ES2539125T3

ES2539125T3 - Método para reprogramar células diferenciadas

Info

Publication number: ES2539125T3
Application number: ES09710897.1T
Authority: ES
Inventors: Maria Pia Cosma; Frederic Lluis Viñas
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-02-13
Filing date: 2009-02-10
Publication date: 2015-06-26
Anticipated expiration: 2029-02-10
Also published as: US20100311170A1; EP2090649A1; WO2009101084A1; EP2271746B1; EP2271746A1

Abstract

Un método in vitro para reprogramar una célula diferenciada aislada en una célula madre indiferenciada, que comprende la etapa de fusionar dicha célula diferenciada con una célula pluripotente aislada, en donde dicha célula pluripotente aislada se trata in vitro con una cantidad adecuada de activador de la ruta Wnt/ β-catenina que es al menos una isoforma de la proteína Wnt o un inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa-3.

Description

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experimentales restantes.

Los autores analizaron entonces los efectos del tratamiento con BIO en el transcurso del tiempo. Las células fusionadas PEG ES-neo x NS-Oct4-puro se cultivaron durante 12, 24, y 48 h con esta concentración optimizada de 5 BIO (1 µM; Figura 2B). Tras 24 h de tratamiento, los autores obtuvieron hasta 70 veces más de clones reprogramados (desde 200 a 1.500 de clones totales), con respecto al control (Figura 5A). La reprogramación era dependiente del tiempo de estimulación con BIO, con una disminución del número de clones reprogramados tras 48 h de tratamiento. Los híbridos seleccionados se reprogramaban ya que mostraban un fenotipo tipo ES, eran positivos a AP, y expresaban GFP-puro (Figura 5A, B). Sin embargo para excluir el papel del BIO como un 10 potenciador de la fusión celular, los autores llevaron a cabo más experimentos de control. El BIO no potenciaba la fusión mediada por PEG de células ES, ya que solo había un ligero aumento del número de clones tras la fusión de células ES-neo pre-tratadas con BIO con células ES-higro (Figura 6A). En la fusión de células ES x ES, los autores solo podían seleccionar híbridos y no clones reprogramados, y el número de clones que se obtenía era comparable. Además, para excluir de una mejor manera la posibilidad de que BIO tenía una actividad fusiogénica en diferentes 15 tipos celulares, los autores fusionaron PEG células ES-neo x NS-Oct4-puro durante 3 horas y luego volvieron a colocar los híbridos a una dilución tal que las células no tuvieran contacto entre ellas. Así, se añadió BIO al medio celular durante 12, 24, 48 y 72 h (Figura 6B). Los híbridos se formaron antes de la adición de BIO y no podían aumentar ya que las células no se tocaban entre ellas. Aun así, sin embargo, los clones se seleccionaron con un pico a las 24 h del tratamiento con BIO (Figura 6B). Esto confirma además que BIO aumenta la reprogramación, y no

20 la fusión, de células.

La inhibición de GSK-3 con BIO también aumentaba sorprendentemente el número de colonias reprogramadas cuando se fusionaban células MEF y timocitos con células ES. Las células híbridas PEG de ES-neo x MEF-higro y ES-higro x timocitos-neo se cultivaron en BIO durante 12, 24 y 48 h, y se seleccionaron por doble fármaco. Había

25 hasta 20 veces (entre 200 y 1.500 clones totales) y nueve veces (entre 20 y 100 clones totales) de aumento, respectivamente, en el número de clones reprogramados seleccionados, con respecto a sus controles (fusiones en ausencia de BIO; Figura 5C, E). De nuevo, la eficiencia era más baja con el aumento del tiempo de tratamiento con BIO. Todos los clones seleccionados mostraban un fenotipo tipo ES y eran positivos a AP (Figura 5C-F).

30 Estos datos demuestran que la inhibición transitoria de GSK-3 aumenta mucho la capacidad de las células ES para reprogramar células somáticas. Además, esta reprogramación existe en un tiempo variable a lo largo de los diferentes tipos celulares.

La estabilización cíclica de imagen11 -catenina en células ES aumenta su capacidad para reprogramar células NS

35 Los autores entonces se preguntaban si la activación de la ruta Wnt/β-catenina en células ES fortalecería y aumentaría su capacidad de reprogramación. Por lo tanto los autores investigaron si un aumento de la reprogramación se produce cuando se cultivan las células ES y/o NS con Wnt3a o BIO durante 12, 24, 48, 72 y 96 h, y se fusionan con células NS-Oct4-puro cultivadas en ausencia de BIO. Se apreciaron aumentos de hasta 15 veces

40 (aproximadamente 600 clones totales) u 80 veces (aproximadamente 2000 clones totales en el número de clones reprogramados cuando se pre-cultivaban las células ES durante 24 h y 96 h con Wnt3a o BIO, respectivamente (Figuras 7A y 9A); los clones seleccionados mostraban un fenotipo tipo célula ES, eran positivas a AP, y expresaban Oct4 (Figuras 7A y 9A, B). Por el contrario, había un escaso aumento de reprogramación de NS con las células ES cultivadas con Wnt3a o BIO durante 12, 48 y 72 h. Para asegurar que el pre-tratamiento de células ES con BIO

45 antes de fusionarlas con células NS-Oct4-puro no aumentaba la fusión, las células fusionadas PEG se cultivaron durante 3 h, un tiempo para que se produzca la reprogramación, y se llevó a cabo un análisis FACS. Se apreciaba el mismo número de clones híbridos si las células ES se pre-trataban o no con BIO antes de la fusión, lo que excluía una actividad fusiogénica aumentada, dependiente de BIO (Figura 8). Los autores por lo tanto se preguntaban por qué había una onda parabólica de reprogramación a lo largo de los periodos de tratamiento Wnt3a y BIO. Esto

50 parece que se debe a la acumulación de β-catenina en las células tratadas con Wnt3a y BIO a las 24 h y 96 h (Figuras 7B y 9C), y su posterior localización en el núcleo celular en estos dos momentos del tratamiento (Figuras 7C y 9D). Estos datos muestran que la reprogramación puede desencadenarse solo tras la acumulación cíclica de βcatenina. Mientras que a las 12 h de tratamiento con Wnt3a o BIO no se acumulaba suficiente β-catenina para desencadenar la reprogramación, a las 24 h (y 96 h) de pre-tratamiento con Wnt3a y BIO de las células ES se

55 producía la acumulación de β-catenina; en los mismos momentos, se expresaban también Axin2, Dkk4 y APC, dando lugar a un bucle de retroalimentación negativa en la ruta Wnt/β-catenina (Bazzi et al., 2007; Doble et al., 2007; Jho et al., 2002; Lustig et al., 2002; Niida et al., 2004; Yan et al., 2001) que afectaba los momentos posteriores de 48 h y 72 h (Figuras 7B, D, E y 9C, E, F, y datos no mostrados). La ola de acumulación de β-catenina es similar en las células ES tratadas con Wnt3a y BIO. Esto puede ser debido a la baja concentración de BIO que se utiliza

60 aquí, que puede no inhibir la actividad de GSK-3 completamente, lo que se parece al bucle de regulación de retroalimentación en las células tratadas con Wnt3a. Además, con 1 µM de BIO, la cantidad de fosfo-β-catenina en células ES era mayor con respecto a las células tratadas con concentraciones crecientes de BIO, y además, la acumulación nuclear de la forma no fosforilada era bastante baja. Esto da lugar a la conclusión de que la GSK-3 no se inhibía completamente por 1 µM de BIO (Figura 10B, C). Para confirmar que el aumento de la expresión de Axin2

65 se evitaba con la reprogramación, los autores generaron clones ES estables que sobre-expresaban Axin2 (ES

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Axin2) y las fusionaron con células NS-Oct4-puro. Se seleccionaron los clones no reprogramados tras la fusión con cinco diferentes clones ES-Axin2 (Figura 11). En conclusión, la activación de la ruta Wnt/β-catenina es un mecanismo clave para la reprogramación de células somáticas, y solo cuando se acumula la β-catenina en las células ES en un cierto umbral pueden estas células reprogramar las células NS tras la fusión.

5 De manera notable, las células ES tratadas con Wnt3a y BIO expresaban los mismos niveles de genes pluripotentes Nanog, Oct4, Rex1 y Fgf4 en todos los momentos de tratamiento, mientras que la expresión de genes dependientes de β-catenina Cdx1, Axin2 y Dkk4 era cíclica de acuerdo con la acumulación de la misma proteína β-catenina (Figuras 7D, E y 9E, F). Es digno de mención que, aunque c-Myc, un conocido gen diana de β-catenina (He et al.,

10 1998) había demostrado previamente que aumentaba la reprogramación cuando se sobre-expresaba junto con otros tres genes (Takahashi y Yamanaka, 2006), aquí se expresaba constantemente bajo los tratamientos con Wnt3a y BIO. Estos datos sugieren que el pretratamiento de las células ES con Wnt3a o BIO da como resultado la activación de la ruta de señalización Wnt/β-catenina y la expresión de genes diana específicos de β-catenina que a su vez, estimulan la reprogramación de células somáticas. Esta ruta es independiente de Nanog, Oct4, Rex1, Fgf4 y c-Myc;

15 además, estos genes se expresaban a los mismos niveles durante los diferentes tratamientos con Wnt3a y BIO.

El pre-tratamiento alternativo de células NS con BIO daba lugar a la acumulación de β-catenina a las 24 h y las 72 h, pero proporcionaba escaso aumento de la reprogramación, con solo un ligero aumento en el número de clones tipo células ES, positivas a AP (Figura 9A y Figura 12). Por lo tanto la ruta de señalización Wnt/ β-catenina dirige un

20 notable aumento de reprogramación de células somáticas solo cuando es activada en células ES.

A continuación, los autores querían caracterizar mejor el mecanismo de activación de reprogramación y asegurarse de que la β-catenina es un factor clave en el mecanismo de reprogramación de células somáticas. Los autores se preguntaban si las células ES que expresan niveles diferentes de β-catenina tienen diferentes capacidades de 25 reprogramación. Para esto, los autores generaron clones ES estables que sobre-expresaban diferentes niveles de la β-catenina estabilizada (ES-β-catenina) que albergan una mutación en uno de sus sitios de fosforilación dependiente del complejo de destrucción. Los autores seleccionaron cinco clones que activaban la expresión del gen indicador Topflash con diferentes grados de actividad, siendo E1 y F19 los menos activos, A13 y A12 con actividad intermedia, y C2 el más activo y el más similar a células ES GSK-3-/-, que acumulaban una cantidad constante y alta de β30 catenina (Doble et al., 2007) y activaba mucho Topflash (Figura 13A). Se generó un número muy alto de genes reprogramados (hasta 55 veces de aumento) tras la fusión de los clones E1 y F19 con células NS-Oct4-puro, se generó un número intermedio de clones reprogramados con la fusión de los clones A13 y A12 (hasta 18 veces de aumento), y casi no se seleccionaron clones tras la fusión del clon C2 y de células GSK-3-/-(Figura 13B). Es digno de mención que el clon E1 activaba el gen indicador Topflash con una extensión similar a la que se observaba en las

35 células tratadas 24 h con 1 µM de BIO o Wnt3a (Figura 13C), lo que da lugar a la conclusión de que estas células expresan niveles similares de β-catenina activa, y por lo tanto tienen capacidades de reprogramación comparables. Estos datos demuestran claramente que la reprogramación se produce solo cuando los niveles de β-catenina no son demasiado bajos ni demasiado altos; los niveles de β-catenina necesitan estar en un nivel fisiológico medio, que tienen los clones E1 y F19 y las células ES tratadas tanto con Wnt3a como con 1 µM de BIO.

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Los clones aislados se reprograman y se pueden diferenciar in vitro e in vivo

Para confirmar la pluripotencia, y por tanto el fenotipo tipo celular ES, se aislaron 21 clones reprogramados diferentes de la fusión de células ES pre-tratadas con BIO durante 24 h con NS-Oct4-puro. Todos los clones eran 45 tetraploides (Figura 14A), eran positivos a GFP, y expresaban Oct4, Nanog y Rex1 tras varias pasadas (Figura 14B). Por el contrario se anularon los genes neurales Blbp y Olig2 (Figura 14C y Figura 15). De la misma manera, los híbridos reprogramados ES x timocitos y ES x MEF expresaban Oct4 y Nanog y perdían la expresión de CD4 y CD8, y los marcadores específicos Col1a1 y Col1a2, respectivamente (Figura 16A). Además, el análisis de la secuencia con bisulfito revelaba que en los clones reprogramados ES x NS, las islas CpG de los promotores Nanog y Oct4

50 estaban altamente desmetilados y eran comparables a las células ES, sugiriendo que estos dos loci tenían modificaciones epigenéticas masivas subyacentes; por el contrario las mismas CpG estaban altamente metiladas en las células NS parentales (Figura 14D). Estos datos muestran claramente que los híbridos aislados de las fusiones con células ES pre-tratadas con BIO se habían reprogramado.

55 A continuación, para determinar la capacidad de diferenciación de los clones reprogramados, los autores indujeron la diferenciación espontánea de ES x NS, ES x timocitos y ES x MEF. Los cuerpos embrioides que se formaban: eran estructuras con forma esférica claramente visibles tras 3 días y se diferenciaban tras 6 y 9 días (Figura 14E y Figura 16B). La expresión de Oct4 (célula madre pluripotente), AFP (endodermo), Brachyury (mesodermo), Nkx2.5 (músculo cardíaco) y GATA4 (músculo cardíaco) se apreciaban a los 3, 5, 7 y 9 días de diferenciación, en sus

60 tiempos esperados (Boheler et al., 2002), y como era comparable con las células ES (Figura 14F y Figura 16C). Además, algunos de los clones comenzaban a palpitar espontáneamente, demostrando su diferenciación en cardiomiocitos.

Finalmente, para ensayar la capacidad de diferenciación de los híbridos ES x NS in vivo, los autores trasplantaron 65 cinco clones diferentes subcutáneamente en ratones inmunodeficientes (SCID). Tres semanas tras la inyección, se

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Claims

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