ES2539619T3

ES2539619T3 - Partículas compuestas, conjugados derivados, procedimiento de preparación y aplicaciones

Info

Publication number: ES2539619T3
Application number: ES02732849.1T
Authority: ES
Inventors: Abdelhamid Elaissari; Franck Montagne; Eric Bosc; Christian Pichot; Bernard Mandrand; Jérôme Bibette; Olivier Mondain-Monval
Original assignee: Biomerieux SA; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Biomerieux SA; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2001-05-10
Filing date: 2002-05-06
Publication date: 2015-07-02
Anticipated expiration: 2022-05-06
Also published as: JP2004533530A; US20040115433A1; JP4272513B2; FR2824563B1; EP1397429B1; US7217457B2; FR2824563A1; WO2003004559A1; CA2445824A1; EP1397429A1

Abstract

Partículas compuestas que comprenden un núcleo de un polímero hidrófobo y unas nanopartículas inorgánicas, constituyendo dicho polímero hidrófobo una matriz polimérica en cuyo interior las nanopartículas inorgánicas están estabilizadas y distribuidas de manera homogénea, estando dichas partículas caracterizadas por que están por lo menos parcialmente rodeadas por un copolímero anfífilo que comprende una parte hidrófoba y una parte hidrófila, y cuya parte hidrófoba está por lo menos parcialmente inmovilizada sobre o en dicha matriz polimérica, - siendo la matriz polimérica una matriz de tipo polímero vinilaromático hidrófobo seleccionada de entre los homopolímeros de monómeros vinilaromáticos insolubles en agua, tales como estireno, metilestireno, etilestireno, tercio-butil-estireno, viniltolueno, así como los copolímeros de estos monómeros entre sí y/o con otros comonómeros, tales como los acrilatos de alquilo o los metacrilatos de alquilo en los que el grupo alquilo comprende de 3 a 10 átomos de carbono, los ésteres de ácidos etilénicos que poseen 4 o 5 átomos de carbono y de alquilo que poseen de 1 a 8 átomos de carbono, los ácidos metacrílicos, los derivados estirénicos, los compuestos diénicos, - siendo la parte hidrófoba del copolímero anfífilo seleccionada de entre los poliestirenos, los polialquilos tales como el polietileno, las cadenas de ácidos grasos, - siendo la parte hidrófila del copolímero anfífilo seleccionada de entre los poliácidos acrílicos, los polisulfatos, las poliaminas, las poliamidas, los polisacáridos.

Description

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DESCRIPCIÓN

Partículas compuestas, conjugados derivados, procedimiento de preparación y aplicaciones.

La presente invención tiene por objeto unas partículas compuestas, su procedimiento de preparación y sus utilizaciones.

Las microesferas de tipo polímero presentan una ventaja como soporte, vector o vehículo en los campos de la ingeniería biológica, del diagnóstico y de la farmacia. Con este propósito, se han utilizado en el diagnóstico médico como soporte sólido para moléculas biológicas.

Las partículas coloidales presentan varias ventajas con respecto a los soportes sólidos tradicionales, tales como tubos, placas, bolas, en particular porque permiten disponer de una gran superficie para interacciones específicas y porque son fácilmente modificables químicamente para introducir en su superficie unos grupos funcionales susceptibles de reaccionar con otras moléculas, por ejemplo unas moléculas biológicas, tales como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, proteínas, polipéptidos, polinucleótidos, ácidos nucleicos, fragmentos de ácidos nucleicos, enzimas o moléculas químicas, tales como catalizadores, medicamentos, moléculas jaula, quelantes.

Entre las partículas coloidales, los látex magnéticos han suscitado un gran interés en el campo analítico y se utilizan, por ejemplo, como medio para separar y/o detectar unos analitos, tales como antígenos, anticuerpos, moléculas bioquímicas, ácidos nucleicos y otros.

Las partículas compuestas de tipo polímero/magnético están clasificadas habitualmente en tres categorías según un criterio de tamaño: teniendo las pequeñas partículas un diámetro inferior a 50 nm, teniendo las grandes partículas un diámetro superior a 2 µm y las partículas intermedias un diámetro comprendido entre 50 y 1000 nm.

Pero, para que se puedan considerar como buenos candidatos, en particular para una aplicación diagnóstica, deben responder a algunos criterios. Desde un punto de vista morfológico, es preferible que sean relativamente esféricas y que la carga magnética esté repartida de manera relativamente homogénea en la matriz polimérica. No deben agregarse de manera irreversible bajo la acción de un campo magnético, lo que significa que pueden ser redispersadas fácil, rápidamente y de manera reversible. Asimismo, deben presentar una densidad relativamente baja para reducir el fenómeno de sedimentación. Ventajosamente, deben presentar una distribución granulométrica estrecha. Se habla también de partículas monodispersas o isodispersas.

Así, debido a su tamaño y su densidad, las grandes partículas magnéticas en suspensión en una fase líquida tienden a sedimentar rápidamente. Por otra parte, tienden a agregarse después de haber sido sometidas a un campo magnético, ya que son susceptibles de haber sido por lo tanto magnetizadas de manera permanente (imantación remanente). Por lo tanto, no constituyen un buen candidato.

Por el contrario, las pequeñas partículas magnéticas tienden a quedarse en suspensión debido a su movimiento browniano y son difícilmente atraídas, incluso nada, por un imán, en particular si el campo magnético aplicado es relativamente bajo. Por lo tanto no son muy apropiadas para las utilizaciones desarrolladas anteriormente.

Existe por lo tanto un interés evidente para producir unas partículas compuestas de tipo polímero/magnético, que presentan un tamaño intermedio de entre 50 y 100 nm, que evitan al mismo tiempo los inconvenientes antes citados y responden a los criterios establecidos anteriormente. Pero la invención no se limita a partículas compuestas magnetizables, como se describe a continuación.

La solicitud de patente EP-A-0 390 634 describe unas microesferas compuestas magnetizables de polímero vinilaromático reticulado hidrófobo de un diámetro del orden de 50 a 10000 nm y que comprenden un núcleo sólido constituido por partículas magnetizables y por una corteza constituida por un copolímero hidrófobo derivado de por lo menos un monómero vinilaromático hidrófobo y de por lo menos un polímero emulsionante polietilénicamente insaturado soluble en el o los monómeros vinilaromáticos y susceptible de reticular con dicho o dichos monómeros. Sin embargo, a pesar de que pueden responder a la exigencia del tamaño, adolecen del inconveniente de no tener una distribución homogénea de la carga magnética que está localizada en el interior del núcleo. Por otro lado, y como se destaca de las figuras adjuntas, las partículas no son homogéneas en tamaño. Se trata por lo tanto de un conjunto de partículas polidispersas que deberán ser seleccionadas por aplicación de un campo magnético para retener sólo las partículas de tamaño esperado.

Se pueden citar asimismo las partículas Dynal (nombre comercial). Estas partículas son unas microesferas constituidas por un núcleo poroso de poliestireno y de óxidos de hierro, habiéndose depositado los óxidos de hierro por impregnación a nivel de los poros disponibles en la superficie del poliestireno, y por una envoltura de otro polímero que encapsula los óxidos de hierro de las microesferas porosas. Presentan un diámetro respectivamente de 2,8 µm (partículas M280) y de 4,5 µm (partículas M450) y son relativamente uniformes en tamaño. Por lo tanto son consideradas como unas partículas isodispersas pero, debido a su tamaño elevado, presentan los inconvenientes antes citados, principalmente el fenómeno de sedimentación. Además, su superficie específica es

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débil.

El documento US-A-4.358.388 describe unas partículas compuestas constituidas por una matriz polimérica en la que una carga magnética está distribuida de manera homogénea. Se obtienen por polimerización de un monómero orgánico insoluble en agua, en una fase orgánica que contiene la carga magnética, estando dicha fase orgánica en emulsión en una fase acuosa en presencia de un agente tensioactivo.

Unas partículas de este tipo constituyen en biología unos soportes similares a los evocados anteriormente de tipo tubos, placas o bolas, con una ventaja suplementaria que reside en su capacidad a ser aisladas fácilmente mediante la aplicación de un campo magnético.

Sin embargo, su utilización en este campo de aplicación sigue siendo bastante limitada ya que estas partículas no presentan ninguna funcionalización.

Según la invención, se dispone ahora de nuevas partículas compuestas que aportan una solución a los problemas planteados por las partículas conocidas descritas anteriormente, y que responden a los criterios siguientes:

-partículas esféricas isodispersas,

-partículas que poseen una carga inorgánica distribuida de manera homogénea en el núcleo,

-partículas de tamaño intermedio, a saber que tiene un diámetro comprendido entre 50 y 1000 nm.

-partículas funcionalizadas o funcionalizables,

-la carga inorgánica puede ser magnética o magnetizable,

-partículas obtenidas mediante un procedimiento de síntesis simple y controlable.

Las partículas compuestas de la invención son unas partículas compuestas tales como se reivindican en las reivindicaciones 1 a 13 que comprenden un núcleo de un polímero hidrófobo y unas nanopartículas inorgánicas, constituyendo dicho polímero hidrófobo una matriz polimérica en el interior de la cual las nanopartículas inorgánicas son estabilizadas y distribuidas de manera homogénea, siendo dichas partículas por lo menos parcialmente rodeadas por un copolímero anfífilo que comprende una parte hidrófoba y una parte hidrófila y cuya parte hidrófoba está por lo menos parcialmente inmovilizada sobre o en dicha matriz polimérica.

Según una variante de la invención, las partículas están completamente rodeadas por el copolímero anfífilo y/o la totalidad de la parte hidrófoba del copolímero anfífilo está inmovilizada sobre o en la matriz polimérica.

Se comprende según la invención un copolímero anfífilo, como un copolímero que posee una parte hidrófoba y una parte hidrófila, entendiéndose que la parte hidrófoba y/o la parte hidrófila pueden ser un conjunto de subpartes respectivamente hidrófobas y/o hidrófilas constitutivas del copolímero anfífilo. Así, un copolímero anfífilo de la invención se selecciona en particular de entre los copolímeros en bloques, los copolímeros secuenciados, los polímeros ramificados cuyo esqueleto es hidrófobo o hidrófilo y las ramificaciones son respectivamente hidrófilas o hidrófobas, los polímeros en peine cuyo esqueleto es hidrófobo o hidrófilo y las ramificaciones en peine son respectivamente hidrófilas o hidrófobas.

La parte hidrófila del copolímero anfífilo puede ser iónica, aniónica o catiónica, o no iónica; comprende unos grupos funcionales que son reactivos, directa o indirectamente.

Según la invención, la parte hidrófoba está por lo menos parcialmente inmovilizada sobre o en la matriz polimérica. La inmovilización de esta parte hidrófoba es siempre por lo menos de naturaleza física, y más precisamente mecánica, de tipo aprisionamiento, y puede complementar una fijación previa de la parte hidrófoba, de naturaleza química o física como una fijación por adsorción, por ejemplo. Así, una inmovilización puede resultar de los eventos siguientes:

-la parte hidrófoba del copolímero anfífilo es adsorbida en la superficie de la matriz, y después inmovilizada definitivamente en la matriz por el polímero hidrófobo;

-dicha parte hidrófoba está solubilizada en la fase orgánica, y después aprisionada en el polímero hidrófobo cuando tiene lugar la formación de la matriz;

-dicha parte hidrófoba está únicamente aprisionada mecánicamente durante la formación de la matriz polimérica.

Esta inmovilización lleva a unas partículas que poseen una fuerte estabilidad, y en particular muy superior a la de las partículas conocidas descritas anteriormente.

Un copolímero anfífilo apropiado comprende ventajosamente:

-una parte hidrófoba seleccionada de entre los poliestirenos, los polialquilos tales como el polietileno, las

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cadenas de ácidos grasos, y/o

-una parte hidrófila seleccionada de entre los poliácidos acrílicos, los polisulfatos, las poliaminas, las poliamidas, los polisacáridos.

Los materiales inorgánicos que constituyen las nanopartículas se seleccionan de entre los óxidos metálicos, tales como los óxidos de hierro, de titanio, de cromo, de cobalto, de zinc, de cobre, de manganeso, de níquel y en particular se seleccionan de entre los óxidos metálicos magnetizables, tales como los óxidos de hierro, la magnetita, la hematita; las ferritas tales como las ferritas de manganeso, de níquel, de manganeso-zinc; las aleaciones de cobalto, de níquel.

Ventajosamente, los materiales inorgánicos se seleccionan de entre los óxidos metálicos magnetizables, preferentemente los óxidos de hierro.

Las nanopartículas inorgánicas representan del 5 al 95%, preferentemente del 10 al 90% y ventajosamente del 20 al 90% en masa con respecto a la masa total de la partícula compuesta, preferentemente del 25 al 85%.

En el interior de las partículas de la invención, las nanopartículas son estabilizadas por unos agentes de estabilización seleccionados de entre las cadenas de polímero anfífilos, los agentes tensioactivos iónicos o no iónicos, funcionales o no funcionales, polimerizables o no polimerizables. Los agentes tensioactivos funcionales se seleccionan en particular de entre los ácidos grasos o de unos derivados de ácidos grasos, en particular el ácido oleico o sus derivados, y las mezclas de agentes tensioactivos tales como se han definido anteriormente.

Los polímeros hidrófobos apropiados de la matriz son los polímeros de tipo vinilaromático hidrófobo, es decir los homopolímeros de monómeros vinilaromáticos insolubles en agua, tales como estireno, metilestireno, etilestireno, tercio-butil-estireno, viniltolueno, así como los copolímeros de estos monómeros entre sí y/o con otros comonómeros, tales como los acrilatos y los metacrilatos de alquilo en los que el grupo alquilo comprende de 3 a 10 átomos de carbono, los ésteres de ácidos etilénicos que poseen 4 o 5 átomos de carbono y de alquilo que poseen de 1 a 8 átomos de carbono, los ácidos metacrílicos, los derivados estirénicos, los compuestos diénicos. Preferentemente, el polímero es un polímero reticulado. Esto se obtiene añadiendo en el o los monómeros una baja cantidad (inferior al 10% en peso) de moléculas que tienen por lo menos dos dobles enlaces reactivos, tales como el divinilbenceno, el metacrilato de vinilo, el cianurato de trialilo, el diacrilato de mono o de polietilenglicol.

Las partículas compuestas de la invención pueden también incluir un marcador, tal como un marcador radioactivo, entendiéndose que el marcador está introducido cuando tiene lugar la preparación de la emulsión, tal como se describe en el ejemplo 1 siguiente.

Las partículas de la invención presentan un diámetro del orden de aproximadamente 50 a 1000 nm, preferentemente de aproximadamente 100 a 500 nm, y ventajosamente de aproximadamente 100 a 250 nm. Este diámetro está definido a más o menos aproximadamente el 5%, lo que significa que su diámetro medio en volumen está definido a más o menos aproximadamente el 5%.

La presente invención tiene asimismo por objeto un procedimiento de preparación de las partículas compuestas antes citadas que permite obtener directamente unas partículas de diámetro deseado e isodispersas sin la necesidad de una etapa de selección en función del diámetro.

Según un primer procedimiento de la invención, tal como se reivindica en las reivindicaciones 14 y 15 y 18 a 29, se obtienen unas partículas compuestas para las cuales la parte hidrófoba del copolímero anfífilo está por lo menos parcialmente inmovilizada en la matriz polimérica, de la siguiente manera:

(i): se dispone de una emulsión de partida estable e isodispersa constituida por dos fases no miscibles, una fase A hidrófoba constituida por gotitas que contienen unas nanopartículas inorgánicas dispersadas en una fase orgánica que contiene un agente tensioactivo; y una fase B hidrófila en la que está dispersada la fase A;

(ii): se introducen en la fase B unos monómeros hidrófobos y por lo menos un agente cebador; y

(iii) se polimerizan dichos monómeros hidrófobos en el interior de la fase A,

y, según este procedimiento, se introduce además, en la fase B, por lo menos un copolímero anfífilo, antes de la etapa (iii), es decir antes o después de la etapa (ii).

Según un segundo procedimiento de la invención, tal como se reivindica en las reivindicaciones 16 a 29, se obtienen unas partículas compuestas para las cuales la parte hidrófoba del copolímero anfífilo está por lo menos parcialmente inmovilizada sobre la matriz polimérica, de la siguiente manera:

(i) se dispone de una emulsión de partida estable e isodispersa constituida por dos fases no miscibles, una fase

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A hidrófoba constituida por gotitas que contienen unas nanopartículas inorgánicas dispersas en una fase orgánica que contiene un agente tensioactivo; y una fase B hidrófila en la que la fase A está dispersada;

(ii) se introducen en la fase B unos monómeros hidrófobos y por lo menos un agente cebador; y

(iii) se polimerizan dichos monómeros hidrófobos en el interior de la fase A,

y, según este procedimiento, se introduce además, en la fase B, por lo menos un copolímero anfífilo, antes de la etapa (iii), o después de la etapa (iii), y después, durante una etapa (iv), se polimeriza la fracción restante de los monómeros hidrófobos en la superficie de la matriz polimérica. Cuando el copolímero anfífilo está introducido antes de la etapa (iii), se puede introducir antes o después de la etapa (ii).

Para obtener las partículas compuestas según los procedimientos de la invención, el polímero anfífilo se selecciona ventajosamente de entre los enunciados anteriores en la descripción de las partículas compuestas.

Los monómeros utilizados deben formar unos polímeros hidrófobos. Son insolubles en la fase hidrófila y están seleccionados de entre los monómeros vinilaromáticos, tales como estireno, metilestireno, etilestireno, tercio-butilestireno, amino-metilestireno, viniltolueno. Se utilizan solos o en mezcla, o también en mezcla con otros monómeros polimerizables insolubles en agua tales como los acrilatos, los metacrilatos de alquilo, los ésteres de ácidos etilénicos y de alquilo, los ácidos metacrílicos, los derivados estirénicos, los ácidos etilénicos, los compuestos diénicos.

Es posible añadir al monómero o a la mezcla de monómeros un agente de reticulación hidrófobo, por ejemplo un monómero reticulante de tipo divinilbenceno, dimetacrilato, en particular dimetacrilato de vinilo.

El cebador organosoluble se selecciona de entre los cebadores de tipo azobis, tales como 2,2'-azobis(2,4dimetilvaleronitrilo), 2,2'-azobis(4-metoxi-2,4-dimetilvaleronitrilo), 2,2'-azobis(2-ciclopropilpropionitrilo), 2,2'-azobis(2metilpropionitrilo), 2,2'-azobis(2-metilbutironitrilo), 1,1'-azobis(ciclohexano-1-carbonitrilo), 1-((1-ciano-1metiletil)azo)formamida, 2-fenilazo-4-metoxi-2,4-dimetil-valeronitrilo, 2,2'-azobis(2-metilpropionato de dimetilo, 4,4'azobis(4-ácido cianovalérico) y 2,2'-azobis(2-(hidroximetil)propionitrilo). Si se selecciona un cebador hidrosoluble o poco hidrosoluble, tales como los peróxidos, los hidroperóxidos y los persulfatos, éste genera un principio de polimerización en la fase hidrófila que se propaga en la fase hidrófoba. Los persulfatos, en particular el persulfato de amonio, el persulfato de sodio y el persulfato de potasio son solubles en fase acuosa. Bajo la acción del calor, se descomponen y generan unos aniones con radicales sulfato que contribuirán a cargar la nanoesfera compuesta. El peróxido de hidrógeno es soluble en fase acuosa y genera unos radicales hidroxilos no cargados. La descomposición de los hidroperóxidos genera un hidroxilo y un radical oxigenado que se dividirán en una de las fases en función de la naturaleza del peróxido utilizado. Así, el peróxido de cumeno, en el caso de la polimerización del estireno, se descompone supuestamente a nivel del interfaz entre la partícula de monómero y el agua, los radicales hidroxilos entran en la fase acuosa y los radicales no polares difunden hacia la partícula. De la naturaleza catiónica o aniónica del cebador dependerá el carácter catiónico o aniónico de la partícula y del conjugado resultante de la invención.

El agente cebador se introduce en la fase hidrófila y penetra en la fase hidrófoba (a) o bien simultáneamente a la introducción de los monómeros hidrófobos, (b) o bien previamente a la etapa de introducción de los monómeros hidrófobos, (c) o bien posteriormente a la etapa de introducción de dichos monómeros hidrófobos.

En un modo de realización preferido, la etapa (iii), y eventualmente la etapa (iv) de polimerización se efectúan por elevación de la temperatura hasta aproximadamente 60 a 90ºC, en particular a una temperatura de 70ºC, en presencia del cebador de polimerización, entendiéndose que las condiciones de la polimerización se determinarán por el experto en la materia en función de la naturaleza del cebador elegido, o por fotoquímica con la ayuda de radiaciones, por ejemplo de radiaciones ultravioletas o de un haz láser o de otras fuentes de energía.

La fase orgánica es una fase que comprende un hidrocarburo alifático o cíclico seleccionado de entre los compuestos que comprenden de 5 a 12 átomos de carbono, sus isómeros y sus mezclas, o una fase que comprende la totalidad o parte de un compuesto orgánico polimerizable por vía radicalaria. Preferentemente, el hidrocarburo se selecciona de entre el pentano, el hexano, el heptano, el octano, el nonano, el decano, el undecano, y el dodecano, y el compuesto orgánico polimerizable por vía radicalaria se selecciona de entre los monómeros vinilaromáticos insolubles en agua, tales como estireno, metilestireno, etilestireno, tercio-butil-estireno, viniltolueno, así como los copolímeros de estos monómeros entre sí, entendiéndose que está al alcance del experto en la materia adaptar las condiciones de polimerización en función de la selección del o de los hidrocarburo(s) retenido(s) y de la naturaleza del cebador seleccionado. En particular, si la polimerización se efectúa por elevación de la temperatura, o genera una elevación de la temperatura, el montaje de reacción deberá ser adaptado a los disolventes volátiles, tales como el pentano.

De manera preferida, la fase hidrófila es una fase acuosa, tal como agua.

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En unos modos de realización preferidos de la presente invención, la funcionalización de las partículas se puede complementar por introducción en la fase B y penetración en la fase A de grupos reactivos funcionales. Los grupos reactivos funcionales son aportados por ejemplo por unos monómeros débilmente hidrófilos susceptibles de polimerizar con los monómeros hidrófobos de la matriz polimérica. En particular, los grupos reactivos funcionales son aportados por unos monómeros hidrófilos seleccionados de entre los monómeros de los ácidos acrílicos, metacrílicos, etilénicos y sulfónicos, solos o en mezcla, o también en mezcla con unos monómeros hidrófobos; entendiéndose que está al alcance del experto en la materia determinar la composición de la mezcla. Los grupos funcionales permiten las reacciones ulteriores, pero aportan también la estabilización coloidal necesaria para las aplicaciones ulteriores. Los grupos funcionales son introducidos en la fase B y penetran en el interior de la fase A (a)

o bien de manera simultánea a la penetración de los monómeros hidrófobos de la etapa (ii), (b) o bien previamente a la penetración de los monómeros hidrófobos de la etapa (ii), (c) o bien posteriormente a la penetración de los monómeros hidrófobos de la etapa (ii).

En un modo de realización particular, y si se desea, la etapa (iii) está seguida de una etapa de evaporación parcial o total de la fase orgánica A con formación de partículas compuestas porosas.

La invención proporciona por lo tanto unas partículas compuestas que son funcionalizadas por la parte hidrófila del copolímero anfífilo, y que pueden además serlo por la presencia de grupos funcionales reactivos, aportados como se ha indicado anteriormente durante el procedimiento de preparación. Las partículas de la invención son funcionalizadas preferentemente por grupos seleccionados de entre los grupos carboxílicos, amina, tiol, hidroxilo, tosilhidrazina, que serán capaces de reaccionar con por lo menos un ligando.

Las partículas compuestas funcionalizadas, no porosas o porosas, así formadas serán susceptibles de inmovilizar un ligando, por ejemplo una molécula biológica, tal como un anticuerpo, un fragmento de anticuerpos, una proteína, un polipéptido, una enzima, un polinucleótido, una sonda, un cebador, un fragmento de ácido nucleico; unas moléculas químicas, tales como unos polímeros químicos, unas sustancias medicamentosas, unas moléculas jaula, unos agentes quelantes, unos catalizadores, la biotina; entendiéndose que cuando las partículas compuestas son denominadas "porosas", éstas han alcanzado un grado de porosidad determinado por evaporación total o parcial de la fase orgánica.

Asimismo, la presente invención tiene también por objeto unos conjugados constituidos por unas partículas compuestas de la invención tales como se definen en la reivindicación 5, cuyos grupos de reacción han reaccionado, directa o indirectamente, con por lo menos un ligando tal como se ha definido anteriormente, así como sus utilizaciones.

A título de ejemplo, dichos conjugados se utilizan en unos ensayos inmunológicos para la detección y/o la cuantificación de proteínas, de antígenos, de anticuerpos en una muestra biológica o en unos ensayos que utilizan la tecnología de las sondas para la detección y/o la cuantificación de un fragmento de ácido nucleico en una muestra biológica. La utilización de sondas para la detección y/o la cuantificación de un ácido nucleico en una muestra es bien conocida por el experto en la materia y se puede citar, a título ilustrativo, la técnica de hibridación sándwich. Asimismo, los conjugados de la invención se pueden utilizar como "agentes portadores de cebadores" para una reacción de amplificación de ácidos nucleicos en una muestra, por ejemplo por PCR (Reacción en Cadena de Polimerasa) o cualquier otra técnica de amplificación apropiada, que permite así la detección y/o la cuantificación de ácidos nucleicos en la muestra biológica.

La presente invención tiene por lo tanto también por objeto un reactivo y una composición de diagnóstico que comprende además dichos conjugados y la utilización de dicho reactivo en un ensayo de diagnóstico.

Los conjugados encuentran también una aplicación en el campo terapéutico como vehículo o vector de una sustancia medicamentosa, de un agente reparador de genes defectuoso, de un agente susceptible de bloquear la expresión de un gen, tal como una sonda antisentido en terapia o de un agente susceptible de bloquear la actividad de una proteína, y por lo tanto pueden ser utilizados en una composición terapéutica o profiláctica.

Así, los conjugados de la invención son susceptibles de transportar una sustancia medicamentosa en una composición terapéutica o profiláctica que comprende dicho conjugado en asociación con un adyuvante y/o diluyente y/o excipiente apropiado y farmacéuticamente aceptable, siendo dicha sustancia medicamentosa capaz de ser liberada in vivo. Las definiciones de los excipientes y adyuvantes farmacéuticamente aceptables están descritas por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª ed., Mack Publishing Co.

Los conjugados de la invención son también susceptibles de transportar un gen de interés terapéutico que codifica para por lo menos una proteína de interés o un fragmento de una proteína de interés, entendiéndose que por proteína se entiende al mismo tiempo una proteína en su definición utilizada más generalmente y un anticuerpo. Por supuesto, dicho conjugado es incorporado en una composición terapéutica o profiláctica que comprende también los elementos necesarios para la expresión de dicho gen de interés terapéutico.

Los conjugados de la invención son también utilizables, cuando se incorporan en una composición terapéutica o

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profiláctica, para la transferencia in vivo de sondas u oligonucleótidos antisentido. Los antisentido son capaces de interferir específicamente con la síntesis de una proteína diana de interés, por inhibición de la formación y/o del funcionamiento del polisoma según el posicionamiento del ARNm en la diana. Por lo tanto, la selección frecuente de la secuencia que rodea el codón de iniciación de la traducción como diana para una inhibición por un oligonucleótido 5 antisentido pretende prevenir la formación del complejo de iniciación. Otros mecanismos en la inhibición por unos oligonucleótidos antisentido implican una activación de la ribonucleasa H que digiere los híbridos oligonucleótido antisentido/ARNm o una interferencia a nivel de sitios de empalme por unos oligonucleótidos antisentido, cuya diana es un sitio de empalme de ARNm. Los oligonucleótidos antisentido son también complementarios de secuencias ADN y pueden por lo tanto interferir a nivel de la transcripción por la formación de una triple hélice, emparejándose el 10 oligonucleótido antisentido mediante unos enlaces hidrógeno denominados de Hoogsteen a nivel del gran surco de la doble hélice de ADN. En este caso particular, se habla más precisamente de oligonucleótidos antígenos. Por supuesto, se entiende que los oligonucleótidos antisentido pueden ser estrictamente complementarios de la diana ADN o ARN a la que se deben hibridar, pero también no estrictamente complementarios, con la condición que se hibriden a la diana. Asimismo, puede tratarse de oligonucleótidos antisentido no modificados o modificados a nivel

15 de los enlaces inter-nucleotídicos. Todas estas nociones forman parte de los conocimientos generales del experto en la materia.

La presente invención se refiere por lo tanto a una composición terapéutica que comprende, entre otros, un conjugado vector de un oligonucleótido antisentido tal como se ha definido anteriormente.

20 Por último, los conjugados son susceptibles de formar unos complejos de tipo molécula jaula/criptato, quelante/molécula quelada o servir de vehículo para unos catalizadores en una aplicación química.

Las partículas compuestas de la invención se obtienen por polimerización en emulsión in situ según el protocolo 25 descrito en los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1: Preparación de una emulsión estable e isodispersa

Una emulsión inicial estable e isodispersa se preparó de acuerdo con uno u otro de los protocolos descritos en este 30 ejemplo.

(i) la emulsión primaria se preparó con la ayuda de un procedimiento de emulsificación incorporando progresivamente, cizallando al mismo tiempo con la ayuda de un molino coloidal (Ika: nombre comercial), la fase dispersa, formada por el 45% en peso de óxidos de hierro en octano, la fase continua formada por

35 dodecilsulfato de sodio a una concentración del 50% en peso en agua hasta la obtención de fracciones que comprenden el 80% en peso de ferrofluido orgánico. La mezcla así definida se fragmentó en un flujo de Couette de tipo PG398 a un porcentaje de cizallamiento previamente determinado. La emulsión primaria preparada de esta manera es una emulsión polidispersa caracterizada por una distribución amplia del diámetro de las gotitas, que se trata después por unas clasificaciones magnéticas sucesivas para la

40 obtención de la emulsión de partida isodispersa en tamaño.

(ii) la emulsión primaria se preparó con la ayuda de un procedimiento de emulsificación añadiendo rápidamente la fase dispersa, formada por octano, por el 73% en peso de óxidos de hierro y por un agente tensioactivo lipófilo de tipo monoglicerol o poliglicerol de polirisinoleato (del 1 al 10% en peso), la fase continua formada

45 por tensioactivo de tipo tergitol NP10 (31% en peso) gracias a una espátula. La mezcla así definida se fragmenta después en un flujo de Couette de tipo PG398 a un porcentaje de cizallamiento previamente definido. La emulsión primaria así preparada es una emulsión relativamente isodispersa caracterizada por una distribución baja del diámetro de las gotitas, que se trata después por unas clasificaciones magnéticas sucesivas para la obtención de la emulsión de partida isodispersa en tamaño.

50

Ejemplo 2: Preparación de partículas compuestas con un copolímero anfífilo en "peine"

La emulsión preparada según el protocolo descrito en el Ejemplo 1 (i) (50 ml; Ts = 5%) inicialmente estabilizada en el Triton X405 (2 g/l) se lava tres veces por separación magnética con una solución de polímero (1,5 g/l; pH 8). En 55 cada lavado, se elimina el sobrenadante y se sustituye por un volumen igual de solución que contiene el copolímero. El copolímero anfífilo es un poliácido acrílico modificado por unas cadenas hidrófobas (Mw = 20000 g/mol). Este polímero está compuesto por el 90% de unidades ácido acrílico y por el 10% de unidades metacrilato de polioxialquileno/arilo (Coatex JS3879B). El copolímero posee unas propiedades anfífilas que permiten llegar a adsorberse a las interfaces agua-aceite. Después de ser filtrada en un filtro de nylon de 1 µm, la emulsión se 60 introduce en un reactor de 50 ml y se desgasifica bajo nitrógeno durante 2 horas con baja agitación (200 rpm). El estireno (0,3 g) en el que se disuelve el 2,2'-azobis(2,4-dimetilvaleronitrilo) (4 mg) son entonces añadidos en el reactor con la ayuda de una jeringa. El conjunto se deja bajo agitación (200 rpm) y a temperatura ambiente durante una hora. La elevación de la temperatura hasta 70ºC provoca la descomposición del cebador e inicia la polimerización en las gotas de emulsión. La polimerización dura 15 horas y permite obtener un látex magnético

65 carboxílico estable constituido por unas partículas de poliestireno que contienen unos granos de óxido de hierro.

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Ejemplo 3: Preparación de partículas compuestas con un copolímero anfífilo dibloque

La emulsión preparada según el protocolo descrito en el Ejemplo 1 (i) (50 ml; Ts = 5%) inicialmente estabilizada en el Triton X405 (2 g/l) se lava tres veces por separación magnética con la solución de copolímero anterior (0,8 g/l; pH 8). Este copolímero se obtuvo según un procedimiento de polimerización por vía radicalaria controlada. Posee una masa de aproximadamente 20000 g/mol. El bloque poliestireno representa aproximadamente el 10% de la masa del polímero. En cada lavado, el sobrenadante límpido se elimina y se sustituye por un volumen igual de solución que contiene el copolímero. Después de haberse filtrado en un filtro de nylon de 1 µm, la emulsión se introduce en un reactor de 50 ml y se desgasifica bajo nitrógeno durante 2 horas con baja agitación (200 rpm). El estireno (0,3 g) y el 2,2'-azobis(2,4-dimetilvaleronitrilo) (6 mg) son entonces añadidos en el reactor con la ayuda de una jeringa. El conjunto se deja bajo agitación (200 rpm) y a temperatura ambiente durante una hora. La elevación de la temperatura hasta 70ºC provoca la descomposición del cebador e inicia la polimerización en las gotas de emulsión. La polimerización dura 15 horas y permite obtener un látex magnético carboxílico estable constituido por unas partículas de poliestireno que contienen unos granos de óxido de hierro.

Ejemplo 4: Preparación de partículas compuestas con un copolímero anfífilo dibloque

La emulsión preparada según el protocolo descrito en el Ejemplo 1 (i) (50 ml; Ts = 5%) inicialmente estabilizada en el Triton X405 (2 g/l) se lava dos veces por separación magnética con la solución de copolímero anterior (0,4 g/l; pH 8). El bloque poliácido acrílico se obtuvo por polimerización radicalaria controlada. El polímero posee una masa de 18600 g/mol y el bloque polietileno representa aproximadamente el 2% de esta masa. En cada lavado, el sobrenadante límpido se elimina y se sustituye por un volumen igual de solución que contiene el copolímero. Después de haberse filtrado en un filtro de nylon de 1 µm, la emulsión se introduce en un reactor de 50 ml y se desgasifica bajo nitrógeno durante 2 horas con baja agitación (200 rpm). El estireno (0,3 g) y el 2,2'-azobis(2,4dimetilvaleronitrilo) (6 mg) son entonces añadidos en el reactor con la ayuda de una jeringa. El conjunto se deja bajo agitación (200 rpm) y a temperatura ambiente durante una hora. La elevación de la temperatura hasta 70ºC provoca la descomposición del cebador e inicia la polimerización en las gotas de emulsión. La polimerización dura 14 horas y permite obtener un látex magnético carboxílico estable constituido por unas partículas de poliestireno que contienen unos granos de óxido de hierro.

Ejemplo 5: Preparación de partículas compuestas con un copolímero anfífilo en "peine" cuya parte hidrófoba está inmovilizada en la superficie de la matriz polimérica

(i): obtención del látex

Se disponen en una reactor de polimerización 20 ml de la emulsión inicial estable e isodispersa preparada según el protocolo del ejemplo 1 (i) y constituida por dos fases no miscibles: la fase A constituida por gotitas de 180 nm más o menos 5 nm de diámetro que contienen unas nanopartículas de óxidos de hierro de 10 nm en el octano y una mezcla de tensioactivos (dodecilsulfato de sodio (SDS) y ácido oleico), dispersa en la fase acuosa B (concentración 1%, a 0,8 veces la concentración micelar crítica (CMC) del SDS). La emulsión se desgasifica durante 7 horas con nitrógeno. Se introduce en la emulsión el 2,2'-azobis(2,4-dimetilvaleronitrilo) como cebador de polimerización, solubilizado en hexano (215 µl a 20 g/l). La mezcla es sometida a homogeneización durante una hora y se introducen después 80 mg de monómeros de estireno. Los monómeros de estireno sedifunden en el interior de la fase A durante dos horas. La polimerización se inicia por calentamiento de la solución a una temperatura de 70ºC y se prosigue durante 12 horas y treinta minutos, bajo agitación lenta. Después del final de la polimerización, las partículas compuestas obtenidas presentan un diámetro de 188 nm y un índice de polidispersidad del orden de 1,1.

(ii): inmovilización del copolímero anfífilo

Se lavan unas partículas de látex magnéticas de poliestireno obtenidas en (i) (45 ml) dos veces con una solución de polímero Coatex (PM = 20000 g/mol; 0,8 g/l; pH 3,4) mediante separaciones magnéticas sucesivas. El látex así lavado se introduce (44 ml; Ts = 3,8%) en el reactor de polimerización. El medio de reacción se desgasifica durante dos horas mediante nitrógeno bajo agitación (200 rpm). Se introduce el estireno (0,3 g) y se deja hinchar durante una hora bajo agitación a 200 rpm. Se eleva la temperatura a 70ºC y después se introduce persulfato de potasio (KPS)(6 mg en 1 ml de agua milliQ). Después, se polimeriza a 70ºC durante 7 horas bajo agitación a 200 rpm.

Ejemplo 6: Preparación de partículas compuestas con un copolímero anfífilo dibloque, cuya parte hidrófoba está inmovilizada en la superficie de la matriz polimérica

Se lavan unas partículas de látex magnéticas de poliestireno (45 ml obtenidas por polimerización in situ de una emulsión con una mezcla clásica estireno/cebador no hidrosoluble, conforme al ejemplo 5 (i)) se lavan dos veces con una solución de polímero dibloque (PM = 10000 g/mol; 0,8 g/l; pH 3,4) mediante separaciones magnéticas sucesivas. El látex así lavado se introduce (40 ml; Ts = 3,4%) en el reactor de polimerización. El medio de reacción se desgasifica durante dos horas mediante nitrógeno bajo agitación (200 rpm). Se introduce el estireno (0,3 g) y se deja hinchar durante una hora bajo agitación a 200 rpm. Se eleva la temperatura a 70ºC y después se introduce persulfato de potasio (KPS)(4 mg en 0,2 ml de agua milliQ). Después, se polimeriza a 70ºC durante 16 horas bajo

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agitación a 200 rpm.

Ejemplo 7: Preparación de partículas compuestas con un copolímero anfífilo en "peine"

La emulsión magnética preparada como se indica en el ejemplo 1 (i) (diámetro 220 nm y de concentración del 4% masa/volumen) se estabiliza con un copolímero anfífilo en peine poliácido acrílico modificado por unas cadenas hidrófobas (PM = 50000 g/mol), constituido por el 80% de unidades ácido acrílico y el 20% de unidades metacrilato de polioxialquileno/arilo (Coatex M883), a una concentración del 0,05%, y se dispone en una reactor de polimerización. Se añaden seis mg de AIBN (2,2'-azobisisobutironitrilo), 260 mg de estireno y 240 mg de divinilbenceno, y se incuba durante 1 hora a 20ºC. La polimerización es generada por elevación de la temperatura a 70ºC durante 13 horas. El látex magnético final tiene un tamaño del orden de 240 nm.

Ejemplo 8: Preparación de partículas compuestas

La emulsión magnética tal como se prepara en el ejemplo 1 (i) se estabiliza en el Triton X-405 a 0,2%, después se lava tres veces con una solución de polímero tal como se describe en el ejemplo 7 (Coatex M883; PM = 50000 g/mol) a una concentración del 0,05%.

Ejemplo 9: Injerto de la estreptavidina

Se añaden 100 µl de tampón fosfato (10 mM, pH 6,8) en 0,5 mg de las partículas tales como se obtienen en los ejemplos 7 y 8 anteriores. Se agitaron y después se imantaron las partículas. Se recogieron las partículas en 50 µl de tampón fosfato. En un tubo Eppendorf, se mezclaron 15 µl de estreptavidina (5 mg/ml) con 50 µl de carbodiimida hidrosoluble (1 mg/ml). Se agitó durante 2 minutos a 300 rpm y después se añadieron las partículas en el tubo. Se incubó a 40ºC y 1000 rpm durante 30 minutos y después se añadieron 100 µl de tampón de bloqueo (PBS+Triton X405+ etanolamina). Se incubó a 40ºC y 1000 rpm durante 30 minutos. Se imantaron entonces las partículas y después se recogieron en 100 µl d tampón de almacenamiento (PBS+Triton X-405). Se efectuaron dos nuevos lavados con el tampón de almacenamiento. Durante el último lavado, se recogieron las partículas en 50 µl de tampón de almacenamiento.

Ejemplo 10: Injerto de un oligonucleótido biotinilado sobre el conjugado partícula-estreptavidina

Se imantaron las partículas de 0,25 mg de los conjugados tales como se obtienen en el ejemplo 9 anteriormente y se recogieron en 50 µl de tampón TE NaCl (Tris 10mM, EDTA 1mM, NaCl 1M, Triton X-405 0,05%, ADN de salmón). Se añadieron 2,2·1013 copias de oligonucleótido (ODN biotinilado. Se incubó a 37ºC y 1000 rpm durante 30 minutos. Se imantaron las partículas y se recogieron en 50 µl de tampón TE NaCl.

Ejemplo 11: Hibridación y revelación del acoplamiento

Se añadieron 100 µl de tampón TE NaCl a 40 µg de los conjugados tales como se obtienen en el ejemplo 10 anterior. Se añadieron 18·1010 copias de oligonucleótido diana y 18·1010 copias de oligonucleótido de detección marcado por peroxidasa de rábano picante. Se incubó a 37ºC y 1000 rpm durante 30 minutos. Se lavó tres veces en el tampón TE NaCl. Se añadieron 100 µl de o-fenilendiamina (OPD)(dilución de 5 mg de OPD en 2,5 ml de diluyente Coloreia). Se incubó durante 3 minutos. Se añadieron 100 µl de H2SO4 1N, y después se imantaron las partículas. Se recogieron 100 µl de sobrenadante y se analizó su intensidad a 492 nm. El control negativo está compuesto de conjugados sin diana. Los resultados están indicados en la tabla siguiente:

Control negativo: Ensayo-1 Ensayo -2

Conjugados del ejemplo 8: 0,266 0,848 0,871

Conjugados del ejemplo 9: 0,242 0,822 0,824

Claims

REIVINDICACIONES

1. Partículas compuestas que comprenden un núcleo de un polímero hidrófobo y unas nanopartículas inorgánicas, constituyendo dicho polímero hidrófobo una matriz polimérica en cuyo interior las nanopartículas inorgánicas están

5 estabilizadas y distribuidas de manera homogénea, estando dichas partículas caracterizadas por que están por lo menos parcialmente rodeadas por un copolímero anfífilo que comprende una parte hidrófoba y una parte hidrófila, y cuya parte hidrófoba está por lo menos parcialmente inmovilizada sobre o en dicha matriz polimérica,

-siendo la matriz polimérica una matriz de tipo polímero vinilaromático hidrófobo seleccionada de entre los

10 homopolímeros de monómeros vinilaromáticos insolubles en agua, tales como estireno, metilestireno, etilestireno, tercio-butil-estireno, viniltolueno, así como los copolímeros de estos monómeros entre sí y/o con otros comonómeros, tales como los acrilatos de alquilo o los metacrilatos de alquilo en los que el grupo alquilo comprende de 3 a 10 átomos de carbono, los ésteres de ácidos etilénicos que poseen 4 o 5 átomos de carbono y de alquilo que poseen de 1 a 8 átomos de carbono, los ácidos metacrílicos, los derivados

15 estirénicos, los compuestos diénicos,

-siendo la parte hidrófoba del copolímero anfífilo seleccionada de entre los poliestirenos, los polialquilos tales como el polietileno, las cadenas de ácidos grasos,

20 -siendo la parte hidrófila del copolímero anfífilo seleccionada de entre los poliácidos acrílicos, los polisulfatos, las poliaminas, las poliamidas, los polisacáridos.
2. Partículas según la reivindicación 1, caracterizadas por que están completamente rodeadas por un copolímero

anfífilo. 25
3.

Partículas según la reivindicación 1 o 2, caracterizadas por que la totalidad de la parte hidrófoba del copolímero anfífilo está inmovilizada sobre o en la matriz polímérica.
4.

Partículas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizadas por que el copolímero anfífilo se

30 selecciona de entre los polímeros en bloque, los polímeros secuenciados, los polímeros ramificados, los polímeros en peine.
5. Partículas según la reivindicación 4, caracterizadas por que presentan unos grupos funcionales reactivos en su

superficie, tales como unos grupos carboxílico, amina, tiol, aldehído, hidroxilo, tosilo, hidrazina, susceptibles de 35 reaccionar con por lo menos un ligando.
6. Partículas según la reivindicación 1, caracterizadas por que las nanopartículas están constituidas por materiales inorgánicos seleccionados de entre los óxidos metálicos de hierro, de titanio, de cobalto, de zinc, de cobre, de manganeso, de níquel; la magnetita; la hematita; las ferritas tales como las ferritas de manganeso, de níquel, de

40 manganeso-zinc; las aleaciones de cobalto, de níquel.
7. Partículas según la reivindicación 6, caracterizadas por que los materiales inorgánicos se seleccionan de entre los óxidos metálicos magnetizables tales como el óxido de hierro, la magnetita y la hematita.

45 8. Partículas según la reivindicación 6 o 7, caracterizadas por que los materiales inorgánicos representan del 5 al 95%, preferentemente del 10 al 90%, de manera aún más preferida del 20 al 90%, y ventajosamente del 25 al 85% en masa con respecto a la masa total de dichas partículas.
9. Partículas según la reivindicación 1, caracterizadas por que las nanopartículas inorgánicas están estabilizadas por

50 unos agentes de estabilización seleccionados de entre los grupos iónicos, las cadenas poliméricas, los agentes tensioactivos, los agentes tensioactivos funcionales, tales como los ácidos grasos o los derivados de ácidos grasos, y las mezclas de agentes tensioactivos.
10. Partículas según la reivindicación 9, caracterizadas por que los agentes tensioactivos se seleccionan de entre el 55 dodecilsulfato de sodio y las mezclas de dodecilsulfato de sodio y de ácido oleico.
11. Partículas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizadas por que el polímero es un polímero reticulado.

60 12. Partículas según las reivindicaciones anteriores, caracterizadas por que comprenden además un marcador radioactivo.
13. Partículas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizadas por que presentan un diámetro del

orden de 50 a 1000 nm, preferentemente de aproximadamente 100 a 500 nm, y ventajosamente de 65 aproximadamente 100 a 250 nm.
14. Procedimiento de preparación de partículas compuestas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, y para la cual la parte hidrófoba del copolímero anfífilo está por lo menos parcialmente inmovilizada en la matriz polimérica, caracterizado por que

5

(i) se dispone de una emulsión de partida estable e isodispersa constituida por dos fases no miscibles, una fase A hidrófoba constituida por gotitas que contienen unas nanopartículas inorgánicas dispersadas en una fase orgánica que contiene un agente tensioactivo; y una fase B hidrófila en la que está dispersada la fase A;

10 (ii) se introducen en la fase B unos monómeros hidrófobos y por lo menos un agente cebador; y

(iii) se polimerizan dichos monómeros hidrófobos en el interior de la fase A,

estando dicho procedimiento caracterizado por que, antes de la etapa (iii), se introduce además, en la fase B, por lo 15 menos un copolímero anfífilo,

siendo la fase A una fase que comprende un hidrocarburo alifático o cíclico seleccionado de entre los compuestos que comprenden de 5 a 12 átomos de carbono, sus isómeros y sus mezclas o una fase que comprende la totalidad o parte de un compuesto orgánico polimerizable por vía radicalaria seleccionado de entre los monómeros

20 vinilaromáticos insolubles en agua, tales como estireno, metilestireno, etilestireno, tercio-butil-estireno, viniltolueno, así como los copolímeros de estos monómeros entre sí,

siendo la fase B una fase acuosa, tal como agua,

25 siendo los monómeros hidrófobos seleccionados de entre los monómeros vinilaromáticos tales como estireno, metilestireno, etilestireno, tercio-butil-estireno, amino-metilestireno, viniltolueno, solos o en mezcla, o en mezcla con otros monómeros polimerizables insolubles en agua tales como los acrilatos, los metacrilatos de alquilo, los ésteres de ácidos etilénicos y de alquilo, los ácidos metacrílicos, los derivados estirénicos, los ácidos etilénicos, los compuestos diénicos.

30
15.

Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado por que se introduce el copolímero anfífilo antes o después de la etapa (ii).
16.

Procedimiento de preparación de partículas compuestas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, y para

35 la cual la parte hidrófoba del copolímero anfífilo está por lo menos parcialmente inmovilizada sobre la matriz polimérica, caracterizado por que

(i) se dispone de una emulsión inicial estable e isodispersa constituida por dos fases no miscibles, una fase A

hidrófoba constituida por gotitas que contienen unas nanopartículas inorgánicas dispersadas en una fase 40 orgánica que contiene un agente tensioactivo; y una fase B hidrófila en la que está dispersada la fase A;

(ii) se introducen en la fase B unos monómeros hidrófobos y por lo menos un agente cebador; y

(iii) se polimeriza una fracción de dichos monómeros hidrófobos en el interior de la fase A,

45 estando dicho procedimiento caracterizado por que, antes de la etapa (iii) o después de la etapa (iii), se introduce además, en la fase B, por lo menos un copolímero anfífilo, y después, según una etapa (iv), se polimeriza la fracción restante de los monómeros hidrófobos en la superficie de la matriz polimérica,

50 siendo la fase A una fase que comprende un hidrocarburo alifático o cíclico seleccionado de entre los compuestos que comprenden de 5 a 12 átomos de carbono, sus isómeros y sus mezclas o una fase que comprende la totalidad o parte de un compuesto orgánico polimerizable por vía radicalaria seleccionado de entre los monómeros vinilaromáticos insolubles en el agua, tales como estireno, metilestireno, etilestireno, tercio-butil-estireno, viniletolueno, así como los copolímeros de estos monómeros entre sí,

55 siendo la fase B una fase acuosa, tal como agua,

siendo los monómeros hidrófobos seleccionados de entre los monómeros vinilaromáticos tales como estireno, metilestireno, etilestireno, tercio-butil-estireno, amino-metilestireno, viniltolueno, solos o en mezcla, o en mezcla con

60 otros monómeros polimerizables insolubles en agua, tales como los acrilatos, los metacrilatos de alquilo, los ésteres de ácidos etilénicos y de alquilo, los ácidos metacrílicos, los derivados estirénicos, los ácidos etilénicos, los compuestos diénicos.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado por que cuando se introduce el copolímero anfífilo antes 65 de la etapa (iii), se introduce antes o después de la etapa (ii).

5

15

25

35

45

55

65
18.

Procedimiento según la reivindicación 14 o 16, caracterizado por que el copolímero anfífilo se selecciona de entre los polímeros en bloque, los polímeros secuenciados, los polímeros ramificados, los polímeros en peine.
19.

Procedimiento según la reivindicación 14 o 16, caracterizado por que se añade al monómero o a la mezcla de monómeros un agente de reticulación hidrófobo, tal como un monómero reticulante de tipo divinilbenceno, dimetacrilato, en particular dimetacrilato de vinilo.
20.

Procedimiento según la reivindicación 14 o 16, caracterizado por que el agente cebador se selecciona de entre los cebadores organosolubles o poco solubles en la fase hidrófila, y los cebadores solubles en la fase hidrófila.
21.

Procedimiento según la reivindicación 20, caracterizado por que el agente cebador organosoluble se selecciona de entre los cebadores de tipo azobis tales como 2,2'-azobis(2,4-dimetilvaleronitrilo), 2,2'-azobis(4-metoxi-2,4dimetilvaleronitrilo), 2,2'-azobis(2-ciclopropilpropionitrilo), 2,2'-azobis(2-metilpropionitrilo), 2,2'-azobis(2metilbutironitrilo), 1,1'-azobis(ciclohexano-1-carbonitrilo), 1-((1-ciano-1-metiletil)azo)formamida, 2-fenilazo-4-metoxi2,4-dimetil-valeronitrilo, dimetil-2,2'-azobis(2-metilpropionato), 4,4'-azobis(4-ácido cianovalérico) y 2,2'-azobis(2(hidroximetil)propionitrilo) y el cebador poco soluble o soluble en la fase hidrófila se selecciona de entre los cebadores radicalarios de tipo peróxido, tales como los peróxidos, los hidroperóxidos, en particular el hidroperóxido de cumeno, y los cebadores de tipo persal, tales como los persulfatos, en particular el persulfato de amonio, el persulfato de sodio y el persulfato de potasio.
22.

Procedimiento según las reivindicaciones 14 o 16 y 20 o 21, caracterizado por que el agente cebador se introduce en la fase hidrófila, o bien simultáneamente a la introducción de los monómeros hidrófobos, o bien antes, o bien después de la introducción de dichos monómeros.
23.

Procedimiento según la reivindicación 14 o 16, caracterizado por que la polimerización (iii) y/o (iv) se efectúa por calentamiento hasta una temperatura de 60 a 90ºC, preferentemente de 70ºC.
24.

Procedimiento según la reivindicación 14 o 16, caracterizado por que la polimerización (iii) se efectúa por fotoquímica.
25.

Procedimiento según la reivindicación 14 o 16, caracterizado por que el hidrocarburo se selecciona de entre el pentano, el hexano, el heptano, el octano, el nonano, el decano, el undecano, el dodecano, y el compuesto orgánico polimerizable por vía radicalaria se selecciona de entre el estireno, metilestireno, etilestireno, tercio-butil-estireno, viniltolueno, así como los copolímeros de estos monómeros entre sí.
26.

Procedimiento según la reivindicación 14 o 16, caracterizado por que comprende además una etapa de funcionalización de las partículas compuestas por penetración en la fase A de grupos reactivos funcionales aportados por unos monómeros poco hidrófilos susceptibles de polimerizar con los monómeros hidrófobos.
27.

Procedimiento según la reivindicación 26, caracterizado por que los grupos reactivos funcionales son unos grupos ácidos aportados por unos monómeros poco hidrófilos seleccionados de entre los monómeros de los ácidos acrílicos, metacrílicos, etilénicos, sulfónicos y los monómeros polimerizables seleccionados de entre los monómeros vinilaromáticos insolubles en el agua, tales como estireno, metilestireno, etilestireno, tercio-butil-estireno, viniltolueno, así como los copolímeros de estos monómeros entre sí, solos o en mezcla con otros monómeros hidrófobos.
28.

Procedimiento según las reivindicaciones 14 o 16 y 26 o 27, caracterizado por que dichos monómeros poco hidrófilos son aportados en la fase A, o bien simultáneamente a la introducción de los monómeros hidrófobos, o bien antes, o bien después de la introducción de dichos monómeros.
29.

Procedimiento según la reivindicación 14 o 16, caracterizado por que comprende además, después de la etapa de polimerización (iii), una etapa de evaporación total o parcial de la fase A.
30.

Conjugados caracterizados por que están constituidos por unas partículas compuestas tales como las definidas en la reivindicación 5, cuyos grupos funcionales han interactuado, directa o indirectamente, con por lo menos un ligando seleccionado de entre un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteína, un polipéptido, una enzima, un polinucleótido, un fragmento de ácido nucleico y la biotina.
31.

Reactivo que comprende además por lo menos un conjugado tal como el definido en la reivindicación 30.
32.

Conjugados caracterizados por que están constituidos por unas partículas compuestas tales como las definidas en la reivindicación 5, cuyos grupos funcionales han interactuado, directa o indirectamente, con por lo menos un ligando seleccionado de entre las moléculas jaula, los agentes quelantes y los catalizadores.
33.

Conjugados caracterizados por que están constituidos por unas partículas compuestas tales como las descritas en la reivindicación 5, cuyos grupos funcionales han interactuado, directa o indirectamente, con por lo menos un

ligando seleccionado de entre las sustancias medicamentosas, las sondas antisentido, los agentes reparadores de genes, los agentes que bloquean o que inhiben una actividad proteica.
34. Utilización de los conjugados tales como los definidos en la reivindicación 33 en una composición terapéutica.