JP2004533530A

JP2004533530A - 複合体粒子、誘導されたコンジュゲート、その製造方法および用途

Info

Publication number: JP2004533530A
Application number: JP2003510722A
Authority: JP
Inventors: アブデルハミド・エレサリ; フランク・モンターニュ; エリック・ボスク; クリスチャン・ピショ; ベルナール・マンドラン; ジェローム・ビベット; オリヴィエ・モンダン−モンヴァル
Original assignee: ベーイーオー・メリュー; サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・レシェルシュ・サイエンティフィーク
Priority date: 2001-05-10
Filing date: 2002-05-06
Publication date: 2004-11-04
Anticipated expiration: 2022-05-06
Also published as: ES2539619T3; US20040115433A1; JP4272513B2; FR2824563B1; EP1397429B1; US7217457B2; FR2824563A1; WO2003004559A1; CA2445824A1; EP1397429A1

Abstract

本発明は、疎水性ポリマーのコアおよび無機ナノ粒子を含む複合体粒子に関する。前記疎水性ポリマーは、内側に無機ナノ粒子が安定化されて比較的均一な状態で分布しているポリマーマトリックスを形成する。前記複合体粒子は、疎水性部分および親水性部分を含む両親媒性共重合体によって少なくとも一部分取り囲まれており、その疎水性部分が、前記ポリマーマトリックス内に少なくとも一部分固定されている。本発明は、また、その製造方法、そのような粒子およびリガンドを含むコンジュゲート、および、反応原系および治療用組成物における同一物の用途に関する。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、複合体粒子、その製造方法およびその用途を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
ポリマータイプのミクロスフェアは、バイオ工学、診断および製薬の分野で保持体、担体または媒体として優位にある。この目的のために、それらは、生体分子の固体保持体として医療診断で使用されてきた。
【０００３】
コロイド粒子は、管、薄板またはビーズ等の通常の固体保持体と比較して、特に特定の相互作用のための大きな表面積を得られるようにすることが可能であること、化学的に容易に変性して、その表面が他の化合物、例えば、抗体または抗体フラグメント、蛋白質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸、核酸フラグメント、酵素等の生体分子、または、触媒、薬物、かご分子またはキレート化剤等の化学分子と反応することができる官能基を導入することができることにより、多数の利点を有する。
【０００４】
コロイド粒子の中で、磁性ラテックスが分析分野で大きな興味を喚起しており、例えば、抗原、抗体、生体分子、核酸その他等の検体を分離および/または検知する手段として使用される。
【０００５】
ポリマー/磁性タイプの複合体粒子は、通常、大きさの基準として、50nm未満の直径を有する小粒子、2μmより大きい直径を有する大粒子および50nmと1000nmの間の直径を有する中粒子の3つの種類に分類される。
【０００６】
しかしながら、特に診断への用途の優れた候補として認められるためには一定の基準を満たさなければならない。形態学的観点から、比較的球形であり、磁性充填材がポリマーマトリックス中に比較的均一に分布していることが望ましい。磁界の作用のもとで不可逆的に凝集してはならず、そのことは、容易に素早く可逆的に再分散することができることを意味する。同様に、沈降の現象を少なくするために比較的低密度でなければならない。有利には、単分散または等分散という用語も使用される、狭い粒径分布を示すべきである。
【０００７】
例えば、その大きさおよび密度のために、液相に懸濁している大きな磁性粒子は、素早く沈降する傾向がある。さらにそれらは、磁界の影響下に置かれると、そのために永久に磁化(磁束密度が残留)され易いので、その後凝集する傾向がある。したがって、良好な候補にはならない。
【０００８】
他方、小さい磁性粒子は、それらのブラウン運動のために懸濁したままでいる傾向があり、引き寄せるのは困難で、特に適用する磁界が比較的弱い場合は磁力によっては実際全くといっていいほど引き寄せられない。したがって、上記の大きくする用途にはあまり適切ではない。
【０００９】
したがって、50nmと1000nmの間の中間の大きさを示し、同時に上記の不利な点を克服して上で設定した基準を満たすポリマー/磁性タイプの複合体粒子を製造することにははっきりとした利点がある。しかしながら、本発明は、以下に記述するように、磁化することのできる複合体粒子に限定されるものではない。
【００１０】
欧州特許出願公開第0 390 634号は、50nmから10,000nm程度の直径を有する疎水性の架橋した芳香族ビニルポリマーであって磁化することができる複合体ミクロスフェアを開示しており、磁化することができる粒子からなる固体コアと、少なくとも1つの疎水性芳香族ビニルモノマーおよび少なくとも1つの芳香族ビニルモノマー(単数または複数)に可溶であり、前記モノマー(単数または複数)で架橋することが可能なポリエチレン系不飽和乳化性ポリマーから誘導される疎水性ポリマーからなるシェルとを含んでいる。しかしながら、大きさの要求は満たすことができるが、コア内に位置する磁性充填材が均一な分布を有していないという不都合を示す。さらに、添付されている図から明白に現われているように、粒子は大きさが均一ではない。したがって、必要な大きさの粒子のみを保持するために磁界を適用して選り分けなければならない多分散粒子の集合である。
【００１１】
Dynal(商品名)粒子についても述べる。この粒子は、酸化鉄をポリスチレン表面にある孔に含浸することによって析出させたポリスチレンと酸化鉄の多孔性コアと、その多孔性ミクロスフェアの酸化鉄を封じ込める別のポリマーでできた外皮からなるミクロスフェアである。それらは2.8μmの直径(M280粒子)および4.5μmの直径(M450粒子)をそれぞれ示し、大きさは比較的均一である。それらはしたがって等分散粒子であると認められるが、その径が大きいために上記の不都合、主として沈降の現象、を示す。さらにそれらは、比表面積が小さい。
【００１２】
特許文献米国特許出願第4,358,388号は、磁気充填材が均一に分布しているポリマーマトリックスからなる複合体粒子を開示している。それらは、磁性充填材を含む有機相中の水不溶性有機モノマーを重合することによって得られ、前記有機相は、表面活性剤が存在する水相中でエマルションになっている。
【００１３】
その粒子は、生体内で、上記の管、薄板またはビーズのタイプと同様のものに磁界をかけることによって容易にそれらを単離することができるというさらなる利点を有する保持体を形成する。
【００１４】
とは言っても、これらの粒子が官能化を示すことはないので、この分野の応用におけるそれらの用途はかなり限定されたままである。
【特許文献１】
欧州特許出願公開第0 390 634号
【特許文献２】
米国特許出願第4,358,388号
【非特許文献１】
Remington's Pharmaceutical Sciences、16th Ed.、Mack Publishing Co.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明によれば、上記の既知の粒子によって生じる問題の解決策を創出し、以下の基準:
- 等分散の球状粒子であること、
- コア中に均一に分布している無機充填材を有する粒子であること、
- 中間の大きさ、すなわち、50nmから1000nmの間の直径を有する粒子であること、
- 官能化されたまたは官能化可能な粒子であること、
- 無機充填材が磁性物質であるかまたは磁化可能であること、
- 簡単で制御可能な合成方法によって得られる粒子であること、
を満たす新規な複合体粒子を今や入手できる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の複合体粒子は、疎水性ポリマーおよび無機ナノ粒子からなるコアを備えており、前記疎水性ポリマーが、その内部に無機ナノ粒子が安定して均一に分布しているポリマーマトリックスを構成しており、前記複合体粒子は、疎水性部分および親水性部分を含む両親媒性共重合体によって少なくとも一部分取り囲まれており、その疎水性部分が、前記ポリマーマトリックス上または内部に少なくとも一部分固定されている。
【００１７】
本発明の別の形態によると、粒子は、両親媒性共重合体によって完全に取り囲まれており且つ/または両親媒性共重合体のすべての疎水性部分が、ポリマーマトリックス上または内部に固定されている。
【００１８】
両親媒性共重合体とは、本発明によれば、疎水性部分と親水性部分とを有する共重合体と解釈され、疎水性部分および/または親水性部分は、それぞれ疎水性および/または親水性である両親媒性共重合体の構成下位区分の組み合わせであり得ることが理解される。したがって、本発明の両親媒性共重合体は、特に、ブロック共重合体、逐次共重合体、主鎖が疎水性または親水性であり、側鎖がそれぞれ親水性または疎水性である枝分れ重合体、または主鎖が疎水性または親水性であり、櫛形側鎖がそれぞれ親水性または疎水性である櫛形ポリマーから選択する。
【００１９】
両親媒性共重合体の親水性部分は、イオン性すなわち陰イオン性または陽イオン性、または非イオン性であることができ、それは、直接的にまたは間接的に反応性の官能基を有する。
【００２０】
本発明によれば、疎水性部分は、少なくとも一部をポリマーマトリックス上または内部に固定する。この疎水性部分の固定は、常に、閉じ込めのタイプが少なくとも事実上物理的、より具体的には事実上力学的であり、吸着による結合等の事実上化学的または物理的である疎水性部分の予備的な結合を補完することができる。したがって、固定化は以下の事象;
- 両親媒性共重合体の疎水性部分を、マトリックスの表面に吸着し、次いで疎水性ポリマーによってマトリックス中に恒久的に固定する、
- 前記疎水性部分を有機相に溶解し、次いでマトリックスが形成される間に疎水性ポリマー中に閉じ込める、
- 前記疎水性部分をポリマーマトリックスの形成の間に力学的に閉じ込める、
からもたらすことができる。
【００２１】
この固定化により、高度に安定性であって特に上記の既知粒子のそれよりはるかに優れた安定性がもたらされる。
【００２２】
適当な両親媒性共重合体は、有利には、
- ポリスチレン、ポリエチレン等のポリアルキル、または脂肪酸鎖から選択される疎水性部分、および/または
- ポリ(アクリル酸)、ポリ硫酸塩、ポリアミン、ポリアミドまたは多糖類から選択される親水性部分を含む。
【００２３】
ナノ粒子を構成する無機材料は、鉄、チタン、コバルト、亜鉛、銅、マンガンまたはニッケルの酸化物等の金属酸化物から、そして特に、鉄酸化物、磁鉄鉱または赤鉄鉱等の磁化可能な金属酸化物;マンガンフェライト、ニッケルフェライトまたはマンガン亜鉛フェライト等のフェライト類;またはコバルト合金、ニッケル合金から選択する。
【００２４】
無機材料は、有利には、磁化可能な金属酸化物好ましくは鉄酸化物から選択する。
【００２５】
無機ナノ粒子は、前記複合体粒子の全体重量に関して、重量で、5から95%、好ましくは10から90%、そして有利には20から90%、好ましくは25から85%に相当する。
【００２６】
本発明の複合体粒子内で、ナノ粒子は、イオン性または非イオン性、官能性または非官能性そして重合性または非重合性である両親媒性ポリマー鎖または表面活性剤から選択される安定化剤によって安定化される。官能性表面活性剤は、特に脂肪酸または脂肪酸誘導体、特にオレイン酸またはその誘導体、および上で定義した表面活性剤の混合物から選択する。
【００２７】
マトリックスの適当な疎水性ポリマーは、すなわち、スチレン、メチルスチレン、エチルスチレン、t-ブチルスチレンまたはビニルトルエン等の水不溶性の芳香族ビニルモノマーのホモポリマー、およびこれらのモノマー同士の、および/または、アルキル基が3から10個の炭素原子を含むアクリル酸アルキルおよびメタクリル酸アルキル、エチレン酸が4個または5個の炭素原子を持ち、アルキル基が1から8個の炭素原子を持つエチレン酸のアルキルエステル、メタクリル酸、スチレン誘導体またはジエン化合物等、他のコモノマーとの共重合体から選択される疎水性芳香族ビニルタイプのポリマーである。好ましくは、そのポリマーは、架橋ポリマーである。これは、モノマー(単数または複数)に、ジビニルベンゼン、メタクリル酸ビニル、シアヌル酸トリアリル、モノエチレングリコールジアクリレートまたはポリエチレングリコールジアクリレート等の少なくとも2つの反応性二重結合を有する分子の少量(10重量%未満)を添加することによって得られる。
【００２８】
本発明の複合体粒子は、また、放射性トレーサ等のトレーサも含むことができるが、そのトレーサは、以下の実施例1における説明で分かるように、エマルションを調製する途中で添加する。
【００２９】
本発明の粒子は、約50から1000nm、好ましくは約100から500nm、そして有利には約100から250nm程度の直径を示す。この直径は、プラスまたはマイナス約5%までと定義され、それはそれらの容積平均の直径がプラスまたはマイナス約5%以内までと定義されることを意味する。
【００３０】
本発明の他の対象は、直径によって選り分ける段階を必要としないで所望の直径の等分散粒子を直接得ることを可能にする上記の複合体粒子を製造する方法である。
【００３１】
本発明の第1の方法によれば、両親媒性共重合体の疎水性部分を、少なくとも一部はポリマーマトリックス中に固定化させる、複合体粒子は、以下の:
(i)表面活性剤を含む有機相に分散した無機ナノ粒子を含む小滴からなる疎水性相Aおよび相Aが分散している親水性相Bの2つの非混和性相からなる安定な等分散の出発エマルションを存在させる段階;
(ii)疎水性モノマーおよび少なくとも1つの開始剤を相Bに添加する段階;および
(iii)前記疎水性モノマーを相A中で重合させる段階、により得、
そしてこの方法によれば、少なくとも1つの両親媒性共重合体を段階(iii)の前、すなわち、段階(ii)の前または後に相B中にさらに添加する。
【００３２】
本発明の第2の方法によれば、両親媒性共重合体の疎水性部分を、少なくとも一部はポリマーマトリックス上に固定化させる、複合体粒子は、以下の:
(i)表面活性剤を含む有機相に分散した無機ナノ粒子を含む小滴からなる疎水性相Aおよび相Aが分散している親水性相Bの2つの非混和性相からなる安定な等分散の出発エマルションを存在させる段階;
(ii)疎水性モノマーおよび少なくとも1つの開始剤を相Bに添加する段階;
(iii)前記疎水性モノマーの一部分を相A中で重合させる段階、により得、
そしてこの方法によれば、段階(iii)の前または段階(iii)の後に少なくとも1つの両親媒性共重合体を相B中にさらに添加し、次いで段階(iv)の間に、疎水性モノマーの残りの部分をポリマーマトリックスの表面で重合させる。両親媒性共重合体を段階(iii)の前に添加する時、それは、段階(ii)の前または後に添加することができる。
【００３３】
本発明の方法による複合体粒子を得るために、両親媒性ポリマーは、有利には、複合体粒子の説明で上に示したものから選択する。
【００３４】
採用するモノマーは、疎水性ポリマーを生成しなければならない。それらは親水性相に不溶性であり、スチレン、メチルスチレン、エチルスチレン、t-ブチルスチレン、アミノメチルスチレンまたはビニルトルエン等の芳香族ビニルモノマーから選択する。それらは、単独または混合物として、または別法では、アクリル酸アルキル、メタクリル酸アルキル、エチレン酸のアルキルエステル、メタクリル酸、スチレン誘導体、エチレン酸またはジエン化合物等その他の水不溶性重合性モノマーとの混合物として使用する。
【００３５】
疎水性架橋剤、例えば、ジビニルベンゼンまたはジメタクリル酸エステルタイプ特にジメタクリル酸ビニルを、モノマーまたはモノマー混合物に添加することが可能である。
【００３６】
有機可溶性開始剤は、2,2'-アゾビス(2,4-ジメチルバレロニトリル)、2,2'-アゾビス(4-メトキシ-2,4-ジメチルバレロニトリル)、2,2'-アゾビス(2-シクロプロピルプロピオニトリル)、2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)、2,2'-アゾビス(2-メチルブチロニトリル)、1,1'-アゾビス(シクロヘキサン-1-カルボニトリル)、1-((1-シアノ-1-メチルエチル)アゾ)ホルムアミド、2-フェニルアゾ-4-メトキシ-2,4-ジメチルバレロニトリル、ジメチル2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオネート)、4,4'-アゾビス(4-シアノバレリン酸)および2,2'-アゾビス(2-(ヒドロキシメチル)プロピオニトリル)等アゾビスタイプの開始剤から選択する。過酸化物、ヒドロペルオキシドおよび過硫酸塩等の水溶性またはやや水溶性の開始剤を選択する場合、親水性相で開始し、疎水性相に成長する重合をもたらす。過硫酸塩、特に過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウムおよび過硫酸カリウムは、水性相に可溶性である。熱の作用のもとで、それらは分解し、陰イオンを有する硫酸塩ラジカルを発生し、それが複合体ナノ粒子の電荷に寄与する。過酸化水素は、水性相に可溶性であり、電荷を持たないヒドロキシルラジカルを発生する。ヒドロペルオキシドが分解すると、ヒドロキシルおよび酸素含有ラジカルを発生し、それは使用する過酸化物の特質によって相の1つに分布するであろう。例えば、クメンヒドロペルオキシドは、スチレンの重合の場合にモノマー粒子と水の間の界面で分解し、ヒドロキシルラジカルが水性相に入り、非極性ラジカルが粒子に向って拡散するものと考えられる。本発明によってもたらされる粒子およびコンジュゲートの陽イオン性または陰イオン性は、開始剤の陽イオン性または陰イオン性に依存する。
【００３７】
開始剤は、(a)疎水性モノマーの添加と同時、または、(b)疎水性モノマーの添加段階の前、または、(c)前記疎水性モノマーの添加段階の後のいずれかに親水性相に添加し、疎水性相に浸入させる。
【００３８】
好ましい実施形態において、重合段階(iii)および場合によって段階(iv)は、重合開始剤を存在させて、約60から90℃までの温度、特に、70℃までの温度に上げることによるか(重合条件が、選んだ開始剤の特質によって当技術分野の熟練者によって決定されるのは当然である)、または、放射線を用いる光化学、例えば、紫外線放射またはレーザビームあるいはその他のエネルギー源により行う。
【００３９】
有機相は、5から12個の炭素原子を含む化合物、それらの異性体およびそれらの混合物から選択される脂肪族または環状炭化水素を含む相、または、ラジカル経由により重合することができる有機化合物の全部または一部を含む相である。好ましくは、その炭化水素は、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカンおよびドデカンから選択し、ラジカル経由により重合することができる有機化合物は、スチレン、メチルスチレン、エチルスチレン、t-ブチルスチレンまたはビニルトルエン、およびこれらのモノマー同士の共重合体から選択する[重合条件を、選抜した炭化水素(単数または複数)の選択および選んだ開始剤の特質によって調整するのは、当技術分野の熟練者の領域であることは当然である]。特に、重合を、温度を上げて行うかあるいは温度の上昇をもたらす場合は、重合の手はずは、ペンタン等の揮発性溶媒に適切にするべきである。
【００４０】
好ましくは、親水性相は、水等の水性相である。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態において、粒子の官能化は、反応性官能基を相Bに導入することおよび相Aに浸入させることにより完結させることができる。反応性官能基は、例えば、ポリマーマトリックスの疎水性モノマーと重合することができる弱親水性モノマーによって導入することができる。特に、反応性官能基は、アクリル酸、メタクリル酸、エチレン酸およびスルホン酸モノマーから選択される親水性モノマーの単独または混合物によって、または疎水性モノマーとの混合物によって導入される(その混合物の組成を決定するのが当技術分野の熟練者の領域であるのは当然である)。官能基は、その後の反応を可能にするほかに、その後の応用のために必要なコロイドの安定化をももたらす。官能基は、相Bに導入され、(a)段階(ii)の疎水性モノマーの浸入と同時、または(b)段階(ii)の疎水性モノマーの浸入前、または(c)段階(ii)の疎水性モノマーの浸入の後のいずれかに、相Aの内側に浸入する。
【００４２】
特定の実施形態においては、そして必要な場合は、段階(iii)の後に多孔性複合体粒子の生成を伴う有機相Aの一部または全部の蒸発の段階が続く。
【００４３】
本発明は、かくして、両親媒性共重合体の親水性部分によって官能化され、さらに上で示したように製造工程の途中で添加される反応性官能基の存在によって官能化することができる複合体粒子を提供する。本発明の粒子は、好ましくは、カルボキシル基、アミン基、チオール基、ヒドロキシル基、トシル基またはヒドラジン基から選択される基によって官能化され、それは少なくとも1つのリガンドと反応することができる。
【００４４】
かくして生成した非多孔性または多孔性官能化複合体粒子は、リガンド、例えば、抗体、抗体フラグメント、蛋白質、ポリペピチド、酵素、ポリヌクレオチド、プローブ、プライマーまたは核酸フラグメント等の生体分子;または、化学ポリマー、医薬物質、かご分子、キレート化剤、触媒またはビオチン等の化学分子を固定化することができる。その複合体粒子が「多孔性」と書かれるときは、それらは、有機相の全部または一部の蒸発によって所定の多孔度の度合いに達しているものと解釈される。
【００４５】
したがって、本発明の他の対象は、本発明の複合体粒子の反応性基が、上で定義した少なくとも1つのリガンドと直接または間接的に反応したものからなるコンジュゲート、およびその用途である。
【００４６】
例として、前記コンジュゲートは、免疫試験で、生体試料中の蛋白質、抗原または抗体の検知および/または定量化のため、またはプローブ技術を使用する試験で生体試料中の核酸フラグメントの検知および/または定量化のために使用する。試料中の核酸の検知および/または定量化のためにプローブを使用することは、当技術分野の熟練者には良く知られており、説明のために、サンドウィッチハイブリダイゼーション技法を挙げることができる。同様に、本発明のコンジュゲートは、例えば、それによって生体試料中の核酸の検知および/または定量化を可能にするPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)またはその他の適当な増幅技法による試料中の核酸の増幅のための反応用「プライマー担持剤」として使用することができる。
【００４７】
本発明の他の対象は、したがって、前記コンジュゲートを付加的に含む診断用試薬および組成物、および、前記試薬の診断試験における用途である。
【００４８】
コンジュゲートには、また、医薬物質用、欠損遺伝子修復剤用、治療におけるアンチセンスプローブ等の遺伝子の発現を阻止することができる薬剤用、または蛋白質の活性を阻止することができる薬剤用の担体または媒体としての治療分野における応用が見出され、そんな訳でそれらは治療用または予防用組成物に使用することができる。
【００４９】
このように、本発明のコンジュゲートは、前記コンジュゲートを、適切であって薬剤として許容できる補助剤および/または希釈剤および/または賦形剤と組み合わせて含む治療用または予防用組成物の中の医薬物質を担持することができ、前記の医薬物質は、生体内で放出することができる。薬剤として許容できる賦形剤および補助剤の定義は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、16th Ed.、Mack Publishing Co.に記載されている。
【００５０】
また、本発明のコンジュゲートは、少なくとも1つの対象となる蛋白質または1つの対象となる蛋白質のフラグメントに遺伝コードを指定する治療対象の遺伝子を担持することができる。ここで「蛋白質」の用語を、最も一般的に用いられるその定義内の蛋白質および抗体の両方を意味するものと解釈するのは当然である。もちろん、上記のコンジュゲートは、治療対象の前記の遺伝子の発現のために必要な成分も含んだ治療用または予防用組成物の中に組み込む。
【００５１】
また、本発明のコンジュゲートは、治療用または予防用組成物中に組み込めば、アンチセンスプローブまたはオリゴヌクレオチドの生体内での移動のために使用することができる。アンチセンス配列は、特に、標的中のmRNAの位置によるポリソームの生成および/または機能化を抑えることによって対象となる標的蛋白質の合成を特異的に妨げることができる。例えば、開始複合体生成の防止のためにアンチセンスオリゴヌクレオチドによる抑制の標的として翻訳開始コドンNO周囲の配列が頻々選択される。アンチセンスオリゴヌクレオチドによる抑制のその他の機構としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド/mRNAハイブリッドを消化するリボヌクレアーゼHの活性化、または、その標的がmRNAスプライスサイトであるアンチセンスオリゴヌクレオチドによるスプライスサイトにおける妨害が含まれる。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、DNA配列に対して相補性であり、したがって、三重ラセンの形成、すなわち、DNA二重ラセンの主溝内の「Hoogsteen」水素結合を介したアンチセンスオリゴヌクレオチドの対合により、転写を妨害することができる。この特定の場合において、この用語はより正確には「アンチ遺伝子オリゴヌクレオチド」である。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、それらがハイブリッド形成すべきDNAまたはRNAの標的には厳密に相補性であり得るが、しかしそれらが標的とハイブリッド形成する場合には厳密には相補性はなくてもよいことが明らかに理解できる。同様に、ヌクレオチド間結合の所が修飾されていないまたは修飾されているアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。これらの概念はすべて、当業者の一般知識の一部を形成している。
【００５２】
本発明は、したがって、とりわけ、上で定義したアンチセンスオリゴヌクレオチドを担持するコンジュゲートを含む治療用組成物に関する。
【００５３】
最後に、このコンジュゲートは、かご分子/クリプテートまたはキレート化剤/キレート化分子タイプの複合または化学的応用で触媒用の媒体として作用する複合錯体を形成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
本発明の複合体粒子は、以下の実施例に記載したプロトコルに従うインサイチューでの乳化重合によって得られる。
【実施例１】
【００５５】
安定な等分散エマルションの調製
安定で等分散の出発エマルションを、本実施例に記載のプロトコルの1つまたは他によって調製した。
【００５６】
(i)水中50重量%の濃度のドデシル硫酸ナトリウムからなる連続相に、コロイドミル(商品名: Ika)を使用してせん断をかけながら、80重量%の有機フェロフルイドを含むフラクションが得られるまで、オクタン中45重量%の酸化鉄からなる分散相を徐々に混合して、乳化法を使用して最初のエマルションを調製した。上記の混合物を、PG398タイプのCouette粘度計中で予め決めたせん断速度で細かく砕いた。そのように調製した最初のエマルションは、小滴の直径の分布が幅広い特徴をもつ多分散系のエマルションであり、大きさが等分散系の出発エマルションを得るために、次いで連続磁気選別により処理する。
(ii)Tergitol NP10タイプの表面活性剤(31重量%)からなる連続相に、スパチュラを使用して、オクタンと73重量%の酸化鉄および脂肪親和性のポリリシノール酸モノグリセロールまたはポリグリセロールタイプの表面活性剤(1から10重量%)からなる分散相を素早く加えることにより、乳化法を使用して最初のエマルションを調製した。上記の混合物を、その後、PG398タイプのCouette粘度計中で予め決めたせん断速度で細かく砕く。そのように調製した最初のエマルションは、小滴の直径の分布が低い特徴をもつ比較的等分散系のエマルションであり、大きさが等分散系の出発エマルションを得るために、その後連続磁気選別により処理する。
【実施例２】
【００５７】
「櫛形」両親媒性共重合体を含む複合体粒子の調製
実施例1(i)に記載したプロトコルに従って調製したエマルション(50ml、Ts=5%)を、最初にトリトンX-405(2g/l)中で安定化し、ポリマー溶液(1.5g/l、pH8)で磁気分離により3回洗浄する。洗浄毎に透明な上澄み液を除去し、共重合体を含む等体積の溶液で置き換える。両親媒性共重合体は、疎水性結合(Mw=20,000g/mol)で変性したポリ(アクリル酸)である。このポリマーは、90%のアクリル酸単位と10%のアリール/メタクリル酸ポリオキシアルキレン単位(Coatex JS3879B)からなる。その共重合体は、それが水/油界面に吸着する両親媒性の特性を有する。そのエマルションを、1μmのナイロンフィルターでろ過した後、50mlの反応器に入れ、窒素下で穏やかに撹拌しながら(200回転/分)、2時間脱気する。続いて、2,2'-アゾビス(2,4-ジメチルバレロニトリル)(4mg)を溶解したスチレン(0.3g)を、注射器を用いて反応器に加える。一体化した混合物を外界温度で1時間撹拌したまま(200回転/分)にする。温度を70℃まで上げると開始剤の分解が起こり、エマルションの滴の中で重合が始まる。重合を15時間続けることにより、酸化鉄の粒を含むポリスチレン粒子からなる安定なカルボキシル基をもつ磁性ラテックスを得ることが可能となる。
【実施例３】
【００５８】
ダイブロック両親媒性共重合体を含む複合体粒子の調製
実施例1(i)に記載したプロトコルに従って調製したエマルション(50ml、Ts=5%)を、最初にトリトンX-405(2g/l)中で安定化し、上記の共重合体溶液(0.8g/l、pH8)で磁気分離により3回洗浄する。この共重合体は、管理されたラジカル重合法によって得た。それは約20,000g/モルの重量を有する。ポリスチレンのブロックは、ポリマー重量の約10%である。洗浄毎に透明な上澄み液を除去し、共重合体を含む等体積の溶液で置き換える。そのエマルションは、1μmのナイロンフィルターでろ過した後、50mlの反応器に入れ、窒素下で穏やかに撹拌しながら(200回転/分)、2時間脱気する。続いて、スチレン(0.3g)および2,2'-アゾビス(2,4-ジメチルバレロニトリル)(6mg)を、注射器を用いて反応器に加える。一体化した混合物を外界温度で1時間撹拌したまま(200回転/分)にする。温度を70℃まで上げると開始剤の分解が起こり、エマルションの滴の中で重合が始まる。重合を15時間続けることにより、酸化鉄の粒を含むポリスチレン粒子からなる安定なカルボキシル基をもつ磁性ラテックスを得ることが可能となる。
【実施例４】
【００５９】
ダイブロック両親媒性共重合体を含む複合体粒子の調製
実施例1(i)に記載したプロトコルに従って調製したエマルション(50ml、Ts=5%)を、最初にトリトンX-405(2g/l)中で安定化し、上記の共重合体溶液(0.4g/l、pH8)で磁気分離により2回洗浄する。管理されたラジカル重合によりポリ(アクリル酸)ブロックが得られた。そのポリマーは、18,600g/モルの重量をもち、この重量の約2%がポリエチレンブロックである。洗浄毎に透明な上澄み液を除去し、共重合体を含む等体積の溶液で置き換える。そのエマルションは、1μmのナイロンフィルターでろ過した後、50mlの反応器に入れ、窒素下で穏やかに撹拌しながら(200回転/分)、2時間脱気する。続いて、スチレン(0.3g)および2,2'-アゾビス(2,4-ジメチルバレロニトリル)(6mg)を、注射器を用いて反応器に加える。一体化した混合物を外界温度で1時間撹拌したまま(200回転/分)にする。温度を70℃まで上げると開始剤の分解が起こり、エマルションの滴の中で重合が始まる。重合を14時間続けることにより、酸化鉄の粒を含むポリスチレン粒子からなる安定なカルボキシル基をもつ磁性ラテックスを得ることが可能となる。
【実施例５】
【００６０】
疎水性部分がポリマーマトリックス表面に固定される「櫛形」両親媒性共重合体を含む複合体粒子の調製
(i)ラテックスの製造
実施例1(i)のプロトコルに従って調製し、オクタン中に直径10nmの酸化鉄ナノ粒子を含む直径が180nmプラスまたはマイナス5nmの小滴である相Aおよび表面活性剤混合物[ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)およびオレイン酸]を分散した水性相B[SDSの臨界ミセル濃度(CMC)の0.8倍に当たる1%濃度]の非混和性の2つの相からなる安定した等分散の出発エマルションの20mlを重合反応容器に配置する。エマルションは、窒素下で7時間に亘って脱気する。ヘキサンに溶解した重合開始剤の2,2'-アゾビス(2,4-ジメチルバレロニトリル)(20g/lのものを215μl)をエマルション中に添加する。その混合物を1時間かけて均質化し、その後80mgのスチレンモノマーを添加する。スチレンモノマーは2時間に亘って相Aの内部に拡散する。溶液を70℃の温度に加熱して重合を開始し、ゆっくり撹拌しながら12時間30分継続する。重合の完了後、得られた複合体粒子は、188nmの直径および1.1程度の多分散指数を示す。
【００６１】
(ii)両親媒性共重合体の固定化
(i)で得られたポリスチレン磁性ラテックス粒子(45ml)を、Coatexポリマーの溶液(MW=20,000g/モル、0.8g/l、pH3.4)で連続磁気分離により2回洗浄する。こうして洗浄したラテックス(44ml、Ts=3.8%)を重合反応器に導入する。反応媒体を撹拌しながら(200回転/分)、窒素で2時間脱気する。スチレン(0.3g)を添加し、200回転/分で撹拌しながら1時間に亘って膨潤を起こさせる。温度を70℃に上げ、次いで過硫酸カリウム(KPS)(1mlのMilliQ水6mg)を添加する。次いで70℃で7時間に亘り200回転/分で撹拌しながら重合を行う。
【実施例６】
【００６２】
疎水性部分がポリマーマトリックス表面に固定されるダイブロック両親媒性共重合体を含む複合体粒子の調製
ポリスチレン磁性ラテックス粒子(45ml、実施例5(i)による通常のスチレン/水不溶性開始剤混合物を含むエマルションのインサイチューでの重合によって得られたもの)を、ダイブロックポリマーの溶液(MW=10,000g/モル、0.8g/l、pH3.4)で連続磁気分離により2回洗浄する。こうして洗浄したラテックス(40ml、Ts=3.4%)を重合反応器に導入する。反応媒体を撹拌しながら(200回転/分)窒素で2時間脱気する。スチレン(0.3g)を添加し、200回転/分で撹拌しながら1時間に亘って膨潤を起こさせる。温度を70℃に上げ、次いで過硫酸カリウム(0.2mlのMilliQ水4mg)を添加する。次いで70℃で16時間に亘り200回転/分で撹拌しながら重合を行う。
【実施例７】
【００６３】
「櫛形」両親媒性共重合体を含む複合体粒子の調製
実施例1(i)で示したように調製した磁性エマルション(直径220nm、濃度4重量%/容積)を、80%のアクリル酸単位と20%のアリール/メタクリル酸ポリオキシアルキレン単位(Coatex M883)からなる疎水性結合によって変性したポリ(アクリル酸)である櫛形両親媒性共重合体を0.05%の濃度で用いて安定化し、重合反応器に入れる。AIBN(2,2'-アゾビスイソブチロニトリル)の6mg、スチレンの360mgおよびジビニルベンゼンの240mgを加え、20℃で1時間保持する。温度を70℃に上げて13時間に亘って重合させる。最終的な磁性ラテックスは、240nm程度の大きさを有する。
【実施例８】
【００６４】
複合体粒子の調製
実施例1(i)で調製した磁性エマルションを、0.2%のトリトンX-405中で安定化し、次いで、0.05%の濃度の実施例7に記載したポリマーの溶液(Coatex M883、MW=50,000g/モル)で3回洗浄する。
【実施例９】
【００６５】
ストレプトアビジンのグラフト化
リン酸塩緩衝液(10mM、pH6.8)の100μlを、上記の実施例7および8で得られた粒子の0.5mgに加えた。その粒子を撹拌し、次いで磁化した。その粒子をリン酸塩緩衝液の50μl中に入れた。ストレプトアビジン(5mg/ml)の15μlを水溶性のカルボジイミド(1mg/ml)の50μlとエッペンドルフ管の中で混合した。撹拌を300回転/分で2分間行い、続いて粒子をその管に加えた。40℃、1,000回転/分で30分の定温放置を行い、続いて、ブロッキング緩衝液(PBS+トリトンX-405+エタノールアミン)の100μlを加えた。その混合物を、40℃、1,000回転/分で30分間、定温で放置した。その粒子を次に磁化し、保存用緩衝液(PBS+トリトンX-405)の100μl中に入れた。この保存用緩衝液で新たな2回の洗浄操作を行った。最後の洗浄操作の間に粒子を保存用緩衝液50μl中に入れた。
【実施例１０】
【００６６】
ビオチン標識オリゴヌクレオチドを粒子ストレプトアビジンコンジュゲートにグラフト化
上記の実施例9で得たコンジュゲートの粒子(0.25mg)を磁化し、TE NaCl緩衝液(トリス10mM、EDTA 1mM、NaCl 1M、トリトンX-405 0.05%、サケのDNA)の50μl中に入れた。ビオチン標識オリゴヌクレオチド(ODN)のコピー2.2×10¹³個を加えた。37℃で1,000回転/分で30分間の定温放置を行った。粒子を磁化し、TE NaCl緩衝液の50μl中に入れた。
【実施例１１】
【００６７】
ハイブリダイゼーション、およびカップリングの立証
上記の実施例10で得たコンジュゲートの40μgにTE NaCl緩衝液の100μlを加えた。標的オリゴヌクレオチドのコピー10.18×10¹⁰個およびセイヨウワサビペルオキシダーゼのラベルをつけた検知用オリゴヌクレオチドのコピー18×10¹⁰個を加えた。37℃、1,000回転/で分30分間の定温放置を行った。TE NaCl緩衝液中で洗浄を3回行った。o-フェニレンジアミン(OPD)(Coloreia希釈剤2.5ml中OPD5mgの希釈溶液)100μlを加えた。定温放置を3分間行った。1NのH₂SO₄の100μlを加えた後、粒子を磁化した。上澄み液100μlを取り出し、その492nmにおける強度を分析した。ネガティブコントロールは、標的のないコンジュゲートからなる。結果を次の表に示す。
【００６８】
【表１】

Claims

疎水性ポリマーおよび無機ナノ粒子からなるコアを備え、前記疎水性ポリマーは、その内部に無機ナノ粒子が安定して均一に分布しているポリマーマトリックスを構成している複合体粒子であって、前記複合体粒子が、疎水性部分および親水性部分を含む両親媒性共重合体によって少なくとも一部分取り囲まれており、その疎水性部分が、前記ポリマーマトリックス上または内部に少なくとも一部分固定されていることを特徴とする複合体粒子。
その粒子が、両親媒性共重合体によって完全に取り囲まれていることを特徴とする請求項1に記載の複合体粒子。
両親媒性共重合体のすべての疎水性部分が、ポリマーマトリックス上または内部に固定されていることを特徴とする請求項1または2に記載の複合体粒子。
両親媒性共重合体の疎水性部分を、ポリスチレン、ポリエチレン等のポリアルキル、または脂肪酸鎖から選択することを特徴とする請求項1から3のいずれか一項に記載の複合体粒子。
両親媒性共重合体の親水性部分を、ポリ(アクリル酸)、ポリ硫酸塩、ポリアミン、ポリアミドまたは多糖類から選択することを特徴とする請求項1から4のいずれか一項に記載の複合体粒子。
両親媒性共重合体を、ブロックポリマー、逐次ポリマー、分岐ポリマーまたは櫛形ポリマーから選択することを特徴とする請求項4および5に記載の複合体粒子。
粒子が、その表面に、少なくとも1つのリガンドと反応することができる、カルボキシル基、アミン基、チオール基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、トシル基またはヒドラジン基等の反応性官能基を表すことを特徴とする請求項6に記載の複合体粒子。
ナノ粒子が、鉄、チタン、コバルト、亜鉛、銅、マンガンまたはニッケルの金属酸化物;磁鉄鉱;赤鉄鉱;マンガンフェライト、ニッケルフェライトまたはマンガン亜鉛フェライト等のフェライト類;またはコバルト合金、ニッケル合金から選択される無機材料からなることを特徴とする請求項1に記載の複合体粒子。
無機材料を、酸化鉄、磁鉄鉱、赤鉄鉱等の磁化可能な金属酸化物から選択することを特徴とする請求項8に記載の複合体粒子。
無機材料が、前記複合体粒子の全体重量に対して、質量で、5から95%、好ましくは10から90%、より好ましくはさらに20から90%、そして有利には25から85%に相当することを特徴とする請求項8または9に記載の複合体粒子。
無機ナノ粒子を、イオン性基、ポリマー鎖、表面活性剤、脂肪酸または脂肪酸誘導体等の官能性表面活性剤、および表面活性剤の混合物から選択される安定化剤によって安定化することを特徴とする請求項1に記載の複合体粒子。
表面活性剤を、ドデシル硫酸ナトリウムおよびドデシル硫酸ナトリウムとオレイン酸の混合物から選択することを特徴とする請求項11に記載の複合体粒子。
ポリマーマトリックスが、スチレン、メチルスチレン、エチルスチレン、t-ブチルスチレンまたはビニルトルエン等の水不溶性の芳香族ビニルモノマーのホモポリマー、およびこれらのモノマー同士の、および/または、アルキル基が3から10個の炭素原子を含むアクリル酸アルキルおよびメタクリル酸アルキル、エチレン酸が4個または5個の炭素原子を持ち、アルキル基が1から8個の炭素原子を持つエチレン酸のアルキルエステル、メタクリル酸、スチレン誘導体またはジエン化合物等の他のコモノマーとの共重合体から選択される疎水性芳香族ビニルポリマータイプのマトリックスであることを特徴とする請求項1に記載の複合体粒子。
ポリマーが架橋ポリマーであることを特徴とする請求項13に記載の複合体粒子。
粒子が、さらに放射性トレーサを備えていることを特徴とする請求項1から14に記載の複合体粒子。
粒子が、50から1,000nm、好ましくは約100から500nm、有利には約100から250nm程度の直径を示すことを特徴とする請求項1から15のいずれか一項に記載の複合体粒子。
両親媒性共重合体の疎水性部分の少なくとも一部をポリマーマトリックス中に固定化させる、請求項1から16のいずれか一項に記載の複合体粒子を製造する方法であって、
(i)表面活性剤を含む有機相に分散した無機ナノ粒子を含む小滴からなる疎水性相Aおよび相Aが分散している親水性相Bの2つの非混和性相からなる安定な等分散の出発エマルションを存在させる段階;
(ii)疎水性モノマーおよび少なくとも1つの開始剤を相Bに添加する段階;および
(iii)前記疎水性モノマーを相A中で重合させる段階を特徴とし、
前記方法が、段階(iii)の前に少なくとも1つの両親媒性共重合体を相B中にさらに添加することを特徴とする方法。
両親媒性共重合体を段階(ii)の前または後に添加することを特徴とする請求項17に記載の方法。
両親媒性共重合体の疎水性部分の少なくとも一部をポリマーマトリックス上に固定化させ、
(i)表面活性剤を含む有機相に分散した無機ナノ粒子を含む小滴からなる疎水性相Aおよび相Aが分散している親水性相Bの2つの非混和性相からなる安定な等分散の出発エマルションを存在させる段階;
(ii)疎水性モノマーおよび少なくとも1つの開始剤を相Bに添加する段階;および
(iii)前記疎水性モノマーの一部分を相A中で重合させる段階を特徴とし、
前記方法が、段階(iii)の前または段階(iii)の後に少なくとも1つの両親媒性共重合体を相B中にさらに添加し、次いで段階(iv)により、疎水性モノマーの残りの部分をポリマーマトリックスの表面で重合させることを特徴とする請求項1から16のいずれか一項に記載の複合体粒子を製造する方法。
両親媒性共重合体を段階(iii)の前に添加する時、それを段階(ii)の前または後に添加することを特徴とする請求項19に記載の方法。
両親媒性共重合体を、ブロックポリマー、逐次ポリマー、分岐ポリマーまたは櫛形ポリマーから選択することを特徴とする請求項17または19に記載の方法。
疎水性モノマーを、スチレン、メチルスチレン、エチルスチレン、t-ブチルスチレン、アミノメチルスチレンまたはビニルトルエン等芳香族ビニルモノマーから、単独または混合物として、または別法では、アクリル酸アルキル、メタクリル酸アルキル、エチレン酸のアルキルエステル、メタクリル酸、スチレン誘導体、エチレン酸またはジエン化合物等その他の水不溶性重合性モノマーとの混合物として選択することを特徴とする請求項17または19に記載の方法。
ジビニルベンゼンまたはジメタクリル酸エステルタイプ、特にジメタクリル酸ビニルである架橋モノマー等の疎水性架橋剤を、モノマーまたはモノマー混合物に加えることを特徴とする請求項17または19に記載の方法。
開始剤を、有機可溶性開始剤、親水性相に弱可溶性である開始剤および親水性相に可溶性である開始剤から選択することを特徴とする請求項17または19に記載の方法。
有機可溶性開始剤を、2,2'-アゾビス(2,4-ジメチルバレロニトリル)、2,2'-アゾビス(4-メトキシ-2,4-ジメチルバレロニトリル)、2,2'-アゾビス(2-シクロプロピルプロピオニトリル)、2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)、2,2'-アゾビス(2-メチルブチロニトリル)、1,1'-アゾビス(シクロヘキサン-1-カルボニトリル)、1-((1-シアノ-1-メチルエチル)アゾ)ホルムアミド、2-フェニルアゾ-4-メトキシ-2,4-ジメチルバレロニトリル、ジメチル2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオネート)、4,4'-アゾビス(4-シアノバレリン酸)および2,2'-アゾビス(2-(ヒドロキシメチル)プロピオニトリル)等アゾビスタイプの開始剤から選択し、そして、親水性相に弱可溶性または可溶性である開始剤を、過酸化物またはヒドロペルオキシド、特にクメンヒドロペルオキシド等の過酸化物タイプのラジカル開始剤、および過硫酸塩、特に過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウムおよび過硫酸カリウム等の過酸塩タイプの開始剤から選択することを特徴とする請求項24に記載の方法。
開始剤を、疎水性モノマーの添加と同時または前記モノマーの添加の前または後のいずれかに親水性相に添加することを特徴とする請求項17または19および24または25に記載の方法。
重合段階(iii)および/または(iv)を、60から90℃、好ましくは70℃の温度に加熱することにより行うことを特徴とする請求項17または19に記載の方法。
重合段階(iii)を光化学によって行うことを特徴とする請求項17または19に記載の方法。
相Aが、5から12個の炭素原子を含む化合物、それらの異性体およびそれらの混合物から選択される脂肪族または環状炭化水素を含む相、または、スチレン、メチルスチレン、エチルスチレン、t-ブチルスチレンまたはビニルトルエン等の水不溶性芳香族ビニルモノマーから選択されるラジカル経由により重合することができる有機化合物およびこれらのモノマー同士の共重合体の全部または一部を含む相であることを特徴とする請求項17または19に記載の方法。
炭化水素を、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカンまたはドデカンから選択し、ラジカル経由により重合することができる有機化合物を、スチレン、メチルスチレン、エチルスチレン、t-ブチルスチレンまたはビニルトルエン、およびこれらのモノマー同士の共重合体から選択することを特徴とする請求項29に記載の方法。
相Bが、水等の水性相であることを特徴とする請求項17または19に記載の方法。
方法が、疎水性モノマーと重合することができる弱親水性モノマーによって導入される反応性官能基が相A中に浸入することによる複合体粒子の官能化の段階をさらに含むことを特徴とする請求項17または19に記載の方法。
反応性官能基が、アクリル酸、メタクリル酸、エチレン酸またはスルホン酸モノマーから選択される弱親水性モノマー、および、スチレン、メチルスチレン、エチルスチレン、t-ブチルスチレンまたはビニルトルエン等の水不溶性の芳香族ビニルモノマーから選択される重合性モノマー、および、これらのモノマー同士の共重合体の単独または他の疎水性モノマーとの混合物により添加される酸基であることを特徴とする請求項32に記載の方法。
前記弱親水性モノマーを、疎水性モノマーの添加と同時または前記モノマーの添加の前または後のいずれかに相A中に添加することを特徴とする請求項17または19および32または33に記載の方法。
方法が、重合段階(iii)の後に相Aの全部または一部を蒸発させる段階をさらに含むことを特徴とする請求項17または19に記載の方法。
コンジュゲートであって、請求項7で定義した複合体粒子からなり、その官能基が、抗体、抗体フラグメント、蛋白質、ポリペプチド、酵素、ポリヌクレオチド、核酸フラグメントおよびビオチンから選択される少なくとも1つのリガンドと直接または間接的に相互作用していることを特徴とするコンジュゲート。
試薬であって、請求項36で定義した少なくとも1つのコンジュゲートを付加的に含む試薬。
コンジュゲートであって、請求項7で定義した複合体粒子からなり、その官能基が、かご分子、キレート化剤および触媒から選択される少なくとも1つのリガンドと直接または間接的に相互作用していることを特徴とするコンジュゲート。
コンジュゲートであって、請求項7で定義した複合体粒子からなり、その官能基が、医薬物質、アンチセンスプローブ、遺伝子修復剤、または蛋白質活性を阻害または抑制する作用から選択される少なくとも1つのリガンドと直接または間接的に相互作用していることを特徴とするコンジュゲート。
請求項39で定義したコンジュゲートの使用であって、治療用組成物での使用。