ES2865420T3 - Virus VSV/NDV híbridos para la terapia oncolítica del cáncer - Google Patents

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Abstract

Un virus oncolítico recombinante de la estomatitis vesicular (VSV), en el que se elimina la glicoproteína (proteína G) del VSV, y que comprende una proteína de fusión modificada (proteína F) del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV); y la proteína hemaglutinina neuraminidasa (HN) del NDV, en el que la proteína de fusión modificada (proteína F) del NDV es la proteína modificada con F3aa, o en el que la proteína de fusión modificada (proteína F) del NDV es la proteína modificada con F3aa y comprende al menos una sustitución de aminoácidos en el sitio de escisión de la proteasa, preferentemente en la posición L289, por ejemplo, L289A.

Description

DESCRIPCIÓN
Virus VSV/NDV híbridos para la terapia oncolítica del cáncer
La presente invención se refiere a virus oncolíticos recombinantes que comprenden un virus de la estomatitis vesicular (VSV), en los que se elimina la glicoproteína (proteína G) del VSV; y que comprenden una proteína de fusión modificada (proteína F) del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV); y la proteína hemaglutinina neuraminidasa (HN) del NDV. La presente invención se refiere además a ácidos nucleicos que codifican el virus oncolítico recombinante y a vectores que comprenden los ácidos nucleicos. La presente invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden el rVSV de la invención, el ácido nucleico o el vector, además de a los usos como herramienta de suministro de genes y/o para la detección de tumores. La presente invención se refiere además al virus recombinante oncolítico de la estomatitis vesicular (VSV) para su uso en medicina, en particular para el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento del cáncer.
Antecedentes de la invención
Los virus oncolíticos (VO) representan una nueva clase de agentes terapéuticos para el tratamiento del cáncer, debido a su capacidad intrínseca para replicarse y eliminar selectivamente células tumorales, a la vez que se preserva el tejido normal circundante (Lorence y col., 1994; Coffey y col., 1998; Kirn y col., 2001; Peng y col., 2001). Las terapias con VO implican el uso de virus competentes para la replicación que o bien son intrínsecamente selectivos para los tumores o bien se han diseñado para proliferar preferentemente en las células tumorales. Durante el proceso de transformación maligna, se acumulan anomalías genéticas que proporcionan a las células cancerosas ventajas de crecimiento y supervivencia. Muchos VO aprovechan estos defectos en las vías de señalización celular para soportar su propia replicación en estas células. En particular, muchas células cancerosas tienen una capacidad reducida para secretar o responder al interferón (IFN), que es un mecanismo clave en la respuesta inmunitaria innata contra los virus invasores en las células normales. Estos defectos impiden a las células tumorales montar una defensa antiviral productiva, y, por tanto, la replicación del VO se apoya específicamente en estas células.
Los virus oncolíticos ejercen sus efectos tanto eliminando directamente las células tumorales infectadas, así como efectos indirectos, como la destrucción de la vasculatura tumoral y la inducción de respuestas inmunitarias adaptativas, que puede dirigirse contra el tumor y provocar la destrucción de las células tumorales vecinas no infectadas. Además, se dispone de sistemas genéticos, que permiten diseñar y rescatar vectores virales recombinantes a partir de ADN plasmídico. De esta manera, los virus pueden modificarse para aumentar la especificidad tumoral o para expresar genes terapéuticos y/o genes indicadores.
A lo largo de la última década, se han producido avances significativos en el desarrollo de terapias mejoradas con VO y diversos vectores han entrado en fase de ensayos clínicos (Kirn y col., 2001; Everts y Van der Poel, 2005; Patel y Kratzke, 2013). Recientemente, un vector recombinante del virus del herpes simple I fue el primer virus oncolítico aprobado por la FDA para su uso como agente clínico (comunicado de prensa del 27 de octubre de 2015, Amgen), y se espera que también obtenga la autorización en Europa. Sin embargo, en general, los resultados de los ensayos clínicos suelen ser decepcionantes debido a la falta de modelos preclínicos fiables y predictivos y a la inadecuada respuesta tumoral a la mayoría de las terapias con VO en hospedadores inmunocompetentes.
La eficacia terapéutica de la terapia vírica oncolítica suele estar reñida con la seguridad, de manera que los vectores potentes suelen estar asociados a toxicidad, mientras que los virus más seguros proporcionan efectos terapéuticos atenuados. A pesar de los prometedores datos preclínicos, el desarrollo del virus de la estomatitis vesicular (VSV) como agente clínico se ha visto sustancialmente obstaculizado por el hecho de que se ha observado una neurotoxicidad grave en roedores y primates no humanos en respuesta al tratamiento con VSV de tipo silvestre (Van den Pool y col., 2002; Johnson y col., 2007). Además de las consideraciones de seguridad, la rápida acumulación de altas concentraciones intratumorales de VSV, como consecuencia de su corto ciclo de vida, da lugar a una respuesta inmunitaria innata temprana y potente, lo que limita gravemente la capacidad del virus para propagarse eficazmente y destruir toda la masa tumoral antes de ser eliminado por el hospedador (Altomonte y col., 2008).
El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) ha demostrado ser un potente agente oncolítico con un atractivo perfil de seguridad en humanos; sin embargo, el uso del NDV supone un riesgo medioambiental para las aves y la industria avícola, ya que las especies aviares son los hospedadores naturales del virus. Aunque las cepas mesogénicas y velogénicas del NDV han demostrado ser las más eficaces como virus oncolíticos, desde 2008, la USDA los clasifica como agentes peligrosos, prohibiendo su uso y, por tanto, obstaculizando gravemente el desarrollo del NDV como agente clínico (www.selectagents.gov).
A fin de mejorar la seguridad de los vectores oncolíticos de VSV, los investigadores han investigado una diversas estrategias. En primer lugar, los VSV recombinantes que portan sustituciones o eliminaciones de nucleótidos para alterar la composición de aminoácidos de la proteína de la matriz (M) en la posición 51 interfieren con la capacidad de la proteína M endógena para inhibir la transcripción celular y la transferencia de ARN nucleocitoplásmico, permitiendo que se lancen respuestas celulares antivíricas. Aunque estos vectores han demostrado ser más seguros que los de tipo silvestre, la replicación intratumoral también está atenuada (Stojdl y col., 2003; Ebert y col., 2005), lo que limita el valor terapéutico de esta estrategia. Otra estrategia para mejorar la seguridad del VSV consiste en la incorporación de secuencias diana de miARN en el genoma del virus para modificar su tropismo, sin embargo, estos vectores también son menos eficaces (Edge y col., 2008; Kelly y col., 2010).
Se están explorando varios intentos de modificar por ingeniería genética el genoma del NDV para limitar la patogenicidad en las especies aviares, véase, por ejemplo, la solicitud de patente WO 2015/032755 A1. Queda por ver si estas modificaciones mejorarán realmente la seguridad y el efecto de las mismas en la capacidad oncolítica de los vectores.
Por tanto, existe la necesidad en la técnica de mejorar los medios y procedimientos de viroterapia oncolítica, así como de mejorar los virus oncolíticos.
Sumario de la invención
De acuerdo con la presente invención, este objeto se resuelve mediante un virus oncolítico recombinante de la estomatitis vesicular (VSV), de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas,
en el que se elimina la glicoproteína (proteína G) del VSV, y que comprende
una proteína de fusión modificada (proteína F) del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV); y
la proteína hemaglutinina neuraminidasa (HN) del NDV.
De acuerdo con la presente invención, este objeto se resuelve mediante un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas, que codifica el virus oncolítico recombinante de la invención.
De acuerdo con la presente invención, este objeto se resuelve mediante un vector de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas, que comprende el ácido nucleico de la invención.
De acuerdo con la presente invención, este objeto se resuelve mediante una composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas, que comprende
(i) el virus oncolítico recombinante de la estomatitis vesicular (VSV), el ácido nucleico o el vector de la presente invención; y
(ii) opcionalmente, uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.
De acuerdo con la presente invención, este objeto se resuelve mediante el uso del virus oncolítico recombinante de la estomatitis vesicular (VSV), el ácido nucleico o el vector de la presente invención o la composición farmacéutica de la presente invención, como herramienta de suministro de genes y/o de formación de imágenes (no invasiva) de la biodistribución del virus y/o para la detección de tumores.
De acuerdo con la presente invención, este objeto se resuelve proporcionando el virus oncolítico recombinante de la estomatitis vesicular (VSV), el ácido nucleico o el vector de la presente invención o la composición farmacéutica de la presente invención para su uso en medicina.
De acuerdo con la presente invención, este objeto se resuelve proporcionando el virus oncolítico recombinante de la estomatitis vesicular (VSV), el ácido nucleico o el vector de la presente invención o la composición farmacéutica de la presente invención para su uso en el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento del cáncer.
También se desvela un procedimiento de diagnóstico, prevención y/o tratamiento del cáncer que comprende la etapa de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz del virus oncolítico recombinante, el ácido nucleico o el vector de la presente invención o la composición farmacéutica de la presente invención.
Descripción de las realizaciones preferentes de la invención
Antes de que la presente invención se describa con más detalle a continuación, debe entenderse que la presente invención no se limita a la metodología, los protocolos y los reactivos particulares descritos en el presente documento, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene la finalidad de describir solo realizaciones particulares, y no pretende limitar el ámbito de la presente invención, que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizadosen el presente documento tienen los mismos significados que entiende comúnmente un experto en la materia.
Las concentraciones, cantidades y otros datos numéricos pueden expresarse o presentarse en el presente documento en un formato de intervalo. Debe entenderse que este formato de intervalo se utiliza simplemente por conveniencia y brevedad y, por lo tanto, debe interpretarse de manera flexible para incluir no solo los valores numéricos explícitamente recitados como los límites del intervalo, sino también para incluir todos los valores numéricos individuales o subintervalos englobados dentro de ese intervalo como si se recitaran explícitamente cada valor numérico y subintervalo. A modo de ilustración, un intervalo numérico de "20 a 100 nucleótidos" debe interpretarse de manera que incluya no solo los valores explícitamente recitados de 20 a 100, sino que también incluyen valores individuales y subintervalos dentro del intervalo indicado. Por tanto, en este intervalo numérico se incluyen valores individuales como 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,... 97, 98, 100 y subgrupos como el de 25 a 35, de 20 a 40, de 25 a 50, etc. Este mismo principio se aplica a los intervalos que recitan un solo valor numérico, tales como "al menos 25 nucleótidos". Además, dicha interpretación debe aplicarse independientemente de la amplitud del intervalo o de las características descritas.
Virus oncolíticos y vectores VSV
Como se ha analizado anteriormente, la presente invención proporciona virus oncolíticos recombinantes.
En particular, la presente invención proporciona virus VSV oncolíticos recombinantes de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas, en los que se pseudotipa la proteína glicoproteína del VSV.
Entre las plataformas de vectores VO más prometedoras que se están desarrollando están el virus de la estomatitis vesicular (VSV) y el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV).
El virus de la estomatitis vesicular (VSV) es un virus de ARN de cadena negativa de la familia de los rabdovirus. Los vectores VSV son agentes oncolíticos muy atractivos debido a su inherente especificidad tumoral y a su rápido ciclo de replicación, que dan lugar a concentraciones intratumorales elevadas y a la consiguiente lisis de las células tumorales.
El genoma del VSV es una única molécula de ARN de sentido negativo que codifica cinco proteínas principales: glicoproteína (G), proteína polimerasa grande (L), fosfoproteína (P), proteína de la matriz (M) y nucleoproteína (N). El genoma total es de aproximadamente 11.000 nucleótidos.
La proteína G del VSV permite la entrada del virus. Media la adhesión vírica a un receptor de LDL (LDLR) o a un miembro de la familia de LDLR presente en la célula hospedadora. Tras la unión, el complejo VSV-LDLR se endocita rápidamente. A continuación, media la fusión de la envoltura vírica con la membrana endosómica. El VSV entra en la célula a través de vesículas parcialmente recubiertas de clatrina; las vesículas con virus contienen más clatrina y adaptador de clatrina que las vesículas convencionales. Las vesículas que contienen virus reclutan componentes de la maquinaria de actina para su interacción, induciendo así su propia captación. La replicación se produce en el citoplasma.
La proteína L del VSV está codificada por la mitad del genoma y se combina con la fosfoproteína para catalizar la replicación del ARNm.
La proteína M del VSV está codificada por un ARNm de 831 nucleótidos que se traduce en una proteína de 229 aminoácidos. La secuencia predicha de la proteína M no contiene ningún dominio hidrófobo o no polar largo que pueda promover la asociación con la membrana. La proteína es rica en aminoácidos básicos y contiene un dominio amino terminal altamente básico.
Genoma completo del VSV Indiana SEQ ID NO: 1
Número de referencia de GenBank del NCBI: J02428.1
Proteína G de VSV Indiana SEQ ID NO: 2 y 3
Véase la secuencia de nucleótidos y aminoácidos en el número de referencia de GenBank X03633.1.
El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus aviar de la familia de los Paramixovirus. Los miembros de esta familia tienen un ARN lineal monocatenario. El genoma total es de aproximadamente 16.000 nucleótidos. La replicación del virus tiene lugar en el citoplasma de la célula hospedadora.
Es similar al VSV en el sentido de que es un virus de ARN de hebra negativa y se ha desarrollado como un virus oncolítico, debido a su capacidad innata de replicarse y provocar la lisis en las células tumorales, mientras que deja ilesas a las células sanas (Altomonte y col., 2010; Vigil y col., 2007). Los ensayos clínicos de fase I-II se han mostrado prometedores para el NDV y sugieren que la toxicidad relacionada con la terapia es mínima. Una de las principales ventajas del NDV como agente oncolítico es que la envoltura vírica, que está compuesta de una hemaglutininaneuraminidasa (HN) y una proteína de fusión (F), no solo interviene en la adhesión y la fusión del virus con la célula diana, sino que provoca la fusión de las células infectadas con sus vecinas no infectadas, lo que proporciona un potente mecanismo de propagación vírica y de eliminación de células tumorales. Además, nuevas pruebas indican que la formación de sincicios causada por la fusión de células resulta en una respuesta de muerte celular multimodal, que puede sinergizar con el efecto oncolítico directo del virus, obteniéndose un potente mecanismo de destrucción tumoral (Cuadrado-Castano y col., 2015).
Dos proteínas del virus de la enfermedad de Newcastle se insertan en la envoltura. Son la proteína hemaglutinina/neuraminidasa (HN) y la proteína de fusión (F). Estas dos proteínas son importantes para determinar la virulencia del virus y la forma en que éste infecta las células del hospedador.
La proteína hemaglutinina/neuraminidasa tiene dos secciones de interés: (1) La sección de hemaglutinina, que es una proteína de fijación y se une a los receptores del exterior de la membrana de las células del hospedador, incluidos los glóbulos rojos. (2) La sección de la neuraminidasa es el sitio activo de una enzima que ayuda a la liberación del virus de la membrana de las células hospedadoras. La actividad de esta enzima influye en el tiempo que tarda el virus en eluir de los glóbulos rojos.
La proteína de fusión F fusiona la envoltura del virus con la membrana de la célula hospedadora. Esto permite la penetración del genoma vírico en la célula hospedadora. Para que se produzca la fusión, debe cambiar la forma de la proteína de fusión nativa. Este cambio se produce cuando una proteasa de la célula hospedadora escinde la proteína en un sitio de escisión específico. Después de que esto haya sucedido, la proteína de fusión se activa y ya puede fusionarse con la membrana de la célula. La secuencia de aminoácidos alrededor del sitio de corte determina el rango de proteasas que pueden activar el corte de la proteína. Por lo tanto, esta secuencia determina la virulencia.
La proteína F del NDV es responsable de la fusión vírica con la membrana celular y de la propagación viral de célula a célula mediante la formación de sincicios. La presencia de un sitio de corte multibásico dentro de la proteína F permite el corte y la activación de la proteína por una amplia gama de proteasas y es un determinante de la virulencia en las cepas víricas velogénicas.
Para aumentar la potencia oncolítica de una cepa lentógena Hitchner B1 NDV altamente atenuada, se introdujo un sitio de corte polibásico en la proteína F para generar el rNDV/F3aa (Vigil y col., 2007). Mientras que el virus resultante solo mostraba un fenotipo de virulencia intermedio basado en un tiempo medio de muerte en huevos embrionados, el virus formó grandes sincicios y se potenció su replicación en las células cancerosas, lo que conlleva una mejora de los efectos oncolíticos en varios modelos tumorales animales. Se obtuvieron resultados similares cuando se modificó de forma análoga la proteína F de la cepa lentógena del NDV La Sota (Peeters y col., 1999). Los inventores han demostrado además que una única sustitución de aminoácidos de leucina a alanina en el aminoácido 289 (L289A) en la proteína de fusión modificada por F3aa da lugar a una formación sincitial y a una necrosis tumoral sustancialmente mayor que la del virus que solo porta la mutación F3aa, sin ninguna toxicidad adicional (Altomonte y col., 2010).
La actividad fusogénica y oncolítica de la cepa rNDV/F3aa puede mejorarse aún más mediante una mutación puntual en la proteína F en el resto 289 de leucina a alanina, generando rNDV/F3aa (L289A). En un modelo de rata con tumor hepático inmunocompetente ortotópico, la administración del virus mutante mediante infusión arterial hepática dio lugar a una importante formación de sincicios y necrosis, que se tradujo en una prolongación significativa del 20 % de la supervivencia respecto al tratamiento con el virus rNDV/F3aa original (Altomonte y col., 2010).
Genoma completo del NDV Hitchner B1 SEQ ID NO: 4 Número de referencia de GenBank: AF375823
Proteína HN del NDV SEQ ID NO: 5 y 6 Véase el número de referencia de GenBank AF375823 y la ID de gen del NCBI 912270 para la secuencia de ácidos nucleicos y aminoácidos.
Proteína F del NDV SEQ ID NO: 7 y 8 Véase el número de referencia de GenBank AF375823 y la ID de gen del NCBI 912271 para la secuencia de ácidos nucleicos y aminoácidos.
SEQ ID NO: 8
MGSRPFTKNP APMMLTIRVA LVLSCICPAN SIDGRPFAAA GIVVTGDKAV NIYTSSQTGS 60
IIVKLLPNLP KDKEACAKAP LDAYNRTLTT LLTPLGDSIR RIQESVTTSG GGRQGRLIGA 120
IIGGVALGVA TAAQITAAAA LIQAKQNAAN ILRLKESIAA TNEAVHEVTD GLSQLAVAVG 180
KMQQFVNDQF NKTAQELDCI KIAQQVGVEL NLYLTELTTV FGPQITSPAL NKLTIQALYN 240
LAGGNMDYLL TKLGIGNNQL SSLIGSGLIT GNPILYDSQT QLLGIQVTLP SVGNLNNMRA 300
TYLETLSVST TRGFASALVP KVVTQVGSVI EELDTSYCIE TDLDLYCTRI VTFPMSPGIY 360
SCLSGNTSAC MYSKTEGALT TPYMTIKGSV IANCKMTTCR CVNPPGIISQ NYGEAVSLID 420
KQSCNVLSLG GITLRLSGEF DVTYQKNISI QDSQVIITGN LDISTELGNV NNSISNALNK 480
LEESNRKLDK VNVKLTSTSA LITYIVLTII SLVFGILSLI LACYLMYKQK AQQKTLLWLG 540
NNTLDQMRAT TKM 553
Proteína de fusión modificada por F3aa del NDV SEQ ID NO: 9 y 10
SEQ ID NO: 9 (Park y col., 2006 y Altomonte y col., 2010)
ATGGGCTCCAGACCTTCTACCAAGAACCCAGCACCTA'IGATGCTGACTATCCGGGTCGCGCTGGTACTGAGTTGC ATCTGCCCGGCAAACTCCATTGATGGCAGGCCTCTTGCAGCTGCAGGAATTGTGGTTACAGGAGACAAAGCAGTC AACATATACACCTCATCCCAGACAGGATCAATCATAGTTAAGCTCCTCCCGAATCTGCCCAAGGATAAGGAGGCA TGTGCGAAAGCCCCCTTGGATGCATACAACAGGACATTGACCACTTTGCTCACCCCCCTTGGTGACTCTATCCGT AGGATACAAGAGTCTGTGACTACATCTGGAGGGCGGAGACAGAGGCGCTTTATAGGCGCCATTATTGGCGGTGTG GCTCTTGGGGTTGCAACTGCCGCACAAATAACAGCGGCCGCAGCTCTGATACAAGCCAAACAAAATGCTGCCAAC ATCCTCCGACTTAAAGAGAGCATTGCCGCAACCAATGAGGCTGTGCATGAGGTCACTGACGGATTATCGCAACTA GCAGTGGCAGTTGGGAAGATGCAGCAGTTTGTTAATGACCAATTTAATAAAACAGCTCAGGAATTAGACTGCATC AAAATTGCACAGCAAGTTGGTGTAGAGCTCAACCTGTACCTAACCGAATTGACTACAGTATTCGGACCACAAATC ACTTCACCTGCCTTAAACAAGCTGACTATTCAGGCACTTTACAATCTAGCTGGTGGGAATATGGATTACTTATTG ACTAAGTTAGGTATAGGGAACAATCAACTCAGCTCATTAATCGGTAGCGGCTTAATCACCGGTAACCCTATTCTA TACGACTCACAGACTCAACTCTTGGGTATACAGGTAACTCTACCTTCAGTCGGGAACCTAAATAATATGCGTGCC ACCTACTTGGAAACCTTATCCGTAAGCACAACCAGGGGATTTGCCTCGGCACTTGTCCCAAAAGTGGTGACACAG GTCGGTTCTGTGATAGAAGAACTTGACACCTCATACTGTATAGAAACTGACTTAGATTTATATTGTACAAGAATA GTAACGTTCCCTATGTCCCCTGGTATTTACTCCTGCTTGAGCGGCAATACATCGGCCTGTATGTACTCAAAGACC GAAGGCGCACTTACTACACCATATATGACTATCAAAGGCTCAGTCATCGCTAACTGCAAGATGACAACATGTAGA TGTGTAAACCCCCCGGGTATCATATCGCAAAACTATGGAGAAGCCGTGTCTCTAATAGATAAACAATCATGCAAT GTTTTATCCTTAGGCGGGATAACTTTAAGGCTCAGTGGGGAATTCGATGTAACTTATCAGAAGAATATCTCAATA CAAGATTCTCAAGTAATAATAACAGGCAATCTTGATATCTCAACTGAGCTTGGGAATGTCAACAACTCGATCAGT AATGCTTTGAATAAGTTAGAGGAAAGCAACAGAAAACTAGACAAAGTCAATGTCAAACTGACCAGCACATCTGCT CTCATTACCTATATCGTTTTGACTATCATATCTCTTGTTTTTGGTATACTTAGCCTGATTCTAGCATGCTACCTA ATGTACAAGCAAAAGGCGCAACAAAAGACCTTATTATGGCTTGGGAATAATACCCTAGATCAGATGAGAGCCACT ACAAAAATGTGA SEQ ID NO: 10 (Park y col., 2006 y Altomonte y col., 2010)
MGSRPFTKNP APMMLTIRVA LVLSCICPAN SIDGRPFAAA GIVVTGDKAV NIYTSSQTGS 60 IIVKLLPNLP KDKEACAKAP LDAYNRTLTT LLTPLGDSIR RIQESVTTSG GRRQRRFIGA 120 IIGGVALGVA TAAQITAAAA LIQAKQNAAN ILRLKESIAA TNEAVHEVTD GLSQLAVAVG 180 KMQQFVNDQF NKTAQELDCI KIAQQVGVEL NLYLTELTTV FGPQITSPAL NKLTIQALYN 240 LAGGNMDYLL TKLGIGNNQL SSLIGSGLIT GNPILYDSQT QLLGIQVTLP 3VGNLNNMRA 300 TYLETLSVST TRGFASALVP KVVTQVGSVI EELDTSYCIE TDLDLYCTRI VTFPMSPGIY 360 SCLSGNTSAC MYSKTEGALT TPYMTIKGSV IANCKMTTCR CVNPPGIISQ NYGEAVSLID 420 KQSCNVLSLG GITLRLSGEF DVTYQKNISI QDSQVIITGN LDISTELGNV NNSISNALNK 480 LEESNRKLDK VNVKLTSTSA LITYIVLTII SLVFGILSLI LACYLMYKQK AQQKTLLWLG 540 NNTLDQMRAT TKM
Proteína de fusión modificada por F3aa del NDV con L289A SEQ ID NO: 11 y 12
SEQ ID NO: 11 (véase también Altomonte y col., 2010)
ATGGGCTCCAGACCTTCTACCAAGAACCCAGCACCTATGATGCTGACTATCCGGGTCGCGCTGGTACTGAGTTGC ATCTGCCCGGCAAACTCCATTGATGGCAGGCCTCTTGCAGCTGCAGGAATTGTGGTTACAGGAGACAAAGCAGTC AACATATACACCTCATCCCAGACAGGATCAATCATAGTTAAGCTCCTCCCGAATCTGCCCAAGGATAAGGAGGCA TGTGCGAAAGCCCCCTTGGATGCATACAACAGGACATTGACCACTTTGCTCACCCCCCTTGGTGACTCTATCCGT AGGATACAAGAGTCTGTGACTACATCTGGAGGGCGGAGACAGAGGCGCTTTATAGGCGCCATTATTGGCGGTGTG GCTCTTGGGGTTGCAACTGCCGCACAAATAACAGCGGCCGCAGCTCTGATACAAGCCAAACAAAATGCTGCCAAC ATCCTCCGACTTAAAGAGAGCATTGCCGCAACCAATGAGGCTGTGCATGAGGTCACTGACGGATTATCGCAACTA GCAGTGGCAGTTGGGAAGATGCAGCAGTTTGTTAATGACCAATTTAATAAAACAGCTCAGGAATTAGACTGCATC AAAATTGCACAGCAAGTTGGTGTAGAGCTCAACCTGTACCTAACCGAATTGACTACAGTATTCGGACCACAAATC ACTTCACCTGCCTTAAACAAGCTGACTATTCAGGCACTTTACAATCTAGCTGGTGGGAATATGGATTACTTATTG ACTAAGTTAGGTATAGGGAACAATCAACTCAGCTCATTAATCGGTAGCGGCTTAATCACCGGTAACCCTATTCIA TACGACTCACAGACTCAACTCTTGGGTATACAGGTAACTGCACCTTCAGTCGGGAACCTAAATAATATGCGTGCC ACCTACTTGGAAACCTTATCCGTAAGCACAACCAGGGGATTTGCCTCGGCACTTGTCCCAAAAGTGGTGACACAG GTCGGTTCTGTGATAGAAGAACTTGACACCTCATACTGTATAGAAACTGACTTAGATTTATATTGTACAAGAATA GTAACGTTCCCTATGTCCCCTGGTATTTACTCCTGCTTGAGCGGCAATACATCGGCCTGTATGTACTCAAAGACC GAAGGCGCACTTACTACACCATATATGACTATCAAAGGCTCAGTCATCGCTAACTGCAAGATGACAACATGTAGA TGTGTAAACCCCCCGGGTATCATATCGCAAAACTATGGAGAAGCCGTGTCTCTAATAGATAAACAATCATGCAAT GTTTTATCCTTAGGCGGGATAACTTTAAGGCTCAGTGGGGAATTCGATGTAACTTATCAGAAGAATATCTCAATA CAAGATTCTCAAGTAATAATAACAGGCAATCTTGATATCTCAACTGAGCTTGGGAATGTCAACAACTCGATCAGT AATGCTTTGAATAAGTTAGAGGAAAGCAACAGAAAACTAGACAAAGTCAATGTCAAACTGACCAGCACATCTGCT CTCATTACCTATATCGTTITGACTATCATATCTCTTGTTTTTGGTATACTTAGCCIGATTCTAGCATGCTACCTA ATGTACAAGCAAAAGGCGCAACAAAAGACCTTATTATGGCTTGGGAATAATACCCTAGATCAGATGAGAGCCACT ACAAAAATGTGA SEQ ID NO: 12 (véase también Altomonte y col., 2010)
MGSRPFTKNP APMMLTIRVA LVLSCICPAN SIDGRPFAAA GIVVTGDKAV NIYTSSQTGS 60 IIVKLLPNLP KDKEACAKAP LDAYNRTLTT LLTPLGDSIR RIQESVTTSG GRRQRRFIGA 120 IIGGVALGVA TAAQITAAAA LIQAKQNAAN ILRLKESIAA TNEAVHEVTD GLSQLAVAVG 180 KMQQFVNDQF NKTAQELDCI KIAQQVGVEL NLYLTELTTV FGPQITSPAL NKLTIQALYN 240 LAGGNMDYLL TKLGIGNNQL SSLIGSGLIT GNPILYDSQT QLLGIQVTAP SVGNLNNMRA 300 TYLETLSVST TRGFASALVP KVVTQVGSVI EELDTSYCIE TDLDLYCTRI VTFPMSPGIY 360 SCLSGNTSAC MYSKTEGALT TPYMTIKGSV IANCKMTTCR CVNPPGIISQ NYGEAVSLID 420 KQSCNVLSLG GITLRLSGEF DVTYQKNISI QDSQVIITGN LDISTELGNV NNSISNALNK 480 LEESNRKLDK VNVKLTSTSA LITYIVLTII SLVFGILSLI LACYLMYKQK AQQKTLLWLG 540 NNTLDQMRAT TKM 553 Como se ha analizado anteriormente, la presente invención proporciona virus VSV oncolíticos recombinantes de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas, en los que se pseudotipa la proteína glicoproteína del VSV.
Recientemente, el concepto de intercambiar la glicoproteína ("pseudotipado") de un virus por la de un virus heterólogo se ha demostrado como un medio eficaz para alterar el tropismo del virus. Utilizando esta estrategia, la cadena principal del virus se mantiene intacta, y por lo tanto, se plantea la hipótesis de que la replicación del virus en las células susceptibles debería verse mínimamente afectada. Un grupo ha descrito un vector de VSV que se ha pseudotipado con la proteína de la envoltura del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV-GP), que ha demostrado ser significativamente menos neurotrópico que el vector de tipo silvestre (Muik y col., 2011). De manera similar, la glicoproteína del VSV se ha intercambiado con la del virus del sarampión y se ha modificado con fragmentos de anticuerpos variables monocatenarios para volver a dirigir el VSV a las células cancerosas que expresan receptores de superficie individuales (Ayala-Breton y col., 2012).
En la presente invención, un virus oncolítico recombinante de la estomatitis vesicular (VSV) de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas,
en el que se elimina la glicoproteína (proteína G) del VSV, y que comprende
una proteína de fusión modificada (proteína F) del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV); y
la proteína hemaglutinina neuraminidasa (HN) del NDV.
La proteína de fusión modificada (proteína F) del NDV es la proteína F modificada con F3aa,
o es la proteína F modificada con F3aa y comprende al menos una sustitución de aminoácidos en el sitio de corte de la proteasa, preferentemente en la posición L289, por ejemplo, L289A.
En una realización preferida, la proteína G del VSV se sustituye por la proteína de fusión modificada y la proteína HN del NDV.
El virus oncolítico recombinante comprende además las proteínas restantes del VSV, a saber, la proteína polimerasa grande (L), fosfoproteína (P), proteína de la matriz (M) y nucleoproteína (N).
Por ejemplo, la glicoproteína endógena del VSV puede eliminarse de un plásmido que codifica el genoma completo del VSV. La glicoproteína del NDV, que comprende una proteína de fusión modificada (NDV/F(L289A)) y la hemaglutinina-neuraminidasa (NDV/HN), pueden insertarse como unidades de transcripción individuales entre los genes de la matriz (M) y de la polimerasa grande (L) del VSV. Véase, por ejemplo, la figura 1.
En una realización del rVSV (vector) de la presente invención, la proteína de fusión modificada (proteína F) del NDV comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 [= secuencia de aa de la proteína F3aa] o de la SEQ ID NO: 12 [= secuencia aa de la proteína F3aa/L289A], o en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 %, o preferentemente al menos un 70 % o un 80 % o un 90 % o un 95 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 o 12, y/o en la que la proteína de fusión (proteína F) modificada del NDV está codificada por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9 [=secuencia de nucleótidos de la proteína F3aa] o de la SEQ ID NO: 11 [=secuencia de nucleótidos de la proteína F3aa/L289A],
o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 %, o preferentemente al menos un 70 % o un 80 % o un 90 % o un 95 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO: 9 u 11.
En una realización del rVSV (vector) de la presente invención, en el que la proteína HN del NDV comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6,
o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 60 %, o preferentemente al menos un 70 % o un 80 % o un 90 % o un 95 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6,
y/o en el que la proteína HN del NDV está codificada por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 %, o preferentemente al menos un 70 % o un 80 % o un 90 % o un 95 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5.
Como se ha analizado anteriormente, la presente invención comprende ácidos nucleicos que codifican los virus oncolíticos de la estomatitis vesicular (VSV) de la presente invención.
Como se ha analizado anteriormente, la presente invención comprende vectores que comprenden los ácidos nucleicos de la presente invención.
En realizaciones preferidas, el vector de la presente invención comprende además:
- uno o más genes indicadores,
tales como HSV1-sr39TK, el simportador de yoduro de sodio (NIS), el receptor de somatostatina 2 (SSTR2), luciferasa (de luciérnaga o Renilla), proteína fluorescente verde (GFP), lacZ; tirosinasa
- uno o más genes que se suministrarán a las células o al tejido diana,
tales como los uno o más genes que se suministrarán a las una o más células tumorales o a los uno o más tumores, por ejemplo,
genes inmunoestimuladores, tales como IFN-a, IFN-p o factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF);
anticuerpos inhibidores de punto de control inmunitario, tales como PD-1, PD1-L, CTLA-4, LAG-3 o B7-H3; y/o antígenos asociados al tumor (TAA) para la vacunación (específicos para el tumor diana);
- o combinaciones de los mismos.
En una realización, el ácido nucleico o el vector de la presente invención comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13 [= secuencia de nucleótidos de la construcción completa del virus/vector],
o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 %, o preferentemente al menos un 70 % o un 80 % o un 90 % o un 95 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13,
y/o comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con las SEQ ID NO: 6, 12, 14 a 17 [= secuencia de aa de las proteínas codificadas por la construcción del virus/vector],
o una secuencia de nucleótidos que tenga al menos un 60 %, o preferentemente al menos un 70 % o un 80 % o un 90 % o un 95 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con las SEQ ID NO: 6, 12, 14 a 17.
La SEQ ID NO: 13 muestra la secuencia de nucleótidos de la construcción completa del virus/vector.
Las SEQ ID NO: 14-17 y 12 y 6 muestran las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas por la SEQ ID NO: 13, a saber:
SEQ ID NO: 14, secuencia de aminoácidos de la proteína VSV-N;
15, secuencia de aminoácidos de la proteína VSV-P;
16, secuencia de aminoácidos de la proteína VSV-M;
SEQ ID NO: 12, secuencia de aminoácidos de la proteína NDV-F3aa(L289A);
SEQ ID NO: 6, secuencia de aminoácidos de la proteína NDV-HN;
SEQ ID NO: 17 secuencia de aminoácidos de la proteína VSV-L.
Composiciones farmacéuticas
Como se ha analizado anteriormente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica, que comprende
(i) el virus oncolítico recombinante de la presente invención o un ácido nucleico de la presente invención o un vector de la presente invención; y
(ii) opcionalmente, uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.
En una realización, la composición farmacéutica comprende uno o más fármacos adicionales,
tales como
agente(s) quimioterapéutico(s),
agente(s) radioterapéutico(s),
vacuna(s) tumoral(es),
inhibidor(es) del punto de control inmunitario,
sistema(s) de soporte celular,
inhibidor(es) de molécula pequeña,
agente(s) de embolización,
polímero(s) de recubrimiento.
En una realización, la composición farmacéutica se formula para administración sistémica, inyección en el tumor, administración intravenosa, administración intraarterial,
y/o para inyección intradérmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraósea, intraperitoneal, intratecal, epidural, intracardíaca, intraarticular, intracavernosa, intracerebral, intracerebroventricular e intravítrea.
Usos como herramienta de suministro de genes y/o para la detección de tumores
Como se ha analizado anteriormente, la presente invención proporciona el uso del virus recombinante oncolítico de la estomatitis vesicular (VSV), el ácido nucleico o el vector de la presente invención o la composición farmacéutica de la presente invención:
- como herramienta de suministro de genes
y/o
- para la formación de imágenes (no invasiva) de la biodistribución del virus
y/o
- para la detección de tumores.
En una realización, los vectores de la presente invención comprenden los uno o más genes que se van a administrar a las una o más células diana o tejidos, tales como los uno o más genes que se suministrarán a las una o más células tumorales o a los uno o más tumores,
por ejemplo,
genes inmunoestimuladores, tales como IFN-a, IFN-p o factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF); anticuerpos inhibidores de punto de control inmunitario, tales como PD-1, PD1-L, CTLA-4, LAG-3 o B7-H3; y/o
antígenos asociados al tumor (TAA) para la vacunación (específicos para el tumor diana).
En una realización, los vectores de la presente invención comprenden uno o más genes indicadores,
tales como HSV1-sr39TK, el simportador de yoduro de sodio (NIS), el receptor de somatostatina 2 (SSTR2), luciferasa (de luciérnaga o Renilla), proteína fluorescente verde (GFP), lacZ, tirosinasa y son por tanto adecuados para, por ejemplo, la formación de imágenes no invasiva de la biodistribución del virus o la detección de tumores.
Usos médicos
Como se ha analizado anteriormente, la presente invención proporciona los virus recombinantes oncolíticos de la estomatitis vesicular (VSV), los ácidos nucleicos o los vectores de la presente invención o la composición farmacéutica de la presente invención para su uso en medicina.
Como se ha analizado anteriormente, la presente invención proporciona los virus recombinantes oncolíticos de la estomatitis vesicular (VSV), los ácidos nucleicos o los vectores de la presente invención o la composición farmacéutica de la presente invención para su uso en el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento del cáncer.
En una realización, la presente invención proporciona los virus recombinantes oncolíticos de la estomatitis vesicular (VSV), los ácidos nucleicos o los vectores de la presente invención o la composición farmacéutica de la presente invención para su uso en la terapia oncolítica.
El término "viroterapia oncolítica", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al tratamiento del cáncer mediante la administración de virus oncolíticos, ácidos nucleicos que los codifican o de los respectivos vectores para inducir la regresión del tumor.
En una realización, los virus oncolíticos recombinantes de la estomatitis vesicular (VSV), los ácidos nucleicos o los vectores de la presente invención o la composición farmacéutica de la presente invención se proporcionan para su uso en combinación con otras terapias.
Dichas otras terapias pueden ser:
sistemas de soporte celular,
por ejemplo, linfocitos T, células dendríticas, células NK, células madre mesenquimales, inmunoterapias, por ejemplo, vacunas tumorales o inhibidores del punto de control inmunitario, y/o
terapias tumorales convencionales,
por ejemplo, ablación por radiofrecuencia, quimioterapia, embolización, inhibidores de molécula pequeña.
En una realización, la administración es sistémica, intravenosa, intra-arterial, mediante inyección en el tumor y/o mediante inyección intradérmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraósea, intraperitoneal, intratecal, epidural, intracardíaca, intraarticular, intracavernosa, intracerebral, intracerebroventricular e intravítrea.
Procedimientos de diagnóstico, prevención y/o tratamiento del cáncer
Como se ha analizado anteriormente, también se desvela un procedimiento de diagnóstico, prevención y/o tratamiento del cáncer que comprende la etapa de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz del virus oncolítico recombinante, el ácido nucleico o el vector de la presente invención o la composición farmacéutica de la presente invención.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de un virus oncolítico recombinante de la estomatitis vesicular (VSV), un ácido nucleico o un vector de la presente invención es la cantidad que da lugar al resultado terapéutico deseado, en particular la regresión tumoral.
Los virus recombinantes, ácidos nucleicos, vectores o sus composiciones farmacéuticas se administran preferentemente en múltiples ciclos durante un período de tiempo, tal como durante varios días hasta varias semanas. En una realización, la administración es sistémica, intravenosa, intra-arterial, mediante inyección en el tumor y/o mediante inyección intradérmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraósea, intraperitoneal, intratecal, epidural, intracardíaca, intraarticular, intracavernosa, intracerebral, intracerebroventricular e intravítrea.
En una realización, el virus oncolítico recombinante de la estomatitis vesicular (VSV), el ácido nucleico o el vector de la presente invención o la composición farmacéutica de la presente invención se proporcionan para su uso en combinación con otras terapias.
Dichas otras terapias pueden ser:
sistemas de soporte celular,
por ejemplo, linfocitos T, células dendríticas, células NK, células madre mesenquimales, inmunoterapias, por ejemplo, vacunas tumorales o inhibidores del punto de control inmunitario,
y/o
terapias tumorales convencionales,
por ejemplo, ablación por radiofrecuencia, quimioterapia, embolización, inhibidores de molécula pequeña.
Descripción adicional de las realizaciones preferidas
La invención desvela un vector VSV pseudotipado, en el que la glicoproteína endógena se ha eliminado e intercambiado por proteínas de la envoltura modificadas del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV).
Se ha demostrado previamente que una modificación de la proteína de fusión de la cepa Hitchner B1 del NDV mediante la introducción de un sitio de corte de proteasa polibásica (rNDV/F3aa), permite la formación eficiente de sincicios en una amplia gama de células en ausencia de proteasas exógenas (Vigil y col., 2007). Los presentes inventores han demostrado además que una única sustitución de aminoácidos de leucina a alanina en el aminoácido 289 (L289A) en la proteína de fusión modificada por F3aa da lugar a una formación sincitial y a una necrosis tumoral sustancialmente mayor que la del virus que solo porta la mutación F3aa, sin ninguna toxicidad adicional (Altomonte y col., 2010). De acuerdo con la presente invención, se ha insertado dicha proteína F hiperfusogénica modificada, junto con la proteína de fijación Hn del NDV, en el vector de VSV con eliminación de G.
Al crear un híbrido de estos dos potentes vectores oncolíticos, los presentes inventores fusionaron las características positivas de cada virus, al tiempo que se eliminan los problemas de seguridad de cada uno.
El vector resultante tiene la cadena principal del VSV y, por tanto, mantiene el rápido ciclo de replicación del VSV de tipo silvestre. Además, debido a la incorporación de las proteínas HN y F hiperfusogénicas del NDV, el virus recombinante induce una mayor formación de sincicios, lo que permite una eficaz propagación intratumoral del virus y un potente mecanismo de muerte de las células tumorales y de inducción de respuestas inmunitarias antitumorales. Usando esta estrategia, el beneficio de un virus fusogénico puede lograrse sin la amenaza ambiental asociada al NDV.
Adicionalmente, ya que la glicoproteína endógena del VSV se ha eliminado, no debería haber neurotoxicidad asociada al vector. Por último, dado que el NDV se adhiere a las células diana a través de restos de ácido siálico, que están regulados positivamente en las células tumorales (Bull y col., 2014), se puede lograr una focalización transduccional adicional en el tumor con el vector pseudotipado.
Aunque ya se ha informado de que numerosos vectores VSV pseudotipados son más seguros que los VSV de tipo silvestre, nuestra modificación específica del virus difiere en que la sustitución de la proteína de la envoltura del VSV por la del NDV da lugar a un virus más potente, además de ser más seguro.
Además, los presentes inventores introdujeron una versión mutada de la proteína F del NDV para mejorar aún más la eficacia del virus recombinante resultante, sin afectar negativamente a la seguridad.
El beneficio de este intercambio de glicoproteínas es triple:
1. El neurotropismo asociado a la glicoproteína endógena del VSV puede evitarse mediante la supresión de la envoltura del VSV y la introducción de las proteínas de la envoltura del NDV no neurotrópicas;
2. Las células tumorales pueden ser el objetivo mediante la regulación positiva de los restos de ácido siálico, que son el receptor natural del NDV; y
3. La propagación del virus y la eliminación de las células tumorales pueden mejorarse significativamente mediante la introducción de la versión mutante altamente fusogénica de la proteína F del NDV.
Nuestra construcción proporciona simultáneamente mayor seguridad y eficacia.
El virus pseudotipado de la presente invención ofrece una mayor seguridad y una mayor eficacia como ventajas obvias sobre los vectores de tipo silvestre.
Además, también existen ventajas de este vector en particular respecto a los vectores de VSV pseudotipados que se han notificado anteriormente. Aunque el vector VSV-GP (pseudotipado con LCMV-GP) demuestra un perfil de seguridad mejorado, no hay ningún mecanismo terapéutico adicional proporcionado por la glicoproteína del LCMV en comparación con la del NDV (Muik y col., 2011). Aunque el virus del sarampión (VSM) es similar al NDV en el sentido de que es un miembro de la familia de los paramixovirus, y su envoltura también consiste en una hemaglutinina y una proteína de fusión, el vector rVSV-MV (Ayala-Breton y col., 2012) no contiene ninguna modificación para aumentar la fusogenicidad, y es probable que sea menos eficiente que nuestro VSV-NDV hiperfusogénico en la formación de sincicios. Además, MV se adhiere a las células diana mediante tres receptores distintos: CD46, molécula de señal de activación linfocitaria (SLAM) y nectina4. Sin embargo, la infección de las células inmunitarias positivas para SLAM provoca inmunosupresión, y la infección de las células epiteliales de las vías respiratorias positivas para nectina4 provoca la excreción respiratoria y la transmisión del virus, y ambos serían efectos secundarios no deseables de la terapia con virus oncolíticos. Por lo tanto, se han realizado modificaciones para suprimir la interacción de MV H con SLAM y nectina4 (Liu y col., 2014) o para reorientar la proteína de unión a receptores específicos del tumor (Ayala-Breton y col., 2012) en el contexto de los vectores rVSV-MV como estrategias para reorientar el virus pseudotipado al tumor. Sin embargo, estas restricciones al mecanismo natural de fijación de la envoltura del MV seguramente darán lugar a una atenuación del virus recombinante. De hecho, nectina4 y CD46 tienen superficies de unión a receptores sustancialmente superpuestas en MV H, y se demostró que la alteración de la unión de nectina4 comprometía la unión a CD46, resultando en un efecto oncolítico muy disminuido (Liu y col., 2014). Por último, ya que la mayoría de la población humana está vacunada contra el virus del sarampión, los altos niveles de anticuerpos circulantes dirigidos a la envoltura vírica probablemente desempeñen un papel en la neutralización de los vectores rVSV-MV.
Por lo tanto, nuestro vector rVSV-NDV es superior a los vectores pseudotipados anteriormente descritos, debido a su característica hiperfusogénica, falta de inmunidad preexistente en la población general y no se espera una atenuación en comparación con el VSV o el NDV.
Los siguientes ejemplos y dibujos ilustran la presente invención aunque sin limitarla a los mismos.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Construcción recombinante de VSVpseudotipado que expresa la glicoproteína del NDV. La glicoproteína endógena del VSV se eliminó de un plásmido que codifica el genoma completo del VSV. La glicoproteína del NDV, que comprende una proteína de fusión modificada (NDV/F(L289A)) y la hemaglutinina-neuraminidasa (NDV/HN), se insertó como unidades de transcripción individuales entre los genes de la matriz (M) y de la polimerasa grande (L) del VSV. El vector de VSV pseudotipado respectivo se rescató mediante un sistema establecido de genética inversa.
Figura 2. El rVSV-NDV puede replicarse en líneas celulares de CHC y causar una citotoxicidad completa. Las líneas celulares de CHC humano Huh7 (A, B) y HepG2 (C, D) se infectaron con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01 de rVSV, rNDV o rVSV-NDV. Después de 1 hora de infección, las células se lavaron y se añadió medio fresco a las células. En varios momentos posteriores a la infección, se recogieron alícuotas del sobrenadante para medir la citotoxicidad mediante el ensayo de LDH (B, D) y se lisaron monocapas celulares para medir las concentraciones intracelulares mediante el ensayo TCID50 (A, C). Los experimentos se realizaron por triplicado y los datos se presentan como media /- desviación estándar.
Figura 3. La infección por el rVSV-NDV da lugar a una rápida formación de sincicios en las células de CHC. Para evaluar la capacidad del vector rVSV-NDV pseudotipado para inducir la formación de sincicios en las células tumorales, se infectaron varias líneas celulares de c Hc con rVSV-NDV, rNDV o rVSV con una MOI de 0,01 y se observaron microscópicamente en varios puntos de tiempo después de la infección. Se trataron células adicionales como PBS como control. Las células Huh7 se muestran como una línea celular humana representativa de CHC, y las imágenes representativas se capturaron con un aumento de 200x.
Figura 4. El pseudotipado del VSV con las proteínas de la envoltura del NDV no altera la sensibilidad del vector a las acciones antivíricas del IFN.
Para evaluar la sensibilidad del rVSV-NDV al IFN de tipo I, se infectó una línea celular sensible al IFN (A549) con rVSV-NDV, rVSV y rNDV con una MOI de 0,01. Las células se lisaron a las 48 horas después de la infección y se midieron las concentraciones víricas intracelulares mediante el ensayo TCID50. Los experimentos se realizaron por triplicado y se muestran los valores medios /- desviación estándar.
Figura 5. La replicación y la citotoxicidad del rVSV-NDV disminuyen sustancialmente en hepatocitos humanos primarios.
Se infectaron hepatocitos humanos primarios con una MOI de 0,01 con rVSV, rNDV o rVSV-NDV. Los lisados celulares se sometieron a un análisis de TCID50 de los títulos de virus intracelulares en varios puntos de tiempo. Adicionalmente, se recogieron alícuotas del sobrenadante en varios puntos de tiempo para las mediciones de citotoxicidad mediante el ensayo de LDH. Los experimentos se realizaron por duplicado y se muestran las medias /- desviación estándar.
Figura 6. La replicación y la citotoxicidad del rVSV-NDV están sustancialmente disminuidas en neuronas primarias de ratón.
Las neuronas primarias de ratón se infectaron con una MOI de 0,01 con rVSV, rNDV o rVSV-NDV. Los lisados celulares se sometieron a un análisis de TCID50 de los títulos de virus intracelulares en varios puntos de tiempo. En otros pocillos se analizó la viabilidad celular mediante un ensayo estándar de MTS. Los experimentos se realizaron por duplicado y se muestran las medias /- desviación estándar.
Figura 7. El vector rVSV-NDV pseudotipado provoca la muerte celular inmunogénica. Las células Huh7 se infectaron con rVSV, rNDV o rVSV-NDV con una MOI de 0,01 o se infectaron de forma simulada durante 48 horas. Los medios condicionados se concentraron y se sometieron 10 pg de proteína a un análisis de transferencia de Western para detectar la liberación de HMGB1, Hsp70 y Hsp90.
Figura 8. El vector rVSV-NDV pseudotipado demuestra una mayor seguridad en comparación con el rVSV en ratones inmunodeficientes.
Se trató a ratones NOD-SCID macho inmunodeficientes mediante inyección en la vena caudal con rVSV-NDV o rVSV-GFP (citado como rVSV en la figura para simplificar) a una dosis de 106 TCID50. Se controló a diario a los ratones y se les aplicó la eutanasia en los puntos finales humanitarios. Los cambios en el peso corporal se representaron en el tiempo con respecto a la inyección (izquierda); las concentraciones víricas en sangre se midieron en los días 1 y 7 mediante el análisis TCID50 (centro); las proporciones de supervivencia se representaron mediante la curva de supervivencia de Kaplan-Maier (izquierda).
Figura 9. Los ratones tratados con 106 TCID50 de rVSVrevelaron cambios patológicos en el hígado y el cerebro. La tinción con H/E del hígado reveló necrosis de pequeños grupos de hepatocitos tras el tratamiento con rVSV, marcada por la degeneración hepatocelular con cariólisis (panel superior izquierdo). Se observó necrosis aguda en el tronco encefálico tras la aplicación de rVSV con células gliales degeneradas que mostraban picnosis y cariorrexis (panel superior derecho). La degeneración de las células gliales pudo confirmarse además mediante la tinción inmunohistoquímica para caspasa-3 (parte inferior derecha). Se muestran imágenes representativas; las barras de escala equivalen a 50 pm. Se cuantificaron los títulos virales a partir de lisados de tejido cerebral y hepático de los ratones que recibieron el rVSV después de haber demostrado signos de toxicidad. Se muestran las medias EEM.
Ejemplos
1. Material y procedimientos
1.1 Virus
El VSV recombinante que expresa el indicador de GFP (denominado en el presente documento "rVSV") se diseñó y rescató como se describió anteriormente (Huang y col., 2003). El NDV recombinante que porta las mutaciones F3aa(L289A) y que expresa el gen indicador GFP (denominado en el presente documento "rNDV") se diseñó y rescató como se describió anteriormente (Altomonte y col., 2010).
El rVSV-NDV recombinante se produjo modificando primero un plásmido que codifica el genoma completo del VSV (pVSV-XN2) y expresando la proteína de fusión modificada F3aa(L289A) del NDV (Ebert y col., 2004) como una unidad de transcripción adicional entre los genes G y L. La glicoproteína (G) endógena del VSV se eliminó por digestión con las enzimas de restricción MluI y Xhol, que reconocen los sitios de restricción únicos en las regiones no codificantes 5' y 3' de G, respectivamente. Tras la autoligación del plásmido con G eliminada, se insertó un oligonucleótido enlazador corto en el único sitio de restricción de NheI que sigue al gen F del NDV, para crear un sitio de clonación múltiple para la inserción del gen HN. El gen HN se amplificó mediante la PCR a partir de un plásmido que codifica el genoma completo del NDV, utilizando cebadores para introducir sitios de restricción de PacI y Pmel en los extremos 5' y 3' del producto de la PCR, respectivamente, para su inserción en los sitios de restricción recién incorporados en el plásmido VSV-NDV/F3aa(L289A) con G eliminada. El plásmido resultante se sometió a un análisis de la secuencia para confirmar la fidelidad del inserto de la PCR, así como de las secuencias intergénicas de inicio y parada de la transcripción y del orden de los genes. Por último, el virus infeccioso, denominado en el presente documento "rVSV-NDV", se rescató utilizando el sistema de genética inversa establecido para rescatar virus de ARN de cadena negativa (Lawson y col., 1995).
Véase también la figura 1.
1.2 Líneas celulares
Se obtuvieron dos líneas celulares humanas de CHC (HepG2 y Huh-7) del Dr. Ulrich Lauer (Hospital Universitario de Tubinga, Alemania) y se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con un 10 % de suero fetal bovino (FBS), L-glutamina al 1 % (200 mM), penicilina/estreptomicina al 1 %, aminoácidos no esenciales al 1 % y piruvato de sodio al 1 %. Las células A549 se obtuvieron de la ATCC (Rockville, MD) y se cultivaron en el mismo medio que las líneas celulares de CHC. Los hepatocitos humanos primarios procedían de pacientes (negativos al virus de la hepatitis B y C y al virus de la inmunodeficiencia humana) que habían sido sometidos a una resección quirúrgica de tumores hepáticos, de acuerdo con las directrices de la fundación benéfica estatal para la Investigación de Células y Tejidos Humanos (HTCR, por sus siglas en inglés) (Regensburg, Alemania). Los hepatocitos se mantuvieron en medio HepatoZYME-SFM (Gibco-Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Las neuronas corticales primarias embrionarias se disociaron de la corteza de ratones E16.5 y fueron proporcionadas por el laboratorio de Stefan Lichtenthaler (DZNE, Munich, Alemania). Los cultivos neuronales se mantuvieron en medio Neurobasal (Gibco) complementado con B27 (2 %), glutamina 0,5 mM y penicilina/estreptomicina al 1 %. Todas las líneas celulares y las células primarias se mantuvieron en la incubadora humidificada a 37 °C con un 5 % de CO2.
1.3 Análisis microscópico
Las líneas celulares humanas de CHC, Huh7 y HepG2, se colocaron en placas de 6 pocillos a una confluencia de aproximadamente el 90 % y se infectaron con rVSV, rNDV o rVSV-NDV con una MOI de 0,01 o se infectaron de manera simulada. Las células se visualizaron con un aumento de 200x en un microscopio Axiovert 40CFL (Zeiss) a las 16, 24 y 48 horas después de la infección y se capturaron imágenes representativas con una cámara Canon Powershot A620 acoplada al microscopio.
1.4 Ensayo de respuesta a la dosis de IFN
Las células A549 sensibles al interferón se colocaron en placas de 24 pocillos a una densidad de 105 células por pocillo y se cultivaron durante una noche. Al día siguiente por la tarde se pretrataron con diferentes concentraciones (0, 100, 500 y 1000 UI/ml) de Interferón Universal tipo I añadido directamente al medio de cultivo. Después de la incubación durante la noche, las células fueron infectadas con rVSV, rNDV o rVSV-NDV con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01 48 horas después de la infección, las células se recogieron en 100 ml de PBS y se lisaron mediante tres ciclos de congelación y descongelación. La concentración intratumoral del virus se determinó mediante el análisis de TCID50 de los lisados celulares.
1.5 Curvas de crecimiento (ensayo de TCID50)
Se realizaron curvas de crecimiento viral en líneas celulares de CHC (Huh7 y HepG2), así como en hepatocitos humanos primarios y neuronas primarias de ratón.
Las líneas celulares de CHC se colocaron en placas de 6 pocillos a una densidad de 3,5x105 células por pocillo, mientras que las PHH y las neuronas se sembraron en placas de 24 pocillos recubiertas de colágeno a una densidad de 105 células por pocillo. Cada línea celular fue infectada con rVSV, rNDV y rVSV-NDV con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01. Las infecciones se realizaron en 1 ml de PBS (placas de 6 pocillos) o 250 pl de PBS (placas de 24 pocillos) a 37 °C durante 1 hora. Después de la incubación, las células se lavaron tres veces con PBS y se añadió medio fresco. El lisado celular se recogió a las 0, 16, 24, 48 y 72 horas después de la infección para el análisis de TCID50 de los títulos de virus intracelulares.
1.6 Ensayos de citotoxicidad (ensayo de LDH o MTS)
La viabilidad celular de las líneas celulares de CHC infectadas (Huh7 y HepG2) y de los hepatocitos humanos primarios se analizó midiendo la lactato deshidrogenasa (LDH) liberada en el sobrenadante del cultivo celular. Las células se colocaron en placas, se infectaron y se lavaron como en los experimentos de la curva de crecimiento. A las 24, 48 y 72 horas después de la infección, se recogieron alícuotas del sobrenadante y se cuantificó la liberación de LDH mediante el protocolo del ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96 (Promega). Para cada punto de tiempo, La liberación de LDH tras la infección por el virus se calculó como un porcentaje del control de liberación máxima de LDH. Los niveles de LDH detectados en el sobrenadante de las células tratadas de manera simulada se restaron de los valores obtenidos en los pocillos experimentales.
La viabilidad celular de las neuronas se analizó mediante el ensayo MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio) utilizando el ensayo de proliferación celular CellTiter96 AQueous One Solution (Promega, Madison, WI). Las neuronas se sembraron en placas de 96 pocillos recubiertas de colágeno a una densidad de 5x104 células/pocillo y se trataron de manera simulada o se infectaron con rVSV, rNDV o rVSV-NDV con una MOI de 0,01. A las 24, 48 y 72 horas después de la infección, la viabilidad de las células se midió según el protocolo del fabricante. La citotoxicidad se calculó como la diferencia en la viabilidad celular de las muestras experimentales en comparación con los controles no infectados.
1.7 Transferencias de Western
Las células Huh7 se colocaron en placas de 6 pocillos con una confluencia de aproximadamente el 90 % y se infectaron con el rVSV, rNDV o rVSV-NDV con una MOI de 0,01 o se infectaron de forma simulada durante 48 horas. Los medios condicionados se recogieron y concentraron hasta aproximadamente 200 pl utilizando filtros de centrifugación Amicon Ultra con un corte de 10kD (Merck Millipore, Billerica, MA). Las concentraciones de proteína se cuantificaron usando el ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), y se cargaron 10 pg de cada muestra en un gel de SDS-PAGE desnaturalizante al 7,5 %, seguido de la transferencia a una membrana de nitrocelulosa. Las bandas de proteínas se detectaron utilizando anticuerpos específicos contra HMGB1 y Hsp90 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) y Hsp70 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) y el anticuerpo secundario adecuado conjugado con peroxidasa de rábano picante. Las bandas se visualizaron con el reactivo de detección de transferencia de Western Amersham ECL Prime (GE Healthcare Life Sciences), Pittsburgh, PA).
2. Resultados
Se ha caracterizado la replicación y la citotoxicidad in vitro del vector recombinante VSV-NDV (figura 1) en células tumorales, así como en hepatocitos y neuronas sanos. Se utilizaron dos líneas celulares de carcinoma hepatocelular humano (CHC) como células tumorales representativas y se comparó el rVSV-NDV con el rVSV y el rNDV en cuanto a su capacidad relativa de replicación y muerte de las células. Aunque la replicación del rVSV-NDV se retrasó un poco en comparación con los vectores de tipo silvestre, fue capaz de alcanzar concentraciones similares aproximadamente a las 72 horas después de la infección, lo que provocó la muerte completa de las células in vitro (figura 2).
Para observar la formación sincitial inducida por el virus, se infectaron células adicionales con rVSV-NDV, así como el rVSV y el rNDV precursores, para la fotomicroscopía. El análisis microscópico de las células tumorales reveló múltiples focos de sincicios en los pocillos infectados con rVSV-NDV a las 16 horas después de la infección, mientras que se retrasó significativamente en los infectados por el rNDV. Como cabía esperar, las células tratadas con rVSV no formaron sincicios; sin embargo, eran muy susceptibles al efecto citopático (ECP), que es clásico de la infección por el VSV y se produjo antes de las 16 horas después de la infección (figura 3).
Para descartar que el intercambio de glicoproteínas haya provocado inadvertidamente una pérdida de sensibilidad del vector a las acciones antivíricas del interferón de tipo I (FN), se realizó una respuesta a la dosis de IFN. La elevada sensibilidad del VSV al IFN de tipo I es un mecanismo clave de especificidad tumoral, ya que las células tumorales suelen tener defectos en sus vías de señalización de IFN, mientras que las células sanas pueden eliminar eficazmente el virus a través de los genes que responden al IFN. Aunque este ensayo reveló una relativa insensibilidad del rNDV al IFN de tipo I, el vector rVSV-NDV se atenuó rápidamente con la adición de IFN y se redujo a niveles similares a los observados para el rVSV (figura 4).
A continuación, realizamos curvas de crecimiento y ensayos de citotoxicidad en hepatocitos humanos primarios normales y neuronas de ratón para evaluar la seguridad del rVSV-NDV. Se observó muy poca replicación del vector pseudotipado a lo largo del tiempo, y las concentraciones fueron aproximadamente 5 log más bajas que el vector VSV de control a las 48 horas después de la infección y 3 log más bajas que el rNDV en el mismo punto de tiempo en hepatocitos primarios (figura 5). Aunque casi todos los hepatocitos estaban muertos a las 72 horas después de la infección con rVSV, no se observó citotoxicidad mediante el ensayo de LDH en las células infectadas con rVSV-NDV (figura 5). De manera similar, las concentraciones de rVSV-NDV fueron significativamente inferiores a las del vector VSV de control en las neuronas primarias de ratón en todos los puntos temporales investigados, que correspondían a niveles de viabilidad celular similares a los observados en las neuronas tratadas con PBS (figura 6). Tomados en conjunto, el rVSV-NDV mostró pocas evidencias de replicación en células primarias sanas y dio como resultado poca o ninguna citotoxicidad in vitro, lo que indica que es un virus sustancialmente más seguro que el rVSV y el rNDV.
Para determinar si el vector rVSV pseudotipado induciría una muerte celular inmunogénica, como se ha demostrado para el rNDV mediante la formación de sincicios, investigamos la liberación de la caja 1 del grupo de alta movilidad (HMGB1) y de las proteínas de choque térmico 70 y 90 de las células Huh7 infectadas. Después de 48 hora de infección, observamos niveles relativamente bajos de HMGB1, Hsp70 y Hsp90 liberados en el sobrenadante de las células infectadas por el rVSV. Sin embargo, la infección tanto con el rNDV como con el rVSV-NDV dio lugar a altos niveles de los tres marcadores secretados para la muerte celular inmunogénica (figura 7). Estos resultados indican que, además de la potente citotoxicidad directa causada por la infección con el vector pseudotipado del rVSV-NDV, el tratamiento in vivo con este virus podría dar lugar a importantes respuestas inmunitarias dirigidas contra el tumor.
Para evaluar la seguridad del vector rVSV-NDV pseudotipado in vivo, se trataron ratones macho NOD-SCID inmunodeficientes de aproximadamente 8 semanas de edad mediante inyección en la vena caudal con el virus rVSV-NDV o con el virus rVSV-GFP de control (N = 6) a una dosis de TCID50 por ratón. Se controló a diario el peso corporal y el aspecto físico general de los ratones, y se les aplicó la eutanasia en los puntos finales de forma humanitaria. Se tomaron muestras de sangre los días 1, 3, 7, 14 y en el momento de la eutanasia para analizar la bioquímica sérica y las concentraciones de virus en circulación. Dos ratones que recibieron rVSV-GFP empezaron a perder peso rápidamente durante la primera semana después del tratamiento, y los seis murieron de forma aguda o se les aplicó la eutanasia debido a la extrema pérdida de peso corporal, deshidratación, signos de malestar (cambios de postura, movimiento deteriorado, aislamiento, etc.) y/o signos de neurotoxicidad (parálisis de las extremidades y movimientos en círculos) entre 11 y 17 días después del tratamiento (figura 8). Adicionalmente, se pudieron recuperar concentraciones de virus infecciosos de la sangre el día 1 y 7 después del tratamiento (figura 8, centro). Por el contrario, los ratones que recibieron rVSV-NDV solo perdieron cantidades insignificantes de peso, parecían sanos y mostraron un comportamiento normal durante todo el estudio. A tres de estos ratones se les practicó la eutanasia a los 21 días del tratamiento para realizar un análisis histológico de los órganos principales, mientras que se controló al resto de los animales durante 60 días después del tratamiento, momento en el que se les practicó la eutanasia para el análisis patológico. No se pudieron detectar concentraciones de virus infecciosos en la sangre de los ratones tratados con rVSV-NDV en ninguno de los puntos temporales analizados. Las mediciones plasmáticas de la función hepática (GPT) y de la función renal (BUN y creatinina) no revelaron valores anormales en ninguno de los dos grupos de tratamiento (datos no mostrados).
Las secciones de tejido fueron examinadas por un patólogo que no conocía los grupos de tratamiento de las muestras. El análisis histológico no reveló hallazgos patológicos importantes en el tejido extirpado de los ratones tratados con rVSV-NDV, a los que se practicó la eutanasia en el día 21 o en el día 60. Además, no se pudieron observar concentraciones detectables en el tejido cerebral o hepático en los ratones tratados con rVSV-NDV (datos no mostrados). En marcado contraste, los ratones que recibieron rVSV-GFP a la misma dosis mostraron un fuerte edema intrasinusoidal, hepatitis aguda moderada con necrosis unicelular y de pequeños grupos y apoptosis del tejido hepático (figura 9). Además, se observó necrosis aguda en el tronco encefálico, con células gliales degeneradas que presentaban picnosis y cariorrexis. La degeneración de las células gliales se confirmó además mediante la tinción inmunohistoquímica para caspasa-3. El análisis de TCID50 de los lisados de tejidos reveló concentraciones cuantificables de VSV infeccioso en el hígado y el cerebro en el momento de la necropsia.
REFERENCIAS
Altomonte, J., L. Wu, y col. (2008). "Exponential enhancement of oncolytic vesicular stomatitis virus potency by vector-mediated suppression of inflammatory responses in vivo". Mol Ther 16(1): 146-153.
Altomonte, J., S. Marozin, y col. (2010). "Engineered newcastle disease virus as an improved oncolytic agent against hepatocellular carcinoma". Mol Ther 18(2): 275-284.
Ayala-Breton, C., G. N. Barber, y col. (2012). "Retargeting vesicular stomatitis virus using measles virus envelope

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un virus oncolítico recombinante de la estomatitis vesicular (VSV),
en el que se elimina la glicoproteína (proteína G) del VSV, y que comprende
una proteína de fusión modificada (proteína F) del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV); y la proteína hemaglutinina neuraminidasa (HN) del NDV, en el que la proteína de fusión modificada (proteína F) del n Dv es la proteína modificada con F3aa,
o en el que la proteína de fusión modificada (proteína F) del NDV es la proteína modificada con F3aa y comprende al menos una sustitución de aminoácidos en el sitio de escisión de la proteasa,
preferentemente en la posición L289, por ejemplo, L289A.
2. El virus oncolítico recombinante de la estomatitis vesicular (VSV) de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la proteína G del VSV se sustituye por la proteína de fusión modificada y la proteína HN del NDV.
3. El virus oncolítico recombinante de la estomatitis vesicular (VSV) de la reivindicación 1 o 2, en el que la proteína de fusión modificada (proteína F) del NDV comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12,
o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 60 %, o preferentemente al menos un 70 % o un 80 % o un 90 % o un 95 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 10 o 12, y/o en el que la proteína de fusión modificada (proteína F) del NDV está codificada por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 11,
o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 %, o preferentemente al menos un 70 % o un 80 % o un 90 % o un 95 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO: 9 u 11;
y/o en el que la proteína HN del NDV comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 60 %, o preferentemente al menos un 70 % o un 80 % o un 90 % o un 95 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6,
y/o en el que la proteína HN del NDV está codificada por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 %, o preferentemente al menos un 70 % o un 80 % o un 90 % o un 95 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5.
4. Un ácido nucleico que codifica un virus oncolítico de la estomatitis vesicular (VSV) recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 4,
que además comprende opcionalmente
- uno o más genes indicadores,
tales como HSV1-sr39TK, el simportador de yoduro de sodio (NIS), el receptor de somatostatina 2 (SSTR2), luciferasa (de luciérnaga o Renilla), proteína fluorescente verde (GFP), lacZ, tirosinasa,
- uno o más genes que se suministrarán a las células o al tejido diana,
tales como los uno o más genes que se suministrarán a las una o más células tumorales o a los uno o más tumores, por ejemplo,
genes inmunoestimuladores, tales como IFN-a, IFN-p o factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF);
anticuerpos inhibidores de punto de control inmunitario, tales como PD-1, PD1-L, CTLA-4, LAG-3 o B7-H3; y/o antígenos asociados al tumor (TAA) para la vacunación (específicos para el tumor diana);
- o combinaciones de los mismos.
6. El ácido nucleico de la reivindicación 4 o el vector de la reivindicación 5, que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13,
o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 %, o preferentemente al menos un 70 % o un 80 % o un 90 % o un 95 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13,
y/o que comprenden o consiste en la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con las SEQ ID NO: 6, 12, 14 a 17,
o una secuencia de nucleótidos que tenga al menos un 60 %, o preferentemente al menos un 70 % o un 80 % o un 90 % o un 95 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con las SEQ ID NO: 6, 12, 14 a 17.
7. Una composición farmacéutica, que comprende
(i) el virus oncolítico recombinante de la estomatitis vesicular (VSV) de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el ácido nucleico o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6; y
(ii) opcionalmente, uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.
8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, que comprende otro(s) fármaco(s),
tales como
agente(s) quimioterapéutico(s),
agente(s) radioterapéutico(s),
vacuna(s) tumoral(es),
inhibidor(es) del punto de control inmunitario,
sistema(s) de soporte celular,
inhibidor(es) de molécula pequeña,
agente(s) de embolización,
polímero(s) de recubrimiento.
9. La composición farmacéutica de la reivindicación 7 u 8, formulada para administración sistémica, inyección en el tumor, administración intravenosa, administración intraarterial,
y/o para inyección intradérmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraósea, intraperitoneal, intratecal, epidural, intracardíaca, intraarticular, intracavernosa, intracerebral, intracerebroventricular e intravítrea.
10. Uso del virus oncolítico recombinante de la estomatitis vesicular (VSV) de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el ácido nucleico o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, como herramienta de suministro de genes, de formación de imágenes (no invasiva) de la biodistribución del virus y/o para la detección de tumores.
11. El virus oncolítico recombinante de la estomatitis vesicular (VSV) de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el ácido nucleico o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 para su uso en medicina.
12. El virus oncolítico recombinante de la estomatitis vesicular (VSV) de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el ácido nucleico o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 para su uso en el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento del cáncer.
13. El virus oncolítico recombinante de la estomatitis vesicular (VSV), el ácido nucleico, el vector o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en terapia oncolítica.
14. El virus oncolítico recombinante de la estomatitis vesicular (VSV), el ácido nucleico, el vector o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en combinación con otras terapias, tales como sistemas de soporte celular,
por ejemplo, linfocitos T, células dendríticas, células NK, células madre mesenquimales, inmunoterapias, por ejemplo, vacunas tumorales o inhibidores del punto de control inmunitario,
y/o
terapias tumorales convencionales,
por ejemplo, ablación por radiofrecuencia, quimioterapia, embolización, inhibidores de molécula pequeña, y/o en el que la administración es sistémica, intravenosa, intra-arterial, mediante inyección en el tumor y/o mediante inyección intradérmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraósea, intraperitoneal, intratecal, epidural, intracardíaca, intraarticular, intracavernosa, intracerebral, intracerebroventricular e intravítrea.
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