　　　　　
　　　　　　１０．０ｍｅ（無菌的に加える） 蒸留水　　　　　　　　　　　　１．０００　ｍＡＰ１
１７．５ ＊微舟塩溶液の組成はＪｉｆｖａｎ日変法培地の場合と
同様である。。

３、エンテロトキシンおよびベロ細胞毒の生産；前記１
．の割合で作ったＪＣｖａｎθ変法（液体〕培地２００
ｍｅを５００ｍ／！の長頒コルベンに入れ、１５ポンド
１５分高圧滅菌する。この培地にこれらの要素産生株（
０−５，０−１５３，０−１１２株）の各々の種培養（
内径約１．０×高さ約９．０　ｃｍの小試験管を用いた
市販されているＢ　ＪＥ　Ｌ社のトリプチケースソイ寒
天斜面培地に２０〜２４時間３７℃培養〕から２〜３エ
ーゼづつを移殖して、２４時間、３７℃恒温槽で振盪培
養すると３．０〜４．５Ｘ１０１００　Ｆ　Ｕ　／ｒｒ
ｔの菌濃度となる。この菌液を８．０ＯＯｒ、ｐ。

ｍ４５分遠心分離（１００＋＋＋／容の遠心管使用）し
だ上清を０．４５μｍのミリポアフィルタ−で−過（９
０Ｍｍステンレスフィルターホルダーを使用、加圧）稜
、それぞれの菌株を等量に混合した（操作中の損失があ
り、概ね各法の上清は１５０〜１７０ｍｅとなる）。こ
のようにして４５０〜５１０ｍ１！のエンテロトキシン
およびベロ細胞拷が得られるので、これに０．５％にホ
ルマリンを加え、３７℃のふ卵器に２４時間置き、とき
どき振盪した。さらにアルミニウムゲルを６〜７　ｍ９
　／　ｍｅの割合に加えて、これを不活化ワクチンとし
て用いた。

４・、純毛ワクチンの生産：前記２．の割合で作ったＭ
ｌｎｃａ変法寒天平板培地を１５ボンド１５分間滅菌後
、Ｎｅｏ　−’Ｖｉｔａｌｅｘ　（、’Ｂ　Ｂ　Ｌ　、
）を無菌的に加え、内径約７．６　ｔｒｕｎ　ｘ高さ約
１．５流ｍの７ヤーレーに２０Ｉｎ／！ツつ１０枚のソ
ヤーレーに分注する　この培地に前記８．の種培養から
１エーゼづつを培地面に塗布し、３７℃、２４時間ふ卵
器に静１〃シて培養する。各株１０枚づつのシャーレ分
用いる。培養後ＰＢＳをシャーレ１枚に３〜Ｓ　ｍｅづ
つ加えて集菌し、滅菌ガーナで瀝過しく各法３０〜５０
ｍ１！の濃厚菌液を得る）、　　５　Ｘ　１０　０ＦＵ
／ｍ（！ＶＣなるように菌濃度をＭｃ　Ｆｎ、ｒｌａｎ
ｄまたは０］〕メーターを用いてＰ　Ｂ　Ｓで調製し、
その各ノｌ（Ｖ−５０，０−１２６，０−７２）の菌液
を等用づつ混合し、これに０．５９６にホルマリンを加
え、３７℃ふ卵器に２４時間置き、ときどき振盪し−Ｃ
不活化する。これにさらにアジュバントとじ−Ｃアルミ
ニウムゲルを前記３．と同じ割合で加え、これを不活化
線毛ワクチンとし１＝　。

５、用法：実験的には８４のワクチンをそれぞれ単独捷
たは等量に混合して用いた。

実施例２ 本発明の不活化ワクチンの効果を示す実験例についで以
下に述べる。

妊娠母豚をエンテロトキシン（ＬＴおよびＳＴ産生株〕
とペロ細胞毒（ＶＴ産生株）抗原あるいは線毛（Ｋ２Ｓ
、に９９および９８７Ｐ線毛保有株）抗原または両抗原
を混合した本発明の不活化ワクチンで免疫し、分娩後の
哺乳子豚に経口的に攻撃して感染防御試験を行った（第
１表）。

エンテロトキシンとベロ細胞毒抗原によって免疫した母
豚から生まれた子豚は初乳を介してエンテロトキシンお
よびペロ細胞毒産生株の攻撃によく耐える移行抗体を受
け、下痢を発症しないが、免疫母豚の初乳を飲ませなか
った人工乳の子豚ではその攻撃を防御することができな
かった。

一方、線毛ワクチンによる免疫母豚から生まれた子豚に
ついてもほぼ同様の成績であったが、エンテロトキシン
産生株の攻撃に対しては防御できなかった。

さらに、これらの感染防御試験σ〕成績を裏（−１４す
るように寒天ゲル内沈降反応によつ−（エンテロトキシ
ンおよびペロ細胞毒での免疫により低しλなカ；らＬＴ
、Ｓ’ｌ’およびＶＴ抗体σ）産生を認Ｖ）、免４．１
した母豚から生まれた子豚の結紮腸管ループ攻撃試験で
ＳＴに対する何らかの防御物質力（初乳を介して哺乳子
豚に伝達されていることなど力（確認できた。

まＡ−、一方の線毛ワクチンで免疫した母豚血清。

初乳乳清，哺乳子豚血清などに（：１免疫に川１，Ｎた
に８Ｂ，に９９および９８７Ｐなどの純毛に対する抗線
毛凝集価の上昇が認められた，、 これらの実験結果から、エンテｒ−１１・＝Ｖーシン単
独寸たは線毛ワクチン単独では豚の大腸菌性下°痢症を
完全に防１卜することはできず、−→だコーンｉーロト
ギシンにおい°ＣはＬＴとＳＴとは抗原性が違し＼、三
線毛もそれぞれ抗原性が特異的であるσ）−Ｃ、それぞ
れｃツノ単独では完全な効果は期待てきなし）。

それに反し、本発明の混合ツクチンを検力された母豚か
ら母乳を介して免疫を受けた子豚４ｊｉ　ｕ％　ｉ″れ
の型の大腸菌性下痢症にも耐え得た。

すなわち、本発明のワクチンには２種の免疫原（抗原）
が含まれている。一つはエンテロトキシン（ＬＴおよび
ＳＴを含む．）とベロ細胞毒よりなる免疫原であり、他
の一つけ線毛（　Ｋ　８８，　Ｋ９９および９８７Ｐを
含む）を免疫原とするものである。

このワクチンの特徴Ｇ」、これら２種の免疫原を同時に
ｊｐいるこ七であり、そわぞれ単独での免疫効果は望め
ないとの前記実験的根拠によるものである（第１表）。

第１表 エンテロトキシン（ＬＴ，　８Ｔ　）およびベロ細胞毒
（ＶＴ）、純毛（Ｋ８　８，　Ｋ９　９，　９　８　７
　Ｐ　）　、、その両者の混合などを免疫原どした母子
免疫による感染防御試験 Ａ、　Ｂ、　０．　Ｄ、は用いたワクチンおよび攻撃用
菌株である。

ペロトキシン 実施例３ 実施例２の実験的研究の成果を実施例３ではそれを野外
試験（台湾省萌栗養豚センター）・によって確認しよう
としたものである。

実施例１で得られたワクチンｌＯｍ（！づつを分娩予定
のけば１か１前の妊娠母豚１９頭に２週問おきに２回耳
根部の筋肉内に注射した。上記のセンターにおりる母豚
のＬＴ抗体はＸ２〜４であった。

無処詔対照として同様の母豚５頭には生理食塩水を供試
ワクチンと同舟注射した。第２表に示すように出生子豚
数は混合ワクチン接種群１６６頭、無処置対照群４４頭
であった。これらの内、混合ワクチン接Ｊｉｌｔ群は生
後７日目寸でに１９頭（１１，４％）の下痢が発生した
が、死亡例は０であったのに対し、無処置対照群では生
後７日目までに１８頭＜４０．９９６）の下痢が発生し
、内４頭が死亡しま た。

これに対し、実験例１で用いたエンゾロトキシンとベロ
細胞簿および純毛ワクチンのそれぞれを上述の混合ワク
チンとほぼ同様の条件下でそれぞれ７および９頭の母豚
に接種した後出生した６２および８１頭の分娩子豚につ
いて観察したところ、両者共に２２％のものが下痢を発
症した。明らかに無処置対照群の４０．９％の発生率と
は異なっており、それぞれのワクチンの効果が認められ
るものの上述した混合ワクチンにはかなり劣る成績であ
った（第２表）８ 第２表 エンテロトキシン（ＬＴ、　８Ｔ　）おヨヒヘロ細胞毒
、純毛（Ｋ２Ｓ、に９９，９８７Ｐ）およびそれらの混
合ワクチンを用いた浦乳子豚の大腸菌性下痢症予防の野
外試験 この成績から、ツを外試験でも本発明ワクチンの下痢予
防効果が確認された。なお、混合ワクチン接イ＋ｎ　Ｉ
Ｙと無処置対照群の体１．増加率を見ると混合ワクチン
接種群のほうの生育が良１ｔｒであることが判った１１
才だ、両群ともに下痢の坤因菌となったＦｊ、（！ｏｉ
ｉは０８　：　Ｋ９１．　Ｉ、Ｔ−’、　９８７Ｐであ
った。

実施例４ 実施例１で得られた混合ワクチンを生後１〜１．５か方
今の離乳期の子豚の耳根部筋肉内に２週問おきに５　ｒ
Ｍづつ２回注射し、２回注射彼１か月間観察した。その
成績を第３表に示し、た１、使用した子豚は苗栗蓄産セ
ンターのもので、句豚にはワクチンは捜方され−Ｃいな
い。対照群に比べ下痢の発生率はかなり低く、本発明ワ
クチンの効果が確認された。

第３表 エンｒ＋：＋）ギシン（Ｌ’ｌ”、ＳＴ）およびベロ細
胞毒と純毛ｕ（ｏｓ、に９９，９８７Ｐ）を用いた混合
ワクチンによる１ｌｊｌ＃乳期子豚：’ｌ＝　、−ト痢
予防の野外試＊生後１〜１．５か月 ＊＊観察１か月

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、豚の下痢症由来大腸菌の産生ずるエンテトロキシン
   およびペロ細胞毒と線毛を混合して不活化ワクチンとし
   たことを特徴とする動物用ワクチンリ ２、豚の大腸菌性下痢症用ワクチンである１特許請求の
   範囲第１項記載のワクチン。 ３、子豚の大腸菌性下痢症の予防のための不活化ワクチ
   ンである特許請求の範囲第１項記載のワクチン。 ４、エンテロトキシン（ＬＴおよびｓＴ）およびベロ細
   胞毒を含む免疫原と線毛（Ｋ８８．　Ｋ９９および９８
   ７Ｐ線毛）を含む免疫原を等量に混合し、これにアルミ
   ニウムゲルを加えてなる特許請求の範囲第１項、第２項
   、第３項記載のワクチン。 ５、エンテロトキシン（Ｌ’ｌ’およびＳＴ）およびペ
   ロ細胞毒産生大腸菌株を培養後遠心分離した上清を無菌
   派過し０５％ｍになるようにホルマリンを加え、３７℃
   ２４時間時々振とうしつつインキユヘートシて得られた
   エンテトロキシン洗浄びベロ細胞１１１を含む免疫原と
   線毛保有大腸菌株を培養後、Ｐ　’＋３８　（＋７ン酸
   緩衝食塩水）を加えて集菌し、濾過後５　Ｘ　１０　０
   Ｆ　Ｕ／ｍｅの菌濃度の菌液を調製し、０．５％濃度に
   ポルマリンを加えて３７℃２４時間時り振とうしつつイ
   ンキュベーｉ・して得られた線毛を含む免疫原とを、そ
   れぞれ等量に混合した後、６〜７　ｍ９７　ｍｅにアル
   ミニウムゲルを加えることを特徴とする動物用ワクチン
   の製造法。 ６、分娩予定のほぼ１か月前の妊娠母豚に！（ゲ８′［
   請求の範囲第１項記載の不活イヒワクチン全１週問おき
   に２〜３回皮下または筋肉内に接種して免疫し、分娩後
   の哺乳により初乳を介して子豚に抗体・壬得させしめる
   ことを）時機とするｌ１ｊｔ７乳子豚の大腸菌性下痢を
   予防する方法。 ７、不活化ワクチンにより免疫した母豚より初乳を介し
   て感染防御抗体を受動的に受けたＩＩＪ乳子豚にさらに
   離乳期前接に能動免疫することを特徴とする子豚の大腸
   菌性下痢を予防する方法。 ８、特許請求の範囲第１項記載の不活化ワクチンを投与
   することを特徴とする上記以外の時期における豚の大腸
   菌性下痢を予防する方法。