CN102971339A - 组蛋白瓜氨酸肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及衍生自组蛋白H4蛋白的瓜氨酸合成肽，和其在诊断自身免疫疾病特别是类风湿性关节炎（RA）中的应用。

Description

组蛋白瓜氨酸肽及其应用
发明领域
本发明涉及衍生自组蛋白H4蛋白的瓜氨酸合成肽，和其在诊断自体免疫疾病特别是类风湿性关节炎（RA）中的应用。
当前技术水平
类风湿性关节炎（RA）是以T和B细胞介导的自体免疫机制为特征的炎性关节病。在RA患者的生物液体中能检测到不同的自体抗体。一些这种自体抗体能用于RA诊断和跟踪。
最著名的RA生物标记是类风湿因子（RF），这是针对免疫球蛋白IgG同种型Fc区的IgG或IgM类抗体。然而，由于其也能在其他病理条件和老年健康个体中发现，RF不是特异性的RA标记。使用抗核周因子和抗角蛋白抗体发现RA中涉及瓜氨酸(cit)表位推进了新型高特异性RA生物标记的鉴定。不同的瓜氨酸肽和蛋白用于设定特异和灵敏的诊断试验，能识别RA自体抗体，因此通常称为抗瓜氨酸肽(CP)抗体(ACPA)[US20020143143,US20070087380,EP1946109,US20070148704,WO2009007846,WO2009000077,WO2007017556,EP1456662,WO1999028344,WO2008132264]。与RA相关的所有蛋白中，下列瓜氨酸序列用于诊断试验:纤维蛋白[C.Masson-Bessière等，J.Immunol.2001,166,4177]，胶原II[H.Burkhardt等，Eur.J.Immunol.2005,35,1643]，波形蛋白[E.R.Vossenaar等，Arthritis Rheum.2004,50,3485]，丝聚蛋白[US20090028885,US7445903,US6890720]，和病毒蛋白[C.Anzilotti等，J.Rheumatol.2006,33,647;WO2004087747]。
测试的灵敏度通过使用丝聚蛋白衍生的合成环瓜氨酸肽(CCP)来增加，[G.A.Schellekens等，J.Clin.Invest.1998,101,273][WO1998022503]，所述环瓜氨酸肽特征为使瓜氨酸最佳暴露以用于抗体结合的结构。目前，发展出三代CCP测试：CCP1(灵敏度68%,特异性98%)[G.A.Schellekens等，ArthritisRheum.2000,43,155]，CCP2(灵敏度范围39-94%,特异性范围81-100%)[J.Avouac等，Ann.Rheum.Dis.2006,65,845]，和CCP3(灵敏度范围51-83%,特异性范围93-98%)[L.Lutteri等，Clin.Chim.Acta2007,386,76]。这些RA诊断ELISA都市售可得（荷兰阿纳姆的ED公司（Euro-Diagnostica）；苏格兰敦提的轴盾公司（Axis-Shield）；美国圣地亚哥的INOVA公司）。
近来，使用爱泼斯坦-巴尔病毒的EBNA-1(VCP1)和EBNA-2(VCP2)衍生的瓜氨酸序列能设定特征为特异性和灵敏度与CCP2和CCP3测试报道的那些相似的诊断试验[F.Pratesi等，Arthritis Rheum.2006,54,733;C.Anzilotti等，J.Rheumatol.2006,33,647;WO2004087747;EP091767764]。有趣的是，基于CCP2、CCP3、VCP1和VCP2的测试性能比较表明不同的瓜氨酸序列能检测相同患者组中抗CP抗体的不同亚组。这些结果证明与XG或XnonG单位(X=瓜氨酸)的假设独有作用相比，瓜氨酸残基周围的氨基酸序列在形成抗CP表位中起重要作用[EP1693673]。
通过组蛋白表示与其他自体免疫疾病相关但尚未直接涉及RA诊断的另一类蛋白。组蛋白是核小体的成分，并且分成六类：H1、H2A、H2B、H3、H4和H5。从H1和H2B衍生的序列用于检测系统性红斑狼疮、RA和系统性硬化病中的自体抗体[WO03044054]。即使已知这些蛋白是天然脱亚胺并且通常被修饰[K.Arita等，PNAS2006,103,5291;A.J.W.Zendman等，Anal.Biochem.2007,369,232]，至今没有组蛋白瓜氨酸序列与RA相关。然而，描述用于抗体检测的基于使用经修饰组蛋白（如磷酸化、甲基化、乙酰化和泛素化）但不是瓜氨酸化的微阵列[WO07132177]。
Osborne等[Biochemistry,2007,46(46),13370-13381]描述了在位点17和19有瓜氨酸残基的组蛋白H4片段(1-21)的化学合成以用于酶学研究。
Wysocka等[Frontiers in Bioscience,2006,11,344-355]公开了体内仅在位点3被瓜氨酸化的组蛋白H4和由体外脱氨可得的在位点3、17和19有瓜氨酸残基的组蛋白H4。
Hagiwara等[Biochemistry,2005,44(15),5827-5834]公开了在位点3有Cit的组蛋白H4片段(1-23)和(1-5)。
WO2009/147201公开了结合剂，例如与包含酶促瓜氨酸组蛋白H4在内的瓜氨酸肽特异性结合的抗体。这些结合剂用于预防或治疗自体免疫疾病，特别是RA。
WO2010/117694公开了包含位点23和95处瓜氨酸残基的组蛋白H4片段组合的序列。
WO2004/078098公开了与组蛋白不相关并且主要由瓜氨酸残基组成的肽。
发明内容
本发明涉及衍生自核心组蛋白H4的瓜氨酸合成肽，及其在诊断自体免疫疾病特别是RA中的应用。RA中组蛋白脱亚氨基作用的研究产生衍生自H4的一系列瓜氨酸序列的定义。这些序列能识别对RA特异的自体抗体。根据本发明的瓜氨酸肽衍生自人H4的氨基酸序列，特别是衍生自包含所述序列氨基酸(aa)1-aa50的序列(Swiss-Prot P62805aa2-aa51)。
因此本发明的目标是通过以下定性肽
-抗原有效性和能特异结合自体免疫疾病特异性抗体，和
-从氨基到羧基末端包含氨基酸序列：
S G X1G K G G K G L G K G G A K X2H X3K V L X4D N I Q G I T K PA I X5X6L A X7X8G G V K X9I S G L I(SEQ ID No.1,式I,也称为H4(1-50))或其至少7个氨基酸长的功能片段，其中所述氨基酸X1-X9独立选自精氨酸残基或瓜氨酸残基，并且X1-X9中至少两个是瓜氨酸残基。
本发明所述的和具有至少两个瓜氨酸残基的肽，显示对RA的特异诊断非常合适。
对包含至少7个aa残基和衍生自H4(1-50)(式I)的更短肽序列特别感兴趣。
优选所述肽是SEQ ID No.1的功能片段，并且包含所述氨基酸序列S G X1G K G G K G L G K G G A K X2H X3K(SEQ ID No.1的aa1-aa20)或G A KX2H X3K V L X4D N I Q G I T K P A I(SEQ ID No.1的aa14-aa34，也称为H4(14-34))或K P A I X5X6L A X7X8G G V K X9I S G L I(SEQ ID No.1的aa31-aa50，也称为H4(31-50))或其至少7个氨基酸长的功能片段，其中所述氨基酸X1-X9独立选自精氨酸残基或瓜氨酸残基，并且X1-X7中至少两个是瓜氨酸残基。
优选，所述肽包含序列S G Cit G K G G K G L G K G G A K Cit H Cit K VL Cit D N I Q G I T K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L I(SEQ ID No.1，其中所有X1-X9是瓜氨酸(Cit)残基，式II)或是其至少7个氨基酸长的功能片段。
优选，所述肽包含选自下组的序列：S G Cit G K G G K G L G K G G A KCit H Cit K(SEQ ID No.1的aa1-aa20，其中X1-X3是瓜氨酸(Cit)残基，式III)，G A K Cit H Cit K V L Cit D N I Q G I T K P A I(SEQ ID No.1的aa14-aa34，其中X2-X4是瓜氨酸(Cit)残基，式IV)，K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit IS G L I(SEQ ID No.1的aa31-aa50，其中X5-X9是瓜氨酸(Cit)残基，式V)或是其至少7个氨基酸长的功能片段。
优选，上述肽是线形形式或多亚基分支肽形式或其他偶联复合体形式。
多亚基分支肽优选由以下组成：
-MAP核结构；
-有式III、IV和/或V的氨基酸序列的线形肽，通过化学键结连接每一个MAP核结构的氨基末端残基，其中线形肽彼此相同或不同。
根据本发明，MAP核结构是：
Figure BDA00002661627300041
其中，X是有至少两个氨基功能残基的氨基酸，Y是选自丙氨酸和/或甘氨酸和/或用作为间隔物的分子的氨基酸，m是0或1，n1n2n3n4是包括0-10的整数，并且其中键是脲基键。
MAP或偶联物包含多个拷贝的瓜氨酸线形合成肽或上述来源的抗原有效片段，与免疫惰性氨基酸核心结合，因此也在本发明范围内。
仍然优选地，所述肽包含4个如上述肽的相同拷贝。
在一个优选的实施方式中，所述肽选自下组：
(S G Cit G K G G K G L G K G G A K Cit H Cit K)4K2Kβ(式VI):
Figure BDA00002661627300051
(G A K Cit H Cit K V L Cit D N I Q G I T K P A I)4K2Kβ(式VII),
Figure BDA00002661627300052
或
(K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L I)4K2Kβ(式VIII),
Figure BDA00002661627300053
其中，Cit是瓜氨酸残基，和βA是β丙氨酸残基。
优选，通过抗原有效性和能特异结合类风湿性关节炎特异性抗体来鉴定所述肽。
该发明的进一步目标是诊断对象中自体免疫疾病的方法，包含检测生物样品中自体免疫疾病特异性抗体的步骤，这是通过
-合适条件下所述生物样品与至少一个本发明的肽反应以产生复合物；
-检测所述复合物。
当肽以MAP或其他偶联复合物形式应用（特别是采用四价MAP形式）时，该方法有更高的灵敏度和特异性。
发现基于具有式VI、VII或VIII瓜氨酸肽的MAP使用的方法在测试中产生检测特异性RA抗体的最高灵敏度和特异性。因此，优选所述生物样品与至少一种本发明的式III、IV、V、VI、VII或VIII的肽反应。在另一个优选的实施方式中，方法是基于联用式III、IV和V的肽或者联用式VII的MAP和式VIII的MAP，以鉴定特异性RA抗体。
优选地，所述生物样品与包含以下所述序列(G A K Cit H Cit K V L Cit DN I Q G I T K P A I)4K2KβA的肽，
和包含以下所述序列的肽反应
(K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L I)4K2KβA,
Figure BDA00002661627300062
其中，Cit是瓜氨酸残基，和βA是β丙氨酸残基。
仍然优选所述方法是免疫试验。
本发明的另一个目标是诊断自体免疫疾病的药盒，所述药盒包含至少一个如上述的肽或其至少7个氨基酸长的功能片段。
优选地，所述药盒包含以下所述序列(G A K Cit H Cit K V L Cit D N I Q GI T K P A I)4K2KβA的肽，
Figure BDA00002661627300063
和包含以下所述序列的肽
(K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L I)4K2KβA,
Figure BDA00002661627300064
其中，Cit是瓜氨酸残基，和βA是β丙氨酸残基。
特别地，所述药盒能够检测生物液体中的抗CP抗体。所述药盒包含上述定义瓜氨酸肽之一或其功能片段，和至少一种其他试剂。优选地，所述其他试剂是能与发色底物反应的酶偶联的抗人体免疫球蛋白。所述药盒也可以包含使用说明书。
优选本发明的方法和/或本发明的药盒是用于诊断类风湿性关节炎。
本发明的另一个目标是针对上述肽的抗体，以用于自体免疫疾病的诊断试验。
优选地，所述自体免疫疾病是类风湿性关节炎。
对诊断应用而言，本发明所述的肽能用于检测RA患者生物液体中出现的特异性抗体。在另一个优选的实施方式中，所述肽能用于检测循环和组织浸润的自体反应B和T细胞。
在本发明的另一个实施方式中，上述结合合适树脂的肽能用于抗体移除。
自体免疫患者的生物液体中出现的抗体会与本发明的肽结合。如上所示，线形形式或者MAP形式的本发明瓜氨酸肽特别适合用作试验中的抗原以检测生物液体样品中的自体免疫疾病特异性抗体的存在和/或测量其水平，例如抗CP抗体。
为完成此分析，所述肽可以吸附或共价连接或修饰有载体以结合固体支持物（例如芯片，微球，金，聚苯乙烯，反应容器或孔，微量滴定板）。该方法第一步中，待分析的生物液体样品放置成接触本发明的肽并用其孵育，所述肽可连接于固体支持物上。可能在样品中出现的自体免疫疾病特异性抗体如抗CP抗体，因而特异性结合本发明的肽，产生抗原/抗体复合物。免疫试验中检测的抗CP抗体是IgG、IgA或IgM免疫球蛋白。抗原/抗体复合物的存在和数量能用光谱，压电或电化学生物传感器完成。
上述方法可以是免疫试验，其中指示抗体如抗人体免疫球蛋白与酶偶联并加入以通过光谱转换器来测量抗体效价。
发现基于具有式VI、VII或VIII瓜氨酸肽的MAP使用的方法在测试中产生检测特异性RA抗体的最高灵敏度和特异性。因此，优选所述生物样品与至少一种本发明的式III、IV、V、VI、VII或VIII的肽反应。在另一个优选的实施方式中，方法是基于联用式III、IV和V的肽或者联用式VII的MAP和式VIII的MAP，以鉴定特异性RA抗体。
本发明中抗原有效性指肽或其功能片段能特异性结合自体免疫疾病特异性抗体。特别地，所述肽或其功能片段能特异结合类风湿性关节炎特异性抗体。
具体实施方式
通过参考下图非限制性实施例阐述本发明。
图1.抗CP抗体从RA患者的两个不同代表性血清中纯化，使用肽[Cit17,Cit19,Cit23]H4(14-34)(即SEQ ID No.1的aa14-aa34，其中X2-X4是瓜氨酸(Cit)残基，式IV)，非瓜氨酸序列H4(14-34)，和序列(EEEDEDMGFGLFD)4-K2-K-βA(SEQ ID No.2)的不相关对照MAP。使用所述瓜氨酸肽[Cit17,Cit19,Cit23]H4(14-34)(式IV)完成抗瓜氨酸肽抗体(ACPA)的纯化。相反，所述非瓜氨酸序列H4(14-34)和所述对照MAP没有检测出两个RA血清中的任何IgG抗体。
图2.抗CP抗体从RA患者的两个不同代表性血清中纯化，使用肽[Cit35,Cit36,Cit39,Cit40,Cit45]H4(31-50)(即SEQ ID No.1的aa31-aa50，其中X5-X9是瓜氨酸(Cit)残基，式V)，非瓜氨酸序列H4(31-50)，和序列(EEEDEDMGFGLFD)4-K2-K-βA(SEQ ID No.2)的不相关对照MAP。使用瓜氨酸肽[Cit35,Cit36,Cit39,Cit40,Cit45]H4(31-50)(式V)完成ACPA的纯化。相反，所述非瓜氨酸序列H4(31-50)和所述对照MAP没有检测出两个RA血清中的任何IgG抗体。
图3.RA和NHS组对H4(14-34)的不同瓜氨酸序列的平均抗体效价。
图4.RA和NHS组对H4(31-50)的不同瓜氨酸序列的平均抗体效价。
图5.RA和NHS组对H4(1-50)中所含瓜氨酸重叠肽的平均抗体效价。
实施例
实施例1肽合成
肽用预加载C末端氨基酸序列或MAP核心的Wang树脂遵照Fmoc/tBu固相肽策略合成[R.B.Merrifield J.Am.Chem.Soc.1963,85,2149;E.Atherton等，牛津:IRL出版社（Oxford:IRL Press）1989;J.P.Tam Proc.Natl.Acad.Sci.USA1988,85,5409]。Fmoc脱保护用含20%哌啶的DMF在20分钟内完成。偶联反应用溶于DMF的0.5M Fmoc保护氨基酸和HOBt溶液（2.5当量）、溶于DMF的0.5M TBTU溶液（2.5当量）和溶于DMF的4M NMM溶液（5当量）处理树脂45分钟完成。从树脂上切割肽和氨基酸侧链去保护用TFA/茴香硫醚/乙二硫醇/苯酚/H2O（82.5:5:2.5:5:5）处理3小时完成。粗产品用冷Et2O沉淀，离心并冻干。纯化肽用HPLC获得，纯度>95%，并用质谱分析鉴定（ESI-Orbitrap和/或MALDI-TOF）。
实施例2测定抗瓜氨酸肽抗体的ELISA
根据本发明的瓜氨酸肽抗原的MAP在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中稀释到10μg/ml浓度，并加样到聚苯乙烯微量滴定板的孔中（50μl/孔）。平板+4°C放置过夜，使得肽与塑料相互作用；然而，可以37°C孵育1-2小时得到同一结果。包被期结束后，含有抗原的孔加上同样数目用作对照的孔，在室温（RT）用溶于PBS的3%牛血清白蛋白（BSA）处理1小时。患者血清样品（在缓冲液中1:200稀释，所述缓冲液由溶于PBS的1%BSA、0.05%吐温X-100构成）加入平板（50μl/孔）并RT下孵育3小时。孵育期后，用1%PBS吐温X-100清洗一次，PBS清洗两次（150μl/孔）。与碱性磷酸酶偶联的抗人体－IgG、IgM或IgA抗体用于显示抗原/抗体反应发生。抗体（50μl/孔）RT搅拌孵育3小时。孵育结束时，如上所述完成三次清洗后，将碱性磷酸酶底物（对硝基苯基磷酸酯）加入孔中，存在酶时其产生黄色产物，可用分光光度技术在405nm波长测量；数量与结合抗体的效价成比例。检测结果用阳性百分率表示，通过每个血清样品吸光率除以任意设定为值100的阳性血清样品吸光率计算。
97例RA患者和34例正常健康对象(NHS)的血清样品通过此方法使用式III、IV或V的肽测试。
高于正常对照血清组百分之97.5的结果定义为阳性，数据示于表1。
表1.就式III、IV和V的肽测试的总体血清中的阳性血清数目。
101例RA患者和48例NHS的血清样品通过此方法使用式III、IV或V的MAP测试。
另外，RA以外疾病对照的91例血清样品(系统性硬化病、混合型冷球白血症、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎和银屑病性关节炎)通过此方法使用式III、IV或V的MAP测试，显示了最有趣的反应性。
高于正常对照血清组(NHS)百分之97.5的结果定义为阳性，数据示于表2。
表2.就式VI、VII和VIII的MAP肽测试的总体血清中的阳性血清数目。
式 RA阳性血清 NHS Ssc MC SLE AS PA
VI 28/101 2/48 3/7 1/12 6/48 5/12 1/12
VII 65/101 2/48 1/7 0/12 3/48 0/12 0/12
VIII 61/101 1/48 0/7 0/12 1/48 1/12 0/12
*其中:RA=类风湿性关节炎，NHS=正常健康对象，Ssc=系统性硬化，MC=混合型冷球白血症，SLE=系统性红斑狼疮，AS=强直性脊柱炎，PA=银屑病性关节炎。
三个试验的总体灵敏度和特异性示于下表3。
表3.所述试验的灵敏度和特异性基于式VI、VII、VIII的肽。
式 灵敏度 特异性**
VI 28% 85%
VII 65% 96%
VIII 60% 98%
**在表2所示的NHS和疾病对照群中测定
进行全蛋白H4的表位作图，并且数据显示包含式I不同瓜氨酸肽的N末端部分H4(1-50)对应分子的抗原部分。特别地，所述H4(1-50)的瓜氨酸化C末端部分有高度活性，并且表1-3报道的数据显示式III-VIII的序列能用于识别RA血清。
值得注意地是，直到现在，组蛋白和其瓜氨酸化从来没有与RA相关，而熟知针对SLE患者血清中出现的抗体的反应性[WO03044054]。表3中报道的数据显示式VII和VIII的序列对RA的极好灵敏度和特异性。非常有趣地和令人惊讶地，式VII的MAP和式VIII的MAP都没有显示在检测SLE患者血清中对特异性抗体的显著反应性。因此，本发明的作者证明了包含H4(1-50)区域的瓜氨酸肽序列和RA患者血清中自体抗体的特异性识别之间的未预期的相关性。因此，这些肽是所述疾病的生物标记。
另外，本发明的序列对象不与任何一个已经用于检测抗CP抗体的蛋白或肽(如纤维蛋白、胶原II、波形蛋白、丝聚蛋白、病毒蛋白和合成的CCP)重叠。这显示了H4(1-50)衍生的肽序列对识别抗CP抗体的新作用，所述识别在式VII和VIII的MAP示例中有63-67%灵敏度和96-97%特异性。
实施例3基于同时应用式VII的MAP和式VIII的MAP的ELISA的诊断属性
为实现高敏感性免疫测定，式VII的MAP和式VIII的MAP的等摩尔混合物RT下吸附于96孔微量滴定板4小时。然后按照实施例2所述进行检测。
分析针对式VII和VIII的MAP肽的抗体测试的147例RA患者的第二独立群，作者发现：
–87/147(59%)RA患者识别式VII的肽；
–89/147(61%)RA患者识别式VIII的肽。
更详细分析对式VII的肽或式VIII的肽阳性的该RA患者群，作者发现：
–71/147(48%)与式VII和VIII的两个肽反应；
–16/147(11%)血清仅对式VII的肽阳性；
–18/147(12%)血清仅对式VIII的肽阳性
因此，式VII的瓜氨酸肽MAP和式VIII的瓜氨酸MAP的联用提高所述测试在单个肽试验中的诊断性能。所述联用导致RA高灵敏度诊断试验(105/147–71,5%RA阳性血清)，因为RA血清中鉴定的所述两个抗体群重叠但不同。
实施例4抗瓜氨酸肽抗体的纯化及其应用
抗CP抗体能用亲和色谱方法从RA患者血清中纯化。
根据本领域技术人员已知的标准方法，本发明所述的瓜氨酸肽或MAP与CNBr激活的琼脂糖偶联。包含抗CP抗体血清的全部免疫球蛋白用50%饱和硫酸铵沉淀，沉淀物溶于磷酸盐缓冲液（pH7.4）并用PBS透析过夜。富集的免疫球蛋白制品过柱，收集流出液用于随后分析。柱用20mM Na2HPO4、150mM NaCl(pH7.2)充分洗涤，柱上结合的抗体用0.1M甘氨酸缓冲液（pH2.8）（0.5ml/组分）洗脱，立即用50μl Tris1M(pH8.0)中和，并且PBS透析过夜。通过ELISA测试洗脱液和流出液中的抗CP抗体含量(图1和2)。
图1显示使用所述瓜氨酸肽[Cit17,Cit19,Cit23]H4(14-34)(式IV)完成ACPA的纯化。相反，所述非瓜氨酸序列H4(14-34)和所述对照MAP没有检测出两个RA血清中的任何IgG抗体。图2显示还使用所述瓜氨酸肽[Cit35,Cit36,Cit39,Cit40,Cit45]H4(31-50)(式V)完成ACPA的纯化。相反，所述非瓜氨酸序列H4(31-50)和所述对照MAP没有检测出两个RA血清中的任何IgG抗体。
所述纯化抗体在使用瓜氨酸抗原的固相分析中用作对照。
实施例5瓜氨酸数目和位点的作用。
通过不同瓜氨酸肽方法分析H4(1-50)序列内瓜氨酸数目和位点对检测RA血清中特异性抗体的作用（图3-4）。
表4：瓜氨酸肽
Figure BDA00002661627300121
Figure BDA00002661627300131
Figure BDA00002661627300141
14例RA患者和23例HNS的血清样品用实施例2所述方法通过ELISA检测。分析结果，测定截留值作为NHS血清的OD平均值加上两个标准偏差，然后表示为指数(OD样品/OD截留)。如果所述指数高于1,0，结果是阳性。RA和NHS组的不同瓜氨酸肽对H4(14-34)和H4(31-50)的平均抗体效价分别在图3和4中报道。
对序列H4(14-34)而言，发现需要至少两个瓜氨酸以区分RA和NHS患者(图3)。如所预期，所述非瓜氨酸H4(14-34)没有显示任何反应性。另外，在H4(14-34)中引入单个瓜氨酸残基显示一个脱亚胺的精氨酸不足以检测ACPA。这个结果显示瓜氨酸的侧接氨基酸在抗体识别中的活性作用。
相反，引入两个瓜氨酸残基能区分RA和NHS患者。
特别地，所述肽[Cit17,Cit23]H4(14-34)是活性最高的二瓜氨酸肽。因此，对序列H4(14-34)而言，RA血清中识别ACPA的最低要求是出现两个瓜氨酸。应该注意当H4(14-34)序列中的所有三个精氨酸脱亚胺时，实现RA和NHS血清之间的最佳区分。
图4中就H4(31-50)报道的数据证明了瓜氨酸的消失没有能检测到任何ACPA和区分RA与NHS。引入一个瓜氨酸显示只对[Cit40]H4(31-50)的反应性，提示ACPA识别中位点40脱亚胺化的可能作用。在二瓜氨酸肽中，[Cit35,Cit40]H4(31-50)是最具反应性的序列。这个发现有力证明了两个瓜氨酸的累加作用。包含3个或4个瓜氨酸的H4(31-50)衍生物能区分RA和NHS血清，但是由于没有[Cit35,Cit40]H4(31-50)和[Cit35,Cit36,Cit39,Cit40,Cit45]H4(31-50)(式V)灵敏，所以较不优选。
实施例6抗原决定簇的分析
使用选定的重叠肽研究H4(1-50)序列内部出现的抗原决定簇，以在每个序列中包含最大数目的瓜氨酸(表5和图5)。
表5.在H4(1-50)中用于定义抗原决定簇的重叠肽。
在线形肽上进行所述研究:[Cit3,Cit17,Cit19]H4(1-20)(SEQ ID No.1的aa1-aa20，其中X1-X3是瓜氨酸(Cit)残基，式III)，[Cit17,Cit19,Cit23]H4(14-34)(SEQID No.1的aa14-aa34，其中X2-X4是瓜氨酸(Cit)残基，式IV)，[Cit23]H4(19-28)(SEQ ID No.1的aa19-aa28，其中X4是瓜氨酸残基)，[Cit19,Cit23,Cit35,Cit36]H4(19-38)(SEQ ID No.1的aa19-aa38，其中X3-X6是瓜氨酸残基)，[Cit23,Cit35,Cit36,Cit39,Cit40]H4(22-41)(SEQ ID No.1的aa22-aa41，其中X4-X8是瓜氨酸残基)，[Cit35,Cit36,Cit39,Cit40,Cit45]H4(31-50)(SEQ ID No.1的aa31-aa50，其中X5-X9是瓜氨酸(Cit)残基，式V)。
18例RA患者和23例HNS的血清样品用实施例2所述方法通过ELISA检测。分析结果，测定截留值作为NHS血清的OD平均值加上两个标准偏差，然后表示为指数(OD样品/OD截留)。如果所述指数高于1,0，结果是阳性。RA和NHS组对肽的平均抗体效价示于图5。
用式III-V的肽但不用[Cit19,Cit23,Cit35,Cit36]H4(19-38)或[Cit23,Cit35,Cit36,Cit39,Cit40]H4(22-41)，完成区分RA和NHS血清。有趣地是，所述序列[Cit19,Cit23,Cit35,Cit36]H4(19-38)和[Cit23,Cit35,Cit36,Cit39,Cit40]H4(22-41)有较小的反应性，尽管其比[Cit3,Cit17,Cit19]H4(1-20)和[Cit17,Cit19,Cit23]H4(14-34)包含更多瓜氨酸。这个结果提示瓜氨酸残基的侧接氨基酸的重要性。所述肽[Cit35,Cit36,Cit39,Cit40,Cit45]H4(31-50)(式V)显示此序列中的最佳反应性。
在此实验中，合成所述肽[Cit23,Cit95]H4(19-28)-(91-99),Arg19-Lys-Val-Leu-Cit-Asp-Asn-Ile-Gln-Gly28-Lys91-Arg-Gln-Gly-Cit-Thr-Leu-Tyr-Gly99(SEQ ID No.4)，并且在相同血清组上测试，以比较其与本发明和H4(1-50)序列包含的分子对象的反应性。使用[Cit23,Cit95]H4(19-28)-(91-99)或使用肽[Cit23]H4(19-28)没有观察到RA和NHS血清之间的显著区分。这个数据提示组蛋白H4蛋白中的抗原决定簇定位在1-50区域内。
也考虑到表3报道的数据，能假设出现两个不同的抗原有效结构域，定位在17-23和35-45区域中的H4(1-50)内部。
Figure IDA00002661627900011
Figure IDA00002661627900021
Figure IDA00002661627900031

Claims (17)

1.一种肽，所述肽的特征为
-抗原有效性和能特异结合自体免疫疾病特异性抗体，和
-从氨基到羧基末端包含氨基酸序列：
S G X1G K G G K G L G K G G A K X2H X3K V L X4D N I Q G I T K PA I X5X6L A X7X8G G V K X9I S G L I(SEQ ID No.1)或其至少7个氨基酸长的功能片段，其中所述氨基酸X1-X9独立选自精氨酸残基或瓜氨酸残基，并且X1-X9中至少两个是瓜氨酸残基。
2.如权利要求1所述的肽，其特征在于，所述SEQ ID No.1的功能片段包含所述氨基酸序列S G X1G K G G K G L G K G G A K X2H X3K(SEQ IDNo.1的aa1-aa20)或G A K X2H X3K V L X4D N I Q G I T K P A I(SEQ IDNo.1的aa14-aa34)或K P A I X5X6L A X7X8G G V K X9I S G L I(SEQ IDNo.1的aa31-aa50)或其至少7个氨基酸长的功能片段，其中所述氨基酸X1-X9独立选自精氨酸残基或瓜氨酸残基，并且X1-X7中至少两个是瓜氨酸残基。
3.如权利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽包含序列S G Cit G K G GK G L G K G G A K Cit H Cit K V L Cit D N I Q G I T K P A I Cit Cit L A Cit CitG G V K Cit I S G L I(SEQ ID No.1，其中所有X1-X9是瓜氨酸(Cit)残基，式II)或其至少7个氨基酸长的功能片段。
4.如权利要求2所述的肽，其特征在于，所述肽包含选自下组的序列：SG Cit G K G G K G L G K G G A K Cit H Cit K(SEQ ID No.1的aa1-aa20，其中X1-X3是瓜氨酸(Cit)残基)，G A K Cit H Cit K V L Cit D N I Q G I T K P A I(SEQ ID No.1的aa14-aa34，其中X2-X4是瓜氨酸(Cit)残基)，K P A I Cit Cit LA Cit Cit G G V K Cit I S G L I(SEQ ID No.1的aa31-aa50，其中X5-X9是瓜氨酸(Cit)残基)或其至少7个氨基酸长的功能片段。
5.如前述权利要求中任一项所述的肽，其特征在于，所述肽是线形的。
6.如权利要求1-4中任一项所述的肽，其特征在于，所述肽是多亚基分支肽的形式。
7.如权利要求6所述的肽，其特征在于，所述肽包含4个如权利要求1-4所述肽的相同拷贝。
8.如权利要求7所述的肽，其特征在于，所述肽选自：
(S G Cit G K G G K G L G K G G A K Cit H Cit K)4K2KβA,
Figure FDA00002661627200021
(G A K Cit H Cit K V L Cit D N I Q G I T K P A I)4K2KβA,
Figure FDA00002661627200022
或
(K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L I)4K2KβA,
Figure FDA00002661627200023
其中，Cit是瓜氨酸残基，和βA是β丙氨酸残基。
9.如前述权利要求中任一项所述的肽，其特征在于，所述自体免疫疾病是类风湿性关节炎。
10.一种诊断对象中自体免疫疾病的方法，所述方法包含在生物样品中检测自体免疫疾病特异性抗体的步骤，通过：
-合适条件下使所述生物样品与至少一种如权利要求1-9中任一项所述的肽反应以产生复合物；
-检测所述复合物。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述生物样品与包含序列(GA K Cit H Cit K V L Cit D N I Q G I T K P A I)4K2KβA的肽，
Figure FDA00002661627200024
和包含以下所述序列的肽反应
(K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L I)4K2KβA,
Figure FDA00002661627200031
其中，Cit是瓜氨酸残基，和βA是β丙氨酸残基。
12.如权利要求10或11中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法是免疫学试验。
13.一种自体免疫疾病的诊断药盒，所述药盒包括至少一种如权利要求1-9中任一项所述的肽，或其至少7个氨基酸长的功能片段。
14.如权利要求13所述的药盒，其特征在于，所述药盒包含所述序列(G AK Cit H Cit K V L Cit D N I Q G I T K P A I)4K2KβA的肽，
Figure FDA00002661627200032
和包含以下所述序列的肽
(K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L I)4K2KβA,
Figure FDA00002661627200033
其中，Cit是瓜氨酸残基，和βA是β丙氨酸残基。
15.如权利要求10所述的方法或权利要求13所述的药盒，其特征在于，所述自体免疫疾病是类风湿性关节炎。
16.针对如权利要求1-9中任一项所述的肽的抗体，所述抗体用于自体免疫疾病的诊断试验。
17.如权利要求16所述的抗体，其特征在于，所述自体免疫疾病是类风湿性关节炎。
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