CN108333366B - 一种实验性监测肝细胞恶性转化过程大鼠模型的建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高迁移率蛋白HMGB3在监测肝细胞恶性转化过程的应用，包括以下步骤：动物分组，模型制备，制作大鼠肝脏组织的石蜡切片，大鼠肝脏的H&E染色，Trizol法检测并计算大鼠肝癌形成动态过程中HMGB家族的mRNA表达水平，和免疫组化技术检测大鼠肝癌形成过程中HMGB3的蛋白表达水平。本发明构建了大鼠肝癌模型，以2‑乙酰氨基芴诱发肝细胞恶性转化，通过RT‑qPCR发现，分析肝癌形成的不同阶段HMGB家族成员mRNA水平，发现HMGB3表达在肝恶性转化过程中呈动态增长；并且免疫组化验证HMGB3蛋白水平在肝癌形成的过程中表达显著增高；由此可见HMGB3可以用于肝细胞恶性转化过程的动态监检。

Description

一种实验性监测肝细胞恶性转化过程大鼠模型的建立方法
技术领域
本发明涉及医学研究开发利用技术领域，具体涉及一种实验性监测肝细胞恶性转化过程大鼠模型的建立方法。
背景技术
肝细胞性肝癌(HCC)是全世界最普遍的恶性肿瘤之一，HCC的发生发展是多病因、多基因、多步骤及多因子协同的复杂过程，涉及到癌基因激活，抑癌基因失活及胚胎期某些癌基因重新复活等多信号通路和基因调控。目前肝癌的血清学诊断标志物主要为AFP，但其效果并不理想，直接影响其临床治疗。所以，寻找特异有效的早期标志物，对于HCC的诊治具有十分重要的意义。
高迁移率蛋白家族(HMGB)具有四个成员，分别为HMGB1, HMGB2, HMGB3，和HMGB4。他们具有相似的生理和病理特点。HMGB基因可编码一个或多个DNA绑定结合域。HMGB家族参与多种胞内生理过程，包括细胞分化，迁移，并与多种炎症反应相关。 HMGB3是一种多功能蛋白，主要定位于细胞核，染色体和细胞质中。HMGB3参与多种生理病理过程，其可以促进造血干细胞的自我更新和分化，能强化DNA 弹性以促进某些启动子的激活。近年，在胃癌，肺癌，食管癌，乳腺癌，结直肠癌和膀胱癌中发现HMGB3可促进肿瘤细胞增殖转移。但是目前，HMGB3与HCC的关系尚未明确。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种实验性监测肝细胞恶性转化过程大鼠模型的建立方法，动态检测大鼠模型中肝细胞恶性转化的过程。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种实验性监测肝细胞恶性转化过程大鼠模型的建立方法，包括以下步骤：
（1）动物分组：选取40只的斯普拉格-杜勒鼠，饲养于12h昼夜循环，且湿度为55%的洁净空间内；随机选取10只大鼠作为健康对照组，其余分配为5组化学诱癌组。
（2）模型制备：健康对照组的大鼠进行普通喂食；化学诱癌组的大鼠予以添加有0.05% 的2-乙酰氨基芴的普通饲料进行喂养；每两周取一只正常鼠和一组诱癌鼠，在诱癌过程中根据病理组织学检测，分为健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组；摘取健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠的鼠肝组织，均分为6份备用。
（3）制作大鼠肝脏组织的石蜡切片：将步骤（2）中的健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织，先用生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净；再将肝脏组织切成块状，并用固定液进行固定；对块状大鼠肝脏组织块进行脱水、透明、透蜡及包埋；使用切片机将包埋后的大鼠肝脏组织进行切片，用蒸馏水将切片贴于干净无油的玻片上，在酒精灯上进行烘烤，使得玻片展平；将贴好切片的玻片置于60℃恒温箱内2 h，使得蛋白质凝固，制作成健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织的石蜡切片。
（4）大鼠肝脏的H&E染色：取步骤（3）中健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织的石蜡切片各一份放入苏木色精中染色约10-30 min；用自来水流水冲洗15 min，冲洗过程中，切片颜色发蓝；将切片放入1%盐酸酒精液中褪色，见切片变红，颜色较浅时即可，用0.5%伊红酒精液对比染色2-5 min。
（5）Trizol法检测并计算大鼠肝癌形成动态过程中HMGB家族的mRNA表达水平：用匀浆器将步骤（2）中健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织磨碎，再加入Trizol法提取健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织总RNA，再使用反转录试剂盒合成cDNA，使用SYBR染色试剂盒进行定量PCR，在定量PCR中，GAPDH作为内参，mRNA计算公式为 2−ΔΔCt (ΔΔCt=ΔCt[目的基因] − ΔCt[GAPDH])，该计算公式中的目的基因所用引物序列为如下：HMGB1： F, 5’-CACTGGGCGACTCTGTGC-3’, and R, 5’-AGTTGATTTTCCTCCGCGAG-3’； HMGB2：F, 5’-AAGATCCAAATGCTCCCAAGA-3’, and R, 5’-CGACTTTTCCTTGGCAGA CA-3’；HMGB3：F, 5’-AGAAGAAGGACCCGAA TGCC-3’, and R, 5’-GTCTTCCACCTCTCAGAGCA-3’；HMGB4：F, 5’-CTCCTTCCTGCTC TTCTCCC-3’, and R, 5’-GCTTCAAACTTTGCCTTTTCATT-3’；GAPDH：F, 5’-CTCCTCCGGGTGAT GCTTTTCCTAG-3’, and R,5’-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGA TG-3’。
（6）免疫组化技术检测大鼠肝癌形成过程中HMGB3的蛋白表达水平：免疫组化技术采用非生物素检测，取步骤（3）中健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织的石蜡切片各一份，60℃烤箱烘烤12 h；将健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织石蜡切片置于二甲苯中浸泡脱蜡，逐级梯度酒精水化；使用3%的H2O2甲醇液温育30 min阻断内源性过氧化物酶；使用柠檬酸修复液修复抗原10 min；室温冷却1h，PBS洗3次；使用1%牛血清稀释一抗，均匀滴在石蜡切片，4℃孵育过夜；PBS洗3遍后，加入DAKO二抗，室温放置1h；PBS洗三遍后，DAB染色，苏木精复染；酒精梯度浓度脱水；二甲苯透明，中性树胶封片；显微镜下观察拍照，观察大鼠肝癌形成过程中HMGB3蛋白的动态表达。
上述的，一种实验性监测肝细胞恶性转化过程大鼠模型的建立方法，所述步骤（6）之后还包括步骤（7）：HMGB3浓度定量分析，根据酶联免疫吸附法检测HMGB3的表达，具体包括以下步骤：将蛋白标准品加入已包被HMGB3抗体的96孔板各孔中，放入37℃培养箱孵育2h；然后去掉各孔中悬液，加入100μl HMGB3-生物素连接抗体，37℃孵育1 h；去除悬液，使用TBST清洗3次；再加入100μl亲和素标记的辣根过氧化物酶，放置于37℃，温育30 min；最后加入90μl底物溶液和50μl终止液；使用酶标仪于450 nm读取各孔吸光值。
优选的，一种实验性监测肝细胞恶性转化过程大鼠模型的建立方法，所述步骤（7）之后还包括步骤（8）：免疫组化半定量评分：按免疫染色强度评分，可以分为四个级别：0-阴性、1-弱阳性、2-中等阳性、3-强阳性；按阳性细胞比例评分，也可分为四个级别：阳性细胞比例<5%为0、阳性细胞比例介于 5%–40%为1、阳性细胞比例介于40%–75%为2、阳性细胞比例>75%为3；免疫组化最终得分为染色强度和阳性细胞比例得分相加之和，总分为0-2分时，免疫组化评分结果为阴性，总分为3-6分时，免疫组化评分结果为阳性。
优选的，所述步骤（1）中选用清洁级、4-6周龄、体重为100-120g的雄性斯普拉格-杜勒大鼠。
其中，所述步骤（3）中脱水、透明、透蜡及包埋的具体步骤为，
脱水：使用75%乙醇将大鼠组织块浸泡50 min，再用85%乙醇浸泡50 min，再用95%乙醇浸泡二级，每级30 min；最后，使用100%乙醇浸泡两级，每级30 min。
透明：将脱水后的大鼠肝脏组织块先在纯酒精和二甲苯各半的混合液中浸泡15-30 min，再转入纯二甲苯中透明，15-30 min。
透蜡：将透明处理后的大鼠肝脏组织块自二甲苯中取出后，先移入二甲苯和石蜡等量的混合液中30 min，再将60℃恒温箱打开，使石蜡充分溶解；将大鼠肝脏组织块转入石蜡里，放置于60℃恒温120 min。
包埋：将60℃的石蜡倒入纸盒内，然后用小镊子将透蜡后的大鼠肝脏组织块按顺序排列好，使切面朝下；不同组别的同一组织包埋于一个蜡块中，以保证切片和染色条件相同；为防止倒入纸盒内的石蜡底部立刻凝固，可将纸盒置于一玻璃板上，然后将玻璃板置于80-90℃左右热水上，包埋时蜡盒底部要放平，做蜡块的蜡要反复冻融较好；最后，待纸盒内蜡凝固后，用刀片将其修成梯形，大鼠肝脏组织块与蜡块边缘之间的距离不得小于2mm。
采用上述结构后，本发明有益效果为：本发明一种实验性监测肝细胞恶性转化过程大鼠模型的建立方法，构建了大鼠肝癌模型，以2-乙酰氨基芴诱发肝细胞恶化转化，通过RT-qPCR发现，分析肝癌形成的不同阶段HMGB家族成员mRNA水平，发现HMGB3表达在肝恶性转化过程中呈动态增长；并且免疫组化验证HMGB3蛋白水平在肝癌形成的过程中表达显著增高；由此可见HMGB3在可以用于动态检测肝癌细胞恶化转化过程的发展过程。
附图说明
图1A为本发明中健康对照组大鼠的鼠肝组织示意图；
图1B为本发明中肝脏变性组大鼠的鼠肝组织示意图；
图1C为本发明中癌前病变组大鼠的鼠肝组织示意图；
图1D为本发明中肝癌组大鼠的鼠肝组织示意图；
图1A1为本发明中健康对照组大鼠的肝组织H&E染色（×200）时的镜下观察图；
图1B1为本发明中肝脏变性组大鼠的肝组织H&E染色（×200）时的镜下观察图；
图1C1为本发明中癌前病变组大鼠的肝组织H&E染色（×200）时的镜下观察图；
图1D1分别为本发明中肝癌组大鼠的肝组织H&E染色（×200）时的镜下观察图；
图2A分别为本发明中健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠的肝组织内HMGB1的含量对比图；
图2B分别为本发明中健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠的肝组织内HMGB2的含量对比图；
图2C分别为本发明中健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠的肝组织内HMGB3的含量对比图；
图2D分别为本发明中健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠的肝组织内HMGB3的含量对比图；
图3A为本发明中健康对照组大鼠的肝组织的免疫组织化学分析图；
图3B为本发明中肝脏变性组大鼠的肝组织的免疫组织化学分析图；
图3C为本发明中癌前病变组大鼠的肝组织的免疫组织化学分析图；
图3D为本发明中肝癌组大鼠的肝组织的免疫组织化学分析图；
图4为本发明中半定量分析肝癌组织和配对癌旁组织免疫组化染色强度的对比图；
图5A为本发明中总体生存时间的Kaplan-Meier 生存曲线(P=0.001)；
图5B为本发明中无病生存时间的Kaplan-Meier 生存曲线(P<0.001)；
图6A为本发明中HMGB3在正常对照、肝硬化患者，慢性肝炎患者及肝癌患者血清中的含量对比图；
图6B为本发明中高BCLC分级和低BCLC分级肝癌患者血清中HMGB3的含量对比图；
图6C为本发明中肝癌复发患者血清及原发肝癌患者血清HMGB3含量对比图；
图6D为本发明中血清HMGB3及AFP含量诊断肝癌的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种实验性监测肝细胞恶性转化过程大鼠模型的建立方法，包括以下步骤：
（1）动物分组：选取40只的斯普拉格-杜勒鼠，可选的，选用清洁级、4-6周龄、体重为100-120g的雄性斯普拉格-杜勒大鼠，饲养于12h昼夜循环，且湿度为55%的洁净空间内；随机选取10只大鼠作为健康对照组，其余分配为5组化学诱癌组。
（2）模型制备：健康对照组大鼠进行普通喂食；化学诱癌组的大鼠予以添加有0.05% 的2-乙酰氨基芴的普通饲料进行喂养；每两周取一只正常鼠和一组诱癌鼠，在诱癌过程中根据病理组织学检测，分为健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组；摘取健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠的鼠肝组织，均分为6份备用。
（3）制作大鼠肝脏组织的石蜡切片：将步骤（2）中的健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织，先用生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净；再将肝脏组织切成块状，并用固定液进行固定；对块状大鼠肝脏组织块进行脱水、透明、透蜡及包埋；使用切片机将包埋后的大鼠肝脏组织进行切片，用蒸馏水将切片贴于干净无油的玻片上，在酒精灯上进行烘烤，使得玻片展平；将贴好切片的玻片置于60℃恒温箱内2 h，使得蛋白质凝固，制作成健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织的石蜡切片；其中，所述脱水、透明、透蜡及包埋的具体步骤为，脱水：使用75%乙醇将大鼠组织块浸泡50 min，再用85%乙醇浸泡50 min，再用95%乙醇浸泡二级，每级30 min；最后，使用100%乙醇浸泡两级，每级30 min；透明：将脱水后的大鼠肝脏组织块先在纯酒精和二甲苯各半的混合液中浸泡15-30 min，再转入纯二甲苯中透明，15-30 min；透蜡：将透明处理后的大鼠肝脏组织块自二甲苯中取出后，先移入二甲苯和石蜡等量的混合液中30min，再将60℃恒温箱打开，使石蜡充分溶解；将大鼠肝脏组织块转入石蜡里，放置于60℃恒温120 min；包埋：将60℃的石蜡倒入纸盒内，然后用小镊子将透蜡后的大鼠肝脏组织块按一定的顺序排列好，使切面朝下；不同组别的同一组织包埋于一个蜡块中，以保证切片和染色条件相同。为防止倒入纸盒内的石蜡底部立刻凝固，可将纸盒置于一玻璃板上，然后将玻璃板置于80-90℃左右热水上，包埋时蜡盒底部要放平，做蜡块的蜡要反复冻融较好；最后，待纸盒内蜡凝固后，用刀片将其修成梯形，大鼠肝脏组织块与蜡块边缘之间的距离不得小于2 mm。
（4）大鼠肝脏的H&E染色：取步骤（3）中健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织的石蜡切片各一份放入苏木色精中染色约10-30 min；用自来水流水冲洗15 min，冲洗过程中，切片颜色发蓝；将切片放入1%盐酸酒精液中褪色，见切片变红，颜色较浅时即可，用0.5%伊红酒精液对比染色2-5 min；在OLYMPUS IX71光镜下进行观察、摄片，通过Image Pro Plus 6.0图像分析系统，测定每个视野的红色区域的面积与该视野总面积的比值，进行图像分析半定量研究。
（5）Trizol法检测并计算大鼠肝癌形成动态过程中HMGB家族的mRNA表达水平：用匀浆器将步骤（2）中健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织磨碎，再加入Trizol提取健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织总RNA，再使用反转录试剂盒合成cDNA，使用SYBR染色试剂盒进行定量PCR，在定量PCR中，GAPDH作为内参，mRNA计算公式为 2−ΔΔCt (ΔΔCt=ΔCt[目的基因] − ΔCt[GAPDH])，该计算公式中的目的基因所用引物序列为如下：HMGB1： F, 5’-CACTGGGCGACTCTGTGC-3’, and R, 5’-AGTTGATTTTCCTCCGCGAG-3’； HMGB2：F, 5’-AAGATCCAAATGCTCCCAAGA-3’, and R, 5’-CGACTTTTCCTTGGCAGACA-3’；HMGB3：F, 5’-AGAAGAAGGACCCGA ATGCC-3’, and R, 5’-GTCTTCCACCTCTCAGAGCA-3’；HMGB4：F, 5’-CTCCTT CCTGCTCTTCTCCC-3’, and R, 5’-GCTTCAAACTTTGCCTTTTCAT T-3’；GAPDH： F, 5’-CTCCTCCGGGTGATGCTTTTCCTAG-3’, and R,5’-CTCGCTCCTGGAAGATG GTGATG-3’。
（6）免疫组化技术检测大鼠肝癌形成过程中HMGB3的蛋白表达水平：免疫组化技术采用非生物素检测，取步骤（3）中健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织的石蜡切片各一份，60℃烤箱烘烤12 h；将健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织石蜡切片置于二甲苯中浸泡脱蜡，逐级梯度酒精水化；使用3%的H2O2甲醇液温育30 min阻断内源性过氧化物酶；使用柠檬酸修复液修复抗原10 min；室温冷却1 h，PBS洗3次；使用1%牛血清稀释一抗，均匀滴在石蜡切片，4℃孵育过夜；PBS洗3遍后，加入DAKO二抗，室温放置1 h；PBS洗三遍后，DAB染色，苏木精复染；酒精梯度浓度脱水；二甲苯透明，中性树胶封片；显微镜下观察拍照，通过Image Pro Plus 6.0图像分析系统测定每个视野的累积积分光密度值及有效统计区域的面积，计算光密度平均值，取其平均值代表肝组织中HMGB3表达的相对水平，进行图像分析半定量研究，观察大鼠肝癌形成过程中HMGB3蛋白的动态表达。
（7）HMGB3浓度定量分析：根据酶联免疫吸附法检测HMGB3的表达，具体包括以下步骤：将蛋白标准品加入已包被HMGB3抗体的96孔板各孔中，放入37℃培养箱孵育2 h；然后去掉各孔中悬液，加入100μl HMGB3-生物素连接抗体，37℃孵育1 h；去除悬液，使用TBST清洗3次；再加入100μl亲和素标记的辣根过氧化物酶，放置于37℃，温育30 min；最后加入90μl底物溶液和50μl终止液；使用酶标仪于450 nm读取各孔吸光值。
（8）免疫组化半定量评分：按免疫染色强度评分，可以分为四个级别：0-阴性、1-弱阳性、2-中等阳性、3-强阳性；按阳性细胞比例评分，也可分为四个级别：阳性细胞比例<5%为0、阳性细胞比例介于 5%–40%为1、阳性细胞比例介于40%–75%为2、阳性细胞比例>75%为3；免疫组化最终得分为染色强度和阳性细胞比例得分相加之和，总分为0-2分时，免疫组化评分结果为阴性，总分为3-6分时，免疫组化评分结果为阳性。
通过上述各步骤，分析HMGB3在肝细胞诱发恶性转化过程中的作用，分析结果如下：
Ⅰ、鼠肝细胞恶性转化的病理组织学分析：鼠肝组织及对应的肝组织病理学H&E染色检查见图1，病理组织学检查将大鼠的肝组织分为健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组（图１A-D）。健康对照组鼠肝组织呈红褐色，质软而脆；镜下肝细胞呈索状排列，核仁明显，核膜清楚，核内染色质稀疏，染色较浅，如图1A1所示。肝脏变性组肝脏颜色偏黄镜下肝细胞核周围可见许多圆形空泡，可融合为一个大空泡，可见轻度肝纤维化如图1B1所示。癌前病变组肝脏表面出现少量小结节，镜下发现假小叶形成，肝细胞核多形性、核深染、明显的核仁、多核，不典型增生如图1C1所示。肝癌组肝脏表面大量大小不一的结节弥漫性分布，镜下肿瘤细胞排列紊乱成巢状，细胞大小不一，核大深染，细胞核呈圆形或卵圆形如图1D1所示。
Ⅱ、Trizol法检测并计算大鼠肝癌形成动态过程中HMGB家族（HMGB1、HMGB2、HMGB3、HMGB4）的mRNA表达水平，如图2C所示，HMGB家族中只有HMGB3 mRNA表达水平在肝恶性转化过程中呈动态增长；如图2D所示，HMGB4在肝癌动态形成过程中表达下降，如图2A和图2B所示，HMGB1和HMGB2表达则没有明显变化，可见,HMGB3能够应用于动态检测肝癌形成动态过程。
Ⅲ、免疫组化技术检测鼠肝癌形成过程中HMGB3蛋白表达水平，如图3A-D分别为健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组经免疫组化的结果显示，可知，大鼠肝癌模型恶化转化过程中肝组织内HMGB3蛋白表达动态升高，HMGB3在肝癌恶化转化过程中起着重要的指向性作用，具有潜在的靶向价值。
Ⅳ、对比肝癌组中肝癌组织与癌旁组织进行免疫组化技术检测HMGB3，并进行免疫组化半定量评分，半定量评分显示，肝癌组织中HMGB3免疫组化染色得分明显高于癌旁组织，如图4所示。
Ⅴ、通过Kaplan-Meier法分析HMGB3表达对肝癌患者生存时间的影响，高表达HMGB3的HCC患者具有更短的总体生存时间 (OS, χ2=11.348, P=0.001) 如图5A所示，及无病生存期 (DFS, χ2=14.947, P<0.001)如图5B所示。单因素COX回归分析分析显示肿瘤体积(P=0.028), TNM分期(P=0.02) 和HMGB3表达 (P=0.002) 是影响肝癌患者生存时间的潜在因素。进一步多因素分析显示HMGB3表达是独立的肝癌预后预测因素 (HR=3.055, P=0.013)， 同时，HMGB3也是独立的预测肝癌复发的重要因素 (HR=2.905, P<0.001)，由此可见，HMGB3具有潜在肝癌预后预测价值。
Ⅵ、疫酶联吸附法检测HMGB3表达，如图6A所示，HMGB3在肝病患者、肝硬化患者、慢性肝炎患者、和正常对照血清中的含量分别为2.7 ± 1.3 ng/ml，1.6 ± 0.8 ng/ml，1.5± 0.7 ng/ml，和1.2 ± 0.4 ng/ml。以2.0 ng/ml作为临界值，肝癌患者血清诊断阳性率为75.6%，明显高于正常对照（0%），肝硬化患者（20.8%）和慢性肝炎患者（16.0%）。此外，高BCLC分级肝癌患者血清中HMGB3含量明显高于和低BCLC分级肝癌患者,如图6B所示；肝癌复发患者血清中HMGB3含量也高于原发肝癌患者血清HMGB3含量如图6C所示；使用血清HMGB3及AFP诊断肝癌绘制ROC曲线，如图6D所示；HMGB3曲线下面积为0.791(CI: 0.730-0.853, P<0.001)，AFP曲线下面积为0.743 (CI: 0.679-0.808, P<0.001)。HMGB3诊断肝癌敏感度为75.6%，明显高于AFP（56.7%），而当二者联合检测时，可将敏感性提高至89.0%。
本发明一种实验性监测肝细胞恶性转化过程大鼠模型的建立方法，构建了大鼠肝癌模型，以2-乙酰氨基芴诱发肝细胞恶性转化，通过RT-qPCR发现，分析肝癌形成的不同阶段HMGB家族成员mRNA水平，发现HMGB3表达在肝恶性转化过程中呈动态增长；并且免疫组化验证HMGB3蛋白水平在肝癌形成的过程中表达显著增高；由此可见HMGB3可以用于肝细胞恶性转化过程的动态监测。
以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (5)

1.一种实验性监测肝细胞恶性转化过程大鼠模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）动物分组：选取40只的斯普拉格-杜勒鼠，饲养于12h昼夜循环，且湿度为55%的洁净空间内；随机选取10只大鼠作为健康对照组，其余分配为5组化学诱癌组；
（2）模型制备：健康对照组的大鼠进行普通喂食；化学诱癌组的大鼠予以添加有0.05%的2-乙酰氨基芴的普通饲料进行喂养；每两周取一只正常鼠和一组诱癌鼠，在诱癌过程中根据病理组织学检测，分为健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组；摘取健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠的鼠肝组织，均分为6份备用；
（3）制作大鼠肝脏组织的石蜡切片：将步骤（2）中的健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织，先用生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中的污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水，使其管腔冲洗干净；再将肝脏组织切成块状，并用固定液进行固定；对块状大鼠肝脏组织块进行脱水、透明、透蜡及包埋；使用切片机将包埋后的大鼠肝脏组织进行切片，用蒸馏水将切片贴于干净无油的玻片上，在酒精灯上进行烘烤，使得玻片展平；将贴好切片的玻片置于60℃恒温箱内2小时，使得蛋白质凝固，制作成健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织的石蜡切片；
（4）大鼠肝脏的H&E染色：取步骤（3）中健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织的石蜡切片各一份放入苏木色精中染色10-30min；用自来水流水冲洗15min，冲洗过程中，切片颜色发蓝；将切片放入1%盐酸酒精液中褪色，见切片变红，颜色较浅时即可，用0.5%伊红酒精液对比染色2-5min；
（5）Trizol法检测并计算大鼠肝癌形成动态过程中HMGB家族的mRNA表达水平：用匀浆器将步骤（2）中健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织磨碎，再加入Trizol法提取健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织总RNA，再使用反转录试剂盒合成cDNA，使用SYBR染色试剂盒进行定量PCR，在定量PCR中，GAPDH作为内参，mRNA计算公式为 2−ΔΔCt (ΔΔCt=ΔCt[目的基因] − ΔCt[GAPDH])，该计算公式中的目的基因所用引物序列为如下：HMGB1： F, 5’-CAC TGGGCGACTCTGTGC-3’, and R, 5’-AGTTGATTTTCCTCCGCGAG-3’； HMGB2：F, 5’-AAGATCCAAATGCTCCCAAGA-3’, and R, 5’-CGACTTTTCCTTGGCAGA CA-3’；HMGB3：F, 5’-AGAAGAAGGACCCG AATGCC-3’, and R, 5’-GTCTTCCA CCTCTCAGAGCA-3’；HMGB4：F, 5’-CTCCTT CCTGCTCTTCTCCC-3’, and R, 5’-GCTTCAAACTTTGCCTTTTCAT T-3’；GAPDH： F, 5’-CTCCTCCGGGTGAT GCTTTTCCTAG-3’, andR, 5’-CTCGC TCCTGGAAGA TGGTGATG-3’；
（6）免疫组化技术检测大鼠肝癌形成过程中HMGB3的蛋白表达水平：免疫组化技术采用非生物素检测，取步骤（3）中健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织的石蜡切片各一份，60℃烤箱烘烤12h；将健康对照组、肝脏变性组、癌前病变组和肝癌组各组大鼠肝脏组织石蜡切片置于二甲苯中浸泡脱蜡，逐级梯度酒精水化；使用3%的H2O2甲醇液温育30 min阻断内源性过氧化物酶；使用柠檬酸修复液修复抗原10 min；室温冷却1h，PBS洗3次；使用1%牛血清稀释一抗，均匀滴在石蜡切片，4℃孵育过夜；PBS洗3遍后，加入DAKO二抗，室温放置1 h；PBS洗三遍后，DAB染色，苏木精复染；酒精梯度浓度脱水；二甲苯透明，中性树胶封片；显微镜下观察拍照，观察大鼠肝癌形成过程中HMGB3蛋白的动态表达。
2.根据权利要求1所述的一种实验性监测肝细胞恶性转化过程大鼠模型的建立方法，其特征在于，所述步骤（6）之后还包括步骤（7）：HMGB3浓度定量分析，根据酶联免疫吸附法检测HMGB3的表达，具体包括以下步骤：将蛋白标准品加入已包被HMGB3抗体的96孔板各孔中，放入37℃培养箱孵育2h；然后去掉各孔中悬液，加入100μl HMGB3-生物素连接抗体，37℃孵育1h；去除悬液，使用TBST清洗3次；再加入100μl亲和素标记的辣根过氧化物酶，置于37℃中温育30 min；最后加入90μl底物溶液和50μl终止液；使用酶标仪于450 nm读取各孔吸光值。
3.根据权利要求2所述的一种实验性监测肝细胞恶性转化过程大鼠模型的建立方法，其特征在于，所述步骤（7）之后还包括步骤（8）：免疫组化半定量评分：按免疫染色强度评分，可以分为四个级别：0-阴性、1-弱阳性、2-中等阳性、3-强阳性；按阳性细胞比例评分，也可分为四个级别：阳性细胞比例<5%为0、阳性细胞比例介于 5%–40%为1、阳性细胞比例介于40%–75%为2、阳性细胞比例>75%为3；免疫组化最终得分为染色强度和阳性细胞比例得分相加之和，总分为0-2分时，免疫组化评分结果为阴性，总分为3-6分时，免疫组化评分结果为阳性。
4.根据权利要求1所述的一种实验性监测肝细胞恶性转化过程大鼠模型的建立方法，其特征在于，所述步骤（1）中选用清洁级、4-6周龄、体重为100-120g的雄性斯普拉格-杜勒大鼠。
5.根据权利要求1所述的一种实验性监测肝细胞恶性转化过程大鼠模型的建立方法，其特征在于，所述步骤（3）中脱水、透明、透蜡及包埋的具体步骤为：
脱水：使用75%乙醇将大鼠组织块浸泡50 min，再用85%乙醇浸泡50 min，再用95%乙醇浸泡二级，每级30 min；最后，使用100%乙醇浸泡两级，每级30 min；
透明：将脱水后的大鼠肝脏组织块先在纯酒精和二甲苯各半的混合液中浸泡15-30min，再转入纯二甲苯中透明，15-30 min；
透蜡：将透明处理后的大鼠肝脏组织块自二甲苯中取出后，先移入二甲苯和石蜡等量的混合液中30 min，再将60℃恒温箱打开，使石蜡充分溶解；将大鼠肝脏组织块转入石蜡里，放置于60℃恒温120 min；
包埋：将60℃的石蜡倒入纸盒内，然后用小镊子将透蜡后的大鼠肝脏组织块按顺序排列好，使切面朝下；不同组别的同一组织包埋于一个蜡块中，以保证切片和染色条件相同；为防止倒入纸盒内的石蜡底部立刻凝固，可将纸盒置于一玻璃板上，然后将玻璃板置于80-90℃热水上，包埋时蜡盒底部要放平，做蜡块的蜡要反复冻融；最后，待纸盒内蜡凝固后，用刀片将其修成梯形，大鼠肝脏组织块与蜡块边缘之间的距离不得小于2mm。
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