CN101995471A - 高迁移率族蛋白b2用作肝细胞癌标志物的应用 - Google Patents

高迁移率族蛋白b2用作肝细胞癌标志物的应用 Download PDF

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武祎
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Abstract

本发明提供了一种高迁移率族蛋白B2的应用。本发明提供的高迁移率族蛋白B2的应用为高迁移率族蛋白B2作为检测肝细胞癌的蛋白质分子标记的应用。高迁移率族蛋白B2在肝细胞癌的癌细胞和癌旁细胞中存在明显的差异表达，因此，可根据其在肝细胞中的表达量检测患者是否患有肝细胞癌。

Description

高迁移率族蛋白B2用作肝细胞癌标志物的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及高迁移率族蛋白B2的应用，更具体地说，涉及高迁移率族蛋白B2作为肝细胞癌的蛋白质分子标记的应用。
背景技术
肝细胞癌是世界范围内第四位、我国第二位的常见恶性肿瘤，每年大约有250,000名患者死于肝细胞癌。肝细胞癌恶性程度高，容易复发和转移，预后差，而且早期诊断较困难，往往延误了最佳治疗时期。西方发达国家肝癌的发病率较低，国际上对肝癌的基础研究仍较为薄弱，而我国是肝癌高发国家，发病率和死亡率呈现上升趋势，且发病年龄构成年轻化，每年用于肝癌治疗的医疗支出大为增加，肝癌成了严重危害我国人民生命财产安全的头号敌人，并且是影响社会经济发展的一个重要因素，加大力度进行我国肝癌的基础研究具有战略意义，而分离和鉴定新的肝癌相关基因是目前肝癌基础研究中的前沿课题。
到目前为止，已有不下20种的基因异常表达被确定与肝癌的发生发展有关，但已确定的肝癌相关基因在肝癌中的异常表达率并不高，肝癌的发病机制至今仍未阐明，肝癌的早期诊断率仍有待提高。此外，传统的肝癌手术加化疗以及近年来配合使用的多种基因治疗方法仍没有明显提高肝癌患者的生存率，因而寻找新的肝癌相关基因、尤其是肝癌高表达基因对于探讨肝癌的发病机制具有重要意义。
因此，研究和开发在肝细胞癌中高表达的基因和/或蛋白质具有重要意义，寻找新的在肝细胞癌中高表达的基因和/或蛋白质也具有迫切需要性。
高迁移率族蛋白B2(High mobility group protein B2，High mobility group protein 2，HMGB2，HMG2，HMG-2)的NCBI的登录号为NP_002120，Swissprot登录号为P26583，IPI号为：IPI00219097.4(human3.28version)。高迁移率族蛋白B2是与内质网结合的SET复合体的组成成份之一，其具有多种重要作用，如能够直接与SET相互作用，能够优先结合单链DNA以及解开双链DNA(http://www.uniprot.org/uniprot/P26583)等，但至今只有少量研究结果表明高迁移率族蛋白B2在基因水平上与癌症有关或在蛋白质水平上与癌症有关，其中：
表明高迁移率族蛋白B2在基因水平上与癌症有关的文献主要有：Transcriptionalprofiling of medulloblastoma in children.J Neurosurg.2003；99(3)：534-41(通过cDNA芯片的方法来比较成神经管细胞瘤和正常小脑样品中基因的表达水平，结果发现高迁移率族蛋白B2基因在成神经管细胞瘤中表达水平较高)，Molecular targets for tumour progression ingastrointestinal stromal tumours.Gut.2004；53(2)：235-40(通过定量RT-PCR发现高迁移率族蛋白B2基因在恶性胃肠基质癌中过表达)，和SET complex in serous epithelial ovariancancer.Int J Cancer.2006；119(9)：2119-26(通过比较低恶性潜能和高恶性潜能的浆液性卵巢上皮性肿瘤(0级对3级)发现高迁移率族蛋白B2基因在有扩散性的3级肿瘤中高表达，同时通过组织芯片结合免疫组织化学研究发现高表达的高迁移率族蛋白B2与病人的预后有关)。
表明高迁移率族蛋白B2在蛋白质水平上与癌症有关的文献为：Overexpression of thehigh mobility group(HMG)B 1and B2 proteins directly correlates with the progression ofsquamous cell carcinoma in skin.Cancer Invest.2008；26(8)：843-51(通过对皮肤鳞状细胞癌的研究发现高迁移率族蛋白B2与肿瘤变化的程度直接相关，并可能有效的刺激细胞分化、肿瘤生长以及转移)。
但是到目前为止，现有技术中尚未见到有关于高迁移率族蛋白B2与肝细胞癌的相关性的报道。
发明内容
通过筛选在人类肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中差异表达的蛋白质，本申请的发明人找到了一种在人类肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达的蛋白质(在癌组织中上调表达)，经质谱鉴定为高迁移率族蛋白B2。免疫印迹实验证实，高迁移率族蛋白B2的确在肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达(在癌组织中表达上调)。利用人肝细胞癌细胞株HepG2和人正常肝细胞株L02进行的免疫荧光实验，证明高迁移率族蛋白B2在这两种细胞株间存在差异表达(在人肝细胞癌细胞株HepG2中表达上调)。
基于高迁移率族蛋白B2与肝细胞癌的这种相关性，这种蛋白质可以作为一种蛋白质分子标记物对它的表达量进行检测可以用于检测肝细胞癌。
因此，本发明的首要目的在于，提供一种高迁移率族蛋白B2的应用，以用作检测肝细胞癌。
本发明提供的高迁移率族蛋白B2的应用为，用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记。
本发明的另一个目的在于，提供一种高迁移率族蛋白B2的抗体的应用。
本发明提供的高迁移率族蛋白B2的抗体的应用，包括单克隆抗体和多克隆抗体，为用于制备检测肝细胞癌的制剂和/或试剂盒。
本发明的又一个目的在于提供一种体外检测肝组织中高迁移率族蛋白B2的表达是否异常的方法。
本发明提供的体外检测肝组织中高迁移率族蛋白B2的表达是否异常的方法为：用特异性抗高迁移率族蛋白B2的抗体检测待测肝组织细胞中高迁移率族蛋白B2的数量，并与正常肝组织中的高迁移率族蛋白B2的数量进行比较。
高迁移率族蛋白B2在肝细胞癌的癌细胞和癌旁细胞中存在明显的差异表达，因此，可根据其在肝细胞中的表达量检测患者是否患有肝细胞癌。同时，鉴于到目前为止，还没有高迁移率族蛋白B2的表达量与肝细胞癌的相关性报道。因此，本发明的这一发现将为肝细胞癌的诊断和/或治疗提供一条全新的途径。
附图说明
图1为高迁移率族蛋白B2的免疫印迹分析结果，其中，泳道1-6为肝细胞癌组织的检测结果，泳道1’-6’为与泳道1-6对应的癌旁组织的检测结果。
图2为对图1的免疫印迹图谱进行数据分析得出的蛋白质表达量相对分布图，其中，HCC为肝细胞癌患者的癌组织，non-HCC为癌旁组织，纵坐标IOD为蛋白质表达量相对丰度。
图3为高迁移率族蛋白B2的免疫荧光实验结果，其中，图A1为HepG2细胞中蛋白B2的分布情况，图A2为HepG2的细胞核，图A3为A1和A2的叠加图，图B1为L02细胞中蛋白B2的分布情况，图B2为L02的细胞核，图B3为B1和B2的叠加图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
在本发明的下述实施例中，尿素、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙铵]-1-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、三(羟甲基)氨基乙烷(Tris)、碘代乙酰胺(IAA)购自Bio-Rad公司；CLM-2262L-Leu(U-13C6，98％)购自剑桥同位素实验室；透析胎牛血清购自Gibco公司；D9785细胞培养粉末、β-巯基乙醇、L-Gln、L-Lys和L-Met购自Sigma公司；胰蛋白酶(Trypsin，sequencing grade)购自Promega公司；SCX柱和SAX柱以及pH缓冲液试剂盒购自Column Technology公司；HepG2细胞株和L02细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学和细胞研究所的细胞库。
在本发明的下述实施例中，使用的溶液/培养基配方如下：
不含谷氨酰胺的RPMI1640培养基：5％透析胎牛血清，0.2mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，1mM EDTA，苯甲异恶唑青霉素25mg/mL，庆大霉素50mg/mL，青霉素100U/mL，链霉素100mg/mL，两性霉素B 0.25mg/mL，制霉菌素50U/mL。
裂解液：8mol/L尿素、4％CHAPS、40mmol/L Tris和65mmol/L DTT。
裂解缓冲液：8mol/L尿素，40mmol/L Tris，65mmol/L DTT。
TBST：Tris 2.42g/L，氯化钠8g/L，Tween-201ml/L，用HCl调节pH到7.6。
本申请的发明人用非酶解样品制备法(nonenzymatic sample preparation，NESP)制备了肝细胞癌的癌组织与癌旁组织的蛋白质样品，并采用CDIT技术结合溶液内酶解及阴阳多维液相色谱串联质谱的蛋白质组学标记定量技术对其中的蛋白质进行鉴定并比较其表达量，结果发现高迁移率族蛋白B2在肝细胞癌组织中上调表达。免疫印迹实验进一步证实高迁移率族蛋白B2的确在肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达。另外，免疫荧光实验也进一步证实了高迁移率族蛋白B2的确在人类肝细胞癌患者的癌组织和癌旁组织中存在差异表达，具体如实施例所示。因此，以高迁移率族蛋白B2作为蛋白质分子标记物对它的表达量进行检测可以用于检测肝细胞癌，即高迁移率族蛋白B2可以用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记。
实施例1、肝细胞癌癌组织及癌旁组织蛋白质样品的制备
从东方肝胆外科医院获取5例肝细胞癌患者的癌组织及癌旁组织，该5例患者，均由2名病理科医生确诊，患有肝细胞癌，5例患者的病理资料如表1所示。
表1、5例肝细胞癌标本的病理资料
  No.   性别   年龄   HBV   HCV   等级   AFP   尺寸
  P1   男性   58   +   -   III   1000   5.2×6.4
  P2   男性   44   +   -   III   1000   8×8×7
  P3   男性   55   +   -   III   1000   4×3
  P4   男性   40   +   -   III   1000   10×8×6
  P5   男性   65   +   -   III   1000   11.5×6.5
然后，以非酶解样品制备法制备上述5例患者的肝细胞癌的癌组织及癌旁组织蛋白质样品(所用癌组织及癌旁组织样品均为取自同一肝细胞癌患者的成对样品)，具体过程如下：
手术切除的新鲜组织块迅速置于冰上，快速切成几个肉眼可见、无坏死区域的小块。用预冷的不含谷氨酰胺的RPMI1640培养基洗涤组织小块数次后，在液氮中快速研磨成细胞沉淀，然后将细胞沉淀分别溶于裂解液中，然后于冰浴条件下，使用超声细胞破碎仪(JY92-2D，宁波新芝科器研究所)间歇超声破碎2min后，于15000r/min、4℃离心1h，取上清，以改良的Bradford法(见Bio-Rad公司产品说明书)进行总蛋白质定量。
实施例2、HepG2和L0213C标记的细胞的培养和样品制备
在含有13C标记的CLM-2262L-Leu，10％透析胎牛血清，L-Gln，L-Lys以及L-Met的D9785培养基的6cm的培养皿中分别培养HepG2或L02细胞。
待细胞生长到6代后，将HepG2细胞或L02细胞转移到10cm培养皿中进行培养。
待细胞生长密度达到80％时，用冰冷的PBS洗三遍，加入裂解液进行裂解。然后用刮刀将这两种13C标记的细胞分别刮下收集，冰浴超声破碎，15000g离心1h，取上清，用改良的Bradford法(见Bio-Rad公司产品说明书)定量其总蛋白质含量。
实施例3、癌组织及癌旁组织的差异表达蛋白的筛选
采用CDIT技术(参照Yasushi Ishihama et al.Nat Biotechnol.2005；23(5)：617-621)结合溶液内酶解技术(参照William M.Old et al.Mol Cell Proteomics.2005；4：1487-1502)与阴阳多维液相色谱串联质谱技术(参照Jie Dai et al.J Proteome Res.2007；6(1)：250-262)进行差异表达蛋白的筛选，具体过程如下：
取实施例1中获得的5对肝细胞癌组织及癌旁组织蛋白质样品各100ug，分别将5例肝细胞癌组织蛋白质样品以及5例肝细胞癌的癌旁组织样品进行混合，得到500ug癌组织蛋白质样品和500ug癌旁组织蛋白质样品。
取实施例2中13C标记的HepG2和L02细胞的蛋白质样品，将二者等比例混合作为内标。
取500ug的肝细胞癌的癌组织或癌旁组织蛋白质样品分别与500ug13C标记的内标混合，得到两种组织-细胞混合蛋白质样品各1mg。
分别向混合蛋白质样品中加入裂解缓冲液至总体积100μl，再加入8ul的1M DTT，混匀后37℃反应2小时，然后加入20μl的1M IAA，混匀后室温避光反应45分钟。
然后用4倍体积的-20℃预冷的丙酮进行沉淀，-20℃反应至少4小时。25000g离心45分钟，去上清，加入50mmol/L的碳酸氢铵200μl，再加入20μg胰蛋白酶(蛋白质和胰蛋白酶的比例为50∶1)，37℃酶解反应4小时后，补加胰蛋白酶至总蛋白质和胰蛋白酶比例为25∶1，酶解过夜至总酶解时间16小时。酶解完成后用Millipore10KD孔径大小的超滤膜超滤，收取滤过液，真空冷冻干燥。
酶解后的每份肽段混合物首先用SCX/SAX柱进行分析，然后用完全自动化的多维液相色谱串联质谱仪LTQTMOrbitrapTM(购自Thermo Finnigan公司)进行分析，得到的原始数据采用SEQUEST软件(Thermo Finnigan公司)进行数据库搜索，并采用Census定量分析软件(http://fields.scripps.edu/census/index.php)对鉴定到的蛋白质进行定量分析，定量结果如表2和表3所示。
表2、肝细胞癌组织/13C标记细胞含有定量信息肽段的定量结果
  肽段序列   比率   R2值   X Corr值   Delta Cn值
  K.LGEMWSEQSAK.D   2.24   0.94   2.168   0.2436
  K.SEHPGLSIGDTAK.K   2.68   0.98   1.9543   0.23
  K.SEHPGLSIGDTAK.K   2.39   0.98   3.0541   0.1853
  K.SEHPGLSIGDTAK.K   2.39   0.98   2.8351   0.1094
  K.SEHPGLSIGDTAK.K   2.45   0.98   2.6751   0.3921
  K.SEHPGLSIGDTAK.K   2.45   0.98   2.6477   0.3938
  K.SEHPGLSIGDTAK.K   1.95   0.98   2.3574   0.2175
表3、肝细胞癌癌旁组织/13C标记细胞含有定量信息肽段的定量结果
  肽段序列   比率   R2值   X Corr值   Delta Cn值
  K.LGEMWSEQSAK.D   0.36   0.85   2.2772   0.2528
  K.LGEMWSEQSAK.D   0.36   0.85   2.2175   0.1877
  K.SEHPGLSIGDTAK.K   0.47   0.97   1.9609   0.1971
  K.SEHPGLSIGDTAK.K   0.44   0.97   2.5618   0.2077
根据表2和表3的结果，高迁移率族蛋白B2在肝细胞癌组织/13C标记细胞和癌旁组织/13C标记细胞中的定量结果分别为1.6771228和0.4965873，在肝细胞癌组织中高表达3倍以上，肝细胞癌组织中表达明显上调，其中，高迁移率族蛋白B2在肝细胞癌组织/13C标记细胞中有2条非重复肽段(共鉴定到7次)包含定量信息，而在癌旁组织/13C标记细胞中有2条非重复肽段(共鉴定到4次)包含定量信息。
实施例4、高迁移率族蛋白B2的验证
取6对NESP法制备的肝细胞癌组织及相应的癌旁组织的蛋白质样品，其病理资料如表4所示。
表4、6例肝细胞癌标本的病理资料
  No.   性别   年龄   HBV   HCV   等级   AFP   尺寸
  P6   男性   55   +   -   III   ＞1000   4×3
  P7   男性   40   +   -   III   ＞1000   10×8×6
  P8   男性   65   +   -   III   ＞1000   11.5×6.5
  P9   男性   56   +   -   III   ＞1000   7×6
  P10   男性   50   +   -   III   ＞1000   5×6
  P11   男性   55   +   -   III   ＞1000   5×5.5
使用购买的抗高迁移率族蛋白B2抗体对上述6对肝细胞癌组织及相应的癌旁组织的蛋白质样品进行免疫印迹分析，过程如下：
每个样品取40μg蛋白质样品，用12％SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜(购自GEHealthcare公司)上；
一抗使用鼠抗人高迁移率族蛋白B2单克隆抗体(购自Abnova公司，1∶500稀释)，4℃孵育过夜，用TBST洗涤三次，每次5分钟；
二抗为抗鼠抗体(购自Santa Cruz公司，1∶2500)，室温孵育1小时，再用TBST洗涤三次，每次10分钟；
加入ECL plus试剂(GE Healthcare)，反应5分钟后，以X-光片曝光检测。
检测结果如图1所示，然后采用Gel-Pro Analyzer凝胶定量分析软件(MediaCybernetic公司)对图1的免疫印迹图谱进行数据分析，得出蛋白质表达量的相对分布图，结果如图2所示。
图1结果显示，肝细胞癌组织中高迁移率族蛋白B2的杂交条带的浓度都明显高于相应的癌旁组织；
图2结果显示，高迁移率族蛋白B2在肝细胞癌组织中的表达量均明显高于相应的癌旁组织组织，平均比值为7.263，P值(配对t检验)为0.002197。
根据图1和图2的结果，高迁移率族蛋白B2在肝细胞癌组织存在高表达，该结果与质谱结果一致。
选取HepG2细胞(人肝癌细胞株)和L02细胞(人正常肝细胞株)进行免疫荧光实验，过程如下：
在圆形盖玻片上，用含10％透析胎牛血清的DMEM培养L02细胞和HepG2细胞；
PBS洗涤两次，-20℃预冷的100％丙酮固定；PBS洗涤两次，5％脱脂牛奶封闭30分钟；
加入鼠抗人高迁移率族蛋白B2单克隆抗体(购自Abnova公司，1∶20封闭液稀释)，室温孵育1h，TBST洗3遍，每次7分钟；
加入荧光染料Alexa 488标记的羊抗鼠抗体(购自Molecular Probes公司，1∶200封闭液稀释)，室温孵育45分钟，TBST洗3遍，每次7分钟；
DAPI溶液(购自Sigma公司，1∶1000双蒸水稀释)，孵育1分钟，PBS洗10分钟；
封片，4℃避光保存。
使用激光共聚焦显微镜观察，结果如图3所示。
根据图3结果，高迁移率族蛋白B2在HepG2中的表达水平明显高于在L02中的表达水平，这与从组织中得到的结果相一致。
综上所述，高迁移率族蛋白B2在肝细胞癌的癌组织和癌旁组织中存在明显的差异表达，显然与肝细胞癌的发生发展有着密切的相关性，因此它的表达量可以用于检测肝细胞癌。相应的，特异性抗高迁移率族蛋白B2的抗体，包括各种抗高迁移率族蛋白B2的单克隆抗体和多克隆抗体，由于其能够用于检测高迁移率族蛋白B2的表达量，因而可以用于检测肝细胞癌，或者用于制备检测肝细胞癌的制剂或试剂盒，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
虽然有关高迁移率族蛋白B2动态的生物学功能及肿瘤相关机制还有待进一步研究，但是将它作为检测肝细胞癌的标记物却是肯定的。

Claims (9)

1.一种高迁移率族蛋白B2的应用，其特征在于，所述应用为所述高迁移率族蛋白B2用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记是检测高迁移率族蛋白B2在肝细胞组织中的表达量。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测高迁移率族蛋白B2在肝细胞组织中的表达量是检测高迁移率族蛋白B2在肝细胞组织中是否均存在上调表达。
4.一种抗高迁移率族蛋白B2的抗体的应用，其特征在于，所述应用为用于制备检测肝细胞癌的制剂。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗高迁移率族蛋白B2的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
6.一种抗高迁移率族蛋白B2的抗体的应用，其特征在于，所述应用为用于制备检测肝细胞癌的试剂盒。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗高迁移率族蛋白B2的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
8.一种体外检测肝组织中高迁移率族蛋白B2的表达是否异常的方法，其特征在于，所述方法为：用特异性抗高迁移率族蛋白B2的抗体检测待测肝组织细胞中高迁移率族蛋白B2的数量，并与正常肝组织中的高迁移率族蛋白B2的数量进行比较。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗高迁移率族蛋白B2的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
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