JP2013538202A - 腫瘍崩壊性麻疹ウイルス - Google Patents

Abstract

本発明は、自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスに対する一次又は二次抵抗性を伴っている悪性細胞の治療において使用するための、自殺遺伝子をコードする組換え麻疹ウイルスを含む医薬組成物に関する。さらに本発明は、シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体の融合体を含む自殺遺伝子をコードする麻疹ワクチンＳｃｈｗａｒｚ株に基づく組換え麻疹ウイルスに関する。また特許請求の範囲においてクレームされる組換え麻疹ウイルスを製造するための方法及びキットにも関する。

Description

本発明は、自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスに対する一次又は二次的抵抗性を有する悪性細胞の治療において使用するための、自殺遺伝子を含む組換え麻疹ウイルスを含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、酵母システインデアミナーゼ及び酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合を含む自殺遺伝子を含む、麻疹ワクチンＳｃｈｗａｒｚ株のゲノムに基づく組換え麻疹ウイルス、並びに本出願においてクレームされる組換え麻疹ウイルスを製造する方法及びキットに関する。

例えば化学療法、抗体に基づく治療、腫瘍ワクチン、及び放射線療法の開発における過去の著しい進歩に関わらず、腫瘍や関連する悪性の疾患の治療のための新規の治療や治療アプローチの開発について、満たされていない切迫した必要性が未だに存在している。

遺伝子治療アプローチが、そのような治療に対する十分な見込みを有し、そして抗腫瘍結果が、異なる遺伝子治療モデルにおいて観察されている一方で、ある種の制限、特に目的の遺伝子を腫瘍細胞へ導入する際の制限が、かかるアプローチの一層の開発を妨げている。

以前、麻疹ウイルスの天然感染又はワクチン接種が、自発的な腫瘍の緩和、特に血液悪性腫瘍、例えば白血病における緩和をもたらすことが偶然観察されており、麻疹ウイルスの腫瘍崩壊性の潜在能力が同定されている。

麻疹ウイルスは、モルビリウイルス属（genus Morbillivirusu）の、エンベロープを有し、一本鎖、マイナス鎖のパラミクソウイルスであり、感染性の麻疹疾患、呼吸器系の感染を引き起こす。麻疹ウイルスのゲノムは、８つのタンパク質：ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）、ホスホタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、融合タンパク質（Ｆ）、ヘマググルチニンタンパク質（Ｈ）及びラージタンパク質（Ｌ）、並びにＣ及びＶと名付けられた２のアクセサリータンパク質をコードする６の遺伝子を含む。ウイルスは、ｐＨ非依存性膜融合を介して標的細胞に侵入する。ＨとＦタンパク質は、受容体結合と膜融合にそれぞれ関与している。麻疹ウイルスの細胞内への侵入は、表面のＨ糖タンパク質と、麻疹ウイルスに対する２つの既知の受容体：ＣＤ４６とシグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）との相互作用を介して生じる。ＣＤ４６は、霊長類有核細胞に偏在的に存在しているが、腫瘍において頻繁に過剰発現しており、ＳＬＡＭは、Ｂ細胞及びＴ細胞に主に存在している。ＣＤ４６は、Ｃ３ｂ及びＣ４ｂ補体生成物のタンパク質分解性の不活性化において、コファクターとして作用することにより、自己補体溶解に対してヒト細胞を保護する膜関連補体制御タンパク質であり、そうして補体媒介性の溶解に対して腫瘍細胞の保護を提供する。Ｈタンパク質による受容体の認識は、Ｆタンパク質の構造変化を引き起こし、標的細胞膜との融合と、それに続くウイルスの侵入をもたらす。腫瘍細胞を含む感染細胞は、ウイルスＦ及びＨタンパク質を細胞表面に発現する。近隣の感染又は未感染細胞がウイルス受容体を認識し、細胞−細胞融合が引き起こされる。その結果、麻疹ウイルスの典型的な細胞変性効果は、巨大単核細胞凝集物（合胞体）が形成することである。

麻疹ワクチンや、腫瘍崩壊性麻疹ウイルスの研究に用いられる麻疹ウイルス調製物の多くは、１９５４年に元々得られた単離株であるいわゆるエドモンストンワクチン株に由来する弱毒化生麻疹ウイルスに基づいており、当該株は、エドモンストン−エンダース細胞系統や、それに基づく、ヒト細胞において連続継代し、そして続いてニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞に適用することにより得られるエドモンストンＡ及びＢ種系統（seed line）の作出に用いられている。エドモンストンＢ系統に基づいて元もと開発された生弱毒化ワクチンの使用は、その高い反応原性のため中止しなければならなかった。エドモンストン系統、エドモンストン―エンダースやエドモンストンＡ及びＢ系統のさらなる弱毒化により、さらなる麻疹誘導体が開発されている（エドモンストン―エルダー系統：ＡＩＫ−Ｃ、エドモンストン・ザグレブ；エドモンストンＡ系統：シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）；エドモンストンＢ系統：モラテン）。

麻疹ウイルスの腫瘍崩壊性の潜在能力の発見以来なされてきた進歩、この進歩は、最近の総説論文において要約されている（Msaouel, P., Dispenzieri, A., and Galanis, E., Clinical testing of engineered oncolytic measles virus strain in the treatment of cancer; An overview, Curr Opin Mol Ther. 2009; 11:43-53）にもかかわらず、腫瘍崩壊性麻疹ウイルスに基づく治療製品は、いまだ上市されておらず、この事実は、少なくとも部分的には、重大な副作用を引き起こす野生型ウイルスの潜在能力、並びに特に臨床使用のための高純度のウイルス調製品の製造における技術的制限が原因の可能性がある。麻疹ウイルスの生物学や、組換え麻疹ウイルス株のレスキューについて、又はウイルス操作を可能にする逆遺伝学システムの開発についての知識が拡張することにより、癌治療における治療薬として麻疹ウイルスを開発するための新たな機会が開かれた一方で、現在使用されているコンストラクトにおけるいくつかの制限がいまだ存在している。

例えば、現在行われている研究や開発プログラムの多くは、Martin Billeterとその同僚によりなされた業績に基づいている（Radecke, F., Spielhofer, P., Schneider, H., Kaelin, K., Huber, M., Dotsch, K, Christiansen, G., and Billeter, M., Rescue of measles viruses from cloned DNA. EMBO JouＲＮＡl 14 （1995） 5773-5784; WO 97/06270）。続いて、野生株エドモンストン株に近く、かつエドモンストンサブグループに関連する置換を有するエドモンストンＢ系統に由来するクローン化されたウイルスゲノムの配列が示された（Parks et al., J. Virol. 75 （2001） 910-920; Parks et al., J. Virol. 75 （2001） 921-933）。

さらに、麻疹ウイルス調製品は、現在、ワクチン生産用に承認されていない細胞株、例えばニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）又は２９３ヒト胚性腎臓細胞から取得しており、その両方とも複雑であり、それによりＧＭＰ要件に準拠した組換え麻疹ウイルス粒子の大規模生産のコストを増加させる。

さらに、ある細胞株（例えば、ＲＰＭＩ８２２６及びＨＴ１０８０）に由来する腫瘍は、繰り返しのウイルス注射にもかかわらず、腫瘍崩壊性麻疹ウイルスでの処理に対して抵抗性であったということが示されている（Peng KW, Facteau S, Wegman T, O'Kane D, Russell SJ. Non-invasive in vivo monitoring of trackable viruses expressing soluble marker peptides. Nat Med. （2002）; 8: 527-31）。

その結果、悪性細胞の治療において使用するための組換え麻疹ウイルスを含む改善された医薬組成物や、そのような医薬組成物及び組換え麻疹ウイルスを生成するための改善された方法に対する絶え間ない必要性が残っている。

したがって、従来技術の課題を鑑み、本発明の第一の対象は、従来技術の麻疹ウイルスに対して抵抗性である腫瘍に対して腫瘍崩壊活性を伴う組換え麻疹ウイルスを含む、改善された医薬組成物を提供することである。

本発明の第二の対象は、樹立された弱毒化生麻疹ウイルスのゲノムに対応するウイルスゲノムを有する組換え麻疹ウイルスを含む改善された医薬組成物である。

本発明の第三の対象は、悪性細胞の治療において使用するための組換え麻疹ウイルスを取得するためのより安全かつより安価な方法である。

これらの及び他の対象は、自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスに対する一次又は二次抵抗性（primary or secondary resistances）を有する悪性細胞の治療において使用するための自殺遺伝子を含む組換え麻疹ウイルスを含む医薬組成物により解決される。

自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスに対する一次又は二次抵抗性を有する悪性細胞の治療において使用するための、自殺遺伝子をコードする組換え麻疹ウイルスの発明は、抗腫瘍効力が失われることなく、少ない数の感染性麻疹ウイルス粒子を使用することを同時に可能にする固体腫瘍のより効果的な治療を可能にする。それにより、ウイルス治療のコストを有意に低下できる。

別の態様では、本発明は、シトシンデアミナーゼ、特に酵母のシトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体を含む自殺遺伝子を含む麻疹ワクチンSchwarz株に基づく組換え麻疹ウイルスであって、特にここで当該自殺遺伝子が、配列番号２の配列を含む、前記ウイルスに関する。

別の態様では、本発明は、自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスに対する一次又は二次抵抗性を有する悪性細胞の治療方法であって、本発明に記載の自殺遺伝子を含む組換え麻疹ウイルスを、それらを必要とする患者に投与する工程を含む、前記方法に関する。

別の態様では、本発明は、本発明に記載の組換え麻疹ウイルスを生成するための方法にであって、（ａ）（ｉ）麻疹ワクチンSchwarz株のゲノム、及び（ｉｉ）シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体を含む自殺遺伝子を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下でプラスミドにクローニングする工程を含む、方法に関する。

さらに別の態様では、本発明は、以下の：
（ａ）（ｉ）麻疹ワクチンSchwarz株のゲノム、及び（ｉｉ）シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体を含む自殺遺伝子を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下に含む、プラスミドであって、特に当該自殺遺伝子が、配列番号２に記載の配列を含み、特に当該プラスミドが、配列番号４、配列番号８、又は配列番号９、より具体的に配列番号４に記載の配列を有する、プラスミド；
（ｂ）単一の遺伝子の形態で、麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Ｎ、Ｐ、及びＬを、それぞれＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下で含む少なくとも１のプラスミド
を含むキットに関する。

図１は、麻疹ワクチンＳｃｈｗａｒｚ株の遺伝配列（配列番号１）を示す。 図１は、麻疹ワクチンＳｃｈｗａｒｚ株の遺伝配列（配列番号１）を示す。 図１は、麻疹ワクチンＳｃｈｗａｒｚ株の遺伝配列（配列番号１）を示す。 図１は、麻疹ワクチンＳｃｈｗａｒｚ株の遺伝配列（配列番号１）を示す。 図１は、麻疹ワクチンＳｃｈｗａｒｚ株の遺伝配列（配列番号１）を示す。 図２は、酵母シトシンデアミナーゼと酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体（リンカー配列を伴う）の遺伝子配列（配列番号２）を示す。 図３は、導入遺伝子を伴わないが、追加の転写カセットを伴うＭｅＶ Ｓｃｈｗａｒｚ株から遺伝子操作された基礎組換え麻疹ウイルスをコードするプラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−Ｔｒｋａの完全遺伝子配列（配列番号３）を示す。 図３は、導入遺伝子を伴わないが、追加の転写カセットを伴うＭｅＶ Ｓｃｈｗａｒｚ株から遺伝子操作された基礎組換え麻疹ウイルスをコードするプラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−Ｔｒｋａの完全遺伝子配列（配列番号３）を示す。 図３は、導入遺伝子を伴わないが、追加の転写カセットを伴うＭｅＶ Ｓｃｈｗａｒｚ株から遺伝子操作された基礎組換え麻疹ウイルスをコードするプラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−Ｔｒｋａの完全遺伝子配列（配列番号３）を示す。 図３は、導入遺伝子を伴わないが、追加の転写カセットを伴うＭｅＶ Ｓｃｈｗａｒｚ株から遺伝子操作された基礎組換え麻疹ウイルスをコードするプラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−Ｔｒｋａの完全遺伝子配列（配列番号３）を示す。 図３は、導入遺伝子を伴わないが、追加の転写カセットを伴うＭｅＶ Ｓｃｈｗａｒｚ株から遺伝子操作された基礎組換え麻疹ウイルスをコードするプラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−Ｔｒｋａの完全遺伝子配列（配列番号３）を示す。 図３は、導入遺伝子を伴わないが、追加の転写カセットを伴うＭｅＶ Ｓｃｈｗａｒｚ株から遺伝子操作された基礎組換え麻疹ウイルスをコードするプラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−Ｔｒｋａの完全遺伝子配列（配列番号３）を示す。 図３は、導入遺伝子を伴わないが、追加の転写カセットを伴うＭｅＶ Ｓｃｈｗａｒｚ株から遺伝子操作された基礎組換え麻疹ウイルスをコードするプラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−Ｔｒｋａの完全遺伝子配列（配列番号３）を示す。 図４は、ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（配列番号４）の遺伝子配列を示す。 図４は、ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（配列番号４）の遺伝子配列を示す。 図４は、ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（配列番号４）の遺伝子配列を示す。 図４は、ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（配列番号４）の遺伝子配列を示す。 図４は、ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（配列番号４）の遺伝子配列を示す。 図４は、ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（配列番号４）の遺伝子配列を示す。 図４は、ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（配列番号４）の遺伝子配列を示す。 図４は、ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（配列番号４）の遺伝子配列を示す。 図５は、ＣＭＶプロモーターヌクレオチド−３０１〜−１（＋１が、転写開始部位として定義される）と、−１位の後に追加的に挿入された３つのヌクレオチド（ＴＧＧ）を包含するＣＭＶプロモーターバリアントコンストラクトｐｃ３に基づくＮ遺伝子（配列番号５）の発現に必要とされるヘルパープラスミドの遺伝子配列を示す：− ｎｔ１３５８−２９３５： ＭｅＶ ＳｃｈｗａｒｚのＮ ＯＲＦ（１５７８ ｎｔ＝５２５ａａ＋ストップコドン） 図５は、ＣＭＶプロモーターヌクレオチド−３０１〜−１（＋１が、転写開始部位として定義される）と、−１位の後に追加的に挿入された３つのヌクレオチド（ＴＧＧ）を包含するＣＭＶプロモーターバリアントコンストラクトｐｃ３に基づくＮ遺伝子（配列番号５）の発現に必要とされるヘルパープラスミドの遺伝子配列を示す：・ｎｔ１３５８−２９３５： ＭｅＶ ＳｃｈｗａｒｚのＮ ＯＲＦ（１５７８ ｎｔ＝５２５ａａ＋ストップコドン） 図５は、ＣＭＶプロモーターヌクレオチド−３０１〜−１（＋１が、転写開始部位として定義される）と、−１位の後に追加的に挿入された３つのヌクレオチド（ＴＧＧ）を包含するＣＭＶプロモーターバリアントコンストラクトｐｃ３に基づくＮ遺伝子（配列番号５）の発現に必要とされるヘルパープラスミドの遺伝子配列を示す：・ｎｔ１３５８−２９３５： ＭｅＶ ＳｃｈｗａｒｚのＮ ＯＲＦ（１５７８ ｎｔ＝５２５ａａ＋ストップコドン） 図６は、ＣＭＶプロモーターバリアントコンストラクトｐｃ３に基づくＰ遺伝子（配列番号６）の発現に必要とされるヘルパープラスミドの遺伝子配列を示す：・ｎｔ１３５８−２８８１： ＭｅＶ ＳｃｈｗａｒｚのＰ ＯＲＦ（１５２４ｎｔ＝５０７ａａ＋ストップコドン） 図６は、ＣＭＶプロモーターバリアントコンストラクトｐｃ３に基づくＰ遺伝子（配列番号６）の発現に必要とされるヘルパープラスミドの遺伝子配列を示す：・ｎｔ１３５８−２８８１： ＭｅＶ ＳｃｈｗａｒｚのＰ ＯＲＦ（１５２４ｎｔ＝５０７ａａ＋ストップコドン） 図６は、ＣＭＶプロモーターバリアントコンストラクトｐｃ３に基づくＰ遺伝子（配列番号６）の発現に必要とされるヘルパープラスミドの遺伝子配列を示す：・ｎｔ１３５８−２８８１： ＭｅＶ ＳｃｈｗａｒｚのＰ ＯＲＦ（１５２４ｎｔ＝５０７ａａ＋ストップコドン） 図７は、ＣＭＶプロモーターバリアントコンストラクトｐｃ３に基づくＬ遺伝子（配列番号７）の発現に必要とされるヘルパープラスミドの遺伝子配列を示す：・ｎｔ１３５８−７９０９： ＭｅＶ ＳｃｈｗａｒｚのＬ ＯＲＦ（６５５２ｎｔ＝２１８３ａａ＋ストップコドン） 図７は、ＣＭＶプロモーターバリアントコンストラクトｐｃ３に基づくＬ遺伝子（配列番号７）の発現に必要とされるヘルパープラスミドの遺伝子配列を示す：・ｎｔ１３５８−７９０９： ＭｅＶ ＳｃｈｗａｒｚのＬ ＯＲＦ（６５５２ｎｔ＝２１８３ａａ＋ストップコドン） 図７は、ＣＭＶプロモーターバリアントコンストラクトｐｃ３に基づくＬ遺伝子（配列番号７）の発現に必要とされるヘルパープラスミドの遺伝子配列を示す：・ｎｔ１３５８−７９０９： ＭｅＶ ＳｃｈｗａｒｚのＬ ＯＲＦ（６５５２ｎｔ＝２１８３ａａ＋ストップコドン） 図７は、ＣＭＶプロモーターバリアントコンストラクトｐｃ３に基づくＬ遺伝子（配列番号７）の発現に必要とされるヘルパープラスミドの遺伝子配列を示す：・ｎｔ１３５８−７９０９： ＭｅＶ ＳｃｈｗａｒｚのＬ ＯＲＦ（６５５２ｎｔ＝２１８３ａａ＋ストップコドン） 図７は、ＣＭＶプロモーターバリアントコンストラクトｐｃ３に基づくＬ遺伝子（配列番号７）の発現に必要とされるヘルパープラスミドの遺伝子配列を示す：・ｎｔ１３５８−７９０９： ＭｅＶ ＳｃｈｗａｒｚのＬ ＯＲＦ（６５５２ｎｔ＝２１８３ａａ＋ストップコドン） 図８は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理し、そしてプロドラッグである５−ＦＣとインキュベートされたＨｕＣＣＴ１、ＲＢＥ、及びＴＦＫ−１細胞（ヒト胆管ガン細胞）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。 図８は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理し、そしてプロドラッグである５−ＦＣとインキュベートされたＨｕＣＣＴ１、ＲＢＥ、及びＴＦＫ−１細胞（ヒト胆管ガン細胞）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。 図９は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理されたＨｕＣＣＴ１、ＲＢＥ、及びＴＦＫ−１細胞（ヒト胆管ガン細胞）のＬＤＨ放出アッセイの結果を示す。 図１０は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理されたＳＡＳ及びＨＴＢ−４３ＦａＤｕ細胞（ヒト頭頸部（Ｈ＆Ｎ）ガン細胞）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。 図１０は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理されたＳＡＳ及びＨＴＢ−４３ＦａＤｕ細胞（ヒト頭頸部（Ｈ＆Ｎ）ガン細胞）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。 図１１は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理されたＳＡＳ及びＨＴＢ−４３ＦａＤｕ細胞（ヒト頭頸部（Ｈ＆Ｎ）ガン細胞）のＬＤＨ放出アッセイの結果を示す。 図１１は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理されたＳＡＳ及びＨＴＢ−４３ＦａＤｕ細胞（ヒト頭頸部（Ｈ＆Ｎ）ガン細胞）のＬＤＨ放出アッセイの結果を示す。 図１２は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理されたＡ６７３、ＢＲＺ、及びＳＲＨ細胞（ヒト肉腫細胞）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。 図１２は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理されたＡ６７３、ＢＲＺ、及びＳＲＨ細胞（ヒト肉腫細胞）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。 図１３は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理されたＡ６７３及びＳＲＨ細胞（ヒト肉腫細胞）のＬＤＨ放出アッセイの結果を示す。 図１３は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理されたＡ６７３及びＳＲＨ細胞（ヒト肉腫細胞）のＬＤＨ放出アッセイの結果を示す。 図１４は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理されたＳＲＨ細胞のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。 図１５は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理された肉腫細胞（細胞株ＣＣＳ、ＬＭ）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。 図１５は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理された肉腫細胞（細胞株ＣＣＳ、ＬＭ）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。 図１６は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理された肉腫細胞（細胞株ＳＴＯ、ＺＡＦ、ＫＤ）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。 図１６は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理された肉腫細胞（細胞株ＳＴＯ、ＺＡＦ、ＫＤ）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。 図１７は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理されたグリア芽腫細胞（細胞株ＬＮＴ２２９、ＬＮＴ２２９ＣＴＳ−１）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。 図１７は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理されたグリア芽腫細胞（細胞株ＬＮＴ２２９、ＬＮＴ２２９ＣＴＳ−１）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。 図１８は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理されたグリア芽腫細胞（細胞株ＬＮ１８、ＬＮ１８アポトーシス抵抗性）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。 図１８は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理されたグリア芽腫細胞（細胞株ＬＮ１８、ＬＮ１８アポトーシス抵抗性）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。 図１９は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理された肉腫細胞（細胞株ＣＣＳ、ＬＭ）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。 図１９は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理された肉腫細胞（細胞株ＣＣＳ、ＬＭ）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。 図２０は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理された結腸腺腫瘍細胞（細胞株ＫＭ−１２、ＨＣＴ−１５）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。 図２０は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）から取得されたウイルス粒子で処理された結腸腺腫瘍細胞（細胞株ＫＭ−１２、ＨＣＴ−１５）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。 図２１は、Ｈｅｐ３Ｂ ヒト肝細胞癌腫細胞上で、３つの異なる強化（armed）ＭｅＶベクター（ベクター、ｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ、ｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤ、及びｐＭｅｒＶ２ Ｐ−ＳＣＤ）の効果を示し；全ての実験を、４回行い；実験を３回繰り返した；数値：平均＋ＳＥＭ。 図２２は、ＨｅｐＧ２ヒト肝臓細胞癌腫細胞で３の異なる強化ＭｅＶベクター（ベクター、ｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ、ｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤ、及びｐＭｅｒＶ２ Ｐ−ＳＣＤ）の効果を示す；全ての実験を、４回行い；実験を３回繰り返した；数値：平均＋ＳＥＭ。 図２３は、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５ヒト肝臓細胞癌腫細胞で３の異なる強化ＭｅＶベクター（ベクター、ｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ、ｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤ、及びｐＭｅｒＶ２ Ｐ−ＳＣＤ）の効果を示す；全ての実験を、４回行い；実験を３回繰り返した；数値：平均＋ＳＥＭ。 図２４は、異種移植動物ＨＣＣ腫瘍モデル（Ｈｅｐ３Ｂモデル）における腫瘍体積の測定の結果を示す。 図２５は、異種移植動物ＨＣＣ腫瘍モデル（Ｈｅｐ３Ｂモデル）における生存データーの測定の結果を示す。 図２６は、異種移植動物ＣＣ腫瘍モデル（ＴＦＫ−１モデル）における腫瘍体積の測定の結果を示す。 図２７は、ウイルスｃＤＮＡとそれぞれのウイルスベクターの模式的外観を示す。プラスミド（ａ）ｐｃ３ＭｅｒＶ２ｌｄ−ＳＣＤ（２０８４１ｂｐ）、（Ｂ）ｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤ（２１，７５９ｂｐ）、及び（Ｃ）ｐＭｅｒＶ２ Ｐ−ＳＣＤ（２０５４６ｂｐ）が示される。オープンリーディングフレームが矢印（ウイルス遺伝子を白色、導入遺伝子を暗色）で示される。非翻訳領域及びプラスミド骨格を、直線で示す。Ｎ：ヌクレオキャプシドタンパク質、Ｐ：リンタンパク質、Ｍ：マトリックスタンパク質、Ｆ：融合タンパク質、Ｈ：ヘマググルチニン、Ｌ：ラージタンパク質、ＳＣＤ：スーパーシトシンデアミナーゼ、ＶＰ２２ＳＣＤ：ＳＣＤと単純ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ２２の融合体。 図２８は、ベクターｐＭｅｒＶ２Ｐ−ＳＣＤ（Ｍｅｖ Ｐ−ＳＣＤをコードする）（配列番号８）の遺伝子配列を示す。 図２８は、ベクターｐＭｅｒＶ２Ｐ−ＳＣＤ（Ｍｅｖ Ｐ−ＳＣＤをコードする）（配列番号８）の遺伝子配列を示す。 図２８は、ベクターｐＭｅｒＶ２Ｐ−ＳＣＤ（Ｍｅｖ Ｐ−ＳＣＤをコードする）（配列番号８）の遺伝子配列を示す。 図２８は、ベクターｐＭｅｒＶ２Ｐ−ＳＣＤ（Ｍｅｖ Ｐ−ＳＣＤをコードする）（配列番号８）の遺伝子配列を示す。 図２８は、ベクターｐＭｅｒＶ２Ｐ−ＳＣＤ（Ｍｅｖ Ｐ−ＳＣＤをコードする）（配列番号８）の遺伝子配列を示す。 図２８は、ベクターｐＭｅｒＶ２Ｐ−ＳＣＤ（Ｍｅｖ Ｐ−ＳＣＤをコードする）（配列番号８）の遺伝子配列を示す。 図２８は、ベクターｐＭｅｒＶ２Ｐ−ＳＣＤ（Ｍｅｖ Ｐ−ＳＣＤをコードする）（配列番号８）の遺伝子配列を示す。 図２８は、ベクターｐＭｅｒＶ２Ｐ−ＳＣＤ（Ｍｅｖ Ｐ−ＳＣＤをコードする）（配列番号８）の遺伝子配列を示す。 図２９は、ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤ（ＭｅＶ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤをコードする）（配列番号９）の遺伝子配列を示す。 図２９は、ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤ（ＭｅＶ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤをコードする）（配列番号９）の遺伝子配列を示す。 図２９は、ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤ（ＭｅＶ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤをコードする）（配列番号９）の遺伝子配列を示す。 図２９は、ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤ（ＭｅＶ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤをコードする）（配列番号９）の遺伝子配列を示す。 図２９は、ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤ（ＭｅＶ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤをコードする）（配列番号９）の遺伝子配列を示す。 図２９は、ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤ（ＭｅＶ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤをコードする）（配列番号９）の遺伝子配列を示す。 図２９は、ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤ（ＭｅＶ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤをコードする）（配列番号９）の遺伝子配列を示す。 図２９は、ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤ（ＭｅＶ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤをコードする）（配列番号９）の遺伝子配列を示す。

本発明は、自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスに対して一次又は二次的抵抗性を備えた悪性細胞の治療において使用するための、自殺遺伝子を含む組換え麻疹ウイルスを含む医薬組成物に関する。

本発明の意味における「含む（comprise）」及び「含んでいる（contain）」という語句は、特徴が完全に網羅されていない一覧を意味する。同様に、「１の」という語句は、「少なくとも１」の意味で理解されたい。

本発明の文脈では、「自殺遺伝子」という語句は、宿主細胞において発現すると、かかる宿主細胞の生存性の低下を引き起こすか、又はもたらす遺伝子を指す。特別な状況では、自殺遺伝子は、アポトーシスを介した細胞による細胞自身の殺傷を引き起す。特定の状況では、自殺遺伝子の発現は、非毒性のプロドラッグから細胞障害性の薬剤の生成を触媒する酵素をもたらす。

本発明に記載の医薬組成物の特定の実施態様では、悪性細胞は、以下の工程：
（ａ） 悪性腫瘍に由来する細胞集合を、腫瘍崩壊性麻疹ウイルスで、１の感染多重度で感染後、７２時間、又は好ましくは９６時間で、当該集合における生細胞の割合を測定すること、
を行うことにより同定され、ここで当該集合における４０％以上、特に５０％以上、より具体的に６０％以上の生細胞の割合は、悪性細胞が、自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスに対する一次又は二次抵抗性であることを指し示す。

特定の実施態様では、組換え麻疹ウイルスは、麻疹ワクチンSchwarz株に基づいている。

麻疹ワクチンSchwarz株について、その全長配列を含み、そして他のワクチン株との比較を含む記載は、Tillieuxらにおいて見いだすことができる（Tillieux, S.L., Halseyb, W.S., Satheb, G.M., and Vassilev, V. Comprative analysis of the complete nucleotide sequences of measles, mumps, and rubella strain genomes contained in Priorix-TetraTM and ProQuadTM live attenuated combined vaccines. Vaccine 27 （2009） 2265-2273）。

特定の実施態様では、自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスは、麻疹ワクチンSchwarz株に由来する。より具体的に、自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスは、配列番号１に記載の配列を有する（図１を参照のこと）。

本発明の文脈では、「配列番号１に記載の配列を有する」という用語は、出てきた文脈に依存しており、そして配列番号１に記載されるＤＮＡ配列を指すか、又はそのようなｃＤＮＡ配列を含むベクターからレスキューされたウイルス粒子においてパッケージされて見いだされる対応のＲＮＡ配列を指す。

本発明に記載の医薬組成物の特定の実施態様において、自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼを含む。

シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼ、及びガン遺伝子治療におけるプロドラッグ変換酵素としてのその使用は、様々な文献において論じられ、そして試験されてきた（例えば、Kievit, E., Nyati, M.K., Ng, E., Stegman, L.D., Parsels, J., Ross, B.D., Rehemtulla, A., Lawrence, T.S. Yeast cytosine deaminase improves radiosensitization and bystander effect by 5-fluoro cytosine of human colrectal cancer xenografts. Cancer Res. 60 （2000） 6649-55）。

特定の実施態様では、自殺遺伝子は、さらにウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼを含む。

シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの同時発現は、５−フルオロシトシンから細胞傷害性代謝産物への酵素変換を改善することが示された（Tiraby M, Cazaux C, Baron M, Drocourt D, Reynes JP, Tiraby G. FEMS Microbiol Lett. 167 （1998） 41-9）。

より具体的に、自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体、いわゆるＳＣＤ（スーパーＣＤ）を含む。

シトシンデアミナーゼとウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼを含む融合遺伝子の使用は、アデノウイルスシステムについて記載された（Erbs, P., Regulier, E., Kintz, J., Leroy, P., Poitevin, Y., Exinger, F., Jund, R., and Mehtali, M, "In vivo cancer gene therapy by adenovirus-mediated transfer of a bifunctional yeast cytosine deaminase/uracil phosphori osyltransferase fusion gene. Cancer Res. 60 （2000） 3813-22）。

もっとも具体的に、自殺遺伝子は、配列番号２に記載の配列を含む（図２を参照のこと）。

本発明の文脈では、「配列番号 に記載の配列を含む」という用語は、出てきた文脈に依存し、そして当該配列番号で記載されたＤＮＡ配列を指すか、又はそのようなｃＤＮＡ配列を含むベクターからレスキューされたウイルス粒子においてパッケージされて見いだされる対応のＲＮＡ配列を指す。

特定の実施態様では、組換え麻疹ウイルスは、配列番号３（図３を参照のこと）、配列番号４（図４を参照のこと）、配列番号８（図２８を参照のこと）、又は配列番号９（図２９を参照のこと）、特に配列番号４に対応するＲＮＡ配列を含む。

本発明に記載の医薬組成物の特定の実施態様では、悪性細胞が、化学療法剤及び/又は放射線治療にさらに非応答性である。

特定の実施態様では、悪性細胞は、胆管癌、ヒト頭頸部癌、及び肉腫に由来する悪性細胞のリストから選ばれる。

特定の実施態様では、医薬組成物は、自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスに対して一次又は二次的抵抗性を有する悪性細胞の治療において使用するための自殺遺伝子を含む組換え麻疹ウイルスを使用して、繰り返し治療、具体的に毎週、又は２週間ごと、又は３週間ごと、又は４週間ごと繰り返される治療において使用される。

近年、自殺遺伝子活性を伴わない組換え麻疹ウイルスの繰り返し適用（４週間ごと、最大６サイクル）の臨床レジュメの使用は、ベースライン時と、実験終了時の血清抗麻疹抗体レベルが、血液中及び腹水中の両方において、ベースラインに比較して安定であり、それにより液性免疫応答を有意にブーストすることはないことが示された（Galanis E, Hartmann LC, Cliby WA, Long HJ, Peethambaram PP, Barrette BA, Kaur JS, Haluska PJ Jr, Aderca I, Zollman PJ, Sloan JA, Keeney G, Atherton PJ, Podratz KC, Dowdy SC, Stanhope CR, Wilson TO, Federspiel MJ, Peng KW, Russell SJ. Cancer Res. 2010; 70（3）: 875-82）。その結果、組換え麻疹ウイルスの繰り返し適用は、癌患者の治療に適していることが見いだされた。

別の態様では、本発明は、当該麻疹ウイルスは、シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体を含む自殺遺伝子をコードする麻疹ワクチンＳｃｈｗａｒｚ株に基づく組換え麻疹ウイルスに関する。

本発明に記載の組換え麻疹ウイルスの特定の実施態様では、自殺遺伝子は配列番号２に記載の配列を含む。

特定の実施態様では、組換え麻疹ウイルスは、配列番号３（図３を参照のこと）、配列番号４（図４を参照のこと）、配列番号８（図２８を参照のこと）、又は配列番号９（図２９を参照のこと）、特に配列番号４に記載のＲＮＡ配列を含む。

別の態様では、本発明は、自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスに対して一次又は二次抵抗性を有する悪性細胞の治療方法であって、本発明に記載の自殺遺伝子を含む組換え麻疹ウイルスを、それらを必要とする患者に投与する工程を含む、方法に関する。

本発明の態様の特定の実施態様では、治療は、胆管癌、頭頸部癌、又は肉腫の治療である。

ある実施態様では、治療方法は、繰り返し治療、特に毎週、２週ごと、又は３週ごと、又は４週ごとの繰り返し治療である。

別の態様では、本発明は、本発明に記載の組換え麻疹ウイルスを生成する方法に関しており、以下の（ａ）（ｉ）麻疹ワクチンＳｃｈｗａｒｚ株のゲノムと、（ｉｉ）自殺遺伝子を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下でプラスミド内にクローニングする工程を含む。

一本鎖マイナス鎖ウイルスのｃＤＮＡからゲノムに相補する（antigenomic）ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を効率的に発現するＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターシステムの使用は、ボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）及び麻疹ウイルスについて示されている（Martin, A., Staeheli, P., and Schneider, U. ＲＮＡ Polymerase II-Controlled Expression of Antigenomic ＲＮＡ Enhances the Rescue Efficacies of Two Different Members of the Mononegavirales Independently of the Site of Viral Genome Replication, J. Virol. 80 （2006） 5708-5715）。

本発明に記載の方法の特定の実施態様では、自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼを含む。

別の特定の実施態様では、自殺遺伝子はさらに、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをさらに含む。

別の特定の実施態様では、自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼとの融合体を含む。

本発明に記載の方法の特定の実施態様では、自殺遺伝子が、配列番号２（図２を参照のこと）に記載の配列を含む。

特定の実施態様では、本方法は、さらに、以下の：
（ｂ）麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Ｎ、Ｐ、及びＬを、それぞれＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下で少なくとも１のベクターにクローニングすることを含む、前記方法。

特定の実施態様では、ウイルスヘルパー遺伝子Ｎ、Ｐ及びＬは、各々ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下で別々のベクター、特にプラスミドベクターにクローニングされ、（ｉ）麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Ｎをコードするプラスミド、（ｉｉ）麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Ｐをコードするプラスミド、及び（iii）麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Ｌをコードするプラスミドをもたらす。

こうして、このような実施態様は、以下の工程：
（ｂ） ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下で麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Ｎを、第一ベクター、特にプラスミドベクターにクローニングし；
（ｃ） ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下で麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Ｐを、第二ベクター、特にプラスミドベクターにクローニングし；
（ｄ） ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下で疹ウイルスヘルパー遺伝子Ｌを、第三ベクター、特にプラスミドベクターにクローニングする
を含む方法に関する。

特定の実施態様では、工程（ａ）及び/又は（ｂ）、又は（ａ）及び/又は（ｂ）〜（ｄ）は、当該ゲノム及び/又は当該ヘルパー遺伝子から推定のスプライシング配列を除去する工程をさらに含む。

特定の実施態様では、工程（ａ）は、配列番号４（図４を参照のこと）、配列番号８（図２８を参照のこと）、又は配列番号９（図２９を参照のこと）、特に配列番号４に記載の配列を有するプラスミドをもたらす。

特定の実施態様では、工程（ｂ）〜（ｄ）は、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７（図５〜７を参照のこと）に記載の配列を有するプラスミドをもたらす。

特定の実施態様では、本発明に記載の方法は、さらに、以下の工程：
（ｅ）宿主細胞、特にワクチン生産に承認された認定細胞株、特にベロ又はＭＲＣ−５細胞株由来の細胞株に、工程（ａ）及び（ｂ）のプラスミドをトランスフェクトする
をさらに含む。

生ウイルスワクチンの生産のためのもっとも重要な因子のうちの一つは、その遺伝的安定性である。遺伝的安定性は、ワクチン株のより毒性の形態への潜在的な変換や、潜在的に病原性のウイルスを生産する他のウイルス配列との組換え、そして免疫原性及び効力の低下をもたらしうる任意の遺伝的ドリフトに関する。様々な場合において、ベロ及びＭＲＣ−５細胞株における生ワクチン株の伝播が、ワクチン株の遺伝的安定性を維持することが示された（例えば、Laassri M, Meseda CA, Williams O, Merchlinsky M, Weir JP, Chumakov K., Microarray assay for evaluation of the genetic stability of modified vaccinia virus Ankara B5R gene. J. Med. Virol. 79 （2007） 791-802）.

特定の実施態様では、本方法はさらに、（ｆ）工程（ｅ）においてトランスフェクトされた宿主細胞から組換え麻疹ウイルスをレスキューする工程を含む。

別の態様では、本発明は、以下の：
（ａ） （ｉ）麻疹ワクチンSchwarz株のゲノム、及び（ｉｉ） シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体を含む、自殺遺伝子をＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下に含むプラスミドであって、特にここで当該自殺遺伝子が、配列番号２（図２を参照のこと）に記載の配列を含み、特にここでプラスミドが配列番号４（図４を参照のこと）、配列番号８（図２８を参照のこと）、又は配列番号９（図２９を参照のこと）、より具体的には配列番号４に記載の配列を含む、プラスミド；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下で、単一遺伝子の形態で、麻疹ウイルス遺伝子Ｎ、Ｐ、及びＬを含む少なくとも１のプラスミド
を含むキットに関する。

本発明に記載の具体的な実施態様では、ウイルスヘルパー遺伝子Ｎ、Ｐ、及びＬが、各々別々のプラスミドに、それぞれＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下にクローニングされており、ここで当該プラスミドは、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７（図５〜７を参照）に記載の配列を有する。

本発明は、以下の実施例を参照して記載される。これらの実施例は、例示の目的で提供されており、そして本発明は、これらの実施例に限定されて解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に与えられた教示の結果として明らかとなった任意の及び全ての変更を包含するように解釈すべきである。下記の材料と方法は、それに続く実施例に関して提供されるが、本発明に包含される多様な材料や方法を限定するものではない。

実施例１：ＭｅＶｃＤＮＡプラスミドベクター ｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−Ｔｒｋａ（配列番号３）の調製
麻疹ウイルスｃＤＮＡベクターの調製は、近年記載されたとおりに基本的に行われた（Inoue K, Shoji Y, Kurane I, Iijima T, Sakai T, Morimoto K. J virol Methods. 2003; 107: 229-36; Martin A, Staeheli P, Schneider U. J Virol. 2006; 80:5708-15）が、以下の重要な変更を伴った。
最初に、（ｉ）組換え麻疹ウイルスベクターのレスキューや増幅について使用される場合、広く使用されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）プロモーターのうちどちらの配列部分／断片が、最適か分からず、そして（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ（Ｍ６０３２１，Ｍ２１２９５）に記載される異なるＣＭＶウイルスゲノムのうちどちらが、ＣＭＶベースの最小プロモーターの生成に使用されるべきか分からなかった。その結果、異なる最小ＣＭＶ由来プロモーター構築物についての秩序立った分析を最初に行う必要があった。この研究結果により、-３０１〜-１（＋１が転写開始部位として規定される）のＣＭＶプロモーターヌクレオチドと、追加的に-１位の後に挿入された３のヌクレオチド（ＴＧＧ）を包含するプロモーターバリアント構築物ｐｃ３が、ウイルスレスキューとウイルス増幅の両者において最適な収率を与えたことが明らかになった。
３０１と３のヌクレオチド（ｎｔ）により表されるサイトメガロウイルス由来のかなり短いバージョンのプロモーターは、組換え麻疹ウイルスベクターゲノムを含む全長プラスミドを短くするさらなる利点を提供するものであり、これによりプラスミド複製の効率が高まる。
さらに、最小ｐｃ３ＣＭＶプロモーター（３０１ｎｔ＋３ｎｔ）におけるイントロン配列の欠如により、ｍＲＮＡが核から輸送される前のスプライシング機構へのｍＲＮＡの提供が妨げられ；それにより低下されたスプライシング効率は、麻疹ウイルスレスキューと増幅の両者を改善する。
さらに、３’に配置されたデルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムを意図的に取り込むことにより、３’末端の全ての転写産物が正確に処理された。

ｐｃ３ＭｅｒＶ２ｌｄ―Ｔｒｋａ（図１を参照）の配列は、ヌクレオチド（ｎｔ）の位置を参照して以下の通りに記載される；ＵＴＲ-非翻訳領域；ＯＲＦ-オープンリーディングフレーム：
ｎｔ１-５５ ： ＭｅＶリーダー配列
ｎｔ５６-６６ ： 導入遺伝子転写のための遺伝子開始部位（ＭｅＶ Ｎ遺伝子から得られた遺伝子開始配列）
ｎｔ６７-１０３ ： ５’-ＵＴＲ（ＭｅＶ Ｎ遺伝子から得られた５’-ＵＴＲ配列）
ｎｔ１０３−１０８ ： 制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ（Ｃ’ＴＣＧＡＧ）の認識部位を提示するクローニング部位
ｎｔ１０９−１１４ ： 制限エンドヌクレアーゼＰａｕＩ（Ｇ’ＣＧＣＧＣ）又はＡｓｃＩ（ＧＧ’ＣＧＣＧＣＣ）の認識部位を提示するクローニング部位；両方の認識部位は、完全なベクター配列において一回のみ存在する固有部位を表す
ｎｔ１１５−１２６ ： ＭｅＶ Ｎ遺伝子由来の３’−ＵＴＲ
ｎｔ１２７−１３６ ： 導入遺伝子のための遺伝子末端（ＭｅＶ Ｎ遺伝子から得られる）
ｎｔ１４０−１５０ ： ＭｅＶ Ｎの遺伝子開始部位
ｎｔ１９２−１７６９ ： Ｎ ＯＲＦ（１５７８ｎｔ＝５２５ａａ＋ストップコドン）
ｎｔ１８９１−３４１４ ： Ｐ ＯＲＦ（１５２４ｎｔ＝５０７ａａ＋ストップコドン）
ｎｔ２０３６−２０４３ ： 制限エンドヌクレアーゼＳｄａＩ（ＣＣＴＧＣＡ’ＧＧ）の認識部位を提示する３’−クローニング部位、固有部位は、完全なベクター配列において一回のみ存在する
ｎｔ１９１３−２４７３ ： Ｃ ＯＲＦ（非−構造遺伝子；５６１ｎｔ＝１８６ａａ＋ストップコドン）
ｎｔ２５７５−２５８２ ： Ａ５Ｇ３編集ボックス；ｎｔ２５８０の後に単一のヌクレオチド（Ｇ）が挿入されている
ｎｔ１８９１−２７８９ ： ｍＲＮＡ編集（非構造遺伝子；９００ｎｔ＝２９９ａａ＋ストップコドン）後のＶトランス−フレームＯＲＦ
ｎｔ３５２２−４５２９ ： Ｍ ＯＲＦ（１００８ｎｔ＝３３５ａａ＋ストップコドン）
ｎｔ５５３３−７１９４ ： Ｆ ＯＲＦ（１６６２ｎｔ＝５５３ａａ＋ストップコドン）
ｎｔ７３５５−９２０８ ： Ｈ ＯＲＦ（１８５４ｎｔ＝６１７ａａ＋ストップコドン）
ｎｔ９３１８−１５８６９ ： Ｌ ＯＲＦ（６５５２ｎｔ＝２１３８ａａ＋ストップコドン）
ｎｔ１５９４２−１５９７８： ＭｅＶトレーラー配列（３７ｎｔ）

実施例２：ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）プラスミドベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（配列番号４）の調製
組換えＭｅＶｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）麻疹ウイルスベクターの生成のために、ＳＣＤ自殺融合遺伝子をコードするプラスミドｐＵＳ−ＳＣＤを、制限エンドヌクレアーゼＭｌｕＩで分解し、そしてＳＣＤ自殺融合遺伝子のオープンリーディングフレームを含む断片を、制限エンドヌクレアーゼＡｓｃＩで直線化された基礎ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ｌｄ−Ｔｒｋａ（最適化（短くかつ改変された）ＣＭＶ ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）プロモーターを包含する親ベクターｐｃ３の誘導体）にライゲーションされた。断片の正確な結合を、制限酵素やシーケンシングにより確かめた。続いてレスキュー工程により感染性のウイルス粒子を、うまく生成した。

ｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（配列番号４）。ｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤの配列（図２を参照）を、ｎｔの位置を参照して以下の通り記載することができる：
ｎｔ１−５５ ： ＭｅＶリーダー配列
ｎｔ５６−６６ ： 導入遺伝子転写のための遺伝子開始部位（ＭｅＶ Ｎ遺伝子から得られた遺伝子開始配列）
ｎｔ６７−１０３ ： ５’-ＵＴＲ（ＭｅＶ Ｎ遺伝子から得られた５’-ＵＴＲ配列）
ｎｔ１０３−１０８ ： 制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ（Ｃ’ＴＣＧＡＧ）の認識部位を提示するクローニング部位
ｎｔ１０９−１１４ ： 制限エンドヌクレアーゼＰａｕＩ（Ｇ’ＣＧＣＧＣ）又はＡｓｃＩ（ＧＧ’ＣＧＣＧＣＣ）の認識部位を提示するクローニング部位；両方の認識部位は、完全なベクター配列において一回のみ存在する固有部位を表す
ｎｔ１２１−１２４２ ： ＳＣＤ ＯＲＦ（１１２２ｎｔ＝３７３ａａ＋ストップコドン）
ｎｔ１２４３−１２４８ ： 制限エンドヌクレアーゼＭｌｕＩ（Ａ’ＣＧＣＧＴ）＋ＰａｕＩ（Ａ’ＣＧＣＧＣ）認識部位を提示するクローニング部位
ｎｔ１２４９−１２６０ ： ３’−ＵＴＲ
ｎｔ１２６２−１２７０ ： 導入遺伝子のための遺伝子末端（ＭｅＶ Ｎ遺伝子から得られる）
ｎｔ１２７４−１２８４ ： ＭｅＶ Ｎの遺伝子開始部位
ｎｔ１３２６−２９０３ ： Ｎ ＯＲＦ（１５７８ｎｔ＝５２５ａａ＋ストップコドン）
ｎｔ３０２５−４５４８ ： Ｐ ＯＲＦ（１５２４ｎｔ＝５０７ａａ＋ストップコドン）
ｎｔ３０４７−３６０７ ： Ｃ ＯＲＦ（非構造遺伝子；５６１ｎｔ＝１８６ａａ＋ストップコドン）
ｎｔ３７０９−３７１６ ： Ａ５Ｇ３編集ボックス；ｎｔ２５８０の後に単一のヌクレオチド（Ｇ）が挿入されている
ｎｔ３０２５−３９２３ ： ｍＲＮＡ編集（非構造遺伝子；９００ｎｔ＝２９９ａａ＋ストップコドン）後のＶトランス−フレームＯＲＦ
ｎｔ４６５６−５６６３ ： Ｍ ＯＲＦ（１００８ｎｔ＝３３５ａａ＋ストップコドン）
ｎｔ６６６７−８３２８ ： Ｆ ＯＲＦ（１６６２ｎｔ＝５５３ａａ＋ストップコドン）
ｎｔ８４８９−１０３４２ ： Ｈ ＯＲＦ（１８５４ｎｔ＝６１７ａａ＋ストップコドン）
ｎｔ１０４５２−１７００３： Ｌ ＯＲＦ（６５５２ｎｔ＝２１８３ａａ＋ストップコドン）
ｎｔ１７０７６−１７１１２： ＭｅＶトレーラー配列（３７ｎｔ）

実施例３：ヘルパープラスミド（配列番号５〜７）の調製
Ｎ、Ｐ又はＬの遺伝子をそれぞれ有するヘルパープラスミドの調製を、近年記載された通りに本質的に行った（Martin A, Staeheli P, Schneider U. J Virol. 2006; 80:5708-15）が、以下の重要な変更を伴った。
異なる最小ＣＭＶ由来のプロモーター構築物の秩序立った分析の結果として、ウイルスレスキューとウイルス増幅の両者において最適な収率を与えると見いだされているプロモーターバリアント構築物ｐｃ３は、ヘルパープラスミド生成のために使用された。
最小ｐｃ３ＣＭＶプロモーター（３０１ｎｔ＋３ｎｔ）におけるイントロン配列の欠如により、ｍＲＮＡが核から輸送される前のスプライシング機構へのｍＲＮＡの提供が妨げられ；それにより低下されたスプライシング効率は、麻疹ウイルスレスキューと増幅の両者を改善する。
さらに、３’に配置されたデルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムの意図的な取り込みを使用して、３’末端の全ての転写産物を正確に処理した。
最後に、このプロモーターバリアントｐｃ３は、麻疹ウイルスのＮ、Ｐ、及びＬ遺伝子の効果的なＰｏｌＩＩ依存的転写を可能にするためにのみ見いだしたものではなく、麻疹ウイルスのＮ、Ｐ及びＬ遺伝子の転写産物は、曖昧なスプライシング部位を大量にスプライシングすることなく核から効率的に輸送される。

実施例４：ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）ベクターから麻疹ウイルス粒子のレスキュー
０日目に、ベロ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１）を、４×１０⁵細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種した。１日目に、以下のトランスフェクション条件を用いて、ベロ細胞をトランスフェクトした。
２００μｌのＤＭＥＭ培地をピペットで１．５ｍｌチューブに入れた。次に、以下の量のプラスミドＤＮＡを加えた：

混合後、混合物をスピンダウンし、そして１８．６μｌのＦｕＧｅｎｅＨＤ（Roche）（つまり３μｌFuGene/1μｇDNA）を直接液体に加えた。ボルテックス後に、混合物をスピンダウンした。反応混合液を２５分間室温でインキュベートした。

細胞をＰＢＳで２回洗浄した。１．８ｍｌのＤＭＥＭ＋２％ＦＣＳ＋ＰＳを加えた後に、トランスフェクション混合物を滴下して細胞に加え、そしてプレートを旋回させた。

細胞培養物を３７℃及び５％ＣＯ₂でインキュベートした。

２日目及び３日目に、培地を交換した（１ｍｌＤＭＥＭ＋２％ＦＣＳ＋ＰＳ）。

合胞体が出芽した際に（約４日目）、ベロ細胞を１０ｃｍのディッシュ中に播種した（１のコンフルエントＴ７５、１０ｍｌ、１ディッシュあたり０．５ｍｌで蒔いた）。

次の日、培地中でレスキュー細胞をスクレイピングし、ピペットして取得し、ベロ細胞に滴下することにより、重層を行った。

合胞体が出現した場合に（重層後約１日）、３×１０⁵ベロ細胞を、６ウェルプレート中に撒き、継代０のウイルスとした（Ｐ０）。

次の日、合胞体を拾いあげた（構築物あたり２〜３）。培地を１０ｃｍディッシュから除き、そして５〜１０μｌ培地を直接ピペットで合胞体に加えた。ピペットで出し入れし、そしてスクレイピングすることにより、合胞体を除去し、そして６ウェルプレートの新たなベロ細胞にピペットで加えた。

合胞体が現れた際に、細胞を掻き取って培地に入れ、そして−８０℃で貯蔵した（＝Ｐ．０）。

以下の：
（ａ） 麻疹ワクチンＳｃｈｗａｒｚ株のゲノム、及び酵母シトシンデアミナーゼと酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体を含む自殺遺伝子、
（ｂ） 麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Ｎ
（ｃ） 麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Ｐ
（ｄ） 麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Ｌ
をコードし、その各々が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下に存在するプラスミドを使用した本発明者らの結果として、最大で１６．０００感染スポット（合胞体）を、第１継代（Ｐ．１）で達成することができた。この結果は、Ｐ．１において最大で８８００感染スポット（合胞体）しか生じさせないバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼの制御下の導入遺伝子及び同ゲノムを発現する結果と比較して、ずっと高かった。こうして、ＣＭＶ由来ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターシステムの使用により、感染性組換え麻疹ウイルス粒子の高度に効率的に生産されることが示された。

実施例５：ＨｕＣＣＴ１、ＲＢＥ、及びＴＦＫ−１細胞のＳＲＢ増殖アッセイ
図８は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）からレスキューされたＭｅＶｌｄ−ＳＣＤウイルス粒子で処理され、そしてプロドラッグ５−ＦＣとインキュベートされたＨｕＣＣＴ１、ＲＢＥ、及びＴＦＫ−１細胞のＳＲＢ増幅アッセイの結果を示す。

一般的に、ＳＲＢ増幅アッセイでは、細胞を０日目に播種し、そして２４時間後に、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０ＭＯＩのウイルス粒子で感染させ（個々の実験及び/又は添付の図面を参照）、そしてプロドラッグ処理の場合、５−ＦＣを感染の３時間後に加えた。ＳＲＢアッセイを感染の９６時間後に行った。

ＲＢＥ又はＴＦＫ−１細胞を、感染多重度１（ＭＯＩ１）でＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤで感染させ、そして次にプロドラッグ５−ＦＣを添加せずに培養した場合、９６時間後における細胞質量の低下は、非感染対照細胞（細胞質量１００％とする）に比較して、５８％（ＲＢＥ）又は８６％（ＴＦＫ−１）の範囲であるとそれぞれ計算される（グラフの左側に配置した長方形により囲まれた値）。

ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ（ＭＯＩ１）で感染させ、そして次にプロドラッグ５−ＦＣを添加せずに培養されたＨＵＣＣＴ１細胞は、９６時間後に、非感染対照細胞（細胞質量を１００％とする）に比較して、４２％の範囲の細胞質量の低下を示した。それにより、ＨｕＣＣＴ１細胞は、従来技術の麻疹ウイルス（追加の自殺遺伝子機能を使用していない）に対して一次抵抗性を示した。しかしながら、ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ（ＭＯＩ １）感染ＨｕＣＣＴ１細胞が、（１０^-4〜１０⁰ｍＭの範囲の）プロドラッグ５−ＦＣを添加して培養された場合、９６時間後における細胞質量の低下が、非感染対照細胞（細胞質量を１００％とする）に比較して、最大で９９％の範囲で示された。こうして、（追加の自殺遺伝子機能を使用していない）従来技術の麻疹ウイルスに対するＨｕＣＣＴ１細胞の一次抵抗性が、非毒性プロドラッグ（５−ＦＣ）から細胞傷害性薬剤（５−ＦＵ及び誘導体）への生成を触媒するＳＣＤ自殺遺伝子機能の使用により克服されうるということが示された。

実施例６：ＨｕＣＣＴ１、ＲＢＥ、及びＴＦＫ−１細胞のＬＤＨ放出アッセイ
図９は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）からレスキューされたＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤウイルス粒子で処理され、そしてプロドラッグ５−ＦＣとインキュベートされたＨｕＣＣＴ１、ＲＢＥ、及びＴＦＫ−１細胞（ヒト胆管癌細胞）のＬＤＨ放出アッセイの結果を示す。

ＲＢＥ又はＴＦＫ−１細胞を、ＭＯＩ １にてＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤで感染させ、そして次にプロドラッグ５−ＦＣの添加を伴わずに培養された場合に、（ＬＤＨ放出アッセイにより計測されば場合に）９６時間後ＬＤＨ酵素の放出（ここで、細胞完全性が失われることについての代替的パラメーターとして使用される）が、界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００での処理により完全に溶解された非感染対照細胞に比較して（ＬＤＨ放出を１００％とする）、７０％（ＲＢＥ）又は８５％（ＴＦＫ−１）の範囲であると計算された。

対照的に、ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ（ＭＯＩ １）を感染させ、そしてプロドラッグ５−ＦＣを添加せずに培養されたＨｕＣＣＴ１細胞は、９６時間後に、非感染対照細胞に比較して、３１％の範囲のＬＤＨ酵素の放出を示した。これにより、ＨｕＣＣＴ１細胞が、（追加の自殺遺伝子機能を使用していない）従来技術の麻疹ウイルスに対して一次抵抗性を示すことが再び示された。しかしながら、ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ（ＭＯＩ １）感染ＨｕＣＣＴ１細胞を、プロドラッグ５−ＦＣ（１０^-4〜１０⁰ｍＭの範囲）を添加して培養した場合に、非感染対照細胞（細胞質量を１００％とする）に比較して、９６時間後のＬＤＨ酵素の放出における有意に高い増加が、最大で８２％の範囲で示された。

こうして、ＨｕＣＣＴ１細胞における、（追加の自殺遺伝子機能の使用していない）従来技術の麻疹ウイルスの一次抵抗性が、ＳＣＤ自殺遺伝子機能を使用することにより克服されうることが再び示された。

実施例７：ＳＡＳ及びＨＴＢ−４３ＦａＤｕ細胞におけるＳＲＢ増殖アッセイ
図１０は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）からレスキューされたＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤウイルス粒子で処理され、そしてプロドラッグ５−ＦＣとインキュベートされたＳＡＳ及びＨＴＢ−４３ＦａＤｕ細胞（ヒト頭頸部（Ｈ＆Ｎ）癌細胞）の結果を示す。

ＨＴＢ−４３ＦａＤｕ細胞をＭＯＩ１にてＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤで感染させ、そして次にプロドラッグ５−ＦＣを添加せずに培養した場合に、９６時間後の細胞質量の低下は、非感染対照細胞に比較して６６％の範囲であると計算された（数値は、グラフの左側に配置された長方形により囲まれている）。

対照的に、ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ（ＭＯＩ １）で感染され、そして次にプロドラッグ５−ＦＣを添加せずに培養したＳＡＳ細胞は、９６時間後において、非感染対照に比較してまったく細胞質量は低下を示さなかった（０％）。これによりＳＡＳ細胞は、従来技術の麻疹ウイルスに対して一次抵抗性を示す（追加の自殺遺伝子機能の不使用）。しかしながら、ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ（ＭＯＩ１）感染ＳＡＳ細胞を、プロドラッグ５−ＦＣ（１０^-4〜１０⁰ｍＭの範囲）を添加して培養した場合に、それぞれ非感染対照細胞に比較して、９６時間後において最大で８３％の範囲の細胞質量の低下が示された。

こうして、従来技術の麻疹ウイルスに対するＳＡＳ細胞の一次抵抗性が、ＳＣＤ自殺遺伝子機能の使用により克服できることが示された。

実施例８：ＳＡＳ及びＨＴＢ−４３ＦａＤｕ細胞のＬＤＨ放出アッセイ
図１１は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）からレスキューされたＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤウイルス粒子で処理し、そしてプロドラッグ５−ＦＣとインキュベートされたＳＡＳ及びＨＴＢ−４３ＦａＤｕ細胞におけるＬＤＨ放出アッセイの結果を示す。

ＨＴＢ−４３ＦａＤｕ細胞をＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤで、ＭＯＩ１にて感染させ、そして次にプロドラッグ５−ＦＣを添加せずに培養した場合、９６時間後の酵素ＬＤＨの放出は、界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００での処理により完全に溶解された非感染対照細胞に比較して、１６％の範囲であると計算された（グラフの左側に配置された長方形により囲まれた数値）。

ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ（ＭＯＩ１）で感染させ、そして次にプロドラッグ５−ＦＣを添加せずに培養されたＳＡＳ細胞は、それぞれ非感染対照細胞に比較して、９６時間後において、１８％の範囲の酵素ＬＤＨの放出しか示さなかった。しかしながら、ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ（ＭＯＩ １）感染ＳＡＳ細胞をプロドラッグ５−ＦＣ（１０Ｅ−４〜１０Ｅ０）を添加して培養した場合、９６時間後において、非感染対照細胞（細胞質量を１００％とする）に比較して、最大３８％の範囲で、酵素ＬＤＨの放出を強力に増加することが、示された。

こうして、従来技術の麻疹ウイルスに対するＳＡＳ細胞の一次抵抗性が、ＳＣＤ自殺遺伝子機能の使用により克服されうることが再び示された。

実施例９：Ａ６７３、ＢＲＺ及びＳＲＨ細胞のＳＲＢ増殖アッセイ
図１２は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）からレスキューされたＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤウイルス粒子で処理され、そしてプロドラッグ５−ＦＣとインキュベートされたＡ６７３、ＢＲＺ、及びＳＲＨ細胞（ヒト肉腫細胞）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。

Ａ６７３又はＢＲＺ細胞を、ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤで、ＭＯＩ１にて感染させ、そして次にプロドラッグ５−ＦＣを添加せずに培養した場合、９６時間後における細胞質量の低下は、それぞれ非感染対照細胞に比較して、それぞれ９６％又は７５％の範囲であると計算された（グラフの左手側に配置された長方形により囲まれている数値）。

対照的に、ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ（ＭＯＩ１）で感染され、そして次にプロドラッグ５−ＦＣを添加せずに培養されたＳＲＨ細胞は、９６時間後に、非感染対照細胞に比較して１０％範囲の細胞質量の低下しか示さなかった。これにより、ＳＲＨ細胞は、従来技術の麻疹ウイルスに対して一次抵抗性を示す（追加の自殺遺伝子機能を使用なし）。しかしながら、ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ感染ＳＲＨ細胞（ＭＯＩ１）をプロドラッグ５−ＦＣ（１０⁴〜１０⁰ｍＭの範囲）を添加して培養した場合に、非感染対照細胞に比較して９６時間後で最大で５５％の範囲の細胞質量の低下が示された。

こうして、従来技術の麻疹ウイルス（追加の自殺遺伝子の使用なし）に対するＳＡＳ細胞の一次抵抗性は、有意に改善されたが、選択された条件（ＭＯＩ１）の元では、ＳＣＤ自殺遺伝子機能を克服できなかったことが示された。

実施例１０：Ａ６７３及びＳＲＨ細胞のＬＤＨ放出アッセイ
図１３は、ｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）からレスキューされたＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤウイルス粒子で処理され、そしてプロドラッグ５−ＦＣとインキュベートされたＡ６７３及びＳＲＨ細胞のＬＤＨ放出アッセイの結果を示す。

Ａ６７３細胞を、ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤで、ＭＯＩ１にて感染させ、そして次にプロドラッグ５−ＦＣを添加せずに培養した場合に、９６時間後における酵素ＬＤＨの放出は、界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００での処理により完全に溶解された非感染対照細胞に比較して、５４％の範囲であると計算された。

ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ（ＭＯＩ１）で感染され、そして次にプロドラッグ５−ＦＣを添加せずに培養されたＳＲＨ細胞は、非感染対照細胞に比較して、９６時間後において２３％の範囲の酵素ＬＤＨの放出を示した。注目すべきは、ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ（ＭＯＩ１）感染ＳＲＨ細胞を、プロドラッグ５−ＦＣ（１０^-4〜１０⁰ｍＭの範囲）を添加して培養した場合に、感染対照細胞（細胞質量を１００％とする）に比較して、９６時間後において３１％の酵素ＬＤＨの放出の増加が示された。

こうして、従来技術の麻疹ウイルス（追加の自殺遺伝子機能の使用なし）に対するＳＲＨ細胞一次抵抗性が、選択された条件（ＭＯＩ１）下では、ＳＣＤ自殺遺伝子機能の使用により十分に克服されないことが示された

実施例１１：ＳＲＨ細胞におけるＳＲＢ増殖アッセイ
図１４は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）からレスキューされたＭｅＶ２ ｌｄ−ＳＣＤで、強化したＭＯＩ１０（通常はＭＯＩ１を使用する；ここでウイルスロードの増加は、プロドラッグ５−ＦＣの存在下にてＭＯＩ１にて観察された抵抗性の現象を克服するために使用された）にて処理したＳＲＨ細胞のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。

ＭＯＩ１０にてＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤで感染させ、そして次にプロドラッグ５−ＦＣを添加せずに培養したＳＲＨ細胞は、９６時間後に非感染対照細胞に比較して、６８％の範囲の細胞質量の低下を示し、非感染対照細胞に比較して２８％の細胞質量の低下しか示さないＭＯＩ１にて得られた結果と比較して有意に改善された。さらに、ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ（ＭＯＩ１０）感染ＳＲＨ細胞を、プロドラッグ５−ＦＣ（１０^-4〜１０⁰ｍＭの範囲）を添加して培養した場合、９６時間後の細胞質量の低下が、非感染対照細胞に比較して最大で８９％の範囲で示された。

こうして、従来技術の麻疹ウイルスに対するＳＲＨ細胞の一次抵抗性が、選択された条件下（ＭＯＩ１０）で、ＳＣＤ自殺遺伝子機能の追加的使用により、克服されうることが示された。

実施例１２：肉腫腫瘍細胞（細胞株ＣＣＳ,ＬＭ）のＳＲＢ増殖アッセイ
図１５は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）からレスキューされたウイルス粒子で処理され、そしてプロドラッグ５−ＦＣとインキュベートされた肉腫腫瘍細胞（細胞株ＣＣＳ,ＬＭ）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。

ベクターＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤで、ＭＯＩ１にて感染させ、そして次にプロドラッグ５−ＦＣを添加せずに培養したＣＣＳ又はＬＭ細胞は、９６時間後に、非感染対照細胞に比較してそれぞれ５％又は２５％の範囲の細胞質量の低下を示した（グラフの左手側に配置された長方形により囲まれた数値）。こうして、ＣＣＳ及びＬＭ細胞の両者は、従来技術の麻疹ウイルス（追加の自殺遺伝子機能の使用無し）に対する一次抵抗性を示す。しかしながら、ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ感染ＣＣＳ又はＬＭ細胞（ＭＯＩ２）を、プロドラッグ５−ＦＣ（１０^-4〜１０⁰ｍＭの範囲）を添加して培養した場合に、非感染対照細胞に比較して９６時間後の細胞質量の低下が、それぞれ７９％又は９４％の範囲で示された。

こうして、従来技術の麻疹ウイルス（追加の自殺遺伝子機能の使用なし）に対するＣＣＳおよびＬＭ細胞の一次抵抗性が、選択された条件下（ＭＯＩ１０）で、大幅に改善でき、そしてＬＭ細胞の場合、選択された条件下においてＳＳＣＤ自殺遺伝子機能の使用により、ほぼ完全に克服されうることが示された。

実施例１３：肉腫腫瘍細胞（細胞株ＳＴＯ、ＺＡＦ、ＫＤ）のＳＲＢ増殖アッセイ
図１６は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）からレスキューされたＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤウイルス粒子で処理され、そしてプロドラッグ５−ＦＣとインキュベートされた肉腫腫瘍細胞（細胞株ＳＴＯ、ＺＡＦ、ＫＤ）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。

ＳＴＯ、ＺＡＦ、又はＫＤ細胞を、ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤで、ＭＯＩ１にて感染させ、次にプロドラッグ５−ＦＣを添加せずに培養した場合に、非感染対照細胞に比較して、９６時間後の細胞質量において、それぞれ７６％、８７％、又は９４％の範囲の低下が計算された（グラフの左手側に配置された長方形により囲まれた数値）。

こうして、ＳＴＯ、ＺＡＦ、又はＫＤ細胞は、従来技術の麻疹ウイルス（追加の自殺遺伝子機能の使用なし）に対する一次抵抗性を示さなかった。ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤで感染されたＳＴＯ、ＺＡＦ、又はＫＤ細胞（ＭＯＩ１）を、プロドラッグ５−ＦＣ（１０^-4〜１０⁰ｍＭの範囲）で添加して培養した場合、９６時間後における細胞質量の低下が、非感染対照細胞に比較して、それぞれ９４％、９９％、又は９８％の範囲で示された。

実施例１４：肉腫腫瘍細胞（細胞株ＣＣＳ、ＬＭ）のＳＲＢ増殖アッセイ
図１７は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）からレスキューされたＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤウイルス粒子で処理され、そしてプロドラッグ５−ＦＣとインキュベートされたグリア芽腫細胞（細胞株ＬＮＴ２２９、ＬＮＴ２２９ ＣＴＳ−１）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。

ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤで、ＭＯＩ １にて感染させ、そして次にプロドラッグ５−ＦＣの添加をせずに培養されたＬＮＴ２２９又はＬＮＴ２２９ ＣＴＳ−１細胞は、９６時間後の細胞質量において、それぞれ５６％又は２７％の低下を示した（グラフの左手側に配置された長方形により囲まれた数値）。こうして、ＬＮＴ２２９又はＬＮＴ２２９ ＣＴＳ−１細胞の両者が、従来技術の麻疹ウイルス（追加の自殺遺伝子機能の使用なし）に対して一次抵抗性を示した。しかしながら、ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ感染されたＬＮＴ２２９又はＬＮＴ２２９ ＣＴＳ−１細胞（ＭＯＩ１）を、プロドラッグ５−ＦＣ（１０^-4〜１０⁰ｍＭの範囲）を添加して培養した場合に、９６時間後の細胞質量の低下が、非感染対照細胞に比較してそれぞれ最大で９７％又は９６％の範囲で示された。

こうして、ＬＮＴ２２９又はＬＮＴ２２９ ＣＴＳ−１細胞の従来技術の麻疹ウイルス（追加の自殺遺伝子機能の使用なし）に対する一次抵抗性は、ＳＣＤ自殺遺伝子機能の使用により、選択された条件下（ＭＯＩ １）でほぼ完全に克服されたことが示された。

実施例１５：グリア芽種細胞（細胞株ＬＮ１８、ＬＮ１８アポトーシス抵抗性）のＳＲＢ増殖アッセイ
図１８は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）からレスキューされたＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤウイルス粒子で処理され、そしてプロドラッグ５−ＦＣとインキュベートされたグリア芽腫細胞（細胞株ＬＮ１８、ＬＮ１８アポトーシス抵抗性）のＳＲＢ増幅アッセイの結果を示す。

ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤで、ＭＯＩ１にて感染させ、そして次にプロドラッグ５−ＦＣを添加せずに培養されたＬＮ１８又はＬＮ１８アポトーシス抵抗性細胞は、非感染対照細胞に比較して、９６時間後の細胞質量において、それぞれ３３％又は２２％の低下を示した（グラフの左手側に配置された長方形により囲まれた数値）。こうして、ＬＮ１８又はＬＮ１８アポトーシス抵抗性細胞の両者が、従来技術の麻疹ウイルス（追加の自殺遺伝子機能の使用なし）に対して一次抵抗性を示した。しかしながら、ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ感染されたＬＮＴ１８又はＬＮ１８アポトーシス抵抗性細胞（ＭＯＩ１）を、プロドラッグ５−ＦＣ（１０^-4〜１０⁰ｍＭの範囲）を添加して培養した場合に、９６時間後の細胞質量の低下が、非感染対照細胞に比較してそれぞれ最大で９７％又は８３％の範囲で示された。

こうして、ＬＮ１８又はＬＮ１８アポトーシス抵抗性細胞の従来技術の麻疹ウイルス（追加の自殺遺伝子機能の使用なし）に対する一次抵抗性は、かなり改善され、そしてＬＮ１８細胞の場合、選択された条件下（ＭＯＩ １）でＳＣＤ自殺遺伝子機能の使用により、ほぼ完全に克服されたことが示された。

実施例１６：腎臓細胞癌（ＡＣＨＮ）、肺腺ガン（ＨＯＰ−６２）、及びメラノーマ（Ｍ１４）腫瘍細胞のＳＲＢ増殖アッセイ
図１９は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）からレスキューされたＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤウイルス粒子で処理され、そしてプロドラッグ５−ＦＣとインキュベートされた腎細胞癌（ＡＣＨＮ）、肺腺ガン（ＨＯＰ−６２）、及びメラノーマ（Ｍ１４）腫瘍細胞のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。

ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤで、ＭＯＩ１にて感染させ、そして次にプロドラッグ５−ＦＣを添加せずに培養したＡＣＨＮ、ＨＯＰ−６２、又はＭ１４細胞は、非感染対照細胞に比較して、９６時間後の細胞質量において、それぞれ２０％、１６％、又は１６％の範囲の低下を示した。こうして、ＡＣＨＮ、ＨＯＰ−６２、及びＭ１４細胞は、従来技術の麻疹ウイルス（追加の自殺遺伝子機能の使用なし）に対して一次抵抗性を示した。しかしながら、ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ感染されたＡＣＨＮ、ＨＯＰ−６２、又はＭ１４細胞（ＭＯＩ１）を、１ｍＭのプロドラッグ５−ＦＣを添加して培養した場合に、９６時間後の細胞質量の低下が、非感染対照細胞に比較してそれぞれ最大で８５％、８６％又は７６％の範囲で示された。

こうして、ＡＣＨＮ、ＨＯＰ−６２、及びＭ１４細胞の従来技術の麻疹ウイルス（追加の自殺遺伝子機能の使用なし）に対する一次抵抗性は、ＳＣＤ自殺遺伝子機能の使用により、選択された条件（ＭＯＩ１）でかなり改善されたことが示された。

実施例１７：結腸腺ガン腫瘍細胞（細胞株ＫＭ−１２，ＨＣＴ−１５）のＳＲＢ増殖アッセイ
図２０は、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ（ｌｄ−ＳＣＤ）からレスキューされたＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤウイルス粒子で処理され、そしてプロドラッグ５−ＦＣとインキュベートされた結腸腺ガン腫瘍細胞（細胞株Ｋ−１２、ＨＣＴ−１５）のＳＲＢ増殖アッセイの結果を示す。

ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤベクターで、ＭＯＩ１にて感染させ、そして次にプロドラッグ５−ＦＣを添加せずに培養したＫＭ−１２又はＨＣＴ−１５細胞は、非感染対照細胞に比較して、９６時間後の細胞質量において、それぞれ１３％又は２％の範囲の低下を示した。こうして、ＫＭ−１２及びＨＣＴ−１５細胞の両者は、従来技術の麻疹ウイルス（追加の自殺遺伝子機能の使用なし）に対して一次抵抗性を示した。しかしながら、ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ感染されたＫＭ−１２又はＨＣＴ−１５細胞（ＭＯＩ１）を、１ｍＭのプロドラッグ５−ＦＣを添加して培養した場合に、９６時間後の細胞質量の低下が、非感染対照細胞に比較してそれぞれ最大で８５％、８６％又は７６％の範囲で示された。

こうして、ＫＭ−１２又はＨＣＴ−１５細胞の従来技術の麻疹ウイルス（追加の自殺遺伝子機能の使用なし）に対する一次抵抗性は、ＳＣＤ自殺遺伝子機能の使用により、選択された条件（ＭＯＩ１）でほとんど完全に克服されたことが示されたことが示された。

実施例１８：代替ウイルスベクターの構築
（ｉ） 麻疹ウイルスゲノム内の配置、及び（ｉｉ）ＳＣＤ遺伝子発現のコンテクスト（ここで、融合遺伝子のコンテクスト；すなわち、融合タンパク質を拡散するタンパク質の機能を媒介する１型単純ヘルペス・ウイルス（ＨＳＶ−１）テグメントタンパク質ＶＰ２２を伴っている）に関する自殺遺伝子アレイにおいて異なっている３つのベクターを構築した（図２７を参照）。

導入遺伝子が麻疹ウイルスゲノムに挿入されたゲノムの位置が、ウイルス複製や導入遺伝子発現に影響するので、スーパーシトシンデアミナーゼ（ＳＣＤ）導入遺伝子の位置を２つのバージョンで比較した。ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤにおけるＳＣＤについてのゲノム第一位置、ベクターｐＭｅｒＶ２ Ｐ−ＳＣＤにおけるＳＣＤについてのゲノム第三位置。

さらに、第三ベクター、ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤ、を構築し、そしてほかの２つのベクターと比較した。ゲノム第一位置において、このベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤは、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）テグメントタンパク質ＶＰ２２遺伝子とＳＣＤ導入遺伝子との融合体を発現する。テグメントタンパク質ＶＰ２２遺伝子は、融合タンパク質（ここで：ＶＰ２２ＳＣＤ）を発現細胞から、ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤからレスキューされたＭｅＶ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤウイルス粒子でこれまで感染されていない隣接細胞へと拡散させるタンパク質の機能を媒介し、こうして、第一ベクターの不十分な形質導入効率を補うための有望なツールにする。

ｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤの構築の詳細：第三強化麻疹ワクチンウイルス（a third armed measles vaccine virus）（ＭｅＶ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤ）を新たに生成するために、プラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−Ｔｒｋａを開始基礎プラスミドとして用いた。このプラスミドは、ワクチン株Ｓｃｈｗａｒｚと１００％同一性を有するウイルスｃＤＮＡをコードし、そしてリーダー配列とＮ−遺伝子とのあいだに、空の追加転写ユニット（ＡＴＵ又はＴｒｋａ、転写カセット）を含む。この追加の転写ユニットは、ウイルスゲノムからの導入遺伝子の発現に必要とされる制御配列の全てを含む。遺伝子開始配列及び遺伝子集結配列、並びに非翻訳領域は、Ｎ遺伝子由来の配列と同一である。導入遺伝子は、制限酵素部位ＸｈｏＩ又はＰａｕＩを介して挿入するすることができる。

ＶＰ２２ＳＣＤのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、プラスミドｐＵＣ２９−ＶＰ２２ＳＣＤ由来であった。このＯＲＦは、２つのＳａｌＩ制限酵素部位を含み、そしてＭｅＶ全長コンストラクトにおいてさらなるクローニング工程が、ＳａｌＩを介して行われる可能性が最も高いので、これらの制限酵素部位は、最初に部位特異的突然変異誘導により取り除かれるべきであった。ＯＲＦが、ＰａｕＩにより生成される末端と同一の末端を生成するＭｌｕＩ部位にすでに繋がっていたので、そしてこのプラスミドから生じるＭｌｕＩ−ＭｌｕＩ断片が、すでに、ルール６にしたがってＭｅＶゲノムを生成するための正確な数のヌクレオチドを含んでいたので、さらに変更することなく、ＳａｌＩ部位を除去した後でこの断片をＭｅＶｃＤＮＡに挿入することができた。こうして、クローニング戦略は、以下の３工程から構成された：
・部位特異的突然変異誘導によるＳａｌＩ部位の除去；
・ＶＰ２２ＳＣＤをｐｃ３ＭｅｒＶ２ｌｄ−Ｔｒｋａの挿入；
・ウイルスのレスキュー

ＳａｌＩ部位の除去：２回の単一部位突然変異誘発を行った。１回目において、制限酵素分析により示される通り８０２位のＳａｌＩ部位の除去に成功した。生成したプラスミドを、次にＤｐｎＩにより切断し、そしてＸＬ−１ブルースーパーコンピテント細菌中で増幅し、そして第二回の突然変異誘導用のテンプレートとして用いた。ここで制限酵素分析により再び示される通り、１１２７位の部位を取り除いた。両方の部位の除去、並びにＯＲＦの正確な配列をシーケンスにより確認した。得られたプラスミドをｐＵＣ２９−ＶＰ２２ＳＣＤ＿ｗ/ｏ ＳａｌＩと名付けた。

ＶＰ２２ＳＣＤのｐｃ３ＭｅｒＶ２ｌｄ−Ｔｒｋａへの挿入：レシピエントプラスミドｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−Ｔｒｋａを、ＰａｕｌＩで切断した。約２０ｋｂプラスミドの機械的切断を避けるために、直線化プラスミドをゲル精製しなかった。制限酵素を、熱で不活性化し、そしてＤＮＡ断片を脱リン酸化し、そして直接ライゲーションに供した。ｐＵＣ２９−ＶＰ２２ＳＣＤ＿ｗ/ＯＳａｌＩをＭｌｕＩで切断し、ゲル精製を行い、そしてライゲーションに供した。導入遺伝子の挿入の成功を、ＨｉｎｄＩＩＩ−切断により、さらにシーケンスにより示した。得られたプラスミドをｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤと名付けた。

実施例１９：代替のウイルスベクターの比較
実施例１８に記載されるように合成された３の異なるウイルスベクターを、もっとも有効な１つを同定することを目的として比較した（図２１〜２３を参照）。

図２１は、ウイルス粒子ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ、ＭｅＶ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤ、及びＭｅｖ Ｐ−ＳＣＤの、Ｈｅｐ３Ｂヒト肝細胞癌細胞に対する効果を示す。

Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、０．００１又は０．０１のＭＯＩで、ｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ、ｐＭｅｒＶ２ Ｐ−ＳＣＤ、及びｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤからレスキューされたウイルス粒子で感染させ、そして腫瘍細胞質量を、試験時間のあいだ１ｍＭの５−ＦＣの存在下又は非存在下で測定した。

図に示すとおり、ｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤからレスキューされたウイルス粒子は、ＭＯＩ０．０１の場合において、５−ＦＣが存在しない場合でさえ、劇的に高い腫瘍溶解力を示し、そしてＭＯＩ０．００１の場合でさえ、５−ＦＣの存在下で、６日後に腫瘍細胞のほぼ完全な低下をもたらした。

図２２は、ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ、ｐＭｅｒＶ２ ｐ−ＳＣＤ、及びｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤからレスキューされたウイルス粒子の、ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞癌細胞に対する効果を示す。

ＨｅｐＧ２細胞をＭＯＩ０．００１又は０．０１にて、ｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ、ｐＭｅｒＶ２ Ｐ−ＳＣＤ及びｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤからレスキューされたウイルス粒子で感染させ、そして腫瘍細胞質量を、試験時間のあいだ１ｍＭの５−ＦＣの存在下で、又は非存在下で測定した。

図に示すとおり、ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤウイルス粒子は、ＭＯＩ０．０１の場合において、５−ＦＣが存在しない場合でさえ、実質的に高い腫瘍崩壊力を示し、そしてＭＯＩ０．００１の場合でさえ、５−ＦＣの存在下で、６日後に腫瘍細胞の実質的にかなりの低下をもたらした。

図２３は、ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ、ｐＭｅｒＶ２ ｐ−ＳＣＤ、及びｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤからレスキューされたウイルス粒子の、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５ヒト肝細胞癌細胞に対する効果を示す。

ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞をＭＯＩ０．００１又は０．０１にて、ｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ、ｐＭｅｒＶ２ Ｐ−ＳＣＤ及びｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤからレスキューされたウイルスで感染させ、そして腫瘍細胞質量を、試験時間のあいだ１ｍＭの５−ＦＣの存在下で、又は非存在下で測定した。

図に示すとおり、ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤからレスキューされたウイルス粒子は、ＭＯＩ０．０１の場合において、５−ＦＣが存在しない場合でさえ、実質的に高い腫瘍崩壊力を示し、そしてＭＯＩ０．００１の場合でさえ、５−ＦＣの存在下で、６日後に腫瘍細胞の実質的にかなりの低下をもたらした。

こうして、驚くべきことに、麻疹ウイルスゲノム内のＳＣＤ自殺遺伝子の配置、並びにＳＣＤ遺伝子のコンテクストは、ウイルス粒子の腫瘍崩壊活性について強力な影響を有しており、さらにベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤから得られた粒子は、ｐＭｅｒＶ２ Ｐ−ＳＣＤ及びｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤからレスキューされた粒子よりも優れていた。

実施例２０：異種移植動物腫瘍モデルにおける強化ベクター（armed vector） in vivo特徴決定
強化ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤ、ｐＭｅｒＶ２ Ｐ−ＳＣＤ、及びｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤをin vivoで試験するために、ヒトＨＣＣを移植したマウス異種移植片モデルを用いた。麻疹ウイルスはマウス細胞に感染しないので、ベクターを試験するために、表面糖タンパク質を特別に改変することをせずに、同系腫瘍を患うマウスモデルを用いることはできなかった。

強化ベクターを比較するために、皮下で成長したＨｅｐ３Ｂ腫瘍のマウスモデルを選択した。この決定は、以下の（ｉ）Ｈｅｐ３Ｂが、ＭｅＶにより効率的に感染され、そして高いレベルのＭｅＶ複製を支持し、（ｉｉ）Ｈｅｐ３Ｂにおいて、５−ＦＣの５−ＦＵへの変換が迅速かつ効率的であり、そして（ｉｉｉ）プロドラッグの感染細胞への投与後１〜４日間のインキュベーションにわたり、ウイルスのみでの治療と、コンビネーション治療とのあいだのギャップの増大が観察されたという事実に基づいた。さらに、Ｈｅｐ３Ｂのマウスモデルは、すでに記載されており（Blechacz B, Splinter PL, Greiner S, Myers R, Peng KW, Federspiel MJ, Russell SJ, LaRusso NF. Hepatology. 2006 Dec; 44 （6）: 1465-77）、高い生着率を示した（８０％、私信、Boris Blechacz Mayo Clinic, Rochester, MN, USA）。対照的に、この率は、PLC/PRF/5でずっと低く（６０％）、そしてHepG2においても低かった。両方とも、本発明者らの研究室にて行われた。

このin vivo実験では、６週齢のヌードマウスに、１０⁶Ｈｅｐ３Ｂ細胞をPBS中に含む１００μｌの細胞懸濁液を皮下注射した。予期されるように、マウスの８０％において移植された細胞は、腫瘍細胞の移植と、腫瘍の出現の間の期間にもかかわらず、完全に異種性であると見いだされた。腫瘍は、血管を新生しており、そしてマウスのヌード皮膚を介して青色に見えた。腫瘍が約５ｍｍの直径に成長した後に、それぞれのウイルス（ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ、ＭｅＶ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤ、又はＶｅＶ Ｐ−ＳＣＤ）を腫瘍内に５回、１回あたり２×１０⁶ｐｆuで毎日１回の注射を行った（合計用量：１０⁷ｐｆu）。対照群には培地のみを注射した。続いて７日目に、５００ｍｇ/ｋｇ体重の５−ＦＣ をPBSに溶かしたものをマウスに腹腔内注射した。マウスの腫瘍体積及び体重を週に３回測定した。

上記の治療スケジュールが毒性にならないことを保証するために、マウスを毎日モニターし、そして体重を週に３回測定した。組み合わせ治療（MeV-ＳＣＤ＋５−ＦＣ）では、動物の行動における目に見える変化を導かなかったし、触られることに対する敏感さの増大などの反応も示さなかった。マウスの皮膚は健康に見え、活動や摂食行動について変化が見られず、体重も安定的であった。

自殺遺伝子治療を受けた腫瘍を有するマウスの治療では、腫瘍体積を有意に低下させ、そして生存を有意に延長させた。

in vivo試験の結果として、いずれかのウイルスの強力な腫瘍崩壊効果が記載されている。期待されたとおりに、プロドラッグのみの投与は効果がなく、ウイルス治療されたマウスにおいて５−ＦＣ注射が、ウイルス単独での治療に比較して、変更された結果を導かなかったが、重要なことに、ウイルス複製の初期停止によるウイルス媒介性の効果についても阻害しなかった。さらに、顕著な腫瘍崩壊性の差異が３つのベクターの間において観察されることはなかった。この実験設定では、腫瘍崩壊性麻疹ワクチンウイルスが、特に有効であり、その結果さらに５−ＦＣを適用することにより、高い腫瘍崩壊性や、生存についての利得を導かれなかった。対照治療マウスの生存中央値は３５日であり、そして５−ＦＣで治療されたマウスは３２日に過ぎなかった（図２４を参照）。これらの群の全てのマウスを、５０日の前に屠殺した。対照的に、治療群における生存の中央値は、４９日（Ｍｅｖ Ｐ−ＳＣＤ単独）及び８２．５日（ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ単独）であった（図２４を参照）。Ｍｅｖ Ｐ−ＳＣＤで治療された両方の群のマウスは、１００日の前に屠殺し、一方他の処理群由来の６匹のマウスには腫瘍がなく、１５０日超生存した（１のマウスがＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ単独及びＭｅＶ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤ＋５−ＦＣ；二匹のマウスが、ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ＋５−ＦＣ、でありそしてＭｅＶ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤ単独であった）。異なる治療群由来の何匹かのマウスが、腹膜腔の内部に目に見えかつ触診できる二次腫瘍を発達させた。これは治療失敗と考えられたので、これらのマウスは、統計分析から除外はしなかった。

全ての治療群において、異なる増殖挙動を有する腫瘍を観察した。いくつかの腫瘍がかなり早く成長し、そして治療の開始後３０日で、規定の終点２０００ｍｍ³超に達し、これは対照治療マウスに似ていた。いくつかの他のマウスは、遅延された腫瘍増殖を有しており、治療開始後、最初の週において腫瘍体積は低かったが、最終的に、その腫瘍は成長を再開し、終点の体積に到達した。いくつかの他の腫瘍は完全に消滅し、そしてマウスは１９５日超のあいだ腫瘍を伴わなかった。この異なる挙動は、ＭｅＶ ｌｄ−ＳＣＤ治療群の両方において見られた。いくつかの腫瘍が、振動成長挙動を有し、これはおそらくウイルス複製による腫瘍体積の低下と、それに続いて残りの腫瘍細胞の増殖し、ウイルスに対し複製のための新たな基礎を提供し、再び腫瘍崩壊と腫瘍の低下を導くことのため生じている。この腫瘍の収縮と成長は、腫瘍の血管新生の低下と回復を伴っており、マウスの皮膚を介した青色揺らぎにより検出される。ここで示された実施例では、腫瘍は最終的に９１日目で消滅した。この振動増殖は、腫瘍における長期間のウイルス複製の最初の兆しとして考えられた。

同様の結果が、追加の異種移植動物モデルで観察された（ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞癌腫細胞、及びＰＬＣ／ＰＲＦ／５ヒト肝細胞癌腫細胞）：図２５及び２６をそれぞれ参照のこと。

配列表：
配列番号１：麻疹ワクチンＳｃｈｗａｒｚ株の遺伝配列（図１を参照）
配列番号２：酵母シトシンデアミナーゼと酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体の遺伝子配列（リンカー配列を伴う）（図２を参照）
配列番号３：任意の導入遺伝子を伴わず、挿入カセットを含む基礎組換え麻疹ウイルスの遺伝子配列（図３を参照）
配列番号４：ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＳＣＤの遺伝子配列（図４を参照）
配列番号５：Ｎ遺伝子の発現に必要とされるヘルパープラスミドの遺伝子配列（図５を参照）
配列番号６：Ｐ遺伝子の発現に必要とされるヘルパープラスミドの遺伝子配列
（図６を参照）
配列番号７：Ｌ遺伝子の発現に必要とされるヘルパープラスミドの遺伝子配列（図７を参照）
配列番号８：ベクターｐＭｅｒＶ２ Ｐ−ＳＣＤの遺伝子配列（図２８を参照）
配列番号９：ベクターｐｃ３ＭｅｒＶ２ ｌｄ−ＶＰ２２ＳＣＤの遺伝子配列（図２９を参照）

Claims (25)

1. 自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスに対して、一次又は二次抵抗性を有する悪性細胞の治療において使用するための、自殺遺伝子を含む組換え麻疹ウイルスを含む、医薬組成物。
2. 前記悪性細胞が、以下の工程：
   （ａ）感染多重度１にて腫瘍崩壊性麻疹ウイルスで、当該悪性細胞に由来する細胞の集合を感染させた後、７２時間、又は好ましくは９６時間で当該悪性細胞に由来する細胞の集合において、生細胞の割合を測定すること
   を行うことにより同定され、ここで当該集合における生細胞の４０％以上、特に５０％以上、より特別に６０％以上の割合が、自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスに対する一次又は二次抵抗性を有する悪性細胞を指し示す、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記組換え麻疹ウイルスが、麻疹ワクチンＳｃｈｗａｒｚ株に基づく、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
4. 自殺遺伝子活性を伴わない腫瘍崩壊性麻疹ウイルスが、麻疹ワクチンＳｃｈｗａｒｚ株に由良医師、特に配列番号１に記載の配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
5. 前記自殺遺伝子が、シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
6. 前記自殺遺伝子が、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをさらに含む、請求項５に記載の医薬組成物。
7. 前記自殺遺伝子が、シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼとの融合体を含み、特にここで当該自殺遺伝子が、配列番号２に記載の配列を含む、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 前記組換え麻疹ウイルスが、配列番号３、配列番号４、配列番号８、又は配列番号９、特に配列番号４に記載のＲＮＡ配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
9. 前記悪性腫瘍細胞が、さらに化学療法及び/又は放射線療法に対して追加的に非応答性である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
10. 前記悪性細胞が、以下のリスト：胆管癌、頭頸部癌、及び肉腫に由来する悪性細胞から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
11. 前記治療が、繰り返し治療、特に毎週、隔週、３週に１回、又は４週に１回の治療である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
12. 麻疹ワクチンＳｃｈｗａｒｚ株に基づく組換え麻疹ウイルスであって、シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼを含む自殺遺伝子、特に、シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体を含む自殺遺伝子、をコードし、ここで等外自殺遺伝子が、配列番号２に記載の配列を含む、前記麻疹ウイルス。
13. 前記組換え麻疹ウイルスが、配列番号３、配列番号８、又は配列番号９、特に配列番号４に記載のＲＮＡ配列を含む、請求項１２に記載の組換え麻疹ウイルス。
14. 以下の工程：
    （ａ）（ｉ）麻疹ワクチンＳｃｈｗａｒｚ株のゲノム、及び（ｉｉ）シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼを含む自殺遺伝子、特にシトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体を含む自殺遺伝子を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの制御下でプラスミドにクローニングする工程を含む、請求項１２又は１３に記載の組換え麻疹ウイルスを製造する方法。
15. 前記自殺遺伝子が、配列番号２に記載の配列を含む、請求項１４に記載の方法。
16. （ｂ）麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Ｎ、Ｐ、及びＬを、各々のＲＮＡポリメラーゼＩＩの制御下で少なくとも１のベクターにクローニングする工程をさらに含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
17. 前記ウイルスヘルパー遺伝子Ｎ、Ｐ及びＬが、それぞれ分離したベクター、特にプラスミドベクターにクローニングされる、請求項１６に記載の方法。
18. 以下の：
    （ｂa）麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Ｎを、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下で、第一ベクター、特にプラスミドベクターにクローニングし；
    （ｂｂ）麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Ｐを、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下で、第二ベクター、特にプラスミドベクターにクローニングし；
    （ｂｃ）麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Ｌを、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下で、第三ベクター、特にプラスミドベクターにクローニングする工程
    を含む、請求項１７に記載の方法。
19. 工程（ａ）及び/又は（ｂ）、或いは（ａ）、（ｂａ）、（ｂｂ）及び/又は（ｂｃ）が、前記ゲノム及び/又は任意のヘルパー遺伝子由来の推定のスプライシング配列を除去する工程をさらに含む、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 工程（ａ）が、配列番号４、配列番号８、又は配列番号９、特に配列番号４に記載の配列を有するプラスミドをもたらす、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載方法。
21. 工程（ｂａ）から（ｂｃ）が、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７に記載の配列を有するプラスミドをもたらす、請求項１８又は１９に記載の方法。
22. 以下の：
    （ｃ） 宿主細胞を、工程（ａ）及び（ｂ）のプラスミドで感染させるか、又は工程（ａ）及び（ｂａ）〜（ｂｃ）のプラスミドで感染させる工程をさらに含み、特に宿主細胞はワクチン生産に承認された樹立された細胞株、特にベロ又はＭＲＣ−５細胞株由来である、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 以下の：
    （ｄ）工程（ｃ）で形質導入された宿主細胞から組換え麻疹ウイルスをレスキューする工程
    をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
24. 以下の：
    （ａ）（ｉ）麻疹ワクチンＳｃｈｗａｒｚ株のゲノムと、（ｉｉ）シトシンデアミナーゼ、特に酵母シトシンデアミナーゼと、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、特に酵母ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合体を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下で含む自殺遺伝子とを含むプラスミド；特にここで当該自殺遺伝子が、配列番号２に記載の配列を含み、特にここで当該プラスミドが配列番号４、配列番号８、又は配列番号９、より特別に配列番号４に記載の配列を有し；
    （ｂ）ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下で単一の遺伝子の形態で、麻疹ウイルスヘルパー遺伝子Ｎ、Ｐ、及びＬを含む少なくとも１のプラスミド
    を含むキット。
25. 前記ウイルスヘルパー遺伝子Ｎ、Ｐ及びＬが、それぞれ分離したプラスミドにクローニングされ、特にここで当該プラスミドが、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７に記載の配列を有する、請求項２４に記載のキット。

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