ES2541933T3 - Método para predecir la respuesta al tratamiento farmacológico con chaperona de enfermedades - Google Patents

Abstract

Una chaperona farmacológica específica para α-Gal A para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry en un paciente que expresa una forma mutante de α-Gal A y que se ha determinado que responde al tratamiento con una chaperona farmacológica específica, donde se determina que el paciente responde al tratamiento con la chaperona farmacológica específica para α-Gal A mediante un método que comprende a. sembrar unas primeras y segundas células huésped en un recipiente de ensayo; b. poner en contacto las primeras células huésped con la chaperona farmacológica específica para α-Gal A; y c. comparar la actividad de α-Gal A en las segundas células huésped que no están en contacto con la chaperona farmacológica específica, con la actividad de α-Gal A en la primera célula huésped que está en contacto con la chaperona farmacológica específica, donde la chaperona farmacológica específica para α-Gal A es 1-desoxigalactonojirimicina o una sal farmacéuticamente aceptable de esta; las primeras y segundas células huésped son células HEK-293 MSR que expresan la forma mutante de α-Gal A del paciente; y donde: un incremento de 1.3 a 40 veces más en la actividad de α-Gal A en las primeras células huésped que están en contacto con la chaperona farmacológica específica en comparación con la actividad de α-Gal A expresada por las segundas células huésped que no están en contacto con la chaperona farmacológica específica; o una actividad de α-Gal A en las primeras células huésped que están en contacto con la chaperona farmacológica específica de al menos aproximadamente un 2-100% de la actividad de α-Gal A de células HEK-293 MSR que expresan una forma natural de α-Gal A; indica que el paciente responderá al tratamiento con la chaperona farmacológica específica.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para predecir la respuesta al tratamiento farmacológico con chaperona de enfermedades

Campo de la invención

La presente invención proporciona métodos para determinar si un paciente con la enfermedad de Fabry se beneficiaría del tratamiento con una chaperona farmacológica específica. La presente descripción también 5 proporciona un método in vitro para determinar la capacidad de respuesta enzimática (p. ej., α-galactosidasa A, α-glucosidasa o glucocerebrosidasa) a una chaperona farmacológica (p. ej., 1-desoxigalactonojirimicina, 1-deoxinojirimicina o isofagomina) en una línea celular que expresa una forma mutante de la enzima. La descripción también proporciona un método para diagnosticar un trastorno por acumulación lisosomal (p. ej., enfermedad de Fabry, enfermedad de Pompe o enfermedad de Gaucher) en pacientes que se sospecha que padecen un trastorno 10 por acumulación lisosomal y para implementar el tratamiento adecuado en función del diagnóstico (p. ej., elegir un agente terapéutico particular que administrar al paciente).

Antecedentes

En el cuerpo humano, las proteínas están involucradas en casi todos los aspectos de la función celular. Las 15 proteínas son cadenas lineales de aminoácidos que se pliegan y enroscan en formas tridimensionales específicas para funcionar correctamente. Determinadas enfermedades humanas son el resultado de mutaciones que provocan cambios en la secuencia de aminoácidos de una proteína, los cuales reducen su estabilidad y pueden impedir que se pliegue de manera apropiada. La mayoría de las mutaciones genéticas que conducen a la producción de proteínas menos estables o con un plegamiento erróneo se denominan mutaciones en sentido erróneo. Estas 20 mutaciones provocan la sustitución de un aminoácido simple por otro en la proteína. Debido a este error, las mutaciones en sentido erróneo generalmente dan como resultado proteínas que tienen un nivel reducido de actividad biológica. Aparte de las mutaciones en sentido erróneo, también hay otros tipos de mutaciones que pueden dar lugar a proteínas con actividad biológica reducida.

Las proteínas generalmente se pliegan en una región específica de la célula conocida como el retículo endoplásmico 25 o RE. La célula tiene mecanismos de control de calidad que aseguran que las proteínas se plieguen en la forma tridimensional correcta antes de que puedan partir del RE hacia el destino apropiado en la célula, proceso al que generalmente se hace referencia como tráfico de proteínas. Las proteínas con plegamiento erróneo generalmente se eliminan por los mecanismos de control de calidad luego de ser inicialmente retenidas en el RE. En determinadas instancias, las proteínas con plegamiento erróneo pueden acumularse en el RE antes de ser eliminadas. 30

La retención de proteínas con plegamiento erróneo en el RE interrumpe su tráfico apropiado y la actividad biológica reducida resultante puede conducir a una función celular deficiente y finalmente a una enfermedad. Además, la acumulación de proteínas con plegamiento erróneo en el RE puede conducir a diversos tipos de tensión en las células, lo cual también puede contribuir a la disfunción celular y la enfermedad.

Las enfermedades por acumulación lisosomal (LSD, por sus siglas en inglés) se caracterizan por deficiencias de las 35 enzimas lisosomales debido a mutaciones en los genes que codifican las enzimas lisosomales. Esto produce la acumulación patológica de los sustratos de dichas enzimas, que incluyen lípidos, carbohidratos y polisacáridos. Existen aproximadamente cincuenta LSD conocidas a la fecha, las cuales incluyen la enfermedad de Gaucher, la enfermedad de Fabry, la enfermedad de Pompe, la enfermedad de Tay Sachs y las mucopolisacaridosis (MPS). La mayoría de las LSD se heredan como un rasgo autosómico recesivo, aunque los varones con la enfermedad de 40 Fabry y MPS II son hemicigotos ya que los genes de la enfermedad se codifican en el cromosoma X. Para la mayoría de las LSD, no se dispone de ningún tratamiento aparte del tratamiento sintomático. Para varias LSD, incluidas Gaucher, Fabry, Pompe y MPS I y VI, se dispone de la terapia de reemplazo enzimático (TRE) que utiliza enzimas recombinantes. Para la enfermedad de Gaucher, también se dispone de la terapia de reducción de sustrato (TRS) en situaciones limitadas. La TRS emplea una pequeña molécula inhibidora de una enzima requerida para la 45 síntesis de glucosilceramida (el sustrato GD). El objetivo de la TRS es reducir la producción del sustrato y reducir la acumulación patológica.

Si bien hay muchos genotipos mutantes diferentes asociados con cada LSD, algunas de las mutaciones, incluidas algunas de las mutaciones más prevalentes, son mutaciones en sentido erróneo que pueden conducir a la producción de una enzima menos estable. Estas enzimas menos estables a veces se degradan prematuramente por 50 el sistema de degradación asociado al RE. Esto produce la deficiencia de la enzima en el lisosoma y la acumulación patológica de sustrato. A veces, en la técnica correspondiente, se hace referencia a dichas enzimas mutantes como “mutantes de plegamiento” o “mutantes conformacionales”.

Diagnóstico de la enfermedad de Fabry 55

Debido a que la enfermedad de Fabry es poco común, implica múltiples órganos, tiene una franja de aparición etaria

amplia y es heterogénea, un diagnóstico adecuado supone un reto. Es poco conocida entre los profesionales sanitarios y los diagnósticos erróneos son frecuentes. Algunos ejemplos de diagnósticos seriamente considerados en pacientes a los que finalmente se les diagnosticó la enfermedad de Fabry incluyen: prolapso de la válvula mitral, glomerulonefritis, proteinuria idiopática, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Whipple, abdomen agudo, colitis ulcerativa, porfiria aguda intermitente y neoplasia maligna oculta. Así pues, incluso para los varones 5 tradicionalmente afectados, el diagnóstico requiere aproximadamente 5-7 años o incluso más. Esto resulta preocupante, ya que cuanto más tiempo padezca una persona la enfermedad de Fabry, más probable será que se produzca un daño mayor en los órganos y tejidos afectados, y que el estado de la persona empeore. El diagnóstico de la enfermedad de Fabry se suele confirmar sobre la base de una disminución de la actividad de α-Gal A en leucocitos plasmáticos o periféricos (LEU), una vez que un paciente es sintomático, acompañada de un análisis 10 mutacional. En mujeres, el diagnóstico supone un reto aún mayor ya que la identificación enzimática de mujeres portadoras es menos fiable debido a la inactivación aleatoria del cromosoma X en algunas células de las portadoras. Por ejemplo, algunas portadoras obligadas (hijas de varones tradicionalmente afectados) tienen actividades enzimáticas de α-Gal A que varían de actividades normales a muy bajas. Debido a que las portadoras pueden tener una actividad enzimática de α-Gal A normal en leucocitos, únicamente la identificación de una mutación en α-Gal A 15 mediante pruebas genéticas proporciona una identificación de portadoras y/o un diagnóstico preciso.

Tratamiento de la enfermedad de Fabry

Una terapia autorizada para tratar la enfermedad de Fabry es la terapia de reemplazo enzimático, que suele implicar la infusión intravenosa de una forma purificada de la proteína natural correspondiente (Fabrazyme®, Genzyme 20 Corp.). Una de las principales complicaciones con la terapia de reemplazo proteínico es la obtención y el mantenimiento de cantidades terapéuticamente eficaces de proteína in vivo debido a la rápida degradación de la proteína infundida. La estrategia actual para superar este problema es llevar a cabo numerosas y costosas infusiones de dosis altas.

La terapia de reemplazo proteico presenta varios riesgos adicionales, como dificultades para la generación a gran 25 escala, purificación y acumulación de una proteína debidamente plegada; obtención de una proteína glucosilada natural; generación de una respuesta inmunitaria anti-proteína; e incapacidad de la proteína para atravesar la barrera hematoencefálica para mitigar las patologías del sistema nervioso central (es decir, baja biodisponibilidad). Además, la enzima de reemplazo no puede penetrar en el corazón o el riñón en cantidades suficientes para reducir la acumulación de sustrato en los podocitos renales o miocitos cardiacos, que aparecen predominantemente en la 30 patología de Fabry.

También se está perfeccionando la terapia génica con vectores recombinantes, que contienen secuencias de ácidos nucleicos que codifican una proteína funcional, o con células humanas modificadas genéticamente, que expresan una proteína funcional, para tratar deficiencias proteínicas y otros trastornos que se beneficien del reemplazo proteínico. 35

Una tercera estrategia relativamente reciente para tratar algunas deficiencias enzimáticas implica el uso de pequeñas moléculas inhibidoras para reducir la producción del sustrato natural de las proteínas deficientes en enzimas, de este modo se atenúa la patología. Esta estrategia de “reducción de sustrato” ha sido específicamente descrita para una clase de aproximadamente 40 trastornos enzimáticos relacionados conocidos como trastornos por acumulación lisosomal que incluyen trastornos por acumulación de glucoesfingolípidos. Las pequeñas moléculas 40 inhibidoras propuestas para emplear como terapia son específicas para inhibir las enzimas implicadas en la síntesis de glucolípidos, reducir la cantidad de glucolípidos celulares que ha de ser metabolizada por la enzima deficiente.

Se ha demostrado anteriormente que la unión de pequeñas moléculas inhibidoras de enzimas asociadas con las LSD puede aumentar la estabilidad tanto de la enzima mutante como de la enzima natural correspondiente (remítase a las Patentes de EE. UU. N.o 6.274.597; 6.583.158; 6.589.964; 6.599.919; 6.916.829 y 7.141.582). En particular, se 45 descubrió que la administración de pequeñas moléculas derivadas de glucosa y galactosa, que son inhibidores competitivos, selectivos y específicos de varias enzimas lisosomales objetivo, aumentó eficazmente la estabilidad de las enzimas en células in vitro y, por lo tanto, aumentó el tráfico de las enzimas al lisosoma. De este modo, al aumentar la cantidad de enzima en el lisosoma, se espera que aumente la hidrólisis de los sustratos enzimáticos. La teoría original que respalda esta estrategia es la siguiente: dado que la proteína enzimática mutante es inestable en 50 el RE (Ishii et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996; 220: 812-815), la proteína enzimática se retarda en la vía de transporte normal (RE → aparato de Golgi → endosomas → lisosoma) y se degrada prematuramente. Por lo tanto, un compuesto que se une a una enzima mutante y aumenta su estabilidad puede servir como “chaperona” para la enzima y puede aumentar la cantidad que puede salir del RE y trasladarse hacia los lisosomas. Además, debido a que el plegamiento y el tráfico de algunas proteínas naturales es incompleto, degradándose más del 70% de algunas 55 proteínas naturales en algunos casos antes de llegar a su ubicación celular final, las chaperonas se pueden utilizar para estabilizar enzimas naturales y aumentar la cantidad de enzima que puede salir del RE y trasladarse a los lisosomas. Se ha demostrado que esta estrategia aumenta varias enzimas lisosomales in vitro e in vivo, entre ellas β-glucocerebrosidasa y α-glucosidasa, cuyas deficiencias están relacionadas con las enfermedades de Gaucher y de

Pompe, respectivamente.

Sin embargo, como se indicó anteriormente, los candidatos aptos para la terapia con SPC deben tener una mutación que provoque la producción de una enzima que tenga el potencial para ser estabilizada y plegada en una conformación que permita su tráfico de salida del ER. Las mutaciones que truncan sumamente la enzima, como mutaciones sin sentido o mutaciones en el dominio catalítico que previene la unión de la chaperona, no tendrán 5 tantas posibilidades de ser “salvables” u “optimizables” empleando terapia con SPC, es decir, responder a la terapia con SPC. A pesar de que las mutaciones en sentido erróneo externas al sitio catalítico tienen más posibilidades de ser salvables empleando SPC, no existe garantía, se requiere una detección de mutaciones sensibles. Esto quiere decir que, incluso cuando la enfermedad de Fabry se diagnostique detectando actividad deficiente de α-Gal A en LEU, es muy difícil, si no imposible, predecir si un paciente con Fabry particular responderá al tratamiento con una 10 SPC sin beneficio de la presente invención. Además, dado que los LEU sobreviven únicamente un corto periodo de tiempo en cultivo (in vitro), la detección de la estimulación de α-Gal A por acción de SPC es difícil y no es óptima para el paciente.

Para aplicar la terapia con SPC de forma eficaz, se debe adoptar un método rápido, eficaz y de amplia aplicación para detectar la capacidad de respuesta de los pacientes a la terapia SPC antes de iniciar el tratamiento. El 15 tratamiento se puede implementar en función de los resultados de la detección. Por lo tanto, en la técnica siguen requiriéndose métodos relativamente no invasivos para evaluar rápidamente la estimulación enzimática con terapias potenciales antes de tomar decisiones sobre el tratamiento, por cuestiones de beneficios tanto de costos como emocionales del paciente.

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Resumen de la invención

La invención es definida por las reivindicaciones adjuntas.

Una realización de la presente invención proporciona un método para determinar si un paciente será un candidato 25 para la terapia con SPC. Específicamente, la presente descripción proporciona un ensayo in vitro para evaluar la actividad de la proteína en presencia o ausencia de una SPC, donde una SPC que aumenta la actividad de la proteína en el ensayo in vitro es una SPC que se puede emplear en la terapia con SPC. En una realización, el ensayo in vitro comprende expresar una proteína mutante en una célula huésped, poner en contacto la proteína mutante con una SPC candidata y determinar si la proteína mutante que está en contacto con la SPC presenta un 30 mayor nivel de actividad (preferentemente un aumento estadísticamente significativo) en comparación con una proteína mutante expresada en una célula huésped que no está en contacto con la SPC candidata. Cuando una SPC candidata aumenta la actividad de una proteína mutante de acuerdo con el ensayo de la invención, dicha SPC candidata se puede emplear para la terapia con SPC para tratar a un paciente que expresa la misma proteína mutante estudiada en el ensayo in vitro. 35

En una realización, la proteína es una enzima. En otra realización, la proteína es una enzima lisosomal. En otra realización más, la proteína es una α-galactosidasa A (α-GAL; α-GAL A). En otras realizaciones, la proteína es una alfa-glucosidasa (α-glucosidasa ácida; α-glucosidasa; GAA). En otras realizaciones, la proteína es una glucocerebrosidasa (β-glucosidasa; Gba; GCase). 40

La presente descripción también incluye la base para la evaluación de SPC como una opción de tratamiento para un número cualquiera de otras anomalías proteicas y/o deficiencias enzimáticas y/o trastornos por plegamiento de proteínas.

La presente invención proporciona además un registro por escrito (p. ej., una “tabla de tratamiento de referencia”) que enumera mutaciones proteicas y la capacidad de respuesta de cada una de las mutaciones a la terapia con 45 SPC. Esta lista se puede emplear para determinar las opciones de tratamiento para un paciente, de forma que el paciente o médico o médico especialista del paciente pueda seleccionar la estrategia terapéutica adecuada, por ejemplo, una SPC para el tratamiento por identificación de la mutación proteica del paciente y remisión de la mutación a la lista para identificar si una SPC aumentaría la actividad de la enzima mutante particular del paciente.

En otra realización, la “tabla de tratamiento de referencia” enumera mutaciones para una enzima lisosomal y la tabla 50 de tratamiento de referencia se emplea para determinar la mejor estrategia terapéutica para tratar un trastorno por acumulación lisosomal. La proteína es α-Gal A y la enfermedad es la enfermedad de Fabry. En otras realizaciones de la descripción, la proteína es GAA y la enfermedad es la enfermedad de Pompe. En otras realizaciones, la proteína es Gba y la enfermedad es la enfermedad de Gaucher.

En una realización, la tabla de tratamiento de referencia describe formas mutantes de enzima, tal como una enzima 55 lisomal (p. ej., α-Gal A, Gcase y GAA) y las opciones de tratamiento están establecidas para los trastornos por acumulación lisosomal (p. ej., enfermedad de Fabry, Gaucher y Pompe).

En una realización, la descripción también proporciona métodos para crear una tabla de tratamiento de referencia,

en los cuales la tabla de tratamiento de referencia puede ser para cualquier trastorno por plegamiento de proteínas o trastorno tratable con una SPC. Esta clase de enfermedad incluye el resto de trastornos por acumulación lisosomal, fibrosis cística (CFTR) (células epiteliales respiratorias o de glándulas sudoríparas), hipercolesterolemia familiar (receptor de LDL; LPL-adipocitos o células endoteliales vasculares), cáncer (p53; PTEN-células tumorales) y amiloidosis (transtiretina) entre otros. 5

En otra realización, la presente descripción proporciona métodos para tratar a un paciente que se ha diagnosticado expresa ciertas proteínas mutantes (p. ej., enzimas lisosomales como α-GAL A), en el que la actividad de la proteína mutante (p. ej., α-Gal A), cuando se expresa en una célula huésped, se puede incrementar al administrar una SPC para esa proteína (por ejemplo, 1-deoxigalactonojirimicina, DGJ, como una SPC para α-GAL A mutante).

La presente descripción también proporciona kits diagnósticos que contienen los componentes requeridos para 10 llevar a cabo el ensayo.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A-C muestra un listado de mutaciones de Fabry generadas por mutagénesis dirigida. El texto indica si 15 las células HEK-293 que expresan cada una de las mutaciones enumeradas responden al tratamiento con DGJ en el ensayo de transfección transitoria: cursiva=no se ha ensayado aún; negrita y subrayado=no responde a DGJ; texto normal (sin cursiva, ni negrita, ni subrayado)= responde a DGJ.

La Figura 2A-C muestra la capacidad de respuesta de diferentes mutaciones de α-Gal A al tratamiento con DGJ. La 20 magnitud del incremento en los niveles de actividad de α-Gal A después del tratamiento con DGJ y los valores de CE50 se enumeran para cada mutación ensayada en la Figura 1A-D que respondió al tratamiento con DGJ. El incremento en la actividad enzimática se muestra como un porcentaje de actividad de α-Gal A natural.

La Figura 3 muestra ejemplos representativos de respuestas de α-Gal A natural y mutante al tratamiento con DGJ. La actividad de α-Gal A (expresada como nmol/mg de proteína/h de 4-MU liberada) se midió en lisados preparados a 25 partir de células HEK 293 transfectadas incubadas con concentraciones crecientes de DGJ. Una respuesta dependiente de la concentración típica se muestra para L300P y una respuesta negativa típica a DGJ se muestra para R227Q. La natural presenta una actividad basal elevada y por lo tanto no responde a DGJ en este ensayo.

La Figura 4 muestra que la respuesta a mutaciones en células HEK 293 es comparable a la de linfocitos T, linfoblastos o leucocitos derivados de pacientes in vivo. Los niveles de α-Gal A medidos en tres ensayos diferentes, 30 presentados como porcentaje natural, se comparan para cada mutación examinada. Los niveles de α-Gal A se midieron en linfocitos T, linfoblastos, leucocitos y células HEK 293 que expresan α-Gal A mutante antes y después de la exposición a DGJ. Las barras vacías indican el nivel basal (sin tratamiento con DGJ) y las barras llenas indican un nivel elevado después del tratamiento con DGJ.

La Figura 5 muestra que las mutaciones de α-Gal A que responden a DGJ están ampliamente distribuidas en la 35 secuencia proteica de α-Gal A. Las mutaciones de Fabry ensayadas se muestran en la estructura de α-Gal A secundaria. No se observó correlación significativa entre la repuesta y la ubicación en la secuencia proteica de una mutación, lo que sugiere que tanto las mutaciones sensibles como las que no lo son están ampliamente distribuidas a lo largo de toda la proteína. El color del texto indica la respuesta a DGJ: verde=responde; rojo=no responde; marrón indica que, de las múltiples mutaciones en esa misma ubicación, algunas respondieron al tratamiento con 40 DGJ, mientras que otras no respondieron.

La Figura 6 muestra los pares de oligonucleótidos cebadores empleados para generar las mutaciones puntuales en el gen α-Gal A por mutagénesis dirigida.

La Figura 7 muestra la secuencia de ADNc de α-Gal A que fue mutada por mutagénesis dirigida.

La Figura 8 muestra el efecto del tartrato de isofagomina en macrófagos y linfoblastos derivados de pacientes que 45 se aislaron de pacientes con la enfermedad de Gaucher con diferentes mutaciones en su enzima glucocerebrosidasa (Gba; GCase).

La Figura 9 muestra el efecto sobre los niveles de GL-3 en ratones hR301Q -Gal A Tg/KO macho de ocho semanas que se trataron durante 4 semanas con 300 mg/kg de DGJ en agua potable diariamente o con menos frecuencia (4 días de toma/3 días de descanso). 50

La Figura 10 muestra un listado de mutaciones de Pompe generadas por mutagénesis dirigida. El texto indica si las células COS-7 que expresan cada una de las mutaciones enumeradas responden al tratamiento con DNJ en el ensayo de transfección transitoria.

La Figura 11 muestra la secuencia de ácidos nucleicos de la alfa-glucosidasa (GAA) lisosomal humana (N.o de

acceso a GenBank: Y00839).

La Figura 12 muestra la capacidad de respuesta de cuatro mutaciones de GAA diferentes al tratamiento con DNJ en concentraciones de 0 µM, 20 µM, 50 µM y 100 µM. El incremento en la actividad enzimática se muestra como actividad específica (nmol/mg de proteína/hora). La Figura 12 también muestra que el DNJ fomentó el procesado de GAA en las formas de 95 / 76 / 70 kDa. 5

La Figura 13 muestra la capacidad de respuesta de fibroblastos derivados de pacientes con Pompe al tratamiento con DNJ. Los fibroblastos eran homocigóticos para la mutación P545L o R854X de GAA.

La Figura 14 muestra la CE50 para la actividad de GAA inducida por DNJ en células HEK-293 transfectadas de forma transitoria con la mutación P545L de GAA.

La Figura 15 muestra la capacidad de respuesta de linfocitos derivados de pacientes con Pompe al tratamiento con 10 DNJ. Los linfocitos eran homocigóticos para el defecto por corte y empalme de GAA (IVS1AS, T>G, -13) y una mutación por cambio de marco de GAA.

La Figura 16 muestra la secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico de la alfa-glucosidasa (GAA) lisosomal humana (N.o de acceso a GenBank: Y00839).

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Descripción detallada

La presente descripción proporciona un ensayo in vitro para poder determinar de forma exacta si una SPC estimula la actividad de una proteína mutante.

En una realización, la proteína es una enzima lisosomal, en la cual la enzima lisosomal, cuando muta, provoca un 20 trastorno por acumulación lisosomal. Los conceptos de la presente descripción, sin embargo, se pueden aplicar globalmente a cualquier enfermedad o afección caracterizada por proteínas mutantes susceptibles a la terapia con SPC, en la que las proteínas tienen una o más mutaciones específica que se pueden generar in vitro, por ejemplo, por mutagénesis dirigida.

En una realización específica, la invención proporciona métodos para determinar si una SPC estimula la actividad 25 enzimática de una enzima α-Gal A mutante y, por lo tanto, se puede utilizar como tratamiento terapéutico eficaz para un paciente con la enfermedad de Fabry que expresa la misma mutación α-Gal A.

En otra descripción específica, la invención proporciona métodos para determinar si una SPC estimula la actividad enzimática de una enzima GAA mutante y, por lo tanto, se puede utilizar como tratamiento terapéutico eficaz para un paciente con la enfermedad de Pompe que expresa la misma mutación GAA. 30

En otra realización específica, la descripción proporciona métodos para determinar si una SPC estimula la actividad enzimática de una enzima Gba mutante y, por lo tanto, se puede utilizar como tratamiento terapéutico eficaz para un paciente con la enfermedad de Gaucher que expresa la misma mutación Gba.

De acuerdo con los métodos de la presente descripción, se proporcionan ensayos que permiten determinar si un paciente que expresa una enzima lisosomal mutante será un candidato para la terapia con SPC. El nuevo ensayo in 35 vitro es extremadamente sensible y se puede llevar a cabo en una célula huésped transfectada con un constructo de ácido nucleico que codifique una enzima lisosomal mutante. Las SPC candidatas específicas se pueden ensayar posteriormente para determinar si la SPC candidata es capaz de incrementar la actividad de la enzima mutante expresada por la célula huésped. Así pues, a diferencia de ensayos que emplean células derivadas de un paciente con un trastorno por acumulación lisosomal, el ensayo de la invención evita pasos lentos como la recogida de una 40 muestra de un paciente, la purificación de células de la muestra y el cultivo de las células de la muestra in vitro.

La presente descripción también proporciona un método para determinar si un paciente que expresa una proteína mutante (p. ej., una enzima lisosomal) será un candidato para la terapia con SPC, en el que una persona, por ejemplo, el médico o el especialista del paciente, puede buscar la proteína mutante (p. ej., una mutación de una enzima lisosomal) en una tabla de tratamiento de referencia para determinar si la mutación del paciente responderá 45 a la terapia con SPC. La tabla de referencia se genera a partir de los resultados del análisis in vitro de la respuesta a SPC en una línea celular que ha sido transformada con un vector de ácido nucleico que codifica la proteína mutante.

Además, la descripción también proporciona una “tabla de tratamiento de referencia” que proporciona información que indica si una SPC particular será una terapia apta para estimular la actividad de una mutación de enzima 50 lisosomal específica. La tabla de tratamiento de referencia proporciona información que indica si una SPC candidata puede incrementar la actividad de una enzima lisosomal mutante expresada por una célula huésped. En función de la respuesta de diferentes mutaciones a diferentes terapias con SPC, la presente invención puede proporcionar una

terapia con SPC que se ajuste a la mutación específica del paciente.

En una realización no limitante, la proteína mutante es una enzima lisosomal mutante, como por ejemplo, una α-Gal A, GAA o Gba mutante, y la línea celular se transfecta con un vector de ácido nucleico que codifica la enzima lisosomal mutante.

En otra realización no limitante, la presente descripción proporciona un método para tratar a un paciente con Fabry 5 que incluye el paso de administrar al paciente con Fabry una dosis terapéuticamente eficaz de 1-desoxigalactonojirimicina (DGJ), donde el paciente expresa una α-Gal A mutante, cuya actividad, cuando se expresa en una célula huésped, se puede aumentar si se pone en contacto con una SPC (p. ej., DGJ). Tales mutaciones de α-Gal A que se pueden tratar de acuerdo con este método incluyen, pero no se limitan a, mutaciones A121T, A156V, A20P, A288D, A288P, A292P A348P, A73V, C52R, C94Y, D234E, D244H, D244N, D264Y, E338K, E341D, E358K, 10 E398K, E48K, E59K, E66Q, F113L, G144V, G183D, G260A, G271S, G325D, G328A, G35R, G373D, G373S, H225R, I219N, I242N, I270T, I289F, I303N, I317T, I354K, I91T, L14P, L166V, L243F, L300F, L310F, L32P, L45R, M267I, M284T, M296I, M296V, M72V, M76R, N224S, N263S, N298K, N298S, N320I, N320Y, N34K, P205R, P259L, P265L, P265R, P293A, P293S, P409S, P40L, P40S, Q279E, Q279H, Q279R, Q280H, Q280K, Q312H, Q321E, Q321R, Q327E, R301P, R342Q, R363C, R363H, R49G, R49L, R49S, S201Y, S276N, S297C, S345P, T194I, 15 V269M, V316E, W340R, W47L y W95S.

En una realización, las siguientes mutaciones de α-Gal A quedan excluidas de los métodos para tratar a un paciente con Fabry con una dosis terapéuticamente eficaz de DGJ: D244N, E358K, E59K, E66Q, G183D, G325D, I289F, I91T, L45R, M296V, N263S, N320Y, P205R, P40S, Q279E, R342Q, R363C, R49L, V316E.

Una ventaja del ensayo descrito por la presente invención es su amplio espectro de aplicación a pacientes que son 20 mujeres con un trastorno por acumulación lisosomal ligado al cromosoma X, como la enfermedad de Fabry. Debido a la inactivación del cromosoma X, una muestra extraída de una paciente que es una mujer comprenderá tanto células sanas normales como células mutantes con deficiencia enzimática. Un ensayo para determinar el efecto de SPC sobre dicha muestra mostrará una estimulación de la actividad enzimática debido a la expresión de enzimas naturales normales de las células sanas incluso en el caso en que las células enfermas con la enzima mutante 25 puede que no respondan al SPC. La presente invención vence este obstáculo gracias a que una línea celular transfectada con un vector que codifica una proteína mutante expresará únicamente la forma mutante de la proteína y, por lo tanto, no existirá ninguna proteína natural expresada por la línea celular para provocar dicha pseudoestimulación observada en los ensayos con células derivadas de los pacientes.

En otra realización no limitante, la presente descripción proporciona un método para tratar a un paciente con Pompe 30 que incluye el paso de administrar al paciente con Pompe una dosis terapéuticamente eficaz de 1-desoxinojirimicina (DNJ), donde el paciente expresa una GAA mutante, cuya actividad, cuando se expresa en una célula huésped, se puede aumentar si se pone en contacto con una SPC (p. ej., DNJ). Tales mutaciones de GAA que se pueden tratar de acuerdo con este método incluyen, pero no se limitan a, mutaciones E262K, P266S, P285R, P285S, L291F, L291H, L291P, M318K, G377R, A445P, Y455C, Y455F, P457L, G483R, G483V, M519V, S529V, P545L, G549R, 35 L552P, Y575S, E579K, A610V, H612Q, A644P y ΔN470.

En otra realización no limitante, la presente descripción proporciona un método para tratar a un paciente con Gaucher que incluye el paso de administrar al paciente con Gaucher una dosis terapéuticamente eficaz de isofagomina (IFG), donde el paciente expresa una Gba mutante, cuya actividad, cuando se expresa en una célula huésped, se puede aumentar si se pone en contacto con una SPC (p. ej., IFG). 40

Definiciones

Los términos utilizados en la presente descripción generalmente tienen los significados habituales que se les dan en la técnica, dentro del contexto de la presente invención y en el contexto específico en el que se emplea cada 45 término. A continuación, o en cualquier otra parte en la descripción, se describen algunos términos para proporcionar una orientación adicional para el especialista mediante la descripción de las composiciones y métodos de la invención, cómo producirlos y utilizarlos.

El término “enfermedad de Fabry” se refiere a un error ligado al cromosoma X del catabolismo de glucoesfingolípidos debido a una actividad de α-galactosidasa A lisosomal deficiente. Este defecto provoca la acumulación de 50 globotriaosilceramida (trihexósido de ceramida) y glucoesfingolípidos relacionados en lisosomas endoteliales vasculares del corazón, los riñones, la piel y otros tejidos.

El término “enfermedad de Fabry atípica” se refiere a pacientes con manifestaciones fundamentalmente cardiacas de la deficiencia de α-Gal A, es decir, la acumulación progresiva de globotriaosilceramida (GL-3) en células miocárdicas que produce la hipertrofia del corazón, particularmente del ventrículo izquierdo. 55

Un “portador” es una mujer que posee un cromosoma X con un gen α-Gal A defectuoso y un cromosoma X con el gen normal, y en la cual la inactivación del cromosoma X del alelo normal está presente en uno o más tipos de

células. Un portador suele ser diagnosticado la enfermedad de Fabry.

El término “enfermedad de Pompe” se refiere a una LSD autosómica recesiva caracterizada por una actividad de alfa-glucosidasa ácida (GAA) deficiente que altera el metabolismo glucogénico lisosomal. La deficiencia enzimática provoca la acumulación glucogénica lisosomal y produce debilitamiento progresivo de los músculos esqueléticos, función cardiaca reducida, insuficiencia respiratoria y/o deterioro del SNC en las últimas etapas de la enfermedad. 5 Las mutaciones genéticas en el gen GAA resultan en una término menor o producen formas mutantes de la enzima con una estabilidad alterada y/o una actividad biológica que provoca, en última instancia, la enfermedad (remítase generalmente a Hirschhorn R, 1995, Glycogen Storage Disease Type II: Acid α-Glucosidase (Acid Maltase) Deficiency, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, Scriver et al., eds., McGraw-Hill, Nueva York, 7.a ed., páginas 2443-2464). Las tres formas clínicas reconocidas de la enfermedad de Pompe (infantil, juvenil y en 10 adultos) se correlacionan con el nivel de actividad residual de la α-glucosidasa (Reuser A J et al., 1995, Glycogenosis Type II (Acid Maltase Deficiency), Muscle & Nerve Supplement 3, S61-S69). Las ASSC (a las cuales también se hace referencia en otras partes como “chaperonas farmacológicas”) representan una nueva estrategia terapéutica prometedora para el tratamiento de enfermedades genéticas, como los trastornos por acumulación lisosomal (p. ej., enfermedad de Pompe). 15

La enfermedad de Pompe infantil (de tipo I o A) es la más común y más grave, caracterizada por el retraso del crecimiento, hipotonía generalizada, hiperrofia cardiaca e insuficiencia cardiorespiratoria en el segundo año de vida. La enfermedad de Pompe juvenil (de tipo II o B) es de gravedad intermedia y está caracterizada por unos síntomas musculares predominantes sin cardiomegalia. Los individuos con Pompe juvenil suelen morir antes de cumplir 20 años por insuficiencia respiratoria. La enfermedad de Pompe en adultos (de tipo III o C) suele presentarse como 20 miopatía progresiva lentamente en la adolescencia o en edades tan tardías como los 60 años (Felice K J et al., 1995, Clinical Variability in Adult-Onset Acid Maltase Deficiency: Report of Affected Sibs and Review of the Literature, Medicine 74, 131-135).

En Pompe, se ha demostrado que la α-glucosidasa se modifica extensamente postraslacionalmente por glucosilación, fosforilación y procesado proteolítico. Se requiere la conversión del precursor de 110 kilodalton (kDa) 25 en formas maduras de 76 y 70 kDa por proteolisis en el lisosoma para una catálisis glucogénica óptima.

Como se emplea en la presente, el término “enfermedad de Pompe” se refiere a todos los tipos de enfermedad de Pompe. Las formulaciones y las pautas posológicas divulgadas en esta solicitud se pueden emplear para tratar, por ejemplo, la enfermedad de Pompe de tipo I, tipo II o tipo III.

El término “enfermedad de Gaucher” se refiere a una deficiencia de la enzima lisosomal β-glucocerebrosidasa (Gba) 30 que metaboliza glucocerebrósidos grasos. La grasa se acumula posteriormente, mayoritariamente en el hígado, el bazo y la médula ósea. La enfermedad de Gaucher puede producir dolor, fatiga, ictericia, lesión ósea, anemia e incluso la muerte. Existen tres fenotipos clínicos de la enfermedad de Gaucher. Los pacientes con Gaucher de tipo 1, que se manifiesta a edad temprana o a edad adulta temprana, sufren equimosis fácilmente y experimentan fatiga debido a la anemia, nivel bajo de plaquetas en sangre, hipertrofia del hígado y el bazo, debilitamiento del esqueleto y 35 en algunos casos presentan insuficiencia pulmonar o cardiaca. No hay signos de que afecte al cerebro. En el tipo II, de aparición temprana, la hipertrofia del hígado y el bazo aparece a los 3 meses de edad y afecta de forma extensiva al cerebro. La tasa de mortalidad es elevada a los 2 años. El tipo III se caracteriza por hipertrofia del hígado y el bazo e ictus cerebrales. El gen de la β-glucocerebrosidasa está localizado en el cromosoma 1q21 humano. Su precursor proteico contiene 536 aminoácidos y su proteína madura tiene una longitud de 497 40 aminoácidos.

Un “paciente” se refiere a un sujeto que ha sido diagnosticado o se sospecha que padece una enfermedad particular. El paciente puede ser humano o animal.

Un “paciente con la enfermedad de Fabry” se refiere a un individuo al que se ha diagnosticado o se sospecha que padece la enfermedad de Fabry y presenta una α-Gal A mutada como se define más adelante. Los marcadores 45 característicos de la enfermedad de Fabry se pueden presentar en hemicigotos de hombre y mujeres portadoras con la misma prevalencia, aunque las mujeres suelen verse afectadas con menor intensidad.

Un “paciente con la enfermedad de Pompe” se refiere a un individuo al que se ha diagnosticado o se sospecha que padece la enfermedad de Pompe y presenta una GAA mutada como se define más adelante.

Un “paciente con la enfermedad de Gaucher” se refiere a un individuo al que se ha diagnosticado o se sospecha que 50 padece la enfermedad de Gaucher y que presenta una Gba mutada como se define más adelante.

“α-Galactosidasa A (α-Gal A) humana” se refiere a una enzima codificada por el gen GLA humano. La enzima α-Gal A humana está conformada por 429 aminoácidos y tiene el N.o de acceso a GenBank U78027.

En una realización no limitante, la alfa-glucosidasa lisosomal humana (α-glucosidasa ácida; GAA) es una enzima lisosomal que hidroliza polímeros ligados con enlaces alfa-1,4 y alfa-1,6 a D-glucosa presentes en glucógeno, 55

maltosa e isomaltosa. Los nombres alternativos son los siguientes: glucoamilasa; 1,4-α-D-glucano glucohidrolasa; amiloglucosidasa; gamma-amilasa; y exo-1,4-α-glucosidasa. El gen GAA humano ha sido localizado en el cromosoma 17q25.2-25.3 y presenta las secuencias de nucleótidos y aminoácidos descritas en el N.o de acceso a GenBank Y00839.

El término “gen Gba humano” se refiere al gen que codifica la β-glucosidasa ácida, a la que también se hace 5 referencia como glucocerebrosidasa o Gba. El gen Gba pertenece al cromosoma 1q21 e implica a 11 exones (N.o de acceso a GenBank J03059). También existe un pseudogen homólogo localizado aproximadamente 16 kb en dirección 3’ del gen Gba (N.o de acceso a GenBank M16328).

La “proteína Gba humana” se refiere a la proteína Gba humana natural. La proteína Gba está compuesta por 536 aminoácidos y tiene el N.o de acceso a GenBank J03059. 10

El término “proteína mutante” incluye una proteína que presenta una mutación en el gen que codifica la proteína que provoca la incapacidad de la proteína para adoptar una conformación estable en las condiciones que suele presentar el RE. El no poder adoptar una configuración estable hace que una cantidad sustancial de la enzima sea degradada, en vez de ser transportada al lisosoma. Una mutación de este tipo se conoce a veces como “mutación conformacional”. Estas mutaciones incluyen, pero no se limitan a, mutaciones en sentido erróneo y pequeñas 15 deleciones e inserciones en fase.

Como se emplea en la presente en una realización, el término “α-Gal A mutante” incluye una α-Gal A que presenta una mutación en el gen que codifica α-Gal A que provoca la incapacidad de la enzima para adoptar una conformación estable en las condiciones que suele presentar el RE. El no poder adoptar una configuración estable hace que una cantidad sustancial de la enzima sea degradada, en vez de ser transportada al lisosoma. 20

Los ejemplos no limitantes de mutaciones de α-Gal A asociadas con la enfermedad de Fabry que producen una α-Gal A inestable incluyen: L32P; N34S; T41I; M51K; E59K; E66Q; I91T; A97V; R100K; R112C; R112H; F113L; T141L; A143T; G144V; S148N; A156V; L166V; D170V; C172Y; G183D; P205T; Y207C; Y207S; N215S; A228P; S235C; D244N; P259R; N263S; N264A; G272S; S276G; Q279E; Q279K; Q279H; M284T; W287C; I289F; M296I; M296V; L300P; R301Q; V316E; N320Y; G325D; G328A; R342Q; E358A; E358K; R363C; R363H; G370S; y P409A. 25

Como se emplea en la presente en una realización, el término “GAA mutante” incluye una GAA que presenta un mutación en el gen que codifica GAA que provoca la incapacidad de la enzima para adoptar una conformación estable en las condiciones que suele presentar el RE. El no poder adoptar una configuración estable hace que una cantidad sustancial de la enzima sea degradada, en vez de ser transportada al lisosoma.

Como se emplea en la presente en una realización, el término “Gba mutante” incluye una Gba que presenta un 30 mutación en el gen que codifica Gba que provoca la incapacidad de la enzima para adoptar una conformación estable en las condiciones que suele presentar el RE. El no poder adoptar una configuración estable hace que una cantidad sustancial de la enzima sea degradada, en vez de ser transportada al lisosoma.

Como se emplea en la presente, el término “chaperona farmacológica específica” (“SPC”) o “chaperona farmacológica” se refiere a cualquier molécula incluida una pequeña molécula, proteína, péptido, ácido nucleico, 35 carbohidrato, etc. que se une específicamente a una proteína y tiene uno o más de los siguientes efectos: (i) fomenta la formación de una conformación molecular estable de la proteína; (ii) promueve el tráfico de la proteína desde el RE hasta otra ubicación celular, preferentemente una ubicación celular nativa, es decir, evita la degradación de la proteína asociada con el RE; (iii) evita la agregación de proteínas con plegamiento erróneo; y/o (iv) restaura o incrementa al menos la función natural y/o la actividad parcial de la proteína. Que un compuesto se 40 una específicamente a una enzima, p. ej., α-Gal A, GAA o Gba, quiere decir que se une y ejerce un efecto de chaperona sobre la enzima, y no sobre un grupo genérico de enzimas relacionadas o no. Más específicamente, este término no se refiere a chaperonas endógenas, tales como BiP, ni a agentes no específicos que han demostrado actividad de chaperona no específica frente a diversas proteínas, tales como glicerol, DMSO o agua deuterada, es decir, chaperonas químicas (remítase a Welch et al., Cell Stress and Chaperones 1996; 1(2):109-115; Welch et al., 45 Journal of Bioenergetics and Biomembranes 1997; 29(5):491-502; Patente de EE. UU. N.o 5.900.360; Patente de EE. UU. N.o 6.270.954 y Patente de EE. UU. N.o 6.541.195). En la presente invención, la SPC puede ser un inhibidor competitivo reversible.

Un “inhibidor competitivo” de una enzima se puede referir a un compuesto que se asemeja estructuralmente a la estructura química y geometría molecular del sustrato enzimático para unirse a la enzima aproximadamente en la 50 misma ubicación que el sustrato. Así pues, el inhibidor compite por el mismo sitio activo que la molécula de sustrato, de este modo aumenta la Km. La inhibición competitiva suele ser reversible si se dispone de suficientes moléculas de sustrato para desplazar al inhibidor, es decir, los inhibidores competitivos se pueden unir reversiblemente. Por lo tanto, la cantidad de inhibición enzimática depende de la concentración de inhibidor, la concentración de sustrato y las afinidades relativas del inhibidor y el sustrato por el sitio activo. 55

A continuación se presenta una descripción de algunas chaperonas farmacológicas específicas (SPC) contempladas

por esta invención:

En una realización no limitante particular, la SPC es 1-desoxigalactonojirimicina que se refiere a un compuesto con las siguientes estructuras:

imagen1

imagen2

5

o

o una sal, un éster o un profármaco farmacéuticamente aceptable de la 1-desoxigalactonojirimicina. La sal clorhidrato de DGJ se conoce como clorhidrato de migalastat (Migalastat). 10

Otras SPC para α-GAL se describen en las Patentes de EE. UU. 6.274.597, 6.774.135, y 6.599.919 de Fan et al., e incluyen α-3,4-di-epi-homonojirimicina, 4-epi-fagomina, y α-alo-homonojirimicina, N-metil-desoxigalactonojirimicina, β-1-C-butil-desoxigalactonojirimicina y α-galacto-homonojirimicina, calistegina A3, calistegina B2, calistegina B3, N-metil-calistegina A3, y N-metil-calistegina B2. y N-metil-calistegina B3.

En una realización particular no limitante, la SPC es isofagomina (IFG; (3R,4R,5R)-5-(hidroximetil)-3,4-piperidinediol) 15 representada por la siguiente fórmula:

imagen3

o una sal, un éster o un profármaco farmacéuticamente aceptable de la isofagomina, tal como, por ejemplo, tartrato de IFG (remítase, por ejemplo, a la Publicación de la Solicitud de Patente de EE. UU. 20070281975.) La IFG tiene la fórmula molecular C6H13NO3 y un peso molecular de 147.17. Este compuesto se describe con más detalle en las 20 Patentes de EE. UU. 5.844.102 de Sierks et al. y 5.863.903 de Lundgren et al.

Otras SPC más para Gba se describen en la patente de EE. UU. 6.916.829 de Fan et al. e incluyen C-bencil-isofagomina y derivados, N-alquil (C9-12)-DNJ, Glucoimidazol (y derivados), C-alquil-IFG (y derivados), N-alquil-β-valeinaminas, Flufenozina, N-dodecil-DNJ, calisteginas A3, B1, B2 y C1.

En una realización particular no limitante, la SPC es 1-desoxinorjirimicina (1-DNJ) representada por la siguiente 25 fórmula:

o

o una sal, un éster o un profármaco farmacéuticamente aceptable de la 1-desoxinorjirimicina. En una realización, la sal es la sal clorhidrato (es decir, 1-desoxinojirimicina-HCl).

Otras SPC más para GAA se describen en las Patentes de EE. UU. N.os 6.274.597; 6.583.158; 6.599.919 y 5 6.916.829 de Fan et al. y la Solicitud Publicada de EE. UU. N.o 2006/0264467, e incluyen N-metil-DNJ, N-etil-DNJ, N-propil-DNJ, N-butil-DNJ, N-pentil-DNJ, N-hexil-DNJ, N-heptil-DNJ, N-octil-DNJ, N-nonil-DNJ, N-metilciclopropil-DNJ, N-metilciclopentil-DNJ, N-2-hidroxietil-DNJ, 5-N-carboxipentil-DNJ, α-homonojirimicina y castanospermina.

Como se emplea en la presente, el término “se une específicamente” se refiere a la interacción de una chaperona farmacológica con una proteína, como α-Gal A, Gba o GAA, específicamente, a una interacción con residuos 10 aminoacídicos de la proteína que participan directamente en el contacto con la chaperona farmacológica. Una chaperona farmacológica se une específicamente a una proteína objetivo, por ejemplo, α-Gal A, Gba o GAA, para ejercer un efecto de chaperona sobre la proteína y no sobre un grupo genérico de enzimas relacionadas o no. Los residuos aminoacídicos de una proteína que interaccionan con una chaperona farmacológica dada cualquiera pueden o no estar localizados en el “sitio activo" de la proteína. La unión específica se puede evaluar mediante 15 ensayos de unión rutinarios o mediante estudios estructurales, p. ej., cristalización conjunta, RMN y similares. El sitio activo para α-Gal A, Gba o GAA es el sitio de unión del sustrato.

La término “actividad de α-Gal A deficiente” se refiere a la actividad de α-Gal A en las células de un paciente que es inferior al rango normal en comparación (empleando los mismos métodos) con la actividad en individuos normales que no padecen o no se sospecha que padecen Fabry ni ninguna otra enfermedad (especialmente una hemopatía). 20

La término “actividad de Gba deficiente” se refiere a la actividad de Gba en las células de un paciente que es inferior al rango normal en comparación (empleando los mismos métodos) con la actividad en individuos normales que no padecen o no se sospecha que padecen Gaucher ni ninguna otra enfermedad.

La término “actividad de GAA deficiente” se refiere a la actividad de GAA en las células de un paciente que es inferior al rango normal en comparación (empleando los mismos métodos) con la actividad en individuos normales 25 que no padecen o no se sospecha que padecen Pompe ni ninguna otra enfermedad.

Como se emplea en la presente, los términos “estimula la actividad de α-Gal A”, “estimula la actividad de Gba” y “estimula la actividad de GAA” o “aumenta la actividad de α-Gal A”, “aumenta la actividad de Gba” y “aumenta la actividad de GAA” se refieren al aumento de la cantidad de α-Gal A, Gba o GAA, respectivamente, que adopta una conformación estable en una célula que está en contacto con una chaperona farmacológica específica para la α-Gal 30 A, Gba o GAA, en comparación con la cantidad en una célula (preferentemente el mismo tipo de célula o la misma célula, p. ej., en un momento previo) que no está en contacto con la chaperona farmacológica específica para la α-Gal A, Gba o GAA. Estos términos también se refieren al aumento del tráfico de α-Gal A, Gba o GAA al lisosoma en una célula que está en contacto con una chaperona farmacológica específica para la α-Gal A, Gba o GAA, en comparación con el tráfico de α-Gal A, Gba o GAA sin estar en contacto con la chaperona farmacológica específica 35 para la proteína. Estos términos se refieren tanto a α-Gal A, Gba o GAA naturales como mutantes. En una realización, el aumento de la cantidad de α-Gal A, Gba o GAA en la célula se evalúa midiendo la hidrólisis de un sustrato artificial en lisados de células que han sido tratadas con la SPC. Un aumento en la hidrólisis indica un aumento en la actividad de α-Gal A, Gba o GAA.

El término “actividad de α-Gal” se refiere a la función fisiológica normal de una α-Gal A natural en una célula. Por 40 ejemplo, la actividad de α-Gal A incluye la hidrólisis de GL-3.

El término “actividad de Gba” se refiere a la función fisiológica normal de una α-Gba natural en una célula. Por ejemplo, la actividad de Gba incluye el metabolismo de glucocerebrósidos grasos.

El término “actividad de GAA” se refiere a la función fisiológica normal de una GAA natural en una célula. Por ejemplo, la actividad de GAA incluye el metabolismo glucogénico lisosomal.

Un “paciente que responde” es un individuo al que se le ha diagnosticado o que se sospecha que padece un trastorno por acumulación lisosomal, como por ejemplo, pero sin limitarse a, enfermedad de Fabry, enfermedad de Pompe o enfermedad de Gaucher, cuyas células experimentan una actividad de α-Gal A, GAA o Gba 5 suficientemente incrementada, respectivamente, y/o la mejoría de los síntomas o una mejora en marcadores indirectos, como respuesta al contacto con una SPC. Los ejemplos no limitantes de mejoras en marcadores indirectos para las enfermedades de Fabry y Pompe se presentan en las Patentes de EE. UU. con N.os de serie 60/909.185 y 61/035.869, respectivamente.

Los ejemplos no limitantes de mejoras en marcadores indirectos para la enfermedad de Fabry presentados en la 10 Patente de EE. UU. con N.o de serie 60/909.185 incluyen aumentos en los niveles o la actividad de α-GAL A en células (p. ej., fibroblastos) y tejido; reducciones de la acumulación de GL-3; disminución de concentraciones en plasma de homocisteína y molécula de adhesión celular vascular-1 (MACV-1); disminución de acumulación de GL-3 en las células miocárdicas y fibrocitos valvulares; reducción de la hipertrofia cardíaca (especialmente del ventrículo izquierdo), mejoría de la insuficiencia valvular y de arritmias; mejoría de la proteinuria; disminución de 15 concentraciones urinarias de lípidos tales como CTH, lactosilceramida, ceramida, y mayores concentraciones urinarias de glucosilceramida y esfingomielina (Fuller et al., Clinical Chemistry. 2005; 51: 688-694); la ausencia de cuerpos de inclusión laminados (cuerpos “cebra”) en células epiteliales glomerulares; mejorías en la función renal; alivio de la hipohidrosis, la ausencia de angioqueratomas; y mejorías en anomalías auditivas tales como la pérdida de la audición sensorineural de alta frecuencia, pérdida progresiva de la audición, sordera súbita o tinnitus. Las 20 mejorías en síntomas neurológicos incluyen la prevención del ataque isquémico transitorio (AIT) o accidente cerebrovascular; y mejoría del dolor neuropático que se manifiesta como acroparestesia (ardor u hormigueo en las extremidades).

La dosis que consigue una o más de las respuestas mencionadas anteriormente es una “dosis terapéuticamente eficaz”. 25

La frase “farmacéuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que son tolerables fisiológicamente y que generalmente no producen reacciones adversas cuando se administran a un humano. Preferentemente, como se emplea en la presente, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o de un gobierno estatal, o listado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otras farmacopeas reconocidas en general para uso en animales y más particularmente en humanos. El 30 término “portador” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo junto al cual se administra el compuesto. Dichos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites. Se emplean preferentemente como portadores agua o soluciones salinas acuosas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol, particularmente para soluciones inyectables. En “Remington’s Pharmaceutical Sciences” de E.W. Martin, 18.a edición u en otras ediciones, se describen portadores farmacéuticos adecuados. 35

Como se emplea en la presente, el término “aislado” significa que el material de referencia se retira del entorno en el que normalmente se encuentra. De este modo, un material biológico aislado puede carecer de componentes celulares, es decir, componentes de las células en las cuales se encuentra o se produce el material. En el caso de moléculas de ácido nucleico, un ácido nucleico aislado incluye un producto de PCR, una banda de ARNm en un gel, un ADNc o un fragmento de restricción. En otra realización, un ácido nucleico aislado se escinde preferentemente 40 del cromosoma en el que se puede encontrar y más preferentemente ya no está unido a regiones no reguladoras y no codificantes, ni a otros genes, ubicados en el extremo 5’ o en el extremo 3’ del gen contenido por la molécula de ácido nucleico aislada cuando se encuentra en el cromosoma. En otra realización más, el ácido nucleico aislado carece de uno o más intrones. Los ácidos nucleicos aislados incluyen secuencias insertadas en plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales y similares. Así pues, en una realización específica, un ácido nucleico 45 recombinante es un ácido nucleico aislado. Una proteína aislada puede asociarse con otras proteínas o ácidos nucleicos, o ambos, con los cuales se asocia en la célula, o con membranas celulares si es una proteína asociada a membrana. Un orgánulo, célula o tejido aislado se extrae del sitio anatómico en el cual se encuentra en un organismo. Un material aislado puede que esté purificado, pero no es necesario que lo esté.

El término “aproximadamente” generalmente significará un grado de error aceptable para la cantidad medida dada la 50 naturaleza o precisión de las medidas. Generalmente, los grados de error ilustrativos están dentro del 20 por ciento (%), preferentemente dentro del 10%, y más preferentemente dentro del 5% de un valor o rango de valores dado. Como alternativa, y particularmente en sistemas biológicos, el término “aproximadamente” puede significar valores que están dentro de un orden de magnitud, preferentemente dentro de 10 ó 5 veces más y más preferentemente dentro del doble de un valor dado. Las cantidades numéricas dadas en la presente son aproximadas a menos que 55 se indique lo contrario, lo que significa que el término “aproximadamente" puede inferirse cuando no se indique expresamente.

Método para determinar las opciones de tratamiento

Para determinar fácilmente si la terapia con SPC sería un tratamiento viable para pacientes, por ejemplo, pacientes con Fabry, Pompe o Gaucher, y que incluyen mujeres portadoras de trastornos por acumulación lisosomal ligados al cromosoma X como la enfermedad de Fabry, se desarrolló un ensayo de rescate con SPC simple y no invasivo de la actividad de la proteína en una línea celular que expresa una forma mutante de la proteína.

Ensayo in vitro 5

En una realización, el método diagnóstico supone transformar una línea celular con un vector de ácido nucleico que codifica una enzima lisosomal mutante, por ejemplo, α-Gal A, GAA o Gba. Posteriormente, la línea celular se trata con o sin una SPC, p. ej., DGJ, DNJ o IFG, durante un periodo de tiempo suficiente para comprobar la estimulación (es decir, el aumento) de la actividad de α-Gal A, GAA o Gba. Posteriormente, se lisan las células transformadas y el lisado se emplea en un ensayo para determinar la actividad enzimática. Un amento suficiente en la actividad de 10 α-Gal A, GAA o Gba en los lisados de células tratadas con la SPC respecto a la actividad en las formas lisadas de células sin tratar indica que un paciente que expresa α-Gal A, GAA o Gba con la misma mutación que la línea celular es probable que responda a la terapia con SPC (es decir, el paciente será un “paciente que responde”).

Transfección transitoria de una línea celular y expresión de una enzima lisosomal mutante 15

En una realización, para identificar las mutaciones sensibles a SPC, se pueden generar todas las mutaciones de enzimas lisosomales conocidas (p. ej., α-Gal A, GAA o Gba), por ejemplo, mutaciones en sentido erróneo y pequeñas deleciones e inserciones en fase, de acuerdo con técnicas conocidas en la materia, por ejemplo, por mutagénesis dirigida. Posteriormente, los constructos enzimáticos mutantes se pueden expresar de forma transitoria en una línea celular, por ejemplo, células COS-7, HEK-293 o GripTite 293 MSR (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EE. 20 UU.) de mamífero. Las células transformadas se pueden incubar posteriormente con concentraciones crecientes de SPC y la actividad enzimática se puede medir en lisados celulares.

Mutagénesis: Se pueden generar vectores de ácido nucleico que codifican una proteína mutante (p. ej., α-Gal A, GAA o Gba mutante) mediante técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y técnicas de ADN 25 recombinante conocidas en la materia. Estas técnicas se explican con todo detalle en la bibliografía (remítase, p. ej., a Sambrook, Fritsch & Maniatis, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Glover, ed., 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes I y II, segunda edición; Gait, M.J., ed., 1984, Oligonucleotide Synthesis: A practical approach; Hames, B.D. & Higgins, S.J. eds., 1985, Nucleic Acid Hybridization; Hames, B.D. & Higgins, S.J., eds., 1984, Transcription 30 And Translation; Freshney, R.I., 2000, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique; Woodward, J., 1986, Immobilized Cells And Enzymes: A practical approach, IRL Press; Perbal, B.E., 1984, A Practical Guide To Molecular Cloning). Por ejemplo, se puede introducir una única mutación de α-Gal A, GAA o Gba en un ácido nucleico que codifica un gen α-Gal A, GAA o Gba natural por mutagénesis dirigida de un ácido nucleico que codifica la enzima natural. 35

Expresión y transfección transitoria: Las secuencias codificantes del gen que se va a suministrar, por ejemplo, un α-Gal A, GAA o Gba mutante, están unidas operablemente a secuencias de control de la expresión, p. ej., un promotor que dirige la expresión del gen. Como se emplea en la presente, la frase “unidas operablemente” se refiere a la relación funcional de un polinucleótido/gen con secuencias de nucleótidos reguladoras y efectoras, como 40 promotores, estimuladores, sitios de terminación de la transcripción y traducción, y otras secuencias señal. Por ejemplo, la unión operativa de un ácido nucleico a un promotor se refiere a la relación física y funcional entre el polinucleótido y el promotor de forma que la transcripción del ADN comience en el promotor por acción de una ARN polimerasa que reconoce y se une específicamente al promotor. El promotor dirige la transcripción del ARN del polinucleótido. La expresión de una proteína mutante (p. ej., α-Gal A, GAA o Gba mutante) puede ser controlada 45 por cualquier elemento promotor/estimulador conocido en la técnica, pero estos elementos reguladores deben ser funcionales en el huésped seleccionado para la expresión.

En una realización específica, se emplea un vector en el que las secuencias codificantes y cualesquiera otras secuencias deseadas están flanqueadas por regiones que promueven la recombinación homóloga en un sitio 50 deseado del genoma, de esta forma se garantiza la expresión del constructo de una molécula de ácido nucleico que ha sido integrada en el genoma (remítase a Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438; la Patente de EE. UU. N.o 6.244.113 de Zarling et al.; y la Patente de EE. UU. N.o 6.200.812 de Pati et al.).

El término “célula huésped” se refiere a cualquier célula de cualquier organismo que se selecciona, modifica, 55 transforma, cultiva, o se emplea o manipula de alguna forma para que la célula produzca una sustancia, por ejemplo, la expresión por parte de la célula de un gen, una secuencia de ADN o RNA, una proteína o una enzima. En una realización, una célula huésped que ha sido transfectada con un vector que codifica una α-Gal A, GAA o Gba mutante se puede emplear en la detección de una SPC candidata, por ejemplo, DGJ, DNJ o IFG, para determinar si la SPC candidata es un compuesto eficaz para aumentar la actividad de la α-Gal A, GAA o Gba mutante expresada 60 por la célula huésped.

El término “sistema de expresión” se refiere a una célula huésped y un vector compatible en condiciones adecuadas, p. ej., para la expresión de una proteína codificada por un ADN exógeno que es portado por el vector e introducido en la célula huésped. Los sistemas de expresión incluyen células huésped y vectores de mamíferos. Las células adecuadas incluyen células PC12, células CHO, células HeLa, células GripTite 293 MSR (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EE. UU.), células HEK-293 (también conocidas como células 293) y 293T (derivadas de células 5 renales embriónicas humanas), células COS (p. ej., células COS-7), mioblastos primarios de ratón y células NIH 3T3.

Los vectores adecuados incluyen virus, como adenovirus, virus asociados a adenovirus (VAA), vaccinia, herpesvirus, baculovirus y retrovirus, parvovirus, lentivirus, bacteriófagos, cósmidos, plásmidos, vectores fúngicos, ADN desnudo, 10 complejos ADN-lípido y otros vehículos de recombinación que se suelen emplear en la técnica que han sido descritos para la expresión en varios huéspedes eucariotas y procariotas, y se pueden emplear para la terapia génica así como también para la expresión proteica simple.

En un ejemplo no limitante, la transfección transitoria se puede llevar a cabo en células GripTite 293 MSR (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EE. UU.) empleando el reactivo Fugene de alto rendimiento (Roche). Las células se pueden 15 sembrar en un recipiente de ensayo adecuado, tal como una placa de 96 pocillos (Costar) con una densidad de, por ejemplo, 7.5-10k células/pocillo, y se pueden incubar en condiciones adecuadas, como por ejemplo, a 37 C, 5% de CO2 durante 24 horas antes de la transfección. Después de la transfección con constructos de expresión que contienen una α-Gal A mutante específica, las células se pueden incubar de nuevo, por ejemplo, a 37 C, 5% de CO2 durante una hora antes de agregar DGJ de 50 nM a 1 mM. Las células se pueden incubar posteriormente 20 durante 4-5 días antes de la lisis y el ensayo.

Ensayo de estimulación/actividad enzimática: Normalmente, después de incubar con una SPC (p. ej., DGJ, DNJ o IFG), las células huésped se lisan por adición de tampón de lisis (o agua desionizada) y perturbación física (pipetear, agitar en vórtex y/o agitar, y/o someter a ultrasonidos) a temperatura ambiente o sobre hielo, seguida de la 25 extracción de los lisados combinados sobre hielo, posteriormente se divide la combinación de listados en alícuotas pequeñas y se congela.

Los lisados se pueden descongelar inmediatamente antes del ensayo y se deben suspender empleando una mezcladora tipo vórtex y someter a ultrasonidos antes de agregarlos a los pocillos adecuados, p. ej., en una 30 microplaca. En el contexto de la enfermedad de Fabry, se agrega posteriormente N-acetilgalactosamina (GalNAc) a cada pocillo (para inhibir la α-galactosidasa B), seguida de una breve incubación. Posteriormente se agrega 4-metilumbeliferil-α-D-galactopiranósido (4-MU Gal) u otro sustrato DGJ debidamente marcado y la placa se mezcla suavemente durante un periodo de tiempo breve, se cubre y se incuba a 37 ˚C durante un tiempo suficiente para la hidrólisis del sustrato, normalmente aproximadamente 1 hora. Para detener la reacción, se agrega tampón de 35 NaOH-glicina, pH 10.7, a cada pocillo y la placa se lee en un lector de fluorescencia en placas (p. ej., Wallac 1420 Victor3 TM o un instrumento similar). Las longitudes de onda de excitación y emisión se fijaron habitualmente a 355 nm y 460 nm, respectivamente. Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza la hidrólisis de 1 nmol de 4-metilumbeliferona por hora. Para cada muestra de un paciente al menos tres muestras normales se pueden evaluar al mismo tiempo. 40

Será posible que un experto en la técnica consiga llevar a cabo fácilmente varias modificaciones de este ensayo. Los ejemplos de sustratos artificiales que se pueden emplear para detectar la actividad de α-Gal A incluyen, pero no se limitan a, p-nitrofenil-α-D-galactopiranósido y 4-MU GAL. Obviamente, serán adecuados para emplear únicamente sustratos que se pueden escindir con α-Gal A. Cabe destacar que aunque se prefiera emplear un sustrato fluorogénico, se contempla el uso de otros métodos para determinar la actividad enzimática en el método, 45 incluido el uso de sustratos cromogénicos o técnicas de inmunocuantificación.

En un ejemplo específico, después de incubar con una SPC, por ejemplo, DGJ, las células huésped se pueden lavar dos veces con PBS, posteriormente se pueden incubar en 200μl de medio recién preparado a 37 C, 5% de CO2 durante dos horas, seguido de 2 lavados con PBS adicionales. A continuación, las células se pueden lisar en 60 L de tampón de lisis (citrato sódico 27 mM/fosfato sódico dibásico 46 mM, 0.5% de Triton X-100, pH 4.6). 50 Posteriormente, se pueden agregar 10 L de lisado a 50 L de tampón de ensayo (tampón de lisis sin Triton X-100, pero que contiene 4-MU--D-galactopiranósido (4-MUG) 6 mM y N-acetil-D-galactosamina (GalNac) 117 mM) y se incuba a 37 C durante 1 h. Se pueden agregar posteriormente 70 L de solución de terminación (glicina 0.4 M, pH 10.8) y la fluorescencia se lee en un lector de placas Victor (Perkin Elmer) con excitación a 355 nm y emisión a 460 nm. Se puede sustraer el fondo definido por el recuento de la solución que contiene sustrato únicamente del 55 recuento de la fluorescencia bruta. Se empleó un kit de ensayo para proteínas MicroBCA (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para determinar la concentración de proteína en 40 L de lisado celular. Se procesó una curva estándar para la 4-metilumbeliferona (4-MU) con concentraciones de 30 M a 1.3 nM en paralelo para calcular la actividad absoluta de α-Gal A expresada como nmol/mg de proteína/h o se normalizó posteriormente para % de actividad de la enzima natural sin tratar. 60

Tabla de tratamiento de referencia

En otra realización, los métodos descritos anteriormente se pueden emplear para generar una “tabla de tratamiento de referencia” o “tabla de terapia de tratamiento”, donde la tabla de tratamiento de referencia es una lista de mutaciones proteicas y donde la tabla indica la capacidad de respuesta de cada mutación a una SPC, tal como DGJ, DNJ o IFG. La tabla de tratamiento de referencia se puede emplear posteriormente para determinar si una SPC 5 particular, por ejemplo, DGJ, DNJ o IFG, podría ser una SPC eficaz para tratar a un paciente con una mutación de α-Gal A, GAA o Gba particular, respectivamente.

Como se emplea en la presente, “tabla de terapia de tratamiento” o “tabla de tratamiento de referencia” se refiere a cualquier registro por escrito que indica si una mutación particular responde a la terapia con SPC y no se limita necesariamente a los registros por escrito presentados en forma tabular. 10

En una realización, la tabla de tratamiento de referencia puede ser empleada por un médico o especialista para seleccionar una SPC para tratar a un paciente, por ejemplo, un paciente con Fabry, Pompe o Gaucher que expresa una α-Gal A, GAA o Gba mutante específica, respectivamente, donde la SPC se selecciona porque la tabla de tratamiento de referencia identifica la SPC como un compuesto que puede aumentar la actividad de la α-Gal A, GAA o Gba mutante del paciente cuando la α-Gal A, GAA o Gba mutante se expresa en una célula huésped. 15

Trastornos tratables

Aunque la presente solicitud haya sido presentada en gran parte en el contexto de las enfermedades de Fabry, Pompe y Gaucher, y las SPC DGJ, DNJ y IFG, respectivamente, se debe sobreentender que es aplicable a cualquier SPC y enfermedad. En una realización no limitante, se puede generar una tabla de tratamiento de referencia para cualquier SPC candidata y cualquier trastorno por acumulación lisosomal o cualquier trastorno que implique el 20 plegamiento erróneo de proteínas. Estas enfermedades incluyen otros trastornos por acumulación lisosomal, por ejemplo, fibrosis cística (CFTR) (células epiteliales respiratorias o de glándulas sudoríparas), hipercolesterolemia familiar (receptor de LDL; LPL-adipocitos o células endoteliales vasculares), cáncer (p53; PTEN-células tumorales), enfermedad de Alzheimer (α-secretasa), enfermedad de Parkinson (glucocerebrosidasa), obesidad (MC4R) y amiloidosis (transtiretina) entre otros. 25

Criterios de determinación de eligibilidad

Los criterios para determinar la eligibilidad para una terapia con SPC depende del tipo de GLA, GAA o Gba mutante que exprese un paciente. En una realización, los pacientes con la enfermedad de Fabry, Pompe o Gaucher se podrían categorizar como aptos para la terapia con SPC si la actividad de α-Gal A, GAA o Gba, respectivamente, en una célula huésped que expresa la misma mutación que el paciente, en presencia de una SPC, tal como DGJ, DNJ 30 o IFG, fuera al menos 1.5 a 20 veces más (de 2% a 100%) que la actividad de una célula huésped que expresa una α-Gal A, GAA o Gba natural.

Este descubrimiento proporciona un método para mejorar el diagnóstico y facilitar las decisiones concernientes al tratamiento clínico de las enfermedades de Fabry, Pompe y Gaucher, en particular, y del trastorno por acumulación lisosomal en general. Además, este método se puede extender a un gran rango de enfermedades definidas 35 genéticamente en tipos de células adecuados. Esta clase de enfermedades incluyen el resto de trastornos por acumulación lisosomal, fibrosis cística (CFTR) (células epiteliales respiratorias o de glándulas sudoríparas), hipercolesterolemia familiar (receptor de LDL; LPL-adipocitos o células endoteliales vasculares), cáncer (p53; PTEN-células tumorales), enfermedad de Alzheimer (α-secretasa), enfermedad de Parkinson (glucocerebrosidasa), obesidad (MC4R) y amiloidosis (transtiretina) entre otros. 40

Kits

La presente descripción también proporciona un kit de prueba diagnóstico comercial para tomar las decisiones concernientes al tratamiento terapéutico. El kit proporciona todos los materiales indicados anteriormente, y más particularmente en los Ejemplos que se presentan a continuación, para preparar y llevar a cabo cada prueba en un envase conveniente, que opcionalmente incluye instrucciones y un manual analítico. 45

A modo de ejemplo no limitante, un kit para evaluar la actividad de α-Gal A puede contener, como mínimo:

a. un panel de células huésped, donde cada una expresa una α-Gal A mutante, o como alternativa, una célula huésped, un vector que codifica una α-Gal A mutante y un medio para transfectar la célula huésped de forma que la célula huésped exprese la α-Gal A mutante;

b. una chaperona farmacológica específica; 50

c. un sustrato cromogénico o fluorogénico para el ensayo enzimático (que incluye un estándar adecuado); y

d. GalNAc.

El kit también puede contener instrucciones para llevar a cabo de forma óptima el ensayo de estimulación de la proteína. En otra realización, el kit contendrá los tubos, los tampones (p. ej., tampón de lisis) y las microplacas adecuados.

En una realización, la SPC se suministra en forma seca y será reconstituida antes de la adición.

Los pacientes que expresan una α-Gal A, GAA o Gba mutante cuyo análisis es positivo para la estimulación 5 enzimática con una SPC candidata en ensayos de la presente invención se pueden tratar posteriormente con ese agente SPC candidato, mientras que para los pacientes que expresan una α-Gal A, GAA o Gba mutante que no presenta estimulación enzimática con una SPC candidata se puede obviar el tratamiento lo cual supondría un ahorro de dinero y evitaría el desgaste emocional por la falta de respuesta a la modalidad de tratamiento.

EJEMPLOS 10

La presente invención se describe además por medio de los ejemplos que se presentan continuación. El uso de dichos ejemplos es ilustrativo solamente y no limita el alcance ni el significado de la invención ni de cualquiera de los términos ejemplificados en ningún modo. De forma análoga, la invención no se limita a ninguna de las realizaciones preferidas particulares descritas en la presente. De hecho, muchas modificaciones y variantes de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica tras la lectura de esta descripción. Por lo tanto, la invención queda limitada 15 solamente por los términos de las reivindicaciones adjuntas junto con el alcance total de los equivalentes posibles que se deriven de las reivindicaciones.

EJEMPLO 1: Identificación de mutaciones que provocan la enfermedad de Fabry y que son sensibles a la chaperona farmacológica DGJ 20

El presente ejemplo proporciona el ensayo diagnóstico in vitro para determinar la capacidad de respuesta de un paciente con Fabry a una chaperona farmacológica específica.

Introducción 25

La enfermedad de Fabry es un trastorno por acumulación lisosomal provocado por mutaciones en el gen que codifica la α-galactosidasa A (α-GAL A). Hay constancia de más de 600 mutaciones de Fabry y aproximadamente el 60% son en sentido erróneo. En la actualidad, el iminoazúcar DGJ está siendo estudiado en estudios clínicos de fase 2 como una chaperona farmacológica para el tratamiento de la enfermedad de Fabry. Previamente, se ha demostrado que la DGJ media aumentos selectivos y dependientes de la dosis en los niveles de α-Gal A en muchas 30 líneas celulares linfoides derivadas de pacientes con Fabry. Para identificar mutaciones sensibles a DGJ adicionales, se transfectaron transitoriamente células GripTite 293 MSR (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EE. UU.) con vectores de expresión que contienen todas las mutaciones en sentido erróneo conocidas de a-Gal A y varias pequeñas deleciones e inserciones en fase generadas por mutagénesis dirigida. Los constructos de α-Gal A mutantes se expresaron transitoriamente en células HEK-293. Las células se incubaron con concentraciones crecientes de DGJ, 35 y la actividad de α-Gal A se midió en lisados celulares. Se ha realizado un ensayo de validación para más de 35 mutaciones en sentido erróneo y los resultados obtenidos en células HEK-293 fueron similares tanto a los de células linfoides derivadas de pacientes con Fabry y cultivos de linfocitos T primarios (remítase a la Patente de EE. UU. con N.o de serie: 11/749.512), así como también a las respuestas de la enzima -Gal A observadas en los leucocitos de pacientes con Fabry después de la administración oral de DGJ en estudios clínicos de fase 2. 40

Métodos y materiales

Mutagénesis: Todas las mutaciones se generaron por mutagénesis dirigida siguiendo los protocolos estándares de biología molecular. Para generar mutaciones puntuales, la mutagénesis dirigida se empleó en la expresión del vector 45 pcDNA3.1 (Invitrogen) que contenía ADNc de α-GAL A humano en fase. Se diseñaron pares de cebadores específicos que contenían la mutación deseada (Figura 6). La mutagénesis se llevó a cabo mediante la reacción en cadena de la polimerasa empleando ADN polimerasa PfuUltra de alta fidelidad (Stratagene) en un termociclo. Cada mezcla de reacción contenía un volumen total de 50 ul con lo siguiente: 41.6 ul de dH2O, 5.0 ul de 10X tampón de reacción PfuUltra de alta fidelidad, 0.5 uL de cebador-5’-directo (50 uM), 0.5 ul de cebador-3’-inverso, 1.0 ul de 50 mezcla dNTP (que contenía 25 mM de cada dA, dT, dC, dG), 0.9 ul de GLA humana en pcDNA3 (2ng/ul de ADN), 0.5ul de ADN polimerasa PfuUltra de alto rendimiento. Los parámetros del termociclo empleados fueron los siguientes: i) 94 C durante 30 segundos, ii) 94 C durante 30 segundos, 55-60 C durante 30 segundos, 68 C durante 6 minutos, iii) repetir (ii) 16 veces. Posteriormente, se agregaron 0.5 ul de Dpn I (New England Biolabs) a cada reacción y se incubó a 37 C durante 2 horas. Se empleó un volumen de 7.5 ul para cada reacción de 55 mutagénesis para transformar células DH5 (New England Biolabs). Las células se colocaron posteriormente en placas LB-agar con 75 ug/ml de ampicilina y se incubaron a 37 C durante la noche. Las colonias bacterianas se recogieron, se cultivaron en LB líquido con ampicilina durante la noche con agitación a 37 C y se extrajo el ADN plasmídico empleando el kit QuickLyse Miniprep (Qiagen). Las mutaciones se confirmaron por secuenciación de la longitud completa del gen GLA humano. Para algunas de las mutaciones, el ADNc de GLA humano estaba 60

contenido en el vector plasmídico pCXN. La mutagénesis tuvo lugar en este vector con la ADN polimerasa NEB Fusion. Tras confirmar la mutación por secuenciación, el plásmido fue digerido con EcoRI y subclonado en el vector de expresión pcDNA3.1. La orientación correcta se confirmó por digestión con Xho I.

Expresión y transfección transitoria: La transfección transitoria se llevó a cabo en células GripTite 293 MSR 5 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EE. UU.) empleando el reactivo Fugene de alto rendimiento (Roche). Resumiendo, las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Costar) con una densidad de 7.5-10k células/pocillo y se incubaron a 37 C, 5% de CO2 durante 24 horas antes de la transfección. Las células se transfectaron con 0.1 μg de ADN y 0.35 μL de reactivo Fugene de alto rendimiento por pocillo (proporción de ADN: Reactivo de 2:7). Después de la transfección con constructos de expresión que contenían mutaciones de α-Gal A específicas, las células se 10 incubaron de nuevo a 37 C, 5% de CO2 durante una hora antes de agregar DGJ de 20 nM a 1 mM. Las células se incubaron posteriormente durante 4-5 días antes de la lisis y el ensayo.

Medida de la actividad de α-GAL A: Las células se lavaron dos veces con PBS, luego se incubaron con 200 μl de medio fresco a 37 C, 5% de CO2 durante dos horas, seguido de 2 lavados con PBS adicionales. A continuación, las 15 células se lisaron en 60 L de tampón de lisis (citrato sódico 27 mM/fosfato sódico dibásico 46 mM, 0.5% de Triton X-100, pH 4.6). Se agregaron 10 L de lisado a 50 L de tampón de ensayo (tampón de lisis sin Triton X-100, pero que contenía 4-MU--D-galactopiranósido (4-MUG) 6 mM y N-acetil-D-galactosamina (GalNac) 117 mM) y se incubó a 37 C durante 1 h. Se agregaron posteriormente 70 L de solución de terminación (glicina 0.4 M, pH 10.8) y la fluorescencia se leyó en un lector de placas Victor (Perkin Elmer) con excitación a 355 nm y emisión a 460 nm. Se 20 sustrajo el fondo definido por el recuento de la solución que contiene sustrato únicamente del recuento de la fluorescencia bruta. Se empleó un kit de ensayo para proteínas MicroBCA (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para determinar la concentración de proteína en 40 L de lisado celular. Se procesó una curva estándar para la 4-metilumbeliferona (4-MU) con concentraciones de 30 M a 1.3 nM en paralelo para calcular la actividad absoluta de α-Gal A expresada como nmol/mg de proteína/h o se normalizó posteriormente como % de 25 actividad de la enzima natural sin tratar.

La transfección transitoria y las medidas de actividad de α-Gal A se llevaron a cabo por cuadriplicado y se repitieron al menos 3 veces para cada mutación para calcular la actividad de α-Gal A promedia para cada concentración de DGJ. Se determinó si la respuesta a DGJ era significativa mediante una prueba t de Student bilateral para datos 30 apareados (p<0.05).

Resultados

Todas las mutaciones de Fabry enumeradas se generaron por mutagénesis dirigida (Figura 1). Las mutaciones 35 representadas en cursiva no se ensayaron, mientras que las representadas en texto normal fueron las mutaciones de α-Gal A que respondieron al tratamiento con DGJ en el ensayo de transfección transitoria y las representadas en negrita y subrayadas no respondieron al tratamiento con DGJ en el ensayo de transfección transitoria. La magnitud del incremento en los niveles de α-Gal A después del tratamiento con DGJ y los valores de CE50 se enumeran para cada mutación ensayada que respondió al tratamiento con DGJ (Figura 2). 40

La actividad de α-Gal A (expresada como nmol/mg de proteína/h de 4-MU liberada) se midió en lisados preparados a partir de células GripTite 293 transfectadas incubadas con concentraciones crecientes de DGJ. Una respuesta dependiente de la concentración típica se muestra para L300P y una respuesta negativa típica a DGJ se muestra para R227Q. La natural presenta una actividad basal elevada y no responde a DGJ en este ensayo (Figura 3). 45

Los niveles de α-Gal A se midieron en tres ensayos diferentes, se presentaron como porcentaje de natural y se compararon para cada mutación representándolos juntos. Los tres ensayos diferentes examinaron los niveles de α-Gal A en linfocitos T y linfoblastos aislados de pacientes con Fabry (por ejemplo, remítase a la Patente de EE. UU. con N.o de serie 11/749.512), así como también en leucocitos (Leu) de estudios de DGJ de fase 2.

Las barras vacías indican el nivel basal (sin tratamiento con DGJ) y las barras llenas indican un nivel elevado 50 después del tratamiento con DGJ (Figura 4).

Las mutaciones de Fabry ensayadas se muestran en la estructura secundaria de α-Gal A (Figura 5). No se observó correlación significativa entre la repuesta y la ubicación en la secuencia proteica de una mutación, lo que sugiere que tanto las mutaciones sensibles como las que no lo son están ampliamente distribuidas a lo largo de toda la proteína. El color del texto indica la respuesta a DGJ: verde=responde; rojo=no responde; marrón indica que, de las 55 múltiples mutaciones en esa misma ubicación, algunas respondieron al tratamiento con DGJ, mientras que otras no respondieron.

Conclusión

60

Estos resultados descritos son comparables a los obtenidos a partir de linfocitos T o linfoides derivados de pacientes con Fabry, así como también a las respuestas de la enzima -Gal A observadas en leucocitos de pacientes con Fabry después de la administración oral de DGJ en estudios clínicos de fase 2.

Así pues, el ensayo de transfección transitoria de GripTite 293 MSR es un método fiable para identificar mutaciones sensibles a DGJ y caracterizar la magnitud y potencia de esta respuesta. 5

Entre las mutaciones sensibles identificadas, los incrementos en los niveles de α-Gal A por el tratamiento con DGJ variaron de 1.3 a 40 veces más (de 2% a 100% de natural), con valores de CE50 de entre 200 nM y >100 mM.

Las formas mutantes sensibles a DGJ y las que no lo eran no parecieron estar localizadas en regiones o dominios particulares de la estructura de la proteína α-Gal A.

10

EJEMPLO 2: Método para evaluar los efectos de una SPC sobre la actividad de la glucocerebrosidasa ex vivo – Ejemplo predictivo

La enfermedad de Gaucher (EG) la provoca una deficiencia de glucocerebrosidasa lisosomal (GCase). La actividad deficiente de GCase produce la acumulación de glucosilceramida (GlcCer) y el desarrollo de síntomas como anemia, 15 trombocitopenia, hepatoesplenomegalia, necrosis ósea, infartos y osteoporosis, y en algunos casos, una enfermedad neuropática. La chaperona farmacológica específica tartrato de isofagomina (IFG) se une selectivamente y estabiliza la GCase mutante (N370S/N370S) en el RE y aumenta su tráfico al lisosoma.

Para evaluar el efecto de IFG sobre diferentes variantes de GCase, se preparará un ensayo diagnóstico ex vivo 20 empleando células Cos7 para identificar mutaciones sensibles a IFG.

Empleando las técnicas descritas en los Ejemplos 1 y 4, se prepararán líneas celulares COS-7 que expresan mutaciones en sentido erróneo y varias deleciones e inserciones pequeñas en fase por mutagénesis dirigida. El ensayo se preparará para todas las mutaciones enumeradas en el eje x de la Figura 8. La respuesta de la actividad 25 a IFG se determinará para cada ensayo de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica (remítase, p. ej., a la Patente de EE. UU. N.o 6.916.829).

Para determinar la correlación entre la respuesta a IFG medida en las células COS-7 y la de las células derivadas de un paciente, también se midió la respuesta de actividad a IFG en macrófagos y linfoblastos derivados de un 30 paciente. Los macrófagos se derivaron con éxito de 46 de 63 pacientes y tras incubar con IFG (3, 10, 30 o 100 µM) durante 5 días los niveles de GCase aumentaron en los macrófagos de 42 a 46 pacientes (media = 2.3 veces más; rango: de 1.1- a 6.5 veces más). Los niveles de actividad residual y la respuesta a IFG fueron más regulares para los mismos genotipos cuando se midieron en linfoblastos en comparación con macrófagos, potencialmente debido a la variabilidad en la disponibilidad de macrófagos entre pacientes diferentes. Los resultados se muestran en la Figura 35 8.

La respuesta a IFG para células derivadas de un paciente se comparará con los resultados obtenidos en la línea celular Cos7.

40

EJEMPLO 3: Efecto de una SPC sobre la actividad de α-GAL A en la piel, el corazón, el riñón o el plasma in vivo

Para determinar si el incremento de los niveles de -Gal A mutante se traduce en un incremento de la actividad de -Gal A in situ, se investigó el efecto de la administración de DGJ sobre los niveles tisulares de GL-3 in vivo en 45 ratones hR301Q -Gal A Tg/KO.

Se trataron ratones hR301Q α-Gal A Tg/KO macho de ocho semanas durante 4 semanas con 300 mg/kg de DGJ en agua potable diariamente o con menos frecuencia (4 días de toma/3 días de descanso). Tras administrar la dosis, se prepararon lisados de piel, corazón, riñón y plasma por homogenización de ~50 mg de tejido en tampón de lisis (remítase a lo indicado anteriormente). 20 L de lisado se mezclaron con 50 L de sustrato (como se indicó 50 anteriormente). Las mezclas de reacción se incubaron a 37 C durante 1 h. Posteriormente, se agregaron 70 L de solución de terminación y se leyó la fluorescencia en un lector de placas Victor como se describe anteriormente. Se sustrajo el fondo de la actividad enzimática en los lisados y se normalizó para la concentración proteica. Se procesó una curva 4-MU estándar para la conversión de los datos de fluorescencia en actividad absoluta de -Gal A expresada como nmol/mg de proteína/h. 55

Se lavaron las muestras de tejido para eliminar la sangre y se pesaron y homogeneizaron con un sistema de solventes en un sistema FastPrep®. Se extrajo el homogenado posteriormente empleando extracción en fase sólida en un cartucho C18. El eluyente se evaporó y se reconstituyó antes de inyectarlo en un sistema LC-MS/MS. Se midieron doce isoformas de GL-3 empleando ESI-MS/MS en modo positivo. Se consiguió la separación por LC en

una columna 00839a Zorbax C18.

Se detectaron reducciones significativas en los niveles de GL-3 con dosis diarias y menos frecuentes de DGJ en la piel, el corazón, el riñón y el plasma (Figura 9). Se detectó una tendencia a una reducción mayor en los niveles de GL-3 en múltiples tejidos y en plasma con dosis menos frecuentes de DGJ. En conjunto, estos resultados indican que DGF merece un estudio más amplio en el tratamiento de pacientes con la enfermedad de Fabry. 5

EJEMPLO 4: Identificación de mutaciones que provocan la enfermedad de Pompe y que son sensibles a la chaperona farmacológica DNJ

La enfermedad de Pompe la provoca la actividad deficiente de alfa-glucosidasa ácida (GAA) que altera el 10 metabolismo glucogénico lisosomal. La deficiencia enzimática provoca la acumulación glucogénica lisosomal y produce debilitamiento progresivo de los músculos esqueléticos, función cardiaca reducida, insuficiencia respiratoria y deterioro del SNC en las últimas etapas de la enfermedad. Las mutaciones genéticas en el gen GAA resultan en una expresión menor o producen formas mutantes de la enzima con una estabilidad alterada y/o una actividad biológica que provoca, en última instancia, la enfermedad. Las chaperonas farmacológicas representan una nueva 15 estrategia terapéutica prometedora para el tratamiento de enfermedades genéticas.

Para evaluar los efectos de DNJ sobre diferentes variantes de GAA, se prepararon un ensayo diagnóstico in vitro empleando células COS-7 y HEK-293 para identificar mutaciones sensibles a DNJ (Figuras 10, 12 y 14).

Se empleó una estrategia de mutagénesis dirigida para introducir mutaciones específicas en el ADN complementario 20 (ADNc) que codifica la -glucosidasa ácida natural humana (GAA). El constructo inicial de ADN de GAA natural se generó por subclonación de la región codificante de GAA del clón 5739991 de ADNc (Invitrogen) en el vector de expresión pcDNA6/V5-HisA de mamífero (Initrogen). El constructo de ADN resultante (denominado ADNc de GAA natural) se empleó como plantilla de ADN en la mutagénesis posterior. Estas mutaciones en sentido erróneo por pequeñas inserciones o deleciones se citan en la base de datos Erasmus y se sabe que están asociadas al trastorno 25 por acumulación de glucógeno de tipo 2 (GSD II, por sus siglas en inglés), también conocido como la enfermedad de Pompe. Resumiendo, el ADNc de GAA natural se amplificó por PCR empleando cebadores mutagénicos para obtener ADN plasmídico con la mutación deseada. Estas mutaciones se confirmaron por secuenciación del ADN antes de su expresión proteica en las células.

Las células COS-7 (derivadas de células embriónicas renales de mono verde) se sembraron asépticamente en 30 placas de cultivo de 12 pocillos con una densidad celular de ~1.4 X 105 células por pocillo en 3 ml de medio esencial de Dulbecco modificado (DMEM) que contenía un 10% (v/v) de suero bovino fetal y se cultivaron durante la noche a 37 ºC en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2. El día siguiente, las células (normalmente con un 60-80% de confluencia) se transfectaron con 0.75 g del constructo de ADN individual mediante un reactivo de transfección lipídico tal como FUGENE de alto rendimiento (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Dos pocillos 35 se transfectaron con cada constructo de ADN de forma que un pocillo se incubó con DNJ (normalmente 0 M, 20 M, 50 M o 100 M) mientras que al otro pocillo se le agregó un volumen equivalente de PBS. Se transfectaron dos pocillos más con el vector vacío (sin ADNc de GAA) y se incubaron con o sin DNJ para emplearlos como control del fondo para la expresión de GAA en monos endógenos. De forma análoga, se transfectaron 2 pocillos más con ADNc de GAA natural humano y se incubaron con o sin DNJ para emplearlos como control positivo. Todas las muestras se 40 incubaron durante ~48 h a 37 ºC en una atmósfera humidificada con 5% de CO2.

Tras un periodo de incubación de 48 horas, el medio gastado se retiró y las células se lavaron con PBS y posteriormente se incubaron con 1-2 ml de medio DMEM recién preparado durante 3 horas a 37 ºC en una atmósfera humidificada de 5% CO2. El medio se retiró posteriormente y las células se lavaron inmediamente con 45 PBS y se lisaron con 200 l de tampón de lisis (Bis-Tris 25 mM (pH 6.5), NaCl 150 mM, 1% (v/v) de Triton X-100) que contenía un cóctel de inhibidores de proteasas. Posteriormente, la placa de cultivo celular se agitó cuidadosamente en un instrumento agitador orbital rotatorio durante 10 min a temperatura ambiente para completar la lisis celular. Los lisados celulares resultantes se transfirieron a tubos de microcentrifugación de 1.5 ml y se centrifugaron a 20000 x g durante 10 min para que sedimentaran los desechos celulares. Posteriormente, se 50 transfirieron aproximadamente 175 l de cada muestra de sobrenadante a un tubo de microcentrifugación de 1.5 ml nuevo. Este lisado celular se empleó para todos los ensayos posteriores, entre ellos la determinación de la actividad enzimática de GAA y de la concentración proteica total e inmunotransferencia de Western.

La actividad enzimática de GAA residual se determinó para cada GAA expresada de forma transitoria empleando un 55 sustrato de 4-metilumbeliferil--glucopiranosida (4-MU--glucosa) fluorogénico (Sigma). Resumiendo, 10 l de cada lisado celular se ensayaron (por triplicado) en una reacción de 100 l en placas de 96 pocillos de fondo negro transparente empleando 4-MU--glucosa 3 mM y KOAc 50 mM (pH 4.0). La muestra de GAA expresada de forma transitoria se diluyó 20 veces con el tampón de lisis para garantizar que la reacción enzimática se mantuviera en el rango lineal del instrumento. Las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo a 37 ºC durante 1 hora y se detuvieron 60 con la adición de 50 l de Na2CO3 500 mM (pH 10.5). Posteriormente, el ensayo se leyó en un lector de

fluorescencia en placas (con excitación a 355 nm/emisión a 460 nm) para cuantificar la cantidad de fluorescencia de 4-MU dependiente de GAA liberada. La actividad enzimática de GAA se extrapoló a una curva estándar de 4-MU libre tras sustraer la fluorescencia de fondo (es decir, el control del vector vacío).

Se emplearon 25 microlitros de lisado de cada pocillo en un ensayo paralelo para determinar la concentración 5 proteica celular total empleando el ensayo para determinar proteínas mediante el método del ácido bicinconínico (BCA) (Pierce) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La concentración proteica celular total se extrapoló a una curva estándar de albúmina de suero bovino (BSA).

La actividad enzimática de GAA para cada muestra se normalizó para la concentración proteica celular total y se 10 expresó como nmol de 4-MU liberada/mg de proteína total/h para definir la actividad específica de GAA. La actividad específica de GAA resultante después del tratamiento con DNJ se comparó con la actividad enzimática de GAA de la muestra sin tratar correspondiente para determinar si una mutación de GAA específica responde a DNJ.

También se determinó el CE50 de DNJ (Figura 14) para una única línea celular HEK-293 transfectada con la 15 mutación P545L de GAA.

Para determinar la correlación entre la respuesta a DNJ medida en las células COS-7 y la de las células derivadas de un paciente, también se midió la respuesta de actividad a DJN en macrófagos y linfoblastos derivados de un paciente ex vivo. 20

También se generaron líneas celulares de fibroblastos y linfocitos derivados de pacientes con Pompe como se describió anteriormente (remítase a la Patente de EE. UU. con N.o de serie: 11/749.512). También se derivaron líneas celulares de fibroblastos de pacientes homocigóticos para las mutaciones P545L o R854X GAA (Figura 13). Se derivaron líneas celulares de linfocitos de pacientes heterocigóticos para el defecto por corte y empalme de GAA 25 (IVS1AS, T>G, -13) y una mutación por cambio de marco de GAA (Figura 15).

La actividad de GAA se midió en las líneas celulares de linfocitos después de incubarlas con DNJ 0 µM, 30µM, 100 µM, o 300 µM (Figura 15). La actividad de GAA también se midió en las líneas celulares de fibroblastos después de incubarlas con DNJ (Figura 13).

En este estudio, se demuestra que la chaperona farmacológica 1-desoxinojirimicina-HCl (DNJ) se une a GAA 30 mutante e incrementa su actividad. En fibroblastos (Figura 13) y linfocitos (Figura 15) derivados de pacientes con Pompe, así como también en células COS-7 (Figuras 10 y 12) o HEK-293 (Figura 14) transfectadas de forma transitoria que expresan ciertas mutaciones de GAA en sentido erróneo, DNJ aumenta de forma significativa los niveles de GAA.

La DNJ aumentó la actividad de GAA para 26 mutaciones (Figura 10) de entre 131 mutaciones ensayadas (datos no 35 incluidos). Aparte de aumentar la actividad de estas GAA mutantes, la DNJ también fomentó el procesado de GAA en las formas 95 / 76 / 70 kDa.

Además, se detectaron aumentos en la actividad de GAA dependientes de la dosis en linfocitos derivados de pacientes que contenían el defecto común por corte y empalme IVS1AS, T>G, -13 en un alelo y una mutación por cambio de marco en el segundo alelo (Figura 15). 40

La presente invención no debe quedar limitada en su alcance por las realizaciones específicas que se describen en la presente. De hecho, diversas modificaciones de la invención, aparte de las que se describen aquí, resultarán evidentes para un experto en la técnica a partir de la descripción que antecede y las figuras adjuntas. Se pretende que dichas modificaciones queden comprendidas en el alcance de las reivindicaciones adjuntas. 45

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una chaperona farmacológica específica para α-Gal A para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry en un paciente que expresa una forma mutante de α-Gal A y que se ha determinado que responde al 5 tratamiento con una chaperona farmacológica específica, donde se determina que el paciente responde al tratamiento con la chaperona farmacológica específica para α-Gal A mediante un método que comprende

   a. sembrar unas primeras y segundas células huésped en un recipiente de ensayo;

   b. poner en contacto las primeras células huésped con la chaperona farmacológica específica para -Gal A; y

   c. comparar la actividad de -Gal A en las segundas células huésped que no están en contacto con la chaperona 10 farmacológica específica, con la actividad de -Gal A en la primera célula huésped que está en contacto con la chaperona farmacológica específica,

   donde

   la chaperona farmacológica específica para α-Gal A es 1-desoxigalactonojirimicina o una sal farmacéuticamente aceptable de esta; 15

   las primeras y segundas células huésped son células HEK-293 MSR que expresan la forma mutante de α-Gal A del paciente; y donde:

   un incremento de 1.3 a 40 veces más en la actividad de α-Gal A en las primeras células huésped que están en contacto con la chaperona farmacológica específica en comparación con la actividad de α-Gal A expresada por las segundas células huésped que no están en contacto con la chaperona farmacológica específica; o 20

   una actividad de α-Gal A en las primeras células huésped que están en contacto con la chaperona farmacológica específica de al menos aproximadamente un 2-100% de la actividad de α-Gal A de células HEK-293 MSR que expresan una forma natural de α-Gal A;

   indica que el paciente responderá al tratamiento con la chaperona farmacológica específica.

   25
2. 2. Un método para determinar si un paciente que expresa una forma mutante de α-Gal A responderá al tratamiento con una chaperona farmacológica específica para α-Gal A, comprendiendo el método:

   a. sembrar unas primeras y segundas células huésped en un recipiente de ensayo;

   b. poner en contacto las primeras células huésped con la chaperona farmacológica específica para -Gal A; y 30

   c. comparar la actividad de -Gal A en las segundas células huésped que no están en contacto con la chaperona farmacológica específica, con la actividad de -Gal A en la primera célula huésped que está en contacto con la chaperona farmacológica específica,

   donde 35

   la chaperona farmacológica específica para α-Gal A es 1-desoxigalactonojirimicina o una sal farmacéuticamente aceptable de esta;

   las primeras y segundas células huésped son células HEK-293 MSR que expresan la forma mutante de α-Gal A del 40 paciente; y donde:

   un incremento de 1.3 a 40 veces más en la actividad de α-Gal A en las primeras células huésped que están en contacto con la chaperona farmacológica específica en comparación con la actividad de α-Gal A expresada por las segundas células huésped que no están en contacto con la chaperona farmacológica específica; o 45

   una actividad de α-Gal A en las primeras células huésped que están en contacto con la chaperona farmacológica específica de al menos aproximadamente un 2-100% de la actividad de α-Gal A de células HEK-293 MSR que expresan una forma natural de α-Gal A;

   indica que el paciente responderá al tratamiento con la chaperona farmacológica específica.

   50
3. 3. Una chaperona farmacológica específica para el uso según se reivindica en la reivindicación 1 o un método según se reivindica en la reivindicación 2, donde la forma mutante de α-Gal A se debe a una mutación en sentido erróneo en un gen que codifica α-Gal A.
4. 4. Una chaperona farmacológica específica para el uso o un método según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 – 3, donde se identifica que el paciente expresa una α-galactosidasa A es una α-galactosidasa A mutante seleccionada del grupo conformado por las mutaciones de α-galactosidasa A: A121T, A156V, A20P, A288D, A288P, A292P A348P, A73V, C52R, C94Y, D234E, D244H, D244N, D264Y, E338K, E341D, E358K, E398K, 5 E48K, E59K, E66Q, F113L, G144V, G183D, G260A, G271S, G325D, G328A, G35R, G373D, G373S, H225R, I219N, I242N, I270T, I289F, I303N, I317T, I354K, I91T, L14P, L166V, L243F, L300F, L310F, L32P, L45R, M267I, M284T, M296I, M296V, M72V, M76R, N224S, N263S, N298K, N298S, N320I, N320Y, N34K, P205R, P259L, P265L, P265R, P293A, P293S, P409S, P40L, P40S, Q279E, Q279H, Q279R, Q280H, Q280K, Q312H, Q321E, Q321R, Q327E, R301P, R342Q, R363C, R363H, R49G, R49L, R49S, S201Y, S276N, S297C, S345P, T194I, V269M, V316E, 10 W340R, W47L y W95S.
5. 5. Una chaperona farmacológica específica para el uso o un método según se reivindica en la reivindicación 4, donde la α-galactosidasa A mutante se selecciona del grupo conformado por las mutaciones de α-galactosidasa A: G144V, H225R, S276G, R301P y N320I. 15
6. 6. Una chaperona farmacológica específica para el uso o un método según se reivindica en la reivindicación 5, donde la chaperona farmacológica específica es clorhidrato de 1-desoxigalactonojirimicina.
7. 7. Una chaperona farmacológica específica para su uso o un método según se reivindica en la reivindicación 6 o la 20 reivindicación 7, donde la primera célula huésped se pone en contacto con 1-desoxigalactonojirimicina en una concentración de 20 nM a 1 mM.
8. 8. Una chaperona farmacológica específica para su uso o un método según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde la actividad de la proteína se determina utilizando un ensayo fluorimétrico que cuantifica 25 la hidrólisis de sustrato en lisados de la célula huésped.
9. 9. Una chaperona farmacológica específica para su uso o un método según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el paciente es una mujer.

   30
10. 10. Un método para producir una tabla de terapia de tratamiento, donde la tabla de terapia de tratamiento indica si una chaperona farmacológica específica es un compuesto eficaz para incrementar la actividad de una α-Gal A mutante, donde el método comprende llevar a cabo un método según se reivindica en la reivindicación 2; y

    registrar el resultado de dicho método en la tabla de terapia de tratamiento, donde una chaperona farmacológica específica registrada en la tabla de terapia de tratamiento que provoca: 35

    un incremento de 1.3 a 40 veces más en la actividad de α-Gal A en la primera célula huésped que está en contacto con la chaperona farmacológica específica en comparación con la actividad de α-Gal A expresada por la segunda célula huésped que no está en contacto con la chaperona farmacológica específica; o

    una actividad de α-Gal A en la primera célula huésped que está en contacto con la chaperona farmacológica 40 específica de al menos aproximadamente un 2-100% de la actividad de α-Gal A de una célula huésped que expresa una forma natural de la proteína;

    es una chaperona farmacológica específica que se puede utilizar como terapia para un paciente que expresa la proteína mutante.