ES2540526T3 - Virus del sarampión oncolítico - Google Patents

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Abstract

Virus del sarampión recombinante basado en la cepa Schwartz de la vacuna contra el sarampión que codifica para un gen suicida que comprende una fusión de una citosina desaminasa, particularmente citosina desaminasa de levadura, y una uracilo fosforribosiltransferasa, particularmente uracilo fosforribosiltransferasa de levadura, particularmente en el que dicho gen suicida comprende una secuencia mostrada en la figura 2, particularmente en el que dicho virus del sarampión recombinante comprende una secuencia de ARN mostrada en la figura 4, 28 ó 29, particularmente mostrada en la figura 4.

Description

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En el contexto de la presente invención, la expresión “comprende una secuencia según SEQ-ID NO...” depende del contexto dado y se refiere o bien a la secuencia de ADN representada en dicha SEQ-ID NO., o bien a la secuencia de ARN correspondiente, tal como se encuentra empaquetada en la partícula viral rescatada de un vector que comprende tal secuencia de ADN.
En una realización particular, el virus del sarampión recombinante comprende una secuencia de ARN que corresponde a la secuencia mostrada en la figura 4 (SEQ-ID NO. 4), la figura 28 (SEQ-ID NO. 8) o la figura 29 (SEQ-ID NO. 9), particularmente la figura 4 (SEQ-ID NO. 4).
En una realización particular de la composición farmacéutica según la presente invención, las células cancerosas adicionalmente no responden a agentes quimioterápicos y/o radioterapia.
En una realización particular, las células cancerosas se seleccionan de la lista de: células cancerosas de colangiocarcinoma, cáncer de cabeza y cuello, y sarcoma.
En una realización particular, la composición farmacéutica es para su uso en un tratamiento, que es un tratamiento repetido, particularmente cada semana, o cada dos semanas, o cada tres semanas, o cada cuatro semanas, que emplea un virus del sarampión recombinante de este tipo basado en la cepa Schwartz de la vacuna contra el sarampión que comprende un gen suicida que comprende una fusión de una citosina desaminasa y una uracilo fosforribosiltransferasa para su uso en el tratamiento de células cancerosas con resistencias primaria o secundaria frente a un virus del sarampión oncolítico sin actividad de gen suicida.
Recientemente, el empleo de un régimen clínico de aplicación repetitiva de un virus del sarampión recombinante sin actividad de gen suicida (cada 4 semanas durante hasta 6 ciclos) ha demostrado que los niveles de anticuerpo antisarampión en suero en el nivel inicial y a la finalización del estudio permanecieron estables tanto en la sangre como en el líquido peritoneal en comparación con el nivel inicial, lo que indica una ausencia de refuerzo significativo con respecto a la respuesta inmunitaria humoral (Galanis E, Hartmann LC, Cliby WA, Long HJ, Peetambaram PP, Barrette BA, Kaur JS, Haluska PJ Jr, Aderca I, Zollman PJ, Sloan JA, Keeney G, Atherton PJ, Podratz KC, Dowdy SC, Stanhope CR, Wilson TO, Federspiel MJ, Peng KW, Russell SJ. Cancer Res. 2010;70(3):875-82). Por tanto, se encontró que la aplicación repetitiva de virus del sarampión recombinantes era factible en el tratamiento de pacientes con cáncer.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un virus del sarampión recombinante basado en la cepa Schwartz de la vacuna contra el sarampión que codifica para un gen suicida, que comprende una fusión de una citosina desaminasa, particularmente una citosina desaminasa de levadura, y una uracilo fosforribosiltransferasa, particularmente una uracilo fosforribosiltransferasa de levadura.
En una realización particular del virus del sarampión recombinante según la presente invención, el gen suicida comprende una secuencia según la figura 2 (SEQ-ID NO. 2).
En una realización particular, el virus del sarampión recombinante comprende una secuencia de ARN mostrada en la figura 4 (SEQ-ID NO. 4), la figura 28 (SEQ-ID NO. 8) o la figura 29 (SEQ-ID NO. 9), particularmente la figura 4 (SEQ-ID NO. 4).
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para generar el virus del sarampión recombinante según la presente invención, que comprende la etapa de (a) clonar (i) el genoma de la cepa Schwartz de la vacuna contra el sarampión, y (ii) un gen suicida que comprende una fusión de una citosina desaminasa y una uracilo fosforribosiltransferasa, en un plásmido bajo el control de un promotor de ARN polimerasa II.
Se ha mostrado el uso del sistema de promotor de ARN polimerasa II para la expresión eficaz de ARN antigenómico (ARNc) a partir de ADNc de Mononegavirales para el virus de la enfermedad de Borna (VEB) y el virus del sarampión (Martin, A., Staeheli, P., y Schneider, U. RNA Polymerase II-Controlled Expresion of Antigenomic RNA Enhances the Rescue Efficacies of Two Different Members of the Mononegavirales Independently of the Site of Viral Genome Replication, J. Virol. 80 (2006) 5708-5715).
En una realización particular del método según la presente invención, el gen suicida comprende una citosina desaminasa de levadura.
El gen suicida comprende además una uracilo fosforribosiltransferasa, particularmente uracilo fosforribosiltransferasa de levadura.
El gen suicida comprende una fusión de una citosina desaminasa, particularmente citosina desaminasa de levadura, y una uracilo fosforribosiltransferasa, particularmente uracilo fosforribosiltransferasa de levadura.
En una realización particular del método según la presente invención, el gen suicida comprende una secuencia mostrada en la figura 2 (SEQ-ID NO. 2).
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Cuando se infectaron células A 673 o BRZ con Id-SCD de VS a MOI 1 y luego se cultivaron sin la adición del profármaco 5-FC, se calculó que la pérdida de masa celular tras 96 h estaba en el intervalo del 96% o el 75%, respectivamente, en comparación con células control no infectadas (valores rodeados por el rectángulo situado en el lado izquierdo de las gráficas).
Por el contrario, las células SRH que se habían infectado con Id-SCD de VS (MOI 1) y luego se habían cultivado sin la adición del profármaco 5-FC mostraron una pérdida de masa celular tras 96 h sólo en el intervalo del 10% en comparación con células control no infectadas. De este modo, las células SRH muestran una resistencia primaria al virus del sarampión de la técnica anterior (sin emplear una función de gen suicida adicional). Sin embargo, cuando se cultivaron células SRH infectadas con Id-SCD de VS (MOI 1) con la adición del profármaco 5-FC (que oscilaba entre 10-4 y 100 mM) se mostró una pérdida de masa celular tras 96 h en el intervalo de hasta el 55% en comparación con células control no infectadas.
Por tanto, se demostró que podía mejorarse significativamente una resistencia primaria al virus del sarampión de la técnica anterior (sin emplear una función de gen suicida adicional) de células SAS, pero no superarse aún en las condiciones elegidas (MOI 1) a través del uso de la función de gen suicida de SCD.
Ejemplo 10: Ensayo de liberación de LDH de células A 673 y SRH
La figura 13 muestra los resultados de un ensayo de liberación de LDH de células A 673 y SRH (células de sarcoma humano) tratadas con partículas virales de Id-SCD de VS rescatadas de pc3MerV2 Id-SCD (Id-SCD) e incubadas con el profármaco 5-FC.
Cuando se infectaron células A 673 con Id-SCD de VS a MOI 1 y luego se cultivaron sin la adición del profármaco 5-FC, se calculó que la liberación de la enzima LDH tras 96 h estaba en el intervalo del 54% en comparación con células control no infectadas que estaban completamente lisadas por el tratamiento con el detergente Triton X-100 (valores rodeados por el rectángulo situado en el lado izquierdo de las gráficas).
Las células SRH que se habían infectado con Id-SCD de VS (MOI 1) y luego se habían cultivado sin la adición del profármaco 5-FC mostraron una liberación de la enzima LDH tras 96 h sólo en el intervalo del 23% en comparación con células control no infectadas. Obsérvese que, cuando se cultivaron células SRH infectadas con Id-SCD de VS (MOI 1) con la adición del profármaco 5-FC (que oscilaba entre 10-4 y 100 mM), se mostraba un aumento en la liberación de la enzima LDH del 31% tras 96 h en comparación con células control no infectadas (establecidas a una masa celular del 100%).
Por tanto, se demostró que aún no podía superarse suficientemente una resistencia primaria al virus del sarampión de la técnica anterior (sin emplear una función de gen suicida adicional) de células SRH en las condiciones elegidas (MOI 1) a través del uso de la función de gen suicida de SCD.
Ejemplo 11: Ensayo de proliferación de tipo SRB de SRH células
La figura 14 muestra los resultados de un ensayo de proliferación de tipo SRB de células SRH tratadas con partículas virales de Id-SCD de VS rescatadas del plásmido pc3MerV2 Id-SCD (Id-SCD) a una MOI elevada de 10 (habitualmente, se usa una MOI de 1; en este caso se empleó el aumento en la “carga viral” para superar los fenómenos de resistencia observados a MOI 1 en presencia del profármaco 5-FC).
Las células SRH que se habían infectado con Id-SCD de VS a MOI 10 y luego se habían cultivado sin la adición del profármaco 5-FC mostraron una pérdida de masa celular tras 96 h en el intervalo del 68% ahora en comparación con células control no infectadas, que está mejorado significativamente en comparación con los resultados obtenidos a MOI 1, a la que sólo se obtuvo un 28% de pérdida de masa celular en comparación con células control no infectadas. Además, cuando se cultivaron células SRH infectadas con Id-SCD de VS (MOI 10) con la adición del profármaco 5-FC (que oscilaba entre 10-4 y 100 mM) se mostró una pérdida de masa celular tras 96 h en el intervalo de hasta el 89% en comparación con células control no infectadas.
Por tanto, se demostró que podía superarse una resistencia primaria al virus del sarampión de la técnica anterior (sin emplear una función de gen suicida adicional) de células SRH en las condiciones elegidas (MOI 10) a través del uso adicional de la función de gen suicida de SCD.
Ejemplo 12: Ensayo de proliferación de tipo SRB de células tumorales de sarcoma (líneas celulares CCS, LM)
La figura 15 muestra los resultados de un ensayo de proliferación de tipo SRB de células tumorales de sarcoma (líneas celulares CCS, LM) tratadas con partículas virales rescatadas del plásmido pc3MerV2 Id-SCD (Id-SCD) e incubadas con el profármaco 5-FC.
Las células CCS o LM que se habían infectado con vector Id-SCD de VS a MOI 1 y luego se habían cultivado sin la adición del profármaco 5-FC mostraron una pérdida de masa celular tras 96 h en el intervalo del 5% o el 25%,
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respectivamente, en comparación con células control no infectadas (valores rodeados por el rectángulo situado en el lado izquierdo de las gráficas). Por tanto, las células tanto CCS como LM muestran una resistencia primaria al virus del sarampión de la técnica anterior (sin emplear una función de gen suicida adicional). Sin embargo, cuando se cultivaron células CCS o LM infectadas con Id-SCD de VS (MOI 1) con la adición del profármaco 5-FC (que oscilaba entre 10-4 y 100 mM) se mostró una pérdida de masa celular tras 96 h en el intervalo de hasta el 79% o el 94%, respectivamente, en comparación con células control no infectadas.
Por tanto, se demostró que podía mejorarse fuertemente una resistencia primaria al virus del sarampión de la técnica anterior (sin emplear una función de gen suicida adicional) de células CCS y LM, y en el caso de células LM casi superarse completamente en las condiciones elegidas (MOI 1) a través del uso de la función de gen suicida de SCD.
Ejemplo 13: Ensayo de proliferación de tipo SRB de células tumorales de sarcoma (líneas celulares STO, ZAF, KD)
La figura 16 muestra los resultados de un ensayo de proliferación de tipo SRB de células tumorales de sarcoma (líneas celulares STO, ZAF, KD) tratadas con partículas virales de Id-SCD de VS rescatadas del plásmido pc3MerV2 Id-SCD (Id-SCD) e incubadas con el profármaco 5-FC.
Cuando se infectaron células STO, ZAF o KD con Id-SCD de VS a MOI 1 y luego se cultivaron sin la adición del profármaco 5-FC, se calculó que la pérdida de masa celular tras 96 h estaba en el intervalo del 76%, el 87% o el 94%, respectivamente, en comparación con células control no infectadas (valores rodeados por el rectángulo situado en el lado izquierdo de las gráficas).
Por tanto, las células STO, ZAF o KD no mostraban una resistencia primaria al virus del sarampión de la técnica anterior (sin emplear una función de gen suicida adicional). Cuando se cultivaron células STO, ZAF o KD infectadas con Id-SCD de VS (MOI 1) con la adición del profármaco 5-FC (que oscilaba entre 10-4 y 100 mM) se mostró una pérdida de masa celular tras 96 h en el intervalo de hasta el 94%, el 99% o el 98%, respectivamente, en comparación con células control no infectadas.
Ejemplo 14: Ensayo de proliferación de tipo SRB de células tumorales de sarcoma (líneas celulares CCS, LM)
La figura 17 muestra los resultados de un ensayo de proliferación de tipo SRB de células tumorales de glioblastoma (líneas celulares LNT 229, LNT 229 CTS-1) tratadas con partículas virales de Id-SCD de VS rescatadas del plásmido pc3MerV2 Id-SCD (Id-SCD) e incubadas con el profármaco 5-FC.
Las células LNT 229 o LNT 229 CTS-1 que se habían infectado con Id-SCD de VS a MOI 1 y luego se habían cultivado sin la adición del profármaco 5-FC mostraron una pérdida de masa celular tras 96 h en el intervalo del 56%
o el 27%, respectivamente, en comparación con células control no infectadas (valores rodeados por el rectángulo situado en el lado izquierdo de las gráficas). Por tanto, las células tanto LNT 229 como LNT 229 CTS-1 muestran una resistencia primaria al virus del sarampión de la técnica anterior (sin emplear una función de gen suicida adicional). Sin embargo, cuando se cultivaron células LNT 229 o LNT 229 CTS-1 infectadas con Id-SCD de VS (MOI 1) con la adición del profármaco 5-FC (que oscilaba entre 10-4 y 100 mM) se mostró una pérdida de masa celular tras 96 h en el intervalo de hasta el 97% o el 96%, respectivamente, en comparación con células control no infectadas.
Por tanto, se demostró que podía superarse casi completamente una resistencia primaria al virus del sarampión de la técnica anterior (sin emplear una función de gen suicida adicional) de células LNT 229 o LNT 229 CTS-1 en las condiciones elegidas (MOI 1) a través del uso de la función de gen suicida de SCD.
Ejemplo 15: Ensayo de proliferación de tipo SRB de células tumorales de glioblastoma (líneas celulares LN 18, LN 18 resistente a la apoptosis)
La figura 18 muestra los resultados de un ensayo de proliferación de tipo SRB de células tumorales de glioblastoma (líneas celulares LN 18, LN 18 resistente a la apoptosis) tratadas con partículas virales de Id-SCD de VS rescatadas del plásmido pc3MerV2 Id-SCD (Id-SCD) e incubadas con el profármaco 5-FC.
Las células LN 18 o LN 18 resistentes a la apoptosis que se habían infectado con Id-SCD de VS a MOI 1 y luego se habían cultivado sin la adición del profármaco 5-FC mostraron una pérdida de masa celular tras 96 h en el intervalo del 33% o el 22%, respectivamente, en comparación con células control no infectadas (valores rodeados por el rectángulo situado en el lado izquierdo de las gráficas). Por tanto, las células tanto LN 18 como LN 18 resistentes a la apoptosis muestran una resistencia primaria al virus del sarampión de la técnica anterior (sin emplear una función de gen suicida adicional). Sin embargo, cuando se cultivaron células LN 18 o LN 18 resistentes a la apoptosis infectadas con Id-SCD de VS (MOI 1) con la adición del profármaco 5-FC (que oscilaba entre 10-4 y 100 mM) se mostró una pérdida de masa celular tras 96 h en el intervalo de hasta el 97% o el 83%, respectivamente, en comparación con células control no infectadas.
Por tanto, se demostró que podía mejorarse fuertemente una resistencia primaria al virus del sarampión de la
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SCD de VS e Id-VP22SCD de VS + 5-FC; en cada caso dos ratones para Id-SCD de VS + 5-FC y para sólo Id-VP22SCD de VS). Algunos ratones de diferentes grupos de tratamiento desarrollaron un tumor secundario visible y palpable dentro de la cavidad peritoneal. Como esto se consideró un fallo del tratamiento, estos ratones no se excluyeron del análisis estadístico.
En todos los grupos de tratamiento, se observaron tumores con diferentes comportamientos de crecimiento. Algunos tumores crecieron muy rápidamente y alcanzaron el punto final definido de > 2000 mm3 aproximadamente en el día 30 tras el inicio del tratamiento, que era similar a los ratones tratados con control. Otros varios ratones tuvieron un crecimiento tumoral retardado, con un volumen tumoral bajo en las primeras semanas tras el inicio del tratamiento, pero finalmente, sus tumores comenzaron de nuevo a crecer y alcanzaron el volumen de punto final. Algunos otros tumores desaparecieron completamente y los ratones estuvieron libres de tumor durante más de 195 días. Este comportamiento diferencial se muestra a modo de ejemplo para ambos grupos de tratamiento con Id-SCD de VS. Además, algunos tumores tuvieron un comportamiento de crecimiento oscilante, que se debía probablemente a una replicación del virus que reduce el volumen tumoral, seguida por el crecimiento de las células tumorales restantes, ofreciendo al virus una nueva base para la replicación, conduciendo de nuevo a oncólisis y remisión del tumor. Esta contracción y crecimiento del tumor iba acompañado de la pérdida y la recuperación de la vascularización tumoral tal como se detecta mediante el brillo de color azul a través de la piel de los ratones. En el ejemplo mostrado en este caso, el tumor desapareció en última instante el día 91. Se consideró este crecimiento oscilante como una primera pista de una replicación de virus a largo plazo en tumores.
Se obtuvieron resultados similares con modelos animales de xenoinjerto adicionales (células de carcinoma hepatocelular humano HepG2 y células de carcinoma hepatocelular humano PLC/PRF/5): véanse las figuras 25 y 26, respectivamente.
Lista de secuencias
SEQ-ID NO. 1: secuencia genética de la cepa Schwartz de la vacuna contra el sarampión (véase la figura 1)
SEQ-ID NO. 2: secuencia genética de la fusión de citosina desaminasa de levadura y uracilo fosforribosiltransferasa de levadura (con secuencia ligadora) (véase la figura 2)
SEQ-ID NO. 3: secuencia genética del virus del sarampión recombinante básico sin ningún transgén pero con casetes de inserción (véase la figura 3)
SEQ-ID NO. 4: secuencia genética del vector pc3MerV2 Id-SCD (véase la figura 4)
SEQ-ID NO. 5: secuencia genética del plásmido auxiliar requerido para la expresión del gen N (véase la figura 5)
SEQ-ID NO. 6: secuencia genética del plásmido auxiliar requerido para la expresión del gen P (véase la figura 6)
SEQ-ID NO. 7: secuencia genética del plásmido auxiliar requerido para la expresión del gen L (véase la figura 7)
SEQ-ID NO. 8: secuencia genética del vector pMerV2 P-SCD, (véase la figura 28)
SEQ-ID NO. 9: secuencia genética del vector pc3MerV2 Id-VP22SCD (véase la figura 29)
19

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
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