ES2338416T5 - Vacunas recombinantes del virus de la estomatitis vesicular contra la fiebre hemorrágica vírica - Google Patents

Abstract

Una partícula recombinante del virus de la estomatitis vesicular (VSV) que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una glicoproteína de la fiebre hemorrágica vírica (VHF) insertada en el genoma vírico, de modo que la glicoproteína de la VHF ha sustituido a la glicoproteína de VSV nativa y sólo se expresa la glicoproteína de la VHF en la superficie de la partícula de VSV recombinante, para uso como una vacuna, partícula que es infecciosa y es capaz de estimular la infección por dicho virus de la VHF pero que no causa la enfermedad ni los síntomas asociados con dicha VHF.

Description

Vacunas recombinantes del virus de la estomatitis vesicular contra la fiebre hemorrágica vírica

Campo del invento

El presente invento se refiere, en general, al campo de las respuestas inmunes protectoras y los virus recombinantes.

Fundamento del invento

El virus de la estomatitis vesicular (VSV; del inglés, vesicular stomatitis virus) es un virus de RNA de cadena negativa no segmentada y pertenece a la familia Rhabdoviridae, genero Vesiculovirus. Su estructura sencilla y su rápido crecimiento con altos títulos en tipos celulares de mamífero y muchos otros tipos celulares han hecho de él una herramienta preferente para los biólogos moleculares y celulares en los últimos 30 años. Esto se vio incluso reforzado con el establecimiento del sistema de genética inversa para el VSV (Schnell et al., 1996).

Los virus de la fiebre hemorrágica vírica (VHF; del inglés, viral hemorrhagic fever) son prototipos de agentes patógenos emergentes/reemergentes. Las infecciones son asuntos de salud pública serios no sólo en países endémicos en desarrollo sino también en muchos países no endémicos desarrollados. Algunas de ellas representan una amenaza para la población mundial y, por lo tanto, son incluidas en la lista de la categoría A de agentes para bioterrorismo. En el pasado, el alto nivel de contención biológica necesario para su manipulación ha impedido estudios sobre virustales como el virus Lassa y los virus Marburg (MBG) y Ébola (EBO). Aunque estos virus pueden ser desarrollados en cultivo tisular, la propagación del virus es normalmente lenta y los títulos son bajos en comparación con otros agentes patógenos víricos.

Aunque no hay vacunas autorizadas mundiales para los virus con nivel IV de contención, ha habido un recientecomunicado relativo a que primates no humanos fueron protegidos de la infección por Ébola mediante una inmunización con DNA/adenovirus (Sullivan et al., 2000). Esta estrategia de vacunación requería varias inyecciones deDNA desnudo tanto a la glicoproteína (GP) como a la nucleoproteína (NP) del virus Ébola, seguidas de la inyecciónde un adenovirus que expresaba el gen para GP de Ébola. Sin embargo, la vacuna protectora de primates no humanos requería múltiples dosis de DNA desnudo y refuerzo adenovírico para alcanzar la protección y, en el virus Ébola, la dosis utilizada para estimular a los monos era sólo 6 unidades formadoras de placas, lo que es muy poco. En general, el uso de esta vacuna para responder rápidamente a brotes epidémicos o actos de bioterrorismo está limitado porque se requieren exactamente 8 semanas para completar el programa de inmunización.

Los sistemas de genética inversa, tal como el VSV (Schnell et al., 1996), pueden ofrecer una posibilidad para superar algunas de las limitaciones y pueden ser realmente útiles para estudiar las etapas tempranas de la replicación, tal como la entrada del virus, en el contexto de una partícula vírica. Ya se han utilizado diferentes sistemas de seudotipos para estudiar el papel de la glicoproteína del virus Ébola en la entrada celular (Takada et al., 1997; Wool-Lewis, 1998; Yang et al., 2000). De una manera similar, se usó un sistema de seudotipo de VSV para estudiar las propiedades funcionales de la glicoproteína del virus Ébola y para explorar además anticuerpos neutralizantes contra dicha glicoproteína (Ito Hiroshi et al., Journal of Virology 75 (3): 1576-1580, 02-2001). Sin embargo, el uso de partículas de seudotipo está limitado a una infección de una sola etapa y, por lo tanto, sigue siendo artificial. Los virus recombinantes serían más realistas y potentes para estudiar el papel durante la replicación in vitro e in vivo. La capacidad del genoma de VSV para tolerar genes/unidades de transcripción adicionales hace que este sistema sea adecuado para la expresión de proteínas extrañas a alto nivel. Su manejo es relativamente poco complicado y, en general, son fácilmente aplicables planteamientos virológicos.

El objeto de nuestro estudio fue producir partículas de VSV recombinantes que expresaran glicoproteínas transmembranales y solubles procedentes de virus de alta contención con la idea de estudiar su papel en la replicación vírica, la patogénesis vírica y la inducción de la respuesta inmune del huésped. Aquí se describe la generación de varias partículas de VSV recombinantes y la caracterización de su fenotipo biológico.

Sumario del invento

De acuerdo con un primer aspecto del invento, se proporciona una partícula recombinante del virus de la estomatitis vesicular (VSV) que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una glicoproteína de la fiebre hemorrágica vírica (VHF) insertada en el genoma vírico, en donde la molécula de ácido nucleico reemplaza al gen de la glicoproteína de VSV, de modo que la glicoproteína de la VHF ha sustituido a la glicoproteína de VSV nativa y sólo se expresa la glicoproteína de la VHF en la superficie de la partícula de VSV recombinante para uso como una vacuna, partícula que es infecciosa y es capaz de simular la infecciónpor dicho virus de la VHF pero que no causa la enfermedad ni los síntomas asociados con dicha VHF.

De acuerdo con un segundo aspecto del invento, se proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende genoma recombinante del virus de la estomatitis vesicular y un gen de la glicoproteína de la fiebre hemorrágica vírica (VHF), en que el gen de la glicoproteína de la VHF ha reemplazado al gen nativo de la glicoproteína de VSV, para uso en la generación de una vacuna, molécula de ácido nucleico que codifica una partícula, para uso como una vacuna, que es infecciosa y es capaz de simular la infecciónpor dicho virus de la VHF pero que no causa la enfermedad ni los síntomas asociados con dicha VHF.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 – Sistema genético inverso para VSV. Diagrama esquemático del rescate de VSV. Células renales de cría de hámster que expresaban constitutivamente la polimerasa del bacteriófago T7 (BHK-T7) fueron transfectadas con un plásmido para la expresión de la síntesis de cRNA de VSV, controlada por el promotor de la RNA polimerasa de T7 y plásmidos de soporte y la ribozima del virus de la hepatitis delta (HDV; del inglés, hepatitis delta virus), que codifica las proteínas de la RNP.

Figura 2. Infección por VSV G MBG GP. (A) Se muestra el efecto citopatogénico (CPE; del inglés, cytopathogenic effect) en células Vero E6 infectadas, por microscopía de contraste de fase, 24 horas después de la infección. (B) Tinción de células Vero E6 infectadas, por inmunofluorescencia, con un anticuerpo específico para MBG GP1. Micrografías electrónicas que muestran VSV G MBG GP, VSVwt [VSV de tipo silvestre (del inglés, wild type)] y VSV G Lassa GP.

Figura 3. Curvas de crecimiento de VSV recombinante. Se infectaron células Vero E6 con A) VSVwt, VSV EBO sGP, MBG GP1 y con B) VSVwt, VSV G EBO GP y VSV G Lassa GP con una multiplicidad de infección (MOI; del inglés, multiplicity of infection) de 10. Se recogieron los sobrenadantes en los momentos indicados y se titularon para definir la "dosis infecciosa en cultivo tisular" [(TCID)50; del inglés, tissue culture infectious dose].

Figura 4. Expresión de glicoproteínas expresadas por VSV recombinante. Se infectaron células Vero E6 con el VSV recombinante con una MOI de 10. A) VSV G MBG GP: 24 horas después de la infección, las proteínas fueron marcadas por impulsos durante 30 minutos con 740 kBq/ml de [35S]-cisteína y fueron perseguidas durante 6 horas. Las proteínas específicas de GP fueron inmunoprecipitadas de los productos de lisis celulares con inmunoglobulinas anti-MBG GP, de ratón, y fueron analizadas por SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS; del inglés, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) al 10% bajo condiciones reductoras. La presencia del decRVKR (25 mM) (un inhibidor de escisión) durante la marcación y la persecución anuló la escisión de preGP (carril 2). B) VSV G EBO GP: 24 horas después de la infección, las células fueron lisadas y fueron analizadas por transferencia Western con un anticuerpo específico para GP1 (carril 1) y un anticuerpo específico para GP2 (carril 2). C) VSV G Lassa G: 24 horas después de la infección, las células fueron lisadas y fueron analizadas por transferencia Western con un anticuerpo específico para G2. D-F) VSVwt (carril 1), VSV EVO sGP (carril 2), VSV MBG GP1 (carril 3): 24 horas después de la infección, las células fueron lisadas y fueron analizadas por transferencia Western con un anticuerpo específico para VSV G (D), un anticuerpo específico para EBO sGP y un anticuerpo específico para MBG GP1.

Figura 5. Tropismo celular: Se infectaron células Jurkat con VSVwt, VSV G Lassa G o VSV G Ébola GP con una MOI de 10. (A) Se midieron los títulos víricos en células Vero E6 en los puntos temporales indicados determinando la dosis infectiva en cultivo tisular (TCID)50/ml. (B) En los momentos indicados, se recogieron las células y los sobrenadantes y se demostró el crecimiento vírico mediante transferencia Western utilizando un suero de conejo generado contra la nucleoproteína (N) de VSV.

Figura 6. Diagrama esquemático del genoma normal de VSV (A), el VSVLG::EBOVGP (B, sustitución de la glicoproteína de VSV) y el VSV::EBOVsGP (C, VSV G normal más la glicoproteína secretora de Ébola).

Figura 7. Se evaluaron los signos clínicos de la enfermedad, incluyendo el porcentaje de cambio de peso, después de la estimulación con 6000 DL50s de virus Ébola adaptado para ratón. Porcentaje de cambio de peso corporal de los ratones inmunizados los días 0 y 21 (vía intraperitoneal) con 1x105 unidades formadoras de placas (pfu; del inglés, plaque forming units) de VSV Lassa GP, VSV-ÉbolaGP, VSV Marburg GP o Testigos Naífs y luego estimulados con 6000 DL50s de Ébola Mayinga adaptado para ratón (vía intraperitoneal). Todos los ratones de los gruposVSV Lassa GP, VSV Marburg GP y Testigo Naíf murieron el día 8. Todos los ratones inmunizados con VSV-Ébola GP sobrevivieron a la estimulación hasta el día 28 y no mostraron pérdida de peso corporal.

Figura 8. Títulos de virus Ébola en la sangre de ratones infectados con 6000 DL50s de virus Ébola adaptado para ratón. TCID50 de virus Ébola en muestras sanguíneas de raton estimulados con 6000 DL50s de Ébola Zaire Mayinga adaptado para ratón. La TCID50 de 2,3 (log10) era el límite inferior de detección en este ensayo. En ningún momentohubo virus Ébola vivo aislado de los ratones inmunizados. Todos los ratones falsamente inmunizados (VSVwt) estaban muy enfermos el día 6 y todos murieron el día 7. Los ratones fueron inmunizados con una inyección intraperitoneal de 1x105 pfu de VSVwt o ÉbolaGP.

Figura 9. La protección proporcionada por la vacuna ÉbolaGP es independiente de la dosis de estimulación. Los ratones fueron inmunizados con 1x105 pfu de VSVwt (1 grupo, n = 6) o ÉbolaGP (4 grupos, n= 6) mediante unainyección intraperitoneal, una vez el día 0. El día 28, los animales fueron estimulados con Ébola Zaire Mayinga adaptado para ratón con dosis crecientes, de 6000 DL50s a 6 millones de DL50s. Todos los animales testigo VSVwt murieron el día 7 y, antes de la muerte, todos presentaban una drástica pérdida de peso y síntomas clínicos de fiebre hemorrágica vírica; estos ratones fueron estimulados con 6000 DL50s. Los ratones ÉbolaGP fueron estimulados con entre 2x103 y 2x106 DL50s y todos sobrevivieron sin presentar síntomas ni perder peso.

Descripción de las realizaciones preferidas

A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos aquí utilizados tienen un significado igual al comúnmente entendido por quien tiene una experiencia normal en la técnica a la cual pertenece el invento. Aunque en la práctica o el ensayo del presente invento se pueden utilizar cualesquier métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos, se describen ahora los métodos y materiales preferidos.

Se describen aquí virus de la estomatitis vesicular (VSV) recombinantes y partículas de VSV recombinantes que expresan glicoproteínas de VHF. También se describe el uso de las partículas de VSV recombinantes para provocar una respuesta inmune en un animal necesitado de ella.

La glicoproteína de la VHF puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse en modo alguno a, la glicoproteína del virusLassa, el virus Marburg, el virus Ébola, el virus Crimean-Congo HF, el virus del dengue, el virus Nipah, el virus Hendra, el virus Machupo, el virus Junin, el virus Guanarito y el virus Sabia. Como apreciará quien tiene experiencia en la técnica, en este sistema se puede usar cualquier virus con envoltura y con glicoproteínas transmembranales, que son determinantes de inmunidad. En otras realizaciones, se pueden utilizar fragmentos inmunogénicos de estas glicoproteínas, así como proteínas de fusión que incluyan epítopos o fragmentos inmunogénicos de la glicoproteína de interés. Como apreciará quien tiene experiencia en la técnica, hay numerosos algoritmos y/o programas informáticos disponibles para pronosticar epítopos y fragmentos potencialmente inmunogénicos.

En algunas realizaciones, el VSV recombinante puede incluir moléculas de ácido nucleico que codifican secuencias genéticas adyuvantes para provocar un patrón específico de respuestas inmunes. Los adyuvantes genéticos pueden ser, por ejemplo, pero sin limitarse en modo alguno a, IL-2, IL-4, GM-CSF y las moléculas coestimuladoras CD80 y CD86.

Además, en otras realizaciones, se inserta una nucleoproteína vírica extraña junto con el gen de la glicoproteína, generándose por ello una partícula vírica recombinante multivalente.

Como resultará evidente a quien tiene experiencia en la técnica, sólo se expresará la glicoproteína extraña en la superficie de la partícula de VSV recombinante, y así se presenta al sistema inmune del huésped. De este modo, la partícula de VSV recombinante es un sistema infeccioso que simula una infección con el virus extraño y, sin embargo, no causa la enfermedad ni los síntomas asociados con el virus extraño. Además, la respuesta inmune generada es protectora independientemente de la vía de inmunización. Como resultará evidente a quien tiene experiencia en la técnica, sólo se requiere una dosis única de la vacuna para provocar una respuesta inmune protectora en el huésped, que puede ser un ser humano. Es importante advertir que el virus debe estar vivo para generar la protección, ya que un virus sometido a radiación gamma no proporciona protección.

En un ejemplo ejemplar descrito más adelante, el sistema simula una infección con el virus Ébola y, sin embargo, no produce efectos secundarios negativos. La partícula de VSV recombinante puede proteger frente a 2 millones dedosis letales de virus Ébola adaptado para ratón y es protectora después de un suministro intranasal, como se discute más adelante.

Como apreciará quien tiene experiencia en la técnica, los vectores que contienen las GPs transmembranales delongitud completa de Ébola, Marburg y Lassa son viables porque las glicoproteínas extrañas sustituyeron a la glicoproteína de VSV nativa. Además, se creía que las GPs de Ébola y Marburg eran determinantes de virulencia importante y, por lo tanto, se preveían síntomas morbosos. La estimulación con Ébola sólo se hizo como una idea posterior, cuando los ratones sobrevivieron a la infección con los virus VSV recombinantes.

Es importante advertir que una partícula de VSV recombinante como la aquí descrita puede ser administrada oral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal o intranasalmente a un individuo que necesite dicho tratamiento. Es importante advertir además que un individuo que necesite dicho tratamiento puede ser un individuo que presente riesgo de infección por el virus extraño.

En aún otras realizaciones, la partícula de VSV recombinante se utiliza para inocular a un animal para generar una respuesta inmune. En estas realizaciones, un material que contiene anticuerpos es luego recolectado o purificado y es utilizado como una terapia tras la exposición (inmunidad pasiva). Como apreciará quien tiene experiencia en la técnica, el material que contiene anticuerpos puede ser plasma, yema de huevo, leche o similar.

El invento será ahora descrito por medio de ejemplos; sin embargo, el invento no se limita a los ejemplos.

EJEMPLO I – Construcción de un plásmido

Se describió previamente un plásmido que expresa el complemento de RNA de cadena positiva del genoma de VSV con un sitio para la expresión de genes extraños (Schnell, 1996). Este plásmido contiene los cinco genes de VSV (nucleoproteína N, fosfoproteína P, proteína matricial M, glicoproteína G y polimerasa L) en orden, flanqueados por el promotor del bacteriófago T7, la secuencia líder de VSV, la ribozima del virus de la hepatitis delta (HDV), y la secuencia terminadora de T7. Entre el gen G y el L está presente un sitio conector único (XhoI, NheI), flanqueado por una señal de inicio y parada de la transcripción para el gen adicional que se va a expresar. Los genes que codifican las glicoproteínas solubles del virus Ébola (sGP) y los genes del virus Marburg (GP1) fueron clonados en los sitios XhoI y NheI del vector VSVXN2 de longitud completa (Schnell et al., 1996). Los plásmidos obtenidos fueron denominados pVSVxn2/mbgGP1 y pVSVxn2/ebosGP, respectivamente, y tienen los genes extraños situados entre los genes G y L de VSV. Los marcos de lectura abiertos que codifican las glicoproteínas transmembranales de los virus Marburg, Ébola y Lassa se clonaron en los sitios XhoI y NheI del vector VSVXN2AG de longitud completa modificado que carecía de la glicoproteína G de VSV. Los plásmidos resultantes fueron llamados pVSVxn2 G/mbgGP, pVSVxn2 G/eboGP y pVSVxn2 G/lvGPc.

EJEMPLO II – Transfección y rescate de VSV recombinante (recuperación de VSV recombinante)

Se recuperaron VSVs recombinantes utilizando métodos establecidos. Células renales de cría de hámster que expresaban constitutivamente la polimerasa del bacteriófago T7 (BHK-T7) fueron desarrolladas hasta una confluencia de aproximadamente 90% en placas de 6 cm. Las células fueron luego transfectadas, en un nivel 2 de seguridad biológica (BSL2; del inglés, biological safety level 2), con los plásmidos de soporte que codificaban los componentes de la ribonucleoproteína (RNP) vírica, 0,5 μg de PBS-N, 1,25 μg de PBS-P, 0,25 μg de PBS-L y 2 μg del plásmido que codificaba uno de los cinco clones genómicos recombinantes anteriormente descritos. Las transfecciones se llevaron a cabo con Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Puesto que en ese momento no se había realizado la clasificación de bioseguridad de estos virus recombinantes, se transfirieron inmediatamente las células transfectadas al BSL4. Después de 48 horas a 37 °C, los sobrenadantes fueron subcultivados a ciegas (sin evidencia de infección) en células Vero E6 (confluentes al 80-90%). Posteriormente, los virus VSV recombinantes han sido clasificados como virus de contención biológica de nivel 2 y, por lo tanto, son adecuados para estudios sobre vacunaciones humanas. La recuperación del virus infeccioso fue confirmada explorando monocapas de VeroE6 en cuanto al efecto citopático del VSV. El VSV recombinante rescatado fue subcultivado en células Vero E6 para obtener una reserva vírica. La reserva vírica fue titulada en placas, sobre células Vero E6.

EJEMPLO III – Microscopía por inmunofluorescencia

Células Vero E6 desarrolladas en cubreobjetos fueron infectadas con el VSV recombinante con una MOI de 1. Después de la adsorción del virus durante 45 minutos a 37 °C, el inóculo fue sustituido por medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM; del inglés, Dulbecco's modified essential medium) que contenía suero de ternera fetal (FCS; del inglés, foetal calf serum) al 2%. 24 horas después de la infección, las células fueron fijadas durante la noche con paraformaldehído al 4% en PBS. Después de un cambio del paraformaldehído, las células fueron retiradas del BSL4 y fueron tratadas con radiación gamma (2 x 104 Gy). Después de la inactivación, las células fueron lavadas con PBS y fueron permeabilizadas con Triton X-100 al 0,1% en PBS durante 15 minutos. Posteriormente, las células fueron incubadas durante 1 hora a temperatura ambiental con un apropiado anticuerpo primario (diluido en PBS). Las muestras fueron lavadas tres veces con PBS y fueron incubadas durante otra hora con un anticuerpo secundario (anti-especie) conjugado con Cy3 o con FITC. Después de un lavado (3 veces), se montaron los cubreobjetos con Supermount (Biogenex, Alemania) y se examinaron con un microscopio Zeiss.

EJEMPLO IV – Microscopía electrónica

Se desarrollaron VSVs recombinantes en células Vero E6, y se recuperaron viriones de los sobrenadantes de cultivo por ultracentrifugación y se fijaron en una disolución de paraformaldehído al 2% y glutaraldehído al 0,5%. Las suspensiones víricas fijadas fueron transferidas a rejillas de cobre para microscopía electrónica previamente revestidas con carbono. Las rejillas revestidas fueron encerradas herméticamente en bolsas y retiradas del BSL4. Para la inactivación, las rejillas fueron tratadas con radiación gamma, con 2 x 104 Gy, utilizando una fuente de cobalto. Se llevó a cabo una tinción negativa con ácido fosfotúngstico al 2% (pH de 6,8) durante 1 minuto. Se eliminó el fluido en exceso y se examinaron las rejillas utilizando un microscopio electrónico de transmisión.

EJEMPLO V – Marcación metabólica, inmunoprecipitación e inmunotransferencia

Se inóculo el VSV recombinante, con una MOI de 10 pfu/célula, a células Vero E6 (placa de 6 cm). El inóculo fue sustituido después de 1 hora por DMEM que contenía suero bovino fetal (FBS; del inglés, foetal bovine serum) al 2% (ambos de Gibco/BRL). Cuando se infectaron células Jurkat (clon e6-1, un clon de células T), se utilizó una versión ligeramente modificada del protocolo descrito por Montel et al. (1997). En resumen, se infectaron las células durante 1 hora, con una MOI de 10 pfu/célula, a temperatura ambiental con un mezclamiento suave cada 10-20 minutos. Luego se añadió DMEM que contenía suero bovino fetal (FBS) al 2% y se continuó el cultivo durante 1 hora a 37 °C. Las células fueron luego lavadas 3 veces en DMEM y fueron resuspendidas, en una cantidad de 106 células/ml, en medio que contenía FBS al 2%, con 1 ml por pocillo de una placa de 12 pocillos. Para los experimentos de marcación metabólica, las células fueron incubadas durante 24 horas, lavadas con DMEM deficiente en cisteína, marcadas por impulsos durante 30 minutos en el mismo medio complementado con 740 kBq/ml de [35S]-metionina/cisteína y perseguidas durante 240 minutos. Para los estudios de inhibición de la escisión, las células infectadas fueron incubadas durante periodos de privación, impulso y persecución, con la peptidil-clorometil-cetona decanoilada (decRVKR-CMK) en una concentración 25 IM. Las células marcadas fueron lisadas en tampón para coinmunoprecipitación (co-ip) [Nonidet P-40 (NP-40) al 1%, desoxicolato sódico al 0,4%, BSA al 0,5%, EDTA 5 mM, NaCl 100 mM, Tris-HCl 20 mM, pH de 7,6, yodoacetamida 25 mM, PMSF 1 mM] a 4 °C. La inmunoprecipitación se llevó a cabo utilizando un anticuerpo monoclonal específico para proteína. Las proteínas precipitadas fueron sometidas a SDSPAGE al 10% bajo condiciones reductoras y fueron visualizadas mediante fluorografía. Para el análisis por inmunotransferencia, las células fueron lavadas con PBS 24 horas después de la infección y fueron lisadas en el tampón de carga del SDS-gel. Las proteínas fueron resueltas por SDS-PAGE (10%) y fueron transferidas a membranas de PVDF. Se detectó la expresión de la proteína extraña utilizando anticuerpos apropiados.

EJEMPLO VI – Características de crecimiento del VSV recombinante

Se cultivaron células Vero E6 hasta una densidad celular de 106 por pocillo de una placa de 12 pocillos y se infectaron con los diferentes VSVs recombinantes con una MOI de 10 pfu/célula. Luego se lavaron las células 3 veces en DMEM y se añadió 1 ml de medio fresco que contenía FBS al 2%. Los cultivos (células y sobrenadantes) fueron recolectados en los puntos temporales indicados y fueron centrifugados a 3000g durante 5 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes fueron almacenados a -80 °C. La titulación se llevó a cabo definiendo la "dosis infecciosa en cultivo tisular", (TCID)50. Para esto, se diluyeron 10 veces los sobrenadantes y se utilizaron las diluciones para infectar las células Vero E6 en 96 pocillos (cinco pocillos para cada dilución). Los cultivos fueron calificados periódicamente en cuanto a los efectos citopatogénicos (CPE) durante un periodo de 7 días. Los títulos víricos de los sobrenadantes de los cultivos en el punto final fueron calculados utilizando el método de Reed y Muench (1938). Los títulos víricos se expresan como el logaritmo decimal del 50 por ciento del punto final de la titulación en cuanto a infectividad, como se calcula por el método de Spearman-Karber.

EJEMPLO VII – Datos de ratones

Se inmunizaron grupos de 5 hembras de ratón con 105 unidades formadoras de placas (pfu) de VSVLG::EBOVGP (ÉbolaGP), VSVLG::MBGVGP, VSVLG::LassaVGP o VSV de tipo silvestre (VSVwt). Se administraron dos dosis de vacuna el día 0 y el día 28. En cada ocasión, la vacuna se administró por vía intraperitoneal (i.p.). 28 días después de la dosis de refuerzo, los ratones fueron estimulados con 6000 DL50s de virus Ébola adaptado para ratón. Losratones que recibieron ÉbolaGP resultaron completamente protegidos de la infección por el virus Ébola, mientras que todos los ratones de los otros grupos sucumbieron rápidamente a la infección (Tabla 1). La medición de los signos clínicos es un ensayo de protección bastante más sensible que la simple observación de la supervivencia. Como parte de la observación clínica, se registraron los pesos de los ratones y se calculó el porcentaje individual de cambio después de la estimulación (Figura 7). Los resultados demostraron que había un claro efecto protector específico de inmunización con la vacuna ÉbolaGP.

El siguiente paso fue intentar proteger a los ratones después de justo una sola dosis de vacuna. Los ratones fueron inmunizados de nuevo con 105 pfu de VSVwt o ÉbolaGP, de nuevo i.p. el día 0. Los ratones fueron luego estimulados con el virus Ébola adaptado para ratón, 28 días después de la inmunización. En esta ocasión, los ratones inmunizados fueron estimulados con entre 2x103 y 2x106 pfu de virus Ébola, y los ratones testigo VSVwt fueron estimulados con 2x102 pfu. Todos los ratones testigo presentaron rápidamente síntomas y pérdida de peso, mientras quetodos los ratones inmunizados permanecieron sanos y sin síntomas. Por lo tanto, la protección de la vacuna ÉbolaGP es aparentemente independiente de la dosis de estimulación (Figura 8).

Se determinó la viremia de Ébola durante 6 días después de la estimulación en ratones inmunizados tanto conVSVwt como con ÉbolaGP (Figuran 9). Se escogieron diariamente tres ratones de los grupos testigo de tipo silvestre y de vacuna y se extrajeron sangre y el bazo para la estimación del título vírico (TCID50). No fue posible detectar elvirus Ébola en la sangre de los ratones inmunizados con la vacuna ÉbolaGP en ningún momento. Sin embargo, los ratones que habían recibido la vacuna VSVwt desarrollaron una viremia el día 3 después de la infección, y esta viremia empeoró progresivamente hasta que los ratones murieron el día 7.

Hasta aquí todos los estudios han sido llevados a cabo utilizando la vía i.p. Esta vía es útil para la inmunización experimental pero no podría ser utilizada para la vacunación de seres humanos. Por lo tanto, se investigó el efecto de la vía de vacunación sobre la protección y, como se muestra en la Tabla 2, la protección es independiente de la vía de inmunización. Sin embargo, la vacuna debe ser viable en el momento de la inmunización para proporcionar protección, ya que la vacuna tratada con radiación gamma no protegió a los ratones de la infección por Ébola.

En resumen, se ha desarrollado una vacuna que puede proteger a los ratones de la infección por Ébola. Esta protección no pudo ser vencida por el incremento de la dosis de estimulación y no resultó afectada por la alteración de la vía de inmunización. Además, parece que la viremia está completamente controlada en los ratones inmunizados, y esto es demostrado por la completa falta de síntomas clínicos en estos ratones así como por los datos de TCID50.

EJEMPLO VIII – Resultados y discusión

La capacidad para manipular genéticamente el VSV ha conducido ya a una diversidad de nuevas ideas en el campo de la investigación del VSV con respecto a estudios de estructura-función de genes víricos, el análisis de elementos promotores y otros elementos no codificadores. Además, la capacidad del genoma del VSV para tolerar genes/unidades de transcripción adicionales o para intercambiar el gen de la glicoproteína por una glicoproteína transmembranal extraña hace que este sistema sea útil con fines de expresión a alto nivel. Además, se utilizaron VSVs recombinantes como candidatos prometedores para vacunas de virus vivos (influenzavirus A, VIH, BVDV). El posible papel de los VSVs recombinantes como vacunas viene apoyado por los hechos de que el VSV y los rVSVs crecen con títulos elevadísimos en muchas líneas celulares, el VSV provoca una potente respuesta inmune celular y humoral in vivo, y las infecciones de seres humanos por VSV son raras y los síntomas, si es que hay, son benignos.

En este estudio, se quería establecer un sistema para expresar y estudiar la función de glicoproteínas solubles y glicoproteínas transmembranales de virus de la fiebre hemorrágica vírica. Para esto, se modificó el clon de cDNA de longitud completa (pVSVxn2) sustituyendo el gen G del VSV por las glicoproteínas de los virus MBGV, EBOV y Lassa

o insertando los genes que codifican la sGP de EBOV (Volchkov et al., 1995; Sánchez et al., 1996) y la GP1 de MBGV, que es el fragmento de escisión grande liberado durante la infección en cultivo tisular (Volchkov et al., 1998 a, b), entre los genes G y L de VSV. Se transfectaron células BHL-T7 con estos cDNAs y se rescató el virus. Los virus rescatados fueron denominados VSV G MBG GP, VSV G EBO GP, VSV G Lassa G, VSV MBG GP1 y VSV EBO sGP, respectivamente. Estudios de los virus recombinantes negativamente contrastados, por microscopía electrónica (Figura 2), proporcionaron datos relativos a que la sustitución de la glicoproteína G del VSV no tiene impacto alguno sobre la morfología de los viriones. El VSV recombinante, independientemente de la glicoproteína insertada, mostraba las típicas partículas de rhabdovirus con forma de bala y contenía una nucleocápsida electrodensa con forma de bala. La nucleocápsida estaba unida por una envoltura. Las envolturas víricas estaban revestidas con proyecciones superficiales. Las proteínas extrañas podían sustituir completamente a la G del VSV en el ensamblaje y no influían en la formación de la estructura de las partículas.

Además, parece que el procesamiento de las glicoproteínas extrañas se produce de la misma manera que en los sistemas víricos de la VHF auténticos. Utilizando métodos inmunológicos y bioquímicos, se confirmó la expresión y el procesamiento proteolítico de las glicoproteínas víricas extrañas. La tinción por inmunofluorescencia ejemplarmente mostrada para células Vero E6 infectadas con VSV G MBG GP, usando un anticuerpo específico para GP, permite detectar MBG GP en la superficie de las células infectadas (Figura 2B).

En la Figura 3A, se muestra el procesamiento proteolítico de la glicoproteína de MBGV en los dos fragmentos de escisión GP1 (160 kDa) y GP2 (38 kDa), por inmunoprecipitación con un anticuerpo monoclonal contra MBG GP. La escisión de la MBG GP codificada por VSV resultó significativamente restringida cuando se expresaba GP en presencia de la peptidil-clorometil-cetona decanoilada decRVKR-CMK, un potente inhibidor de la furina, una endoproteasa similar a la subtilisina. Mediante un análisis por inmunotransferencia se demostraron la expresión y el procesamiento proteolítico de EBO GP y Lassa G. Los dos fragmentos de escisión de la glicoproteína transmembranal de EBOV, GP1 (140 kDa) y GP2 (26 kDa), se detectaron con un suero anti-GP, que reconoce GP1 (Figura 3B, carril izquierdo), y un suero monoespecífico anti-GP2 (Figura 3B, carril derecho). En la parte C se demuestra la escisión del precursor (76 kDa) de la glicoproteína del virus Lassa en G1 (no mostrado) y G2 (36 kDa). En este caso, la detección se llevó a cabo con un antisuero específico generado contra el extremo carboxílico de G2. Además del precursor (no completamente escindido) y el fragmento G2, se detectó un fragmento de 10 kDa hasta ahora desconocido que necesita una mayor atención. En la Figura 3, partes D-F, se muestra la expresión de las glicoproteínas solubles por el VSV recombinante. Además de VSV G, que es expresada por células infectadas con VSVwt, VSV MBG GP1 y VSV EBO sGP (Figura 3D, carriles 1-3), EBO sGP (Figura 3E, carril 2) y MBG GP1 (Figura 3F, carril 3) son sólo detectables en células infectadas con el respectivo virus recombinante, como aquí se demuestra al utilizar el anticuerpo monoespecífico.

Se examinó la replicación de los virus recombinantes, bajo condiciones de crecimiento de una sola etapa, en células Vero E6 infectadas con una MOI de 10, lo que fue seguido de una incubación a 37 °C. Se recogió el fluido sobrenadante en diversos momentos y se midieron las producciones víricas mediante el TCID50.

En la parte B de la Figura 3 se muestra la cinética de crecimiento de los virus recombinantes con una sustitución de la glicoproteína de VSV. Los títulos víricos para VSVwt, VSV G Lassa GP y VSV G Ébola GP alcanzaron valores logarítmicos tres a cuatro veces mayores que los niveles de fondo. Sin embargo, los títulos máximos se alcanzaron entre 8 horas y 12 horas después de la infección para VSVwt, 24 horas después de la infección para VSV G LassaGP, y 36 horas después de la infección para VSV G Ébola GP. Esto indicaba diferencias en cuanto a la replicación para los virus recombinantes si la glicoproteína de VSV es sustituida por una glicoproteína extraña. Los virus recombinantes, que contienen unidades de transcripción adicionales, tienen una cinética de crecimiento similar a la delVSV de tipo silvestre. En la parte A de la Figura 3 se muestran las curvas de crecimiento para VSV Ébola sGP yVSV MBG GP1. Los títulos víricos para VSVwt, VSV Ébola sGP y VSV MBG GP1 alcanzaron valores logarítmicos tres a cuatro veces mayores que los niveles de fondo y, en los tres casos, los títulos máximos se alcanzaron entre 8 horas y 12 horas después de la infección, lo que indica que la adición de genes no afecta a la cinética de crecimiento de los virus recombinantes.

Estudios sobre tropismo celular revelaron que el tropismo de los virus recombinantes depende, como se esperaba, de la glicoproteína transmembranal y no está influido por las glicoproteínas solubles adicionales expresadas desde una unidad de transcripción separada. Entre 8 horas y 12 horas después de la infección, los títulos víricos para VSVwt en células Jurkat alcanzaron valores logarítmicos cuatro veces mayores que los niveles de fondo. Sin embargo, VSV G Lassa GP y VSV G Ébola GP fallaron a la hora de infectar, y replicarse en, células Jurkat. Esto indicaba que la sustitución de la glicoproteína de VSV conducía a un cambio en el tropismo celular, como se esperaba a partirde los estudios de infección utilizando los virus Ébola y Lassa, en los que ninguno de los dos producía una infección productiva de células Jurkat. Con objeto de confirmar los resultados, se llevaron a cabo inmunotransferencias. Se infectaron células con VSVwt y VSV G Lassa G con una MOI de 10 pfu/célula. En los puntos temporales indicados, se recolectaron las células y los sobrenadantes y se analizaron por inmunotransferencia utilizando un suero de conejo generado contra VSV N. El VSVwt se detectó más pronto, intracelularmente a las cuatro horas después de la infección y en el sobrenadante a las ocho horas después de la infección, lo que indicaba la liberación de partículas víricas. No fue detectable replicación alguna para los virus VSV G Lassa GP y VSV G EBO GP, lo que confirmaba que estos virus recombinantes no son capaces de infectar productivamente células Jurkat. La ventaja de los VSVs que codifican glicoproteínas extrañas y son competentes en cuanto a la replicación, además de su uso en estudios in vitro sobre tropismo celular, es el potencial para utilizar estos virus en estudios in vivo, en los que son necesarios múltiples ciclos de replicación. Esto incluye, por ejemplo, la investigación de la variedad de huéspedes o del tropismo de órgano. Los VSVs recombinantes con tropismo celular (tropismo de órgano) alterado (especificado) podrían ser útiles incluso para planteamientos de distribución celular de genes específicos.

De esta manera, estos virus recombinantes representan un excelente sistema para estudiar el papel de las glicoproteínas en el tropismo celular y la patogénesis in vivo e in vitro. Datos preliminares en animales sugieren además que los virus recombinantes pueden ser manipulados con más seguridad que los virus de la VHF de donantes.

En relación con la Tabla 3, es importante advertir que se considera que el cobayo es un modelo más sensible parauna infección por el virus Ébola y, en consecuencia, más difícil de proteger. Sin embargo, los datos de la Tabla 3 indican que la vacuna es muy potente y es capaz de proteger al menos dos especies diferentes.

En relación con la Tabla 4, estos datos muestran que tenemos una vacuna mucosa de una sola dosis, capaz de proteger a animales de la estimulación con 6 millones de partículas víricas. Obviamente, las vacunas mucosas, sean orales o sean intranasales, son mucho más fáciles de distribuir que las inyectadas y podrían ser desplegadas más fácilmente en el caso de un ataque bioterrorista o de una epidemia. El elevado nivel de protección alcanzado indicaría que se podría alcanzar protección frente a un ataque bioterrorista o frente al daño accidental al clavarse una aguja en un hospital que trata pacientes.

En relación con la Tabla 5, estos datos muestran que se puede alcanzar una protección completa con una inmunización justo 7 días antes de la estimulación y una protección significativa (p < 0,05) cuando se administra 30 minutos después de la estimulación, lo que indica que hay un campo de aplicación para una terapia de vacunación tras una exposición. Conjuntamente considerados, los dos conjuntos de datos demuestran una aplicación potencial significativa en la prevención de una enfermedad en situaciones de epidemia y como una vacuna utilizada en respuesta a un ataque bioterrorista o por armas biológicas. El tiempo para que se desarrolle inmunidad después de la administración de la vacuna ÉbolaGP es más corto que el requerido para la vacuna descrita por Sullivan et al. (2000).

En relación con la Tabla 6, una sola inmunización dio lugar a una protección que duró al menos 9 meses sin aparente disminución de potencia. La extrapolación de estos datos indica que una sola aplicación de la vacuna provocaría probablemente una inmunidad en poblaciones humanas que duraría varios años.

En relación con la Tabla 8, este resultado implica que puede ser posible utilizar las presentes vacunas para producirun suero inmune, poliespecífico o monoespecífico, para la protección pasiva de seres humanos infectados con Ébola u otros agentes de la VHF para los que podemos preparar recombinantes de VSV.

La vacuna ÉbolaGP está siendo actualmente examinada en primates no humanos. Éste modelo animal es el más similar al de la enfermedad humana. Se inmunizarán cuatro animales con 2x107 pfu de ÉbolaGP. Serán estimuladosen 28 días con el virus Ébola mediante inyección intramuscular. Durante el periodo antes de la estimulación, los animales serán controlados en cuanto a la respuesta inmune y la patología causadas por la vacuna. Se espera ver el desarrollo de una inmunidad protectora y ningún efecto secundario grave en los monos. En la estimulación, se espera que los cuatro animales inmunizados permanezcan exentos de síntomas durante todo el estudio y que el animal testigo muera entre los días 5 y 10. Mediante este estudio se demostrarán la protección de los primates y la seguridad de la vacuna.

Aunque antes se han descrito las realizaciones preferidas del invento, se reconocerá y entenderá que se pueden hacer diversas modificaciones en el mismo, dentro del alcance de las reivindicaciones.

Referencias

N. J. Sullivan, A. Sánchez, P. E. Rollin, Z.-Y. Yang, G. J. Nabel. 2000. "Development of a preventative vaccine for Ebola virus infection in primates". Nature 408: 605-609.

M. J. Schnell, L. Buonocore, E. Kretzschmar, E. Johnson, J. K. Rose. 1996. "Foreign glycoproteins expressed from recombinant vesicular stomatitis viruses are incorporated efficiently into virus particles". Proc. Natl. Acad. Sci. USA

93:

11.359-11.365.

A.

Takada, C. Robison, H. Goto, A. Sánchez, K. G. Murti, M. A. Whitt, Y. Kawaoka. 1997. "A system for functional analysis of Ebola virus glycoprotein". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (26): 14.764-9.

R.

J. Wool-Lewis, P. Bates. 1998. "Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines". J. Virol. 72 (4): 3155-60.

Z.

Y. Yang, H. J. Duckers, N. J. Sullivan, A. Sánchez, E. G. Nabel, G. J. Nabel. 2000. "Identification of the Ebola virus glycoprotein as the main viral determinant of vascular cell cytotoxicity and injury". Nat. Med. 6 (8): 886-9.

A.

H. Montel, G. Hommel-Berrey, Z. Brahmi. 1997. "Fas-mediated cytotoxicity induces degradation of vesicular stomatitis virus RNA transcripts and reduces viral titer". Mol. Immunol. 34 (15): 1055-66.

5 V. E. Volchkov, S. Becker, V. A. Volchkova, V. A. Ternovoj, A. N. Kotov, S. V. Netesov, H. D. Klenk. 1995. "GP mRNA of Ebola virus is edited by the Ebola virus polymerase and by T7 and vaccinia virus polymerases". Virology 214 (2): 421-30.

A. Sánchez, S. G. Trappier, B. W. Mahy, C. J. Peters, S. T. Nichol. 1996. "The virion glycoproteins of Ebola viruses

are encoded in two reading frames and are expressed through transcriptional editing". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 10 (8): 3602-7.

V. E. Volchkov, V. A. Volchkova, W. Slenczka, H. D. Klenk, H. Feldmann. 1998. "Release of viral glycoproteins during Ebola virus infection". Virology 245 (1): 110-9.

V. E. Volchkov, H. Feldmann, V. A. Volchkova, H. D. Klenk. 1998. "Processing of the Ebola virus glycoprotein by the proprotein convertase furin". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (10): 5762-7.

Tabla 1 – Supervivencia de ratones inmunizados y testigo después de la estimulación con 6000 DL50s de virus Ébola

adaptado para ratón.

Tratamiento Supervivientes el día 28 Tiempo medio hasta la muerte (días) VSVwt 0/5 5,6 VSVLG::MBGVGP 0/5 6,6 VSVLG::LassaVGP 0/5 7,0 ÉbolaGP 5/5 no disponible

Tabla 2

Tratamiento Supervivientes el día 28 Tiempo medio hasta la muerte (días)

Testigos naífs 0/4 7,4

VSVwt intraperitoneal 0/5 5,5

VSVwt intramuscular 0/5 5,0

VSVwt subcutáneo 0/5 5,2

VSVwt intranasal 0/5 5,8

ÉbolaGP i.p. 5/5 no disponible

ÉbolaGP i.m. 5/5 no disponible

ÉbolaGP s.c. 5/5 no disponible

ÉbolaGP i.n. 5/5 no disponible

ÉbolaGP i.p. tratado 0/5 7,0

con radiación gamma 20

Tabla 3 – Cobayos Duncan-Hartley resultaron completamente protegidos de la estimulación con virus Ébola adaptado para cobayos, después de la inmunización intramuscular con 200 Il de 1x105 pfu de ÉbolaGP. Todos los animales testigo no tratados y tratados con VSV wt murieron.

Inmunizados con Testigo Testigo de VSV Ébola GP naíf de tipo silvestre

Porcentaje de supervivencia a los 0 0 100

28 días después de la infección

Tiempo medio hasta la muerte (días) 6 5,83 –

5 Tabla 4 – Protección completa de ratones Balb/c estimulados mediante inyección intraperitoneal con entre 6x102 y 6x106 DL50s de virus Ébola adaptado para ratón. Los ratones fueron inmunizados una vez con la vacuna ÉbolaGP por instilación intranasal o por inyección intraperitoneal o intramuscular, 28 días antes de la infección. La dosis de estimulación fue de entre 6x102 y 6x106 DL50s de virus Ébola adaptado para ratón. Los ratones inmunizados en dos ocasiones (días 0 y 28) mediante sonda oral resultaron protegidos de la estimulación intraperitoneal con 6x103 DL50s

10 de virus Ébola adaptado para ratón. Porcentaje de supervivencia a los 28 días después de la estimulación. N.E. = no ensayado

Tratamiento Vía de Dosis de estimulación (DL50s)

inmunización 6x106 6x105 6x104 6x103 6x102

i.n. 100 100 100 100 100 ÉbolaGP i.m. 100 100 100 100 100

i.p. 100 100 100 100 100

oral N.E. N.E. N.E. 100 N.E. VSV wt i.p. 0 0 0 0 0 VSV wt oral N.E. N.E. N.E. 0 N.E. Naíf Ninguna N.E. N.E. N.E. 0 0

Tabla 5 – Se proporciona una protección específica completa mediante una sola inmunización intraperitoneal de los ratones 7 días antes de la estimulación, y se proporciona una protección significativa (p < 0,05) mediante una inmu

15 nización 30 minutos después de la estimulación. Además, se puede demostrar una protección inespecífica en los ratones inmunizados con ÉbolaGP o VSV wt hasta 3 días después de la estimulación. Todos los animales se infectaron con 6x103 DL50s de virus Ébola adaptado para ratón. Porcentaje de supervivencia a los 28 días después de la estimulación.

-28 -21 -14 -7 -3 0 +1 +2 +3

ÉbolaGP 100 100 100 100 100 80 80 100 20

VSVwt 0 0 0 0 20 0 6010040

Naíf N.E. N.E. N.E. N.E. N.E. N.E. N.E. N.E. N.E.

Tabla 6 – La protección completa proporcionada por una sola inmunización i.p. con la vacuna ÉbolaGP es de larga duración. Porcentaje de supervivencia a los 28 días después de la estimulación. Tiempo de estimulación (meses después de la inmunización) 3 meses 6 meses 9 meses Naíf 0 0 0 VSV wt 0 0 0 ÉbolaGP 100 100 100

Tabla 7 – La protección de los ratones no depende de respuestas de células T citotóxicas. Tratamiento Porcentaje de supervivencia a los 28 días después de la estimulación CD4 consumido 40 CD8 consumido 100 No consumido 100

Tabla 8 – La transferencia pasiva de suero de ratones inmunizados con la vacuna ÉbolaGP protege a ratones naífs de la estimulación con 6x103 DL50s de virus Ébola adaptado para ratón. Tratamiento Porcentaje de supervivencia Tiempo medio hasta la muerte Suero naíf 0 5,8 Suero inmune VSV wt 0 6 Suero ÉbolaGP 80 1 muerte el día 11

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una partícula recombinante del virus de la estomatitis vesicular (VSV) que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una glicoproteína de la fiebre hemorrágica vírica (VHF) insertada en el genoma vírico, en donde la molécula de ácido nucleico reemplaza al gen de la glicoproteína del VSV. de modo que la glicoproteína de la

   5 VHF ha reemplazado a la glicoproteína de VSV nativa y sólo se expresa la glicoproteína de la VHF en la superficie de la partícula de VSV recombinante, para uso como una vacuna, partícula que es infecciosa y es capaz de simular la infección por dicho virus de la VHF pero que no causa la enfermedad ni los síntomas asociados con dicha VHF.
2. 2. La partícula de VSV recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la glicoproteína de la VHF es seleccionada del grupo que consiste en: una glicoproteína del virus Lassa, una glicoproteína del virus Marburg, una

   10 glicoproteína del virus Ébola, una glicoproteína del HFV Crimean-Congo, una glicoproteína del virus del dengue, una glicoproteína del virus Nipah, una glicoproteína del virus Hendra, una glicoproteína del virus Machupo, una glicoproteína del virus Junin, una glicoproteína del virus Guanarito y una glicoproteína del virus Sabia.
3. 3. Una molécula de ácido nucleico que comprende genoma recombinante del virus de la estomatitis vesicular y un gen de la glicoproteína de la fiebre hemorrágica vírica (VHF), en donde el gen de la glicoproteína de la VHF ha re

   15 emplazado al gen nativo de la glicoproteína de VSV, para uso en la generación de una vacuna, molécula de ácido nucleico que codifica una partícula, para uso como una vacuna, que es infecciosa y es capaz de simular la infección por dicho virus de la VHF pero que no causa la enfermedad ni los síntomas asociados con dicha VHF.
4. 4. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la glicoproteína de la VHF es seleccionada del grupo que consiste en: una glicoproteína del virus Lassa, una glicoproteína del virus Marburg, una glico

   20 proteína del virus Ébola, una glicoproteína del HFV Crimean-Congo, una glicoproteína del virus del dengue, una glicoproteína del virus Nipah, una glicoproteína del virus Hendra, una glicoproteína del virus Machupo, una glicoproteína del virus Junin, una glicoproteína del virus Guanarito y una glicoproteína del virus Sabia.