ES2539255T3 - Péptidos citrulinados de histonas y usos de los mismos - Google Patents

Péptidos citrulinados de histonas y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Un péptido caracterizado por - ser antigénicamente eficaz y capaz de unirse específicamente a los anticuerpos específicos de la artritis reumatoide y - consistir en, desde el extremo amino al carboxílico, la secuencia de aminoácidos: S G X1 G K G G K G L G K G G A K X2 H X3 K (del aa 1 al aa 20 de la SEC ID Nº 1), G A K X2 H X3 K V L X4 D N I Q G I T K P A I (del aa 14 al aa 34 de la SEC ID Nº 1) o K P A I X5 X6 LA X7 X8 G G V K X9 I S G L I (del aa 31 al aa 50 de la SEC ID Nº 1) en donde los aminoácidos X1-X9 se seleccionan de forma independiente de un resto de arginina o un resto de citrulina y al menos dos de X1-X9 son un resto de citrulina, o un fragmento funcional del mismo que tiene una longitud de al menos 7 aminoácidos y que comprende al menos dos restos de citrulina, siendo dicho fragmento funcional antigénicamente eficaz y capaz de unirse específicamente a los anticuerpos específicos de artritis reumatoide.

Description

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Por tanto, el uso combinado del péptido citrulinado MAP de fórmula VII y el MAP citrulinado de fórmula VIII mejora los rendimientos diagnósticos de la prueba con respecto a los ensayos basados en un solo péptido. El uso combinado conduce a un ensayo diagnóstico de alta sensibilidad en la AR (105/147-71,5 % sueros positivos en la AR) dado que las dos poblaciones de anticuerpos identificadas en los sueros de AR se solapan pero son diferentes.
5
Ejemplo 4. Purificación de anticuerpos anti-péptidos citrulinados y usos de los mismos
Los anticuerpos anti-PC se pueden purificar del suero de pacientes de AR por medio de procedimientos de cromatografía de afinidad.
10 Un péptido citrulinado o MAP de acuerdo con la presente invención se conjugó con sefarosa activada-CNBr de acuerdo con procedimientos estándar conocidos por el experto en la técnica. Las inmunoglobulinas totales de sueros que contienen anticuerpos anti-PC se precipitaron con 50 % de sulfato amónico saturado; los precipitados se disolvieron en tampón fosfato (pH 7,4) y se dializaron durante la noche contra PBS. Las preparaciones enriquecidas
15 con inmunoglobulina se aplicaron a la columna y se recogió el flujo continuo para su posterior análisis. La columna se lavó extensamente con Na2HPO4 20 mM, NaCl 150 mM (pH 7,2) y los anticuerpos unidos a la columna se eluyeron mediante tampón glicina 0,1 M (pH 2,8) (0,5 ml/fracción), se neutralizaron inmediatamente con 50 µl de Tris 1 M (pH 8,0) y se dializaron durante la noche contra PBS. El contenido del anticuerpo anti-PC en los eluatos y el flujo continuo se analizó mediante ELISA (Fig. 1 y 2).
20 La Figura 1 muestra que la purificación de los AAPC se logró usando el péptido citrulinado [Cit17,Cit19,Cit23]H4(14-34) (fórmula IV). Por el contrario, la secuencia no citrulinada H4(14-34) y el MAP control no detectó ningún anticuerpo IG en los dos sueros de AR. La Figura 2 muestra que la purificación de los AAPC también se logró usando el péptido citrulinado [Cit35,Cit36,Cit39,Cit40,Cit45]H4(31-50) (fórmula V). Por el contrario, la secuencia no citrulinada H4(31-50) y
25 el MAP control no detectó ningún anticuerpo IG en los dos sueros de AR.
Dichos anticuerpos purificados se pueden usar como controles en los ensayos de fase sólida usando antígenos citrulinados.
30 Ejemplo 5. Papel del número y posición de las citrulinas.
El papel del número y de la posición de las citrulinas dentro de la secuencia H4(1-50) en la detección de anticuerpos específicos en sueros de AR se investigó por medio de péptidos citrulinados de forma diferente (Figuras 3-4).
35 Tabla 4: Péptidos citrulinados
Nombre de la secuencia
Secuencia
H4(14-34)
GAKRHRKVLRDNIQGITKPAI (del aa 14 al aa 34 de la SEC ID Nº 1 en la que X2-X4 son restos de arginina)
[Cit17]H4(14-34)
GAKCitHRKVLRDNIQGITKPAI (del aa 14 al aa 34 de la SEC ID Nº 1 en la que X2 es Cit y X3-X4 son restos de arginina)
[Cit19]H4(14-34)
GAKRHCitKVLRDNIQGITKPAI (del aa 14 al aa 34 de la SEC ID Nº 1 en la que X3 es Cit y X2 y X4 son restos de arginina)
[Cit23]H4(14-34)
GAKRHRKVLCitDNIQGITKPAI (del aa 14 al aa 34 de la SEC ID Nº 1 en la que X4 es Cit y X2 y X3 son restos de arginina)
[Cit17,Cit19]H4(14-34)
GAKCitHCitKVLRDNIQGITKPAI (del aa 14 al aa 34 de la SEC ID Nº 1 en la que X2 y X3 son Cit y X4 es arginina)
[Cit17,Cit23]H4(14-34)
GAKCitHRKVLCitDNIQGITKPAI (del aa 14 al aa 34 de la SEC ID Nº 1 en la que X2 y X4 son Cit y X3 es arginina)
[Cit19,Cit23]H4(14-34)
GAKRHCitKVLCitDNIQGITKPAI (del aa 14 al aa 34 de la SEC ID Nº 1 en la que X3 y X4 son Cit y X2 es arginina)
[Cit17,Cit19,Cit23]H4(14-34)
GAKCitHCitKVLCitDNIQGITKPAI, fórmula IV
H4(31-50)
KPAIRRLARRGGVKRISGLI (del aa 31 al aa 50 de la SEC ID Nº 1 en la que X5-X9 son restos de arginina)
[Cit35]H4(31-50)
KPAICitRLARRGGVKRISGLI(del aa 31 al aa 50 de la SEC ID Nº 1 en la que X5 es Cit y X6-X9 son restos de arginina)
[Cit36]H4(31-50)
KPAIRCitLARRGGVKRISGLI (del aa 31 al aa 50 de la SEC ID Nº 1 en la que X6 es Cit y X5 y X7-X9 son restos de arginina)
[Cit39]H4(31-50)
KPAIRRLACitRGGVKRISGLI (del aa 31 al aa 50 de la SEC ID Nº 1 en la que X7 es Cit y X5-X6 y X8-X9 son restos de arginina)
[Cit40]H4(31-50)
KPAIRRLARCitGGVKRISGLI (del aa 31 al aa 50 de la SEC ID Nº 1 en la que X8 es Cit y X5-X7 y X9 son restos de arginina)
[Cit45]H4(31-50)
KPAIRRLARRGGVKCitISGLI (del aa 31 al aa 50 de la SEC ID Nº 1 en la que X9 es Cit y X5-X8 son restos de arginina)
[Cit35,Cit40]H4(31-50)
KPAICitRLARCitGGVKRISGLI (del aa 31 al aa 50 de la SEC ID Nº 1 en la
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Nombre de la secuencia
Secuencia
que X5 y X8 son Cit y X6-X7 y X9 son restos de arginina)
[Cit36,Cit40]H4(31-50)
KPAIRCitLARCitGGVKRISGLI (del aa 31 al aa 50 de la SEC ID Nº 1 en la que X6 y X8 son Cit y X5, X7 y X9 son restos de arginina)
[Cit39,Cit40]H4(31-50)
KPAIRRLACitCitGGVKRISGLI (del aa 31 al aa 50 de la SEC ID Nº 1 en la que X7 y X8 son Cit y X5-X6 y X9 son restos de arginina)
(Cit40,Cit45]H4(31-50)
KPAIRRLARCitGGVKCitlSGLI (del aa 31 al aa 50 de la SEC ID Nº 1 en la que X8 y X9 son Cit y X5-X7 son restos de arginina)
[Cit35,Cit36,Cit40]H4(31-50)
KPAICitCitLARCitGGVKRISGLI (del aa 31 al aa 50 de la SEC ID Nº 1 en la que X5 X6 y X8 son Cit y X7 y X9 son restos de arginina)
[Cit35,Cit39,Cit40]H4(31-50)
KPAICitRLACitCitGGVKRISGLI (del aa 31 al aa 50 de la SEC ID Nº 1 en la que X5, X7 y X8 son Cit y X6 y X9 son restos de arginina)
[Cit35,Cit40,Cit45]H4(31-50)
KPAICitRLARCitGGVKCitISGLI (del aa 31 al aa 50 de la SEC ID Nº 1 en la que X5, X8 y X9 son Cit y X6 y X7 son restos de arginina)
[Cit36,Cit39,Cit40]H4(31-50)
KPAIRCitLACitCitGGVKRISGLI (del aa 31 al aa 50 de la SEC ID Nº 1 en la que X6, X7 y X8 son Cit y X5 y X9 son restos de arginina)
[Cit36,Cit40,Cit45]H4(31-50)
KPAIRCitLARCitGGVKCitISGLI (del aa 31 al aa 50 de la SEC ID Nº 1 en la que X6, X8 y X9 son Cit y X5 y X7 son restos de arginina)
[Cit35,Cit36,Cit39,Cit40]H4(31-50)
KPAICitCitLACitCitGGVKRISGLI (del aa 31 al aa 50 de la SEC ID Nº 1 en la que X5-X8 es Cit y X9 es arginina)
[Cit35,Cit36,Cit40,Cit45]H4(31-50)
KPAICitCitLARCitGGVKCitISGLI (del aa 31 al aa 50 de la SEC ID Nº 1 en la que X5-X6 y X8-X9 es Cit y X7 es arginina)
[Cit35,Cit39,Cit40,Cit45]H4(31-50)
KPAICitRLACitCitGGVKCitISGLI (del aa 31 al aa 50 de la SEC ID Nº 1 en la que X5, X7 y X8-X9 son Cit y X6 es arginina)
[Cit36,Cit39,Cit40,Cit45]H4(31-50)
KPAIRCitLACitCitGGVKCitISGLI (del aa 31 al aa 50 de la SEC ID Nº 1 en la que X6-X9 es Cit y X5 es arginina)
[Cit35,Cit36,Cit39,Cit40,Cit45]H4(31-50)
KPAICitCitLACitCitGGVKCitISGLI, fórmula V
[Cit3,Cit17,Cit19]H4(1-20)
SGCitGKGGKGLGKGGAKCitHCitK, fórmula III
[Cit23]H4(19-28)
RKVLCitDNIQG (del aa 19 al aa 28 de la SEC ID Nº 1 en la que X4 es Cit y X3 es arginina)
[Cit19,Cit23,Cit35,Cit36]H4(19-38)
CitKVLCitDNIQGITKPAICitCitLA (del aa 19 al aa 38 de la SEC ID Nº 1 en la que X3-X6 son Cit)
[Cit23,Cit35,C36,Cit39,Cit40]H4(22-41)
LCitDNIQGITKPAICitCitLACitCitG (del aa 22 al aa 41 de la SEC ID Nº 1 en la que X4-X8 son Cit)
[Cit23,Cit95]H4(19-28)-(91-99)
RKVLCitDNIQGKRQGCitTLYG SEC ID Nº 3
Las muestras de suero de 14 pacientes de AR y 23 SSN se analizaron mediante ELISA usando el método descrito en el ejemplo 2. Los resultados se analizaron determinando el valor de corte como la DO media de los sueros de SSN más dos desviaciones estándar y después se expresaron como un índice (DO de la muestra/DO del corte). Los
5 resultados son positivos si el índice es superior de 1,0. La media del título de anticuerpos para los grupos de AR y de SSN frente a los péptidos citrulinados de forma diferente H4(14-34) y H4(31-50) se indica en las Figuras 3 y 4, respectivamente.
Para la secuencia H4(14-34) se descubrió que al menos dos citrulinas son necesarias para discriminar entre
10 pacientes de AR y SSN (Figura 3). Como cabía esperar, la H4(14-34) no citrulinada no mostró ninguna reactividad. Además, la introducción de un único resto de citrulina en la H4(14-34) mostró que una arginina desiminada no es suficiente para permitir la detección de AAPC. Este resultado sugiere un papel activo de los aminoácidos que flanquean a la citrulina en el reconocimiento de anticuerpos.
15 Por el contrario, la introducción de dos residuos de citrulina permite la discriminación entre pacientes de AR y SSN.
En particular, el péptido [Cit17,Cit23]H4(14-34) es el péptido dicitrulinado más activo. Por tanto, para la secuencia de H4(14-34), la presencia de dos citrulinas es el requisito mínimo para el reconocimiento de AAPC en sueros de AR. Cabe destacar que la mejor discriminación entre sueros de AR y de SSN se consigue cuando las tres argininas
20 presentes en la secuencia de H4(14-34) están desiminadas.
Los datos indicados en la Figura 4 para H4(31-50) confirmaron que la ausencia de citrulinas no permitía detectar ningún AAPC ni discriminar entre AR y SSN. La introducción de una citrulina mostró una reactividad solo para [Cit40]H4(31-50), lo que sugiere un posible papel de la desiminación de la posición 40 en el reconocimiento de AAPC.
25 Entre los péptidos dicitrulinados, [Cit35,Cit40]H4(31-50) es la secuencia más reactiva. Este hallazgo demuestra fuertemente el efecto adictivo de dos citrulinas. Los derivados de H4(31-50) que contienen tres o cuatro citrulinas son capaces de discriminar entre sueros de AR y SSN pero son menos preferidos porque no son tan sensibles como [Cit35,Cit40]H4(31-50) y [Cit35,Cit36,Cit39,Cit40,Cit45]H4(31-50) (fórmula V).
30 Ejemplo 6. Análisis de los determinantes antigénicos.
10

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  1. imagen1
    imagen2
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