ES2533769T9

ES2533769T9 - Derivados de ácidos nucleicos peptídicos con buena penetración celular y fuerte afinidad por el ácido nucleico

Info

Publication number: ES2533769T9
Application number: ES09719041.7T
Authority: ES
Inventors: Shin Chung; Jong-Ook Lee; Heui-Yeon Kim; Hyun-Jin Park; Mi-Ran Kim
Original assignee: CTI Bio
Current assignee: CTI Bio
Priority date: 2008-03-14
Filing date: 2009-03-13
Publication date: 2016-05-13
Anticipated expiration: 2029-03-13
Also published as: IL236513A0; IL207617A; CA2715844A1; AU2009224149B2; CA2715844C; KR20110010691A; EP2268607B9; KR101598423B1; US20140155604A1; WO2009113828A9; US8859766B2; CN102015628A; MX2010009687A; US8895734B2; US8680253B2; DK2268607T3; JP2011518770A; PL2268607T3; WO2009113828A3; US8884008B2

Description

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Descripcion

Derivados de acidos nucleicos peptidicos con buena penetracion celular y fuerte afinidad por el acido nucleico.

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a derivados de acidos nucleicos peptidicos qmmicamente modificados para mostrar buena penetracion celular y fuerte afinidad por el acido nucleico.

Breves descripciones de los dibujos

La Figura 1 proporciona los cromatogramas de HPLC antes y despues de la purificacion del Oligo 17 por HPLC de fase inversa.

La Figura 2 proporciona un espectro de masa MALDI-TOF para un lote purificado del Oligo 17.

La Figura 3 proporciona graficos de cambios de absorbancia con la temperatura para el Oligo 17 contra el ADN complementario o no coincidente.

Las Figura 4(a) y 4(b) proporcionan imagenes de microscopfa confocal (al objetivo 63x) 1, 2, 3 y 24h despues de que celulas HeLa se trataron con el Oligo 1 y el Oligo 2 a 5|jM, respectivamente.

Las Figuras 5(a) y 5(b) proporcionan imagenes de microscopfa confocal (al objetivo 63x) 0.5 y 1h despues de que celulas MCF-7 se trataron con el Oligo 6y el Oligo 7 a 2.5jM, respectivamente.

Las Figuras 6(a) y 6(b) proporcionan imagenes de microscopfa confocal (al objetivo 40x) 6 o 24h despues de que las celulas HeLa se trataron con el Oligo 1 y el Oligo 6 a 1jM, respectivamente.

Las Figuras 7(a) y 7(b) proporcionan imagenes de microscopfa confocal (objetivo 40x) 24h despues de que las celulas JAR se trataron con el Oligo 21 y el Oligo 28 a 2jM, respectivamente.

Las Figuras 7(c) y 7(d) proporcionan imagenes de microscopfa confocal (al objetivo 40x) 24h despues de que las celulas A549 se trataron con el Oligo 21 y el Oligo 28 a 2jM, respectivamente.

Las Figuras 7(e) y 7(f) proporcionan imagenes de microscopfa confocal (al objetivo 40x) 12h despues de que las celulas HeLa se trataron con el Oligo 21 y el Oligo 28 a 2jM, respectivamente.

La Figura 7(g) proporciona imagenes de microscopfa confocal (al objetivo 40x) 24h despues de que las celulas HeLa se trataron con el Oligo 21 a 2jM.

Las Figuras 8(a), 8(b) y 8(c) proporcionan imagenes de microscopfa confocal (al objetivo 40x) 24h despues de que las celulas HeLa, A549, y jAr se trataron con 2jM delOligo 22, respectivamente.

La Figura 9 proporciona resultados de la transferencia de tipo Western para celulas JAR tratadas con 5jM o 10jM del Oligo 9, 5jM o 10jM del Oligo 10, cotratamiento con los oligomeros a 5jM o 10jM cada uno, y blanco (sin tratamiento con oligomero).

La Figura 10 es la estructura representativa de los oligomeros de PNA de esta invencion.

Antecedentes de la invencion

Los oligonucleotidos se han usado para diversos propositos biologicos que incluyen la inhibicion antisentido de la expresion genetica, PCR (reaccion en cadena de la polimerasa), analisis diagnostico por chips de genes, y asf sucesivamente. A partir de que los oligonucleotidos interaction de una forma espedfica por la secuencia con acidos nucleicos tales como ADN y ARN ellos son muy utiles para modular predeciblemente procesos biologicos que involucran ADN o ARN dentro de la celula. A diferencia de los farmacos pequenas moleculas, sin embargo los oligonucleotidos no penetran rapidamente las membranas de las celula de mairnferos, y por lo tanto apenas afectan los procesos biologicos dentro de las celula a menos que se modifiquen o formulen apropiadamente para penetrar rapidamente la membrana plasmatica.

Proternas como objetivos de farmaco: Las proternas median diversas funciones celulares. No sena sorprendente encontrar que la mayona de los farmacos comerciales actualmente muestran actividad terapeutica por la modulacion de funciones de la proterna(s) Por ejemplo, el farmaco antiinflamatorio no esteroide aspirina inhibe las enzimas llamadas ciclooxigenasas para su actividad antiinflamatoria. El Losartan se une a y antagoniza la funcion de un receptor de transmembrana llamado receptor de angiotensina II para su actividad antihipertensiva. La Rosiglitazona activa selectivamente un receptor intracelular llamado receptor y activado por proliferador de peroxisoma (PPARy) para provocar su actividad antidiabetica. El Etanercept es una proterna de fusion que se une a una citocina llamada factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), y neutraliza la actividad biologica del TNF-a para su actividad anti-reumatica. El Herceptin es un anticuerpo monoclonal para el tratamiento del cancer de mama por la union selectiva al erbB2 sobre-expresado en ciertos tipos de celulas de cancer de mama.

Inhibicion antisentido de la sintesis de proterna: Las proternas se codifican por el ADN (acido nucleico 2- deoxiribosa). En respuesta a la estimulacion celular, el ADN se transcribe para producir el pre-ARNm (acido ribonucleico pre-mensajero) en el nucleo. La porcion(s) intron del pre-ARNm se empalma enzimaticamente lo que produce el ARNm (acido ribonucleico mensajero), que despues se transloca al compartimiento citosolico. En el citosol, un complejo de la maquinaria traduccional llamado ribosoma se une al ARNm y lleva a cabo la sintesis de proterna a medida que detecta

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la informacion genetica codificada por el ARNm.(Biochemistry vol 41,4503-4510, 2002;Cancer Res. vol 48, 2659-2668, 1988).

Un oligonucleotido que se une al ARNm o pre-ARNm en una manera espedfica por la secuencia se llama oligonucleotido antisentido (AO). AO puede unirse fuertemente a un ARNm e inhibir la smtesis de protema por el ribosoma a lo largo del ARNm en el citosol. AO necesita estar presente dentro de la celula con el fin de inhibir la smtesis de su protema objetivo. AO puede unirse fuertemente a un pre-ARNm en el nucleo y afectar el empalme del pre-ARNm, lo que produce un ARNm de secuencia alterada y consecuentemente una protema alterada.

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Oligonucleotidos no naturales: Los oligonucleotidos de ADN o ARN son susceptibles a la degradacion por las endonucleasas endogenas, lo que limita su utilidad terapeutica. Hasta la fecha, muchos tipos de oligonucleotidos no naturales se han desarrollado y estudiado intensivamente. (Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540, 2006) Algunos de ellos muestran una estabilidad metabolica prolongada en comparacion al ADN y el ARN. Se proporcionaron anteriormente estructuras qmmicas para algunos de los oligonucleotidos no naturales representativos. Tales oligonucleotidos predeciblemente se unen a un acido nucleico complementario como hacen el ADN o el ARN.

El oligonucleotido fosforotioato (PTO) es un analogo del ADN con uno de los atomos de oxfgeno de la cadena principal de fosfato remplazado con un atomo de azufre por monomero. Tal cambio estructural pequeno hace a PTO comparativamente resistente a la degradacion por nucleasas. (Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367-402, 1985).

Para reflejar la similitud estructural de PTO y ADN, ambos penetran pobremente la membrana celular en la mayona de los tipos celulares de mairnferos. Para algunos tipos de celulas que expresan abundantemente transportador(es) para el ADN, sin embargo, ADN y PTO muestran buena penetracion celular. Los PTO administrados sistemicamente se conoce que se distribuyen rapidamente al hngado y al rinon. (Nucleic Acids Res. vol 25, 3290-3296, 1997).

Con el fin de facilitar la penetracion celular de PTO in vitro, se practica popularmente la lipofeccion. Sin embargo, la lipofeccion altera ffsicamente la membrana celular, causa citotoxicidad, y por lo tanto no sena ideal para el uso terapeutico a largo plazo.

Durante los ultimos 20 anos, los PTO antisentido y variantes de PTO se evaluaron clmicamente para tratar canceres, trastornos inmunologicos, enfermedades metabolicas, y asf sucesivamente. (Biochemistry vol. 41, 4503-4510, 2002;Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540, 2006) Muchos de tales farmacos antisentido candidatos no han tenido exito debido en parte a la pobre penetracion celular de PTO. Con el fin de superar la pobre penetracion celular, se necesita administrar el PTO a una dosis alta para la actividad terapeutica. Sin embargo, se conoce que los PTO se asocian con toxicidades dependientes de la dosis tales como aumento del tiempo de coagulacion, activacion del complemento, nefropatfa tubular, activacion de las celulas de Kupffer, y estimulacion inmune que incluye esplenomegalia, hiperplasia linfoide, infiltracion de celulas mononucleares. (Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540, 2006).

Se encontro que muchos PTO antisentido muestran una actividad clinica adecuada para enfermedades con una contribucion significativa del hngado y el rinon. ISIS-301012 (mipomersen) es un analogo de PTO que inhibe la smtesis de apoB-100, una protema involucrada en el transporte del colesterol por las LDL. Mipomersen manifiesta actividad clmica adecuada en una cierta poblacion de pacientes de aterosclerosis probablemente debido a su distribucion preferencial al hngado. (
www.medscape.com/viewarticle/556073: Consultada el 19 febrero de 2009) ISIS-113715 es un analogo del PTO antisentido que inhibe la smtesis de la protema tirosina fosfatasa 1B (PTP1B), y se encontro que muestra actividad terapeutica en pacientes de diabetes tipo II. (Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331-336, 2004).

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En el oligonucleotido fosforamidita morfolino (PMO), la cadena principal de fosfato y 2-deoxirribosa de ADN se remplazan con fosforamidita y morfolina, respectivamente. (Appl. Microbiol. Biotechnol. vol 71, 575-586, 2006) Mientras que la cadena principal del ADN esta cargada negativamente, la cadena principal de PMO no esta cargada. As^ la union entre PMO y ARNm esta libre de repulsiones electrostaticas entre las cadenas principales, y tiende a ser mas fuerte que entre el ADN y el ARNm. A partir de que PMO es estructuralmente muy diferente del ADN, transportador(es) hepaticos que reconocen el ADN no debenan reconocer a PMO. Sin embargo, el PMO no penetra rapidamente la membrana celular.

El acido nucleico peptfdico (PNA) es un polipeptido con N-(2-aminoetil)glicina como la cadena principal de la unidad, y se descubrio por Nielsen y colaboradores. (Science vol 254, 1497-1500, 1991) Como el ADN y el ArN, PNA ademas se une selectivamente al acido nucleico complementario [Nature (Londres) vol 365, 566-568, 1992] Al igual que PMO, la cadena principal de PNA no esta cargada. Asf la union entre PNA y ARN tiende a ser mas fuerte que aquella entre ADN y ARN. A partir de que PNA es estructuralmente notablemente diferente del ADN, el transportador hepatico que reconoce ADN no debena reconocer a PNA, y mostrana un perfil de distribucion en los tejidos muy diferente al de aDn o PTO. Sin embargo, PNA ademas penetra pobremente las membranas celulares de mairnferos. (Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280, 2003).

En el acido nucleico bloqueado (LNA), el anillo de ribosa de la cadena principal del ARN esta restringido estructuralmente para aumentar la afinidad de union por el ARN o el ADN. Asf, los lNa se pueden considerar como derivados de alta afinidad del ADN o el ARN. (Biochemistry vol 45, 7347-7355, 2006).

Mecanismos antisentido: El mecanismo antisentido difiere en dependencia de los tipos de AO. La ARNsa H reconoce un hnbrido de ARNm con ADN, ARN, o PTO, y degrada la porcion hnbrida del ARNm. Asf, la actividad antisentido de PTO se amplifica significativamente por la ARNsa H. Entretanto, la ARNsa H no reconoce un tnbrido de ARNm con PMO, PNA, o LNA. En otras palabras, PMO, PNA y LNA deben depender puramente del bloqueo esterico del ARNm para su actividad antisentido. (Biochemistry vol 41,4501-4510, 2002).

Para oligonucleotidos con la misma afinidad de union por el ARNm, PTO debe por lo tanto mostrar una actividad antisentido mas fuerte que PMO, PNA, y LNA. Para AO de bloqueo esterico tales como PMO, PNA, y LNA, se desea una fuerte afinidad por ARNm para la actividad antisentido.

La actividad antisentido de PNA: La afinidad de union de PNA por ARNm podna aumentar a medida que aumenta la longitud de PNA hasta un cierto punto. Sin embargo, la actividad antisentido de PNA no parece siempre aumentar con la longitud de PNA. Hubo casos en los que la actividad antisentido de PNA alcanzo la actividad maxima de 12 a 13-meros y disminuyo despues. (Nucleic acids Res. vol 32, 4893-4902, 2004) Por otro lado, la actividad antisentido optima se alcanzo con PNA de 15 a 18-meros contra un cierto ARNm, lo que refleja que la accesibilidad estructural del sitio de union objetivo del ARNm sena importante. (Biochemistry vol 40, 53-64, 2001).

En muchos casos, se ha informado que los PNA inhiben la smtesis de protema por el ribosoma a nivel micromolar bajo buenas condiciones de penetracion celular. (Science vol 258, 1481-85, 1992; Biochemistry vol 40, 7853-7859, 2001; Nucleic acids Res. vol 32, 4893-4902, 2004) Sin embargo, se encontro que los PNA dirigidos a una posicion altamente accesible del ARNm muestran actividad antisentido a nivel sub-micromolar (Neuropeptides vol 38, 316-324, 2004; Biochemistry vol 40, 53-64, 2001) o aun a un nivel sub-nanomolar (Nucleic acids Res. vol 36, 4424-4432, 2008) bajo buenas condiciones de transfeccion.

Adicionalmente a dirigirse a un sitio altamente accesible en el ARNm, se requerira una fuerte afinidad de union de PNA por el ARNm para una buena actividad antisentido. A diferencia de ADN, PTO, y LNA, la cadena principal de PNA no esta cargada. Los PNA tienden a agregar y a hacerse menos adecuados para la union al ARN segun su tamano aumenta. Se desea mejorar la afinidad de union de los PNA por el ARNm sin aumentar la longitud de PNA. La incorporacion de los monomeros de PNA con una carga puntual sena beneficiosa para prevenir la agregacion de PNA.

Estrategias de penetracion celular para PNA: Los PNA no penetran rapidamente la membrana celular y tienden a mostrar una pobre actividad antisentido a menos que se transfecten apropiadamente. En los primeros anos, la actividad antisentido de PNA se evaluo mediante microinyeccion ("Science vol 258, 1481-85, 1992) o electroporacion ("Biochemistry vol 40, 7853-7859, 2001). La microinyeccion y la electroporacion son invasivas e inapropiadas para propositos terapeuticos. Con el fin de mejorar la penetracion celular, se desarrollaron varias estrategias. (Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280, 2003; Curr. Top. Med. Chem. vol 7, 727-737, 2007).

Los PNA se suministran eficazmente dentro de la celulas por la incorporacion covalente de peptidos que penetran la celula (Neuropeptides vol 38, 316-324, 2004), lipofeccion despues de la formacion del hnbrido con un ADN complementario (Biochemistry vol 40, 53-64, 2001), lipofeccion de PNA con una 9-aminoacridina unida covalentemente. (Nucleic Acids Res. vol 32, 2695-2706, 2004), lipofeccion de PNA con aniones fosfonato unidos covalentemente (Nucleic Acids Res. vol 36, 4424-4432, 2008), y asf sucesivamente. Ademas la penetracion celular se mejoro por la

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union de PNA a una molecula lipofflica tal como adamantano (Bioconjugate Chem. vol 10, 965-972, 1999) o un grupo anfifflico tal como tetrafenil fosfonio. (Nucleic Acids Res. vol. 29, 1852-1863, 2001) Sin embargo, tal modificacion covalente es poco probable que aumente la afinidad de union por el ARNm a pesar de mejorar marcadamente la penetracion celular.

PNA con un CPP unido covalentemente: Los peptidos que penetran celulas (CPPs) son polipeptidos que muestran una buena penetracion celular, y tienen multiples cargas positivas de los residuos de arginina o lisina. Hasta la fecha se han descubierto muchos CPP tales como transportan, penetratin, NLS (senal de localizacion celular), y Tat. Se conoce que los CrPP portan eficientemente una carga unida covalentemente al interior de la celula. Los PNA con un CPP unido covalentemente ademas mostraron buena penetracion celular.

Aunque algunos PNA con un CPP unido covalentemente mostraron IC50 antisentido alrededor de 100nM (Neuropeptides vol.38, 316-324, 2004), IC50 antisentido micromolares prevalecen para tales PNA.

Los PNA con un CPP covalentemente unido se componen de dos porciones, el dominio PNA hidrofobico y el dominio CPP cargado positivamente. Tal PNA tiende a agregarse y atraparse en endosomas dentro de la celula, y no estana disponible para la inhibicion antisentido de la smtesis de protema. (Curr. Top. Med. Chem. vol 7, 727-737, 2007; Nucleic Acids Res. vol 33, 6837-6849, 2005) Ademas, un CPP de este tipo unido covalentemente apenas aumenta la afinidad de union del PNA por el ARNm.

PNA con una cadena quiral principal: Ha habido intentos de introducir un sustituyente quiral en la cadena principal del PNA de 2-aminoetil-glicina (Aeg). Por ejemplo, la solubilidad acuosa de PNA mejoro significativamente por la incorporacion de monomero(s) de PNA con una cadena principal de 2-aminoetil-lisina en lugar de Aeg. (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. vol 35, 1939-1941, 1996).

Mediante la introduccion de la cadena principal de L-(2-amino-2-metil)etil-glicina en lugar de Aeg, la afinidad de union de PNA por ADN y ARN mejoro significativamente. Un 10-mero de PNA con toda la cadena principal de L-(2-amino-2- metil)etil-glicina en lugar de 2-aminoetil-glicina mostro un aumento de 19°C y 10°C en la Tm contra el ADN y ARN complementarios, respectivamente. Aunque tal aumento no parece ser proporcional al numero de sustitucion con L-(2- amino-2-metil)etil-glicina. (J. Am. Chem. Soc. vol 128, 10258-10267, 2006).

GPNA: Se informo que la penetracion celular de PNA mejoro notablemente con la incorporacion de monomeros con una cadena principal de 2-aminoetil-arginina en lugar de Aeg. (J. Am. Chem. Soc. vol 125, 6878-6879, 2003) Tales PNA se denominan 'GPNA' ya que tienen una porcion de guanidinio en la cadena principal.

Se informo que GPNA con la cadena principal de 2-aminoetil-D-arginina teman una afinidad mas fuerte por ADN y ARN que los correspondientes GPNA con la de 2-aminoetil-L-arginina. (Chem. Commun. 244-246, 2005) Para un 10-mero de GPNA con 5 monomeros de GPNA con la cadena principal de 2-aminoetil-D-arginina hubo un aumento de 7°C en la Tm (temperatura de fusion) contra el ADN complementario en comparacion al PNA correspondiente no modificado. (Bioorg. Med. Chem. Lett. vol 16, 4931-4935, 2006).

Se informo que un 16-mero de GPNA antisentido contra EGFR-TK humano mostro actividad antitumoral a partir de la administracion ip (intra peritoneal) en ratones atfmicos desnudos, aunque la actividad antisentido in vitro no se documento para el GPNA antisentido en la tecnica anterior. (Documento WO 2008/061091).

PNA con Nucleobase Modificada: Al igual que los casos con ADN, se han intentado modificaciones de nucleobases para mejorar la afinidad del PNA por los acidos nucleicos.

Los PNA con la adenina remplazada con 2,6-diaminopurina se evaluaron por su afinidad por el ADN complementario o el ARN. Se encontro que la sustitucion con 2,6-diaminopurina provoco un incremento de 2.5 ~ 6°C en la Tm por remplazo. (Nucleic Acids Res. vol 25, 4639-4643,1997).

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Los PNA con la citosina remplazada con 9-(2-aminoetoxi)fenoxazina se evaluaron por su afinidad por el ADN complementary o el ARN. Una sustitucion sencilla con 9-(2-aminoetoxi)fenoxazina provoco un incremento de 10.7 ~ 23.7°C en la Tm, aunque tal incremento dependio notablemente de la secuencia de nucleotidos. La nucleobase 9-(2- aminopropoxi)fenoxazina ademas indujo un gran aumento en la Tm. Debido a un enorme aumento de la Tm, el monomero de PNA con ya sea 9-(2-aminoetoxi)-fenoxazina o 9-(2-aminopropoxi)fenoxazina como un remplazo de citosina se denomina 'abrazadera-G'. (Org. Lett. vol 4, 4395-4398, 2002) Sin embargo, no se informaron los datos de penetracion celular para PNA con abrazadera(s)-G.

Los PNA con citosina remplazada con ya sea 6-{2-(2-aminoetoxi)fenil}-pirrolocitosina o 6-{2,6-di(2- aminoetoxi)fenil}pirrolocitosina se evaluaron por su afinidad por el ADN complementario o el ARN. Una sola sustitucion con ya sea 6-{2-(2-aminoetoxi)fenil}pirrolocitosina o 6-{2,6-di(2-aminoetoxi)-fenil}pirrolocitosina aumento la Tm por 3 ~ 11.5°C. (J. Am. Chem. Soc. vol. 130, 12574-12575, 2008) Sin embargo, tales PNA no se evaluaron para la penetracion celular.

Otros usos de los PNA: Mediante la union estrecha a un microARN, el PNA puede inhibir la funcion regulatoria del microARN, lo que lleva a un aumento en el nivel de expresion de la protema(s) regulada directamente por el microARN. (RNA vol. 14, 336-346, 2008) Por la union estrecha a una ribonucleoprotema tal como la telomerasa, el PNA puede modular la funcion celular de la ribonucleoprotema. (Bioorg. Med. Chem. Lett, vol. 9, 1273-78, 1999) Por la union estrecha a cierta porcion de un gen en el nucleo, el PNA puede modular el nivel de transcripcion del gen. (Biochemistry vol 46, 7581-89, 2007.)

A partir de que el PNA se une fuertemente al ADN y el ARN, y discrimina sensiblemente un solo par de bases no coincidentes, el PNA sena adecuado para la deteccion de alta fidelidad de polimorfismo de un solo nucleotido (SNP). A partir de que el PNA se une fuertemente al ADN y el ARN con alta especificidad por la secuencia, el PNA puede encontrar otras varias aplicaciones terapeuticas y de diagnostico que involucran el ADN o el ARN. (FASEB vol. 14, 1041-1060, 2000).

Resumen de la invencion

La presente invencion proporciona un acido nucleico peptfdico derivado de la Formula I o una sal farmaceuticamente aceptable de este:

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Formula I

en donde

n es un entero igual a o mayor que 5;

S1, S2, ..., 5n-1, Sn, T1, T2, ..., Tn-1, y Tn independientemente representan radicales hidrogeno, deuterio, alquilo sustituido o no sustituido, o arilo sustituido o no sustituido;

X y Y independientemente representan radicales hidrogeno, deuterio, alquilo sustituido o no sustituido, acilo sustituido o no sustituido, sulfonilo sustituido o no sustituido, o arilo sustituido o no sustituido;

Z representa radicales hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, o amino sustituido o no sustituido;

B1, B2, ..., Bn-1, y Bn son independientemente seleccionadas de nucleobases naturales que incluyen adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, y nucleobases no naturales; y,

al menos una de B1, B2, ..., Bn-1, y Bn es independientemente seleccionada de nucleobases no naturales representadas por la Formula II, Formula III, o Formula IV:

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Formula II

Formula III

Formula IV

en donde

Ri, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente de radicales alquilo sustituido o no sustituido, e hidrogeno;

y,

L1, L2 y L3 son un enlazador covalente representado por la Formula V que conecta un grupo amino basico a la porcion responsable de las propiedades de apareamiento de las nucleobase: en donde

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Q-t

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Formula V

Qi y Qm son radicales metileno sustituido o no sustituido (-CH2-), y Qm esta directamente enlazado al grupo amino basico;

Q2, Q3, ..., y Qm-i son independientemente seleccionados de radicales metileno sustituido o no sustituido, oxfgeno (-O-), azufre (-S-), y amino sustituido o no sustituido [-N(H)-, o -N(sustituyente)-]; y, m es un numero entero de 2 a 15.

Un oligomero de PNA de la Formula I muestra una afinidad de union por el acido nucleico y penetracion celular mejoradas en comparacion a su correspondiente oligomero de PNA 'no modificado'. Los oligomeros de PNA de esta invencion son utiles para inhibir o modular espedficamente por la secuencia funciones celulares y fisiologicas mediadas por los acidos nucleicos o moleculas fisiologicamente activas que tiene un dominio de acido nucleico tales como las ribonucleoprotemas. Ademas los oligomeros de PNA de esta invencion son utiles para propositos de diagnostico debido a su capacidad de union espedfica por la secuencia de los acidos nucleicos.

Descripcion de la invencion

La presente invencion proporciona una nueva clase de oligomeros de PNA representados por la Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable de estos:

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Formula I

en donde

n es un entero igual a o mayor que 5;

Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Ti, T2, ..., Tn-i, y Tn independientemente representan radicales hidrogeno, deuterio, alquilo sustituido o no sustituido, o arilo sustituido o no sustituido;

X y Y independientemente representan radicales hidrogeno, deuterio, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, amino sustituido o no sustituido, alquilo sustituido o no sustituido, acilo sustituido o no sustituido, sulfonilo sustituido o no sustituido, o arilo sustituido o no sustituido;

Z representa radicales hidrogeno, deuterio, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, amino sustituido o no sustituido, alquilo sustituido o no sustituido, o arilo sustituido o no sustituido; Bi, B2, ..., Bn-i, y Bn son independientemente seleccionadas de nucleobases naturales que incluyen adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, y nucleobases no naturales; y,

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al menos una de Bi, B2, ..., Bn-1, y Bn independientemente representa una nucleobase no natural con un radical amino sustituido o no sustituido covalentemente unido a la porcion responsable de sus propiedades de apareamiento de las nucleobase.

Un oligomero de PNA de esta invencion muestra penetracion celular y union al acido nucleico mejoradas en comparacion con su correspondiente oligomero de PNA 'no modificado'. En esta invencion, oligomero de PNA 'no modificado' se refiere a un oligomero de PNA de la Formula I, en donde Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Ti, T2, ..., Tn-i, y Tn son radicales hidrogeno; y Bi, B2, ..., Bn-i, y Bn son independientemente seleccionadas de nucleobases naturales que comprenden adenina, timina, guanina, y citosina.

Un oligomero de PNA de esta invencion penetra rapidamente la membrana celular de mairnferos, y puede afectar o alterar las funciones celulares por la unirse espedficamente por la secuencia a un acido nucleico o una nucleoprotema dentro de la celula.

Un oligomero de PNA de la Formula I puede inhibir potentemente la smtesis de protema ribosomal por unirse fuertemente al ARNm. Un oligomero de PNA de la presente invencion puede unirse fuertemente al pre-ARNm y alterar el empalme del pre-ARNm a ARNm. Mas aun, un oligomero de PNA de la presente invencion puede unirse fuertemente a un microARN, e inhibir la degradacion del ARNm inducida por el microARN.

Un oligomero de PNA de la Formula I puede predeciblemente unirse al dominio del acido nucleico de una ribonucleoprotema, por ejemplo la telomerasa, y modular su funcion(es) fisiologica(s). Un oligomero de PNA de la presente invencion puede unirse a un gen y modular la transcripcion del gen. Un oligomero de PNA de la Formula I puede unirse a un gen viral o su transcrito, e inhibir la proliferacion del virus. Un oligomero de PNA de esta invencion puede afectar funciones celulares diferentes de aquellas descritas anteriormente por unirse espedficamente por la secuencia a un acido nucleico o una nucleoprotema dentro de la celula de mamffero. Adicionalmente, un oligomero de PNA de la presente invencion puede unirse fuertemente a un ARNm bacteriano, acido nucleico, o gen, e inhibir la proliferacion bacteriana o alterar los perfiles de biosmtesis bacteriana.

Un oligomero de PNA de esta invencion es altamente sensible a una base no coincidente en la union a su contraparte de ADN complementario, y seria apropiado para detectar polimorfismo de un solo nucleotido (SNP) con alta fidelidad. Los oligomeros de PNA de la presente invencion se unen fuertemente a sus ADN complementarios con alta especificidad por la secuencia, y pueden ser utiles para el perfilado de genes. Un oligomero de PNA de la Formula I puede ser util para sondear o localizar una molecula que porta un acido nucleico tal como el telomero dentro de la celula si se etiqueta apropiadamente con un cromoforo, por ejemplo un fluoroforo. Los oligomeros de PNA de esta invencion pueden ser utiles para una variedad de propositos de diagnostico o analfticos diferentes de aquellos detallados anteriormente.

Un oligomero de PNA de la presente invencion posee buena solubilidad acuosa en comparacion al correspondiente oligomero de PNA 'no modificado', y puede usarse como una solucion disuelto en agua, salina, o un amortiguador. Un oligomero de PNA de la Formula I puede formularse con un lfpido cationico tal como la lipofectamina. Un oligomero de PNA de esta invencion puede hibridar con un ADN complementario y el tubrido resultante puede formularse con un lfpido cationico.

Un oligomero de PNA de esta invencion puede formularse en una variedad de dosificaciones que incluyen pero sin limitarse a formulacion inyectable, aerosol nasal, tableta, granulos, capsulas duras, capsulas suaves, formulacion liposomal, suspension oral, formulacion transdermica, y asf sucesivamente.

Un oligomero de PNA de la presente invencion puede administrarse a un sujeto en una dosis terapeuticamente efectiva, que variara en dependencia de la indicacion, via de administracion, esquema de dosificacion, situaciones del sujeto, y asf sucesivamente.

Un oligomero de PNA de la presente invencion puede administrarse a un sujeto por una variedad de vfas que incluyen pero no se limitan a inyeccion intravenosa, inyeccion subcutanea, inyeccion intraperitoneal, inhalacion nasal, administracion oral, aplicacion transdermica, y asf sucesivamente.

Un oligomero de PNA de la Formula I puede administrarse a un sujeto en conjunto con un adyuvante farmaceuticamente aceptable que incluyen pero sin limitarse a acido dtrico, acido clorlddrico, acido tartarico, acido estearico, polietilenglicol, polipropilenglicol, etanol, bicarbonato de sodio, agua destilada, acido hialuronico, lfpido cationico tal como la lipofectamina, almidon, gelatina, talco, acido ascorbico, aceite de oliva, aceite de palma, metilcelulosa, oxido de titanio, sodio carboximetilcelulosa, edulcorante, preservativo, y asf sucesivamente.

Un oligomero de PNA de la presente invencion, en dependencia de la presencia del grupo(s) funcional basico o addico en el, puede usarse neutralizado con una cantidad equivalente de un acido o base farmaceuticamente aceptable que

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incluyen pero sin limitarse a hidroxido de sodio, hidroxido de potasio, acido clorhndrico, acido metanosulfonico, acido citrico, y asf sucesivamente.

Los oligomeros de PNA preferidos abarcan los oligomeros de PNA de la Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable de estos:

en donde

n es un entero igual a o mayor que 5 pero menor que o igual a 30;

Si, S2, ..., Sn-1, Sn, Ti, T2, ..., Tn-1, y Tn son radicales hidrogeno;

X y Y son independientemente seleccionados de radicales hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, acilo sustituido o no sustituido, sulfonilo sustituido o no sustituido, y arilo sustituido o no sustituido;

Z representa radicales hidrogeno, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, amino sustituido o no sustituido, alquilo sustituido o no sustituido, o arilo sustituido o no sustituido;

Bi, B2, ..., Bn-i, y Bn son independientemente seleccionadas de nucleobases naturales que incluyen adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, y nucleobases no naturales; y,

al menos una de Bi, B2, ..., Bn-i, y Bn es independientemente seleccionada de nucleobases no naturales representadas por la Formula II, Formula III, o Formula IV:

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en donde

Ri, R2, R3, R4, R5 y R6 son independientemente seleccionados de radicales alquilo sustituido o no sustituido, hidrogeno, hidroxi, y alquiloxi sustituido o no sustituido; y,

Li, L2 y L3 son un enlazador covalente representado por la Formula V que conecta un grupo amino basico a la porcion responsable de las propiedades de apareamiento de las nucleobase:

Formula V

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en donde

Q2, Q3, . ., y Qm-i son independientemente seleccionados de radicales metileno sustituido o no sustituido, oxfgeno (-O-), azufre (-S-), y amino sustituido o no sustituido [-N(H)-, o -N(sustituyente)-]; y, m es un entero igual a o mayor que 2 pero menor que o igual a i5.

Los oligomeros de PNA de interes particular comprenden los oligomeros de PNA de la Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable de estos:

en donde

n es un entero igual a o mayor que 8 pero menor que o igual a 25;

Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Ti, T2, ..., Tn-i, y Tn son radicales hidrogeno;

X y Y son independientemente seleccionados de radicales hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, y acilo sustituido o no sustituido;

Z representa radicales hidroxi, o amino sustituido o no sustituido;

Bi, B2, ..., Bn-i, y Bn son independientemente seleccionadas de nucleobases naturales que incluyen adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, y nucleobases no naturales;

al menos dos de Bi, B2, ..., Bn-i, y Bn son independientemente seleccionadas de nucleobases no naturales representadas por la Formula II, Formula III, o Formula IV;

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Ri, R2, R3, R4, R5 y R6 son independientemente seleccionados de radicales alquilo sustituido o no sustituido, e hidrogeno;

Qi y Qm son radicales metileno sustituido o no sustituido, y Qm esta directamente enlazado al grupo amino basico;

Q2, Q3, .., y Qm-i son independientemente seleccionados de radicales metileno sustituido o no sustituido, oxfgeno, y amino ; y,

m es un entero igual a o mayor que 2 pero menor que o igual a 12.

Los oligomeros de PNA de alto interes comprenden los oligomeros de PNA de la Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable de estos:

en donde,

n es un entero igual a o mayor que 10 pero menor que o igual a 25;

Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Ti, T2, ..., Tn-i, y Tn son radicales hidrogeno;

X y Y son independientemente seleccionados de radicales hidrogeno, y acilo sustituido o no sustituido;

Z representa radicales hidroxi, alquiloxi, o amino sustituido o no sustituido; y,

al menos tres de Bi, B2, ..., Bn-i, y Bn son independientemente seleccionadas de nucleobases no naturales representadas por la Formula II, Formula III, o Formula IV;

Qi y Qm son radicales metileno, y Qm esta directamente enlazado al grupo amino basico;

Q2, Q3, . ., y Qm-i son independientemente seleccionados de radicales metileno, oxfgeno, y amino; y, m es un entero igual a o mayor que 2 pero menor que o igual a i0.

Los oligomeros de PNA de mas alto interes abarcan los oligomeros de PNA de la Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable de estos:

en donde,

n es un entero igual a o mayor que i0 pero menor que o igual a 20;

Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Ti, T2, ..., Tn-i, y Tn son radicales hidrogeno;

Z representa radicales hidroxi, o amino sustituido o no sustituido;

Bi, B2, ..., Bn-i, y Bn es independientemente seleccionada de nucleobases naturales que incluyen adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, y nucleobases no naturales;

Ri, R3, y R5 son radicales hidrogeno, y R2, R4, y Raindependientemente representan radicales hidrogeno, o amidinilo sustituido o no sustituido;

Los oligomeros de PNA de maximo interes comprenden los oligomeros de PNA de la Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable de estos:

en donde,

n es un entero igual a o mayor que i0 pero menor que o igual a 20;

Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Ti, T2, ..., Tn-i, y Tn son radicales hidrogeno;

Z representa radicales hidroxi, o amino sustituido o no sustituido;

Bi, B2, ..., Bn-i, y Bn son independientemente seleccionadas de adenina, timina, guanina, citosina, y nucleobases no naturales;

Ri, R3, y R5 son radicales hidrogeno, y R2, R4, y Raindependientemente representa radicales hidrogeno o amidinilo;

Q2, Q3, . ., y Qm-i son independientemente seleccionados de radicales metileno, y oxfgeno; y, m es un entero igual a o mayor que 2 pero menor que o igual a 8.

Los oligomeros de PNA espedficos de fuerte interes comprenden los oligomeros de PNA de la Formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable de estos:

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en donde

n es un entero igual a o mayor que 8 pero menor que o igual a 20;

Si, S2, ..., Sn-1, Sn, Ti, T2, ..., Tn-1, y Tn son radicales hidrogeno;

X es un radical hidrogeno;

Y representa radicales hidrogeno, o acilo sustituido o no sustituido;

Z representa radicales hidroxi, o amino sustituido o no sustituido;

Ri, R3, y R5 son radicales hidrogeno, y R2, R4, y Raindependientemente representan radicales hidrogeno o amidinilo;

Li representa -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, o -CH2-O-(CH2)3-con el extremo derecho directamente enlazado al grupo amino basico; y,

L2 y L3 son independientemente seleccionados de -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)3-, - (cH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)a-, - (CH2)7-, y -(CH2)8- con el extremo derecho esta directamente enlazado al grupo amino basico.

Los terminos y abreviaturas usados anteriormente para los oligomeros de PNA de esta invencion se ilustran en la tabla mas abajo.

Termino/Abreviatura: Ilustracion o definicion

oligomero: oligonucleotido.

hidrogeno: atomo de hidrogeno (-H) solo

deuterio: atomo de deuterio (-D) solo

alquilo: radical alquilo recto o ramificado

arilo: grupo aromatico tal como fenilo, piridilo, furilo, naftilo, etc

metileno: -(CH2)-

acilo: '-C(O)-' sustituido con radicales hidrogeno, alquilo, o arilo

sulfonilo: '-S(O)2-' sustituido con radicales alquilo, o arilo

alquiloxi: 'R-O-' donde R es un radical alquilo sustituido o no sustituido

oxigeno: '-O-'

azufre: '-S-'

amidinilo: nh2 V^NH____________________________________________

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citosina (C)

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timina (T)

V"nh

uracilo (U)

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adenina (A)

guanina (G)

Procedimientos generales de smtesis

Para la caracterizacion de las moleculas de esta invencion se registro el espectro de NMR en un espectrometro de NMR Varian Mercury 300MHz, Bruker Avance 400MHz, o Varian Inova 500MHz. Se empleo ya sea un Bruker Daltonics Ultraflex MALDI-TOF o un sistema de trampa de iones Agilent LC/MS para la determinacion del peso molecular. Los oligomeros de PNA se analizaron y purificaron por HPLC Ci8- de fase inversa ya sea en un HPLC Hewlett Packard 1050 o un HPLC Shimazu LC-6AD. A menos que se indique de otra manera, se uso gel de silice para la separacion cromatografica de las pequenas moleculas preparadas en esta invencion. El punto de fusion se informa no corregido.

Los derivados de nucleobases no naturales usados para la smtesis de monomeros de PNA de esta invencion se prepararon de acuerdo a uno de los metodos (Metodos A, B, y C) proporcionados mas abajo o con modificacion(es) menor de ellos, a menos que se detalle de otra forma en ejemplos reales sinteticos.

Metodo A: Los derivados 6-alquil-pirolocitosina se sintetizaron protegidos adecuadamente de acuerdo al Esquema 1 o con variacion(es) menor de este. Tales derivados 6-alquil-pirolocitosina se usaron para sintetizar monomeros de PNA que contienen una nucleobase representados por la Formula II como un equivalente de citosina.

Primero el compuesto a se desprotono con NaH y despues se alquilo con etilbromoacetato para obtener el compuesto b. El compuesto b se sometio a un acoplamiento catalizado por paladio con el derivado acetileno terminal de a que se anulo in situ al producto c de acuerdo con la literatura. (Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids vol 22, 1029-1033, 2003).

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Metodo B: Los derivados 2,6-diaminopurina se sintetizaron protegidos adecuadamente de acuerdo al Esquema 2 o con variacion(es) menor de este. Tales derivados 2,6-diamino-purina se usaron para sintetizar monomeros de PNA que contienen una nucleobase representada por la Formula III como un equivalente de adenina.

Primero la 2-haloadenina reacciono con una diamina a alta temperatura para obtener el compuesto d, que despues reacciono con Boc2O para dar el compuesto e. El compuesto e se desprotono con NaH, y se alquilo con etilbromoacetato para obtener el compuesto f. El grupo amino aromatico del compuesto f se protegio ya sea con el grupo Cbz o Boc para producir el compuesto g.

Esquema 2

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Metodo C: Derivados N-alquilados de guanina se sintetizaron adecuadamente protegidos de acuerdo con el esquema 3 o con variaciones menores de este. Tales derivados de guanina se usaron para sintetizar monomeros de PNA que contienen una nucleobase representada por la Formula IV como un equivalente de guanina.

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X=Clo Br

Esquema 3

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Primero la 2-haloadenina reacciono con una diamina a alta temperatura para obtener el compuesto h, que despues reacciono con Boc2O para dar el compuesto i. El compuesto i se desprotono con NaH, y se alquilo con etilbromoacetato para obtener el compuesto j.

Se sintetizaron dos tipos de monomeros de PNA de acuerdo con ya sea el Metodo D o el Metodo E para preparar oligomeros de PNA de la Formula I. Los oligomeros de PNA se prepararon por Panagene, Inc. (
www.panagene.com, Daejon, Corea del Sur) por medio del uso de monomeros de PNA del tipo o del esquema 4 por pedido de CTI Bio. Alternativamente, los monomeros de PNA de tipo q del esquema 5 se usaron en-casa para la smtesis de oligomeros de PNA de acuerdo con el metodo descrito en la tecnica anterior o con modificacion(es) menor de estos. (USP 6,133,444)

Metodo D: Los monomeros de PNA con una nucleobase modificada se prepararon de acuerdo con el esquema 4 o con variacion(es) menor de estos protegidos adecuadamente para el metodo de smtesis del oligomero de PNA descrito en la literatura. (Org. Lett. vol. 9, 3291-3293, 2006) En el Esquema 4, el compuesto k puede corresponder al compuesto c del esquema 1, al compuesto g del esquema 2, o al compuesto j del esquema 3, sin embargo puede no limitarse necesariamente a uno de estos compuestos ester.

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Primero el ester k se sometio a hidrolisis alcalina para proporcionar el acido l, que despues se acoplo con etil N-[2-{N-(2- benzotiazolinil)sulfonilamino}etil]-glicinato para obtener el compuesto m. El compuesto m se hidrolizo ligeramente con LiOH para dar el acido n, que se hizo ciclico por la reaccion de acoplamiento eDcI para obtener el monomero de PNA modificado o. La estructura qmmica para el monomero de PNA o se asumio como en el Esquema 4 a lo largo de esta invencion, dado que tales monomeros de PNA asignados han rendido exitosamente oligomeros de PNA en la literatura. (Org.Lett.vol9,3291-3293,2006).

Metodo E: Alternativamente, los monomeros de PNA con una nucleobase modificada se prepararon de acuerdo con el esquema 5 o con variacion(es) menor(es) de este protegidos adecuadamente para el metodo de smtesis del oligomero

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de PNA descrito en la tecnica anterior. USP 6,133,444) En el Esquema 5, el compuesto k puede corresponder al compuesto c del esquema 1, al compuesto g del Esquema 2, o al compuesto j del Esquema 3, sin embargo puede no limitarse necesariamente a uno de estos compuestos ester.

Esquema 5

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Primero el acido l se acoplo con etil N-[2-{N-(9H-fluoren-9-il)amino}etil]-glicinato para obtener el compuesto p por una reaccion de acoplamiento EDCI. Despues el compuesto p se hidrolizo ligeramente con LiOH para obtener el monomero de PNA q con una nucleobase modificada.

Los siguientes ejemplos contienen descripciones detalladas de los metodos de preparacion para los compuestos de esta invencion. Las descripciones detalladas de estos ejemplos se presentan para propositos ilustrativos solamente y no deben interpretarse como una restriccion a la presente invencion. La mayona de estas descripciones detalladas caen dentro del alcance, y sirven para ejemplificar los PROCEDIMIENtOs SINTETICOS GENERALES descritos anteriormente que forman una parte de la invencion. Las abreviaturas usadas en los siguientes ejemplos se definen en la siguiente tabla.

Categona: Designacion

1H NMR: Resonancia magnetica nuclear de protones. Al presentar los datos de NMR, abreviaturas ampliamente aceptadas se usaron como sigue: s para singulete, d para doblete, t para triplete, q para cuarto, m para multiplete, br para amplio, J para constante de acoplamiento, CdCI3 para cloformo deuterado, DMSOd6 para dMsO hexa-deuterado, y asf sucesivamente.

ms: Espectroscopia de masas Al presentar los datos de MS, se usaron abreviaturas popularmente aceptadas como sigue: MALDI-TOF para ionizacion desorcion laser asistida por matriz tiempo de vuelo, ESI para ionizacion por electrospray, MW para peso molecular, (m+1) para MH+ maximo de ion, (m+23) para MNa+ maximo de ion, etc.

Solventes: Se usaron abreviaturas ampliamente aceptadas para los solventes como sigue: THF parar tetrahidrofurano, MC para cloruro de metileno, DMF para dimetilformamida, EtOH para etanol, MeOH para metanol, DMSO para dimetilsulfoxido, EA para acetato de etilo, y asf sucesivamente.

Reactivos: Se usaron abreviaturas popularmente aceptadas para los reactivos como sigue: NaH para hidruro de sodio, HCl para acido clortndrico, EDCI para hidrocloruro de 1- etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, HOBT para 1-hidroxi-benzotriazol, Boc para t-butiloxicarbonil, Boc2O para Boc antndrido o di-t-butil-dicarbonato, Cbz para benciloxicarbonilo, Fmoc para (9H-fluoren-9-il)-metoxicarbonilo, Bts para (benzo[d]tiazol-2-sulfonilo), Bts-Cl para cloruro de (benzo-[d]tiazol-2-sulfonilo), TFA para acido trifluoacetico, TEA para trietil-amina, DIEA para N,N-diisopropiletilamina, LiOH para hidroxido de litio , Aeg para N-(2-aminoetil)glicina, Fmoc-Aeg-OH para N- [2-{(9H-fluoren-9-il)-metoxicarbonilo}amino-etil]glicina, Fmoc-Aeg-OMe para metil N- [2-(Fmoc-amino)etil]-glicinato, Fmoc-Aeg-OtBu para t-butil N-[2-(Fmoc-amino)etil]- glicinato, Fmoc-Aeg-OSu para N-succinil N-[2-(Fmoc-amino)-etil]-glicinato, HBTU para 0-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluranio hexafluorofosfato, DCC para 1,3- diciclohexilcarbodiimida, y as^ sucesivamente.

Otros: Se usaron abreviaturas ampliamente aceptadas para las terminologfas como sigue: mp para punto de fusion, °C para grado en Celcius, h para hora, min para minuto, g para gramo, mg para miligramo, kg para kilogramo, l para litro, ml para mililitro, M para mol/l, comp. para compuesto, ac. para acuoso, tA para temperatura ambiente, y asf sucesivamente.

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Ejemplo 1: Preparacion de 3-{(t-butoxicarbonil)amino}-1-propanol (1).

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NHBoc

A 14g de 3-amino-1-propanol disueltos en 150ml de THF y 150ml de agua, se anadio en forma de gotas durante 30min 40.7g de Boc2O disueltos en 100ml de THF. Despues que la mezcla de reaccion se agito por 24h, el THF se elimino a presion reducida. La capa ac. resultante se extrajo con 200ml de EA, y la capa organica se lavo con 0.5M acido citrico ac. y con agua destilada, y despues se seco sobre sulfato magnesico anhidro. El sulfato magnesico se filtro, y el filtrado resultante se concentro al vado para dar 25g del comp. 1 como un ffquido incoloro. 1H NMR (400MHz; CDCl3): 5 4.84 (br s, 1H), 3.66 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.28 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 3.05 (br s, 1H), 1.66 (m, 2H), 1.45 (s, 9H).

Ejemplo 2: Preparacion de etil {(N-benzoil)-5-iodocitosina-1-il}acetato (2).

A una solucion agitada de 8.3g de N-benzoil-5-iodocitosina disueltos en 60ml de DMF, se anadio a 0°C 1.06g de 55% NaH en aceite mineral, y la solucion se agito a temperatura ambiente por 2h. Despues que 2.7ml de bromoacetato de etilo se anadieran a la mezcla de reaccion, la solucion de reaccion se agito por otras 24h a temperatura ambiente, a lo cual siguio la eliminacion del solvente a presion reducida. El residuo resultante se disolvio y el material insoluble se filtro. El filtrado se lavo dos veces con cloruro amonico saturado ac., se seco sobre sulfato magnesico anhidro, y se concentro al vado. El residuo resultante se purifico por cromatograffa de columna (1:1 hexano/EA) para producir 6.5g del comp. 2 (comp. b en el Esquema 1) como un solido amarillo. mp 154-5°C. 1H NMR (400MHz; cDCh) 5 13.31 (br s, 1H), 8.37 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.69 (s, 1H), 7.55 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.46 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 4.49 (s, 2H), 4.27(g, J = 7.2 Hz, 2H), 1.32 (t, J = 7.2 Hz, 3H).

Ejemplo 3: Preparacion de 3-{3-(t-butoxicarbonilamino)propiloxi}-1-propino (3).

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A 6.5g de 55% NaH en aceite mineral dispersados en 150ml de THF a 0°C, se anadieron en forma de gotas durante 15 min 25g del comp. 1, y la mezcla se agito por 1h. Despues que 17.5ml de bromuro de propargilo (80% solucion de tolueno) se anadieran en forma de gotas durante 30min, la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente por 20h. La reaccion se apago al anadir lentamente 250ml de agua y el THF se elimino a presion reducida. Despues, la mezcla ac. resultante se extrajo con 250ml de EA, la cual se lavo 3 veces con 250ml de agua. La capa organica se seco sobre sulfato magnesico anhidro, y el sulfato magnesico se filtro. El filtrado resultante se concentro al vado y se sometio a cromatograffa de columna (5:1 hexano/EA) para proporcionar 22.7g del comp. 3 como un ffquido amarillo. 1H NMR (400 MHz; DMSOda) 5 6.78 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.09 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 3.43-3.39 (m, 3H), 2.95 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 1.60 (m, 2H), 1.37 (s, 9H).

Ejemplo 4: Preparacion de 4-{2-(t-butoxicarbonilamino)etoxi}-1-butino (4)

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NHBoc

A 3.8g de 4-(2-azidoetoxi)-1-butino disueltos en 17ml de THF, se anadieron 7.2g de trifenilfosfina y 0.7ml de agua, y la mezcla de reaccion se agito por 8h, a lo cual siguio la eliminacion del solvente a presion reducida. Despues, el residuo resultante se disolvio en 20ml de EA y se extrajo dos veces con 10ml 1M HCl ac. Carbonato sodico ac. se anadio a la capa ac. para ajustar el pH a 9 ~ 10. 5.96g de Boc2O disueltos en 15ml de THF se anadieron a la solucion, y la mezcla de reaccion se agito por 12h. Despues que el THF se elimino al vado, la solucion resultante se extrajo con EA. La capa organica se lavo con 0.5M acido citrico ac., y se seco sobre sulfato magnesico anhidro. La capa organica se concentro y se purifico por cromatograffa de columna (9:1 hexano/EA) para proporcionar 3.4g del comp. 4 como un aceite amarillo. 1H NMR (400MHz; CDCh) 5 4.95 (s, 1H), 3.58 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.53 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.32 (m, 2H), 2.46 (m, 2H), 2.00 (t, J = 2.8 Hz, 1H), 1.45 (s, 9H).

Ejemplo 5: Preparacion de 3-{2-(t-butoxicarbonilamino)etoxi}-1-propino (5).

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NHBoc

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20g de 2-{(t-butoxicarbonil)amino}-1-etanol reaccionaron y se purificaron siguiendo de manera similar el procedimiento descrito en el Ejemplo 3 para proporcionar 23.7g del comp. 5 como un aceite amarillo palido. 1H NMR (400MHz; DMSOda) 5 6.81 (t, 1H), 4.11 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 3.41 (m, 3H), 3.07 (q, J= 6.0 Hz, 2H), 1.38 (s, 9H).

Ejemplo 6: Preparacion de 3-[N-{3-(t-butoxicarbonilamino)propil}-N-(t-butoxi-carbonil)amino]-1-propino (6)

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A una solucion agitada de N-[3-(t-butoxicarbonilamino)propil]-N-(2-propinil)amina disueltos en 83ml de THF y 95ml de agua, se anadieron en forma de gotas 42g de Boc2O a temperatura ambiente. La solucion de reaccion se agito por 1.5h, y se concentro al vado. La capa ac. resultante se extrajo con EA. La capa de EA se lavo en serie con 0.5M acido dtrico ac. y salmuera, se seco sobre sulfato magnesico anhidro, se concentro a presion reducida, y se purifico por cromatografia de columna (1:1 hexano/EA) para dar 19g del comp. 6 como un aceite amarillo. 1H NMR (400MHz; CDQ3) 5 5.26 (br s, 0.6H), 4.74 (br s, 0.4H), 4.07 (br s, 1H), 3.98 (br s, 1H), 3.40 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.13 (m, 2H), 2.21 (t, 1H), 1.73 (m, 2H), 1.49 (s, 9H), 1.45 (s, 9H).

Ejemplo 7: Preparacion de 3-[2-{2,3-bis(benciloxicarbonil)guanidino}-etoxi]-1-propino (7)

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A una solucion agitada de 10.9g del comp. 5 disueltos en 110ml de MC, se anadieron 110ml de TFA a 0°C en forma de gotas durante 2h, y la mezcla de reaccion se agito por otras 3h. La solucion de reaccion se concentro a presion reducida y el residuo resultante se disolvio en 40ml de MC a 0°C, a lo cual se anadieron 12.3ml de TEA y despues 8.8g de 1,3- bis(benciloxicarbonil)-2-(metiltio)pseudourea a temperatura ambiente. La solucion de reaccion se agito por 4h y se lavo dos veces con agua. La capa organica se seco sobre sulfato magnesico anhidro, se concentro al vado, y se sometio a cromatografia de columna (5:1 hexano/EA) para proporcionar 9.8g del comp. 7 como un solido blanco. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 5 11.72 (s, 1H), 8.58 (s, 1H), 7.40-7.35 (m, 10H), 5.18 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.18 (d, 2H), 3.67-3.66 (m, 4H), 2.43 (t, 1H).

Ejemplo 8: Preparacion de 2-{(t-butoxicarbonil)amino}-1-(2-propinil-1-oxi)}-(R)-propano (8).

BocHN

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10.8g de t-butil (R)-1-hidroxipropan-2-ilcarbamato reaccionaron y se purificaron siguiendo de manera similar el procedimiento descrito en el Ejemplo 3 para proporcionar 10.1g del comp. 8 como un aceite amarillo. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 5 6.63 (d, 1H), 4.11 (d, 2H), 3.60 (m, 1H), 3.37-3.33 (m, 2H), 3.26-3.23 (m, 1H), 1.38 (s, 9H), 1.05 (d, 3H).

Ejemplo 9: Preparacion de N-[2-{2-(t-butoxicarbonil)aminoetoxi}etil]-N-[2-{(3-butinil)-1-oxi}etil]-N-(t-butoxicarbonil)amina (9).

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A una solucion agitada de 5g de 2-{(3-butinil)-1-oxi}etil metanosulfonato y 5.32g de 2-[2-{2-(t-butoxicarbonil)amino}etil-1- oxi]etilamina en 60ml de acetonitrilo, se anadio en forma de gotas 3.6g de carbonato potasico disueltos en agua a 0°C. La solucion de reaccion se dejo calentar lentamente hasta la temperatura ambiente y se agito por otras 24h, y despues se concentro a presion reducida. El residuo resultante se disolvio en MC y se lavo con agua. La capa organica se concentro y se disolvio en 80ml de THF y 80ml de agua, a lo cual se anadieron 8.4g de Boc2O disueltos en 50ml de THF. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente por 16h, a lo cual siguio la eliminacion de THF al vado y la extraccion con EA. La capa organica se lavo en serie con 0.5M acido dtrico ac., agua, y salmuera. La capa organica se seco sobre sulfato sodico anhidro, se concentro, y se purifico por cromatografia de columna (hexano ^ 1:4 EA/hexano)

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para obtener 2.45g del comp. 9 como un aceite amarillo palido. 1H NMR (400MHz; CDCI3) 5 5.08 (br s, 0.5H), 4.93 (br s, 0.5H), 3.61-3.46 (m, 12H), 3.31 (m, 2H), 2.48 (m, 2H), 1.99 (t, 1H), 1.48 (s, 9H), 1.46 (s, 9H).

Ejemplo 10: Preparacion de etil 2-[6-(3-(t-butoxicarbonilamino)propiM-oxi}-metil-2-oxo-2H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-3(7H)- il]acetato (10).

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A una solucion agitada de 6.5g del comp. 2 disueltos en 120ml de DMF, se anadieron en serie 580mg de CuI, 4.2ml de TEA, 9.74g del comp. 3, y 1.76g de Pd(PPh3)4. Despues, la mezcla de reaccion se agito por 24h a 50°C con proteccion para la luz, y se concentro a presion reducida. El residuo resultante se disolvio en 250ml EtOH y se agito a reflujo por 18h. Despues, la solucion se concentro al vado y se sometio a separacion cromatografica (95:5 EA/EtOH) para obtener 2.3g del comp. 10 como un solido/espuma roja oscura. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 5 11.30 (br s, 1H), 8.37 (s, 1H), 6.78 (m, 1H), 6.19 (s, 1H), 4.70 (s, 2H), 4.37 (s, 2H), 4.14 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.42 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.98 (m, 2H), 1.63 (m, 2H), 1.36 (s, 9H), 1.20 (t, J = 7.2 Hz, 3H).

Ejemplo 11: Preparacion de acido 2-[6-{3-(t-butoxicarbonilamino)propil-1-oxi}metil-2-oxo-2H-pirrolo-[2,3-d]pirimidin- 3(7H)-il]acetico (11).

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A 3.3g del comp. 10, se anadieron 15ml de THF, 30ml de agua, y despues 760mg de LiOH, y la mezcla se agito a temperatura ambiente por 20 min. Despues que el THF se elimino a presion reducida, la solucion resultante ac. se lavo con eter de dietilo. La capa ac. se acidifico hasta pH 3 con 1M HCl ac. y se extrajo con EA. La capa organica se seco sobre sulfato sodico anhidro y se concentro al vado para producir 2.46g del comp. 11 como un solido blanco. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 5 11.05 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 6.79 (t, 1H), 6.12 (s, 1H), 4.35 (s, 2H), 4.23 (s, 2H), 3.41 (t, 2H), 2.97 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 1.64 (m, 2H), 1.36 (s, 9H).

Ejemplo12: Preparacion de etilN-[2-{(benzo[d]tiazol-2-sulfonil)amino}-etil]-N-[2-[6-{3- (t-butoxicarbonilamino)propil-1-oxi}metil-2-oxo-2H-pirrolo-[2,3-d]pirimidin-3(7H)-il]acetil]glicinato (12).

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A 4.0g del comp. 11 y 3.6g de etil N-[2-{(benzo[d]tiazol-2-sulfonil)amino}etil]glicinato disueltos en 30ml de DMF, se anadieron a temperatura ambiente 2.42g de EDCI y 1.70g de HOBt. La mezcla de reaccion se agito por 8h. Despues que el solvente se elimino al vado, el residuo resultante se disolvio en MC, y se lavo con 1M HCl ac. y despues con agua. La capa de MC se concentro a presion reducida y se purifico por cromatograffa de columna (95:5 MC/MeOH) para obtener 4.6g del comp. 12 como un solido/espuma amarilla. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 5 11.09 (br s, 1H), 8.74 (s, 0.6H), 8.58 (s, 0.4H), 8.27 (m, 1H), 8.20-8.14 (m, 2H), 7.66 (m, 2H), 6.56 (br s, 1H), 6.16 (m, 1H), 4.91 (s, 1.2H), 4.73 (s, 0.8H), 4.38 (s, 2.6H), 4.17 (m, 0.9H), 4.07 (m, 2.5H), 3.67 (m, 1.1H), 3.49-3.44 (m, 4H), 3.26 (m, 0.9H), 3.01 (m, 2H), 1.66 (m, 2H), 1.38 (s, 9H), 1.24 (t, J = 7.0 Hz, 1.2H), 1.17 (t, J = 7.0 Hz, 1.8H).

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Ejemplo 13: Preparacion de N-[2-{(benzo[d]tiazol-2-sulfonil)amino}etil]-N-[2-[6-(3-(t-butoxicarbonilamino)propiM- oxi}metil-2-oxo-2H-pirrolo-[2,3-d]-pirimidin-3(7H)-il]acetil]glicina (13).

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4.5g del comp. 12 y 670mg de LiOH se dispersaron en 20ml de THF y 20ml de agua, y se agito a temperatura ambiente por 20min. THF se elimino al vado, y la solucion resultante ac. se lavo con eter de dietilo. La capa ac. se acidifico hasta pH 3 con 1M HCl ac., y se extrajo con EA. La capa de EA se seco sobre sulfato sodico anhidro y se concentro a presion reducida para proporcionar 4.4g del comp. 13 como un solido amarillo oscuro. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 6 11.32 (br s, 1H), 8.36 (m, 1H), 8.28 (m, 1.6H), 8.22 (s, 0.4H), 7.73 (m, 2H), 6.78 (m, 1H), 6.20 (s, 1H), 4.94 (s, 1.2H), 4.84 (s, 0.8H), 4.52 (s, 0.8H), 4.37 (s, 2H), 4.30 (s, 1.2H), 4.26 (m, 1.2H), 4.07 (m, 2H), 3.87 (m, 0.8H), 3.43 (m, 2H), 2.99 (m, 2H), 1.63 (m, 2H), 1.37 (s, 9H).

Ejemplo 14: Preparacion de 1-{(benzo[d]tiazol-2-sulfonil)}-2-oxo-4-[6-{3-(t-butoxicarbonilamino)propil-1-oxi}metil-2-oxo- 2H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-3(7H)-il]acetil]piperazina (14).

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4.4g del comp. 13 y 1.49g de EDCI en 50ml de DMF se agitaron a temperatura ambiente por 16h. Despues que la mezcla de reaccion se concentro al vado, el residuo resultante se disolvio en 50ml de MC. La solucion de MC se lavo en serie con 1M HCl ac. y agua, se concentro al vado, y despues se purifico por cromatograffa de columna (acetona) para obtener 1.5g del comp. 14 como un solido/espuma marron. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 6 11.25 (br s, 1H), 8.36 (m, 1H), 8.29 (m, 1H), 8.25 (s, 0.6H), 8.19 (0.4H), 7.72 (m, 2H), 6.78 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 6.18 (s, 1H), 4.92 (s, 1.2H), 4.82 (s, 0.8H), 4.51 (s, 0.8H), 4.37 (s, 2H), 4.29 (s, 1.2H), 4.23 (m, 1.2H), 4.06 (m, 2H), 3.87 (m, 0.8H), 3.41 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.98 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 1.62 (m, 2H), 1.36 (s, 9H). MS/ESI (m+23/MNa+) = 682.2 (observado), PM = 659.8 (C28H33N7O8S2).

A partir de derivados de acetileno 4 ~ 9, derivados de pirollocitosina 15 ~ 20 se prepararon siguiendo de manera similar el procedimiento descrito en el Ejemplo 10. Datos espectrales y ffsicos para los comp. 15 ~ 20se proporcionan en la tablas mas abajo.

Ejemplos 15 ~ 20: Datos analtticos para derivados de pirollocitosina 15~ 20.

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Comp.: Material de partida X Datos espectrales & fisicos

15: 4 BocHN. cr * 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 5 11.12 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 6.79 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 6.00 (s, 1H), 4.68 (s, 2H), 4.14 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.65 (t, J = 6.6, 2H), 3.39 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.08 (m, 2H), 2.78 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.37 (s, 9H), 1.20 (t, J = 7.2 Hz, 3H). Solido/espuma verde palida.

16: 5 BocHN. cr i AVWV 1 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 5 11.35 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 6.87 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 6.21 (s, 1H), 4.70 (s, 2H), 4.41 (s, 2H), 4.15 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.43 (m, 2H), 3.12 (m, 2H), 1.38 (s, 9H), 1.21 (t, J = 7.2 Hz, 3H). Solido/espuma amarilla palida.

17: 6 NHBoc^ BocN j X 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 5 11.20 (br s, 0.6H), 8.86 (br s, 0.4H), 8.57 (s, 0.2H), 8.35 (s, 0.8H), 6.83-6.76 (m, 1H), 6.00 (s, 0.8H), 5.76 (s, 0.2H), 4.75 (s, 0.3H), 4.70 (s, 1.7H), 4.55 (s, 0.3H), 4.30 (s, 1.7H), 4.14 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.18 (m, 2H), 2.90-2.88 (m, 2H), 1.58 (m, 2H), 1.401.36 (m, 18h), 1.20 (t, 3H). Solido/espuma marron.

18: 7 ChzN^NHCbz hn-^9 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 5 11.57 (s, 1H), 11.33 (s, 1H), 8.50 (m, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.44-7.31 (m, 10H), 6.22 (s, 1H), 5.22 (s, 2H), 5.03 (s, 2H), 4.70 (s, 2H), 4.44 (s, 2H), 4.14 (q, 2H), 3.57-3.53 (m, 4H), 1.21 (t, 3H). Solido marron palido.

19: 8 BocHN / cr 'H NMR (500MHz; DMSOd6) 5 11.32 (s, 1H), 8.38 (s, 1H), 6.71 (d, 1H), 6.20 (s, 1H), 4.70 (s, 2H), 4.41 (m, 2H), 4.14 (q, 2H), 3.65 (m, 1H), 3.37-3.34 (m, 1H), 3.26-3.22 (m, 1H), 1.37 (s, 9H), 1.20 (t, 3H), 1.02 (d, 3H). Solido marron palido.

20: 9 BocHN. Q> s -NBoc T> 1 •MUM 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 5 11.13 (s, 1H), 8.25 (s, 1H), 6.73 (s, 1H), 5.99 (s, 1H), 4.68 (s, 2H), 4.12 (q, 2H), 3.67 (t, 2H), 3.48~3.27 (m, 10H), 3.04 (q, 2H), 2.78 (t, 2H), 1.38 (s, 9H), 1.36 (s, 1H), 1.19 (t, 3H). Solido marron.

A partir de los derivados de pirollocitosina 15, 16, 17, y 20, se prepararon monomeros de PNA citosina modificada 21 ~ 24 siguiendo de manera similar los procedimientos descritos en los Ejemplos 11 ~ 14. Los datos espectrales y fisicos para los comps. 21 ~ 24 se proporcionan en la tabla mas abajo.

Ejemplos 21 ~ 24: Datos anaKticos para monomeros de PNA citosina 21 ~ 24.

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Comp.: Material de partida X Datos espectrales & flsicos

21: 15 BocHN. cr L/ ’H NMR (400MHz; DMSOd6) 5 11.06 (s, 1H), 8.36 (m, 1H), 8.28 (m, 1H), 8.14 (s, 0.6H), 8.08 (2, 0.4H), 7.72 (m, 2H), 6.78 (t, 1H), 5.98 (s, 1H), 4.91 (s, 1.2H), 4.80 (s, 0.8H), 4.51 (s, 0.8H), 4.29 (s, 1.2H), 4.24 (m, 1.2H), 4.06 (m, 2H), 3.86 (m, 0.8H), 3.64 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.38 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.07 (m, 2H), 2.78 (m, 2H), 1.37 (s, 9H). MS/ESI (m+1) = 660.2 (observado), PM = 659.8 (C28H33N7O8S2). Solido/espuma marron.

22: 16 BocHN. cr i «AiWWV 1 'H NMR (400MHz; DMSOd6) 5 11.31 (s, 1H), 8.36 (m, 1H), 8.30-8.27 (m, 1.6H), 8.22 (s, 0.4H), 7.73 (m, 2H), 6.87 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 6.20 (m, 1H), 4.94 (s, 1.2H), 4.83 (s, 0.8H), 4.52 (s, 0.7H), 4.41 (s, 2.1H), 4.30 (s, 1.1 H), 4.25 (m, 1.2H), 4.06 (m, 2H), 3.87 (m, 0.8H), 3.42 (t, 2H), 3.12 (m, 2H), 1.38 (s, 9H). MS/ESI (m+1) = 646.2 (observado), PM = 645.7 (C27H31N7O8S2). Solido/espuma roja.

23: 17 NHBoc^ B°CN>< nH NMR (400MHz; DMSOd6) 5 11.16 (br s, 1H), 8.36 (m, 1H), 8.28 (m, 1H), 8.21 (s, 0.6H), 8.15 (s, 0.4H), 7.73 (m, 2H), 6.77 (br s, 1H), 6.00 (br s, 1H), 4.92 (s, 1.2H), 4.82 (s, 0.8H), 4.52 (s, 0.9H), 4.30 (s, 3.1H), 4.25 (m, 1.2H), 4.07 (m, 2H), 3.87 (m, 0.8H), 3.19 (m, 2H), 2.89 (m, 2H), 1.59 (m, 2H), 1.41-1.36 (m, 18H); MS/ESI (m+23/MNa+) = 781.3 (observado), PM = 758.9 (C33H42N8O9S2). Solido/espuma roja.

24: 20 BocHNL cr s -NBoc v . >A/tfV 1H NMR (500MHz; DMSOd6?? 5 11.10 (m,1H), 8.35 (m, 1H), 8.28 (m, 1H), 8.14 (s, 0.6H), 8.08 (s, 0.4H), 7.72 (m, 2H), 6.76 (m, 1H), 5.97-5.96 (s, 1H), 4.90 (s, 1.2H), 4.80 (s, 0.8H), 4.51 (s, 0.8H), 4.29 (s, 1.2H), 4.25 (t, 1.2H), 4.08-4.04 (m, 2H), 3.86 (t, 0.8H), 3.66 (m, 2H), 3.47 (m, 2H), 3.41 (m, 2H), 3.323.30 (m, 4H), 3.27 (m, 2H), 3.04 (m, 2H), 2.77 (m, 2H), 1.37 (s, 9H), 1.35 (s, 9H). MS/ESI (m+23/MNa+) = 869.3 (observado), PM = 847.0 (C37H50N8OnS2). Solido amarillo.

Ejemplo 25: Preparacion de 2-{3-(t-butoxicarbonilamino)propil}amino-adenina (25).

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6.8g de 2-cloroadenina disueltos en 68ml de 1,3-diaminopropano y 68ml de monometoxietanol se agitaron a reflujo por 24h, y la mezcla de reaccion se concentro al vado. El residuo resultante se disolvio en 100ml de THF y 100ml de agua, a lo cual se anadieron lentamente 60g de BoC2O disueltos en 70ml de THF. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente por 6h, y despues el solvente organico se elimino a presion reducida. La capa ac. resultante se extrajo dos veces con 100ml de EA. La capa organica se lavo con 0.5M acido dtrico ac. y con salmuera, y se seco sobre sulfato magnesico anhidro. La capa organica se concentro a presion reducida y se sometio a separacion cromatografica (1:10 MeOH/MC) para obtener 4.07g de un comp. protegido con dos grupos Boc. Este compuesto se disolvio en 100ml MeOH, a lo cual se anadieron lentamente 45ml carbonato sodico saturado ac.. La solucion de reaccion se agito a 50°C por 1h, y despues se concentro al vado. El residuo resultante se disolvio en 50ml MeOH y el material insoluble se filtro. Despues, el filtrado se concentro para proporcionar 3.16g del comp. 25 como un solido

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blanco. 1H NMR (400MHz; DMSOda) 8 12.11 (br s, 1H), 7.63 (s, 1H), 6.78 (t, 1H), 6.55 (s, 2H), 6.07 (t, 1H), 3.20 (q, 2H), 2.96 (q, 2H), 1.60 (m, 2H), 1.37 (s, 9H).

A partir de 2-cloroadenina y una diamina adecuada, los derivados 2,6-diaminopurina 26 ~ 30 se prepararon siguiendo de manera similar el procedimiento descrito en el Ejemplo 25. Datos espectrales y ffsicos para los compuestos 26 ~ 30 se proporcionan en la tabla mas abajo.

Ejemplos 26 ~ 30: Datos analfticos para los derivados de 2,6-diaminopurina 26 ~ 30.

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Comp.: Diamina de partida L2 Datos espectrales & fisicos

26: H2N h2nt (CH2)2- 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 8 12.20 (br s, 1H), 7.66 (s, 1H), 6.84 (t, 1H), 6.62 (s, 2H), 6.10 (t, 1H), 3.25 (q, 2H), 3.08 (q, 2H), 1.36 (s, 9H). Solido amarillo palido.

27: NH, > (CH2)4- 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 8 12.07 (br s, 1H), 7.63 (s, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.50 (s, 2H), 6.02 (s, 1H), 3.18 (q, 2H), 2.91 (q, 2H), 1.481.36 (m, 13H). Solido verde amarillento.

: nh2

28: nh2 HZN^J (CH2)5- 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 8 12.14 (br s, 1H), 7.65 (s, 1H), 6.77 (t, 1H), 6.55 (s, 2H), 6.01 (s, 1H), 3.17 (m, 2H), 2.89 (q, 2H), 1.48 (m, 2H), 1.41-1.36 (m, 11H), 1.26 (m, 2H). Solido espuma amarilla palida.

29: nh2 (CH2)7- 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 8 12.11 (br s, 1H), 7.64 (s, 1H), 6.78 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 6.56 (s, 2H), 6.04 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 3.17 (td, J = 6.3, 6.3 Hz, 2H), 2.88 (td, J= 6.7, 6.7 Hz, 2H), 1.49-1.47 (m, 2H), 1.36-1.31 (m, 11H), 1.29-1.22 (m, 6H). Solido verde amarillento.

: ^nh2

30: nh2 Sd h2n 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 8 12.15 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 6.84 (t, 1H), 6.56 (s, 2H), 6.05 (t, 1H), 3.48 (t, 2H), 3.39-3.34 (m, 4H), 3.07 (q, 2H), 1.37 (s, 9h). Espuma amarilla.

Ejemplo 31: Preparacion de 2-[2-{2-(t-butoxicarbonilamino)-2-metil}etil]-amino-1H-purin-6(9H)-ona (31).

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11g de 2-clorohipoxantina y 4.96ml de 1,2-diaminopropano(racemico) se dispersaron en 33ml de monometoxietanol, y se agito por 24h a 130°C. El solvente se elimino al vado, y el residuo resultante se disolvio en 97ml de THF y 97ml de agua, a lo cual se anadieron lentamente 22.8g de Boc2O disueltos en 64ml de THF. La mezcla de reaccion se agito a temperature ambiente por 6h, y EA se anadio a la solucion. El precipitado resultante se recogio por filtracion para obtener el comp. 31 como un solido gris.1H NMR (500MHz; DMSOda) 8 12.42 (s, 1H), 10.44 (br s, 1H), 7.61 (s, 1H), 6.76 (d, 1H), 6.27 (m, 1H), 3.67 (m, 1H), 3.32 (m, 1H), 3.14 (m, 1H), 1.36 (s, 9H), 1.02 (d, 3H).

Ejemplo 32: Preparacion de etil 2-[6-amino-2-{3-(t-butoxicarbonilamino)-propil}amino-9H-purin-9-il]acetato (32).

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A una solucion agitada de 3.16g del comp. 25 disueltos en 100ml de DMF, se anadieron 480mg de 55% NaH en aceite mineral. La solucion de reaccion se agito por 2h, despues de lo cual se anadieron lentamente 1.98ml de bromoacetato de etilo. 2h mas tarde, la mezcla de reaccion se concentro al vado, y se purifico por cromatograffa de columna (1:10 EtOH/EA) para dar 2.92g del analogo de diaminopurina 32 como un solido amarillo palido. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 8 7.67 (s, 1H), 6.80 (t, 1H), 6.71 (s, 2H), 6.28 (t, 1H), 4.85 (s, 2H), 4.15 (q, 2H), 3.20 (q, 2H), 2.94 (q, 2H), 1.57 (m, 2H), 1.37 (s, 9H), 1.21 (t, 3H).

Ejemplo 33: Preparacion de etil 2-[6-(benciloxicarbonil)amino-2-(3-(t-butoxi-carbonilamino)propil}amino-9H-purin-9- il]acetato (33).

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A una solucion agitada de 4.68g del comp. 32 disueltos en 100ml de DMF, se anadieron a temperatura ambiente 13.2g de N-(benciloxicarbonil)-N'-metil-imidazolio triflato. 12h mas tarde, la mezcla de reaccion se concentro a presion reducida, y se sometio a cromatograffa de columna (5% MeOH en MC) para producir 5.4g del comp. 33 como un solido blanco. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 8 10.19 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.45-7.33 (m, 5H), 6.88 (t, 1H), 6.77 (t, 1H), 5.18 (s, 2H), 4.94 (s, 2H), 4.16 (q, 2H), 3.25 (q, 2H), 2.95 (q, 2H), 1.60 (m, 2H), 1.36 (s, 9H), 1.21 (t, 3H).

Ejemplo 34: Preparacion de etil N-[2-{2-(benzo[d]tiazol)sulfonil}amino-etil]-N-[2-[6-(benciloxicarbonil)amino-2-{3-{t- butoxicarbonilamino)-propil}amino-9H-purin-9-il]acetil]glicinato (34).

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5.4g del comp. 33 y 950mg de LiOH se disolvieron en 40ml de THF y 40ml de agua, y se agito a temperatura ambiente por 1h. El THF se elimino al vado, y la solucion ac. resultante se acidifico hasta pH 3 con 1M HCl ac., y despues se extrajo con EA. La capa organica se seco sobre sulfato sodico anhidro y se concentro a presion reducida. El residuo resultante y 2.92g de etil 2-N-[2-{(benzo[d]tiazol-2-sulfonil)amino}etil]glicinato se disolvieron en 240ml de DMF, a lo cual se anadieron a temperatura ambiente 1.95g de EDCI y 1.38g de HOBt. La mezcla de reaccion se agito por 20h, se concentro a presion reducida, y se disolvio en MC. La solucion de se lavo con 1M HCl ac., se concentro al vado, y despues se purifico por cromatograffa de columna (5% MeOH/MC) para obtener 2.7g del comp. 34 como una espuma amarilla palida. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 8 10.18 (m, 1H), 8.97 (br s, 0.6H), 8.80 (br s, 0.4H), 8.28 (d, 1H), 8.18 (m, 1H), 7.80 (s, 0.6H), 7.76 (s, 0.4H), 7.66 (m, 2H), 7.46-7.32 (m, 5H), 6.77 (m, 2H), 5.18 (s, 2H), 5.10 (s, 1.2H), 4.89 (s, 0.8H), 4.45 (s, 0.8H), 4.17 (q, 0.8H), 4.07-4.00 (m, 2.4H), 3.68 (m, 1.2H), 3.47 (m, 1.2H), 3.41 (m, 0.9H), 3.22 (m, 2.7H), 2.94 (m, 2H), 1.59 (m, 2H), 1.36 (s, 9H), 1.31-1.12 (m, 3H).

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Ejemplo 35: Preparacion de 1-(benzo[d]tiazol-2-sulfonil)-2-oxo-4-[[6-(bencil-oxicarbonil)amino-2-(3- (t-butoxicarbonilamino)propilamino}-9H-purin-9-il]-acetil]piperazina (35).

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2.7g del comp. 34 y 340mg de LiOH se dispersaron en 15ml de THF y 20ml de agua, y se agito por 30 min a temperature ambiente. El THF se elimino a presion reducida. Despues, la capa ac. resultante se acidifico hasta pH 3 con 1M HCl ac., y se extrajo con EA. La capa de EA se seco sobre sulfato sodico anhidro y se concentro al vacfo para obtener 2.48g de un producto crudo. El producto crudo y 716mg de EDCI disueltos en 70ml de DMF se agitaron a temperature ambiente por 20h. El solvente se elimino a presion reducida, y el residuo resultante se disolvio en MC y se lavo con 1M HCl ac. y despues con agua. La capa organica se concentro al vacfo y se purifico por cromatograffa de columna (acetona) para obtener 1.4g del comp. 35 como una espuma blanca. 1H nMr (400MHz; DMSOd6) 6 10.16 (s, 1H), 8.35 (m, 1H), 8.26 (m, 1H), 7.81 (s, 0.6H), 7.77 (s, 0.4H), 7.72 (m, 2H), 7.45-7.31 (m, 5H), 6.78 (m, 2H), 5.18 (s, 2H), 5.12 (s, 1.2H), 5.01 (s, 0.8H), 4.55 (s, 0.8H), 4.29-4.27 (m, 2.4H), 4.09 (m, 2H), 3.88 (m, 0.8H), 3.26 (m, 2H), 2.95 (m, 2H), 1.61 (m, 2H), 1.36 (s, 9H); MS/ESI (m+1) = 779.2 (observado), PM = 778.9 (C34H38N10O8S2).

A partir de los derivados de 2,6-diaminopurina26 ~ 30, monomeros de PNA adenina modificados 36 ~ 40 se prepararon de manera similar a los procedimientos descritos en los Ejemplos 32 ~ 35. Datos espectrales y ffsicos para los comp. 36 ~ 40 se proporcionan en la tabla mas abajo.

Ejemplos 36 ~ 40: Datos analfticos para los monomeros de PNA adenina 36 ~ 40.

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Comp.: Material de partida L2 Datos espectrales & fisicos

36: 26 (CH2)2- 1H NMR (400MHz; DMSOda) 8 10.17 (s, 1H), 8.36 (m, 1H), 8.26 (m, 1H), 7.82 (s, 0.6H), 7.78 (s,0.4H), 7.72 (m, 2H), 7.45-7.31 (m, 5H), 6.79 (2H), 5.18 (s, 2H), 5.12 (s, 1.2H), 5.01 (s, 0.8H), 4.55 (s, 0.8H), 4.29-4.25 (m, 2.4H), 4.09 (m, 2H), 3.87 (m, 0.8H), 3.29 (m, 2H), 3.11 (m, 2H), 1.33 (d, 9H). MS/ESI (m+1) = 765.2 (observado), PM = 764.8 (C33H36N10O8S2). Espuma blanca.

37: 27 (CH2)4- 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 8 10.10 (s, 1H), 8.36 (m, 1H), 8.26 (m, 1H), 7.80 (s, 0.6H), 7.76-7.71 (m, 2.4H), 7.46-7.31 (m, 5H), 6.81-6.73 (m, 2H), 5.18 (s, 2H), 5.12 (s, 1.2H), 5.01 (s, 0.8H), 4.55 (s, 0.8H), 4.30-4.25 (m, 2.4H), 4.09 (m, 2H), 3.88 (m, 0.8H), 3.26 (m, 2H), 2.90 (m, 2H), 1.50-1.36 (m, 13H); MS/ESI (m+1) = 793.3 (observado), Pm = 792.9 (C35H40N10O8S2). Solido/espuma roja amarillenta.

38: 28 (CH2)5- 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 8 10.09 (s, 1H), 8.35 (m, 1H), 8.26 (m, 1H), 7.80 (s, 0.6H), 7.76 (s, 0.4H), 7.74-7.72 (m, 2.0H), 7.467.31 (m, 5H), 6.79-6.72 (m, 2H), 5.18 (s, 2H), 5.12 (s, 1.2H), 5.01 (s, 0.8H), 4.56 (s, 0.8H), 4.30-4.27 (m, 2.4H), 4.09 (m, 2H), 3.88 (m, 0.8H), 3.25 (m, 2H), 2.89 (m, 2H), 1.49 (m, 2H), 1.36 (m, 11H), 1.25 (m, 2H); MS/ESI (m+1) = 807.3 (observado), PM = 806.9 (C36H42N10O8S2)- Solido/espuma amarilla.

39: 29 (CH2)7- 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 8 10.11 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 8.37-8.34 (m, 1H), 8.28-8.24 (m, 1H), 7.80 (s, 0.6H), 7.76 (s, 0.4 Hz), 7.757.70 (m, 2H), 7.75-7.31 (m, 5H), 6.82-6.74 (m, 2H), 5.18 (s, 2H), 5.12 (s, 1.2H), 5.01 (s, 0.8H), 4.58 (s, 0.8H), 4.29 (m, 1.2H), 4.27 (q, J = 4.9 Hz, 1H), 4.06-4.03 (m, 2H), 3.88 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 3.26-3.20 (m, 2H), 2.88-2.85 (m, 2H), 1.51-1.45 (m, 2H), 1.39-1.32 (m, 11H), 1.28-1.15 (m, 6H). MS/ESI (m+1) = 834.8 (observado), PM = 835.0 (C38H46N10O8S2). Solido/espuma amarilla rojiza.

40: 30 f; 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 8 10.14 (s, 1H), 8.35 (m, 1H), 8.26 (m, 1H), 7.82 (s, 0.6H), 7.78 (s, 0.4H), 7.73 (m, 2H), 7.46-7.31 (m, 5H), 6.81-6.74 (m, 2H), 5.18 (s, 2H), 5.13 (s, 1.2H), 5.02 (s, 0.8H), 4.55 (s, 0.8H), 4.30-4.26 (m, 2.4H), 4.09 (m, 2H), 3.88 (m, 0.8H), 3.50 (m, 2H), 3.43-3.38 (m, 4H), 3.07 (m, 2H), 1.36 (s, 9H); MS/ESI (m+1) = 809.3 (observado), PM = 808.9 (C35H40N10O9S2). Espuma amarilla palida.

Ejemplo 41: Preparacion de etil 2-[2-[2-{2-(t-butoxicarbomlamino)-2-metil}etil]amino-6-oxo-6,9-dihidro-1H-purin-2- il]acetato (41).

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A una solucion agitada de 4.69g del comp. 31 en 47ml de DMF, se anadieron 790mg de 55% NaH en aceite mineral y la solucion de reaccion se agito por 2h. Despues que 1.85ml de bromoacetato de etilo se anadieron lentamente, la solucion de reaccion se agito por otras 2h. La mezcla de reaccion se concentro al vado y se purifico por cromatograffa de columna (5:95 MeOH/Mc) para obtener 5.04g del comp. 41 como un solido amarillo palido. 1H NMR (500MHz; DMSOda) 8 10.55 (s, 1H), 7.67 (s, 1H), 6.74 (d, 1H), 6.40 (m, 1H), 4.87 (s, 2H), 4.17 (q, 2H), 3.65 (m, 1H), 3.28 (m, 1H), 3.16 (m, 1H), 1.36 (s, 9H), 1.21 (t, 3H), 1.01 (d, 3H).

Ejemplo 42: Preparacion de 2-{2-(t-butoxicarbonilamino)etoxi}etilamina (42).

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A 146g de [2-{2-(t-butoxicarbonilamino)etoxiletil]metano sulfonato se disolvio en 500ml de DMF, se anadieron 134g de azida sodica. La mezcla de reaccion se agito a 70°C por 20h, y despues se concentro a presion reducida. El residuo resultante se disolvio en 1,200ml de agua y se extrajo con EA. La capa organica se seco sobre sulfato sodico anhidro y se concentro al vado. El residuo resultante se disolvio en 2,000ml de THF, a lo cual se anadieron 162g de trifenilfosfina. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente por 2h, despues de lo cual se anadieron 200ml de agua. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente por 18h y se concentro hasta 500ml a presion reducida. Despues, el precipitado resultante se filtro. El filtrado se concentro adicionalmente a presion reducida para eliminar el THF, y se lavo con MC. La capa ac. se concentro para obtener 86.2g del comp. 42 como un lfquido. 1H NMR (400MHz; CDCh) 8 4.96 (br s, 1H), 3.54-3.48 (m, 4H), 3.34 (q, 2H), 2.88 (t, 2H), 1.48-1.46 (m, 11H).

Ejemplo 43: Preparacion de 2-[2-{2-(t-butoxicarbonilamino)-etoxi}etil]amino-1H-purin-6(9H)-ona (43).

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6.3g del comp. 42 y 2.0g de 2-bromohipoxantina se dispersaron en 55ml de monometoxietanol y 17.5ml de agua. La mezcla de reaccion se agito a reflujo por 16h, y el solvente se elimino a presion reducida. Despues, el concentrado se agito en 20ml de MC y 10ml de agua por 30 min, y el precipitado resultante se recogio por filtracion para obtener 2.1g del comp. 43 como un solido amarillo palido. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 8 12.43 (br s, 1H), 10.45 (br s, 1H), 7.89 (s, 0.2H), 7.61 (s, 0.8H), 6.77 (m, 1H), 6.34 (s, 0.8H), 6.12 (s, 0.2H), 3.52 (t, 2H), 3.41 (m, 4H), 3.09 (q, 2H), 1.36 (s, 9H).

Ejemplo 44: Preparacion de 2-[2-[3-(t-butoxicarbonilamino)propiloxi}-etil]]-amino-1H-purin-6(9H)-ona (44).

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2-{3-(t-butoxicarbonilamino)propiloxi}etilamina y 2-bromohipoxantina reaccionaron siguiendo de manera similar el procedimiento descrito en el Ejemplo 43 para producir el compuesto 44 como un solido blanco. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 8 12.43 (br s, 1H), 10.45 (br s 1H), 7.61 (m, 1H), 6.80 (t, 1H), 6.30 (s, 0.7H), 6.08 (s, 0.3H), 3.49 (t, 2H), 3.41 (t, 4H), 2.99 (q, 2H), 1.61 (m, 2H), 1.37 (s, 9H).

Ejemplo 45: Preparacion de 2-{3-(t-butoxicarbonilamino)propil}amino-1H-purin-6(9H)-ona (45).

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Una mezcla de 10g de clorohipoxantina y 19.6ml 1,3-diaminopropano dispersados en 40ml de monometoxietanol se agito a 130°C por 10h. Despues, el solvente se elimino a presion reducida y el residuo resultante se disolvio en 150ml de THF y 150ml de agua, a lo cual se anadieron lentamente 19.2g de Boc2O disueltos en 100ml de THF. La mezcla se agito a temperatura ambiente por 6h. Despues que EA se anadio, el precipitado resultante se recogio por filtracion para obtener 6.31g del comp. 45 como un solido verde oscuro. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 5 11.13 (br s, 1H), 7.64 (s, 1H), 6.87 (s, 1H), 6.31 (s, 1H), 3.23 (q, 2H), 2.98 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 1.38 (s, 9H).

Los derivados de guanina 46 ~ 47 se prepararon usando una diamina adecuada siguiendo de manera similar el procedimiento descrito en el Ejemplo 45. Datos espectrales y ffsicos para los comp. ~46 47 se proporcionan en la tabla mas abajo.

Ejemplos 46 ~ 47: Datos anaffticos para los derivados de guanina 46 ~ 47.

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Comp.: Diamina usada n Datos espectrales & ffsicos

46: Etileno diamina 2 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 5 12.43 (br s, 1H), 10.61 (br, 1H), 7.62 (s, 1H), 6.93 (t, 1H), 6.32 (s, 1H), 3.29 (q, 2H),3.10 (q, 2H), 1.37 (s, 9H). Solido gris.

47: Pentileno diamina 5 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 5 12.44 (s, 1H), 10.35 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 6.80 (m, 1H), 6.29 (m, 1H), 3.21 (m, 2H), 2.90 (m, 2H), 1.49 (m, 2H), 1.39-1.35 (m, 11H), 1.27-1.23 (m, 2H). Solido marron palido.

Los comp. 43 ~ 46 se transformaron en los comp. 48 ~ 51 siguiendo de manera similar el procedimiento descrito en el Ejemplo 32. Datos espectrales y ffsicos para compuestos 48 ~ 51 se proporcionan en la tabla mas abajo.

Ejemplos 48 ~ 51: Datos anaffticos para los derivados de guanina 48 ~ 51.

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Comp.: Material de partida L3 Datos espectrales & ffsicos

48: 43 C 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 5 10.67 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 6.78 (m, 1H), 6.15 (t, 1H), 4.87 (s, 2H), 4.15 (q, 2H), 3.51 (m, 2H), 3.41 (m, 4H), 3.10 (m, 2H), 1.37 (s, 9H), 1.20 (t, 3H). Solido/espuma blanca.

49: 44 1 vvw 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 5 10.57 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 6.79 (m, 1H), 6.44 (m, 1H), 4.87 (s, 2H), 4.16 (q, 2H), 3.48 (t, 2H), 3.40 (m, 4H), 2.99 (q, 2H), 1.61 (m, 2H), 1.37 (s, 9H), 1.21 (t, 3H). Solido/espuma amarilla.

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50: 45 1 WW 1 1H NMR (500MHz; DMSOda) 8 10.64 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 6.91 (t, 1H), 6.47 (s, 1H), 4.88 (s, 2H), 4.16 (q, 2H), 3.28 (q, 2H), 3.08 (q, 2H), 1.36 (s, 9H), 1.21 (t, 3H). Solido rojo oscuro.

51: 46 * 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 8 10.44 (br s, 1H), 7.66 (s, 1H), 6.77 (m, 1H), 6.41 (m, 1H), 4.86 (s, 2H), 4.16 (q, 2H), 3.21 (q, 2H), 2.89 (q, 2H), 1.48 (m, 2H), 1.41-1.36 (m, 11H), 1.28-1.19 (m, 5H). Solido gris oscuro.

A partir de los derivados de guanina 48, 49 y 51, monomeros de PNA guanina modificados 52 ~ 54 se prepararon de manera similar a los procedimientos descritos en los Ejemplos 34 ~ 35. Datos espectrales y ffsicos para los comps. 52 54 se proporcionan en la tablas mas abajo.

Ejemplos 52 ~ 54: Datos analfticos para monomeros de PNA guanina 52 ~ 54.

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Comp.: Material de partida L3 Datos espectrales & fisicos

52: 48 c 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 8 10.61 (m, 1H), 8.36 (m, 1H), 8.25 (m, 1H), 7.76-7.65 (m, 3H), 6.78 (t, 1H), 6.54 (m, 1H), 5.07 (s, 1.2H), 4.96 (s, 0.8H), 4.54 (s, 0.8H), 4.30 (s, 1.2H), 4.25 (m, 1.2H), 4.07 (m, 2H), 3.88 (m, 0.8H), 3.49 (m, 2.4H), 3.40 (m, 3.6H), 3.09 (m, 2H), 1.36 (s, 9H); MS/ESI (m+1) = 676.1 (observado), PM = 675.8 (C27H33N9O8S2). Solido/espuma marron oscuro.

53: 49 1 vvw ) JVVU 1 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 8 10.69 (s, 1H), 8.36 (m, 1H), 8.25 (m, 1H), 7.73 (m, 2H), 7.64-7.60 (m, 1H), 6.80 (t, 1H), 6.65 (br s, 1H), 5.05 (s, 1.2H), 4.94 (s, 0.8H), 4.54 (s, 0.8H), 4.29 (s, 1.2H), 4.24 (m, 1.2H), 4.07 (m, 2H), 3.87 (m, 0.8H), 3.46~3.39 (m, 6H), 2.97 (m, 2H), 1.60 (m, 2H), 1.36 (s, 9H); MS/ESI (m+1) = 689.8 (observado), PM = 689.8 (C28H35N9O8S2). Solido/espuma amarilla.

54: 51 $ 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 8 10.42-10.40 (m, 1H), 8.37-8.32 (m, 1H), 8.28-8.25 (m, 1H), 7.73-7.70 (m, 2H), 7.58-7.54 (m, 1H), 6.76 (t, 1H), 6.39-6.38 (m, 1H), 5.03 (s, 1.2H), 4.92 (s, 0.8H), 4.54 (s, 0.8H), 4.29 (s, 1.2H), 4.25 (m, 1.2H), 4.08-4.07 (m, 2H), 3.87 (m, 0.8H), 3.18 (m, 2H), 2.89 (m, 2H), 1.47 (m, 2H), 1.40-1.30 (m, 11H), 1.24 (m, 2H). MS/ESI (m+23/MNa+) = 696.2 (observado), PM = 673.8 (C28H35N9O7S2). Solido/espuma roja.

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Ejemplo 55: Preparacion de etil 2-[6-amino-2-{2-(t-butoxicarbonil-amino)etil}-amino-9H-purin-9-il]acetato (55).

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El comp. 55 se preparo a partir del comp.26 siguiendo de manera similar el procedimiento para el Ejemplo 32. Solido amarillo palido. 1H NMR (400MHz; DMSOda) 8 7.70 (s, 1H), 6.84 (t, 1H), 6.79 (s, 2H), 6.30 (t, 1H), 4.87 (s, 2H), 4.16 (q, 2H), 3.25 (q, 2H), 3.08 (q, 2H), 1.37 (s, 9H), 1.22 (t, 3H).

Ejemplo 56: Preparacion de etil 2-[6-amino-2-[2-{2,3-bis(benciloxi-carbonil)guanidino}etil]amino-9H-purin-9-il]acetato (56).

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A 4.42g del comp. 55 disueltos en 22ml MC, se anadieron lentamente 22ml TFA a 0°C, y la solucion se agito por 2.5h. La solucion de reaccion se concentro a presion reducida, a lo cual se anadieron 100ml de eter de dietilo. El precipitado resultante se recogio por filtracion para obtener 5.79g de un producto intermedio solido marron palido. 3.9g del intermedio se disolvieron en 39ml MC, a lo cual se anadieron lentamente 6.9ml de TEA a 0°C. La solucion se agito por 15min a temperatura ambiente, a lo cual se anadieron 2.48g de 1,3-bis(benciloxicarbonil)-2-(metiltio)pseudourea. Despues, la mezcla de reaccion se agito por otras 24h, y se lavo con 0.5M HCl ac. La capa organica se seco sobre sulfato magnesico anhidro y se concentro a presion reducida para producir 4.58g del comp.56 como un solido amarillo palido. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 8 11.59 (s, 1H), 8.56 (t, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.39-7.29 (m, 10H), 6.75 (s, 2H), 6.53 (s, 1H), 5.15 (s, 2H), 5.02 (s, 2H), 4.86 (s, 2H), 4.13 (q, 2H), 3.50 (q, 2H), 3.37 (m, 2H), 1.19 (t, 3H).

Ejemplo 57: Preparacion de etil 2-[6-(benciloxicarbonilamino)-2-[2-{2,3-bis-(benciloxicarbonil)guanidino}etil]amino-9H- purin-9-il]acetato (57).

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4.54g del comp. 56 y 8.22g de N-(benciloxicarbonil)-N'-metilimidazolio triflato se disolvieron en 90ml de DMF, y se agito por 29h a temperatura ambiente. El solvente se elimino a presion reducida, y el residuo resultante se purifico por cromatograffa de columna (1:3 hexano/EA) para proporcionar 3.06g del comp. 57 como una espuma blanca/solido. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 8 11.60 (s, 1H), 10.25 (s, 1H), 8.57 (t, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.45-7.29 (m, 15H), 7.14 (t, 1H), 5.18 (s, 2H), 5.14 (s, 2H), 5.02 (s, 2H), 4.95 (s, 2H), 4.15 (q, 2H), 3.54 (q, 2H), 3.42 (q, 2H), 1.19 (t, 3H).

Ejemplo 58: Preparacion de etil 2-[6-amino-2-{4-(t-butoxicarbonil-amino)butil}-amino-9H-purin-9-il]acetato (58).

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El comp. 58 se prepare a partir del comp.27 como un solido/espuma amarilla rojiza siguiendo de manera similar el procedimiento descrito en el Ejemplo 32.1H NMR (500MHz; DMSOda) 8 7.67 (s, 1H), 6.79 (t, 1H), 6.69 (s, 2H), 6.30 (m, 1H), 4.85 (s, 2H), 4.15 (q, 2H), 3.22-3.17 (m, 2H), 2.93-2.89 (m, 2H), 1.45 (m, 2H), 1.40-1.36 (m, 11H), 1.21 (t, 3H).

Ejemplo 59: Preparacion de etil 2-[6-(benciloxicarbonilamino)-2-[4-(2,3-bis-(benciloxicarbonil)guanidino}butil]amino-9H- purin-9-il]acetato (59).

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El comp. 59 se preparo a partir del comp.58 como un solido/espuma amarilla palida siguiendo de manera similar los procedimientos descritos en los Ejemplos 56 ~ 57. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 8 11.49 (s, 1H), 10.12 (s, 1H), 8.28 (t, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.45-7.31 (m, 5H), 6.95 (t, 1H), 5.17 (s, 2H), 4.93 (s, 2H), 4.16 (q, 2H), 3.28 (m, 4H), 1.51 (m, 4H), 1.46 (s, 9H), 1.38 (s, 9H), 1.21 (t, 3H).

Ejemplo 60: Preparacion de etil 2-[6-amino-2-{5-(t-butoxicarbonilamino)-pentil}amino-9H-purin-9-il]acetato (60).

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El comp. 60 se preparo a partir del comp.28 como un solido/espuma amarilla rojiza siguiendo de manera similar el procedimiento descrito en el Ejemplo 32.1H NMR (500MHz; DMSOd6) 8 7.67 (s, 1H), 6.78 (t, 1H), 6.69 (s, 2H), 6.28 (m, 1H), 4.85 (s, 2H), 4.15 (q, 2H), 3.18 (q, 2H), 2.89 (q, 2H), 1.47 (m, 2H), 1.40-1.34 (m, 11H), 1.25 (m, 2H), 1.21 (t, 3H).

Ejemplo 61: Preparacion de etil 2-[6-{di-(t-butoxicarbonil))amino-2-[5-1(t-butoxicarbonil)amino}pentil]amino-9H-purin-9- il]acetato (61).

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A 6.98g del comp. 60 disueltos en 100ml de THF, se anadieron 7.95g de Boc2O y 186mg de 4-(N,N- dimetilamino)piridina, y la solucion se agito por 10min. Despues, la solucion se mezclo con 4.62ml de TEA, se agito por 30min, lentamente se calento hasta 50°C, y despues, se agito por otras 24h a la temperatura. La solucion de reaccion se concentro al vacfo, y el residuo resultante se disolvio en 170ml de EA y se lavo en serie con 0.5M HCl ac. y agua. La capa organica se seco sobre sulfato sodico anhidro, se concentro, y se sometio a separacion cromatografica (1:1 hexano/MC ^ MC) para obtener el comp. 61 como un solido/espuma amarilla. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 8 8.05 (s, 1H), 7.23 (t, 1H), 6.77 (t, 1H), 5.00 (s, 2H), 4.19 (q, 2H), 3.25 (q, 2H), 2.91 (q, 2H), 1.53 (m, 2H), 1.40-1.39 (m, 29H), 1.28 (m, 2H), 1.22 (t, 3H).

Ejemplo 62: Preparacion de etil 2-[2-[2-{2,3-bis-(benciloxicarbonil)-guanidino}etil]amino-6-oxo-6,9-dihidro-1H-purin-2- il]acetato (62).

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El comp. 50 se convirtio al comp. 62 como un solido blanco siguiendo de manera similar el procedimiento descrito en el Ejemplo 57. 1H NMR (500MHz; DMSOda) 8 11.59 (s, 1H), 10.68 (s, 1H), 8.50 (t, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.42-7.29 (m, 10H), 6.58 (m, 1H), 5.13 (s, 2H), 5.02 (s, 2H), 4.86 (s, 2H), 4.12 (q, 2H), 3.50 (m, 2H), 3.46 (m, 2H), 1.18 (t, 3H).

Ejemplo 63: Preparacion de acido 2-[6-(benciloxicarbonilamino)-2-[2-12,3-bis-(benciloxicarbonil)guanidino}etil]amino-9H- purin-9-il]acetico (63).

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A 2.57g del comp. 57 disueltos en 7.1ml de THF y 7.1ml de agua, se anadieron 340mg de LiOH a 0°C, y la solucion se agito a temperatura ambiente por 40min. La solucion de reaccion se acidifico hasta pH 5~6 con 1N HCl ac. a 0°C, y el solido resultante se recogio por filtracion para producir 2.33g del comp. 63 como un solido blanco. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 8 11.59 (s, 1H), 10.21 (s, 1H), 8.57 (t, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.45-7.28 (m, 15H), 7.12 (t, 1H), 5.17 (s, 2H), 5.13 (s, 2H), 5.02 (s, 2H), 4.83 (s, 2H), 3.53 (q, 2H), 3.42 (q, 2H).

Ejemplo 64: Preparacion de t-butil N-[2-{(9H-fluoren-9-il)metoxicarbonil-amino}etil)]-N-[2-(6-(benciloxicarbonilamino)-2- [2-{2,3-bis-(benciloxi-carbonil)-guanidino}etil]amino-9H-purin-9-il}acetil]glicinato (64).

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A 1.6g del comp. 63 disueltos en 30ml de DMF, se anadieron a 0°C 660mg de EDCI y 910mg de Fmoc-Aeg-OtBu. La solucion de reaccion se agito por 2h a temperatura ambiente y despues se concentro a presion reducida. El residuo resultante se disolvio en 50ml Me y se lavo con 0.5M HCl ac., y la capa organica se seco sobre sulfato sodico anhidro. Despues, la capa organica se concentro y se sometio a separacion cromatografica (65:1 MC/MeOH) para obtener 500mg del comp.64 como un solido blanco. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 811.59 (s, 0.4H), 11.58 (s, 0.6H), 10.21 (s, 1H), 8.55 (m, 1H), 7.47-7.28 (m, 20H), 7.06 (br, 1H), 5.17-4.89 (m, 8H), 4.34-4.28 (m, 2.8H), 4.20 (m, 1H), 3.95 (s, 1.2H), 3.52 (m, 3.4H), 3.43 (m, 2.2H), 3.34 (m, 1.7H), 3.12 (m, 0.7H), 1.43 (s, 3H), 1.34 (s, 6H).

Ejemplo 65: Preparacion de N-[2-{(9H-fluoren-9-il)metoxicarbonilamino}-etil)]-N-[2-{6-(benciloxicarbonilamino)-2-[2-{2,3- bis(benciloxicarbonil)-guanidino}etil]amino-9H-purin-9-il}acetil]glicina (65).

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A 460mg del comp. 64 disueltos en 3.6ml MC, se anadieron lentamente 3.6ml TFA a 0°C. La solucion de reaccion se agito a temperatura ambiente por 3.5h, y despues, 50ml eter de dietilo se anadieron. El precipitado resultante se recogio por filtracion para producir 430mg del comp. 65 como un solido blanco. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) 8 11.57 (s, 1H),

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10.77 (br s, 1H), 8.66 (s, 1H), 8.54 (s, 1H), 7.87 (m, 2H), 7.63 (m, 2H), 7.50-7.28 (m, 21H), 5.26-4.96 (m, 8H), 4.34-4.18 (m, 4H), 4.03 (s, 1H), 3.52-3.36 (m, 7H), 3.13 (m, 1H). MS/ESI (m+1) = 1019.4 (observado), PM = 1018.0

(C53H51N11O11).

Ejemplo 66: Preparacion de N-[2-{(9H-fluoren-9-il)metoxicarbonilamino}-etil)]-N-[2-{6-(benciloxicarbonilamino)-2-[4-{2,3- bis(benciloxicarbonil)-guanidino}-butil]amino-9H-purin-9-il}acetil]glicina (66).

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El comp. 59 se convirtio al comp. 66 como un solido/espuma blanca siguiendo de manera similar los procedimientos descritos en los Ejemplos 63 ~ 65. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 8 12.84 (br s, 1H), 11.50 (s, 1H), 10.14-10.13 (m, 1H), 8.28 (m, 1H), 7.88 (m, 2H), 7.80-7.77 (m, 1H), 7.68-7.66 (m, 2H), 7.49 (t, 1H), 7.45-7.29 (m, 9H), 6.90 (m, 1H), 5.17 (s, 2H), 5.07 (s, 1.2H), 4.89 (s, 0.8H), 4.35-4.18 (m, 3H), 4.00 (s, 1H), 3.52 (m, 1H), 3.35-3.25 (m, 6H), 3.12 (m, 1H), 1.49 (m, 4H), 1.44 (d, 9H), 1.37 (d, 9H). MS/ESI (m+1) = 978.4 (observado), PM = 978.1 (C49H59N11O11).

Ejemplo______67. Preparacion de N-[2-{(9H-fluoren-9-il)metoxicarbonilamino}-etil)]-N-[2-[6-[2-{2,3-

bis(benciloxicarbonil)guanidino}etoxi]metil-2-oxo-2H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-3(7H)-il]acetil]glicina (67).

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El comp. 18 se convirtio al comp. 67 como un solido amarillo palido siguiendo de manera similar los procedimientos descritos en los Ejemplos 63 ~ 65. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 8 11.99 (br s, 1H), 11.57 (br, 1H), 8.56 (m, 1H), 8.488.45 (m, 1H), 7.89-7.87 (m, 2H), 7.70-7.65 (m, 2H), 7.49-7.26 (m, 15H), 6.36-6.33 (m, 1H), 5.20 (s, 2H), 5.03-5.01 (m, 3.3H), 4.83 (s, 0.7H), 4.49-4.17 (m, 5.7H), 4.01 (m, 1.3H), 3.57-3.11 (m, 8H); MS/ESI (m+1) = 899.7 (observado), PM = 898.9 (C47H46N8O11).

Ejemplo______68: Preparacion de N-[2-{(9H-fluoren-9-il)metoxicarbonilamino}-etil)]-N-{2-[2-{2,3-bis-

(benciloxicarbonil)guanidino}etil]amino-6-oxo-6,9-dihidro-1H-purin-2-il]acetil}glicina (68).

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El comp. 62 se convirtio al comp. 68 como un solido/espuma blanca siguiendo los procedimientos descritos en Ejemplos

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63 ~ 65. 1H NMR (500MHz; DMSOda) 8 11.58 (s, 1H), 10.88 (s, 1H), 8.51 (m, 1H), 7.93 (m, 1H), 7.87 (m, 2H), 7.64 (m, 2H), 7.47 (t, 1H), 7.41-7.26 (m, 14H), 6.66 (br, 1H), 5.16-4.89 (m, 8H), 4.34-4.18 (m, 3.8H), 4.00 (m, 1.2H), 3.50-3.35 (m, 7H), 3.13 (m, 1H); MS/ESI (m+1) = 885.3 (observado), PM = 884.9 (C45H44N10O10).

Ejemplo 69: Preparacion de acido 2-[6-{2-(t-butoxicarbonilamino)etoxi}metil-2-oxo-2H-pirrolo-[2,3-d]pirimidin-3(7H)- il]acetico (69).

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El compuesto 16 se hidrolizo al compuesto 69 como un solido marron palido siguiendo de manera similar el procedimiento descrito en el Ejemplo 11. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 8 13.03 (br s, 1H), 11.31 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 6.85 (t, 1H), 6.19 (s, 1H), 4.63 (s, 2H), 4.40 (s, 2H), 3.42 (t, 2H), 3.11 (q, 2H), 1.37 (s, 9H).

Ejemplo 70: Preparacion de metil N-[2-{(9H-fluoren-9-il)metoxicarbonil-amino}etil)]-N-{2-[6-{2-(t-

butoxicarbonilamino)etoxi}metil-2-oxo-2H-pirrolo-[2,3-d]pirimidin-3(7H)-il]acetil}glicinato (70).

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3.6g del comp. 69, 3.6g de Fmoc-Aeg-OMe, 2.5g de EDCI 1.73g de HOBt, y 2.24ml DIEA se disolvieron en 70ml de DMF, y se agito a temperatura ambiente por 1.5h. El solvente de reaccion se elimino a presion reducida, y el residuo resultante se disolvio en 100ml MC y se lavo en serie con 1M HCl ac., agua destilada, y salmuera. La capa organica se seco sobre sulfato sodico anhidro, se concentro al vacfo, y se purifico por cromatograffa de columna (100:2 MC/MeOH) para proporcionar 2.5g del comp. 70 como un solido/espuma amarilla. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 8 11.30 (s, 1H), 8.24 (s, 0.65H), 8.21 (s, 0.35H), 7.89-7.87 (m, 2H), 7.71-7.67 (m, 2H), 7.48-7.25 (m, 5H), 6.87 (t, 1H), 6.17 (s, 0.7H), 6.15 (s, 0.3H), 4.93 (s, 1.3H), 4.74 (s, 0.7H), 4.40-4.39 (m, 2.7H), 4.35-4.21 (m, 3H), 4.08 (s, 1.3H), 3.73 (s, 0.8H), 3.62 (s, 2.2H), 3.51 (t, 1.4H), 3.43-3.30 (m, 3.6H), 3.13-3.10 (m, 3H), 1.37 (s, 9H).

Ejemplo_______71 Preparacion de N-[2-{(9H-fluoren-9-il)metoxicarbonilamino}-etil)]-N-{2-[6-{2-(t-

butoxicarbonilamino)etoxi}metil-2-oxo-2H-pirrolo-[2,3-d]pirimidin-3(7H)-il]acetil}glicina (71).

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A 5.0g del comp. 70 disueltos en 75ml 1:1:1 acetonitrilo/acetona/agua, se anadieron lentamente a 0°C 28.5ml de 2.5N LiOH ac.. La solucion de reaccion se agito por 10min y se neutralizo con 20% acido c^trico ac.. Despues que el pH de la la solucion se ajusto a 8 con bicarbonato sodico saturado ac., 516mg de Fmoc-OSu se anadieron a la solucion y la solucion se agito por 2h a temperatura ambiente. Despues, la solucion se acidifico hasta pH 3 con 20% acido cftrico ac. y se agito por 90min a 0°C. El precipitado resultante se recogio por filtracion para dar 4.0g del comp. 71 como un solido verde amarillento. 1H NMR (500MHz; DMSOda) 8 12.02 (br, 1H), 8.51-8.49 (m, 1H), 7.89-7.88 (d, 2H), 7.70-7.50 (m, 2H), 7.49 (t, 1H), 7.42-7.28 (m, 4H), 6.87 (t, 1H), 6.36 (s, 0.7H), 6.33 (s, 0.3H), 5.02 (s, 1.2H), 4.84 (0.8H), 4.43-4.42 (m, 2.4H), 4.34-4.19 (m, 3.2H), 4.01 (s, 1.4H), 3.48 (t, 1.2H), 3.44-3.41 (m, 2.1H), 3.37-3.29 (m, 2H), 3.12-3.10 (m, 2.7H), 1.37 (s, 9H); MS/ESI (m+1) = 689.3 (observado), PM = 688.7 (C35H40N6O9).

Ejemplo_______72. Preparacion de N-[2-{(9H-fluoren-9-il)metoxicarbonilamino}-etil)]-N-{2-[5-{(t-

butoxicarbonil)amino}pentil]amino-6-oxo-6,9-dihidro-1H-purin-2-il]acetil}glicina (72).

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El comp. 51 se convirtio al comp. 72 como un solido/espuma blanca siguiendo de manera similar los procedimientos descritos en los Ejemplos 69 ~ 71. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 8 13.01 (br, 1H), 10.52-10.46 (m, 1H), 7.88 (d, 2H), 7.65 (d, 2H), 7.54 (s, 0.5H), 7.50 (s, 0.5H), 7.48 (m, 1H), 7.40 (t, 2H), 7.31 (m, 2H), 6.81 (t, 0.5H), 6.72 (t, 0.5H), 6.52-6.48 (m, 1H), 4.98 (s, 1H), 4.77 (s, 1H), 4.33 (d, 1H), 4.23-4.21 (m, 2H), 4.05 (m, 1H), 3.96 (s, 1H), 3.50 (m, 1H), 3.35 (m, 2H), 3.21 (m, 2H), 3.14 (q, 1H), 2.88 (m, 2H), 1.46 (q, 2H), 1.39-1.35 (m, 11H), 1.23 (m, 2H); MS/ESI (m+1) = 717.4 (observado), PM = 716.8 (C36H44N8O8)

Ejemplo 73: Preparacion de N-[2-{(9H-fluoren-9-il)metoxicarbonilamino}-etil)]-N-[2-[6-{bis(t-butoxicarbonil)amino}-2-{5-(t- butoxicarbonilamino)-pentil}amino-9H-purin-9-il]acetil]glicina (73).

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El comp. 61 se convirtio al comp. 73 como una solido/espuma blanca siguiendo de manera similar los procedimientos descritos en los Ejemplos 69 ~ 71. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) 8 12.71 (br s, 1H), 7.90-7.87 (m, 3H), 7.67 (m, 2H), 7.44-7.39 (m, 3H), 7.31 (m, 2H), 7.07 (m, 1H), 6.69 (m, 1H), 5.11 (s, 1.2H), 4.93 (s, 0.8H), 4.37-4.21 (m, 3.8H), 4.01 (s, 1.2H), 3.52 (m, 1H), 3.36 (m, 2H), 3.23 (m, 2H), 3.13 (m, 1H), 2.88 (m, 2H), 1.49 (m, 2H), 1.38-1.35 (m, 27H), 1.27-1.25 (m, 4H); MS/ESI (m+1) = 916.5 (observado), PM = 916.0 (C46H61N9O11).

Preparacion de oligomeros de PNA: monomeros de PNA o, que se sintetizaron de acuerdo con el Esquema 4, se enviaron a Panagene, Inc (
www.panagene.com, Daejon, Corea del Sur) para preparar oligomeros de PNA de la Formula I en Panagene de acuerdo con el metodo descrito en la literatura o con modificacion(s) menor(s) de este. (Org. Lett. vol 9, 3291-3293, 2006) Se recibieron de Panagene oligomeros de PNA caracterizados por MALDI-tOf y analizados por HPLC- C18 de fase inversa. Los oligomeros de PNA recibidos de Panagene se usaron sin purificacion adicional.

Los monomeros de PNA q del Esquema 5 se usaron para sintetizar los oligomeros de PNA de la Formula I de acuerdo con el metodo descrito en la tecnica anterior o con modificacion(s) menor(s) de este. (patente US 6,133,444) Esos oligomeros de PNA se purificaron por HPLC- C18 de fase inversa (acetonitrilo ac con 0.1% TFA) y caracterizados por MALDI-TOF. La Figura 1 proporciona cromatogramas de HPLC antes y despues de la purificacion del Oligo 17 por HPLC de fase inversa. La Figura 2 proporciona un espectro de masa de MALDI-TOF para un lote del Oligo 17. Las

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Figuras 1 y 2 se proporcionan solo con propositos ilustrativos y no se deben interpretar como una restriccion a esta invencion.

Los oligomeros de PNA sintetizados para esta invencion se proporcionan en la Tabla 1 junto con sus datos de peso molecular por MALDI-TOF. De las abreviaturas usadas en la Tabla 1, A, T, G, y C se refieren a la nucleobase adenina, timina, guanina y citosina, sin modificar, respectivamente. Las nucleobases modificadas C(mXn), C(mXng), A(mXn), A(m), A(mg), y G(m) son como se define mas abajo la Tabla 1 junto con Lys, Fam, L(1), y L(2). Estos oligomeros de PNA solo se presentan para propositos ilustrativos y no se deben interpretar como una restriccion a la presente invencion.

Tabla 1. Oligomeros de PNA de esta invencion y datos espectrales de masa de estos.a

Entrada: Secuencia (N ^ C) PM (m+1)b

Oligo 1: Fam-L(1)L(1)-TGC(1O3)-TAC(1O3)-TAC(1O3)-TG-Lys-NH2 4079.0 4078.3

Oligo 2: Fam-L(1)L(1)-TGC-TAC-TAC-TG-Lys-NH2 3745.6 3745.5

Oligo 3: TGC(1O3)-TAC-TAC(1O3)-TG-Lys-NHz 3319.4 3318.5

Oligo 4: TGC-TAC(1O3)-TAC-TG-Lys-NH2 3208.3 3208.3

Oligo 5: TGC-TAC-TAC-TG-Lys-NH2 3097.2 3097.8

Oligo 6: Fam-L(1)L(1)-TC(1O3)T-CC(1O3)C-AGC(1O3)-GTG-C(1O3)GC- C(1O3)AT-Lys-NH2 6140.1 6141.8

Oligo 7: Fam-L(1)L(1)-TCT-CCC-AGC-GTG-CGC-CAT-Lys-NH2 5584.4 5583.1

Oligo 8: TGC(2O2)-TAC-TAC(202)-TG-Lys-NH2 3319.4 3318.9

Oligo 9: GC(2O2)A-C(2O2)AT-TTG-C(2O2)CT-NH2 3553.7 3552.7

Oligo 10: GC(1O2)A-C(1O2)AT-TTG-C(1O2)CT-NH2 3511.6 3511.1

Oligo 11: GCA-CAT-TTG-CCT-Lys-NH2 3348.3 3345.8

Oligo 12: CA(3)T-A(3)GT-A(3)TA-A(3)GT-NH2 3580.8 3580.9

Oligo 13: CA(4)T-A(4)GT-A(4)TA-A(4)GT-NH2 3636.9 3634.9

Oligo 14: CA(5)T-A(5)GT-A(5)TA-A(5)GT-NH2 3693.0 3691.5

Oligo 15: CA(7)T-A(7)GT-A(7)TA-A(7)GT-NH2 3805.0 3803.4

Oligo 16: CAT-AGT-ATA-AGT-Lys-NH2 3420.3 3418.3

Oligo 17: CA(5)T-A(5)GT-A(5)TA-A(5)GT-Lys-NH2 3820.9 3819.8

Oligo 18: CA(2O2)T-A(2O2)GT-A(2O2)TA-A(2O2)GT-NH2 3700.7 3701.4

Oligo 19: L(1)-TAG(2O3)-CTG(2O3)-CTG-ATT-Lys-NH2 3746.9 3748.9

Oligo 20: TG(5)G-C(1O2)AA-C(1O2)TG-A(5)T-Lys-NH2 3525.6 3523.8

Oligo 21: Fam-L(2)-TG(5)G-C(102)AA-C(102)TG-A(5)T-Lys-NH2 3997.0 3996.1

Oligo 22: Fam-L(2)-TT-C(1O2)AT-A(5)GT-A(5)TA-AG(5)T-Lys-NH2 4806.9 4806.7

Oligo 23: Fam-L(2)L(2)-TC(1O2)A-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)T-Lys-NH2 4084.2 4083.8

Oligo 24: Fam-L(2)-CA(5)T-A(4g)GT-A(4g)TA(5)-AGT-Lys-NH2 4348.5 4347.4

Oligo 25: TT-C(1O2g)AT-A(5)GT-A(5)TA-AG(5)T-Lys-NH2 4377.4 4375.6

Oligo 26: GC(1N3)A-C(1N3)AT-TTG-C(1N3)CT-NH2 3550.8 3550.9

Oligo 27: CAT-AGT -ATA-AGT-NH2 3292.3 3292.5

Oligo 28: Fam-L(2)-TGG-CAA-CTG-AT-Lys-NH2 3617.5 3616.3

a. Las abreviaturas empleadas para los monomeros se definen mas abajo. b. Maximo ion observado para Mh+ a menos que se indique lo contrario.

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X--(CHiL-hHj

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B: N Lie leu base modifies da

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Afinidad de union para ADN: Los oligomeros de esta invencion se evaluaron por su afinidad de union para ADN por medicion de los valores de Tm de la siguiente manera.

Se mezclaron 4pM del oligomero de PNA y 4pM de ADN en amortiguador ac. (pH 7.16, 10mM fosfato sodico, 100mM NaCI), y se incubaron a 90°C durante varios minutos y lentamente se enfriaron a temperatura ambiente. Despues, la solucion se transfirio a una cubeta de cuarzo de 4ml y la cubeta se sello fuertemente. La cubeta se monto en un espectrofotometro UV/Visible Agilent 8453 y los cambios de absorbancia a 260nm se registraron con aumento de la temperatura de la cubeta ya sea a 0.5 o 1.0°C por minuto. A partir de la curva de absorbancia vs temperatura, la temperatura que mostro la mayor velocidad de aumento en absorbancia se leyo como la temperatura de fusion Tm entre PNA y ADN. Los ADN para las mediciones de Tm se adquirieron ya sea de Bioneer, Inc. (
www.bioneer.com, Daejon, Corea del Sur) o de Ahram Biosystems (
www.ahrambio.com, Seul, Corea del Sur), y se usaron sin purificacion adicional.

La Figura 3 proporciona graficos de cambios de absorbancia con temperatura para el Oligo 17 contra ADN complementario o no coincidente. Para las secuencias de ADNs no coincidentes contra el Oligo 17, referirse a la Tabla 2. En la Figura 3, hay una temperatura de transicion en cada curva, que se leyo como el valor de Tm para la curva.

Los valores de Tm se proporcionan en la Tabla 2 para los oligomeros de PNA de esta invencion. Estos valores de Tm se proporcionan solo con propositos ilustrativos y no se deben interpretar como una restriccion a esta invencion.

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Tabla 2. Valores de Tm entre PNA y ADN complementary o no coincidente.

Entrada: Secuencia de ADN (5' ^ 3') H 3 0 O Observacion

Oligo 5: 55 oligomero de PNA sin modificar

Oligo 3: CAG-TAG-TAG-CA 65 C(1O3) x 2

Oligo 4: 61 C(1O3) x 1

Oligo 8: 68 C(2O2) x 2

Oligo 10: AGG-CAA-TTG-TGC > 85 C(1O2) x 3

Oligo 11: 59 oligomero de PNA sin modificar

Oligo 12: 60 A(3) x 4

Oligo 13: 64 A(4) x 4

Oligo 14: ACT-TAT-ACT -ATG 69 A(5) x 4

Oligo 15: 71 A(7) x 4

Oligo 18: 66 A(2O2) x 4

Oligo 27: 55 oligomero de PNA sin modificar

Oligo 16: ACT-TAT-ACT -ATG 56 oligomero de PNA sin modificar

: ACT-TAT-ACT -ATG 72 complementario

Oligo 17: ACT-TAC-ACT -ATG 61 no coincidente (T ^ C)

ACT-T AA-ACT -ATG: 59 no coincidente (T ^ A)

: ACT-TAG-ACT-ATG 58 no coincidente (T ^ G)

Oligo 24: ACT-TAT-ACT -ATG 70 A(5) x 2 mas A(4g) x 2

: ATC-AGT-TGC-CA 84 complementario

Oligo 20: ATC-ATT-TGC-CA 62 no coincidente (G ^ T)

: ATC-AAT-TGC-CA 65 no coincidente (G ^ A)

La sustitucion de citosina con un derivado de la nucleobase pirrolocitosina no natural de esta invencion aumento notablemente la afinidad del oligomero de PNA para el ADN complementary. Por ejemplo, Oligo 10 que tiene tres monomeros 'C(1O2) de citosina 'modificados' mostro una Tm que sobrepasaba 85°C, mientras que el correspondiente Oligo 11 'sin modificar' mostro una Tm de 58°C. Otros monomeros de citosina modificada tales como 'C(1O3) o 'C(2O2)' ademas aumentaron significativamente la afinidad del oligomero de PNA para el ADN complementario, como se ejemplifico con Oligo 3 y Oligo 8.

Nucleobases de adenina 'modificada' de esta invencion ademas aumentaron significativamente la afinidad del oligomero de PNA para el ADN complementario. Por eiemplo.Oligo 15 que tiene cuatro monomeros A(7) de adenina 'modificada' mostraron una Tm de 71°C, la cual es significativamente mas alta que la Tm de 55°C observada con Oligo 27 'sin modificar'. Otros monomeros de adenina 'modificada' tales como A(4), y A(5) ademas aumentaron notablemente la afinidad para el ADN complementario.

Se encontro que los monomeros de PNA 'modificados' de esta invencion eran muy sensibles a la no coincidencia de bases. Por ejemplo, disminuciones de 11 ~ 14°C en la Tmse observaron con una sola base no coincidente para un monomero A(5) en Oligo 17. Una sola base no coincidente para un monomero C(102) en Oligo 20 resulto en disminuciones de 19 ~ 22°C en la Tm.

Penetracion celular : Con el fin de evaluar la capacidad de penetracion celular de los oligomeros de PNA de esta invencion, celulas de cancer de origen humano se trataron con oligomeros de PNA etiquetados covalentemente con fluorescema. El metodo aplicado se proporciona en resumen de la siguiente manera.

En cada cubreobjeto (en autoclave) colocado en cada pocillo de una placa de 24-pocillos, se sembraron 20,000 ~ 100,000 celulas en dependencia de la velocidad de crecimiento de la lmea celular usada, y las celulas se cultivaron a 37°C y 5% CO2 durante 16 a 24h. Despues, el medio se sustituyo con 500pl de medio Opti-MEM fresco (con o sin 1%

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FBS), al cual se anadio una almuota de solucion madre ac. de un oligomero de PNA etiquetado covalentemente con fluorescema. Despues de que las celulas se cultivaron durante un intervalo designado, las celulas se lavaron con PBS, y se fijaron mediante la incubacion a 3.7% o 4% paraformaldelmdo. Las celulas se lavaron totalmente varias veces con PBS o PBS que contema 0.1% Tween-20. Despues, el cubreobjeto se monto sobre un portaobjeto por medio del uso de una gota de solucion de montaje y se sello con esmalte de unas para microscopfa de fluorescencia confocal. Se tomaron imagenes de fluorescencia ya sea en un microscopio confocal Zeiss LSM 510 (Alemania) a objetivo 63X o en un microscopio confocal Nikon C1Si a objetivo 40X.

Las imagenes de penetracion celular en las Figuras 4~8 se proporcionan solo para propositos ilustrativos y no se deben interpretar como una restriccion a la presente invencion.

En la Figura 4(a) y 4(b), se proporcionan imagenes de microscopfa confocal (a objetivo 63x) 1, 2, 3 y 24h despues de que las celulas HeLa se trataron con Oligo 1 y Oligo 2 a 5|jM, respectivamente (sin FBS). Mientras la intensidad de fluorescencia es clara y llega a ser intensa sobre las 24h en la Figura 4(a), la intensidad de fluorescencia es debil en la Figura 4(b), lo que indica que Oligo 1penetra las celulas HeLa significativamente mas rapido que Oligo 2 'sin modificar' .

En la Figura 5(a) y 5(b), se proporcionan imagenes de microscopfa confocal (a objetivo 63x) 0.5 y 1h despues de que las celulas MCF-7 se trataron con Oligo 6y Oligo 7 a 2.5jM, respectivamente (sin FBS). Mientras la intensidad de fluorescencia es clara y llega a ser intensa sobre 1h en la Figura 5(a), la intensidad de fluorescencia es debil en la Figura 5(b), lo que indica que Oligo 6penetra las celulas MCF-7 significativamente mas rapido que Oligo 7 'sin modificar'

En la Figura 6(a) y 6(b), se proporcionan fotograffas de microscopfa confocal (a objetivo 40x) 6 o 24h despues de que las celulas HeLa se trataron con Oligo 1 y Oligo 6 a 1jM, respectivamente (con 1% FBS). Mientras la intensidad de fluorescencia es debil aun a 24h en la Figura 6(a), la intensidad de fluorescencia es clara y llega a ser intensa sobre 24h en la Figura 6(b), lo que sugiere que Oligo 6 penetra las celulas HeLa significativamente mas rapido que Oligo 1.

En la Figura 7(a) y 7(b), se proporcionan fotograffas de microscopfa confocal (objetivo 40x) 24h despues de que las celulas JAR se trataron con Oligo 21y Oligo 28 a 2jM, respectivamente (sin FBS). Mientras la intensidad de fluorescencia es fuerte en la Figura 7(a), no hay intensidad de fluorescencia significativa en la Figura 7(b), lo que sugiere que Oligo 21 penetra las celulas JAR significativamente mas rapido que Oligo 28 'sin modificar'.

En la Figura 7(c) y 7(d), se proporcionan fotograffas de microscopfa confocal (a objetivo 40x) 24h despues de que las celulas A549 se trataron con Oligo 21y Oligo 28 a 2jM, respectivamente (sin FBS). Mientras la intensidad de fluorescencia es fuerte en la Figura 7(c), no hay intensidad de fluorescencia significativa en la Figura 7(d), lo que sugiere que Oligo 21 penetra las celulas A549 significativamente mas rapido que Oligo 28 'sin modificar'.

En la Figura 7(e) y 7(f), se proporcionan fotograffas de microscopfa confocal (a objetivo 40x) 12h despues de que las celulas HeLa se trataron con Oligo 21 y Oligo 28 a 2jM, respectivamente (sin FBS). Mientras la intensidad de fluorescencia es evidente en la Figura 7(e), no hay intensidad de fluorescencia significativa en la Figura 7(f), lo que sugiere que Oligo 21 penetra las celulas HeLa significativamente mas rapido que Oligo 28 'sin modificar'.

En la Figura 7(g), se proporcionan fotograffas de microscopfa confocal (a objetivo 40x) 24h despues de que las celulas HeLa se trataron con el Oligo 21 a 2jM (sin FBS). Dado que la fluorescencia celular en la Figura 7(g) es significativamente mas fuerte que en la Figura 7(e), Oligo 21 parece penetrar sobre 24h en vez de 12h.

La Figura 8(a), 8(b) y 8(c) proporcionan imagenes de microscopfa confocal (objetivo 40x) 24h despues de que las celulas HeLa, A549, y JAR se trataron con 2jM Oligo 22, respectivamente (sin FBS). Todas las imagenes estan asociadas con fluorescencia dentro de la celula, lo que indica que Oligo 22 posee buena penetracion celular en las celulas probadas.

Antisentido Ejemplo: Oligo 9 y Oligo 12 poseen la misma secuencia de bases que T1-12 y T5-12, respectivamente, las cuales se informo en la literatura que inhiben la smtesis ribosomal de mdm2. (Nucleic Acids Res. vol 32, 4893-4902, 2004) Oligo 9 y Oligo 12 se evaluaron por su capacidad de inhibir la smtesis ribosomal de mdm2 en las celulas JAR de la siguiente manera. El siguiente ejemplo antisentido se presenta solo para propositos ilustrativos y no se debe interpretar como una restriccion a la presente invencion.

Las celulas JAR (ATCC # de catalogo HTB-144) se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina a 37°C y 5% CO2. Las celulas despues se sembraron en cada pocillo de una placa de 12- pocillos que contema 1ml del mismo medio, y se trataron con una almuota de una solucion madre acuosa de Oligo 9 u Oligo 12 de una concentracion designada. Despues, las celulas se incubaron a 37°C y 5% CO2 por 15h.

Las celulas en cada pocillo se lavaron con PBS frio y se trataron con 80jl de amortiguador RIPA que contema 1% de coctel de inhibidores de proteasa, y la placa se incubo a 4°C y se agito lentamente por 15min. El contenido de cada pocillo se raspo en un micro tubo. El micro tubo se incubo en hielo por 10min y se centrifugo a 10,000g. El sobrenadante

resultante se recogio y se sometio a cuantificacion de protema por el ensayo de Bradford y analisis de transferencia de tipo Western. Para electroforesis, 20|jg de protema se cargaron en cada lmea del gel en un aparato de minigel, se separo y se transfirio sobre una membrana de PVDF (0.45j, Millipore). El anticuerpo primario mdm2 usado para la transferencia de tipo Western fue SC-965 (Santa Cruz Biotechnology).

5

La Figura 9 proporciona los resultados de la transferencia de tipo Western para las celulas JAR tratadas con 5jM o 10jM Oligo 9, 5jM o 10jM Oligo 10, co-tratamiento con los oligomeros a 5jM o 10jM cada uno, y blanco (sin tratamiento con oligomero). En la Figura 9, el tratamiento con Oligo 9 u Oligo 10, o co-tratamiento con Oligo 9y Oligo 10 inhibio significativamente la smtesis ribosomal de mdm2 en las celulas JAR tanto a 5jM y 10jM.

10

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Reivindicaciones

1. Un derivado de acido nucleico peptidico de la Formula I o una sal farmaceuticamente aceptable de este:

imagen1

en donde

n es un entero igual a o mayor que 5;

Si, S2, .... Sn-1, Sn, Ti, T2, ..., Tn-1, y Tn independientemente representan radicales hidrogeno, deuterio, alquilo sustituido o no sustituido, o arilo sustituido o no sustituido;

X y Y independientemente representan radicales hidrogeno, deuterio, alquilo sustituido o no sustituido, acilo sustituido o no sustituido, sulfonilo sustituido o no sustituido, o arilo sustituido o no sustituido;

Z representa radicales hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, o amino sustituido o no sustituido;

Bi, B2, ..., Bn-i, y Bn son independientemente seleccionadas de nucleobases naturales que incluyen adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, y nucleobases no naturales; y,

al menos una de Bi, B2, ..., Bn-i, y Bn es independientemente seleccionada de nucleobases no naturales representadas por la Formula II, Formula III, o Formula IV:

imagen2

en donde

Ri, R2, R3, R4, R5 y R6 son independientemente seleccionados de radicales alquilo sustituido o no sustituido, e hidrogeno; y,

Li, L2 y L3 son un enlazador covalente representado por la Formula V que conecta un grupo amino basico a la porcion responsable de las propiedades de apareamiento de las nucleobases:

imagen3

imagen4

imagen5

Formula V

en donde

Qi y Qm son radicales metileno sustituido o no sustituido (-CH2-), y Qm esta directamente enlazado al grupo amino basico;

Q2, Q3, .., y Q m-i son independientemente seleccionados de radicales metileno sustituido o no sustituido, oxfgeno (-O-), azufre (-S-), y amino sustituido o no sustituido [-N(H)-, o -N(sustituyente)-]; y, m es un numero entero de 2 a i5.
2. El derivado de acido nucleico peptfdico de acuerdo con la Reivindicacion i o una sal farmaceuticamente aceptable de este:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

en donde

n es un numero entero del 5 al 30;

Si, S2, ..., Sn-1, Sn, Ti, T2, ..., Tn-1, y Tn son radicales hidrogeno;

X y Y son independientemente seleccionados de radicales hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, acilo sustituido o no sustituido, sulfonilo sustituido o no sustituido;

Z representa radicales hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, o amino sustituido o no sustituido;

B1, B2, ..., Bn-1, y Bn son independientemente seleccionadas de nucleobases naturales que incluyen adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, y nucleobases no naturales; y,

al menos una de B1, B2, ..., Bn-1, y Bn es independientemente seleccionada de nucleobases no naturales representadas por la Formula II, Formula III, o Formula IV.

El derivado de acido nucleico peptidico de acuerdo con la Reivindicacion 1 o una sal farmaceuticamente aceptable de este:

en donde

n es un numero entero del 8 al 25;

Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Ti, T2, .... Tn-i, y Tn son radicales hidrogeno;

X y Y son independientemente seleccionados de radicales hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, acilo sustituido o no sustituido;

Z representa radicales hidroxi, o amino sustituido o no sustituido;

Bi, B2, ..., Bn-i, y Bn son independientemente seleccionadas de nucleobases naturales que incluyen adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, y nucleobases no naturales;

al menos dos de Bi, B2, ..., Bn-i, y Bn son independientemente seleccionadas de nucleobases no naturales representadas por la Formula II, Formula III, o Formula IV;

Ri, R2, R3, R4, R5 y R6 son independientemente seleccionados de radicales alquilo sustituido o no sustituido, e hidrogeno;

Qi y Qm son radicales metileno sustituido o no sustituido, y Qm esta directamente enlazado al grupo amino basico;

Q2, Q3, .., y Qm-i son independientemente seleccionados de radicales metileno sustituido o no sustituido, oxfgeno, y amino ; y, m es un numero entero de 2 a i2.

El derivado de acido nucleico peptfdico de acuerdo con la Reivindicacion i o una sal farmaceuticamente aceptable de este:

en donde

n es un numero entero del i0 al 25;

Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Ti, T2, ..., Tn-i, y Tn son radicales hidrogeno;

X y Y son independientemente seleccionados de radicales hidrogeno, y acilo sustituido o no sustituido;

Z representa radicales hidroxi, o amino sustituido o no sustituido;

Bi, B2, ..., Bn-i, y Bn son independientemente seleccionadas de nucleobases naturales que incluyen adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, y nucleobases no naturales;

al menos tres de Bi, B2, ..., Bn-i, y Bn son independientemente seleccionadas de nucleobases no naturales representadas por la Formula II, Formula III, o Formula IV;

Ri, R2, R3, R4, R5 y R6 son independientemente seleccionados de radicales alquilo sustituido o no sustituido, e hidrogeno;

Qi y Qm son radicales metileno, y Qm esta directamente enlazado al grupo amino basico;

Q2, Q3, . ., y Qm-i son independientemente seleccionados de radicales metileno, oxfgeno, y amino; y, m es un numero entero de 2 a i0.

El derivado de acido nucleico peptfdico de acuerdo con la Reivindicacion i o una sal farmaceuticamente aceptable de este:

en donde

n es un numero entero del i0 al 20;

Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Ti, T2, ..., Tn-i, y Tn son radicales hidrogeno;

X y Y son independientemente seleccionados de radicales hidrogeno, y acilo sustituido o no sustituido;

Z representa radicales hidroxi, o amino sustituido o no sustituido;

Bi, B2, ..., Bn-i, y Bn son independientemente seleccionadas de nucleobases naturales que incluyen adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, y nucleobases no naturales;

al menos tres de Bi, B2, ..., Bn-i, y Bn son independientemente seleccionadas de nucleobases no naturales representadas por la Formula II, Formula III, o Formula IV;

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Ri, R3, y R5 son radicales hidrogeno, y R2, R4 y R6 are independientemente representan radicales hidrogeno, o amidinilo sustituido o no sustituido;

Qi y Qm son radicales metileno, y Qm esta directamente enlazado al grupo amino basico;

Q2, Q3, ..., y Qm-i son independientemente seleccionados de radicales metileno, oxfgeno, y amino; y, m es un numero entero de 2 a 10.
6. El derivado de acido nucleico peptidico de acuerdo con la Reivindicacion 1 o una sal farmaceuticamente aceptable de este:

en donde

n es un numero entero del 10 al 20;

Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Ti, T2, ..., Tn-i, y Tn son radicales hidrogeno;

X y Y son independientemente seleccionados de radicales hidrogeno, y acilo sustituido o no sustituido;

Z representa radicales hidroxi, o amino sustituido o no sustituido;

Bi, B2, ..., Bn-i, y Bn son independientemente seleccionadas de adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, y nucleobases no naturales;

al menos tres de Bi, B2, ..., Bn-i, y Bn son independientemente seleccionadas de nucleobases no naturales representadas por la Formula II, Formula III, o Formula IV;

Ri, R3, y R5 son radicales hidrogeno, y R2, R4, y Raindependientemente representan radicales hidrogeno o amidinilo;

Qi y Qm son radicales metileno, y Qm esta directamente enlazado al grupo amino basico;

Q2, Q3, ..., y Qm-i son independientemente seleccionados de radicales metileno, y oxfgeno; y, m es un numero entero de 2 a 8.
7. El derivado de acido nucleico peptfdico de acuerdo con la Reivindicacion i o una sal farmaceuticamente aceptable de este:

en donde

n es un numero entero del 8 al 20;

Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Ti, T2, Tn-i, y Tn son radicales hidrogeno;

X es un radical hidrogeno;

Y representa radicales hidrogeno, o acilo sustituido o no sustituido;

Z representa radicales hidroxi, o amino sustituido o no sustituido;

Bi, B2, ..., Bn-i, y Bn son independientemente seleccionadas de adenina, timina, guanina, citosina, y nucleobases no naturales;

al menos tres de Bi, B2, ..., Bn-i, y Bn son independientemente seleccionadas de nucleobases no naturales representadas por la Formula II, Formula III, o Formula IV;

Ri, R3, y R5 son radicales hidrogeno, y R2, R4, y Raindependientemente representa radicales hidrogeno o amidinilo;

Li representa -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, o -CH2-O-(CH2)3- con el extremo derecho esta directamente enlazado al grupo amino basico; y,

L2 y L3 son independientemente seleccionados de -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, - (CH2)2-O-(CH2)3-, - (cH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)a-, -(CH2)7-, y - (CH2)8- con el extremo derecho esta directamente enlazado al grupo amino basico.
8. Una composicion farmaceutica que contiene una cantidad terapeuticamente eficaz del derivado de acido nucleico peptfdico de cualquiera de las reivindicaciones i ~ 7 o una sal farmaceuticamente aceptable de este para un proposito terapeutico.
9. Un metodo para usar el derivado de acido nucleico peptfdico de cualquiera de las reivindicaciones i ~ 7 o una sal de este para un proposito de diagnostico.
10. Un metodo para usar el derivado de acido nucleico peptfdico de cualquiera de las reivindicaciones i ~ 7 o una sal de este para la modulacion in vitro de la expresion de la proterna celular.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60
11. Un compuesto de la Formula VI:

imagen6

Formula VI

en donde

R7 es un radical hidrogeno, N-succinilo, o alquilo sustituido o no sustituido;

Pi se selecciona de radicales hidrogeno, t-butoxicarbonilo, (9H-fluoren-9-il)metoxi-carbonilo, benciloxicarbonilo sustituido o no sustituido, y arilsulfonilo sustituido o no sustituido;

P2 se selecciona de radicales hidrogeno, t-butoxicarbonilo, (9H-fluoren-9-il)metoxi-carbonilo, benciloxicarbonilo sustituido o no sustituido, alquiloxicarbonilo sustituido, alquilo sustituido o no sustituido, amidinilo, i,3-bis(t-butoxi- carbonil)amidinilo, 1,3-bis-(benciloxicarbonil)amidinilo; y,

Li es un enlazador representado por la Formula V:

Formula V

imagen7

en donde

Qi y Qm son radicales metileno sustituido o no sustituido, y Qm esta directamente enlazado al radical amino;

Q2, Q3, ..., y Qm-i son independientemente seleccionados de radicales metileno sustituido o no sustituido, oxfgeno, azufre, y amino sustituido o no sustituido; y, m es un numero entero de 2 a 15.
12. Un compuesto de la Formula VII:

imagen8

en donde

R8 es un radical hidrogeno, N-succinilo, o alquilo sustituido o no sustituido;

Pi se selecciona de radicales hidrogeno, t-butoxicarbonilo, (9H-fluoren-9-il)metoxi-carbonilo, benciloxicarbonilo sustituido o no sustituido, y arilsulfonilo sustituido o no sustituido;

P2 se selecciona de radicales hidrogeno, t-butoxicarbonilo, (9H-fluoren-9-il)metoxi-carbonilo, benciloxicarbonilo sustituido o no sustituido, alquiloxicarbonilo sustituido, alquilo sustituido o no sustituido, amidinilo, i,3-bis(t-butoxi- carbonil)amidinilo, i,3-bis-(bencil-oxicarbonil)amidinilo; y

P3 se selecciona de radicales hidrogeno, t-butoxicarbonilo, (9H-fluoren-9-il)metoxi-carbonilo, benciloxicarbonilo sustituido o no sustituido;

P4 se selecciona de radicales hidrogeno, y t-butoxicarbonilo; y,

L2 es un enlazador representado por la Formula V:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

imagen9

en donde

Qi y Qm son radicales metileno sustituido o no sustituido, y Qm esta directamente enlazado al radical amino;

Q2, Q3, . ., y Qm-i son independientemente seleccionados de radicales metileno sustituido o no sustituido, oxfgeno, azufre, y amino sustituido o no sustituido; y, m es un numero entero de 2 a 15.
13. Un compuesto de la Formula VIII:

imagen10

en donde

Rg es un radical hidrogeno, N-succinilo, o alquilo sustituido o no sustituido;

Pi se selecciona de radicales hidrogeno, t-butoxicarbonilo, (9H-fluoren-9-il)metoxi-carbonilo, benciloxicarbonilo sustituido o no sustituido, y arilsulfonilo sustituido o no sustituido;

P2 se selecciona de radicales hidrogeno, t-butoxicarbonilo, (9H-fluoren-9-il)metoxi-carbonilo, benciloxicarbonilo sustituido o no sustituido, alquiloxicarbonilo sustituido, alquilo sustituido o no sustituido, amidinilo, 1,3-bis(t-butoxi- carbonil)amidinilo, 1,3-bis-(bencil-oxicarbonil)amidinilo; y L3 es un enlazador representado por la Formula V:

imagen11

imagen12

Formula V

en donde

Qi y Qm son radicales metileno sustituido o no sustituido, y Qm esta directamente enlazado al radical amino;

Q2, Q3, .., y Qm-i son independientemente seleccionados de radicales metileno sustituido o no sustituido, oxfgeno, azufre, y amino sustituido o no sustituido; y, m es un numero entero de 2 a i5.
14. Un compuesto de la Formula IX:

imagen13

Formula IX

en donde

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Rio es un radical hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, o amino sustituido o no sustituido;

P2 se selecciona de radicales hidrogeno, t-butoxicarbonilo, (9H-fluoren-9-il)metoxi-carbonilo, benciloxicarbonilo sustituido o no sustituido, alquiloxicarbonilo sustituido, alquilo sustituido o no sustituido, amidinilo, 1,3-bis(t- butoxi-carbonil)amidinilo, 1,3-bis-(benciloxicarbonil)amidinilo; y,

L1 es un enlazador representado por la Formula V:

imagen14

Formula V

en donde

Qi y Qm son radicales metileno sustituido o no sustituido, y Qm esta directamente enlazado al radical amino;

Q2, Q3, ..., y Qm-i son independientemente seleccionados de radicales metileno sustituido o no sustituido, oxfgeno, azufre, y amino sustituido o no sustituido; y, m es un numero entero de 2 a 15.

Un compuesto de la Formula X:

Formula X

imagen15

en donde

R11 es un radical hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, o amino sustituido o no sustituido ;

P2 se selecciona de radicales hidrogeno, t-butoxicarbonilo, (9H-fluoren-9-il)metoxi-carbonilo, benciloxicarbonilo sustituido o no sustituido, alquiloxicarbonilo sustituido, alquilo sustituido o no sustituido, amidinilo, 1,3-bis(t- butoxi-carbonil)amidinilo, 1,3-bis-(bencil-oxicarbonil)amidinilo; y

P3 se selecciona de radicales hidrogeno, t-butoxicarbonilo, (9H-fluoren-9-il)metoxi-carbonilo, benciloxicarbonilo sustituido o no sustituido;

P4 se selecciona de radicales hidrogeno, y t-butoxicarbonilo; y,

L2 es un enlazador representado por la Formula V:

imagen16

imagen17

Formula V

en donde

Q1 y Qm son radicales metileno sustituido o no sustituido, y Qm esta directamente enlazado al radical amino;

Q2, Q3 ..., y Qm-1 son independientemente seleccionados de radicales metileno sustituido o no sustituido, oxfgeno, azufre, y amino sustituido o no sustituido; y, m es un numero entero de 2 a 15.

Un compuesto de la Formula XI:

o

imagen18

r,2

Formula XI

5

10

15

20

en donde

R12 es un radical hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, o amino sustituido o no sustituido;

P2 se selecciona de radicales hidrogeno, t-butoxicarbonilo, (9H-fluoren-9-il)metoxi-carbonilo, benciloxicarbonilo sustituido o no sustituido, alquiloxicarbonilo sustituido, alquilo sustituido o no sustituido, amidinilo, 1,3-bis(t- butoxi-carbonil)amidinilo, 1,3-bis-(bencil-oxicarbonil)amidinilo; y L3 es un enlazador representado por la Formula V:

imagen19

imagen20

imagen21

Formula V

en donde

Qi y Qm son radicales metileno sustituido o no sustituido, y Qm esta directamente enlazado al radical amino;

Q2, Q3, .., y Qm-i son independientemente seleccionados de radicales metileno sustituido o no sustituido, oxfgeno, azufre, y amino sustituido o no sustituido; y, m es un numero entero de 2 a 15.