KR102260250B1

KR102260250B1 - P53의 전사적 활성 저해에 의한 암 검출용 바이오마커, 키트 또는 조성물, 이를 이용한 정보 제공 방법, 약물 스크리닝 방법, 및 악성 형질전환 모델

Info

Publication number: KR102260250B1
Application number: KR1020210049822A
Authority: KR
Inventors: 한정아; 이현주
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2021-02-22
Filing date: 2021-04-16
Publication date: 2021-06-03
Also published as: KR20210045386A; KR20210065916A; KR102273119B1

Abstract

본 명세서에는 암 진단 바이오마커, 상기 바이오마커를 검출하기 위한 키트 또는 조성물, 상기 바이오마커를 이용하여 암에 대한 정보를 제공하는 방법, 상기 바이오마커를 이용한 악성 형질전환 모델 및 상기 바이오마커를 이용한 항암제 스크리닝 방법이 개시된다. 상기 바이오마커는 p53의 기능을 억제하는 종양유전자 또는 종양단백질이므로, 이를 이용하면 효과적인 암 검출이 가능해진다. 즉, 악성 종양의 진단, 치료, 또는 예후 판정에 효과적으로 활용할 수 있다. 또한 악성 형질전환의 새로운 모델로서, 세포 및 동물에서 암발생의 기전을 연구하고, 암을 억제하는 약물 또는 요인들을 스크리닝 하는 데 유용하게 활용할 수 있다.

Description

P53의 전사적 활성 저해에 의한 암 검출용 바이오마커, 키트 또는 조성물, 이를 이용한 정보 제공 방법, 약물 스크리닝 방법, 및 악성 형질전환 모델{Biomarker, kit or composition for detecting cancer caused by inhibition of transcriptional activity of p53, method for providing information or screening drugs, and malignant transformation model}

본 명세서에는 암 진단 바이오마커, 상기 바이오마커를 검출하기 위한 키트 또는 조성물, 상기 바이오마커를 이용하여 암에 대한 정보를 제공하는 방법, 상기 바이오마커를 이용한 악성 형질전환 모델 및 상기 바이오마커를 이용한 항암제 스크리닝 방법이 개시된다.

1977년, Raus sarcoma virus가 가지고 있는 src 유전자가 정상세포를 악성 형질전환 시킨다는 것이 알려지면서, 유전자가 종양을 일으킨다는 이른바 '종양유전자(oncogene)'의 개념이 도입되었다. 종양유전자란 '정상세포를 악성 형질전환 시키며 동물에 주입했을 때 종양을 형성하는 유전자'로 정의된다.

이후 계속된 연구를 통해 '인간 세포 속에도 종양유전자 존재하며, 이것은 인간의 정상세포가 원래 가지고 있던 유전자가 돌연변이 되었거나 과도하게 발현된 형태'라는 것이 알려지게 되었다. 따라서 인간 세포 속에 존재하는 종양유전자를 ’세포성 종양유전자 (cellular oncogene)'라 하며, 바이러스가 가지고 있는 종양유전자를 ‘바이러스성 종양유전자 (viral oncogene)'라 한다. 종양유전자의 대부분은 세포성 종양유전자들이며, 지금까지 약 80여개의 세포성 종양유전자들이 발견되었다. 이들은 대부분 세포분열에 관여하는 것들이며, 그 외 세포사멸을 억제하거나, p53의 기능을 억제하는 유전자들이다.

p53은 최초로 확인된 종양억제유전자(tumor suppressor gene)인 동시에 지금까지 알려진 것 중 최고의 종양억제유전자이다. 사람에서 발생하는 암의 약 50%에서 p53 유전자의 돌연변이가 관찰되며, 나머지 경우에도 p53 단백질의 기능적 이상이 관찰된다.

p53은 세포 내에서 활성화되면 세포주기 정지, DNA 손상 수복, 세포사멸, 또는 세포노화를 일으킨다. p53을 활성화시키는 대표적인 자극으로는 DNA 손상(전리방사선, 자외선, 활성산소, 약물 등)이 있으며, 이들에 의해 p53이 활성화되면 (i) 세포주기가 정지되면서, 손상된 DNA가 복구되어 다시 정상 세포로 돌아오거나, (ii) 세포사멸 과정을 거쳐 손상된 세포가 영구히 제거되거나, (iii) 세포노화 과정을 거쳐 손상된 세포가 영구히 분열 능력을 잃어버리게 된다. 결국 p53은 DNA 손상이 발생한 세포의 분열을 억제함으로써 종양 발생을 억제한다.

p53은 전사인자(transcription factor)로서, DNA 손상에 의해 세포질 내에서 활성화되면 핵 안으로 이동하여 표적유전자의 프로모터(promoter)에 직접 결합함으로써 표적유전자의 발현을 증가시킨다. 즉 세포주기 정지 유전자 (p21, 14-3-3-σ 등), DNA 수선 유전자 (Gadd45 등), 세포사멸 유전자 (Bax, IGF-BP3, DR5, PREP, Pidd, Fas, p53AIP1, PUMA, NOXA 등), 세포노화 유전자 (PAI-I 등) 등의 발현을 증가시킴으로써, 손상된 DNA를 수선하고 세포주기를 억제시키며 경우에 따라서는 세포사멸이나 세포노화를 유도한다. 따라서 p53의 전사활성(transcriptional activity)은 p53이 종양억제 기능을 수행함에 있어서 핵심적인 기능이다.

많은 연구자들의 노력에 의해 현재 '종양유전자가 종양 발생의 원인'이라는 중요한 결론에 도달해 있다. 그러나 아직까지 80여개의 세포성 종양유전자가 알려져 있을 뿐이며, 이들도 대부분 세포분열을 매개하는 유전자들이다. p53의 기능을 저해하는 유전자 중, Mdm-2는 다른 표적유전자들과는 달리 p53 단백질의 분해를 촉진함으로써, p53의 전사활성을 비롯한 주요 기능들을 억제하는 ‘음성 되먹임 조절자 (negative feedback regulator)’이다.

WO2014-193999A US7939263B US8476420B US2016-0069906A US9296687B US2016-0177396A

일 측면에서, 본 발명은 암 검출용 바이오마커를 제공하는 것을 목적으로 한다.

다른 측면에서, 본 발명은 p53의 전사적 활성 저해에 기인한 암을 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

다른 측면에서, 본 발명은 p53에 결합하는 단백질의 존재에 의해 발생하는 암을 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

다른 측면에서, 본 발명은 암 검출용 조성물 또는 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

다른 측면에서, 본 발명은 암을 진단하기 위한 기초 정보로서 p53의 전사적 활성 저해에 의한 암의 존재 또는 암의 발병 가능성에 대한 기초 정보를 제공하는 것을 목적으로 한다.

다른 측면에서, 본 발명은 p53의 전사적 활성 저해에 의한 암 발생을 억제하는 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

다른 측면에서, 본 발명은 효과적인 p53 불활성화 악성 형질전환 모델을 제공하는 것을 목적으로 한다.

일 측면에서 본 발명은, 암 검출을 위한 DNA 분자 또는 그 단편으로서, 상기 DNA 분자 또는 그 단편은 암의 존재 또는 암의 발병 가능성을 나타내는 바이오마커인 mRNA를 검출할 수 있는 것으로서, 상기 mRNA 바이오마커에 결합하거나 상기 mRNA 바이오마커를 증폭할 수 있는 것이며, 상기 mRNA 바이오마커는, 서열번호 1 내지 9 중 어느 한 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것인, 암 검출용 DNA 분자 또는 그 단편이다.

일 측면에서 본 발명은 암 검출을 위한 DNA 분자 또는 그 단편으로서, 상기 DNA 분자 또는 그 단편은 암의 존재 또는 암의 발병 가능성을 나타내는 바이오마커인 mRNA에 결합할 수 있는 것이며, 상기 mRNA 바이오마커는, 서열번호 1 내지 9 중 어느 한 서열에 상보적인 서열을 포함하는 DNA 분자 또는 그 단편이다.

일 측면에서 본 발명은 암 검출을 위한 항체 또는 그 단편으로서, 상기 항체는, 서열번호 11 내지 19 중 어느 한 서열을 포함하는 단백질에 특이적으로 결합하며, 상기 단편은 상기 항체의 항원 결합능을 보유한 단편이며, 상기 서열번호 11 내지 19 중 어느 한 서열을 포함하는 단백질은 암의 존재 또는 암의 발병 가능성을 나타내는 바이오마커인, 암 검출용 항체이다.

일 측면에서 본 발명은, 상기 DNA 분자 또는 그 단편; 또는 상기 항체 또는 그 단편을 포함하는, 암 진단 키트이다.

다른 측면에서 본 발명은, 암의 존재 또는 암의 발병 가능성을 검출하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은, 대상의 생물학적 시료 내의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하며, 상기 mRNA는 서열번호 1 내지 9 중 어느 한 서열을 포함하는 DNA 서열에 상보적인 mRNA이며, 상기 mRNA는 암의 존재 또는 암의 발병 가능성을 나타내는 바이오마커인 조성물이다.

다른 측면에서 본 발명은, 암의 존재 또는 암의 발병 가능성을 검출하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은, 대상의 생물학적 시료 내의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하며, 상기 단백질은 서열번호 11 내지 19 중 어느 한 서열을 포함하며, 상기 단백질은 암의 존재 또는 암의 발병 가능성을 나타내는 바이오마커인 조성물이다.

다른 측면에서 본 발명은, 암의 존재 또는 암의 발병 가능성에 대한 정보를 제공하는 방법으로서, 상기 방법은, 대상의 생물학적 시료 내의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 mRNA 또는 단백질의 발현 수준은, 서열번호 1 내지 9 중 어느 한 서열을 포함하는 DNA 서열에 상보적인 mRNA의 발현 수준, 또는 서열번호 11 내지 19 중 어느 한 서열을 포함하는 단백질의 발현 수준인 단계를 포함하는 정보 제공 방법이다.

일 측면에서 본 발명은, 항암제 스크리닝 방법으로서, 상기 방법은, 서열번호 11 내지 19 중 어느 한 서열을 포함하는 단백질이 p53에 결합하여 p53의 전사 활성(transcriptional activity) 억제하는 과정을 후보물질이 저해하는지의 여부를 검출하는 단계; 및 상기 후보물질이 상기 과정을 저해하면 항암제로서 판정하는 단계를 포함하는, 항암제 스크리닝 방법이다.

일 측면에서 본 발명은, 악성 형질전환 모델로서, 상기 형질전환 모델은, p53이 기능적으로 불활성화된 형질전환 모델이며, 상기 악성 형질전환 모델은 서열번호 11 내지 19 중 어느 한 서열을 포함하는 단백질을 발현하는 유전자를 갖는 세포 또는 동물인, 악성 형질전환 모델이다.

p53의 전사활성은 p53의 세포주기 정지, DNA 손상 수복, 세포사멸, 세포노화 등 종양억제 기능의 바탕이 되는 핵심적인 기능이다. 본 명세서에 개시된 바이오마커는 이러한 p53의 기능을 억제하는 종양유전자 (oncogene) 또는 종양단백질 (oncoprotein) 이므로, 이를 이용하면 효과적인 암 검출이 가능해진다. 즉, 악성 종양의 진단, 치료, 또는 예후 판정에 효과적으로 활용할 수 있다. 또한 악성 형질전환의 새로운 모델로서, 세포 및 동물에서 암발생의 기전을 연구하고, 암을 억제하는 약물 또는 요인들을 스크리닝 하는 데 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 p53에 결합하지 않는 것으로 알려진 음성대조군과 p53에 결합하는 것으로 알려진 양성대조군의 p53 결합 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 본 발명의 일실시예들에 따른 단백질들의 p53 결합 유무를 실험한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 본 발명의 일실시예들에 따른 단백질들의 p53 전사활성 저해 기능을 실험한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 음성대조군과 양성대조군의 p53 전사활성 저해 기능을 나타내는 그래프이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "암"은, '악성(malignant) 종양'을 의미한다. “종양(tumor)”이란 비정상적인 분열을 하는 세포들의 덩어리를 말한다. 이 세포들이 주변 조직을 침윤하여 다른 장기로 전이할 수 있는 능력을 가지고 있지 않는 경우에는 '양성(benign) 종양'이라 하며, 능력을 가지고 있는 경우에는 '악성(malignant) 종양' 또는 ‘암(cancer)'이라 한다.

정상세포와 달리 암세포를 배양해 보면, (i) 무한증식하며, (ii) 자체 분열신호를 가지며, (iii) 밀도-의존적 저해나 접촉 저해가 되지 않으며, (iv) 부유상태에서도 잘 자라며, (v) 조직 침윤 능력을 가지고 있다. 정상세포가 어떤 원인에 의해 이러한 악성 형질을 획득하게 되는 현상을 ‘악성 형질전환(malignant transformation)’이라 한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "컷오프 레벨"은 암을 앓고 있거나 또는 암 발병 위험이 있는 개체들을 구별할 수 있도록 결정된 상대 레벨 또는 절대 레벨을 의미한다. 컷-오프 레벨은 상대 레벨의 경우에 배수 차이(fold difference)로서 또는 절대값의 경우에, 예를 들어 ng 또는 pg/ml로서 표시되는 단백질 레벨의 경우에 특성값으로 주어진다. 본 명세서에서 지적된 바와 같이, 각각 컷오프 레벨 이하 또는 이상인 값은 암의 진단을 가능하게 하거나 또는 암의 발병 위험을 결정하거나, 또는 중증 암의 존재를 결정하고 최종적으로 암 환자의 치료 조절을 가능하게 하는 것으로 간주된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "바이오마커"는 질환 상태를 나타낼 수 있는 물질을 의미한다. 암의 진단에 관한 본 발명의 문맥에서, "바이오마커"는 암이 존재하거나 암의 발병 위험이 있음을 나타내는 물질을 의미한다. "바이오마커"는 폴리펩티드 및 단백질을 포함하며, 이것의 양은 암을 앓고 있거나 또는 정상의 건강한 대상체에 비하여 암에 걸리기 쉬운 환자에서 증가하거나 감소한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적 시료"는 개체로부터 얻어진 다양한 시료 유형을 포함하며 또한 진단 또는 모니터링 분석에서 사용될 수 있다. 생물학적 시료는 고체, 액체 또는 기체일 수 있다. 생물학적 액체 시료는 혈액, 뇌척수액(CSF), 뇨 및 생물 유래의 다른 액체 시료를 포함한다. 또한, 상기 생물학적 시료는 암 조직, 또는 암이 의심되는 조직의 일부일 수도 있다. 필요에 따라, 시료는 예를 들면 농축 및 분리를 위해 미리 처리할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "혈액"은 전혈, 혈청 및 혈장을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 생체분자의 항원영역에 특이적으로 결합하는 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명의 목적과 관련하여, 항체는 바이오마커에 특이적으로 결합하며, 또한 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 및 재조합 항체를 포함한다. 또한 본 발명의 항체는 항체 분자의 기능적 단편은 물론 2개의 전체 길이 경쇄 및 2 개의 전체 길이 중쇄를 갖는 완전한 형태를 포함한다. 항체 분자의 기능적 단편은 적어도 항원-결합 기능을 보유하는 단편을 의미하며 또한 Fab, F(ab')2, Fv, 및 유사 단편을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "항원-항체 복합체"는 그것을 인식하는 항체에 바이오마커가 결합된 결합 산물을 의미한다.

“대상”은 포유동물, 바람직하게는 인간을 의미한다.

본 명세서에서 서열번호 1 내지 9의 DNA 서열은 하기 표 1에 나타난 바와 같다.

서열번호	cDNA 서열
1	atggctaacg tggctgacac gaagctgtac gacatcctgg gcgtcccgcc cggcgccagc 60 gagaacgagc tgaagaaggc atacagaaag ttagccaagg aatatcatcc tgataagaat 120 ccaaatgcag gagacaaatt taaagaaata agttttgcat atgaagtact atcaaatcct 180 gagaagcgtg agttatatga cagatacgga 210
2	ttggccaaag aagattatta tcagatatta ggagtgcctc gaaatgccag ccagaaagag 60 atcaagaaag cctattatca gcttgccaag aagtatcacc ctgacacaaa taaggatgat 120 cccaaagcca aggagaagtt ctcccagctg gcagaagcct atgaggtttt gagtgatgag 180 gtgaagagga agcagtacga tgcctacggc tctgcaggct tcgatcctgg ggccagcggc 240
3	aagatggtga aggagaccca gtactatgac atcctgggcg tgaagcccag cgcgtccccg 60 gaggagatca agaaggccta tcggaagctg gcgctcaagt accacccgga caagaacccg 120 gatgagggcg agaagtttaa actcatatcc caggcatatg aagtgctttc agatccaaag 180 aaaagggatg tttatgacca aggcggagag caggcaatta aagaaggagg ctcaggcagc 240
4	atgggtaaag actactacca gacgttgggc ctggcccgcg gcgcgtcgga cgaggagatc 60 aagcgggcct accgccgcca ggcgctgcgc taccacccgg acaagaacaa ggagcccggc 120 gccgaggaga agttcaagga gatcgctgag gcctacgacg tgctcagcga cccgcgcaag 180 cgcgagatct tcgaccgcta cggggaggaa 210
5	atggggaaag actattattg cattttggga attgagaaag gagcttcaga tgaagatatt 60 aaaaaggctt accgaaaaca agccctcaaa tttcatccgg acaagaacaa atctcctcag 120 gcagaggaaa aatttaaaga ggtcgcagaa gcttatgaag tattgagtga tcctaaaaag 180 agagaaatat atgatcagtt tggggaggaa 210
6	ggacgagatt tctataagat cttgggggtg cctcgaagtg cctctataaa ggatattaaa 60 aaggcctata ggaaactagc cctgcagctt catcccgacc ggaaccctga tgatccacaa 120 gcccaggaga aattccagga tctgggtgct gcttatgagg ttctgtcaga tagtgagaaa 180 cggaaacagt acgatactta tggtgaagaa 210
7	tggaagaacc aagatcatta tgcagttctt ggacttggcc atgtgagata caaggctaca 60 cagagacaga tcaaagcagc tcataaagca atggttttaa aacatcaccc agacaaacgg 120 aaagcagctg gtgaaccaat aaaagaagga gataatgact acttcacttg cataactaaa 180 gcttatgaaa tgttatctga tccagtgaaa agacgagcat ttaacagtgt agatcctact 240
8	ggagaagctc tatacgaaat tcttggtctg cataagggag catcaaatga agaaattaag 60 aaaacctaca gaaaattggc cctgaaacac catccagaca agaatccaga tgatccagct 120 gctactgaga agtttaaaga aatcaacaac gcccacgcaa tacttaccga catttcaaag 180 agaagcatat acgacaagta cggatcgctg 210
9	caggattttt acagtttact tggagtgtcc aaaactgcaa gcagtagaga aataagacaa 60 gctttcaaga aattggcatt gaagttacat cctgataaaa acccgaataa cccaaatgca 120 catggcgatt ttttaaaaat aaatagagca tatgaagtac tcaaagatga agatctacgg 180 aaaaagtatg acaaatatgg agaaaaggga cttgaggata atcaaggtgg ccagtatgaa 240

본 명세서에서 서열번호 11 내지 19의 단백질 서열은 하기 표 2에 나타난 바와 같다.

서열번호	단백질 서열
11	manvadtkly dilgvppgas enelkkayrk lakeyhpdkn pnagdkfkei sfayevlsnp ekrelydryg
12	la kedyyqilgv prnasqkeik kayyqlakkyhpdtnkddpk akekfsqlae ayevlsdevk rkqydaygsa gfdpgasg
13	km vketqyydil gvkpsaspee ikkayrklalkyhpdknpde gekfklisqa yevlsdpkkr dvydqggeqa ikeggsgs
14	mgkdyyqtlg largasdeei krayrrqalr yhpdknkepg aeekfkeiae aydvlsdprk reifdrygee
15	mgkdyycilg iekgasdedi kkayrkqalk fhpdknkspq aeekfkevae ayevlsdpkkreiydqfgee
16	grdfykil gvprsasikd ikkayrklal qlhpdrnpddpqaqekfqdl gaayevlsds ekrkqydtyg ee
17	wknqdhy avlglghvry katqrqikaa hkamvlkhhpdkrkaagepi kegdndyftc itkayemlsd pvkrrafnsv dpt
18	eal yeilglhkga sneeikktyr klalkhhpdk npddpaatekfkeinnahai ltdiskrsiy dkygsl
19	qdfysll gvsktassre irqafkklalklhpdknpnn pnahgdflki nrayevlkde dlrkkydkyg ekglednqgg qye

일 측면에서 본 발명은, 암 검출을 위한 DNA 분자 또는 그 단편으로서, 상기 DNA 분자 또는 그 단편은 암의 존재 또는 암의 발병 가능성을 나타내는 바이오마커인 mRNA를 검출할 수 있는 것으로서, 상기 mRNA 바이오마커에 결합하거나 상기 mRNA 바이오마커를 증폭할 수 있는 것이며, 상기 mRNA 바이오마커는, 서열번호 1 내지 9 중 어느 한 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것인, 암 검출용 DNA 분자 또는 그 단편이다. 일 측면에서 본 발명은 암 검출을 위한 DNA 분자 또는 그 단편으로서,상기 DNA 분자 또는 그 단편은 암의 존재 또는 암의 발병 가능성을 나타내는 바이오마커인 mRNA에 결합할 수 있는 것이며, 상기 mRNA 바이오마커는, 서열번호 1 내지 9 중 어느 한 서열에 상보적인 서열을 포함하는 DNA 분자 또는 그 단편이다.일 측면에서 본 발명은 암 검출을 위한 DNA 분자 또는 그 단편으로서, 상기 DNA 분자 또는 그 단편은, 서열번호 1 내지 9 중 어느 한 서열을 포함하는 DNA 분자 또는 상기 DNA 분자의 단편이며, 상기 DNA 분자 또는 그 단편은 서열번호 1 내지 9 중 어느 한 서열을 포함하는 DNA 서열에 상보적인 mRNA에 결합할 수 있는 것이며, 상기 mRNA는 암의 존재 또는 암의 발병 가능성을 나타내는 바이오마커인, 암 검출용 DNA 분자 또는 그 단편이다.

상기 바이오마커는 단백질로 발현되어 p53에 결합하여 p53의 전사 활성(transcriptional activity)을 억제하는 것일 수 있다.

상기 “단편”은 상기 mRNA를 검출할 수 있는 단편이어야 한다. 예컨대, 상기 단편은 상기 mRNA에 결합하기 위해 요구되는 결합능을 보유한 것일 수 있다. 또한 예컨대, 상기 단편은 상기 mRNA에 결합하기 위해 요구되는 결합능을 보유하기 위한 최소한의 길이를 갖는 단편이어야 한다. 예컨대, 10nt 이상, 12 nt이상, 14nt 이상, 16nt 이상, 18nt 이상, 20nt 이상, 22nt 이상, 24nt 이상, 26nt 이상, 28nt 이상, 30nt 이상, 32nt 이상, 34nt 이상, 36nt 이상, 38nt 이상, 40nt 이상, 42nt 이상, 44nt 이상, 46nt 이상, 48nt 이상 또는 50nt 이상일 수 있다.

상기 "서열번호 1 내지 9 중 어느 한 서열을 포함하는" 또는 서열번호 1 내지 9 중 어느 한 서열에 상보적인 서열을 포함하는"는 서열번호 1 내지 9 중 어느 한 서열 또는 그에 상보적인 서열을 포함하면서 서열번호 1 내지 9 중 어느 한 서열 또는 상보적인 서열보다 더 긴 서열을 의미한다. 상기 더 긴 서열은 생체 내에 존재하는 상기 mRNA에 상보적인 서열을 갖는다. 예컨대, 생체 내에서 서열번호 11 내지 19의 서열을 포함하는 단백질 또는 그 전 단계인 mRNA는, 서열번호 11 내지 19 서열을 포함하면서 서열번호 11 내지 19보다 더 긴 단백질의 형태 또는 서열번호 1 내지 9 중 어느 한 서열과 상보적인 서열을 포함하면서 더 긴 mRNA의 형태로 존재할 수 있고, 그와 같은 더 긴 단백질 또는 더 긴 mRNA를 검출함으로써 암을 진단하는 것일 수 있다.

일 측면에서 본 발명은 암 검출을 위한 항체 또는 그 단편으로서, 상기 항체는, 서열번호 11 내지 19 중 어느 한 서열을 포함하는 단백질에 특이적으로 결합하며, 상기 서열번호 11 내지 19 중 어느 한 서열을 포함하는 단백질은 암의 존재 또는 암의 발병 가능성을 나타내는 바이오마커인, 암 검출용 항체이다. 상기 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 또한, 상기 단편은 상기 항체의 특이적 항원 결합능을 보유한 단편이다.

상기 단백질 바이오마커는 p53에 결합하여 p53의 전사 활성(transcriptional activity)을 억제하는 것일 수 있다.

상기 암 검출을 위한 DNA 분자 또는 그 단편, 또는 항체 또는 그 단편, 또는 항원-항체 복합체는 하나 이상의 검출가능한 표지(label)와 융합될 수 있다. 표지는 화학적, 물리적, 또는 효소적 반응에서 검출 가능한 화합물 또는 신호를 직접 또는 간접적으로 발생시키는 화합물일 수 있다. 표지 및 그 이후의 검출은 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다(예컨대, Sambrook, J., and Russel, D.W.(2001); 및 Lottspeich, F., and Zorbas H. (1998) Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlin, Germany). 표지는 형광 표지, 효소 표지, 발색 (chromogenic) 표지, 발광 표지, 방사선 표지, 햅텐, 바이오틴, 금속 복합체, 금속 및 콜로이달 금을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 모든 유형의 표지는 당업계에 잘 알려져 있고 다양한 공급업체로부터 상업적으로 입수할 수 있다.

일 측면에서 본 발명은, 상기 암 검출용 DNA 분자 또는 그 단편; 또는 상기 암 검출용 항체 또는 그 단편을 포함하는, 암 진단 키트이다.

상기 키트는 키트 사용 설명 및/또는 진단과 관련된 설명이 포함된 설명서를 더 포함하는 것일 수 있다.

바이오마커를 검출하기 위한 상기 키트는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하며 또한 라벨에 결합된 이차 항체, 예를 들면 기질과 발색반응을 위해 유용한 효소; 라벨과 발색반응을 유도하기 위한 발색 기질 용액; 세척 용액; 및 효소반응 정지 용액을 추가로 포함할 수 있다. 이것은 적절한 마이크로플레이트, 표준 용액 및 프로토콜을 추가로 포함할 수 있다. 라벨에 결합된 이차 항체 대신에, 상기 또는 하기 기술되는 바이오마커에 특이적인 (일차) 항체 자체는 라벨에 결합할 수 있다. 바이오마커를 검출하기 위한 본 발명의 키트는 항원-항체 결합 반응을 통하여 항원을 정량적으로 또는 정성적으로 분석함으로써 암을 진단할 있으며, 항원-항체 결합반응은 통상적인 방법, 예를 들면 ELISA(효소 결합 면역 흡착 분석) 또는 샌드위치 분석에 의해 측정할 수 있다. 예를 들면 상기 또는 하기 기술된 바와 같은 진단 바이오마커를 검출하기 위한 키트는 분석물 및 대조군으로 코팅된 96-웰 마이크로티터 플레이트 표면을 이용하여 재조합 모노클로날 항체 단백질과 반응시키기 위한 ELISA를 수행하는 방식으로 제공될 수 있다. 항원-항체 결합 반응을 위한 수용체로서, 슬라이드 글래스, 니트로셀룰로오스 멤브레인, 또는 폴리비닐 또는 폴리스티렌 수지의 웰 플레이트가 사용될 수 있다.

발색 반응을 수행하는 통상적인 라벨, 예컨대 HRP (서양고추냉이 퍼옥시다아제), 알칼리성 포스파타제, 콜로이드성 골드, 형광 라벨, 예컨대 플루오레스세인, FITC (폴리 L-라이신-플로우레스세인 이소티오시아네이트) 또는 RITC (로다민-B 이소시아네이트), 또는 염료가 이차 항체 결합체의 라벨로서 또는 일차 항체 결합체의 라벨로서 바람직하게 사용될 수 있다.

발색 반응을 생성하는 기질은 라벨에 따라 선택된다. 특히 바람직한 기질은 퍼옥시다이제, 예를 들면 서양고추냉이 퍼옥시다아제와 함께 사용되는 것들이며, 또한 예를 들면 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘), ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티오졸린-6-설폰산)), 또는 OPD (o-페닐렌디아민)이다. 바람직하게, 발색 기질은 완충용액 (예를 들면 0.1M 소듐 아세테이트, pH 5.5) 중에 용해 상태로 제조된다. 항체 결합체의 라벨로서 사용되는 HRP (서양고추냉이 퍼옥시다아제)는 과산화 수소의 존재하에 발색 기질, 예를 들면 TMB를 분해하여 발색 침전물을 생성시킨다. 발색 침전물의 침전 정도를 육안으로 체크함으로써, 단백질 바이오마커의 존재 또는 부존재가 검출된다. TMB의 색상은 450 nm에서 측정되며, ABTS의 색상은 420 nm에서 측정되며 또한 OPD의 색상은 492 nm에서 측정된다. 황산용액 (H2SO4)는 퍼옥시다아제 효소 정지 용액으로서 바람직하게 사용될 수 있다. 대안적으로, 효소 라벨로서 알칼리성 포스파타제 및 발색 기질로서 PNPP (파라-니트로페닐포스페이트)가 사용될 수 있다. 니트로페놀의 황색 색상은 405 nm에서 측정할 수 있다. 이 반응은 수산화 나트륨을 첨가함으로써 정지된다.

또한, 바이오마커의 양을 결정하는 다른 방법은, 특히 RIA (방사선 면역분석), 폴리아크릴아미드 겔에 대한 웨스턴 블롯, 면역학적 블롯, 및 면역조직화학 염색이 검토된다. 상기 키트는 당해분야에 잘 알려진 바와 같이 바이오마커의 정량적 결정을 위해 검토되는 특수한 방법에 적합하다.

상기 제제는, 상기 mRNA에 상보적인 서열을 가져서 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 분자 또는 그 단편을 포함할 수 있다. 이 DNA 분자 또는 그 단편은 상기 언급된 표지와 융합되어 검출을 용이하게 할 수 있다. 아니면, 상기 제제는, 상기 mRNA에 결합하여 상기 mRNA를 증폭시키는 기능을 하는 프라이머쌍을 포함할 수 있다. 상기 프라이머쌍은 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함한다. mRNA 증폭을 통해 mRNA의 검출을 가능하도록 한다.

다른 측면에서 본 발명은, 암의 존재 또는 암의 발병 가능성을 검출하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은, 대상의 생물학적 시료 내의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하며, 상기 단백질은 서열번호 11 내지 19 중 어느 한 서열을 포함하며, 상기 단백질은 암의 존재 또는 암의 발병 가능성을 나타내는 바이오마커인 조성물이다. 상기 제제는 상기 언급된, 암 검출을 위한 항체 또는 그 단편을 포함할 수 있다. 상기 단편은 상기 항체의 특이적 항원 결합능을 보유한 단편이다. 상기 항체 또는 그 단편은 항원, 즉 바이오마커와 결합하여 항원-항체 복합체를 형성하며, 그 형성된 항원-항체 복합체의 양을 정량함으로써 암과 관련된 정보를 제공할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 방법은, 상기 측정된 발현 수준이 정상 대조군의 기준 레벨에 비해 10% 이상 높은 경우 암이 존재하거나 암의 발병 가능성이 있는 것으로 판정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 다른 일 실시예에 있어서, 상기 판정하는 단계는, 상기 측정된 발현 수준이 컷오프 레벨에 비해 높은 경우 암이 존재하거나 암의 발병 가능성이 있는 것으로 판정하는 것일 수 있다. 암이 존재하거나 암의 발병 가능성이 있는 것으로 판정하기 위한 기준은, 예컨대, 상기 측정된 발현 수준이 정상 대조군의 평균값인 기준 레벨에 비해 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상 높은 것일 수 있다.

본 명세서에서 정의된 바와 같은 9개의 바이오마커 중 둘 이상의 마커를 함께 측정하는 경우, 암을 진단하거나 암의 발병 위험을 결정하는 정확도는 물론 중증 암의 존재를 결정하는 정확도가 매우 높아진다. 특히 9개의 바이오마커 중 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상 또는 9개 전부의 바이오마커를 동시에 검출하면 정확도를 더욱 높일 수 있다.

본 명세서에 따른 바이오마커는 당해 분야에 공지된 다른 바이오마커와 결합될 수 있다. 당업계에는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 바이오마커와 결합될 수 있는 적절한 바이오마커들이 잘 알려져 있다.

본 명세서에 따른 바이오마커의 레벨 또는 양의 측정은 공지의 방법으로 수행한다. 예를 들면, 단백질 수준에 대한 레벨 또는 양을 측정하는 경우에, 면역 분석은 예를 들어 ELISA, RIA, 방사선 면역 확산, 웨스턴 블롯, 오우크테를로니 (Ouchterlony) 면역 확산, 로켓 면역 전기 영동, 면역조직염색, 면역 침강 분석, 보체 결합 분석, FACS 및 단백질 칩 분석 뿐만 아니라 면역 형광 분석, 다중 면역 분석, 라인 분석 또는 도트 로트 분석을 수행한다.

바람직한 실시형태에서는 ELISA를 수행한다. 바이오마커의 레벨 또는 양을 측정하기 위한 측정 수단의 전형적인 예는 단백질 특이적 항체를 포함한다. 특이적 분자 항체는 당해 기술분야에 공지되어 있거나 또는 당해 분야에 기술된 방법에 기초하여 용이하게 제조할 수 있다. 단백질 레벨을 측정하는 것은 항체와 같은 단백질에 특이적으로 결합하는 측정 수단으로 단백질의 양을 측정하는 것을 의미한다. 상기 측정 방법은 상술한 방법 중 어느 하나에 정의되어 있을 수 있다. 일반적으로 상기 방법은 항원 항체 복합체를 형성하는 것 및 공지의 방법에 의해 복합체를 결정하는 것을 포함한다.

항원-항체 복합체 형성의 양은 바이오마커 단백질의 발현 라벨 또는 검출 라벨의 신호 크기를 측정함으로써 결정할 수 있다. 즉, 항체는, 이로 제한되지 않지만, 효소, 형광 마커, 리간드, 발광체, 미립자 및 레독스 분자의 그룹을 포함하는 당해분야에 공지된 검출 라벨로 표지할 수 있다. 검출 라벨로서 사용할 수 있는 효소의 예는, 이로 제한되지 않지만, D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코스옥시다제, 헥소키나제, GDP아제, RN아제, 루시퍼라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 아스파테이트 아미노트란스페라제, 및 포스포에놀피루베이트 데카르복실라제를 포함한다. 형광 바이오마커의 예는, 이로 제한되지 않지만, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌 및 플루오레사민을 포함한다. 리간드의 예는, 이로 제한되지 않지만, 비오틴, 아비딘, 및 비오틴 및 아비딘 유도체를 포함한다.

상술한 바와 같이, 상기 언급된 단백질 바이오마커로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단백질의 종류의 레벨을 측정하기 위하여, 본 발명은 바이오마커 단백질에 특이적인 작용제, 예를 들면, 항체를, 바람직하게는 모노클로날 항체, 재조합 항체 또는 항체 단편의 형태로 포함하는 조성물을 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 상기 생물학적 시료에서 측정된 암 바이오마커의 레벨 또는 양을 상기 바이오마커의 기준 레벨 또는 양과 비교하는 단계를 포함한다. 상기 기준 레벨은

a) 암을 앓고 있지 않는 집단으로부터 얻어진 평균 레벨 또는 중간 레벨; 및/또는

b) 암 환자를 포함하는 개체의 군으로부터 얻어진 평균 또는 중간 레벨이다.

또 다른 구현예에서, 바이오마커의 레벨 또는 양은 각각 컷오프 레벨 이상 또는 이하인지에 따라 암 발병 여부가 결정될 수 있다.

상기 언급된 본 발명의 암은 p53의 전사 활성(transcriptional activity) 억제에 기인한 암일 수 있다. 더 구체적으로, 본 명세서에서의 암은 p53과의 직접 결합을 통해 p53의 전사 활성(transcriptional activity)을 억제시킴으로써 발생하는 암일 수 있다.

정상세포가 악성 형질전환되기 위해서는 ‘자체 분열신호의 획득’이 필수적이다. 이를 위해서는 H-Ras 등 ‘세포분열을 촉진하는 종양유전자 (mitogenic oncogene)’들의 활성화가 필수적이다. 그러나 정상세포에서는 H-Ras 등이 활성화된다 하더라도 악성 형질전환이 일어나지 않으며, 오히려 세포노화가 일어나서 세포의 분열이 영구히 정지된다. 이와 같이 정상세포에서 세포분열을 촉진하는 종양유전자가 활성화되는 경우에 조기 세포노화가 유도되는 현상을 ‘종양유전자-유도성 세포노화 (oncogene-induced senescence, OIS)’라 한다. 종양유전자-유도성 세포노화는 세포분열을 촉진하는 종양유전자가 활성화된 위험한 세포의 분열을 영구히 정지시킴으로써, (i) 세포의 악성 형질전환을 막고, (ii) 개체수준에서도 암발생을 억제하는 중요한 기전으로 생각되고 있다.

p53은 종양유전자-유도성 세포노화에서도 핵심적인 역할을 한다. 만약 H-Ras와 같이 세포분열을 촉진하는 종양유전자가 활성화된 상황에서 p53의 세포노화 기능이 불활성화되는 경우에는 악성 형질전환이 일어날 수 있다. 예를 들면, 설치류의 정상세포인 mouse embryonic fibroblasts (MEFs) 또는 rat embryonic fibroblasts (REFs)에서 H-RasV12를 과발현시키면 종양유전자-유도성 세포노화가 일어나는데, 이때 p53을 불활성화시키면 세포노화가 일어나지 않고 세포가 계속 분열하면서 악성 형질전환이 일어난다). 인간의 섬유아세포(human diploid fibroblasts, HDFs)에서도 H-RasV12, Mos, Cdc6 등 세포분열을 촉진하는 종양유전자를 과발현시키면 종양유전자-유도성 세포노화가 일어나는데, 이때 p53을 불활성화시키면 세포노화가 일어나지 않고 세포가 계속 분열한다. 단, 인간 세포의 경우에는 (i) p53의 불활성화와 함께, (ii) pRb의 불활성화, (iii) telomerase의 활성화가 동시에 되어야 악성 형질전환이 일어난다

기존의 ‘p53의 불활성화’ 방법은 다음과 같은 점에서 한계를 가지고 있다고 생각된다.

(i) p53 siRNA는 실제 발생할 가능성이 없는 것이다.

(ii) p53 dominant negative mutant는 p53의 돌연변이를 동반하는 암의 모델로서 의미가 있으며, 전체 암의 약 50%에 달하는 p53의 기능적 불활성화 모델로서는 적합하지 않다.

(iii) SV40 LT는 p53을 기능적으로 불활성화 시키지만, SV40가 아직 인간에서 종양을 일으키는지 여부가 불분명하다.

(iv) HPV의 E6도 p53을 기능적으로 불활성화 시키지만, HPV는 특수한 상황에서 자궁경부암 등 특정 장기의 암발생에 관련이 있다.

(v) Mdm-2가 p53을 기능적으로 불활성화 시키는 대표적인 세포성 종양유전자이지만, 그 외에는 거의 알려진 바가 없다.

본 명세서에 따른 악성 형질전환 모델은 상기와 같은 한계를 극복한 새로운 악성 형질전환 모델이 될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어들은 특정 구체예들을 설명하기 위한 목적으로만 의도된 것이지 본 발명을 한정하고자 하는 의도가 아니다. 명사 앞에 개수가 생략된 용어는 수량을 제한하고자 하는 것이 아니라 언급된 명사 물품이 하나 이상 존재하는 것을 나타내는 것이다. 용어 "포함하는", "갖는", 및 "함유하는"은 열린 용어로 해석된다(즉, "포함하지만 이에 한정되지는 않는"의 의미).

수치의 범위를 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별개의 수치들을 개별적으로 언급하는 것을 대신하는 쉬운 방법이기 때문이며, 그것이 아님이 명시되어 있지 않는 한, 각 별개의 수치는 마치 개별적으로 명세서에 언급되어 있는 것처럼 본 명세서에 통합된다. 모든 범위의 끝 값들은 그 범위 내에 포함되며 독립적으로 조합 가능하다.

본 명세서에 언급된 모든 방법들은 달리 명시되어 있거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 적절한 순서로 수행될 수 있다. 어느 한 실시예 및 모든 실시예 또는 예시적 언어 (예컨대, "~과 같은")를 사용하는 것은, 청구범위에 포함되어 있지 않는 한, 단지 본 발명을 더 잘 기술하기 위함이지 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 명세서의 어떤 언어도 어떤 비청구된 구성요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 해석되어져서는 아니된다. 다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용되는 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 사람에 의해 통상 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구체예들은 본 발명을 수행하기 위해 발명자에게 알려진 가장 최적의 모드를 포함한다. 바람직한 구체예들의 변이들이 앞선 기재를 읽으면 당업자에게 명백하게 될 수 있다. 본 발명자들은 당업자들이 그러한 변이를 적절히 이용하길 기대하고, 발명자들은 본 명세서에 기재된 것과 다른 방식으로 본 발명이 실시되기를 기대한다. 따라서, 본 발명은, 특허법에 의해 허용되는 것과 같이, 첨부된 특허청구범위에서 언급된 발명의 요지의 균등물 및 모든 변형들을 포함한다. 더욱이, 모든 가능한 변이들 내에서 상기 언급된 구성요소들의 어떤 조합이라도 여기서 반대로 명시하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 예시적인 구체예들을 참조하여 구체적으로 나타내어지고 기술되었지만, 당업자들은 하기 청구범위에 의해 정의되는 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서도 형태 및 디테일에서 다양한 변화가 행해질 수 있음을 잘 이해할 것이다.

실시예 1: p53에의 결합 여부 실험

실험군으로서 서열번호 1 내지 9의 cDNA 서열을 준비하고 음성대조군으로서 p53에 결합하지 않는 것으로 알려진 SV40으로부터 유래된 cDNA 서열을 준비하였다. SV40으로부터 유래된 cDNA 서열 및 단백질 서열은 다음과 같다:

SV40의 cDNA 서열 (서열번호 10)	1 atggataaag ttttaaacag agaggaatct ttgcagctaa tggaccttct aggtcttgaa 61 aggagtgcct gggggaatat tcctctgatg agaaaggcat atttaaaaaa atgcaaggag 121 tttcatcctg ataaaggagg agatgaagaa aaaatgaaga aaatgaatac tctgtacaag 181 aaaatggaag atggagtaaa atatgctcat caacctgact ttggaggctt ctgggatgca 241 actgag
SV40의 단백질 서열 (서열번호 20)	1 mdkvlnrees lqlmdllgle rsawgniplm rkaylkkcke fhpdkggdee kmkkmntlyk 61 kmedgvkyah qpdfggfwda te

또한, 양성대조군으로서 p53의 기능을 조절하는 것으로 알려진 단백질의 cDNA 서열을 준비하였다. 대조군을 포함한 총 11종의 cDNAs를 PCR primer를 디자인하여 pGEX-6P-2 벡터에 클로닝하고 DNA sequencing으로 확인하였다.GST와 융합시킨 후 p53과의 결합 실험을 수행하기 위하여, SK-N-SH 세포(ATCC^® HTB-11™)에 독소루비신(doxorubicin)을 처리하여 p53의 양을 증가시킨 다음, 세포 추출물을 얻고, 이를 사용하여 GST pull-down assay를 시행하였다.

그 결과, 예상대로 음성대조군은 p53에 결합하지 않았고, 양성대조군은 p53에 결합하였다(도 1). 또한, 본 발명의 일실시예들에 따른 서열번호 1 내지 9의 cDNA 서열들이 발현된 단백질, 즉 서열번호 11 내지 19의 단백질들은 모두 p53에 결합하는 것이 관찰되었다(도 2).

실시예 2: p53의 전사활성 억제 실험

p53의 전사활성(transcriptional activity)은 p53의 세포주기 정지, DNA 손상 수복, 세포사멸, 세포노화 기능 등의 바탕이 되는 핵심적인 기능이다. 본 발명의 일실시예들에 따른 단백질들이 p53과의 결합을 통해 p53의 전사활성 기능을 조절하는지를 알아보기 위하여, 대조군을 포함한 총 11종의 단백질을 PCR primer를 디자인하여 pCS2-6myc 벡터에 클로닝하고 DNA sequencing으로 확인하였다.

Myc 태깅된 단백질이 p53의 전사활성 기능을 조절하는지를 알아보기 위하여, p53이 없는 Saos-2 세포주에 p21-Luc (luciferase-fused p21 promoter), human p53 cDNA와 함께 11가지 myc 태깅된 cDNA를 농도별로 주입(transfection)하고 luciferase 활성을 측정하였다. 실험 결과 서열번호 11 내지 19의 단백질 모두가 p53의 전사활성을 억제하는 것을 관찰할 수 있었다(도 3).

한편, 음성대조군과 양성대조군 모두 p53의 전사활성을 억제하는 것도 관찰되었다. 음성대조군은 p53에 결합하지 않으면서 p53의 전사활성을 억제하는 것이므로, p53을 억제하는 다양한 기전이 있음을 나타낸다.

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Cancer biomarker, diagnosis for cancer, and transformed model using the biomarker <130> 16p661/ind <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 210 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggctaacg tggctgacac gaagctgtac gacatcctgg gcgtcccgcc cggcgccagc 60 gagaacgagc tgaagaaggc atacagaaag ttagccaagg aatatcatcc tgataagaat 120 ccaaatgcag gagacaaatt taaagaaata agttttgcat atgaagtact atcaaatcct 180 gagaagcgtg agttatatga cagatacgga 210 <210> 2 <211> 240 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ttggccaaag aagattatta tcagatatta ggagtgcctc gaaatgccag ccagaaagag 60 atcaagaaag cctattatca gcttgccaag aagtatcacc ctgacacaaa taaggatgat 120 cccaaagcca aggagaagtt ctcccagctg gcagaagcct atgaggtttt gagtgatgag 180 gtgaagagga agcagtacga tgcctacggc tctgcaggct tcgatcctgg ggccagcggc 240 240 <210> 3 <211> 240 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 aagatggtga aggagaccca gtactatgac atcctgggcg tgaagcccag cgcgtccccg 60 gaggagatca agaaggccta tcggaagctg gcgctcaagt accacccgga caagaacccg 120 gatgagggcg agaagtttaa actcatatcc caggcatatg aagtgctttc agatccaaag 180 aaaagggatg tttatgacca aggcggagag caggcaatta aagaaggagg ctcaggcagc 240 240 <210> 4 <211> 210 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgggtaaag actactacca gacgttgggc ctggcccgcg gcgcgtcgga cgaggagatc 60 aagcgggcct accgccgcca ggcgctgcgc taccacccgg acaagaacaa ggagcccggc 120 gccgaggaga agttcaagga gatcgctgag gcctacgacg tgctcagcga cccgcgcaag 180 cgcgagatct tcgaccgcta cggggaggaa 210 <210> 5 <211> 210 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atggggaaag actattattg cattttggga attgagaaag gagcttcaga tgaagatatt 60 aaaaaggctt accgaaaaca agccctcaaa tttcatccgg acaagaacaa atctcctcag 120 gcagaggaaa aatttaaaga ggtcgcagaa gcttatgaag tattgagtga tcctaaaaag 180 agagaaatat atgatcagtt tggggaggaa 210 <210> 6 <211> 210 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ggacgagatt tctataagat cttgggggtg cctcgaagtg cctctataaa ggatattaaa 60 aaggcctata ggaaactagc cctgcagctt catcccgacc ggaaccctga tgatccacaa 120 gcccaggaga aattccagga tctgggtgct gcttatgagg ttctgtcaga tagtgagaaa 180 cggaaacagt acgatactta tggtgaagaa 210 <210> 7 <211> 240 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tggaagaacc aagatcatta tgcagttctt ggacttggcc atgtgagata caaggctaca 60 cagagacaga tcaaagcagc tcataaagca atggttttaa aacatcaccc agacaaacgg 120 aaagcagctg gtgaaccaat aaaagaagga gataatgact acttcacttg cataactaaa 180 gcttatgaaa tgttatctga tccagtgaaa agacgagcat ttaacagtgt agatcctact 240 240 <210> 8 <211> 210 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ggagaagctc tatacgaaat tcttggtctg cataagggag catcaaatga agaaattaag 60 aaaacctaca gaaaattggc cctgaaacac catccagaca agaatccaga tgatccagct 120 gctactgaga agtttaaaga aatcaacaac gcccacgcaa tacttaccga catttcaaag 180 agaagcatat acgacaagta cggatcgctg 210 <210> 9 <211> 240 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 caggattttt acagtttact tggagtgtcc aaaactgcaa gcagtagaga aataagacaa 60 gctttcaaga aattggcatt gaagttacat cctgataaaa acccgaataa cccaaatgca 120 catggcgatt ttttaaaaat aaatagagca tatgaagtac tcaaagatga agatctacgg 180 aaaaagtatg acaaatatgg agaaaaggga cttgaggata atcaaggtgg ccagtatgaa 240 240 <210> 10 <211> 246 <212> DNA <213> Simian virus 40 <400> 10 atggataaag ttttaaacag agaggaatct ttgcagctaa tggaccttct aggtcttgaa 60 aggagtgcct gggggaatat tcctctgatg agaaaggcat atttaaaaaa atgcaaggag 120 tttcatcctg ataaaggagg agatgaagaa aaaatgaaga aaatgaatac tctgtacaag 180 aaaatggaag atggagtaaa atatgctcat caacctgact ttggaggctt ctgggatgca 240 actgag 246 <210> 11 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Ala Asn Val Ala Asp Thr Lys Leu Tyr Asp Ile Leu Gly Val Pro 1 5 10 15 Pro Gly Ala Ser Glu Asn Glu Leu Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala 20 25 30 Lys Glu Tyr His Pro Asp Lys Asn Pro Asn Ala Gly Asp Lys Phe Lys 35 40 45 Glu Ile Ser Phe Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asn Pro Glu Lys Arg Glu 50 55 60 Leu Tyr Asp Arg Tyr Gly 65 70 <210> 12 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Leu Ala Lys Glu Asp Tyr Tyr Gln Ile Leu Gly Val Pro Arg Asn Ala 1 5 10 15 Ser Gln Lys Glu Ile Lys Lys Ala Tyr Tyr Gln Leu Ala Lys Lys Tyr 20 25 30 His Pro Asp Thr Asn Lys Asp Asp Pro Lys Ala Lys Glu Lys Phe Ser 35 40 45 Gln Leu Ala Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Glu Val Lys Arg Lys 50 55 60 Gln Tyr Asp Ala Tyr Gly Ser Ala Gly Phe Asp Pro Gly Ala Ser Gly 65 70 75 80 <210> 13 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Lys Met Val Lys Glu Thr Gln Tyr Tyr Asp Ile Leu Gly Val Lys Pro 1 5 10 15 Ser Ala Ser Pro Glu Glu Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu 20 25 30 Lys Tyr His Pro Asp Lys Asn Pro Asp Glu Gly Glu Lys Phe Lys Leu 35 40 45 Ile Ser Gln Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Pro Lys Lys Arg Asp Val 50 55 60 Tyr Asp Gln Gly Gly Glu Gln Ala Ile Lys Glu Gly Gly Ser Gly Ser 65 70 75 80 <210> 14 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser 1 5 10 15 Asp Glu Glu Ile Lys Arg Ala Tyr Arg Arg Gln Ala Leu Arg Tyr His 20 25 30 Pro Asp Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile 35 40 45 Ala Glu Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Pro Arg Lys Arg Glu Ile Phe 50 55 60 Asp Arg Tyr Gly Glu Glu 65 70 <210> 15 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Cys Ile Leu Gly Ile Glu Lys Gly Ala Ser 1 5 10 15 Asp Glu Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Gln Ala Leu Lys Phe His 20 25 30 Pro Asp Lys Asn Lys Ser Pro Gln Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Val 35 40 45 Ala Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Pro Lys Lys Arg Glu Ile Tyr 50 55 60 Asp Gln Phe Gly Glu Glu 65 70 <210> 16 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gly Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val Pro Arg Ser Ala Ser Ile 1 5 10 15 Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His Pro 20 25 30 Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gln Asp Leu 35 40 45 Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser Glu Lys Arg Lys Gln Tyr 50 55 60 Asp Thr Tyr Gly Glu Glu 65 70 <210> 17 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Trp Lys Asn Gln Asp His Tyr Ala Val Leu Gly Leu Gly His Val Arg 1 5 10 15 Tyr Lys Ala Thr Gln Arg Gln Ile Lys Ala Ala His Lys Ala Met Val 20 25 30 Leu Lys His His Pro Asp Lys Arg Lys Ala Ala Gly Glu Pro Ile Lys 35 40 45 Glu Gly Asp Asn Asp Tyr Phe Thr Cys Ile Thr Lys Ala Tyr Glu Met 50 55 60 Leu Ser Asp Pro Val Lys Arg Arg Ala Phe Asn Ser Val Asp Pro Thr 65 70 75 80 <210> 18 <211> 69 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Glu Ala Leu Tyr Glu Ile Leu Gly Leu His Lys Gly Ala Ser Asn Glu 1 5 10 15 Glu Ile Lys Lys Thr Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys His His Pro Asp 20 25 30 Lys Asn Pro Asp Asp Pro Ala Ala Thr Glu Lys Phe Lys Glu Ile Asn 35 40 45 Asn Ala His Ala Ile Leu Thr Asp Ile Ser Lys Arg Ser Ile Tyr Asp 50 55 60 Lys Tyr Gly Ser Leu 65 <210> 19 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gln Asp Phe Tyr Ser Leu Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala Ser Ser Arg 1 5 10 15 Glu Ile Arg Gln Ala Phe Lys Lys Leu Ala Leu Lys Leu His Pro Asp 20 25 30 Lys Asn Pro Asn Asn Pro Asn Ala His Gly Asp Phe Leu Lys Ile Asn 35 40 45 Arg Ala Tyr Glu Val Leu Lys Asp Glu Asp Leu Arg Lys Lys Tyr Asp 50 55 60 Lys Tyr Gly Glu Lys Gly Leu Glu Asp Asn Gln Gly Gly Gln Tyr Glu 65 70 75 80 <210> 20 <211> 82 <212> PRT <213> Simian Virus 40 <400> 20 Met Asp Lys Val Leu Asn Arg Glu Glu Ser Leu Gln Leu Met Asp Leu 1 5 10 15 Leu Gly Leu Glu Arg Ser Ala Trp Gly Asn Ile Pro Leu Met Arg Lys 20 25 30 Ala Tyr Leu Lys Lys Cys Lys Glu Phe His Pro Asp Lys Gly Gly Asp 35 40 45 Glu Glu Lys Met Lys Lys Met Asn Thr Leu Tyr Lys Lys Met Glu Asp 50 55 60 Gly Val Lys Tyr Ala His Gln Pro Asp Phe Gly Gly Phe Trp Asp Ala 65 70 75 80 Thr Glu

Claims

항암제 스크리닝 방법으로서,
상기 방법은,
서열번호 16의 서열을 포함하는 단백질이 p53에 결합하는 과정을 후보물질이 저해하는지의 여부를 검출하는 것 및 서열번호 16의 서열을 포함하는 단백질이 p53의 전사 활성(transcriptional activity)을 억제하는 과정을 후보물질이 저해하는지의 여부를 검출하는 것 중 하나 이상을 수행하는 단계; 및
상기 후보물질이 상기 과정을 저해하면 항암제로서 판정하는 단계를 포함하는, 항암제 스크리닝 방법.
악성 형질전환 모델로서,
상기 모델은, p53 유전자의 돌연변이 없이 p53이 기능적으로 불활성화된 모델이며,
상기 모델은, 서열번호 16의 서열을 포함하는 단백질이 p53과 결합하여 p53의 전사 활성(transcriptional activity)을 억제하는 모델이며,
상기 모델은, 세포인, 또는 영장류를 제외한 동물인, 모델.