ES2535049T3 - Procedimientos para la clasificación in vitro de carcinoma hepatocelular - Google Patents

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Abstract

Procedimiento de clasificación in vitro de un tumor de HCC en 6 subgrupos a partir de una muestra de hígado HCC de un sujeto que sufre HCC, que comprende: a) determinar un perfil de expresión que comprende o que consiste en: (i) la siguiente combinación de 16 genes: RAB1A, REG3A, NRAS, RAMP3, MERTK, PIR, EPHA1, LAMA3, G0S2, HN1, PAK2, AFP, CYP2C9, CDH2, HAMP, y SAE1, o (ii) la siguiente combinación de 24 genes: ALDH1L1, CD24, CD74, CFHR3, CYP4F12, DNAJA3, DSCR1, EPHA1, EPHB4, FAAH, FGFR2, FLJ10159, GLT8D1, HAL, MATN2, MRPS7, PAK2, PLXNB1, RAB1A, RHOQ, SLC27A5, SLPI, SMARCE1, STRA13; b) calcular a partir de dicho perfil de expresión 6 distancias de subgrupo; y c) clasificar dicho tumor HCC en el subgrupo para el cual la distancia de subgrupo es la más baja, en el que los 6 subgrupos G1, G2, G3, G4, G5 y G6 están definidos por la presencia (+) o ausencia (-) de características clínicas y genéticas descritas en la siguiente Tabla 2:**Fórmula** G1 G2 G

Description

15
25
35
45
55
65 E06819878
16-04-2015
DESCRIPCIÓN
Procedimientos para la clasificación in vitro de carcinoma hepatocelular.
La presente invención se refiere a procedimientos para la clasificación in vitro de carcinoma hepatocelular (HCC). Los presentes procedimientos están basados en la determinación del perfil de expresión de combinaciones de genes particulares.
El carcinoma hepatocelular (HCC) es uno de los tumores sólidos más frecuentes en todo el mundo y representa la tercera causa de mortalidad entre las muertes por cáncer (Bosch. F.X., et al. Semin Liver Dis 19, 271-85 (1999)). Su frecuencia es particularmente elevada en Asia y África debido a la elevada frecuencia de las infecciones por hepatitis vírica y a la exposición a Aflatoxina B1 (AFB1). Durante los últimos 10 años, la incidencia de HCC ha aumentado notablemente en el Reino Unido, Francia y los Estados-Unidos (Taylor-Robinson, S.D. et al. Bmj 319, 640 (1999); Deuffic, S. et al. Lancet 351, 214-5 (1998). El-Serag, H.B. & Mason, A.C. N Engl J Med 340, 745-50 (1999)). Este aumento está relacionado con el aumento de las infecciones por hepatitis C virales.
La cirrosis hepática de cualquier origen y los nódulos regenerativos displásticos han sido considerados durante mucho tiempo como precursores probables de HCC debido a su frecuente asociación con la ocurrencia de HCC (Edmondson, H.A. & Peters, R.L. Semin Roentgenol 18, 75-83 (1983); Thorgeirsson, S.S. & Grisham, J.W. Nat Genet 31, 339-46 (2002)). Del mismo modo que en otros tumores sólidos, un gran número de alteraciones genéticas se acumulan durante el proceso carcinogénico. Algunas de estas alteraciones genéticas son específicas de factores etiológicos de HCC, en particular de la infección por HBV que puede inducir inestabilidad cromosómica (Aoki, H., et al. Proc Natl Acad Sci USA 93, 7300-4 (1996)) o mutagénesis insercional (Brechot, C. Gastroenterology 127, S56-61 (2004)). Las demás alteraciones asociadas específicamente con factores de riesgo son la mutación R249S del gen TP53 en HCCs expuestos a Aflatoxina B1 (Bressac, B. et al, Proc Natl Acad Sci USA 87, 1973-7 (1990)), mutaciones de KRAS2 observadas en HCCs asociados a cloruro de vinilo (Weihrauch, M. et al. Br J Cancer 84, 982-9 (2001)) y mutaciones de TCF1 asociadas con adenomas hepatocelulares (Bluteau, O. et al. Nat Genet 32, 312-5 (2002)). De entre las alteraciones genéticas no relacionadas con factores de riesgo de HCC, estudios de alelotipos de microsatélites y de hibridación genómicas comparativa (CGH) han demostrado aberraciones cromosómicas recurrentes. Los brazos cromosómicos frecuentemente delecionados son el 17p, 8p, 16q, 16p, 4q, 9p, 13q, 1p y 6q mientras que las ganancias más frecuentes se encuentran en los cromosomas 1q, 7q, 8q y 17q (Boige, V. et al. Cancer Res 57, 1986-90 (1997); Wong, N. et al. Clin Cancer Res 6, 4000-9 (2000); Guan, X.Y. et al. Genes Chromosomes Cancer 29, 110-6 (2000)). El HCC es, por lo tanto, un grupo heterogéneo de tumores que difieren en los factores de riesgo y alteraciones genéticas.
Esto impone una necesidad de una clasificación de tumores HCC más precisa, fiable y fácil de llevar a cabo. De hecho, es por ejemplo muy difícil buscar terapias eficaces contra tumores muy heterogéneos. Por el contrario, una clasificación de HCC fiable permitiría estudiar cada subgrupo por separado y encontrar nuevas terapias dirigidas para cada subgrupo. Una prueba de clasificación fiable y fácil de llevar a cabo permitiría entonces elegir para cada paciente un tratamiento adaptado.
En particular, el pronóstico del HCC también es muy heterogéneo. Actualmente, el principal tratamiento para HCC es la eliminación quirúrgica del tumor de HCC, que puede o no estar seguida por quimioterapia adyuvante. La quimioterapia puede ser muy cansina y dolorosa para los pacientes pero es necesaria en caso de HCC con poco pronóstico. Por lo tanto, una clasificación y un procedimiento de pronóstico de tumores de HCC sería de de gran ayuda para decidir si se debe o no administrar una terapia adyuvante a un paciente de HCC.
La heterogeneidad del HCC es bien conocida para el experto en la materia, y se han realizado bastantes esfuerzos para clasificar mejor y/o pronosticar los tumores HCC en la técnica anterior.
Por ejemplo, recientemente varios grupos han intentado clasificar los tumores de HCC mediante análisis de transcriptoma global. Algunos de ellos describen alteraciones de los perfiles de expresión significantes entre HCC derivados de HBV y de HCV respectivamente (Okabe et al. Cancer Res. 2001 Mar 1;61(5):2129-37; Iizuka et al. Cancer Res. 2002 Jul 15;62(14):3939:44).
Otros describen una clasificación de HCC en dos o tres subgrupos basada en varias características histológicas (Chung et al. Mol Cells. 2002 Dec 31;14(3):382-7; Chen et al. Mol Bio Cell. 2002 Jun;13(6):1929-39; WO 2004/090163) o en la probabilidad de supervivencia (Lee et al. Hepatology 2004 Sep;40(3):667-76).
Los inventores, en particular, han mostrado anteriormente que las alteraciones genéticas están de hecho estrechamente relacionadas con las características clínicas del HCC definiendo dos grupos de HCC (Legoix, P. et al. Oncogene 18, 4044-6 (1999); Laurent-Puig, P. et al. Gastroenterology 120, 1763-73 (2001)). El primer tipo de HCC se asoció no solamente con un elevado nivel de inestabilidad cromosómica y mutaciones de TP53 y AXIN1 frecuentes, sino que también se relacionó estrechamente con infecciones por HBV y con un mal pronóstico. A la inversa, de tumores HCC del segundo subgrupo son estables cromosómicamente, con una elevada incidencia de alteraciones que activan las β-cateninas y no están asociados con infecciones virales.
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Con respecto al pronóstico, varios grupos han descrito genes implicados en invasión vascular (Chen et al. Mol Bio Cell. 2002 Jun;13(6):1929-39; Qin et al. J Cancer Res Clin Oncol. 2004 Sep;130(9):497-513) o metastasis (Qin et al. J Cancer Res Clin Oncol. 2004 Sep;130(9):497-513; Ye et al. Nat Med. 2003 Apr; 9(4):416-23).
5 Otros han identificado grupos de genes que permiten un pronóstico de recaída (Kurokawa et al. J Hepatol. 2004 Aug; 41(2):284-91; Iizuka et al. Lancet. 2003 Mar 15; 361(9261):923-9; WO 2005/017150) y/o de supervivencia (Lee et al. Hepatology. 2004 Sep; 40(3):667-76; WO 2005/017150).
Okabe et al. “Genome-wide Analysis of Gene Expression in Human Hepatocellular Carcinomas Using cDNA
10 Microarray: Identification of Genes Involved in Viral Carcinogenesis and Tumor Progression”, Cancer Research. Vol. 61, p. 2129-2137 (2001) divulga perfiles de expresión de genes que distinguen HCCs positivos para HVB y para HVC y diferentes fenotipos de tumores.
Sin embargo, una clasificación de los tumores HCC en dos o incluso tres subgrupos, basada solamente en
15 características histológicas o genéticas, no es probable que refleje de forma precisa la gran heterogeneidad de HCC. Además, existe todavía una necesidad de una prueba de pronóstico simple y fácil de realizar.
Para seguir investigando correlaciones genotipo-fenotipo en HCC, identificando vías y/o procesos biológicos desregulados en dichos tumores heterogéneos y encontrar nuevos factores de pronóstico, los inventores han llevado
20 a cabo de este modo un análisis exhaustivo a nivel clínico, genético y transcriptómico de una amplia serie de 123 tumores.
A pesar de que la mayoría de estudios previos sólo fueron capaces de subdividir los tumores de HCC en dos subgrupos, los inventores hallaron sorprendentemente que los tumores HCC se agrupaban de hecho en 6
25 subgrupos distintos, estrechamente asociados con varias alteraciones clínicas y genéticas. También determinaron un predictor de diagnóstico de 16 genes y un predictor de pertenencia a clase de 24 genes así como una firma de 5 genes que predice el pronóstico de un paciente independientemente del subgrupo de HCC y que obtiene mejores resultados que los marcadores de pronóstico clínicos comunes.
30 Más precisamente, los inventores han definido 6 subgrupos o clases de HCC distintos (de ahora en adelante denominados G1 a G6). Estos 6 subgrupos se definieron mediante un análisis no supervisado del análisis transcriptómico global de 57 HCC, 3 adenomas hepatocelulares y 5 muestras de tejidos no tumorales agrupados utilizando micromatrices Affymetrix HG-U133A GeneChipTM . Los 6 subgrupos están muy asociados con factores clínicos y genéticos, tal como se muestra en la siguiente Tabla 1 y se resume en la Figura 1.
35 Tabla 1. Características clínicas y genéticas asociados con subgrupos de HCC
Hibridaciones Affymetrix (57 HCC)
QRT-PCR
Set de validación (63 HCC)
Set completo (109 HCC)
G1
HBV bajo número de copias
0,03 0,04 <10 -5
AFP > 100 IU/ml
0,01 0,006 <10 -4
origen africano
0,005 0,3* 0,004
hembra
0,06 0,05 0,002
Mutación de Axin1
0,1 0,009 0,001
16q LOH
0,05 0,04 0,001
G2
HBV alto num. de copias
<10 -4 0,07 0,004
hemocromatosis
1* 0,005* 0,03
invasión portal
0,6 0,05 0,01
Mutación de PIK3CA
0,009* - -
G3
Mutación R249S de TP53
0,3* 0,002* 0,004
Metilación de CDKN2A
0,04 0,1 0,01
17p LOH
0,02 0,004 0,0002
5q LOH
0,02 0,02* 0,004
19p LOH
0,002 0,4* 0,004
21q LOH
0,001 0,05 <10 -3
22q LOH
0,007 0,02* <10 -4
G1, G2, G3
FAL
<10 -3 <10 -3 <10 -5
4q LOH
<10 -3 0,002 <10 -5
16p LOH
0,005 0,05 <10 -3
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Hibridaciones Affymetrix (57 HCC)
QRT-PCR
Set de validación (63 HCC)
Set completo (109 HCC)
Recaída temprana
0,005 1 0,3
Muerte temprana
0,05 0,7 0,4
G1, G2
Edad < 63 años
0,03 0,08 0,001
13q LOH
0,08 0,0001 <10 -4
1p LOH
0,1 0,02 0,007
G2, G3
Mutación de TP53
0,03 0,001 0,0001
G4
Mutación de TCF1**
0,01* -* -*
no invasión vascular
0,2 0,03 0,01
G6
Nódulos satélite
0,005 - 0,0005
G5, G6
Metilación de CDH1
0,01 0,007 <10 -3
Mutación de CTNNB1
<10 -10 <10 -5 <10 -12
Los valores mostrados son los P-valores obtenidos a partir de unas pruebas exactas de Fisher basadas en la variable genética o clínica dada y (i) los grupos de clúster originales para las series de Affymetrix GeneChip, (ii) el grupo de clúster predicho (en base al predictor de 16 genes) para las series de QRT-PCR. * Igual o inferior a 5 muestras con esta característica en el set de tumores probado. ** incluyendo las 3 muestras de adenoma.
Como se describe más detalladamente en el Ejemplo 2, párrafo 2.2, los 6 subgrupos pueden estar definidos utilizando sus características principales tal y como se describe en la siguiente Tabla 2.
Tabla 2. Definición de los 6 subgrupos por la presencia (+) o ausencia (-) de características clínicas y genéticas principales
G1
G2 G3 G4 G5 G6
Inestabilidad cromosómica
+ + + - - -
Recaída y muerte tempranas
+ + + - - -
Mutación de TP53
- + + - - -
Infección HBV
+ + - - - -
Bajo número de copias
+ - - - - -
Alto número de copias
- + - - - -
Mutación de CTNNB1
- - - - + +
Nódulos satélite
- - - - - +
Los procedimientos de clasificación según la invención permiten determinar fácilmente a cual de éstos 6 subgrupos 10 HCC pertenece cualquier muestra de hígado de HCC.
La invención se refiere a un procedimiento de clasificación in vitro de un tumor de HCC en 6 subgrupos a partir de una muestra de hígado HCC de un sujeto que sufre HCC, que comprende:
15 a) determinar un perfil de expresión que comprende o que consiste en:
a. la siguiente combinación de 16 genes: RAB1A, REG3A, NRAS, RAMP3, MERTK, PIR, EPHA1, LAMA3, G0S2, HN1, PAK2, AFP, CYP2C9, CDH2, HAMP, y SAE1, o
20 b. la siguiente combinación de 24 genes: ALDH1L1, CD24, CD74, CFHR3, CYP4F12, DNAJA3, DSCR1, EPHA1, EPHB4, FAAH, FGFR2, FLJ10159, GLT8D1, HAL, MATN2, MRPS7, PAK2, PLXNB1, RAB1A, RHOQ, SLC27A5, SLPI, SMARCE1, STRA13;
b) calcular a partir de dicho perfil de expresión 6 distancias de subgrupo; y 25 c) clasificar dicho tumor HCC en el subgrupo para el cual la distancia es la más baja,
en el que los 6 subgrupos G1, G2, G3, G4, G5 y G6 están definidos por sus características clínicas y genéticas descritas en la Tabla 2. 30 La presente descripción también divulga un procedimiento de clasificación in vitro de un tumor HCC entre 6
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subgrupos a partir de una muestra de hígado HCC de un sujeto que sufre HCC, que comprende:
a) determinar un perfil de expresión que comprende o que consiste en una combinación de por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 14 o por lo menos 16 genes seleccionados de entre el grupo que
5 consiste en: RAB1A, REG3A, NRAS, RAMP3, MERTK, PIR, EPHA1, LAMA3, G0S2, HN1, PAK2, AFP, CYP2C9, CDH2, HAMP, SAE1, ADH6, DCN, FLJ10159, ALDH1L1, IGF1, LECT2, SLC38A1, SPARCL1, CTNNA2, GLUL, LEF1, MATN2, MME, PFN2, SPINT2, TBX3, y FGFR2;
b) calcular a partir de dicho perfil de expresión 6 distancias de subgrupo; y 10 c) clasificar dicho tumor HCC en el subgrupo para el cual la distancia de subgrupo es la más baja,
en el que los 6 subgrupos G1, G2, G3, G4, G5 y G6 están definidos por sus características clínicas y genéticas descritas en la Tabla 2.
15 Las características principales del primer set de genes implicados en la clasificación de HCC están descritos en la siguiente Tabla 3.
Tabla 3. Primer set de genes implicados en la clasificación de HCC. 20
Símbolo del gen *
Nombre del gen HUGO ID del gen "Entrez Gene" **
RAB1A
RAB1A, miembro de la familia de oncogenes RAS 5861
REG3A
regenerador derivado de islote 3 alfa 5068
NRAS
homólogo de oncogen de neuroblastoma RAS viral (v-ras) 4893
RAMP3
Proteína modificadora de actividad receptor (calcitonina) 3 10268
MERTK
Tirosina quinasa de proto-oncogen c-mero 10461
PIR
pirina (proteína nuclear de unión a hierro) 8544
EPHA1
receptor de EPH A1 2041
LAMA3
laminina, alpha 3 3909
G0S2
Interruptor G0/G1 2 50486
HN1
Expresado hematológico y neurológico 1 51155
PAK2
Quinasa activada por p21 (CDKN1A) 2 5062
AFP
Fetoproteína alfa 174
CYP2C9
Citocromo P450, familia 2, subfamilia C, polipéptido 9 1559
CDH2
cadherina 2, tipo 1, N-cadherina (neuronal) 1000
HAMP
péptido antimicrobiano hepcidina 57817
SAE1
subunidad 1 de enzima activadora de SUMO-1 10055
ADH6
alcohol deshidrogenasa 6 (clase V) 130
DCN
decorina 1634
FLJ10159
Proteína hipotética FLJ10159 55084
ALDH1L1
familia aldehído deshidrogenasa 1, miembro L1 10840
IGF1
Factor de crecimiento tipo insulina 1 (somatomedina C) 3479
LECT2
quimiotaxina derivada de celular leucocitaria 2 3950
SLC38A1
Transportador de soluto familia 38, miembro 1 81539
SPARCL1
De tipo SPARC 1 (mast9, hevina) 8404
CTNNA2
catenina (proteina asociada a cadherina), alfa 2 1496
GLUL
Ligasa glutamato-amonio (glutamina sintetasa) 2752
LEF1
Factor de union a potenciador linfoide 51176
MATN2
matrilina 2 4147
MME
metalo-endopeptidasa de membranae (endopeptidasa neutral, encefalinasa, CALLA, CD10) 4311
PFN2
Profilina 2 5217
SPINT2
Inhibidor de serinpeptidasa, tipo Kunitz, 2 10653
TBX3
T-box 3 (síndrome ulnar mamario) 6926
FGFR2
Receptor de factor de crecimiento de fibroblasto 2 (quinasa expresada en bacteria, receptor de factor de crecimiento de queratinocito, disostosis craneofacial 1, síndrome de Crouzon, síndrome de Pfeiffer, síndrome de Jackson-Weiss) 2263
* Todos los símbolos y nombres de genes son según el Comité de Nomenclatura de Genes HUGO (disponible en
http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/) 25 ** Toda la información disponible en relación con los genes listados de la Tabla 3 puede recuperarse del portal
5 E06819878
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"Entrez Gene” (http://www.ncbi.n/m.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=gene) utilizando la ID de gen de "Entrez Gene" proporcionada en la Tabla 3.
Según la invención, una “clasificación” de tumores HCC pretende significar la determinación para cualquier tumor
5 HCC, del “subgrupo” o “clase” HCC (estos dos términos “subgrupo” y “clase” se utilizarán indistintamente el uno por el otro a lo largo de la presente memoria) al cual pertenece, en la que los subgrupos están definidos por las características descritas en la Tabla 2.
También se divulga un procedimiento de clasificación in vitro, en el qe el perfil de expresión comprende o consiste
10 en por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 14, o por lo menos 16 genes seleccionados de entre el grupo que consiste en: RAB1A, REG3A, NRAS, RAMP3, MERTK, PIR, EPHA1, LAMA3, G0S2, HN1, PAK2, AFP, CYP2C9, CDH2, HAMP, SAE1, ADH6, DCN, FLJ10159, ALDH1L1, IGF1, LECT2, SLC38A1, SPARCL1.
Además se divulga un procedimiento de clasificación in vitro en el que el perfil de expresión comprende o consiste
15 en por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 14, o por lo menos 16 genes seleccionados de entre el grupo que consiste en: RAB1A, REG3A, NRAS, RAMP3, MERTK, PIR, EPHA1, LAMA3, G0S2, HN1, PAK2, AFP, CYP2C9, CDH2, HAMP, y SAE1.
En una forma de realización preferida del procedimiento de clasificación in vitro según la presente invención, el perfil
20 de expresión comprende o consiste en la combinación de 16 genes: RAB1A, REG3A, NRAS, RAMP3, MERTK, PIR, EPHA1, LAMA3, G0S2, HN1, PAK2, AFP, CYP2C9, CDH2, HAMP, y SAE1.
La presente descripción también divulga otro procedimiento de clasificación in vitro de un tumor de HCC entre 6 subgrupos a partir de muestras de hígado HCC de un sujeto que sufre HCC, que comprende:
25 a) determinar un perfil de expresión que comprende o que consiste en una combinación de por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 14, por lo menos 16, por lo menos 18, por lo menos 20, por lo menos 22 o por lo menos 24 genes seleccionados de entre el grupo que consiste en: ALDH1L1, CD24, CD74, CFHR3, CYP4F12, DNAJA3, DSCR1, EPHA1, EPHB4, FAAH, FGFR2, FLJ10159, GLT8D1, HAL, MATN2,
30 MRPS7, PAK2, PLXNB1, RAB1A, RHOQ, SLC27A5, SLPI, SMARCE1, STRA13;
b) calcular a partir de dicho perfil de expresión 6 distancias de subgrupo; y
c) clasificar dicho tumor de HCC en el subgrupo para el que la distancia de subgrupo es la más baja,
35 en el que los 6 subgrupos G1, G2, G3, G4, G5 y G6 están definidos por sus características clínicas y genéticas descritas en la Tabla 2.
Las características principales de este segundo set de genes implicados en la clasificación de HCC están descritos 40 en la siguiente Tabla 4.
Tabla 4. Segundo set de genes implicados en la clasificación de HCC
Símbolo del gen *
Nombre del gen HUGO * ID del gen "Entrez Gene" ** Ubicación cromosómica Otros alias
ALDH1L1
Formiltetrahidrofolato deshidrogenasa 10840 chr3q21.2 FTHFD
CD24
Antígeno CD24 (antígeno de clúster de células de carcinoma pulmonar 4 pequeño) 934 chr6q21 CD24A
CD74
Antígeno CD74 972 chr5q32 DHLAG, HLADG, la-GAMMA, proteína 41
CFHR3 /// CFHR4
Relacionado con factor H de complemento 3 /// Relacionado con factor H de complemento 4 10878 /// 10877 chr1q32 CFHL3, DOWN16, FHR-3, FHR3, HLF4 /// CFHL4, FHR-4, FHR4, RP4608O15.2
CYP4F12
citocromo P450, familia 4, subfamilia F, polipéptido 12 66002 chr19p13.1 F22329_1
DNAJA3
Homólogo DnaJ (Hsp40), subfamilia A, miembro 3 9093 chr16p13.3 FLJ45758, TID1, hTid-1
DSCR1
Gen 1 región crítica para síndrome de Down 1827 chr21q22.1q22.2|21q22.12 ADAPT78, CSP1, DSC1, MCIP1, RCN1
EPHA1
EphA1 2041 chr7q34 EPH, EPHT, EPHT1
EPHB4
EphB4 2050 chr7q22 HTK, MYK1, TYRO11
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Símbolo del gen *
Nombre del gen HUGO * ID del gen "Entrez Gene" ** Ubicación cromosómica Otros alias
FAAH
Hidrolasa de amida de ácidos grasos 2166 chr1p35-p34 MGC102823, MGC138146
FGFR2
receptor de factor de crecimiento de fibroblasto 2 2263 chr10q26 BEK, BFR-1, CD332, CEK3, CFD1, ECT1, JWS, K-SAM, KGFR, TK14, TK25
FLJ10159
Proteína hipotética FLJ10159 55084 chr6q21
GLT8D1
Dominio glicosiltransferasa 8 que contiene 1, or glicosiltransferasa AD-017 55830 chr3p21.1 AD-017, DKFZp781020198, FLJ14611, MSTP139
HAL
histidina amonio liasa 3034 chr12q22-q24.1 HIS, HSTD, histidasa
MATN2
matrilina 2 4147 chr8q22
MRPS7
Proteína ribosomal mitocondrial S7 51081 chr17q25 MRP-S, MRP-S7, RP-S7, RPMS7
PAK2
Quinasa activada por p21 (CDKN1A) 2 5062 chr3q29 PAK65, PAKgamma
PLXNB1
plexina B1 5364 chr3p21.31 KIAA0407, PLEXIN-B1, PLXN5, SEP
RAB1A
RAB1A, miembro familia oncogenes RAS 5861 chr2p14 DKFZP564B163, RAB1
RHOQ
Homólogo familia genes ras, miembro Q 23433 chr2p21 ARHQ, RASL7A, TC10, TC10A
SLC27A5
Familia de transportadores de soluto 27 (transportador de ácidos grasos), miembro 5 10998 chr19q13.43 ACSB, ACSVL6, FACVL3, FATP5, FLJ22987, VLACSR, VLCS-H2, VLCSH2
SLPI
Inhibidor de proteasa leucocitaria secretado (antileucoproteinasa) 6590 chr20q12 ALK1, ALP, BLPI, HUSI, HUSI-I, MPI, WAP4, WFDC4
SMARCE1
Regulador de cromatina relacionado con SWI/SNF, asociado a matriz, dependiente de actina, subfamilia e, miembro 1 6605 chr17q21.2 BAF57
STRA13
Estimulado por ácido retinoico 13 201254 ch17q25.3 E3, MGC14480
* Todos los símbolos y nombres de genes son según el Comité de Nomenclatura de Genes HUGO (disponible en http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/)
5 ** Toda la información disponible en relación con los genes listados de la Tabla 4 puede recuperarse del portal "Entrez Gene” (http://www.ncbi.n/m.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=gene) utilizando la ID de gen de "Entrez Gene" proporcionada en la Tabla 4.
En una forma de realización preferida del procedimiento de clasificación in vitro según la invención mencionado
10 anteriormente en la presente memoria, el perfil de expresión comprende o consiste en la combinación de 24 genes siguiente: ALDH1L1, CD24, CD74, CFHR3, CYP4F12, DNAJA3, DSCR1, EPHA1, EPHB4, FAAH, FGFR2, FLJ10159, GLT8D1, HAL, MATN2, MRPS7, PAK2, PLXNB1, RAB1A, RHOQ, SLC27A5, SLPI, SMARCE1, STRA13.
Según la invención, una “muestra de hígado HCC” pretende significar cualquier muestra de hígado que comprende
15 tejido de tumor de HCC. En una forma de realización preferida de un procedimiento de clasificación in vitro según la invención, la muestra de hígado HCC es una biopsia de hígado HCC o una extirpación quirúrgica de tumor HCC.
Por “determinar un perfil de expresión” se pretende decir la medición del nivel de expresión de un grupo de genes seleccionados. El nivel de expresión de cada gen puede ser determinado in vitro ya sea a nivel proteico o a nivel
20 nucleico, utilizando cualquier tecnología conocida de la técnica.
Por ejemplo, a nivel proteico, la medición in vitro del nivel de expresión de una proteína en particular puede realizarse mediante cualquier procedimiento de cuantificación conocido por el experto en la materia, incluyendo pero no limitado a ELISA o análisis de espectrometría de masas. Estas tecnologías se adaptan fácilmente a cualquier
25 muestra de HCC. De hecho, las proteínas de la muestra HCC pueden ser extraídas utilizando varias tecnologías bien conocidas por los expertos en la materia para medición por ELISA o por espectrometría de masas en solución. Alternativamente, el nivel de expresión de una proteína en una rodaja de tumor de HCC puede ser analizado utilizando espectroscopia de masas directamente sobre la rodaja de tejido.
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En una forma de realización preferida de un procedimiento de clasificación in vitro según la invención, el perfil de expresión se determina in vitro a nivel nucleico. A nivel nucleico, la medición in vitro del nivel de expresión de un gen puede llevarse a cabo ya sea directamente sobre el ARN mensajero (ARNm), o sobre el ADN complementario retrotranscrito (ADNc). Cualquier procedimiento de medición del nivel de expresión puede ser utilizado, incluyendo 5 pero no limitado a análisis con micromatrices, PCR cuantitativa, análisis Southern. En una forma de realización preferida de un procedimiento de clasificación in vitro según la invención, el perfil de expresión se determina utilizando una micromatriz. En otra forma de realización preferida de un procedimiento de clasificación in vitro según la invención, el perfil de expresión se determina utilizando PCR cuantitativa. En cualquier caso, el nivel de expresión de cualquier gene se normaliza preferentemente en comparación con el nivel de expresión de un gen de control
10 interno, generalmente un gen constitutivo, incluyendo pero no limitado a RNA ribosomal (como por ejemplo ARN ribosomal 18S) o genes tales como la actina o el HRPT. Estas tecnologías son también fácilmente adaptables a cualquier muestra HCC. De hecho, varias tecnologías bien conocidas están disponibles para los expertos en la materia para extraer ARNm de una muestra de tejido y retrotranscibirlo ARNm a ADNc.
15 En una forma de realización preferida, cuando se utiliza un procedimiento de clasificación in vitro que involucra el primer set de genes (ver Tabla 3), el perfil de expresión se determina in vitro a nivel nucleico utilizando PCR cuantitativa. En otra forma de realización preferida, cuando se utiliza un procedimiento de clasificación que involucra el segundo set de genes (ver Tabla 4), el perfil de expresión se determina in vitro a nivel nucleico utilizando una micromatriz de ácidos nucleicos. En particular, puede utilizarse ventajosamente una micromatriz de Affymetrix
20 U133A.
En cualquier procedimiento de clasificación in vitro de un tumor de HCC en los 6 subgrupos definidos por los inventores, para cada subgrupo se calcula una “distancia de subgrupo”, que representa una distancia matemática entre dicho tumor de HCC y cada uno de los 6 subgrupos. Cuanto menor sea la distancia entre una muestra y un
25 subgrupo, mayor es la probabilidad de que dicha muestra pertenezca a este subgrupo en particular.
Para una combinación de n genes (n ≥ 8), el set de todos los tumores puede definirse como un set de n dimensiones en el que cada muestra de tumor puede ser caracterizada por n coordenadas que corresponden a los niveles de expresión de cada gen seleccionado en dicha muestra de tumor. Cada subgrupo o clase es un subset del set de n
30 dimensiones que puede definirse por un punto central y un porcentaje de variación aceptable alrededor de cada coordenada del punto central. Dependiendo de la tecnología utilizada para la determinación del perfil de expresión, pueden elegirse funciones matemáticas apropiadas permietiendo cada una calcular la distancia de cualquier muestra de tumor a uno de los 6 subgrupos o clases.
35 En particular, cuando el perfil de expresión se determina utilizando PCR cuantitativa, para una muestrai de tumor de HCC dada, y un subgrupo o clasek particular, la distancia de dicha muestra a dicha clase puede calcularse utilizando la siguiente fórmula (I):
2
(ΔCt (muestra , gen ) −µ(clase , gen ))
it kt
∑
Distancia (muestra i, clase k )
=
(I) σ (gen t )
t=1.. n
40 en la que
-n representa el número de genes en el perfil de expresión
45 -para cada gent, µ(clasek, gent) y σ(gent) son parámetros que dependen de la combinación de genes elegida y pueden ser calculados mediante optimización en un grupo de entreno de tumores de HCC, seguido de una validación en un grupo de prueba de tumores de HCC, tal como está descrito con más detalles en el Ejemplo 2 de la presente memoria.
50 Alternativamente, cuando el perfil de expresión se determina a nivel nucleico utilizando una micromatriz de ácidos nucléicos, para una muestrai de tumor de HCC dada, y un subgrupo o clasek particular, la distancia de dicha muestrai a dicha clasek puede ser calculada utilizando varias fórmulas derivadas de varios algoritmos bien conocidos por los expertos en la material. Por ejemplo, dicha distancia de dicha muestrai a dicha clasek puede ser calculada utilizando la siguiente fórmula (II):
55
∑
⎛ ⎜⎜
(c(gen t,clase k )) 2
⎞ ⎟⎟
( y(muestra , gene ) −µ(gen ))
it t
(
∑
t
=
n.. 1
1,791759
−
Distancia (muestra i,clase k )
=
c(gen ,)clase (II)
+ ×
kt
σ
(gen t )
2
t=n..1
⎠
⎝
en la que -n representa el número de genes en el perfil de expresión,
8
10
15
20
25
30
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-para cada gent y clasek, y (muestrai, gent) representa el valor de intensidad normalizado para el gent en la muestrai, y
-para cada gent y clasek, c(gent, clasek), µ(gent) y σ(gent) son parámetros que dependen de la combinación de genes elegida y pueden ser calculados mediante optimización en un grupo de entreno de tumores de HCC, seguido de una validación en un grupo de prueba de tumores de HCC, tal como está descrito en con más detalles en el Ejemplo 2 de la presente memoria.
La normalización puede realizarse utilizando cualquier procedimiento bien conocido, por ejemplo utilizando normalización RMA.
Para una muestrai dada, una vez se han calculado todas las distancias a todas las clases, la clase predicha para de muestrai se calcula según la siguiente fórmula (III):
clase predicha (muestra ) = arg min(distancia (muestra ,clase )) (III)
i ik k=1.. 6
que significa que la clase predicha para una muestrai dada es la clase para la que la distancia de la muestrai a la clase es la más baja.
En una forma de realización preferida de un procedimiento de clasificación in vitro de un tumor de HCC en 6 subgrupos definidos por los inventores utilizando el primer set de genes (ver Tabla 3), el perfil de expresión consiste en la siguiente combinación de genes: RAB1A, REG3A, NRAS, RAMP3, MERTK, PIR, EPHA1, LAMA3, G0S2, HN1, PAK2, AFP, CYP2C9, CDH2, HAMP, y SAE1, y se determina utilizando PCR cuantitativa, en la que cada distancia de una muestrai a una clasek se calcula utilizando la siguiente fórmula (IV):
(ΔCt (muestra i , gen t ) −µ(clase k , gen t )) 2
Distancia (muestra i , clase k ) = ∑ (IV)
=σ (gen t )
t 1..16
en la que para cada gent y clasek, los valores µ(clasek, gent) y σ(gent) están en un intervalo de 10%, preferentemente de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%; o incluso 4%, 3%, 2% o 1% alrededor de los valores mostrados en la siguiente Tabla 5.
Tabla 5. Parámetros utilizados en la fórmula (IV) de distancia de PCR cuantitativa anterior para cada gen y para cada clase.
µ
clase 1 clase 2 clase 3 clase 4 clase 5 clase 6 σ
gen 1 (RAB1A)
-16,39 -16,04 -16,29 -17,15 -17,33 -16,95 0,23
gen 2 (PAP)
-28,75 -27,02 -23,48 -27,87 -19,23 -11,33 16,63
gen 3 (NRAS)
-16,92 -17,41 -16,25 -17,31 -16,96 -17,26 0,27
gen 4 (RAMP3)
-23,54 -23,12 -25,35 -22,36 -23,09 -23,06 1,23
gen 5 (MERTK)
-18,72 -18,43 -21,24 -18,29 -17,03 -16,16 7,23
gen 6 (PIR)
-18,44 -19,81 -16,73 -18,28 -17,09 -17,25 0,48
gen 7 (EPHA1)
-16,68 -16,51 -19,89 -17,04 -18,70 -21,98 1,57
gen 8 (LAMA3)
-20,58 -20,44 -20,19 -21,99 -18,77 -16,85 2,55
gen 9 (G0S2)
-14,82 -17,45 -18,18 -14,78 -17,99 -16,06 3,88
gen 10 (HN1)
-16,92 -17,16 -15,91 -17,88 -17,72 -17,93 0,54
gen 11 (PAK2)
-17,86 -16,56 -16,99 -18,14 -17,92 -17,97 0,58
gen 12 (AFP)
-16,68 -12,36 -26,80 -27,28 -25,97 -23,47 14,80
gen 13 (CYP2C9)
-18,27 -16,99 -16,26 -16,23 -13,27 -14,44 5,47
gen 14 (CDH2)
-15,20 -14,76 -18,91 -15,60 -15,48 -17,32 10,59
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µ
clase 1 clase 2 clase 3 clase 4 clase 5 clase 6 σ
gen 15 (HAMP)
-19,53 -20,19 -21,32 -18,51 -25,06 -26,10 13,08
gen 16 (SAE1)
-17,37 -17,10 -16,79 -18,22 -17,72 -18,16 0,31
En una forma de realización preferida de un procedimiento de clasificación de un tumor de HCC en 6 subgrupos definidos por los inventores utilizando el segundo set de genes (ver Tabla 4), el perfil de expresión consiste en la siguiente combinación de genes: ALDH1L1, CD24, CD74, CFHR3, CYP4F12, DNAJA3, DSCR1, EPHA1, EPHB4, FAAH, FGFR2, FLJ10159, GLT8D1, HAL, MATN2, MRPS7, PAK2, PLXNB1, RAB1A, RHOQ, SLC27A5, SLPI, SMARCE1, STRA13, y se determina a nivel nucleico utilizando cuantitativo una micromatriz, en el que cada distancia de una muestrai a una clasek se calcula utilizando la siguiente fórmula (V):
∑
⎛ ⎜⎜
(c(gen t,clase k )) 2
⎞ ⎟⎟
( y(muestra , gene ) −µ(gen ))
it t
∑
t
=1.. 24
+
1,791759
−
(
Distancia (muestra i,clase k )
=
c(gen ,)clase (V)
×
kt
σ
(gen t )
2
t=1..24
⎠
⎝
en la que para cada gent y clasek, los valores c(gent, clasek), µ(gent) y σ(gent) están en un intervalo de 10%, preferentemente de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%; o incluso 4%, 3%, 2% o 1% alrededor de los valores mostrados en la siguiente Tabla 6.
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Tabla 6. Parámetros utilizados en la fórmula (V) de distancias de micromatriz anterior para cada gen y para cada clase.
imagen1
5 La presente descripción también divulga un procedimiento de pronóstico in vitro de supervivencia global y/o supervivencia sin recaída a partir de una muestra de hígado HCC de un sujeto que sufre HCC, que comprende:
a) determinar un perfil de expresión que comprende una combinación de por lo menos 2, por lo menos 3, por lo
10 menos 4 o por lo menos 5 genes seleccionados de entre un grupo que consiste en NRCAM, PIR, RAMP3, SLC21A2, TAF9, TNA, HN1, PSMD1, MRPS7, CDC20, ENO1, HLF, STRA13, RAGD, NRAS, ARFGEF2, RAB1A, G0S2, SMAD3, DNAJA3, HELO1, RHOQ, C14orf156, NPEPPS, PDCD2, PHB, KIAA0090, IMP-3,
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KPNA2, KIAA0268 , UNQ6077, LOC440751, G6PD, STK6, TFRC, GLA, TRIP13, SPP1, AKR1C1, AKR1C2, GIMAP5, ADM, CCNB1, TKT, AGPS, RAN, NUDT9, HRASLS3, HLA-DQA1, NEU1, RARRES2, PAPOLA, ABCB6, BIRC5, FLJ20273, C14orf109, CHKA, TUBB2, HMGB3, TXNRD1, IFITM1, KIAA0992, MPPE1, KLRB1, CCL5, SYNE1, DNASE1L3, CYP2C18, PACSIN2, PON3, y PPP2R1B;
5 b) calcular a partir de dicho perfil de expresión una puntuación de supervivencia global y/o una puntuación de supervivencia sin recaída; y
c) comparar la puntuación de supervivencia global y/o la puntuación de supervivencia sin recaída obtenidas, 10 cada una con un valor umbral, de manera que
-una puntuación de supervivencia global/de supervivencia sin recaída inferior a dicho valor umbral indica un buen pronóstico de supervivencia/supervivencia sin recaída, mientras que
15 -una puntuación de supervivencia global/de supervivencia sin recaída superior o igual a dicho valor umbral indica un mal pronóstico de supervivencia/supervivencia sin recaída.
Las características principales de los genes implicados en el pronóstico de HCC están descritas en la siguiente Tabla 7. 20 Tabla 7. Genes implicados en el pronóstico de HCC
Símbolo del gen*
Nombre del gen HUGO * ID del gen "Entrez Gene" **
NRCAM
Molécula de adhesión de célula neuronal 4897
PIR
pirina (proteína nuclear de unión a hierro) 8544
RAMP3
proteína modificadora de actividad de receptor (calcitonina) 3 10268
SLCO2A1
familia transportadores de aniones orgánicos transportadores de solutos, miembro 2A1 6578
TAF9
TAF9 ARN polimerasa II, factor asociado a proteína de unión a TATA box (TBP), 32kDa 6880
CLEC3B
Familia dominios lectina tipo-C 3, miembro B 7123
HN1
expresado hematológico y neurológico 1 51155
PSMD1
proteosome (prosoma, macropain) subunidad 26S, no-ATPasa, 1 5707
MRPS7
Proteína ribosomal mitocondrial S7 51081
CDC20
Homólogo ciclo división celular 20 (S. cerevisiae) CDC20 991
ENO1
enolasa 1, (alfa) 2023
HLF
factor de leucemia hepática 3131
STRA13
Homólogo estimulado por ácido retinoico 13 (ratón) 201254
RRAGD
D de unión a GTP asociado a ras 58528
NRAS
Homólogo oncogen viral RAS (v-ras) de neuroblastoma 4893
ARFGEF2
Factor ribosilación de ADP factor intercambio nucleótido guanina 2 (inhibido por brefeldina A) 10564
RAB1A
RAB1A, miembro familia oncogenes RAS 5861
G0S2
G0/G1 interruptor 2 50486
SMAD3
SMAD, homólogo madres contra DPP 3 (Drosophila) 4088
DNAJA3
Homólogo DnaJ (Hsp40), subfamilia A, miembro 3 9093
ELOVL5
miembro 5 familia ELOVL, elongación de cadena larga de ácidos grasos (FEN1/Elo2, tipo SUR4/Elo3, levadura) 60481
RHOQ
Familia de genes homólogos a ras, miembro Q 23433
C14orf156
cromosoma 14 patrón abierto de lectura 156 81892
NPEPPS
Aminopeptidasa sensible a puromicina 9520
PDCD2
Muerte celular programada 2 5134
PHB
prohibitina 5245
KIAA0090
KIAA0090
23065
IMP-3
Proteína de unión a IGF-II ARNm 3 10643
KPNA2
carioferina alfa 2 (cohorte RAG 1, importina alfa 1) 3838
KIAA0268
Péptido reactivo a C219 348477
UNQ6077
AAAP6077 375056
LOC440751
similar a péptido reactivo C219 440751
G6PD
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 2539
STK6
serina/treonina quinasa 6 6790
TFRC
Receptor transferrina (p90, CD71) 7037
GLA
galactosidasa, alfa 2717
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Símbolo del gen*
Nombre del gen HUGO * ID del gen "Entrez Gene" **
TRIP13.
Interactuador receptor hormona tiroidea 13 9319
SPP1
fosfoproteína secretada 1 (osteopontina, sialoproteína de hueso I, activación temprana de linfocitos T 1) 6696
AKR1C1
Familia aldo-ceto reductasa 1, miembro C1 (dihidrodiol deshidrogenasa 1; 20-alfa (3-alfa)-hidroxiesteroide deshidrogenasa) 1645
AKR1C2
Familia aldo-ceto reductasa 1, miembro C2 (dihidrodiol deshidrogenasa 2; proteína de unión a ácido biliar; 3-alfa hidroxiesteroide deshidrogenasa, tipo III) 1646
GIMAP5
GTPasa, familia IMAP miembro 5 55340
ADM
adrenomedulina 133
CCNB1
Ciclina B1 891
TKT
transcetolasa (síndrome Wernicke-Korsakoff) 7086
AGPS
alquilglicerona fosfato sintasa 8540
RAN
RAN, miembro familia oncogenes RAS 5901
NUDT9
nudix (motivo de tipo residuo unido a nucleosidos difosfato X) 9 53343
HRASLS3
supresor de tipo HRAS 3 11145
HLA-DQA1
Complejo principal histocompatibilidad, clase II, DQ alfa 1 3117
NEU1
sialidasa 1 (llialidasa lisosomal) 4758
RARRES2
respondedor de receptor de ácido retinoico (inducido por tazaroteno) 2 5919
PAPOLA
poli(A) polimerasa alfa 10914
ABCB6
Casete de unión a ATP, subfamilia B (MDR/TAP), miembro 6 10058
BIRC5
IAP baculoviral que contiene repeticiones 5 (survivina) 332
FLJ20273
Proteína de unión a RNA 54502
C14orf109
Patrón abierto de lectura 109 cromosoma 14 26175
CHKA
colina quinasa alfa 1119
TUBB2
Tubulina, beta 2 7280
HMGB3
Caja grupo alta movilidad 3 3149
TXNRD1
Tioredoxina reductasa 1 7296
IFITM1
proteína transmembrana inducida por interferon 1 (9-27) 8519
KIAA0992
paladina 23022
MPPE1
Metalofosfoesterasa 1 65258
KLRB1
subfamilia B de receptores de tipo lecitina de célula asesina, miembro 1 3820
CCL5
Quimiocina (motivo C-C) ligando 5 6352
SYNE1
espectrina que contiene repeticiones, envuelta nuclear 1 23345
DNASE1L3
deoxiribonucleasa de tipo I 3 1776
CYP2C18
citocromo P450, familia 2, subfamilia C, polipéptido 18 1562
PACSIN2
Sustrato proteína quinasa C y caseína quinasa en neuronas 2 11252
PON3
paraoxonasa 3 5446
PPP2R1B
proteína fosfatasa 2 (anteriormente 2A), subunidad reguladora A (PR 65), isoforma beta 5519
* Todos los símbolos y nombres de genes son según el Comité de Nomenclatura de Genes HUGO (disponible en http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/)
5 ** Toda la información disponible en relación con los genes listados de la Tabla 7 puede recuperarse del portal "Entrez Gene” (http://www.ncbi.n/m.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=gene) utilizando la ID de gen de "Entrez Gene" proporcionada en la Tabla 7.
Preferentemente, en un procedimiento de pronóstico in vitro divulgado en la presente memoria, el perfil de expresión
10 comprende y preferentemente consiste en una combinación de por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, o por lo menos 5 genes seleccionados de entre un grupo que consiste en NRCAM, PIR, RAMP3, SLC21A2, TAF9, TNA, HN1, PSMD1, MRPS7, CDC20, ENO1, HLF, STRA13, RAGD, NRAS, ARFGEF2, RAB1A, G0S2, SMAD3, DNAJA3, HELO1, y RHOQ.
15 En la presente descripción, un “pronóstico” de la evolución de HCC significa una predicción de la evolución futura de un tumor de HCC en particular en relación con un paciente que sufre de este tumor de HCC particular. Los procedimientos de la presente memoria permiten ambos, un pronóstico de supervivencia global y un pronóstico de supervivencia sin recaída.
20 Por “pronóstico de supervivencia global” se pretende decir pronóstico de supervivencia, con o sin recaída. Como se ha dicho anteriormente, el principal tratamiento hoy en día contra HCC es la extirpación quirúrgica del tumor. Como resultado, un “mal pronóstico de supervivencia global” se define como la ocurrencia de muerte en los 3 años
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posteriores a la extirpación, mientras que un “buen pronóstico de supervivencia global” se define como la ausencia de muerte en los 5 años post-operación.
Por “pronóstico de supervivencia sin recaída” se pretende decir un pronóstico de supervivencia en ausencia de cualquier recaída. Un “mal pronóstico de supervivencia sin recaída” se define como la presencia de una recaída del tumor durante los dos años posteriores a la extirpación del hígado, mientras que un “buen pronóstico de supervivencia sin recaída” se define como la ausencia de recaída durante los 4 años post-operación.
Preferentemente, en un procedimiento de pronóstico in vitro de supervivencia global divulgado en la presente memoria, el perfil de expresión comprende y preferentemente consiste en una combinación de genes seleccionada de entre:
-TAF9, PIR, NRCAM y RAMP3,
-TAF9, NRCAM, SLC21A2 y PSMD1,
-TAF9, NRCAM, RAMP3 y PSMD1,
-TAF9, NRCAM, NRAS, RAMP3 y PSMD1, o
-TAF, NRCAM, RAMP3, PSMD1 y ARFGEF2.
Más preferentemente, en un procedimiento de pronóstico in vitro de supervivencia global divulgado en la presente memoria, el perfil de expresión comprende y preferentemente consiste en la siguiente combinación de genes:
-TAF9, NRCAM, RAMP3, PSMD1 y ARFGEF2.
Alternativamente, en un procedimiento de pronóstico in vitro de supervivencia sin recaída divulgado en la presente memoria, el perfil de expresión comprende y preferentemente consiste en una combinación de genes seleccionada de entre:
-TAF9 y G0S2,
-TAF9, NRCAM y RAMP3,
-TAF9, G0S2 y RAMP3,
-TAF9, NRCAM, DNAJA3 y RAMP3, o
-TAF9, NRCAM, G0S2, DNAJA3 y RAMP3.
Más preferentemente, en un procedimiento de pronóstico in vitro de supervivencia sin recaída divulgado en la presente memoria, el perfil de expresión comprende y preferentemente consiste en la siguiente combinación de genes:
-TAF9, NRCAM y RAMP3
Puede hacerse referencia a una combinación particular de genes con el término predictor.
Para un procedimiento de pronóstico in vitro de supervivencia global y/o de supervivencia sin recaída divulgado en la presente memoria, la “muestra de hígado HCC” puede ser cualquier muestra de hígado que comprende tejido de tumor de HCC. Preferentemente, en un procedimiento de pronóstico in vitro de supervivencia global y/o de supervivencia sin recaída divulgado en la presente memoria, la muestra de hígado HCC es una biopsia de hígado HCC o una extirpación quirúrgica de un tumor de HCC.
Al igual que para los procedimientos de clasificación in vitro, en un procedimiento de pronóstico in vitro de supervivencia global y/o de supervivencia sin recaída divulgado en la presente memoria, el nivel de expresión de cada gen puede ser determinado in vitro tanto a nivel proteico como a nivel nucleico, utilizando cualquier tecnología conocida de la técnica, en particular cualquier tecnología descrita anteriormente.
Preferentemente, en un procedimiento de pronóstico in vitro de supervivencia global y/o de supervivencia sin recaída divulgado en la presente memoria, el perfil de expresión se determina in vitro a nivel nucleico. Preferentemente, el perfil de expresión se determina utilizando una micromatriz. También preferentemente, el perfil de expresión se determina utilizando PCR cuantitativa. En cualquier caso, el nivel de expresión de cualquier gen es preferentemente normalizado en comparación con el nivel de expresión de un gen de control interno, generalmente un gen constitutivo, incluyendo pero no limitado a ARN ribosomal (tal como por ejemplo ARN ribosomal 18S) o genes como la actina o el HPRT.
En cualquier procedimiento de pronóstico in vitro de supervivencia global y/o supervivencia sin recaída divulgados en la presente memoria, se calcula una “puntuación” de supervivencia global y/o supervivencia sin recaída. Para una combinación de n genes (n ≥ 2) seleccionada, una “puntuación” es una función logística que tiene en cuenta los n niveles de expresión de cada gen seleccionado en dicha muestra de tumor, balanceado por parámetros que dependen de la combinación de genes elegida y que pueden se calculados mediante optimización sobre un grupo de entrenamiento de tumores de HCC, seguido de una validación sobre un grupo de prueba de tumores de HCC, tal
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y como está explicado con más detalle en el Ejemplo 3 de la presente memoria.
En función de la tecnología utilizada para la determinación del perfil de expresión, puede determinarse una función de puntuación apropiada con parámetros adecuados.
5 En particular, cuando el perfil de expresión se determina utilizando PCR cuantitativa, para una muestrai dada, se puede calcular una “puntuación” de supervivencia global o de supervivencia sin recaída utilizando la siguiente fórmula:
−ΔCt (muestra ,gen )
it
Puntuación (muestra i ) = ∑ β (gen t ) • (2 −µ(gen t ))
t =1.. n
10 en la que
-n representa el número de genes en el perfil de expresión,
15 -para cada gent, β(gent) y µ(gent) son parámetros que dependen de la combinación de genes elegida y pueden ser calculados mediante optimización sobre un grupo de entrenamiento de tumores de HCC, seguido de una validación sobre un grupo de prueba de tumores de HCC, tal y como está explicado con más detalle en el Ejemplo 3 de la presente memoria.
20 En cualquier procedimiento de pronóstico in vitro de supervivencia global o de supervivencia sin recaída divulgado en la presente memoria, la puntuación o puntuaciones de supervivencia global y/o de supervivencia si recaída obtenidas se comparan entonces con por lo menos un valor umbral, que determina si el pronóstico es malo o bueno.
25 Para una combinación de genes dada en el perfil de expresión, dicho valor umbral puede ser determinado utilizando el mismo procedimiento que para los parámetros β(gent) y µ(gent), es decir, mediante optimización sobre un grupo de entrenamiento de tumores de HCC, seguido de una validación sobre un grupo de prueba de tumores de HCC, tal y como está explicado con más detalle en el Ejemplo 3 de la presente memoria.
30 Para un valor umbral dado, el pronóstico de la muestra será:
-un mal pronóstico: si su puntuación es superior o igual a dicho valor umbral, o
-un buen pronóstico: si su puntuación es estrictamente inferior a dicho valor umbral.
35 Preferentemente, en un procedimiento de pronóstico in vitro de supervivencia global divulgado en la presente memoria, el perfil de expresión consiste en una combinación de genes de la siguiente Tabla 8 y se determina utilizando PCR cuantitativa y la siguiente fórmula:
−ΔCt (muestra , gen )
it
Puntuación supervivencia global (muestra i ) = ∑ β (gen t ) • (2 −µ(gen t ))
t =1.. n
40 en la que:
-n representa el número de genes de la combinación
45 -t representa el número de cada gen en la combinación mostrada en la siguiente Tabla 8, y
-el valor de cada uno de los coeficientes β(gent) y µ(gent) está en un intervalo de 10%, preferentemente 9%, 8%, 7%, 6%, 5%; o incluso 4%, 3%, 2% o 1% alrededor de los valores mostrados en la Tabla 8.
50 Tabla 8. Combinación de genes (predictor) preferida y parámetros para la determinación de la puntuación global.
Predictor 1
Número de gen
Símbolo de gen µ β Valor umbral
1
TAF9 7,28 0,129 -0,393
2
NRCAM 1,59 0,252
3
RAMP3 0,14 -6,133
4
PSMD1 4,66 0,024
5
ARFGEF2 3,66 -0,025
Preferentemente, el valor umbral utilizado para el pronóstico de supervivencia global está en un intervalo de 10%, preferentemente 9%, 8%, 7%, 6%, 5%; o incluso 4%, 3%, 2% o 1% alrededor de los valores mostrados en la Tabla
55 8.
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Preferentemente, en un procedimiento de pronóstico in vitro de supervivencia sin recaída divulgado en la presente memoria, el perfil de expresión consiste en un combinación de genes de la siguiente Tabla 9 y se determina utilizando PCR cuantitativa y la siguiente fórmula:
5
−ΔCt (muestra , gen )
i t
Puntuación supervivencia sin recaída (muestra i ) = ∑ β (gen t ) • (2 −µ(gen t ))
t =1.. n
en la que
-n representa el número de genes en la combinación 10 -t representa el número de cada gen en la combinación mostrada en la siguiente Tabla 9, y
-el valor de cada uno de los coeficientes β(gent) y µ(gent) está en un intervalo de 10%, preferentemente 9%, 8%, 7%, 6%, 5%; o incluso 4%, 3%, 2% o 1% alrededor de los valores mostrados en la Tabla 9. 15 Tabla 9. Combinación de genes (predictor) preferida y parámetros para la determinación de la puntuación global.
Predictor 1
Número de gen
Símbolo de gen µ β Valor umbral
1
TAF9 7,28 0,127 -0,461
2
NRCAM 1,59 0,196
3
RAMP3 0,14 -3,886
Preferentemente, el valor umbral utilizado para el pronóstico está en un intervalo de 10%, preferentemente 9%, 8%, 20 7%, 6%, 5%; o incluso 4%, 3%, 2% o 1% alrededor de los mostrados en la Tabla 9.
Preferentemente, los valores de ∆Ct(muestrai, gent) se calculan en relación a ARN ribosomal 18S (R18S).
La presente descripción divulga además un procedimiento para el diagnóstico/determinación in vitro respecto a si es 25 recomendable la terapia adyuvante a partir de una muestra de hígado HCC de un sujeto que sufre HCC, que comprende:
a) determinar un pronóstico de supervivencia global y/o de supervivencia sin recaída según cualquier procedimiento divulgado en la presente memoria y 30 b) determinar si es recomendable la terapia adyuvante a partir de dicho pronóstico, de manera que:
-en presencia de un mal pronóstico, se recomienda la terapia adyuvante, mientras que -en ausencia de un mal pronóstico, no se recomienda la terapia adyuvante.
35 Por “terapia adyuvante” se pretende decir una terapia antitumoral adicional que puede ser administrada a un sujeto que sufre HCC después de la extirpación quirúrgica del tumor de HCC. Las terapias adyuvantes pueden incluir, sin estar limitadas a, quimioterapia y radioterapia.
40 La presente invención también se refiere a un kit para la clasificación in vitro de un tumor de HCC en 6 subgrupos G1, G2, G3, G4, G5 y G6 a partir de una muestra de hígado HCC de un sujeto que sufre HCC, que consiste en reactivos para la determinación de un perfil de expresión que consiste en:
(i) la siguiente combinación de 16 genes: RAB1A, REG3A, NRAS, RAMP3, MERTK, PIR, EPHA1, LAMA3, 45 G0S2, HN1, PAK2, AFP, CYP2C9, CDH2, HAMP, y SAE1, o
(ii) la siguiente combinación de 24 genes: ALDH1L1, CD24, CD74, CFHR3, CYP4F12, DNAJA3, DSCR1, EPHA1, EPHB4, FAAH, FGFR2, FLJ10159, GLT8D1, HAL, MATN2, MRPS7, PAK2, PLXNB1, RAB1A, RHOQ, SLC27A5, SLPI, SMARCE1, STRA13,
50 en el que los 6 subgrupos G1, G2, G3, G4, G5 y G6 están definidos por sus características clínicas y genéticas descritas en la Tabla 2.
La presente descripción también divulga un kit para la clasificación in vitro de un tumor HCC en 6 subgrupos a partir
55 de una muestra de hígado HCC de un sujeto que sufre HCC, que comprende reactivos para la determinación in vitro de un perfil de expresión que comprende o que consiste en una combinación de por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 14, o por lo menos 16 genes seleccionados de entre el grupo que consiste en: RAB1A, REG3A, NRAS, RAMP3, MERTK, PIR, EPHA1, LAMA3, G0S2, HN1, PAK2, AFP, CYP2C9, CDH2, HAMP, SAE1, ADH6, DCN, FLJ10159, ALDH1L1, IGF1, LECT2, SLC38A1, SPARCL1, CTNNA2, GLUL, LEF1, MATN2,
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MME, PFN2, SPINT2, TBX3, y FGFR2. Estos genes corresponden al primer set de genes (ver Tabla 3) identificados como útiles para clasificar tumores HCC en los subgrupos G1 a G6 tal como están definidos por sus características clínicas y genéticas de la Tabla 2.
Un kit para la clasificación in vitro de un tumor de HCC divulgada en la presente memoria comprende los reactivos para la determinación in vitro de un perfil de expresión que comprende o que consiste en una combinación de por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 14, o por lo menos 16 genes seleccionados de entre el grupo que consiste en: RAB1A, REG3A, NRAS, RAMP3, MERTK, PIR, EPHA1, LAMA3, G0S2, HN1, PAK2, AFP, CYP2C9, CDH2, HAMP, SAE1, ADH6, DCN, FLJ10159, ALDH1L1, IGF1, LECT2, SLC38A1, SPARCL1.
Más preferentemente, un kit para la clasificación in vitro de un tumor de HCC divulgado en la presente memoria comprende los reactivos para la determinación in vitro de un perfil de expresión que comprende o que consiste en una combinación de por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 14, o por lo menos 16 genes seleccionados de entre el grupo que consiste en: RAB1A, REG3A, NRAS, RAMP3, MERTK, PIR, EPHA1, LAMA3, G0S2, HN1, PAK2, AFP, CYP2C9, CDH2, HAMP, y SAE1.
La presente descripción divulga además un kit para la clasificación in vitro de un tumor de HCC en 6 subgrupos a partir de una muestra de hígado de HCC de un sujeto que sufre HCC, que comprende los reactivos para la determinación in vitro de un perfil de expresión que comprende o que consiste en una combinación de por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 14, por lo menos 16, por lo menos 18, por lo menos 20, por lo menos 22 o por lo menos 24 genes seleccionados de entre el grupo que consiste en: ALDH1L1, CD24, CD74, CFHR3, CYP4F12, DNAJA3, DSCR1, EPHA1, EPHB4, FAAH, FGFR2, FLJ10159, GLT8D1, HAL, MATN2, MRPS7, PAK2, PLXNB1, RAB1A, RHOQ, SLC27A5, SLPI, SMARCE1, STRA13. Estos genes corresponden al segundo set de genes (ver Tabla 4) identificados como útiles para clasificar tumores de HCC en subgrupos G1 a G6 tal como están definidos por sus características clínicas y genéticas de la Tabla 2.
La presente descripción divulga un kit para el pronóstico in vitro de supervivencia global y/o de supervivencia sin recaída a partir de una muestra de hígado HCC de un sujeto que sufre HCC, que comprende los reactivos para la determinación in vitro de un perfil de expresión que comprende o que consiste en una combinación de por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4 o por lo menos 5 genes seleccionados de entre el grupo que consiste en NRCAM, PIR, RAMP3, SLC21A2, TAF9, TNA, HN1, PSMD1, MRPS7, CDC20, EN01, HLF, STRA13, RAGD, NRAS, ARFGEF2, RAB1A, G0S2, SMAD3, DNAJA3, HELO1, RHOQ, C14orf156, NPEPPS, PDCD2, PHB, KIAA0090, IMP3, KPNA2, KIAA0268 , UNQ6077, LOC440751, G6PD, STK6, TFRC, GLA, TRIP13, SPP1, AKR1C1, AKR1C2, GIMAP5, ADM, CCNB1, TKT, AGPS, RAN, NUDT9, HRASLS3, HLA-DQA1, NEU1, RARRES2, PAPOLA, ABCB6, BIRC5, FLJ20273, C14orf109, CHKA, TUBB2, HMGB3, TXNRD1, IFITM1, KIAA0992, MPPE1, KLRB1, CCL5, SYNE1, DNASE1L3, CYP2C18, PACSIN2, PON3, y PPP2R1B.
Preferentemente, el kit divulgado en la presente memoria para el pronóstico in vitro de supervivencia global y/o de supervivencia sin recaída a partir de una muestra de hígado HCC de un sujeto que sufre HCC, comprende reactivos para la determinación in vitro de un perfil de expresión que comprende o que consiste en una combinación de por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4 o por lo menos 5 genes seleccionados de entre el grupo que consiste en NRCAM, PIR, RAMP3, SLC21A2, TAF9, TNA, HN1, PSMD1, MRPS7, CDC20, ENO1, HLF, STRA13, RAGD, NRAS, ARFGEF2, RAB1A, G0S2, SMAD3, DNAJA3, HEL01, y RHOQ.
Más preferentemente, el kit divulgado en la presente memoria para el pronóstico in vitro de supervivencia global a partir de una muestra de hígado HCC de un sujeto que sufre HCC, comprende reactivos para la determinación in vitro de un perfil de expresión que comprende o que consiste en una de las combinaciones de genes siguientes:
-TAF9, PIR, NRCAM y RAMP3,
-TAF9, NRCAM, SLC21A2 y PSMD1,
-TAF9, NRCAM, RAMP3 y PSMD1,
-TAF9, NRCAM, NRAS, RAMP3 y PSMD1, o
-TAF9, NRCAM, RAMP3, PSMD1 y ARFGEF2.
Más preferentemente, el kit divulgado en la presente memoria para el pronóstico in vitro de supervivencia global a partir de una muestra de hígado HCC de un sujeto que sufre HCC, comprende reactivos para la determinación in vitro de un perfil de expresión que comprende o que consiste en la siguiente combinación de genes:
-TAF9, NRCAM, RAMP3, PSMD1 y ARFGEF2.
Preferentemente, el kit divulgado en la presente memoria para el pronóstico in vitro de supervivencia sin recaída a partir de una muestra de hígado HCC de un sujeto que sufre HCC comprende reactivos para la determinación in vitro de un perfil de expresión que comprende o que consiste en una de las combinaciones de genes siguientes:
-TAF9 y G0S2, -TAF9, NRCAM y RAMP3,
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- TAF9, G0S2 y RAMP3,
- TAF9, NRCAM, DNAJA3 y RAMP3, o
- TAF9, NRCAM, G0S2, DNAJA3, y RAMP3.
Más preferentemente, el kit divulgado en la presente memoria para el pronóstico in vitro de supervivencia sin recaída a partir de una muestra de hígado HCC de un sujeto que sufre HCC comprende reactivos para la determinación in vitro de un perfil de expresión que comprende o que consiste en la siguiente combinación de genes:
- TAF9, NRCAM y RAMP3.
En un kit para el pronóstico in vitro de supervivencia global y/o de supervivencia sin recaída divulgado en la presente memoria, los reactivos que se proporcionan pueden permitir el pronóstico de sólo supervivencia global o de sólo supervivencia sin recaída, o pueden permitir el pronóstico de ambos supervivencia global y supervivencia sin recaída.
En cualquier kit según la invención, los reactivos para la determinación de un perfil de expresión pueden incluir cualquier reactivo útil para la determinación de un nivel de expresión de un gen. Dicha determinación del nivel de expresión puede realizarse a nivel proteico o a nivel nucleico.
Reactivos adecuados para la determinación de un perfil de expresión a nivel proteico incluyen, sin estar limitados a, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, reactivos para análisis por espectrometría de masas, y micromatrices de proteínas.
A la inversa, reactivos adecuados para la determinación de un perfil de expresión a nivel nucleico incluyen, sin estar limitados a, cebadores de amplificación, sondas nucleicas y micromatrices de ácidos nucleicos.
En particular, en un kit para la clasificación de HCC que comprende reactivos para determinar un perfil de expresión que implica genes del primer set de genes útiles para la clasificación de HCC (ver tabla 3), dicho kit puede ventajosamente comprender cebadores de amplificación, y opcionalmente sondas nucleicas útiles para el análisis por PCR cuantitativa de la expresión génica. Dicho kit también puede contener opcionalmente otros reactivos de PCR cuantitativa útiles.
De forma alternativa, en un kit para la clasificación de HCC que comprende reactivos para determinar un perfil de expresión que involucra genes del segundo set de genes útiles para la clasificación de HCC (ver Tabla 4), dicho kit puede ventajosamente comprender una micromatriz de ácidos nucleicos, y opcionalmente otros reactivos útiles para el análisis con micromatriz de la expresión génica.
Adicionalmente, en cualquier kit según la invención, dichos reactivos pueden estar provistos de instrucciones para llevar a cabo un procedimiento de clasificación in vitro según la invención. Por ejemplo, dichas instrucciones pueden:
1) permitir al usuario por si mismo llevar a cabo la clasificación o pronóstico, por ejemplo proporcionando las fórmulas necesarias y varios valores de parámetros, o
2) instruir al usuario para entrar sus datos de expresión en un software dedicado que puede proporcionarse en el kit o puede, por ejemplo, ser accesible por Internet.
En este caso, los reactivos e instrucciones pueden proporcionarse juntos en el mismo paquete o de forma separada en dos paquetes distintos.
La presente descripción divulga demás un procedimiento de tratamiento de un sujeto que sufre de HCC, que comprende:
a) determinar la supervivencia global y/o supervivencia sin recaída a partir de una muestra de hígado HCCC de dicho sujeto según un procedimiento divulgado en la presente memoria, y
b) administrar a dicho sujeto una terapia adyuvante en presencia de un mal pronóstico, mientras que no administrar dicha terapia adyuvante en ausencia de un mal pronóstico.
La presente descripción también divulga un procedimiento de criba in vitro de compuestos útiles para el tratamiento de uno de los 6 subgrupos de HCC divulgados en la presente memoria, que comprende:
a) proporcionar muestras de tumor de HCC,
b) clasificar dichas muestras de tumor de HCC según un procedimiento de la invención, y
c) probar la habilidad de dichos compuestos de inhibir el crecimiento in vitro de las muestras de tumor de HCC
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que han sido clasificadas en dicho subgrupo de HCC:
La presente descripción divulga además un procedimiento de tratamiento de un sujeto que sufre HCC, que comprende:
a) clasificar dicha muestra de tumor de HCC de un sujeto en uno de los 6 subgrupos divulgados en la presente memoria, y
b) administrar a dicho sujeto un tratamiento terapéutico orientado al subgrupo de HCC al cual pertenece la muestra de tumor de HCC.
Habiendo descrito de forma general la invención, un entendimiento adicional de las características y ventajas de la invención puede obtenerse mediante referencia a ciertos ejemplos específicos 1-2 y figuras 1-4 que se proporcionan en la presente memoria con propósitos de ilustración.
El Ejemplo 3 y la figura 5 ilustran contenido que no se reivindica en la presente solicitud.
Descripción de las figuras
Figura 1. Esquema de los diferentes subgrupos de HCC definidos por análisis transcriptómico con sus clínica, genética y vías relacionadas.
G1 a G6 indica los subgrupos de HCC de tumores definidos por análisis transcriptómico. Las líneas verticales indican características asociadas significativas (ver Tabla 1). LOH, pérdida de homocigosis; Hemocrom, hemocromatosis; AFP, alfa-fetoproteína, HBV, virus hepatits B. Las líneas sólidas y punteadas subrayando palabras principalmente indican genes sobre-y subexpresados, respectivamente, en esa categoría funcional particular.
Figura 2. Agrupamiento jerárquico no supervisado.
El dendograma mostrado se obtuvo en base al perfil de expresión de 6.176 sets de sondas de datos de Affymetrix provenientes de 57 tumores de HCC, 3 adenomas y 5 cuando positivo y negativo respectivamente. En caso de infección por HBV, las cajas grises indican un bajo número de copias de ADN viral. FAL indica Pérdida Alélica Fraccional (negro indica tumores que contienen la deleción de más de 5 brazos cromosómicos (FAL > 0,128)). Otras abreviaciones son: CTNNB1, gen β-catenina; Mut, mutación; met, metilación; nódulos sat., nódulos satélite a menos de 1 cm del tumor principal; AFP, fetoproteína alfa; CDH1, gen de E-cadherina; inv. portal, invasión portal.
Figura 3: Caracterización de un número seleccionado de genes específicos del subgrupo de HCC G1 utilizando QRT-PCR.
a.
Validación de genes específicamente sobreexpresados en el subgrupo G1 de HCC predicho. Se analizaron IGF2 (Factor de crecimiento de insulina 2), AFP (feto proteína alfa), SOX9 (región Y-box9 determinada por sexo), MYH4 (Cadena pesada de miosina IIb), PEG1 y PEG3 (expresado paternalmente 1 y 3) en 109 HCC. Los diagramas de cajas y bigotes muestran (extendiéndose desde el percentil 25 al percentil 75 con una línea en la mediana (percentil 50) el rango de valores de expresión log10 relativos (tumor versus media de 21 no tumores (T/NT)) obtenidos para el gen indicado en cada uno de los 6 subgrupos predichos (G1 a G6), en 21 muestras no tumorales (NT) y en 19 muestras de hígados fetales (FL). Los bigotes se extienden por encima y por debajo de la caja para mostrar los valores superior e inferior. Los P-valores a partir de pruebas ANOVA que comparan los valores de expresión en los diferentes subgrupos de HCC están indicados debajo del símbolo del gen.
b.
Validación de genes sobreexpresados en tumores mutados en PIK3CA (PIK3CA mut) comparados con 107 HCC no mutados (PIK3CA NM) para EEF1A2 (factor de elongación de la traducción eucariótico 1 alfa) y PRSS7 (precursor enteroquinasa). Los P-valores resultantes de una prueba T comparando muestras mutadas y no mutadas se muestran debajo del símbolo del gen.
Figura 4: Caracterización de tumores de HCC que lleva a los subgrupos G5 y G6.
a.
Validación de genes especialmente sobreexpresados en los subgrupos G5 y G6 de HCC predichos utilizando QRT-PCR. Los diagramas de cajas y bigotes que representan el rango de valores de expresión log10 relativos (tumor versus media no tumores (T/NT)) obtenidos para GLUL (glutamina sintasa), TBX3 (factor de transcripción TBX3), MME (metalopeptidasa de membrana, CD10), LAMA3 (cadena alfa-3 de laminina 5), SPARCL1 (hevina), MERTK (tirosina quinasa de proto-oncogen c-mero), PAP (proteína asociada a pancreatitis), EPHB2 (receptor de efrina B2), LEF1 (factor de unión a intensificador linfoide 1) y CDH1 (Ecadherina) analizados en 109 muestras de HCC como se describe en la Figura 3.
b.
Inmunotinción de β-catenina en casos representativos de HCC mutado para la β-catenina y que lleva a G5 y
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G6. En el caso HCC303 (G5), debe notarse un bajo número de núcleos teñidos y una tinción intensa de la membrana plasmática (flechas blancas). En el caso HCC305 (G6), el citoplasma y los núcleos de los hepatocitos están intensamente teñidos (flechas negras) sin señal en la membrana plasmática.
5 c. Expresión de proteína E-cadherina en HCC de G6 utilizando western blot (paneles superiores) comparado con el nivel de expresión de ARNm (grupo G5 y G6) utilizando QRT-PCR (panel inferior).
Figura 5: Predictores de supervivencia
10 a. Se muestran los resultados para el mejor predictor de supervivencia global. La curva ROC muestra la especificidad y sensibilidad para diferentes umbrales de puntuación. Los círculos corresponden al set de entrenamiento (n = 42) y las cruces al set de validación (n=53). Los círculos y cruces encuadrados indican la sensibilidad y especificidad obtenidas para el umbral elegido (-0,393). El umbral se eligió con el fin de tener una tasa de éxito máxima y un P-valor mínimo en base a una prueba exacta de Fisher para la tabla de
15 contingencia “clase predicha/clase verdadera” de las muestras del set de entrenamiento. La curva de puntuación muestra las puntuaciones obtenidas para el set de entrenamiento (curva superior) y el set de validación (curva inferior) a partir de la fórmula de puntuación de supervivencia global descrita en el Ejemplo
3.2 con los parámetros de la Tabla 11, mientras que la línea punteada indica la puntuación umbral elegida. Los trazos horizontales representan pacientes vivos mientras que los trazos verticales representan pacientes
20 muertos. Las curvas de supervivencia para el set de entrenamiento (líneas punteadas) y el set de validación (líneas sólidas) están estratificadas mediante la puntuación umbral indicada.
b. Se muestran los resultados para el mejor predictor de supervivencia libre de enfermedad. Se utiliza el mismo código de representación que en la Figura 5A. La curva de puntuación muestra las puntuaciones obtenidas
25 a partir de la fórmula de puntuación libre de enfermedad descrita en el Ejemplo 3.2 con los parámetros de la Tabla 14. Los trazos horizontales representan pacientes libres de enfermedad mientras que los trazos verticales representan pacientes no libres de enfermedad.
Ejemplos
30
Ejemplo 1: Estrategia de análisis transcripcional de tumores de HCC
Tumores y muestras, datos clínicos
35 Una serie de 120 carcinomas hepatocelulares y 3 adenomas hepatocelulares con sus tejidos no tumorales correspondientes se recogieron de 123 pacientes tratados por extirpación de hígado en tres departamentos quirúrgicos franceses entre 1992 y 1999. Para todos los casos incluidos en este estudio, estuvieron disponible los datos clínicos y el seguimiento completos. Todos estos tumores se caracterizaron clínicamente tal y como se ha descrito anteriormente (Laurent-Puig, P. et al. Gastroenterology 120, 1763-73 (2001)). La proporción por sexo (M:F)
40 fue de 1:4 y la media de edad de los pacientes fue de 60 años (edad mediana = 63 años, rango entre 18 y 85 años). Los pacientes nacieron en Francia (92 casos), África subsahariana (11 casos), área mediterránea (7 casos), las Antillas (4 casos) y Asia (4 casos). Los factores de riesgo para HCC de virus hepatitis B, virus hepatitis C, abuso de alcohol y hemocromatosis ocurrieron en 36, 30, 40 y 6% de los tumores, respectivamente. En 25 casos los HCC se desarrollaron en ausencia de factores de riesgo conocidos y en 16 casos se encontraron por lo menos dos factores
45 de riesgo. El grado histológico de diferenciación del tumor se asignó de acuerdo con el sistema de graduación de Edmonson y Steiner, grado I (7%), II (49%), III (39%) y IV (4%). En 103 casos el nivel preoperatorio de αfetoproteína en suero estuvo disponible y para 37 pacientes por encima de 100 IU/ml. Se registró invasión vascular microscópica y/o microscópica en 37% de los casos. Se registraron tumores satélites, definidos por nódulos localizados a menos de 1 cm del tumor principal en el 41% de los casos. Se evaluó la supervivencia global y la
50 supervivencia libre de enfermedad en 99 pacientes con una extirpación completa R0 después de eliminar los pacientes tratados con un transplante de hígado o que murieron en un periodo de 3 meses post-operatorios. Para minimizar el efecto de la ocurrencia de un segundo tumor no relacionado en cirrosis, no se tuvieron en cuenta los datos de supervivencia después de 5 años. El seguimiento medio en toda la serie fue de 38 meses (rango de 3-60 meses) y fue de 49 meses para pacientes todavía vivos. Se construyeron dos variables de pronóstico cuantitativas:
55 (1) “recaída temprana” si o no se definió por la presencia de una recaída del tumor durante los dos años después de la extirpación del hígado y la ausencia de recaída durante los 4 años post-operatorios; (2) “muerte temprana” si o no se definió mediante la ocurrencia de muerte durante los 3 años después de la extirpación de hígado y la ausencia de muerte durante los 5 años post-operatorios. Para el análisis de Affymetrix, se utilizaron 5 conjuntos de 3 tejidos de hígado no tumorales correspondientes con los tumores analizados incluyendo cirrosis alcohólica (conjunto 1), hígado
60 alcohólico no cirrótico (conjunto 2), hígado no cirrótico HBV (conjunto 3), cirrosis HCV (conjunto 4) y cirrosis HBV (conjunto 5). En los experimentos de QRT-PCR, se analizaron individualmente estos 15 ARNs no tumorales y 6 ARNs de hígado no tumoral normal adicionales. También se recogieron 19 muestras de hígado fetal humano en diferentes etapas del embarazo (desde 11 hasta 29 semanas de embarazo). El estudio fue aprobado por el Comité Ético local (CCPPRB Paris Saint-Louis) y se obtuvo el consentimiento informado de acuerdo con la legislación
65 francesa.
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Análisis del transcriptoma básico
Se realizaron análisis con micromatriz utilizando como material de partida 5 µg de ARN total de cada muestra y 20 µg de ARNc por hibridación (GeneChip Fluidics Station 400) de matrices de Affymetrix GeneChipTM HG-U133A. Se generaron imágenes de cada matriz utilizando HP GeneArray 2500 y se analizaron siguiendo los protocolos del fabricante (http://www.affymetrix.com/support/technical/manual/expression manual.affx). Excepto cuando se indique, todos los análisis de transcriptoma se llevaron a cabo utilizando ya sea un surtido de paquetes del software de sistema R (v 1.9.0) incluyendo aquellos de Bioconductor (v 1.1.1) o código de R original. Los paquetes de R y las versionas están indicadas cuando es necesario. Los datos de características crudos de 65 micromatrices Affymetrix GeneChipTM HG-U133A se normalizaron y los valores resumen de expresión de intensidad log2 para cada set de sondas se calcularon utilizando una media multimatriz robusta (paquete Affy V1.4.32). Sets de sonda correspondientes a genes control o que tienen una anotación “_x_” se enmascararon resultando en un total de
19.787 sets de sondas disponibles para posteriores análisis.
Ejemplo 2: Clasificación de tumores de HCC
2.1 Material y métodos
Mutaciones génicas, desequilibrio cromosómico, cuantificación del genoma HBV y metilación de ADN
Para todas las muestras, los ADNs de tumor y de no tumor se diseccionaron y se almacenaron a -80ºC hasta que tuvo lugar la extracción de ADN y ARN utilizando los kits de extracción Qiaquick y Rneasy, respectivamente (Qiagen). Los ADNs se cuantificaron mediante fluorometría (Fluoroskan Thermo Lab-system), el ARN se cuantificó utilizando un espectrofotómetro a 260 nm (Nanodrop). La calidad del ADN y el ARN se controló mediante electroforésis en gel seguida de tinción con bromuro de etidio y bioanalizador Agilent 2100. Los ARNs calificaron para los experimentos de Affymetrix si la proporción 28S/18S era más de 1,5 y para análisis de PCR cuantitativa si la proporción 28S/18S era más de 1. Se buscaron mutaciones génicas en los exones 2 a 11 de TP53, exones 2 a 4 de CTNNB1 que codifica para la β-catenina, exones 1 a 10 de AXIN1, exones 1 a 20 de PIK3CA, mediante secuenciación directa de los ADNs de tumor utilizando un secuenciador 3100 Applied Biosystems. Las pérdidas alélicas y desequilibrios cromosómicos se investigaron mediante el genotipado de 400 marcadores del panel de microsatélites LMS2 (Applied Biosystems) como se ha descrito anteriormente (Laurent-Puig, P. et al. Gastroenterology 120, 1763-73 (2001)). Para todas las muestras relacionadas con una infección HBV, ya sea por resultados serológicos o por amplificación de ADN viral (Laurent-Puig, P. et al. Gastroenterology 120, 1763-73 (2001)), se cuantificaron copias de HBS y HBX de ADN en los ADN tumoral y no tumorales utilizando el método Sybr green (Applied Biosystems). Las secuencias de ADN de HBS y HBX se determinaron en todos los tumores para asegurar que los cebadores utilizados para la cuantificación se habían elegido en regiones fuera de polimorfismos o mutaciones virales. La cuantificación de ADN viral se relacionó con la amplificación por PCR del cromosoma 22. La amplificación por PCR se midió a 95, 97 y 94% para HBS, HBX y referencia de cromosoma 22, respectivamente. Las muestras de ADN de tumor y de no tumor también se cuantificaron cuidadosamente utilizando fluorimetría con Hoetsch y las concentraciones se verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Se definió un bajo número de copias de ADN viral en los tumores mediante una proporción HBX/referencia y HBS/referencia inferior a 0,5 (media: 0,01, rango: 0,002-0,5, error estándar: 0,14). Se definió un alto número de copias de ADN viral en los tumores mediante una proporción HBX/referencia y HBS/referencia superior a 1,5 (media: 25, rango: 1,6-212, error estándar: 46). No se encontró ningún valor entre 0,5 y 1,6. Se investigó la metilación del ADN en los promotores de CDH1 y CDKN2A utilizando ADN bisulfito y una amplificación específica de metilación tal y como se ha descrito anteriormente (Lee, S. et al. Am J Pathol 163, 1371-8 (2003); Zochbauer-Muller, S. et al. Cancer Res 61, 249-55 (2001)).
Análisis por RT-PCR cuantitativa
Para los análisis de RT-PCR cuantitativa, 3 µg de ARN total se retrotranscribieron utilizando el Archive kit de alta capacidad y hexámeros aleatorios (Applied Biosystems). Para cada muestra y cada gen probado, se analizó 1 µl de ADNc, correspondiente a 2 ng de ARN retrotranscrito, mediante análisis de PCR TaqMan, en duplicado, utilizando la matriz de Baja Densidad TaqMan® y el Sistema ABI PRISM® 7900HT (Applied Biosystems). La calidad del ADNc se evaluó utilizando una cuantificación de R18S mediante PCR a tiempo real (Coeficiente de variación 7% para la serie entera). La cantidad relativa del ARNm probado en las muestras se determinó utilizando el método 2 -∆∆CT en el que ∆∆CT = (CTPROBADA – CTR18S)muestra – (CTPROBADA – CTR18S)calibrador (Livak, K.J. & Schmittgen, T.D. Methods 25, 402-8 (2001)). Brevemente, los resultados de expresión de un gen fueron normalizados con respecto a un control interno 18S ribosomal y en relación a un calibrador, que consiste en el nivel de expresión medio del gen correspondiente en muestras de no tumor normalizadas con respecto a un control interno 18S ribosomal. Los valores mostrados en las tablas y gráficos expresan la proporción n-veces de la expresión génica en una muestra probada comparada con la media de tejidos no tumorales.
Western-blot e inmunocitoquímica
Se homogeneizaron tejidos congelados con un Dounce en 500 µl de tampón de lisis RIPA (Santa Cruz) enfriado en
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hielo y se determinó la concentración de proteína mediante el kit de ensayo de proteína BCA (Pierce). Se realizó un análisis de inmunoblot utilizando 50 µg de proteínas migradas en un gel de SDS poliacrilamida 6%, un anticuerpo Ecadherina policlonal (SC-7870, 1:500, Santa Cruz), un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (1:2000, Santa Cruz) y quimioluminiscencia mejorada (ECL, Pierce). La inmunotinción de realizó sobre secciones de 5 µm de muestras de hígado fijadas en formalina y embebidas en parafina, utilizando anti-β-catenina (1:400, BD biosciences 610153), anti-raton biotinilado (1:200, Vector Laboratories BA-2000), Vectastain ABC Elite standard kit (Vector Laboratories PK-6100), DaB kit (Vector laboratories SK-4100). Antes de la inmunotinción, la peroxidasa endógena se bloqueó y se realizó la recuperación de antígeno con tampón citrato 0,001 M pH 7 en una olla a presión (Biogenex).
Clasificación basada en el análisis de transcriptoma
La clasificación de las 65 muestras se basó en una serie de 24 análisis de clústeres jerárquicos, obtenidos a partir de 8 subsets de datos y 3 métodos de enlace diferentes (media, completo y de Ward), utilizando una correlación 1-Pearson como métrica de distancia (paquete clase V 2.2-2). Los 8 subsets de datos correspondieron a 8 selecciones no-supervisadas de los perfiles de expresión más variables. Los criterios para esta selección fueron la diferencia significativa de la varianza para un set sonda dado en comparación con la varianza mediana (P<0,01), así como un coeficiente “robusto” diferente coeficientes de umbrales de variación (rCVs, calculados dividiendo la desviación estándar por la media de los valores de intensidad log2 de un set sonda para n-2 muestras eliminando los valores más bajo y la más alto). Se seleccionaron entre 99 y 6.712 sets sonda (percentiles de rCV 99,5 y 60). La estabilidad de los 24 dendogramas iniciales se evaluó mediante comparación de cada uno con los resultados de clúster obtenidos antes de perturbar/re-muestrear (100 iteraciones para cada uno, ver información suplementaria para detalles sobre la estabilidad de la puntuación). El modelo también se probó utilizando una aproximación de agrupamiento de K-medias, con diferentes números de clústeres iniciales (k= 7..15). Utilizando el mejor resultado de 200 para cada k (es decir, el resultado con la mayor distancia entre los k grupos), las muestras se agruparon de forma consistente en los 6 subgrupos de HCC o como subsets de los mismos.
Asociación de subgrupos de HCC y variables clínicas/genéticas
Se realizaron pruebas exactas de Fisher con el fin de determinar la significación de la asociación entre diferentes variables clínicas y genéticas y los 6 subgrupos de tumores de HCC. Se probaron los resultados de clústeres obtenidos a partir de todas las combinaciones de métodos de enlace y listas de genes. Además, se recodificaron variables con múltiples modalidades (por ejemplo, HBT) en valores binomiales y se probó cada combinación. Para el predictor global utilizando resultados de QRT-PCR (ver Tabla 1), se utilizaron 1.000 permutaciones aleatorias de etiquetas de clase para corregir los P-valores originales lo que significa que un P de 0 en la tabla equivale a P<0,001.
Construcción de un predictor global
Predictor de datos de Affymetrix
Para construir un predictor multiclase, las 65 muestras se dividieron en un set de entrenamiento (n=36, 6 para cada grupo de clúster, seleccionados de forma aleatoria), y en un set de prueba (n= 24 tumores más 5 muestras no tumorales). Se utilizó una estrategia de aprendizaje en 6 etapas: (1) selección supervisada del gen utilizando pruebas F y en base a las muestra de entrenamiento (n = 376 sets sonda); (2) filtrado de los set de sondas del gen en base a submuestreo, a niveles de intensidad globales y a símbolos de genes HUGO redundantes y a control de la tasa de descubrimiento falso (n = 258); (3) subselecciones aleatorias de 8-25 genes, segmentados (o no) mediante “bins” de clústeres de genes; (4) aprendizaje de regla utilizando 5 algoritmos de predicción; (5) selección de regla en base a la tasa de éxito en predecir el set de prueba; (6) validación de regla utilizando datos de RT-PCR y pruebas exactas de Fisher para evaluar la asociación de factores clínicos y genéticos con los grupos predichos.
De forma más precisa, las diferentes etapas se llevaron a cabo como se explica a continuación:
1. Selección de gen y 2. Filtrado de set sonda del gen: utilizando S1, se realizó una prueba F utilizando una prueba de permutación multivariable en base a 1.000 permutaciones de etiquetas de muestra para corregir para pruebas múltiples (BRB ArrayTools3.0.beta2). Esta prueba resultó en 1.041 sets de sondas que contenían menos de 10 descubrimientos falsos. Se realizó la misma prueba sobre una subselección de 18 muestras en S1 (3 casos por grupo seleccionados de forma aleatoria) y se encontraron 515 sets de sondas significativos (aquí se utilizó un p-valor <0,001 como criterio umbral debido al bajo número de muestras por clase que hace que la prueba de permutación no sea fiable). La intersección de estas dos listas y el filtrado de los sets de sondas que tuvieron una intensidad máxima menor de 100 unidad en los 6 grupos de clúster de HCC resultaron en 258 sets de sondas.
3. Subselecciones aleatorias de genes: (i) A partir de la lista de 225 sets de sondas se generaron de forma aleatoria 1000 sublistas de un número k de sets de sondas (k = 8,,25) por lista (total de 18.000 sublistas). (ii) A partir de la lista de 225 sets de sondas, se generaron 1.000 sublistas de un número k-de sets de sondas (k=15, 30, total de
2.000 sublistas), eligiendo la misma proporción de genes de bins de clúster de genes individuales. Los bins de clústeres de genes se construyeron en base a un agrupamiento por enlace completo de los 225 sets de sondas
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(utilizando un coeficiente 1-Pearson como métrica de distancia), y después cortando el dendograma para obtener 15 nodos de clúster (n = 4 a 49 sets de sondas por bin de clúster); (iii) también se generaron 1.000 sublistas de k sets de sondas (k = 8, 16, 24, un total de 3.000 sublistas) representando igualmente los bins de clúster de genes derivados a partir de un agrupamiento de enlace medio, (coeficiente 1-Pearson) y cortando el dendograma en 20 nodos, fusionando nodos de clúster pequeños (representados por menos de 10 sets de sondas o una correlación mayor de 0,3 con el nodo adyacente más cercano) resultando en un total de 8 bins de clústeres de genes (n = 9 – 87 sets de sondas por bin de clúster).
4.
Aprendizaje de regla: Los datos de expresión del set S1, restringidos a las 23.000 sublistas de sets de sondas, sirvieron para entrenar 5 algoritmos de predicción (SVM (e1071, v1.4-1), PAM (pamr, 1.14.2), k-NN (class, v7.2-2), DQDA y DLDA (sma, v0.5.14)), resultando en 115.000 predictores.
5.
Selección de regla: Para cada algoritmo, en combinación con cada valor de k ((i) k = 8..25; (ii) k=15, 30; (iii) k = 8, 16, 24), se seleccionó la mejor sublista de entre 1.000 en base a la tasa de éxito del predictor correspondiente (entrenado con un set de entrenamiento) para clasificar sets de muestra de validación (en caso de igualdad se conservó la primera sublista encontrada); esta selección resultó en 115 predictores. De entre estos, 7 predictores relacionados con 6 sublistas distintas, obtuvieron tasas de éxito superiores al 93% al clasificar muestras del set de validación. Se seleccionaron las 24 sublistas de genes relacionadas con 2 predictores (algoritmos SVM y PAM) de entre estas 6 sublistas. Se observó que esta sublista tuvo una tasa de éxito de 97% utilizando Centroides Encogidos Más Cercanos (PAM) en predecir pertenencias verdaderas de las 36 muestras en el set de entrenamiento (100% para SVM) y 93,1% de las 29 muestras en el grupo de validación.
6.
Validación de regla: Se obtuvieron datos de RT-PCR para 23 de los 24 genes en la sublista previamente seleccionada (no hubo cebadores disponibles para CD24), sobre una serie de 109 tumores, incluyendo 46 muestras analizadas previamente con micromatrices Affymetrix HG-U133A GeneChipTM (28 en el set de entrenamiento original (S1a), y 18 HCC en el set de validación original (S2a)). Utilizando datos de ∆Ct (con 18S como gen control) para el set S1a, se entrenaron 5 algoritmos de predicción (SVM, PAM, k-NN, DQDA y DLDA): aplicado al set S2a, el predictor derivado de SVM tuvo una tasa de éxito de 81% (100% para S1a).
Predictor de datos de PCR
Dado el éxito parcial del predictor de 24 genes transferido de los datos Affymetrix a los datos de PCR, se investigó un nuevo predictor, empezando el proceso desde una lista inicial de 103 genes de entre los 140 genes analizados por QRT-PCR. Estos 103 genes correspondieron a las pruebas estadísticas supervisadas comparando los diferentes grupos de clústeres, utilizando todas las 65 muestras en el set de datos de Affymetrix. Se siguió entonces la misma estrategia de aprendizaje descrita para los datos de Affymetrix: subselecciones aleatorias de genes; aprendizaje de regla; selección de regla; validación de regla . De forma aleatoria, se generaron 500 sublistas de un número k de sets de sondas (k = 5..16) por lista (total de 6.000 sublistas). Utilizando los datos de ∆Ct (gen control 18S), se entrenaron 5 algoritmos de predicción (SVM, PAM, k-NN, DQDA, DLDA) sobre el set S1 y se obtuvieron 30.000 predictores. Para cada algoritmo, en combinación con cada valor de k, se seleccionó la mejor sublista de entre las 500, en base a la tasa de éxito del predictor correspondiente (entrenado con S1) para clasificar el set de prueba S2 (en caso de igualdad se conservó la primera sublista encontrada); esta selección resultó en 60 predictores. De entre estos, 3 predictores dieron las tasa de éxito más altas para clasificar el set de prueba S2, uno de los cuales, obtuvo una tasa de éxito (de S2) superior a 88% para 3 algoritmos diferentes, y se consideró por lo tanto como el mejor. Este predictor se obtuvo con el algoritmo DLDA y predijo el set S1 con una tasa de éxito de 100% y el set S2 con una tasa de éxito de 94%. Como validación del predictor seleccionado, la relevancia de las clases predichas para el set S3 se evaluó vía el P-valor de una prueba exacta de Fisher midiendo el nivel de asociación entre las clases predichas (1, 2, 3 vs 4, 5, 6) y FAL (P=8,5·10-4) así como entre las clases predichas (4 vs 5, 6) y la mutación CTNNB1 (P = 5·10-5).
Determinación de los genes expresados diferencialmente en un subgrupo específico de HCC y análisis GO subsiguientes
Todas las pruebas t y F univariables se realizaron utilizando BRB ArrayTools (v3.2 b5) sobre los valores de intensidad transformados log2 para los 19.787 sets de sondas. Se designó un nivel de significación nominal de cada prueba univariable de P < 0,001 así como un 90% confianza de menos de 10 descubrimientos falsos en base a una prueba mutlivariable utilizando 1.000 permutaciones. Todas las pruebas t inter-grupo se realizaron para identificar genes que se hallaron diferencialmente expresados entre un subgrupo dado (o una combinación de subgrupos) y las muestras restantes (Gx versus Gno-x) así como entre 5 muestras no tumorales agrupadas (Gx versus no tumoral). Los genes que se hallaron mediante los dos tipos de pruebas para un subgrupo dado (y no en comparación con cualquier otro grupo) y que a su vez fueron significativos (P< 0,001, menos de 10 descubrimientos falsos como descrito) en un análisis ANOVA (prueba F anteriormente descrita) se consideraron genes específicos de un subgrupo de HCC (o de una combinación de subgrupos).
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Evaluación de estabilidad de la clasificación
Para la perturbación, se añadió ruido Gaussiano aleatorio (µ =0, σ = 1,5 x varianza mediana calculada a partir del set de datos) a un set de datos dado. Cada dendograma se dividió en k grupos (k = 2..18) y la proporción de pares de muestras retenidas en cada grupo comparado con el dendograma inicial se utilizó como puntuación de estabilidad (rango de puntuación de 0 a 1, en el que una puntuación de 1 significa que la perturbación (o remuestreo) no tuvo ningún efecto sobre la pertenencia del grupo de clúster).
2.2 Resultados
El análisis de transcriptoma no supervisado define clústeres de tumores estrechamente relacionados con alteraciones clínicas y genéticas
Se analizaron cincuenta y siete HCC, 3 adenomas hepatocelulares y 5 muestras de tejidos no tumorales agrupados utilizando matrices Affymetrix HG-U133A GeneChipTM. En base a un análisis no supervisado se ha desarrollado un modelo robusto de clasificación de tumores de HCC en 6 subgrupos (Figura 2) cada uno de los cuales está estrechamente asociado con factores clínicos y genéticos en base a pruebas exactas de Fisher (ver Tablas 1 y 2 arriba). En base a los análisis realizados, las 60 muestras de tumores se subdividen en 2 grupos principales cada uno estando dividido en 3 subgrupos más pequeños (denominados G1 a G6). Esta clasificación probó ser extremadamente robusta cuando se confrontó con pruebas de perturbación/remuestreo (las puntuaciones de reproducibilidad medias para cada análisis de clúster fueron de por lo menos 0,9 para los dos grupos principales y los 6 subgrupos) así como consistente con un análisis de clúster de k-medias iterativo (ver Materiales y Métodos). Además la topología de la división de la muestra se conservó a lo largo de las diferentes listas de genes y métodos de enlace de clústeres. Los dos grupos principales corresponden con muestras cromosómicamente inestables (G1, G2 y G3) y estables (G4, G5 y G6) ya que G1 a G3 mostraron una mayor pérdida alélica fraccional (FAL) significativa que G4 a G6 (P = 0,05, Tabla 2). Los diferentes subgrupos se caracterizaron por mutaciones de TP53 (G2 y G3), una infección HBV (G1 y G2), con un bajo número de copias de ADN HBV (G1) y mutaciones del gen CTNNB1 (G5 y G6). La presencia de nódulos cancerosos localizados a menos de 1 centímetro del tumor primario se asoció con G6 (P = 0,04, Tabla 2), indicando el gran potencial de invasión local de estos tumores. Los 5 conjuntos de muestras de tejidos de hígado no tumoral se agruparon juntos estrechamente y se encontró que un amplio grupo heterogéneo (G4) que contiene 20 tumores, 4 de los cuales, en el mismo clúster pequeño, presentaba mutaciones de TCF1 (3 adenomas y un HCC).
Identificación de 2 predictores de la clasificación de 6 grupos
Dada la relevancia clínica de los subgrupos y el potencial de diagnóstico de esta clasificación, el objetivo de los inventores fue identificar un predictor de clase más adaptado a un ambiente clínico utilizando la tecnología de transcriptasa inversa cuantitativa (QRT-PCR), más eficiente en tiempo y coste. Con el fin de buscar genes que pueden predecir la pertenencia a una clase de los 6 subgrupos se construyó, en primer lugar, un predictor utilizando los datos de Affymetrix (ver Material y métodos y siguiente Tabla 10). Este análisis identificó un primer predictor de 24 genes (ALDH1L1, CD24, CD74, CFHR3, CYP4F12, DNAJA3, DSCR1, EPHA1, EPHB4, FAAH, FGFR2, FLJ10159, GLT8D1, HAL, MATN2, MRPS7, PAK2, PLXNB1, RAB1A, RHOQ, SLC27A5, SLP1, SMARCE1, STRA13) resultando en una alta tasa de éxito de predicción de clase utilizando los datos de Affymetrix (93,1%) pero resultó ser menos satisfactorio utilizando datos de QRT-PCR (81%).
Tabla 10. Lista de los 24 genes que fueron identificados como el predictor de HCC global para las muestras de Affymetrix utilizando datos de Affymetrix. Se incluyen el símbolo del gen HUGO, el estadístico F a partir de una ANOVA entre las 6 clases de muestras y la media geométrica de valores de intensidad no log asociada por subgrupo de HCC (G1-G6).
Símbolo de gen HUGO
Estadístico F G1 G2 G3 G4 G5 G6
ALDH1L1
13,1 221 226 766 993 2213 2123
CD24
10,7 511 235 274 66 75 17
CD74
5,7 1343 2008 2481 1896 1121 4973
CFHR3///CFHR4
5,8 368 1000 174 2527 1567 980
CYP4F12
8,4 341 347 243 461 595 459
DNAJA3
6,8 412 521 621 662 727 658
DSCR1
5,5 139 134 136 205 170 265
EPHA1
16,2 432 972 189 530 230 120
EPHB4
9,3 538 264 204 261 288 220
FAAH
5,6 140 134 127 258 169 186
FGFR2
20,8 373 515 71 47 25 29
FLJ10159
11,9 896 289 168 116 89 40
GLT8D1
8,5 471 433 463 542 933 868
HAL
27,7 380 1065 139 298 83 66
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Símbolo de gen HUGO
Estadístico F G1 G2 G3 G4 G5 G6
MATN2
10,4 291 180 114 190 60 37
MRPS7
6,5 321 389 725 403 438 448
PAK2
7,6 297 199 337 143 150 119
PLXNB1
6,9 482 343 194 207 304 217
RAB1A
6,5 1960 2490 2388 1820 1601 1722
RHOQ
5,2 220 389 366 259 191 204
SLC27A5
12,2 282 564 437 2309 2147 2152
SLPI
18,0 1148 2766 313 1829 159 141
SMARCE1
7,3 439 395 489 265 303 253
STRA13
13,7 433 570 1170 583 959 1151
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De este modo, se realizaron una serie de pruebas supervisadas utilizando datos de Affymetrix y anotaciones clínicas y genéticas relevantes (es decir, el estatus mutacional de los genes TP53, CTNNB1 y AXIN1, presencia y título de HBV, recaída temprana y supervivencia global). Se elaboró una lista de 140 genes que mostraron ser significativos en una o más de estas pruebas supervisadas. Todos menos 5 de estos genes fueron validados por QRT-PCR en 109 tumores de HCC (incluyendo 46 de los 57 HCC analizados utilizando micromatrices Affymetrix y un set de validación de 63 HCC) y 21 tejidos de hígado no tumoral. Se encontró una elevada correlación entre los datos de Affymetrix y los datos de QRT-PCR en 135 de los 140 genes seleccionados (coeficiente de correlación de mediana rho de Spearman de 0,84 utilizando valores de ∆Ct). Utilizando los datos de QRT-PCR, se probaron múltiples sublistas de un subset de 103 genes (dentre los 135 probados) con el fin de identificar el mejor predictor global de los 6 subgrupos de HCC. Para este propósito, los 46 HCCs analizados con micromatrices Affymetrix se dividieron en un set de entrenamiento (n=28) y un set de prueba (n=18). Se demostró que todos los genes en la Tabla 3 previamente descrita fueron significativos en una o más de estas pruebas supervisadas, y la mayoría de ellos estuvieron presentes en por lo menos uno o dos predictores de clasificaciones buenos. La mejor tasa de éxito en predecir la pertenencia verdadera a una clase del set de entrenamiento (100%) y del set de prueba (94,4 %) se obtuvo con los valores de Ct de 16 genes (RAB1A, PAP, NRAS, RAMP3, MERTK, PIR, EPHA1, LAMA3, G0S2, HN1, PAK2, AFP, CYP2C9, CDH2, HAMP, SAE1) utilizando el algortimo de predicción DLDA.
El mejor predictor sigue las siguientes fórmulas:
clase predicha (muestra i ) = arg min(distancia (muestra i , clase k ))
k =1.. 6
en la que
(ΔCt (muestra , gen ) −µ(clase , gen )) 2
it kt
distancia (muestra i , clase k ) = ∑ σ (gen )
t=1..16 t
y en la que los parámetros µ(clasek, gent) y σ(gent) son aquellos listados en la Tabla 5 previamente descrita.
De este modo, después de haber calculado la distancia entre la muestra dada y la representación centroide de cada clase, la nueva muestra se asigna a la clase más cercana.
Esta firma se utilizó entonces para dividir las 63 muestras del set de tumores de validación en 6 subgrupos. Como se ha observado en el primer set de tumores analizados en el experimento de Affymetrix, se hallaron, utilizando pruebas exactas de Fisher, asociaciones significativas entre FAL, TP53, infección HBV y mutación del gen CTNNB1 y los diferentes subgrupos predichos, así como con aquellos que utilizan la serie completa de 109 tumores de HCC (Tabla 1).
Identificación de vías de señalización claves y categorías funcionales de genes implicados en cada subgrupo HCC
Para identificar vías clave afectadas en los diferentes subgrupos de HCC se identificaron 1.560 genes específicamente desreglados en uno o más subgrupos de HCC en base a los resultados de un “análisis de prueba t de todo el grupo combinado con ANOVA. Para todas las listas de genes específicos de subgrupos de HCC, se investigó la asociación de genes de vías conocidas. Se observó un enriquecimiento de genes del ciclo celular /proliferación/ metabolismo de ADN específicamente sobreexpresados en los subgrupos G1 a G3, correspondientes a las muestras cromosómicamente inestables (P < 0,01). Un elevado número de genes específicamente sobreexpresados se observaron para el subgrupo G1 (relacionados con infección HBV con bajo número de copias de ADN, mutaciones AXIN1, una edad más joven, niveles elevados de AFP en suero y orígenes frecuentes en África, Tablas 1 y 2). Entre ellos se encontraron genes que codifican para proteínas expresadas durante el desarrollo: cadena pesada de miosina IIb, MYH4, factores de transcripción SOX9 y SOX4 y genes con impronta parental: factor de crecimiento de tipo insulina (IGF2), gene expresado paternamente 1, 3 y 10 (PEG1, PEG3 y PEG10), fetoproteína-alfa (AFP) y sarcoglicano epsilon (SGCE). La expresión diferencial de todos estos genes fue
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validada utilizando QRT-PCR en 109 tumores (Figura 3a). Los genes marcado probados estuvieron altamente sobreexpresados en hígados fetales normales (Figura 3a). El ARNm H19 también estuvo sobreexpresado, no sólo en muestras G1 sino también en muestras fetales, correlacionando con IGF2 en estos dos grupos (R2 = 0,4 y 0,6, respectivamente).
Los tumores del subgrupo G2 (relacionado con infección HBV con alto número de copias de ADN viral, invasión local y vascular frecuente y mutaciones de TP53) estuvieron asociados de forma significativa con la sobreexpresión de genes del ciclo celular/proliferación/metabolismo de ADN (P < 0,01), un enriquecimiento que se observó igualmente en G3 (relacionado con mutaciones de TP53 y metilación de promotor de CDKN2A) y todas las muestras cromosómicamente inestables (P < 0,007). También se identificó una sobrerepresentación significativa de genes sobreexpresados implicados en fosforilación de proteína (P < 0,009). De manera interesante, se identificaron mutaciones en el gen PIK3CA de las cuales se ha predicho que resultan en la activación de la vía de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K)-AKT en dos tumores pertenecientes a G2. Estas dos muestras estuvieron estrechamente asociadas en el análisis de agrupamiento no supervisado (Figura 2). Se identificaron 38 genes específicamente sobreexpresados en las muestras mutadas en PIK3CA cuando se compararon con los otros tumores en los grupos G1 a G3. Entre estos genes, se validó utilizando QRT-PCR la sobreexpresión de dos genes que codifican para el factor de elongación de proteína EEF1A2 y la enteroquinasa PRSS7, que están específicamente sobreexpresados en los tumores mutados en PIK3CA (P = 0,001, Figura 3b). Además, el análisis GO demostró un enriquecimiento de genes de comunicación celular en los tumores mutados en PIK3CA (P = 0,07).
En G5 (CTNNB1 mutado, no nódulos distantes), se observó un enriquecimiento de genes subexpresados involucrados en estrés y respuesta inmune como IFI16, IL4R, IFI44, STAT1, IL10RA, CTSS y HLA-DPA1/B1 (P < 0,002). Los subgrupos de HCC G5 y G6 contienen 23 y 11 tumores mutados en CTNNB1 en70y 100%delos casos, respectivamente. En una investigación sobre posibles genes diana de β-catenina, se halló una lista de 280 genes sobreexpresados de forma significativa en G5 y G6. Además de GPR49 y GLUL, dos genes diana de βcatenina en el hígado conocidos (Cadoret, A. et al. Oncogene 21, 8293-301 (2002); Yamamoto, Y: et al. Hepatology 37, 528-33 (2003)), se confirmó la sobreexpresión de 7 genes diana de β-catenina putativos utilizando QRT-PCR. Estos genes incluyen: EPHB2, un receptor de tirosina quinasa; MME, la encefalinasa CD10; MERTK, un oncogén tirosina quinasa; LAMA3, que codifica para la cadena alfa 3 de la laminina 5; PAP/HIP, que codifica por una proteína asociada a pancreatitis; SPARCL1 que codifica por la hevina que está asociada con la matriz extracelular; y el factor de transcripción TBX3 (Figura 4a). Se observó un nivel de expresión significativamente más elevado de todos estos genes diana de β-catenina putativos en G6 en comparación con G5, incluso después de de excluir las muestras sin la mutación CTNNB1. También se demostró que la β-catenina estaba más sobreexpresada en tumores G6, en comparación con tumores G5, con una pérdida de señal en la membrana plasmática y una fuerte localización en el citoplasma y el núcleo (Figura 4b). De forma consistente con esta observación, se halló en G6 una sobreexpresión de LEF1, un factor de transcripción que interactúa con la β-catenina para activar genes diana sensibles a Wnt. Mientras que ambos subgrupos G5 y G6 estuvieron asociados con LOH del cromosoma 8p, no se identificó ninguna otra deleción cromosómica especifica de G6. Sin embargo, se halló una subexpresión de CDH1 (que codifica para E-cadherina) en el subgrupo G6 (en experimentos de Affymetrix y de QRT-PCR, Figura 4a) que puede explicar la invasión local de estos HCC como se muestra por la casi-constante presencia de nódulos satélite encontraos alrededor del tumor principal (Figura 4c y Tablas 1 y 2). Se demostró que el nivel de subregulación del ARNm de CDH1 está altamente relacionado con la expresión subregulada de la proteína E-cadherina en G6, consistente con el elevado nivel de metilación de promotor de CDH1 en estos tumores (datos no mostrados).
2.3 Conclusión
Utilizando una aproximación en todo el genoma no supervisada, los inventores obtuvieron una clasificación robusta de HCC en 6 subgrupos principales que reflejan la gran diversidad natural de estos tumores (Bosch, F. X. et al. Gastroenterology 127, S5-S16 (2004), El-Serag, H.B. Gastroenterology 127, S27-34 (“004)). Además esta clasificación pudo ser reproducida utilizando solamente 16 genes analizados mediante QRT-PCR y, de forma más importante, fue confirmada en un set de tumores independiente.
Esta clasificación va en acorde con los análisis de HCC previamente publicados (Lee, J.S. et al. Hepatology 40, 66776 (2004); Breuhahn, K. et al. Cancer Res 64, 6058-64 (2004); Chen, X. et al. Mol Biol Cell 13, 1929-39 (2002)) que han descrito dos grupos principales de tumores relacionados con estabilidad cromosómica (Correspondiendo con los metagrupos G1-G3 y G4-G6). Sin embargo, el presente análisis ha extendido y refinado esta clasificación.
En síntesis, los inventores creen que la elucidación de la clasificación multifaceta de HCC solo ha sido posible en esta solicitud, en comparación con las clasificaciones previamente publicadas en dos grupos, debido a que (1) la serie de tumores estudiados tratados quirúrgicamente en Francia incluyó los diferentes factores de riesgo principales de HCC, es decir, infección por HBV y HCV, abuso de alcohol y hemocromatosis y (2) el gran número de anotaciones clínicas, histopatológicas y genéticas disponibles para la población muestral estudiada. De hecho, el principal determinante clínico de pertenencia a clase es la infección HVB mientras que otros determinantes principales son alteraciones genéticos y epigenéticos incluyendo inestabilidad cromosómica, mutaciones de TP53 y CTNNB1, metilación de CDKN2A y CDH1 y la impronta parental (ver Figura 1).
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Centrándose en la historia natural de HCC; resulta que los tumores relacionados con HBV que definen los subgrupos G1 y G2 son claramente molecularmente distintos de otras etiologías. Los tumores relacionados con infección HCV y abuso de alcohol están dispersados en los subgrupos G3 a G6. La presente clasificación transcriptómica ha permitido la identificación de nuevas entidades de tumores. El subgrupo G1 incluye tumores relacionados con HBV de pacientes más jóvenes (con respecto a los otros HCCs HBV), frecuentemente de África, con una proporción de sexos igual, un bajo número de copias de ADN viral, mutaciones AXIN1 frecuentes, ausencia de mutación de TP53 y una sobreexpresión de genes normalmente con impronta parental. Estos resultados sugieren que la infección HBV a una edad temprana lleva a un tipo específico de HCC que demuestra características inmaduras con una impronta genética parental anormal, posiblemente debido a la persistencia de hepatocitos fetales
o la desdiferenciación de hepatocitos adultos. Dicha diversidad en los tumores puede estar relacionada con las poblaciones de alto riesgo halladas mediante estudios epidemiológicos (Brechot, C. Gastroenterology 127, S56-61 (2004); Yu, M.C. & Yuan, J.M. Gastroenterology 127, S72-8 (2004)).
El subgrupo G6, con un 100% de incidencia de la mutación CTNNB1, un elevado nivel de activación de la vía Wnt patológica (superior que en G5) e inactivación de E-cadherina (Kozyraki, R. et al. Gastroenterology 110, 1137-49 (1996)) es consistente con el gran potencial invasivo de estos tumores ya que es conocido que la inactivación de Ecadherina participa en el proceso de invasión celular (Behrens, J. et al. J Cell Biol 108, 2435-47 (1989)).
A parte de estos amplios subgrupos de tumores, el presente análisis transcriptómico también ha sugerido subgrupos homogéneos de tumores relacionados con alteraciones genéticas raras como mutaciones de TCF1 o PIK3CA (Bluteau, O. et al. Nat Genet 32, 312-5 (2002); Lee, J.W. et al. Oncogene 24, 1477-80 (2005)). Todavía han quedado por identificar nuevas alteraciones genéticas estructurales de otros pequeños subgrupos homogéneos de tumores y en cambio esto puede ser una potente herramienta para descubrir nuevas dianas terapéuticas.
Ejemplo 3: Pronóstico de tumores de HCC
3.1 Material y métodos
Análisis por RT-PCR cuantitativa
El análisis por RT-PCR cuantitativa se realizó tal como se ha descrito en la sección Material y Métodos del Ejemplo 2.
Construcción del predictor de pronóstico
En base a los valores 2 -∆Ct (∆Ct = CtPROBADA – CtR18S) para 135 genes de la serie de 42 muestras analizadas con Affymetrix GeneChips, se identificaron los mejores 16 genes (rango logP máximo ≤ 10-2) asociados con el estado de pronóstico (Supervivencia Global en 60 meses) utilizando un modelo Cox univariable (paquete survival V2.15). Utilizando las mismas 42 muestras, se seleccionaron las mejores combinaciones de 5 genes o menos de entre estos 16 genes (rango logP máximo < 10-5) utilizando un modelo Cox multivariable de entre todas las combinaciones posibles. Una segunda serie de 53 HCC independientes se utilizó entonces para validar estos modelos (rango logP máximo < 10-3), conservando 42 de ellas. La robustez de cada modelo se evaluó a continuación con la siguiente aproximación de remuestreo: se obtuvieron 1.000 muestreos dividiendo 1.000 veces, aleatoriamente, la serie entera de 95 tumores en 2 grupos de 47 y 48 muestras cada uno (equilibrando el número de muertes entre ambos grupos); a continuación, utilizando cada una de las 42 listas de genes, para ambos grupos de cada muestreo, se construyeron modelos Cox multivariables y se almacenaron el valor de rango log P-calculado a partir de ambos modelos. Se conservó la combinación de genes que condujo al rango logP mediano más bajo en ambos grupos (de entre estos 1.000 remuestreos) y se derivó entonces un predictor a partir de esta combinación.
3.2 Resultados
Identificación y validación de genes que predicen pronóstico
Aunque útil para el diagnóstico, la firma de clasificación de 16 genes (ver Ejemplo 2) no fue suficiente para predecir el pronóstico de HCC ya que las pruebas de rango log resultaron en p valores altos (P = 0,2 y 0,1) probando ya sea los dos grupos de tumores principales (G1 a G3 vs G4 a G6) o los 6 subgrupos individuales, respectivamente. Como resultado, se construyó un predictor de pronóstico específico tal y como se ha descrito en la sección de Material y Métodos.
Globalmente, los genes que se encontraron útiles para el pronóstico de la supervivencia global y/o la supervivencia sin recaída fueron los que están incluidos en la lista mostrada en la Tabla 7 descrita anteriormente.
De forma más precisa, se determinó que los mejores 16 genes asociados con el estado de pronóstico de supervivencia global fueron: NRCAM, PIR, RAMP3, SLC21A2, TAF9, TNA, HN1, PSMD1, MRPS7, CDC20, ENO1, HLF, STRA13, RAGD, NRAS, ARFGEF2.
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Después de probar todas las combinaciones posibles de 5 genes o menos de entre estos 16 genes como se ha descrito en Material y Métodos, los mejores 5 modelos predijeron la supervivencia global utilizando un análisis Cox multivariable con un P < 10-8. Finalmente, la combinación más útil para predecir la mala superación es la asociación de 5 genes: un bajo nivel de RAMP3 combinado con un alto nivel de TAF9, NRCAM, PSMD1 y ARFGEF2.
5 El mejor predictor de supervivencia global sigue las siguientes fórmulas:
−ΔCt (muestra , gen )
it
Puntuación supervivencia global (muestra i ) = ∑ β (gen t ) • (2 −µ(gen t ))
t =1.. n
10 en la que los diferentes parámetros β(gent) y µ(gent) son los que están incluidos en la lista de la siguiente Tabla 11.
Tabla 11. Parámetros que deben utilizarse en la fórmula anterior para el mejor de los 5 mejores predictores de supervivencia global.
Supervivencia global
µ β
gen 1 (TAF9)
7,28 0,129
gen 2 (NRCAM)
1,59 0,252
gen 3 (RAMP3)
0,14 -6,133
gen 4 (PSMD1)
4,66 0,024
gen 5 (ARFGEF2)
3,66 -0,025
15 Los resultados para el mejor predictor de supervivencia global en términos de curva ROC, curva de puntuación y curvas de supervivencia se muestran en la Figura 5a, mientras que las estadísticas relacionadas con dicho mejor predictor de supervivencia global están incluidas en la lista de la siguiente Tabla 12.
20 Tabla 12. Estadísticas relacionadas con el predictor de supervivencia global (para los sets de entrenamiento y de validación)
Supervivencia global
Set de entrenamiento
Set de validación
Área bajo la curva
0,88 0,67
Especificidad
72,8% 70%
Sensibilidad
88,8% 73,6%
P de prueba exacta de Fisher
4 10 -5 9 10 -5
Tasa de éxito
80,9% 79,2%
En el set de validación de 53 HCC, esta combinación de genes predijo la recaída temprana en 79% de los casos
25 (70% para (+), 89% para (-)); y las muertes tempranas fueron correctamente predichas en 81% de los casos (73% para (+); 92% para (-)). Entre las características clínicas y morfológicas, el grado de Edmondson y la invasión vascular estuvieron asociados de forma significativa con un pronóstico pobre (rango log P < 0,04 y 0,0002 respectivamente). Se realizó un modelo Cox multivariable incluyendo estas dos variables además del mejor predictor de supervivencia global (ver siguiente Tabla 13). Este modelo muestra que nuestra combinación de genes es una
30 variable de pronóstico independiente.
Tabla 13. Proporción de riesgo (HR), P-valor rango log (P) e Intervalo de confianza (CI) 95% del modelo Cox multivariable obtenido (para supervivencia global) utilizando las siguientes variables predictivas: (i) atribución binaria (umbral de puntuación superior e inferior) para el mejor predictor de supervivencia global, (ii) invasión vascular y (iii)
35 grado de Edmondson (se unieron los grados I y II , ya que solo estaban disponibles 7 casos para el grado I).
HR
P 95% CI
Gen predictor
7,8 0,00001 3,1-19,7
Invasión vascular
2,6 0,02 1,2-5,8
Grado de Edmondson III
0,5 0,09 0,2-1,1
Grado de Edmondson IV
2,8 0,14 0,7-10,6
La misma estrategia se aplicó para encontrar combinaciones de genes que predicen la supervivencia libre de enfermedad. De forma interesante, entre los mejores 16 genes (TAF9, NRCAM, ENO1, RAB1A, ARFGEF2, G0S2,
40 PSMD1, MRPS7, RAGD, HN1, PIR, SMAD3, DNAJA3, HELO1, RAMP3, RHOQ), diez fueron identificados anteriormente como mejores predictores de supervivencia global utilizando un modelo Cox univariable. Finalmente, los 3 genes incluidos en el mejor predictor de supervivencia libre de enfermedad se incluyeron también en el mejor predictor de supervivencia global.
45 El mejor predictor de supervivencia sin recaída (o libre de enfermedad) sigue las fórmulas siguientes:
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−ΔCt (muestra ,gen )
it
Puntuación libre de enfermedad (muestra i ) = ∑ β (gen t ) • (2 −µ(gen t ))
t=1.. n
en la que los diferentes parámetros β(gent) y µ(gent) son los que están incluidos en la lista de la siguiente Tabla 14.
Tabla 14. Parámetros que deben ser usados en la fórmula anterior para el mejor de los mejores 5 predictores de supervivencia libre de enfermedad.
Supervivencia libre de enfermedad
µ β
gen 1 (TAF9)
7,28 0,127
gen 2 (NRCAM)
1,59 0,196
gen 3 (RAMP3)
0,14 -3,886
10 Los resultados para el mejor predictor de supervivencia global en términos de curva ROC, curva de puntuación y curvas de supervivencia se muestran en la Figura 5b, mientras que las estadísticas relacionadas con este mejor predictor de supervivencia global están incluidas en la lista de la Tabla 15 a continuación.
Tabla 15. Estadísticas relacionadas con el predictor de supervivencia libre de enfermedad. 15
Supervivencia libre de enfermedad
Set de entrenamiento
Set de validación
Área debajo de la curva
0,86 0,84
Especificidad
83,4% 84,7%
Sensibilidad
74% 78,5%
P de prueba exacta de Fisher
4 10 -3 6 10 -6
Tasa de éxito
73,8% 81,1%
Rango Log P
3 10 -4 7 10 -6
3.3 Conclusión
La elucidación de la clasificación transcriptómica es de particular interés para aplicaciones clínicas. En particular,
20 parece ser que los HCC pertenecientes a los grupos G1 a G3 estuvieron ligeramente relacionados con una recaída temprana y una muerte temprana en comparación con los HCC de G4 a G6, mostrando que la clasificación y el pronóstico están de alguna manera relacionados.
Sin embargo, los inventores hallaron que utilizar un pequeño subset específico de aproximadamente 5 genes era
25 mejor que utilizar la firma de 16 genes de clasificación global en predecir el pronóstico de pacientes tratados mediante extirpación quirúrgica completa. En contraste con los análisis transcriptómicos publicados previos, el funcionamiento del predictor de supervivencia determinado se verificó en un segundo set de tumores independientes incluyendo todos los factores de riesgo etiológicos y dichas validaciones se realizaron utilizando QRT-PCR en lugar de los datos de hibridación (Lee, J.S. et al. Hepatology 40, 66776 (“004); Ye, Q.H. et al. Nat Med 9, 416-23 (2003);
30 Iizuka, N. et al. Lancet 361, 923-9 (2003); Kurokawa, Y. et al. J Hepatol 41, 284-91 (2004)).
Los genes identificados en las presentes aplicaciones como útiles para predecir la supervivencia nunca antes habían sido encontrados asociados con el pronóstico del paciente y pueden estar implicados en procesos celulares generales como degradación en proteosoma de proteínas (PSMD1, ver Yokota, K. et al. Mol Biol Cell 7, 853-70
35 (1996)), la iniciación de la transcripción de ARN (TAF9, ver Michel, B., Komarnitsky, P. & Buratowski, S. Mol Cell 2, 663-73 (1998)) y proliferación celular (NRCAM, ver Sehgal, A., et al. Anticancer Res 19, 4947-53 (1999); y ARFGEF2, ver Sheen, V.L. et al. Nat Genet 36, 69-76 (2004)).
De forma interesante, las mejores combinaciones de genes que predicen la supervivencia global así como la
40 supervivencia libre de enfermedad (es decir, la supervivencia sin recaída) fueron muy similares en este estudio, demostrando que los predictores determinados reflejan de forma precisa la progresión del tumor independientemente de una enfermedad hepática no relacionada con un tumor.
Sería también muy interesante evaluar estos predictores en pacientes tratados con transplante de hígado o 45 radiofrecuencia con el fin de estimar la potencial utilidad de estos marcadores en la elección terapéutica.
En conclusión, el presente análisis transcriptómico global se ha llevado a cabo y se ha validado utilizando una amplia serie de tumores altamente anotados. Este análisis ha establecido una clasificación robusta que refleja la diversidad natural de los HCCs humanos, las alteraciones genéticas estructurales y desregulaciones epigenéticas
50 acumuladas durante la progresión del tumor. La amplia diversidad de tumores de HCC tiene implicaciones clínicas y la presente clasificación a resultado en herramientas de pronóstico no sólo para pacientes tratados quirúrgicamente sino también para identificar además pacientes que van a beneficiarse de terapias dirigidas.
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Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento de clasificación in vitro de un tumor de HCC en 6 subgrupos a partir de una muestra de hígado HCC de un sujeto que sufre HCC, que comprende:
    5 a) determinar un perfil de expresión que comprende o que consiste en:
    (i) la siguiente combinación de 16 genes: RAB1A, REG3A, NRAS, RAMP3, MERTK, PIR, EPHA1, LAMA3,
    G0S2, HN1, PAK2, AFP, CYP2C9, CDH2, HAMP, y SAE1, o 10
    (ii) la siguiente combinación de 24 genes: ALDH1L1, CD24, CD74, CFHR3, CYP4F12, DNAJA3, DSCR1, EPHA1, EPHB4, FAAH, FGFR2, FLJ10159, GLT8D1, HAL, MATN2, MRPS7, PAK2, PLXNB1, RAB1A, RHOQ, SLC27A5, SLPI, SMARCE1, STRA13;
    15 b) calcular a partir de dicho perfil de expresión 6 distancias de subgrupo; y
    c) clasificar dicho tumor HCC en el subgrupo para el cual la distancia de subgrupo es la más baja,
    en el que los 6 subgrupos G1, G2, G3, G4, G5 y G6 están definidos por la presencia (+) o ausencia (-) de 20 características clínicas y genéticas descritas en la siguiente Tabla 2:
    G1
    G2 G3 G4 G5 G6
    Inestabilidad cromosómica
    + + + - - -
    Recaída temprana y muerte
    + + + - - -
    Mutación TP53
    - + + - - -
    Infección HBV
    + + - - - -
    Bajo número de copias
    + - - - - -
    Alto número de copias
    - + - - - -
    Mutación CTNNB1
    - - - - + +
    Nódulos satélite
    - - - - - +
  2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el perfil de expresión se determina a nivel de ácido nucleico.
    25 3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 o 2, en el que el perfil de expresión consiste en la siguiente combinación de 16 genes: RAB1A, REG3A, NRAS, RAMP3, MERTK, PIR, EPHA1, LAMA3, G0S2, HN1, PAK2, AFP, CYP2C9, CDH2, HAMP, y SAE1.
  3. 4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el perfil de expresión se determina a nivel 30 de ácido nucleico utilizando PCR cuantitativa.
  4. 5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el perfil de expresión consiste en la siguiente combinación de 16 genes: RAB1A, REG3A, NRAS, RAMP3, MERTK, PIR, EPHA1, LAMA3, G0S2, HN1, PAK2, AFP, CYP2C9, CDH2, HAMP, y SAE1, y el en que cada distancia de una muestrai a una clasek se calcula utilizando la siguiente
    35 formula:
    (ΔCt (muestra , gen ) −µ(clase , gen )) 2
    it kt
    Distancia (muestra i , clase k ) = ∑ σ (gen )
    t=1..16 t
    en la que para cada gent y clasek, los valores de µ(clasek, gent) y σ(gent) están en un intervalo de 10% alrededor de los valores que se muestran en la siguiente Tabla 5.
    40
    µ
    clase 1 clase 2 clase 3 clase 4 clase 5 clase 6 σ
    gen 1 (RAB1A)
    -16,39 -16,04 -16,29 -17,15 -17,33 -16,95 0,23
    gen 2 (PAP)
    -28,75 -27,02 -23,48 -27,87 -19,23 -11,33 16,63
    gen 3 (NRAS)
    -16,92 -17,41 -16,25 -17,31 -16,96 -17,26 0,27
    gen 4 (RAMP3)
    -23,54 -23,12 -25,34 -22,36 -23,09 -23,06 1,23
    gen 5 (MERTK)
    -18,72 -18,43 -21,24 -18,29 -17,03 -16,16 7,23
    gen 6 (PIR)
    -18,44 -19,81 -16,73 -18,28 -17,09 -17,25 0,48
    gen 7
    -16,68 -16,51 -19,89 -17,04 -18,70 -21,98 1,57
    µ
    clase 1 clase 2 clase 3 clase 4 clase 5 clase 6 σ
    (EPHA1)
    gen 8 (LAMA3)
    -20,58 -20,44 -20,19 -21,99 -18,77 -16,85 2,55
    gen 9 (G0S2)
    -14,82 -17,45 -18,18 -14,78 -17,99 -16,06 3,88
    gen 10 (HN1)
    -16,92 -17,16 -15,91 -17,88 -17,72 -17,93 0,54
    gen 11 (PAK2)
    -17,86 -16,56 -16,99 -18,14 -17,92 -17,97 0,58
    gen 12 (AFP)
    -16,68 -12,36 -26,80 -27,28 -25,97 -23,47 14,80
    gen 13 (CYP2C9)
    -18,27 -16,99 -16,26 -16,23 -13,27 -14,44 5,47
    gen 14 (CDH2)
    -15,20 -14,76 -18,91 -15,60 -15,48 -17,32 10,59
    gen 15 (HAMP)
    -19,53 -20,19 -21,32 -18,51 -25,06 -26,10 13,08
    gen 16 (SAE1)
    -17,37 -17,10 -16,79 -18,22 -17,72 -18,16 0,31
  5. 6. Procedimiento según las reivindicaciones 1 o 2, en el que el perfil de expresión consiste en la siguiente combinación de 24 genes: ALDH1L1, CD24, CD74, CFHR3, CYP4F12, DNAJA3, DSCR1, EPHA1, EPHB4, FAAH, FGFR2, FLJ10159, GLT8D1, HAL, MATN2, MRPS7, PAK2, PLXNB1, RAB1A, RHOQ, SLC27A5, SLPI, SMARCE1,
    5 STRA13.
  6. 7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el perfil de expresión se determina a nivel de ácido nucleico utilizando una micromatriz de ácidos nucleicos.
    10 8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el perfil de expresión consiste en la siguiente combinación de 24 genes: ALDH1L1, CD24, CD74, CFHR3, CYP4F12, DNAJA3, DSCR1, EPHA1, EPHB4, FAAH, FGFR2, FLJ10159, GLT8D1, HAL, MATN2, MRPS7, PAK2, PLXNB1, RAB1A, RHOQ, SLC27A5, SLPI, SMARCE1, STRA13, y en el que cada distancia de una muestrai a una clasek se calcula utilizando la siguiente formula:
    ∑
    ⎛   
    (c(gen ,clase )) 2
    tk
    ⎞   
    ( y(muestra , gen ) −µ(gen ))
    it t
    ∑
    t
    =1.. 24
    +
    1,791759
    −
    (
    Distancia
    (muestra ,clase )
    ik
    =
    c(gen ,)
    k
    clase
    ×
    t
    σ
    (gen )
    t
    2
    t =1..24
    ⎠
    ⎝
    (V)
    en la que para cada gent y clasek, los valores c(gent, clasek), µ(gent) y σ(gent) están en un intervalo de 10% alrededor de los valores que se muestran en la siguiente Tabla 6:
    imagen1
  7. 9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la muestra de hígado HCC es una biopsia
    de hígado HCC o una extirpación quirúrgica de tumor de HCC. 5
  8. 10. Kit para la clasificación in vitro de un tumor de HCC en 6 subgrupos G1, G2, G3, G4, G5 y G6 a partir de una muestra de hígado HCC de un sujeto que sufre HCC, que consiste en reactivos para la determinación de un perfil de expresión que consiste en:
    10 (i) la siguiente combinación de 16 genes: RAB1A, REG3A, NRAS, RAMP3, MERTK, PIR, EPHA1, LAMA3, G0S2, HN1, PAK2, AFP, CYP2C9, CDH2, HAMP, y SAE1, o
    (ii) la siguiente combinación de 24 genes: ALDH1L1, CD24, CD74, CFHR3, CYP4F12, DNAJA3, DSCR1, EPHA1, EPHB4, FAAH, FGFR2, FLJ10159, GLT8D1, HAL, MATN2, MRPS7, PAK2, PLXNB1, RAB1A, RHOQ, SLC27A5, SLPI, SMARCE1, STRA13,
    en el que los 6 subgrupos G1, G2, G3, G4, G5 y G6 están definidos por la presencia (+) o ausencia (-) de características clínicas y genéticas descritas en la siguiente Tabla 2:
    G1
    G2 G3 G4 G5 G6
    Inestabilidad cromosómica
    + + + - - -
    Recaída temprana y muerte
    + + + - - -
    Mutación TP53
    - + + - - -
    Infección HBV
    + + - - - -
    Bajo número de copias
    + - - - - -
    Alto número de copias
    - + - - - -
    Mutación CTNNB1
    - - - - + +
    Nódulos satélite
    - - - - - +
    10 11. Kit según la reivindicación 10, en el que dichos reactivos se seleccionan de entre cebadores de amplificación, sondas nucleicas y micromatrices de ácidos nucleicos.
  9. 12. Kit según la reivindicación 10, que consiste en reactivos para la determinación de un perfil de expresión que consiste en la siguiente combinación de 16 genes: RAB1A, REG3A, NRAS, RAMP3, MERTK, PIR, EPHA1, LAMA3,
    15 G0S2, HN1, PAK2, AFP, CYP2C9, CDH2, HAMP, y SAE1, en el que dichos reactivos comprenden cebadores de amplificación, y opcionalmente sondas nucleicas útiles para un análisis por PCR cuantitativa de dicha expresión de genes.
  10. 13. Kit según la reivindicación 10, que consiste en reactivos para la determinación de un perfil de expresión que
    20 consiste en la siguiente combinación de 24 genes: ALDH1L1, CD24, CD74, CFHR3, CYP4F12, DNAJA3, DSCR1, EPHA1, EPHB4, FAAH, FGFR2, FLJ10159, GLT8D1, HAL, MATN2, MRPS7, PAK2, PLXNB1, RAB1A, RHOQ, SLC27A5, SLPI, SMARCE1, STRA13, en el que dichos reactivos comprenden una micromatriz de ácidos nucleicos.
  11. 14. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, que comprende además instrucciones para realizar el 25 procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
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