ES2338416T3 - Vacunas de virus recombinantes de la estomatitis vesicular contra las fiebres hemorragicas. - Google Patents
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Abstract
Una partícula recombinante del virus de la estomatitis vesicular (VSV) que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una glicoproteína de la fiebre hemorrágica vírica (VHF) insertada en el genoma vírico, de modo que la glicoproteína de la VHF ha sustituido a la glicoproteína de VSV nativa y sólo se expresa la glicoproteína de la VHF en la superficie de la partícula de VSV recombinante, para uso como una vacuna, partícula que es infecciosa y es capaz de estimular la infección por dicho virus de la VHF pero que no causa la enfermedad ni los síntomas asociados con dicha VHF.
Description
Vacunas de virus recombinantes de la estomatitis
vesicular contra las fiebres hemorrágicas.
El presente invento se refiere, en general, al
campo de las respuestas inmunes protectoras y los virus
recombinantes.
\vskip1.000000\baselineskip
El virus de la estomatitis vesicular (VSV; del
inglés, vesicular stomatitis virus) es un virus
de RNA de cadena negativa no segmentada y pertenece a la familia
Rhabdoviridae, genero Vesiculovirus. Su estructura
sencilla y su rápido crecimiento con altos títulos en tipos
celulares de mamífero y muchos otros tipos celulares han hecho de
él una herramienta preferente para los biólogos moleculares y
celulares en los últimos 30 años. Esto se vio incluso reforzado con
el establecimiento del sistema de genética inversa para el VSV
(Schnell et al., 1996).
Los virus de la fiebre hemorrágica vírica (VHF;
del inglés, viral hemorrhagic fever) son
prototipos de agentes patógenos emergentes/reemergentes. Las
infecciones son asuntos de salud pública serios no sólo en países
endémicos en desarrollo sino también en muchos países no endémicos
desarrollados. Algunas de ellas representan una amenaza para la
población mundial y, por lo tanto, son incluidas en la lista de la
categoría A de agentes para bioterrorismo. En el pasado, el alto
nivel de contención biológica necesario para su manipulación ha
impedido estudios sobre virus tales como el virus Lassa y los virus
Marburg (MBG) y Ébola (EBO). Aunque estos virus pueden ser
desarrollados en cultivo tisular, la propagación del virus es
normalmente lenta y los títulos son bajos en comparación con otros
agentes patógenos víricos.
Aunque no hay vacunas autorizadas mundiales para
los virus con nivel IV de contención, ha habido un reciente
comunicado relativo a que primates no humanos fueron protegidos de
la infección por Ébola mediante una inmunización con DNA/adenovirus
(Sullivan et al., 2000). Esta estrategia de vacunación
requería varias inyecciones de DNA desnudo tanto a la glicoproteína
(GP) como a la nucleoproteína (NP) del virus Ébola, seguidas de la
inyección de un adenovirus que expresaba el gen para GP de Ébola.
Sin embargo, la vacuna protectora de primates no humanos requería
múltiples dosis de DNA desnudo y refuerzo adenovírico para alcanzar
la protección y, en el virus Ébola, la dosis utilizada para
estimular a los monos era sólo 6 unidades formadoras de placas, lo
que es muy poco. En general, el uso de esta vacuna para responder
rápidamente a brotes epidémicos o actos de bioterrorismo está
limitado porque se requieren exactamente 8 semanas para completar el
programa de inmunización.
Los sistemas de genética inversa, tal como el
VSV (Schnell et al., 1996), pueden ofrecer una posibilidad
para superar algunas de las limitaciones y pueden ser realmente
útiles para estudiar las etapas tempranas de la replicación, tal
como la entrada del virus, en el contexto de una partícula vírica.
Ya se han utilizado diferentes sistemas de seudotipos para estudiar
el papel de la glicoproteína del virus Ébola en la entrada celular
(Takada et al., 1997; Wool-Lewis, 1998; Yang
et al., 2000). De una manera similar, se usó un sistema de
seudotipo de VSV para estudiar las propiedades funcionales de la
glicoproteína del virus Ébola y para explorar además anticuerpos
neutralizantes contra dicha glicoproteína (Ito Hiroshi et
al., Journal of Virology 75 (3): 1576-1580,
02-2001). Sin embargo, el uso de partículas de
seudotipo está limitado a una infección de una sola etapa y, por lo
tanto, sigue siendo artificial. Los virus recombinantes serían más
realistas y potentes para estudiar el papel durante la replicación
in vitro e in vivo. La capacidad del genoma de VSV
para tolerar genes/unidades de transcripción adicionales hace que
este sistema sea adecuado para la expresión de proteínas extrañas a
alto nivel. Su manejo es relativamente poco complicado y, en
general, son fácilmente aplicables planteamientos virológicos.
El objeto de nuestro estudio fue producir
partículas de VSV recombinantes que expresaran glicoproteínas
transmembranales y solubles procedentes de virus de alta contención
con la idea de estudiar su papel en la replicación vírica, la
patogénesis vírica y la inducción de la respuesta inmune del
huésped. Aquí se describe la generación de varias partículas de VSV
recombinantes y la caracterización de su fenotipo biológico.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con un primer aspecto del invento, se
proporciona una partícula recombinante del virus de la estomatitis
vesicular (VSV) que comprende una molécula de ácido nucleico que
codifica una glicoproteína de la fiebre hemorrágica vírica (VHF)
insertada en el genoma vírico, de modo que la glicoproteína de la
VHF ha sustituido a la glicoproteína de VSV nativa y sólo se
expresa la glicoproteína de la VHF en la superficie de la partícula
de VSV recombinante, para uso como una vacuna, partícula que es
infecciosa y es capaz de estimular la infección por dicho virus de
la VHF pero que no causa la enfermedad ni los síntomas asociados con
dicha VHF.
De acuerdo con un segundo aspecto del invento,
se proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende genoma
recombinante del virus de la estomatitis vesicular y un gen de la
glicoproteína de la fiebre hemorrágica vírica (VHF), en que el gen
de la glicoproteína de la VHF ha sustituido al gen nativo de la
glicoproteína de VSV, para uso en la generación de una vacuna,
molécula de ácido nucleico que codifica una partícula, para uso
como una vacuna, que es infecciosa y es capaz de estimular la
infección por dicho virus de la VHF pero que no causa la enfermedad
ni los síntomas asociados con dicha VHF.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1 - Sistema genético inverso para VSV.
Diagrama esquemático del rescate de VSV. Células renales de cría de
hámster que expresaban constitutivamente la polimerasa del
bacteriófago T7 (BHK-T7) fueron transfectadas con
un plásmido para la expresión de la síntesis de cRNA de VSV,
controlada por el promotor de la RNA polimerasa de T7 y plásmidos
de soporte y la ribozima del virus de la hepatitis delta (HDV; del
inglés, hepatitis delta virus), que codifica
las proteínas de la RNP.
Figura 2. Infección por VSV G MBG GP. (A) Se
muestra el efecto citopatogénico (CPE; del inglés,
cytopathogenic effect) en células Vero E6
infectadas, por microscopía de contraste de fase, 24 horas después
de la infección. (B) Tinción de células Vero E6 infectadas, por
inmunofluorescencia, con un anticuerpo específico para MBG GP1.
Micrografías electrónicas que muestran VSV G MBG GP, VSVwt [VSV de
tipo silvestre (del inglés, wild type)] y VSV G Lassa
GP.
Figura 3. Curvas de crecimiento de VSV
recombinante. Se infectaron células Vero E6 con A) VSVwt, VSV EBO
sGP, MBG GP1 y con B) VSVwt, VSV G EBO GP y VSV G Lassa GP con una
multiplicidad de infección (MOI; del inglés, multiplicity
of infection) de 10. Se recogieron los sobrenadantes
en los momentos indicados y se titularon para definir la "dosis
infecciosa en cultivo tisular" [(TCID)_{50}; del inglés,
tissue culture infectious dose].
Figura 4. Expresión de glicoproteínas expresadas
por VSV recombinante. Se infectaron células Vero E6 con el VSV
recombinante con una MOI de 10. A) VSV G MBG GP: 24 horas después de
la infección, las proteínas fueron marcadas por impulsos durante 30
minutos con 740 kBq/ml de [^{35}S]-cisteína y
fueron perseguidas durante 6 horas. Las proteínas específicas de GP
fueron inmunoprecipitadas de los productos de lisis celulares con
inmunoglobulinas anti-MBG GP, de ratón, y fueron
analizadas por SDS-PAGE (electroforesis en gel de
poliacrilamida con SDS; del inglés, sodium dodecyl
sulfate-polyacrylamide gel
electrophoresis) al 10% bajo condiciones reductoras. La
presencia del decRVKR (25 mM) (un inhibidor de escisión) durante la
marcación y la persecución anuló la escisión de preGP (carril 2).
B) VSV G EBO GP: 24 horas después de la infección, las células
fueron lisadas y fueron analizadas por transferencia Western con un
anticuerpo específico para GP1 (carril 1) y un anticuerpo
específico para GP2 (carril 2). C) VSV G Lassa G: 24 horas después
de la infección, las células fueron lisadas y fueron analizadas por
transferencia Western con un anticuerpo específico para G2.
D-F) VSVwt (carril 1), VSV EVO sGP (carril 2), VSV
MBG GP1 (carril 3): 24 horas después de la infección, las células
fueron lisadas y fueron analizadas por transferencia Western con un
anticuerpo específico para VSV G (D), un anticuerpo específico para
EBO sGP y un anticuerpo específico para MBG GP1.
Figura 5. Tropismo celular: Se infectaron
células Jurkat con VSVwt, VSV G Lassa G o VSV G Ébola GP con una
MOI de 10. (A) Se midieron los títulos víricos en células Vero E6 en
los puntos temporales indicados determinando la dosis infectiva en
cultivo tisular (TCID)_{50}/ml. (B) En los momentos
indicados, se recogieron las células y los sobrenadantes y se
demostró el crecimiento vírico mediante transferencia Western
utilizando un suero de conejo generado contra la nucleoproteína (N)
de VSV.
Figura 6. Diagrama esquemático del genoma normal
de VSV (A), el VSV\DeltaG::EBOVGP (B, sustitución de la
glicoproteína de VSV) y el VSV::EBOVsGP (C, VSV G normal más la
glicoproteína secretora de Ébola).
Figura 7. Se evaluaron los signos clínicos de la
enfermedad, incluyendo el porcentaje de cambio de peso, después de
la estimulación con 6000 DL_{50}s de virus Ébola adaptado para
ratón. Porcentaje de cambio de peso corporal de los ratones
inmunizados los días 0 y 21 (vía intraperitoneal) con 1x10^{5}
unidades formadoras de placas (pfu; del inglés, plaque
forming units) de VSV Lassa GP, VSV-ÉbolaGP, VSV
Marburg GP o Testigos Naífs y luego estimulados con 6000 DL_{50}s
de Ébola Mayinga adaptado para ratón (vía intraperitoneal). Todos
los ratones de los grupos VSV Lassa GP, VSV Marburg GP y Testigo
Naíf murieron el día 8. Todos los ratones inmunizados con VSV-Ébola
GP sobrevivieron a la estimulación hasta el día 28 y no mostraron
pérdida de peso corporal.
Figura 8. Títulos de virus Ébola en la sangre de
ratones infectados con 6000 DL_{50}s de virus Ébola adaptado para
ratón. TCID_{50} de virus Ébola en muestras sanguíneas de ratón
estimulados con 6000 DL_{50}s de Ébola Zaire Mayinga adaptado
para ratón. La TCID_{50} de 2,3 (log_{10}) era el límite
inferior de detección en este ensayo. En ningún momento hubo virus
Ébola vivo aislado de los ratones inmunizados. Todos los ratones
falsamente inmunizados (VSVwt) estaban muy enfermos el día 6 y todos
murieron el día 7. Los ratones fueron inmunizados con una inyección
intraperitoneal de 1x10^{5} pfu de VSVwt o ÉbolaGP.
Figura 9. La protección proporcionada por la
vacuna ÉbolaGP es independiente de la dosis de estimulación. Los
ratones fueron inmunizados con 1x10^{5} pfu de VSVwt (1 grupo, n =
6) o ÉbolaGP (4 grupos, n= 6) mediante una inyección
intraperitoneal, una vez el día 0. El día 28, los animales fueron
estimulados con Ébola Zaire Mayinga adaptado para ratón con dosis
crecientes, de 6000 DL_{50}s a 6 millones de DL_{50}s. Todos los
animales testigo VSVwt murieron el día 7 y, antes de la muerte,
todos presentaban una drástica pérdida de peso y síntomas clínicos
de fiebre hemorrágica vírica; estos ratones fueron estimulados con
6000 DL_{50}s. Los ratones ÉbolaGP fueron estimulados con entre
2x10^{3} y 2x10^{6} DL_{50}s y todos sobrevivieron sin
presentar síntomas ni perder peso.
\vskip1.000000\baselineskip
A menos que se defina otra cosa, todos los
términos técnicos y científicos aquí utilizados tienen un
significado igual al comúnmente entendido por quien tiene una
experiencia normal en la técnica a la cual pertenece el invento.
Aunque en la práctica o el ensayo del presente invento se pueden
utilizar cualesquier métodos y materiales similares o equivalentes
a los aquí descritos, se describen ahora los métodos y materiales
preferidos.
Se describen aquí virus de la estomatitis
vesicular (VSV) recombinantes y partículas de VSV recombinantes que
expresan glicoproteínas extrañas, por ejemplo, glicoproteínas
víricas, de los cuales se muestran en la Figura 6 ejemplos
ejemplares. También se describe el uso de las partículas de VSV
recombinantes para provocar una respuesta inmune en un animal
necesitado de ella.
En algunas realizaciones, la glicoproteína
extraña es una glicoproteína de la VHF o un fragmento inmunogénico
de la misma.
Se describen aquí VSV recombinantes que pueden
expresar la glicoproteína nativa del VSV y que tienen genes
adicionales que codifican glicoproteínas extrañas. Estos virus
tienen la variedad de huéspedes del VSV pero expresan los genes de
glicoproteínas extrañas durante la replicación. Estos tendrán los
usos de los virus con sustitución de glicoproteína.
La glicoproteína de la VHF puede ser, por
ejemplo, pero sin limitarse en modo alguno a, la glicoproteína del
virus Lassa, el virus Marburg, el virus Ébola, el virus
Crimean-Congo HF, el virus del dengue, el virus
Nipah, el virus Hendra, el virus Machupo, el virus Junin, el virus
Guanarito y el virus Sabia. Como apreciará quien tiene experiencia
en la técnica, en este sistema se puede usar cualquier virus con
envoltura y con glicoproteínas transmembranales, que son
determinantes de inmunidad. En otras realizaciones, se pueden
utilizar fragmentos inmunogénicos de estas glicoproteínas, así como
proteínas de fusión que incluyan epítopos o fragmentos inmunogénicos
de la glicoproteína de interés. Como apreciará quien tiene
experiencia en la técnica, hay numerosos algoritmos y/o programas
informáticos disponibles para pronosticar epítopos y fragmentos
potencialmente inmunogénicos.
En algunas realizaciones, el VSV recombinante
puede incluir moléculas de ácido nucleico que codifican secuencias
genéticas adyuvantes para provocar un patrón específico de
respuestas inmunes. Los adyuvantes genéticos pueden ser, por
ejemplo, pero sin limitarse en modo alguno a, IL-2,
IL-4, GM-CSF y las moléculas
coestimuladoras CD80 y CD86.
En algunas realizaciones, el orden génico del
clon del genoma de VSV de longitud completa puede ser alterado de
modo que el primer gen codifique la glicoproteína en lugar de la
nucleoproteína. Esto tendrá dos efectos: el virus estará más
atenuado y se generará más glicoproteína, aumentando por ello la
eficacia de la vacuna.
Además, en otras realizaciones, se inserta una
nucleoproteína vírica extraña junto con el gen de la glicoproteína,
generándose por ello una partícula vírica recombinante
multivalente.
Como resultará evidente a quien tiene
experiencia en la técnica, sólo se expresará la glicoproteína
extraña en la superficie de la partícula de VSV recombinante, y así
se presenta al sistema inmune del huésped. De este modo, la
partícula de VSV recombinante es un sistema infeccioso que simula
una infección con el virus extraño y, sin embargo, no causa la
enfermedad ni los síntomas asociados con el virus extraño. Además,
la respuesta inmune generada es protectora independientemente de la
vía de inmunización. Como resultará evidente a quien tiene
experiencia en la técnica, sólo se requiere una dosis única de la
vacuna para provocar una respuesta inmune protectora en el huésped,
que puede ser un ser humano. Es importante advertir que el virus
debe estar vivo para generar la protección, ya que un virus
sometido a radiación gamma no proporciona protección.
En un ejemplo ejemplar descrito más adelante, el
sistema simula una infección con el virus Ébola y, sin embargo, no
produce efectos secundarios negativos. La partícula de VSV
recombinante puede proteger frente a 2 millones de dosis letales de
virus Ébola adaptado para ratón y es protectora después de un
suministro intranasal, como se discute más adelante.
Como apreciará quien tiene experiencia en la
técnica, los vectores que contienen las GPs transmembranales de
longitud completa de Ébola, Marburg y Lassa son viables porque las
glicoproteínas extrañas sustituyeron a la glicoproteína de VSV
nativa. Además, se creía que las GPs de Ébola y Marburg eran
determinantes de virulencia importante y, por lo tanto, se preveían
síntomas morbosos. La estimulación con Ébola sólo se hizo como una
idea posterior, cuando los ratones sobrevivieron a la infección con
los virus VSV recombinantes.
Es importante advertir que una partícula de VSV
recombinante como la aquí descrita puede ser administrada oral,
intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal o
intranasalmente a un individuo que necesite dicho tratamiento. Es
importante advertir además que un individuo que necesite dicho
tratamiento puede ser un individuo que presente riesgo de infección
por el virus extraño.
En aún otras realizaciones, la partícula de VSV
recombinante se utiliza para inocular a un animal para generar una
respuesta inmune. En estas realizaciones, un material que contiene
anticuerpos es luego recolectado o purificado y es utilizado como
una terapia tras la exposición (inmunidad pasiva). Como apreciará
quien tiene experiencia en la técnica, el material que contiene
anticuerpos puede ser plasma, yema de huevo, leche o similar.
El invento será ahora descrito por medio de
ejemplos; sin embargo, el invento no se limita a los ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
I
Se describió previamente un plásmido que expresa
el complemento de RNA de cadena positiva del genoma de VSV con un
sitio para la expresión de genes extraños (Schnell, 1996). Este
plásmido contiene los cinco genes de VSV (nucleoproteína N,
fosfoproteína P, proteína matricial M, glicoproteína G y polimerasa
L) en orden, flanqueados por el promotor del bacteriófago T7, la
secuencia líder de VSV, la ribozima del virus de la hepatitis delta
(HDV), y la secuencia terminadora de T7. Entre el gen G y el L está
presente un sitio conector único (XhoI, NheI), flanqueado por una
señal de inicio y parada de la transcripción para el gen adicional
que se va a expresar. Los genes que codifican las glicoproteínas
solubles del virus Ébola (sGP) y los genes del virus Marburg (GP1)
fueron clonados en los sitios XhoI y NheI del vector VSVXN2 de
longitud completa (Schnell et al., 1996). Los plásmidos
obtenidos fueron denominados pVSVxn2/mbgGP1 y pVSVxn2/ebosGP,
respectivamente, y tienen los genes extraños situados entre los
genes G y L de VSV. Los marcos de lectura abiertos que codifican las
glicoproteínas transmembranales de los virus Marburg, Ébola y Lassa
se clonaron en los sitios XhoI y NheI del vector VSVXN2AG de
longitud completa modificado que carecía de la glicoproteína G de
VSV. Los plásmidos resultantes fueron llamados pVSVxn2 G/mbgGP,
pVSVxn2 G/eboGP y pVSVxn2 G/lvGPc.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
II
Se recuperaron VSVs recombinantes utilizando
métodos establecidos. Células renales de cría de hámster que
expresaban constitutivamente la polimerasa del bacteriófago T7
(BHK-T7) fueron desarrolladas hasta una confluencia
de aproximadamente 90% en placas de 6 cm. Las células fueron luego
transfectadas, en un nivel 2 de seguridad biológica (BSL2; del
inglés, biological safety level 2), con los
plásmidos de soporte que codificaban los componentes de la
ribonucleoproteína (RNP) vírica, 0,5 \mug de
PBS-N, 1,25 \mug de PBS-P, 0,25
\mug de PBS-L y 2 \mug del plásmido que
codificaba uno de los cinco clones genómicos recombinantes
anteriormente descritos. Las transfecciones se llevaron a cabo con
Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones
del fabricante. Puesto que en ese momento no se había realizado la
clasificación de bioseguridad de estos virus recombinantes, se
transfirieron inmediatamente las células transfectadas al BSL4.
Después de 48 horas a 37ºC, los sobrenadantes fueron subcultivados
a ciegas (sin evidencia de infección) en células Vero E6
(confluentes al 80-90%). Posteriormente, los virus
VSV recombinantes han sido clasificados como virus de contención
biológica de nivel 2 y, por lo tanto, son adecuados para estudios
sobre vacunaciones humanas. La recuperación del virus infeccioso
fue confirmada explorando monocapas de VeroE6 en cuanto al efecto
citopático del VSV. El VSV recombinante rescatado fue subcultivado
en células Vero E6 para obtener una reserva vírica. La reserva
vírica fue titulada en placas, sobre células Vero E6.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
III
Células Vero E6 desarrolladas en cubreobjetos
fueron infectadas con el VSV recombinante con una MOI de 1. Después
de la adsorción del virus durante 45 minutos a 37ºC, el inóculo fue
sustituido por medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM; del
inglés, Dulbecco's modified essential
medium) que contenía suero de ternera fetal (FCS; del
inglés, foetal calf serum) al 2%. 24 horas
después de la infección, las células fueron fijadas durante la
noche con paraformaldehído al 4% en PBS. Después de un cambio del
paraformaldehído, las células fueron retiradas del BSL4 y fueron
tratadas con radiación gamma (2 x 10^{4} Gy). Después de la
inactivación, las células fueron lavadas con PBS y fueron
permeabilizadas con Triton X-100 al 0,1% en PBS
durante 15 minutos. Posteriormente, las células fueron incubadas
durante 1 hora a temperatura ambiental con un apropiado anticuerpo
primario (diluido en PBS). Las muestras fueron lavadas tres veces
con PBS y fueron incubadas durante otra hora con un anticuerpo
secundario (anti-especie) conjugado con Cy3 o con
FITC. Después de un lavado (3 veces), se montaron los cubreobjetos
con Supermount (Biogenex, Alemania) y se examinaron con un
microscopio Zeiss.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
IV
Se desarrollaron VSVs recombinantes en células
Vero E6, y se recuperaron viriones de los sobrenadantes de cultivo
por ultracentrifugación y se fijaron en una disolución de
paraformaldehído al 2% y glutaraldehído al 0,5%. Las suspensiones
víricas fijadas fueron transferidas a rejillas de cobre para
microscopía electrónica previamente revestidas con carbono. Las
rejillas revestidas fueron encerradas herméticamente en bolsas y
retiradas del BSL4. Para la inactivación, las rejillas fueron
tratadas con radiación gamma, con 2 x 10^{4} Gy, utilizando una
fuente de cobalto. Se llevó a cabo una tinción negativa con ácido
fosfotúngstico al 2% (pH de 6,8) durante 1 minuto. Se eliminó el
fluido en exceso y se examinaron las rejillas utilizando un
microscopio electrónico de transmisión.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
V
Se inóculo el VSV recombinante, con una MOI de
10 pfu/célula, a células Vero E6 (placa de 6 cm). El inóculo fue
sustituido después de 1 hora por DMEM que contenía suero bovino
fetal (FBS; del inglés, foetal bovine serum)
al 2% (ambos de Gibco/BRL). Cuando se infectaron células Jurkat
(clon e6-1, un clon de células T), se utilizó una
versión ligeramente modificada del protocolo descrito por Montel
et al. (1997). En resumen, se infectaron las células durante
1 hora, con una MOI de 10 pfu/célula, a temperatura ambiental con un
mezclamiento suave cada 10-20 minutos. Luego se
añadió DMEM que contenía suero bovino fetal (FBS) al 2% y se
continuó el cultivo durante 1 hora a 37ºC. Las células fueron luego
lavadas 3 veces en DMEM y fueron resuspendidas, en una cantidad de
10^{6} células/ml, en medio que contenía FBS al 2%, con 1 ml por
pocillo de una placa de 12 pocillos. Para los experimentos de
marcación metabólica, las células fueron incubadas durante 24 horas,
lavadas con DMEM deficiente en cisteína, marcadas por impulsos
durante 30 minutos en el mismo medio complementado con 740 kBq/ml
de [^{35}S]-metionina/cisteína y perseguidas
durante 240 minutos. Para los estudios de inhibición de la
escisión, las células infectadas fueron incubadas durante periodos
de privación, impulso y persecución, con la
peptidil-clorometil-cetona
decanoilada (decRVKR-CMK) en una concentración 25
\muM. Las células marcadas fueron lisadas en tampón para
coinmunoprecipitación (co-ip) [Nonidet
P-40 (NP-40) al 1%, desoxicolato
sódico al 0,4%, BSA al 0,5%, EDTA 5 mM, NaCl 100 mM,
Tris-HCl 20 mM, pH de 7,6, yodoacetamida 25 mM, PMSF
1 mM] a 4ºC. La inmunoprecipitación se llevó a cabo utilizando un
anticuerpo monoclonal específico para proteína. Las proteínas
precipitadas fueron sometidas a SDS-PAGE al 10% bajo
condiciones reductoras y fueron visualizadas mediante fluorografía.
Para el análisis por inmunotransferencia, las células fueron lavadas
con PBS 24 horas después de la infección y fueron lisadas en el
tampón de carga del SDS-gel. Las proteínas fueron
resueltas por SDS-PAGE (10%) y fueron transferidas
a membranas de PVDF. Se detectó la expresión de la proteína extraña
utilizando anticuerpos apropiados.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
VI
Se cultivaron células Vero E6 hasta una densidad
celular de 10^{6} por pocillo de una placa de 12 pocillos y se
infectaron con los diferentes VSVs recombinantes con una MOI de 10
pfu/célula. Luego se lavaron las células 3 veces en DMEM y se
añadió 1 ml de medio fresco que contenía FBS al 2%. Los cultivos
(células y sobrenadantes) fueron recolectados en los puntos
temporales indicados y fueron centrifugados a 3000 g durante 5
minutos a 4ºC. Los sobrenadantes fueron almacenados a -80ºC. La
titulación se llevó a cabo definiendo la "dosis infecciosa en
cultivo tisular", (TCID)_{50}. Para esto, se diluyeron
10 veces los sobrenadantes y se utilizaron las diluciones para
infectar las células Vero E6 en 96 pocillos (cinco pocillos para
cada dilución). Los cultivos fueron calificados periódicamente en
cuanto a los efectos citopatogénicos (CPE) durante un periodo de 7
días. Los títulos víricos de los sobrenadantes de los cultivos en
el punto final fueron calculados utilizando el método de Reed y
Muench (1938). Los títulos víricos se expresan como el logaritmo
decimal del 50 por ciento del punto final de la titulación en
cuanto a infectividad, como se calcula por el método de
Spearman-Karber.
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Ejemplo
VII
Se inmunizaron grupos de 5 hembras de ratón con
10^{5} unidades formadoras de placas (pfu) de VSV\DeltaG::EBOVGP
(ÉbolaGP), VSV\DeltaG::MBGVGP, VSV\DeltaG::LassaVGP o VSV de
tipo silvestre (VSVwt). Se administraron dos dosis de vacuna el día
0 y el día 28. En cada ocasión, la vacuna se administró por vía
intraperitoneal (i.p.). 28 días después de la dosis de refuerzo,
los ratones fueron estimulados con 6000 DL_{50}s de virus Ébola
adaptado para ratón. Los ratones que recibieron ÉbolaGP resultaron
completamente protegidos de la infección por el virus Ébola,
mientras que todos los ratones de los otros grupos sucumbieron
rápidamente a la infección (Tabla 1). La medición de los signos
clínicos es un ensayo de protección bastante más sensible que la
simple observación de la supervivencia. Como parte de la
observación clínica, se registraron los pesos de los ratones y se
calculó el porcentaje individual de cambio después de la
estimulación (Figura 7). Los resultados demostraron que había un
claro efecto protector específico de inmunización con la vacuna
ÉbolaGP.
El siguiente paso fue intentar proteger a los
ratones después de justo una sola dosis de vacuna. Los ratones
fueron inmunizados de nuevo con 10^{5} pfu de VSVwt o ÉbolaGP, de
nuevo i.p. el día 0. Los ratones fueron luego estimulados con el
virus Ébola adaptado para ratón, 28 días después de la inmunización.
En esta ocasión, los ratones inmunizados fueron estimulados con
entre 2x10^{3} y 2x10^{6} pfu de virus Ébola, y los ratones
testigo VSVwt fueron estimulados con 2x10^{2} pfu. Todos los
ratones testigo presentaron rápidamente síntomas y pérdida de peso,
mientras que todos los ratones inmunizados permanecieron sanos y sin
síntomas. Por lo tanto, la protección de la vacuna ÉbolaGP es
aparentemente independiente de la dosis de estimulación (Figura
8).
Se determinó la viremia de Ébola durante 6 días
después de la estimulación en ratones inmunizados tanto con VSVwt
como con ÉbolaGP (Figuran 9). Se escogieron diariamente tres ratones
de los grupos testigo de tipo silvestre y de vacuna y se extrajeron
sangre y el bazo para la estimación del título vírico (TCID_{50}).
No fue posible detectar el virus Ébola en la sangre de los ratones
inmunizados con la vacuna ÉbolaGP en ningún momento. Sin embargo,
los ratones que habían recibido la vacuna VSVwt desarrollaron una
viremia el día 3 después de la infección, y esta viremia empeoró
progresivamente hasta que los ratones murieron el día 7.
Hasta aquí todos los estudios han sido llevados
a cabo utilizando la vía i.p. Esta vía es útil para la inmunización
experimental pero no podría ser utilizada para la vacunación de
seres humanos. Por lo tanto, se investigó el efecto de la vía de
vacunación sobre la protección y, como se muestra en la Tabla 2, la
protección es independiente de la vía de inmunización. Sin embargo,
la vacuna debe ser viable en el momento de la inmunización para
proporcionar protección, ya que la vacuna tratada con radiación
gamma no protegió a los ratones de la infección por Ébola.
En resumen, se ha desarrollado una vacuna que
puede proteger a los ratones de la infección por Ébola. Esta
protección no pudo ser vencida por el incremento de la dosis de
estimulación y no resultó afectada por la alteración de la vía de
inmunización. Además, parece que la viremia está completamente
controlada en los ratones inmunizados, y esto es demostrado por la
completa falta de síntomas clínicos en estos ratones así como por
los datos de TCID_{50}.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
VIII
La capacidad para manipular genéticamente el VSV
ha conducido ya a una diversidad de nuevas ideas en el campo de la
investigación del VSV con respecto a estudios de
estructura-función de genes víricos, el análisis de
elementos promotores y otros elementos no codificadores. Además, la
capacidad del genoma del VSV para tolerar genes/unidades de
transcripción adicionales o para intercambiar el gen de la
glicoproteína por una glicoproteína transmembranal extraña hace que
este sistema sea útil con fines de expresión a alto nivel. Además,
se utilizaron VSVs recombinantes como candidatos prometedores para
vacunas de virus vivos (influenzavirus A, VIH, BVDV). El posible
papel de los VSVs recombinantes como vacunas viene apoyado por los
hechos de que el VSV y los rVSVs crecen con títulos elevadísimos en
muchas líneas celulares, el VSV provoca una potente respuesta inmune
celular y humoral in vivo, y las infecciones de seres
humanos por VSV son raras y los síntomas, si es que hay, son
benignos.
En este estudio, se quería establecer un sistema
para expresar y estudiar la función de glicoproteínas solubles y
glicoproteínas transmembranales de virus de la fiebre hemorrágica
vírica. Para esto, se modificó el clon de cDNA de longitud completa
(pVSVxn2) sustituyendo el gen G del VSV por las glicoproteínas de
los virus MBG_{V}, EBO_{V} y Lassa o insertando los genes que
codifican la sGP de EBO_{V} (Volchkov et al., 1995; Sánchez
et al., 1996) y la GP1 de MBG_{V}, que es el fragmento de
escisión grande liberado durante la infección en cultivo tisular
(Volchkov et al., 1998 a, b), entre los genes G y L de VSV.
Se transfectaron células BHL-T7 con estos cDNAs y
se rescató el virus. Los virus rescatados fueron denominados VSV G
MBG GP, VSV G EBO GP, VSV G Lassa G, VSV MBG GP1 y VSV EBO sGP,
respectivamente. Estudios de los virus recombinantes negativamente
contrastados, por microscopía electrónica (Figura 2), proporcionaron
datos relativos a que la sustitución de la glicoproteína G del VSV
no tiene impacto alguno sobre la morfología de los viriones. El VSV
recombinante, independientemente de la glicoproteína insertada,
mostraba las típicas partículas de rhabdovirus con forma de bala y
contenía una nucleocápsida electrodensa con forma de bala. La
nucleocápsida estaba unida por una envoltura. Las envolturas
víricas estaban revestidas con proyecciones superficiales. Las
proteínas extrañas podían sustituir completamente a la G del VSV en
el ensamblaje y no influían en la formación de la estructura de las
partículas.
Además, parece que el procesamiento de las
glicoproteínas extrañas se produce de la misma manera que en los
sistemas víricos de la VHF auténticos. Utilizando métodos
inmunológicos y bioquímicos, se confirmó la expresión y el
procesamiento proteolítico de las glicoproteínas víricas extrañas.
La tinción por inmunofluorescencia ejemplarmente mostrada para
células Vero E6 infectadas con VSV G MBG GP, usando un anticuerpo
específico para GP, permite detectar MBG GP en la superficie de las
células infectadas (Figura 2B).
En la Figura 3A, se muestra el procesamiento
proteolítico de la glicoproteína de MBGV en los dos fragmentos de
escisión GP1 (160 kDa) y GP2 (38 kDa), por inmunoprecipitación con
un anticuerpo monoclonal contra MBG GP. La escisión de la MBG GP
codificada por VSV resultó significativamente restringida cuando se
expresaba GP en presencia de la
peptidil-clorometil-cetona
decanoilada decRVKR-CMK, un potente inhibidor de la
furina, una endoproteasa similar a la subtilisina. Mediante un
análisis por inmunotransferencia se demostraron la expresión y el
procesamiento proteolítico de EBO GP y Lassa G. Los dos fragmentos
de escisión de la glicoproteína transmembranal de EBOV, GP1 (140
kDa) y GP2 (26 kDa), se detectaron con un suero
anti-GP, que reconoce GP1 (Figura 3B, carril
izquierdo), y un suero monoespecífico anti-GP2
(Figura 3B, carril derecho). En la parte C se demuestra la escisión
del precursor (76 kDa) de la glicoproteína del virus Lassa en G1 (no
mostrado) y G2 (36 kDa). En este caso, la detección se llevó a cabo
con un antisuero específico generado contra el extremo carboxílico
de G2. Además del precursor (no completamente escindido) y el
fragmento G2, se detectó un fragmento de 10 kDa hasta ahora
desconocido que necesita una mayor atención. En la Figura 3, partes
D-F, se muestra la expresión de las glicoproteínas
solubles por el VSV recombinante. Además de VSV G, que es expresada
por células infectadas con VSVwt, VSV MBG GP1 y VSV EBO sGP (Figura
3D, carriles 1-3), EBO sGP (Figura 3E, carril 2) y
MBG GP1 (Figura 3F, carril 3) son sólo detectables en células
infectadas con el respectivo virus recombinante, como aquí se
demuestra al utilizar el anticuerpo monoespecífico.
Se examinó la replicación de los virus
recombinantes, bajo condiciones de crecimiento de una sola etapa, en
células Vero E6 infectadas con una MOI de 10, lo que fue seguido de
una incubación a 37ºC. Se recogió el fluido sobrenadante en
diversos momentos y se midieron las producciones víricas mediante el
TCID_{50}.
En la parte B de la Figura 3 se muestra la
cinética de crecimiento de los virus recombinantes con una
sustitución de la glicoproteína de VSV. Los títulos víricos para
VSVwt, VSV G Lassa GP y VSV G Ébola GP alcanzaron valores
logarítmicos tres a cuatro veces mayores que los niveles de fondo.
Sin embargo, los títulos máximos se alcanzaron entre 8 horas y 12
horas después de la infección para VSVwt, 24 horas después de la
infección para VSV G Lassa GP, y 36 horas después de la infección
para VSV G Ébola GP. Esto indicaba diferencias en cuanto a la
replicación para los virus recombinantes si la glicoproteína de VSV
es sustituida por una glicoproteína extraña. Los virus
recombinantes, que contienen unidades de transcripción adicionales,
tienen una cinética de crecimiento similar a la del VSV de tipo
silvestre. En la parte A de la Figura 3 se muestran las curvas de
crecimiento para VSV Ébola sGP y VSV MBG GP1. Los títulos víricos
para VSVwt, VSV Ébola sGP y VSV MBG GP1 alcanzaron valores
logarítmicos tres a cuatro veces mayores que los niveles de fondo
y, en los tres casos, los títulos máximos se alcanzaron entre 8
horas y 12 horas después de la infección, lo que indica que la
adición de genes no afecta a la cinética de crecimiento de los
virus recombinantes.
Estudios sobre tropismo celular revelaron que el
tropismo de los virus recombinantes depende, como se esperaba, de
la glicoproteína transmembranal y no está influido por las
glicoproteínas solubles adicionales expresadas desde una unidad de
transcripción separada. Entre 8 horas y 12 horas después de la
infección, los títulos víricos para VSVwt en células Jurkat
alcanzaron valores logarítmicos cuatro veces mayores que los niveles
de fondo. Sin embargo, VSV G Lassa GP y VSV G Ébola GP fallaron a
la hora de infectar, y replicarse en, células Jurkat. Esto indicaba
que la sustitución de la glicoproteína de VSV conducía a un cambio
en el tropismo celular, como se esperaba a partir de los estudios
de infección utilizando los virus Ébola y Lassa, en los que ninguno
de los dos producía una infección productiva de células Jurkat. Con
objeto de confirmar los resultados, se llevaron a cabo
inmunotransferencias. Se infectaron células con VSVwt y VSV G Lassa
G con una MOI de 10 pfu/célula. En los puntos temporales indicados,
se recolectaron las células y los sobrenadantes y se analizaron por
inmunotransferencia utilizando un suero de conejo generado contra
VSV N. El VSVwt se detectó más pronto, intracelularmente a las
cuatro horas después de la infección y en el sobrenadante a las ocho
horas después de la infección, lo que indicaba la liberación de
partículas víricas. No fue detectable replicación alguna para los
virus VSV G Lassa GP y VSV G EBO GP, lo que confirmaba que estos
virus recombinantes no son capaces de infectar productivamente
células Jurkat. La ventaja de los VSVs que codifican glicoproteínas
extrañas y son competentes en cuanto a la replicación, además de su
uso en estudios in vitro sobre tropismo celular, es el
potencial para utilizar estos virus en estudios in vivo, en
los que son necesarios múltiples ciclos de replicación. Esto
incluye, por ejemplo, la investigación de la variedad de huéspedes
o del tropismo de órgano. Los VSVs recombinantes con tropismo
celular (tropismo de órgano) alterado (especificado) podrían ser
útiles incluso para planteamientos de distribución celular de genes
específicos.
De esta manera, estos virus recombinantes
representan un excelente sistema para estudiar el papel de las
glicoproteínas en el tropismo celular y la patogénesis in
vivo e in vitro. Datos preliminares en animales sugieren
además que los virus recombinantes pueden ser manipulados con más
seguridad que los virus de la VHF de donantes.
En relación con la Tabla 3, es importante
advertir que se considera que el cobayo es un modelo más sensible
para una infección por el virus Ébola y, en consecuencia, más
difícil de proteger. Sin embargo, los datos de la Tabla 3 indican
que la vacuna es muy potente y es capaz de proteger al menos dos
especies diferentes.
En relación con la Tabla 4, estos datos muestran
que tenemos una vacuna mucosa de una sola dosis, capaz de proteger
a animales de la estimulación con 6 millones de partículas víricas.
Obviamente, las vacunas mucosas, sean orales o sean intranasales,
son mucho más fáciles de distribuir que las inyectadas y podrían ser
desplegadas más fácilmente en el caso de un ataque bioterrorista o
de una epidemia. El elevado nivel de protección alcanzado indicaría
que se podría alcanzar protección frente a un ataque bioterrorista o
frente al daño accidental al clavarse una aguja en un hospital que
trata pacientes.
En relación con la Tabla 5, estos datos muestran
que se puede alcanzar una protección completa con una inmunización
justo 7 días antes de la estimulación y una protección significativa
(p < 0,05) cuando se administra 30 minutos después de la
estimulación, lo que indica que hay un campo de aplicación para una
terapia de vacunación tras una exposición. Conjuntamente
considerados, los dos conjuntos de datos demuestran una aplicación
potencial significativa en la prevención de una enfermedad en
situaciones de epidemia y como una vacuna utilizada en respuesta a
un ataque bioterrorista o por armas biológicas. El tiempo para que
se desarrolle inmunidad después de la administración de la vacuna
ÉbolaGP es más corto que el requerido para la vacuna descrita por
Sullivan et al. (2000).
En relación con la Tabla 6, una sola
inmunización dio lugar a una protección que duró al menos 9 meses
sin aparente disminución de potencia. La extrapolación de estos
datos indica que una sola aplicación de la vacuna provocaría
probablemente una inmunidad en poblaciones humanas que duraría
varios años.
En relación con la Tabla 8, este resultado
implica que puede ser posible utilizar las presentes vacunas para
producir un suero inmune, poliespecífico o monoespecífico, para la
protección pasiva de seres humanos infectados con Ébola u otros
agentes de la VHF para los que podemos preparar recombinantes de
VSV.
La vacuna ÉbolaGP está siendo actualmente
examinada en primates no humanos. Éste modelo animal es el más
similar al de la enfermedad humana. Se inmunizarán cuatro animales
con 2x10^{7} pfu de ÉbolaGP. Serán estimulados en 28 días con el
virus Ébola mediante inyección intramuscular. Durante el periodo
antes de la estimulación, los animales serán controlados en cuanto
a la respuesta inmune y la patología causadas por la vacuna. Se
espera ver el desarrollo de una inmunidad protectora y ningún
efecto secundario grave en los monos. En la estimulación, se espera
que los cuatro animales inmunizados permanezcan exentos de síntomas
durante todo el estudio y que el animal testigo muera entre los
días 5 y 10. Mediante este estudio se demostrarán la protección de
los primates y la seguridad de la vacuna.
Aunque antes se han descrito las realizaciones
preferidas del invento, se reconocerá y entenderá que se pueden
hacer diversas modificaciones en él.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (6)
1. Una partícula recombinante del virus de la
estomatitis vesicular (VSV) que comprende una molécula de ácido
nucleico que codifica una glicoproteína de la fiebre hemorrágica
vírica (VHF) insertada en el genoma vírico, de modo que la
glicoproteína de la VHF ha sustituido a la glicoproteína de VSV
nativa y sólo se expresa la glicoproteína de la VHF en la
superficie de la partícula de VSV recombinante, para uso como una
vacuna, partícula que es infecciosa y es capaz de estimular la
infección por dicho virus de la VHF pero que no causa la enfermedad
ni los síntomas asociados con dicha VHF.
2. La partícula de VSV recombinante de acuerdo
con la Reivindicación 1, en que la glicoproteína de la VHF es
seleccionada del grupo que consiste en: una glicoproteína del virus
Lassa, una glicoproteína del virus Marburg, una glicoproteína del
virus Ébola, una glicoproteína del HFV
Crimean-Congo, una glicoproteína del virus del
dengue, una glicoproteína del virus Nipah, una glicoproteína del
virus Hendra, una glicoproteína del virus Machupo, una
glicoproteína del virus Junin, una glicoproteína del virus Guanarito
y una glicoproteína del virus Sabia.
3. La partícula de VSV recombinante de acuerdo
con la Reivindicación 1, en que el primer gen del VSV recombinante
codifica la glicoproteína de la VHF.
4. Una molécula de ácido nucleico que comprende
genoma recombinante del virus de la estomatitis vesicular y un gen
de la glicoproteína de la fiebre hemorrágica vírica (VHF), en que el
gen de la glicoproteína de la VHF ha sustituido al gen nativo de la
glicoproteína de VSV, para uso en la generación de una vacuna,
molécula de ácido nucleico que codifica una partícula, para uso
como una vacuna, que es infecciosa y es capaz de estimular la
infección por dicho virus de la VHF pero que no causa la enfermedad
ni los síntomas asociados con dicha VHF.
5. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con
la Reivindicación 4, en que la glicoproteína de la VHF es
seleccionada del grupo que consiste en: una glicoproteína del virus
Lassa, una glicoproteína del virus Marburg, una glicoproteína del
virus Ébola, una glicoproteína del HFV
Crimean-Congo, una glicoproteína del virus del
dengue, una glicoproteína del virus Nipah, una glicoproteína del
virus Hendra, una glicoproteína del virus Machupo, una
glicoproteína del virus Junin, una glicoproteína del virus Guanarito
y una glicoproteína del virus Sabia.
6. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con
la Reivindicación 4, en que el primer gen del VSV recombinante
codifica la glicoproteína de la VHF.
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