KR102633299B1 - 세포 투과가 가능한 펩타이드 핵산 올리고머를 유효성분으로 포함하는 한탄바이러스 감염 질환 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
세포 투과가 가능한 펩타이드 핵산 올리고머를 유효성분으로 포함하는 한탄바이러스 감염 질환 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 세포 투과가 가능한 펩타이드 핵산 올리고머를 유효성분으로 포함하는 한탄바이러스 감염 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 펩타이드 핵산 올리고머는 한탄바이러스가 감염된 세포 및 동물 내에서 한탄바이러스의 감염과 증식을 억제하는 효과가 있다.
Description
본 발명은 핵산 올리고머를 유효성분으로 포함하는 한탄바이러스 감염 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 신증후출혈열을 일으키는 원인 바이러스로 잘 알려진 설치류 매개 한탄바이러스의 유전자에 특이적으로 결합하여 세포 내 감염 및 증식을 억제하는 활성을 가진 펩타이드 핵산(PNA) 올리고머를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
세계 공중 보건학적으로 매우 중요한 위치를 차지하고 있는 한탄바이러스는 한타비리대과(Family Hantanviridae), 오소한타바이러스속(Genus Orthohantavirus)에 속하는 음성 단일가닥 RNA 바이러스(negative-sense single stranded RNA virus)로 현재까지 약 350종 이상의 종(species)으로 구성되어 있다. 형태는 직경 80nm 내지 120nm의 구형으로 S 분절(S segment), M 분절(M segment), 및 L 분절(L segment)과 같은 3개의 분절로 이루어져 있다. 각각의 분절은 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein)을 암호화하는 사이즈 평균 1.6 kb의 S 분절, 당단백질(Glycoprotein)을 암호화하는 사이즈 평균 3.6 kb의 M 분절, 그리고 RNA 의존 RNA 중합효소(RNA dependent RNA polymerase, RdRp)를 암호화하는 사이즈 평균 6.5 kb의 L 분절이다.
한타바이러스 감염은 설치류에 의해 매개되는 두가지의 다른 임상 양상을 가지는 질병을 유발한다고 알려져 있다. 한국을 포함하는 아시아 및 유라시아 지역에서 발생하는 신증후출혈열(Hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)과 아메리카 대륙에서 발병하는 한타바이러스폐증후군(Hantavirus pulmonary syndrome, HPS)이다. 그 중에서 대표적으로 알려진 신증후출혈열(HFRS)은 오소한타바이러스속에 속하는 여러 종의 바이러스에 의해 유발되는 설치류 매개 인수공통감염병으로 주요 원인 병원체로 한탄바이러스(Hantaan virus, HTNV), 서울바이러스(Seoul virus, SEOV), 푸말라바이러스(Puumala virus, PUUV), 도브라바바이러스(Dobrava-Belgrade virus, DOBV)가 있으며, 한타바이러스폐증후군을 일으키는 신놈브레바이러스(Sin Nombre virus, SNV), 안데스바이러스(Andes virus, ANDV)가 대표적인 원인 병원체로 알려져 있다.
전세계적으로 한탄바이러스 감염으로 발생되는 신증후출혈열(HFRS)은 고열, 출혈증상, 신기능장애 등의 임상소견을 보이는 급성 열성질환으로서 신증후출혈열 환자는 매년 10만명 내지 15만명 이상이 발생하고 있다. 한국에서 발생하는 신증후출혈열 환자는 매년 400명 내지 500명 이상 꾸준히 보고되고 있으며 사망환자는 주로 한탄바이러스에 의한 감염으로 알려져 있다. 실험실 초기 진단 방법으로는 특이항체를 검출하는 혈청학적 방법 및 유전자를 검출하는 방법으로 일반적인 중합효소연쇄반응법(Polymerase chain reaction, PCR)과 실시간 중합효소연쇄반응법(real-time PCR)이 사용되고 있다.
현재까지 개발되어 상용화된 치료제는 없으며, 국내에서만 사용되는 예방백신으로 GC녹십자의 한타박스가 있지만, 중화항체 생성율에 대한 논란이 끊임없이 제기되고 있다. 공기 중에 부유된 한탄바이러스는 사람에게 호흡기를 통해 감염되는 특징이 있고, 치사율 또한 높아 대량살상무기인 생물학 무기로 사용될 가능성이 높기 때문에 이를 예방 및 치료 백신의 개발이 절실하다.
펩타이드 핵산(PNA, Peptide Nucleic Acid): PNA는 N-(2-아미노에틸)글리신[Aeg, N-(2-aminoethyl)glycine]을 단위골격으로 갖는 폴리펩티드로서 Nielsen 등에 의해 발명되었다[Science Vol 254, 1497-1500 (1991)]. PNA의 화학 구조와 축약된 이름은 아래 그림에 도시되었다. DNA나 RNA와 마찬가지로, PNA 역시 상보적인 핵산과 결합한다. [Nature (London) Vol 365, 566-568 (1992)] 상보적인 핵산에 결합할 때, PNA의 N-말단은 DNA나 RNA의 5'-말단, 그리고 C-말단은 DNA나 RNA의 3'-말단에 해당한다.
PMO처럼 PNA 골격은 전하를 갖고 있지 않기 때문에, PNA와 RNA의 결합은 DNA와 RNA의 결합보다 강하다. 아울러 PNA는 DNA와 구조적으로 매우 다르기 때문에, DNA를 인식하는 간에 있는 트랜스포터(Hepatic Transporter)에 의해 인식되지 않는다. 따라서 PNA는 PTO와 매우 다른 조직 분포 특성을 가질 수 있으나, PNA 역시 세포막을 잘 통과하지 못한다[Adv. Drug Delivery Rev. Vol 55, 267-280, (2003)].
변형된 핵산염기로 세포투과성을 높인 PNA: 양이온성 지질(Cationic Lipid)이 핵산염기에 공유 결합으로 연결된 PNA는 포유류의 세포막 투과성이 매우 좋다. 변형된 핵산염기는 다음의 그림과 같이 제공된다. 이렇게 변형된 핵산염기를 갖는 시토신, 아데닌 및 구아닌은 구아닌, 티민 및 아데닌과 각각 상보적으로 결합한다. [PCT Appl. No. PCT/KR2009/001256; EP2268607; US8680253]
이렇게 변형된 핵산염기를 갖는 PNA는 리포펙션(lipofection)과 비슷한 환경이 된다. 리포펙션 상황에서는 포스페이트 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드가 리포펙타민과 같은 양이온성 지질에 둘러싸이게 되는데, 그러한 복합체는 리포펙션으로 처리하지 않은 올리고뉴클레오티드에 비해 세포막 투과가 용이하다.
이렇게 변형된 핵산염기를 갖는 PNA는 향상된 세포 투과성 외에 상보적인 핵산에 대한 결합력이 매우 강하다. 상보적인 DNA와 듀플렉스(duplex)를 형성할 때 4~5개의 변형된 핵산염기가 도입된 11~13머(11~13-mer)의 PNA는 변형되지 않은 PNA에 비해 20℃ 이상 높은 Tm 값을 보인다. 또한, 이렇게 변형된 핵산염기를 갖는 PNA는 한 개의 염기 부정합(Mismatch)에도 매우 민감한데, 변형된 염기의 종류나 PNA의 순서에 따라 다르지만 약 11~22℃의 낮은 Tm 값을 보인다.
상기와 같은 점을 감안하여 본 발명자들은 설치류 유래 한탄바이러스 및 사람 유래 한탄바이러스 등 여러 한탄바이러스의 특이 단백질로서 한탄바이러스 리보핵산(ribonucleic acid; RNA)과 결합하는 뉴클레오캡시드 단백질(Nucleocapsid protein)을 암호화하는 S 분절(S segment), 숙주세포의 표면부착에 관여하는 당단백질(Glycoprotein)을 암호화하는 M 분절(M segment), 및 RNA 의존 RNA 중합효소(RNA dependent RNA polymerase, RdRp)를 암호화하는 L 분절(L segment)의 염기서열을 비교 분석하고 바이러스 증식을 억제할 수 있는 특이 염기서열을 예측하여, 한탄바이러스 증식을 효과적으로 억제할 수 있는 한탄바이러스 감염 억제활성을 가진 PNA 올리고머를 개발하고 그 효능을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 세포 투과가 가능한 펩타이드 핵산 올리고머를 유효성분으로 포함하는 한탄바이러스 감염 질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 펩타이드 핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA) 올리고머 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 한탄바이러스(HTNV) 감염 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서, n은 10 내지 30의 정수이고,
X는 하기 화학식 2로 표시되는 Fethoc [2-(9-플루오레닐)에틸-1-옥시]카보닐이고,
[화학식 2]
Z는 NH2이고,
B1, B2, ……, Bn-1 및 Bn은 각각 독립적으로 아데닌(Adenine, A), 구아닌(Guanine, G), 티민(Thymine, T), 또는 시토신(Cytosine, C)의 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 선택되고,
B1 내지 Bn 중 하나 이상은 각각 독립적으로 하기 화학식 3 내지 화학식 5의 비천연 핵산염기로 이루어진 군으로부터 선택되며,
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
상기 화학식 3 내지 5에서, j, k, l, m은 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.
상기 비천연 핵산염기는 하기 화학식 3a 내지 화학식 5a로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다:
[화학식 3a]
[화학식 4a]
[화학식 5a]
상기 펩타이드 핵산 올리고머는 한탄바이러스의 genomic (+) RNA 또는 genomic (-) RNA의 일부와 상보 결합하는 것일 수 있다.
상기 펩타이드 핵산 올리고머는 하기 PNA 1 내지 PNA 89로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것일 수 있다:
상기 PNA 1 내지 PNA 89에서,
A는 ,
G는 ,
C는 ,
T는 ,
C(1O2)는 ,
A(5)는 , 및
G(6)는 이다.
상기 펩타이드 핵산 올리고머는 상기 PNA 29, PNA 56, PNA 79 및 PNA 81로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 펩타이드 핵산 올리고머는 한탄바이러스의 genomic (+) RNA 또는 genomic (-) RNA의 일부와 90% 이상 상보적인 것일 수 있다.
상기 한탄바이러스 감염 질환은 신증후출혈열인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드 핵산 올리고머는 한탄바이러스가 감염된 세포 및 동물 내에서 한탄바이러스의 감염과 증식을 억제하는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따른 펩타이드 핵산 올리고머를 유효성분으로 포함하는 치료용 조성물은 한탄바이러스 감염에 의한 대표적인 질환인 신증후출혈열을 억제하는 유전자 치료제로 사용될 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명을 상세하기 설명하기 전에, 본 명세서에서 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 무조건 한정하여 해석되어서는 아니되며, 본 발명의 발명자가 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해서 각종 용어의 개념을 적절하게 정의하여 사용할 수 있고, 더 나아가 이들 용어나 단어는 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 알아야 한다.
즉, 본 명세서에서 사용된 용어는 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하기 위해서 사용되는 것일 뿐이고, 본 발명의 내용을 구체적으로 한정하려는 의도로 사용된 것이 아니며, 이들 용어는 본 발명의 여러 가지 가능성을 고려하여 정의된 용어임을 알아야 한다.
또한, 본 명세서에 있어서, 단수의 표현은 문맥상 명확하게 다른 의미로 지시하지 않는 이상, 복수의 표현을 포함할 수 있으며, 유사하게 복수로 표현되어 있다고 하더라도 단수의 의미를 포함할 수 있음을 알아야 한다.
본 명세서의 전체에 걸쳐서 어떤 구성 요소가 다른 구성 요소를 "포함"한다고 기재하는 경우에는, 특별히 반대되는 의미의 기재가 없는 한 임의의 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 임의의 다른 구성 요소를 더 포함할 수도 있다는 것을 의미할 수 있다.
또한, 이하에서, 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 구성, 예를 들어, 종래 기술을 포함하는 공지기술에 대한 상세한 설명은 생략될 수도 있다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명한다.
본 발명에서, "약학적 조성물" 이라 함은 사람을 포함한 동물의 질병의 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방을 목적으로 사용하는 약제를 의미한다.
본 발명에서, "예방" 이라 함은 질병, 장애 또는 질환의 발병을 억제하거나 지연을 의미한다. 질병, 장애 또는 질환의 발병이 예정된 기간 동안 억제되거나 지연된 경우 예방은 완전한 것으로 간주될 수 있다.
본 발명에서, "치료" 이라 함은 질병, 장애 및/또는 질환 또는 질환에 따른 증상을 부분적으로 또는 완전히 경감, 개선, 완화, 저해 또는 지연시키며, 중증도를 감소시키거나, 하나 이상의 증상 또는 특징의 발생을 감소시키는 것을 의미한다.
본 발명은 한탄바이러스(Hantaan virus) 감염 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 한탄바이러스(Hantaan virus, HTNV)는 한타비리대과(Family Hantanviridae) 오소한타바이러스속(Genus Orthohantavirus)에 속하는 음성 단일가닥 RNA 바이러스(negative-sense single stranded RNA virus)로, 한탄바이러스 감염에 의하여 신증후출혈열이 발생할 수 있다. 한탄바이러스는 S 분절(S segment), M 분절(M segment), 및 L 분절(L segment)의 3개의 분절로 이루어져 있고, 구체적으로는 뉴클레오캡시드 단백질(Nucleocapsid protein)을 암호화하는 사이즈 평균 1.6 kb의 S 분절, 당단백질(Glycoprotein)을 암호화하는 사이즈 평균 3.6 kb의 M 분절, 그리고 RNA 의존 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA-polymerase, RdRp)를 암호화하는 사이즈 평균 6.5 kb의 L 분절로 이루어져 있다. 본 발명의 실시예에서는 다양한 종의 한탄바이러스에서 S 분절, M 분절, L 분절의 염기서열들을 확보하고 이들을 서로 비교 분석함으로써 공통 염기서열로부터 표적 서열을 설정하고, 표적 서열을 토대로 한탄바이러스에 대해 특이적인 PNA 올리고머들을 설계한 후, 이들의 한탄바이러스 감염 억제활성을 확인하였다.
본 발명의 한탄바이러스(HTNV) 감염 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 하기 화학식 1로 표시되는 펩타이드 핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA) 올리고머 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함한다:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서, n은 10 내지 30의 정수이고,
X는 하기 화학식 2로 표시되는 Fethoc [2-(9-플루오레닐)에틸-1-옥시]카보닐 이고,
[화학식 2]
Z는 NH2이고,
B1, B2, ……, Bn-1 및 Bn은 각각 독립적으로 아데닌(Adenine, A), 구아닌(Guanine, G), 티민(Thymine, T), 또는 시토신(Cytosine, C)의 천연 핵산염기 및 비천연 핵산염기 중에서 선택되고,
B1 내지 Bn 중 하나 이상은 각각 독립적으로 하기 화학식 3 내지 화학식 5의 비천연 핵산염기로 이루어진 군으로부터 선택되며,
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
상기 화학식 3 내지 5에서, j, k, l, m은 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.
상기 화학식 1로 표시되는 펩타이드 핵산 올리고머는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 다양한 유기산 또는 무기산에 의해 형성된 산부가 염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디 오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모 노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이 트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피온산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-다이온산, 벤조산, 클로로벤조산, 메틸벤 조산, 다이나이트로 벤조산, β-하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조산, 프탈산, 테레프탈레이트, 벤젠설폰산, 톨 루엔설폰산, 클로로벤젠설폰산, 크실렌설폰산, 페닐아세트산, 페닐프로피온산, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프 탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 또는 트라이플루오로아세트산을 사용하여 제조할 수 있다. 이들 중에서 바람직하게는 염산, 옥살산 또는 트라이플루오로아세트산을 사용할 수 있다.
이때, 본 발명에 따른 상기 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1의 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면, 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 리튬, 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은 염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
상기 비천연 핵산염기는 하기 화학식 3a(상기 화학식 3에서 j가 2이고, k가 1임), 화학식 4a(상기 화학식 4에서 l이 5임), 화학식 5a(상기 화학식 5에서 m이 6임)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다:
[화학식 3a]
[화학식 4a]
[화학식 5a]
이하에서는 표 1과 같이 기재하였다.
| 종류 | 화학식 | 약어 |
| 보호기 | Fethoc | |
| 천연 핵산염기 |
A | |
| G | ||
| C | ||
| T | ||
| 비천연 핵산염기 | C(1O2) | |
| A(5) | ||
| G(6) |
상기 펩타이드 핵산 올리고머는 하기 표 2의 펩타이드 핵산 올리고머로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것일 수 있다. 본 발명의 실시예에서, 하기 표 2의 한탄바이러스 RNA와 상보적인 PNA 올리고머들을 제조하고, 이들의 바이러스 증식 억제 효과를 확인하였다.
| PNA 올리고머 | 서열 (N → C) |
| PNA 1 | Fethoc-TTT-A(5)GG-GA(5)G-TCT-A(5)CT-ACT-A(5)-NH2 |
| PNA 2 | Fethoc-TTT-A(5)GG-GA(5)G-TCT-A(5)CT-A(5)CT-A(5)-NH2 |
| PNA 3 | Fethoc-ACA(5)-ACG-A(5)TG-GCA(5)-ACT-A(5)TG-GA-NH2 |
| PNA 4 | Fethoc-TCC-A(5)TA-GTT-G(6)CC-A(5)TC-G(6)TT-GT-NH2 |
| PNA 5 | Fethoc-TGC-A(5)GT-ATC(1O2)-TAT-CCA(5)-GGC-AA(5)-NH2 |
| PNA 6 | Fethoc-TTG-C(1O2)CT-GGA(5)-TAG-A(5)TA-CTG(6)-CA-NH2 |
| PNA 7 | Fethoc-GCT-CA(5)G-TTA(5)-TGG-TA(5)A-TGT-G(6)C-NH2 |
| PNA 8 | Fethoc-GCA(5)-CAT-TA(5)C-CAT-A(5)AC-TGA(5)-GC-NH2 |
| PNA 9 | Fethoc-TTT-A(5)AA-TC(1O2)C-A(5)GC-A(5)CA-TTA(5)-C-NH2 |
| PNA 10 | Fethoc-AA(5)G-CTC(1O2)-TGT-ATA(5)-TGT-TGA(5)-CA-NH2 |
| PNA 11 | Fethoc-TGT-C(1O2)AA-CA(5)T-ATA(5)-CAG-A(5)GC-TT-NH2 |
| PNA 12 | Fethoc-AGG-A(5)TG-ATA(5)-GCT-CG(6)T-TCG-A(5)G-NH2 |
| PNA 13 | Fethoc-CTC-G(6)AA-CGA(5)-GCT-A(5)TC-A(5)TC-CT-NH2 |
| PNA 14 | Fethoc-CCT-G(6)GT-AGA(5)-TAT-A(5)GA-ACA(5)-GC-NH2 |
| PNA 15 | Fethoc-GCT-G(6)TT-CTA(5)-TAT-CTA(5)-CCA-G(6)G-NH2 |
| PNA 16 | Fethoc-GGT-A(5)GA-TA(5)T-AGA-A(5)CA-GCA(5)-GT-NH2 |
| PNA 17 | Fethoc-A(5)CT-G(6)CT-GTT-C(1O2)TA-TA(5)T-CTA(5)-CC-NH2 |
| PNA 18 | Fethoc-GCG-A(5)AA-TA(5)C-AAT-C(1O2)AT-GGC-A(5)T-NH2 |
| PNA 19 | Fethoc-ATG(6)-CCA-TGA(5)-TTG-TA(5)T-TTC-G(6)C-NH2 |
| PNA 20 | Fethoc-A(5)TA-AA(5)A-TGA(5)-TGA(5)-TTT-C(1O2)TT-C-NH2 |
| PNA 21 | Fethoc-TTA(5)-ATT-A(5)GA-G(6)TT-TCA(5)-AAG-G(6)C-NH2 |
| PNA 22 | Fethoc-TA(5)T-TTG(6)-CAC-TA(5)T-TAT-TA(5)T-CA-NH2 |
| PNA 23 | Fethoc-TGA(5)-TAA-TA(5)A-TAG(6)-TGC-AA(5)A-TA-NH2 |
| PNA 24 | Fethoc-TTG(6)-CAC-TA(5)T-TAT-TA(5)T-CAG-G(6)G-NH2 |
| PNA 25 | Fethoc-CCC(1O2)-TGA-TA(5)A-TAA-TA(5)G-TGC-A(5)A-NH2 |
| PNA 26 | Fethoc-ACA(5)-TTT-A(5)TG-GG(6)T-GGG-A(5)AT-CA-NH2 |
| PNA 27 | Fethoc-TGA(5)-TTC-CC(1O2)A-CCC-A(5)TA-AA(5)T-GT-NH2 |
| PNA 28 | Fethoc-AGT-TA(5)A-TCC(1O2)-GTT-G(6)TG-GG(6)T-GG-NH2 |
| PNA 29 | Fethoc-CCA-CC(1O2)C-ACA(5)-ACG-G(6)AT-TAA(5)-CT-NH2 |
| PNA 30 | Fethoc-CAA(5)-CAA-CA(5)T-TCT-A(5)CC-TCA(5)-AC-NH2 |
| PNA 31 | Fethoc-GTT-GA(5)G-GTA(5)-GAA(5)-TGT-TG(6)T-TG(6)-NH2 |
| PNA 32 | Fethoc-ACA(5)-AAA-CTA(5)-CCT-CA(5)A-CTT-A(5)A-NH2 |
| PNA 33 | Fethoc-TTA-A(5)GT-TGA(5)-GGT-A(5)GT-TTT-G(6)T-NH2 |
| PNA 34 | Fethoc-TA(5)G-TA(5)G-TA(5)T-GCT-CC(1O2)C-TAA(5)-AA-NH2 |
| PNA 35 | Fethoc-TAG-TA(5)G-TAG-A(5)CA-CCG-CA(5)A-AA(5)-NH2 |
| PNA 36 | Fethoc-TTT-TG(6)C-GG(6)T-GTC(1O2)-TAC-TA(5)C-TA(5)-NH2 |
| PNA 37 | Fethoc-GTA(5)-GAC-A(5)CC-GCA(5)-AAA-GA(5)A-AG-NH2 |
| PNA 38 | Fethoc-CA(5)C-CGC-A(5)AA-AGA(5)-AAG-CA(5)G-TC-NH2 |
| PNA 39 | Fethoc-ACA(5)-TGG-G(6)GA-TA(5)T-GGA-A(5)GT-GG-NH2 |
| PNA 40 | Fethoc-CCA(5)-CTT-CCA(5)-TAT-CC(1O2)C-CAT-G(6)T-NH2 |
| PNA 41 | Fethoc-A(5)TG-AAA(5)-ATT-GA(5)G-TGC-C(1O2)CC-CA(5)-NH2 |
| PNA 42 | Fethoc-TGG-G(6)GG-CA(5)C-TCA-A(5)TT-TTC-A(5)T-NH2 |
| PNA 43 | Fethoc-A(5)CT-TGA(5)-AAG-GA(5)A-CAT-G(6)TG-TT-NH2 |
| PNA 44 | Fethoc-AA(5)C-ACA(5)-TGT-TC(1O2)C-TTT-CA(5)A-GT-NH2 |
| PNA 45 | Fethoc-GTG-TA(5)C-TGC-AA(5)C-GGG-CA(5)G-NH2 |
| PNA 46 | Fethoc-ATA(5)-TTA-A(5)CA-AAA-A(5)CT-CTA(5)-GT-NH2 |
| PNA 47 | Fethoc-A(5)TT-GGA(5)-CAG-TGT-A(5)TA-TAT-A(5)C-NH2 |
| PNA 48 | Fethoc-ACA(5)-AGC-TTA(5)-TTC-TCA(5)-TTA-NH2 |
| PNA 49 | Fethoc-GGA(5)-TGT-TA(5)C-CGG-A(5)CA-CTA(5)-NH2 |
| PNA 50 | Fethoc-AA(5)T-TTA(5)-TTT-A(5)GA-TA(5)C-AAA(5)-AG-NH2 |
| PNA 51 | Fethoc-C(1O2)TT-TTG(6)-TAT-C(1O2)TA-AA(5)T-AAA(5)-TT-NH2 |
| PNA 52 | Fethoc-TTT-A(5)GA-TA(5)C-AAA-A(5)GC-A(5)GG-TG-NH2 |
| PNA 53 | Fethoc-CTG-CA(5)A-GTG(6)-CAT-CA(5)G-AGA(5)-CA-NH2 |
| PNA 54 | Fethoc-TGT-C(1O2)TC-TGA(5)-TGC-A(5)CT-TGC-A(5)G-NH2 |
| PNA 55 | Fethoc-A(5)CA-GA(5)T-TTA-GA(5)G-CTT-GA(5)T-TT-NH2 |
| PNA 56 | Fethoc-GTG-CCC-A(5)CC-CCA(5)-GGA-CA(5)A-TC-NH2 |
| PNA 57 | Fethoc-ACA(5)-GGC-TGT-A(5)CA-GCA(5)-TGT-GG-NH2 |
| PNA 58 | Fethoc-CCA(5)-CAT-G(6)CT-GTA-CA(5)G-CCT-G(6)T-NH2 |
| PNA 59 | Fethoc-AG(6)G-TGG-TG(6)G-TCT-A(5)AT-ATT-TA(5)-NH2 |
| PNA 60 | Fethoc-TA(5)A-ATA(5)-TTA-GA(5)C-CAC-CA(5)C-CT-NH2 |
| PNA 61 | Fethoc-TTA(5)-AAA-GA(5)T-TGG-A(5)AG-GAA(5)-TC-NH2 |
| PNA 62 | Fethoc-AG(6)G-ACA(5)-TTG-A(5)CT-TTG(6)-ATA-A(5)C-NH2 |
| PNA 63 | Fethoc-GTT-A(5)TC-AAA(5)-GTC-AA(5)T-GTC-C(1O2)T-NH2 |
| PNA 64 | Fethoc-GTA(5)-TAT-GA(5)T-GA(5)T-GGG-GCA(5)-CC-NH2 |
| PNA 65 | Fethoc-TG(6)T-CTT-AAC-A(5)TC-TTG-C(1O2)GG-TG(6)-NH2 |
| PNA 66 | Fethoc-TAA-CA(5)T-CTT-GC(1O2)G-GTG(6)-TCT-A(5)C-NH2 |
| PNA 67 | Fethoc-TCT-TGC(1O2)-GGT-G(6)TC-TA(5)C-TAC-TA(5)-NH2 |
| PNA 68 | Fethoc-TA(5)G-TA(5)G-TAG-A(5)CA-CC(1O2)G-CAA(5)-GA-NH2 |
| PNA 69 | Fethoc-TAG-TA(5)G-TAG-A(5)CT-CCC-TA(5)A-AT-NH2 |
| PNA 70 | Fethoc-GTA-GA(5)C-TCC-CTA(5)-AAT-A(5)AC-A(5)A-NH2 |
| PNA 71 | Fethoc-CTC-CCT-A(5)AA-TAA(5)-CAA-A(5)CT-CT-NH2 |
| PNA 72 | Fethoc-TGG-TCT-GA(5)T-AAT-A(5)AG-GA(5)T-NH2 |
| PNA 73 | Fethoc-A(5)TG-ACA(5)-CCT-GAT-A(5)AT-TAT-A(5)A-NH2 |
| PNA 74 | Fethoc-TTA(5)-TAA(5)-TTA(5)-TCA(5)-GGT-G(6)TC-A(5)T-NH2 |
| PNA 75 | Fethoc-GA(5)T-AAT-TCA(5)-GCA-AA(5)G-TTC-NH2 |
| PNA 76 | Fethoc-TCT-GA(5)T-GAT-GCA(5)-TTA(5)-TTC-A(5)T-NH2 |
| PNA 77 | Fethoc-GA(5)T-GCA-TTA(5)-TTC-A(5)TT-TA(5)T-GG-NH2 |
| PNA 78 | Fethoc-TTT-TGA(5)-CGA(5)-TTT-A(5)GC-NH2 |
| PNA 79 | Fethoc-GCT-AAA(5)-TCG-TCA(5)-AAA(5)-NH2 |
| PNA 80 | Fethoc-TTA(5)-TGA(5)-TTA-TA(5)T-TA(5)T-TCC-NH2 |
| PNA 81 | Fethoc-GGA(5)-ATA-A(5)TA-TAA(5)-TCA-TA(5)A-NH2 |
| PNA 82 | Fethoc-GGA-GA(5)T-GGT-GTA(5)-AAG-CAA(5)-AT-NH2 |
| PNA 83 | Fethoc-CAA(5)-ACA-TA(5)T-AAT-GA(5)A-G-NH2 |
| PNA 84 | Fethoc-ATA(5)-TAT-A(5)TT-AGA(5)-AAC-NH2 |
| PNA 85 | Fethoc-TA(5)A-CAG-AA(5)T-TAG-AGA(5)-G-NH2 |
| PNA 86 | Fethoc-A(5)TG-CTC-CGG-A(5)AA-ATG-A(5)AA-AA(5)-NH2 |
| PNA 87 | Fethoc-CA(5)T-TTT-CCG-GA(5)G-CAT-A(5)CT-AC-NH2 |
| PNA 88 | Fethoc-TCC-GGA(5)-GCA-TA(5)C-TAC-TA(5)C-TA-NH2 |
| PNA 89 | Fethoc-TA(5)G-TA(5)G-TAG-TA(5)T-GCT-C(1O2)CG-GA(5)-NH2 |
상기 펩타이드 핵산 올리고머는 상기 표 2의 PNA 29, PNA 56, PNA 79 및 PNA 81로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다. 본 발명의 실시예에서, 표 2에 기재된 핵산 올리고머의 한탄바이러스 감염 억제 효능을 확인한 결과, PNA 29, PNA 56, PNA 79 및 PNA 81의 PNA 올리고머들에 의하여 한탄바이러스 RNA의 상대적인 발현이 저해되어 우수한 한탄바이러스 억제 효능을 나타내었고, 그 중에서도 PNA 29가 가장 우수한 효능을 나타냄이 확인되었다.
상기 펩타이드 핵산 올리고머는 한탄바이러스의 genomic (+) RNA 또는 genomic (-) RNA의 일부와 상보 결합하는 것 일수 있다. 또한, 상기 펩타이드 핵산 올리고머는 한탄바이러스의 genomic (+) RNA 또는 genomic (-) RNA의 일부와 90% 이상 상보적인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드 핵산 올리고머는 한탄바이러스의 genomic (+) RNA 또는 genomic (-) RNA의 일부와 상보 결합함으로써 한탄바이러스의 활성을 억제하는 것일 수 있다.
상기 한탄바이러스 감염 질환은 신증후출혈열인 것일 수 있다. 본 발명에 따른 펩타이드 핵산 올리고머는 한탄바이러스의 활성을 억제함으로써 한탄바이러스 감염 질환인 신증후출혈열을 예방 또는 치료하기 위한 조성물로 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성 성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
본 발명에서 사용되는 PNA 올리고머는 한탄바이러스 리보핵산(Ribonucleic acid; RNA)과 결합하는 뉴클레오캡시드 단백질(Nucleocapsid protein)을 암호화하는 S 분절(S segment), 숙주세포의 표면 부착에 관여하는 당단백질(Glycoprotein)을 암호화하는 M 분절(M segment) 및 RNA 의존 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA-polymerase, RdRp)를 암호화하는 L 분절을 타겟으로 하며 한탄바이러스의 RNA 서열 및 mRNA에 상보적으로 결합하여 유전자 발현을 억제하는 방법으로 한탄바이러스의 감염 및 증식을 효과적으로 억제한다. PNA 올리고머의 염기서열들은 한탄바이러스만 가지고 있는 특이적인 염기서열들을 기초로 디자인하였다. 바이러스의 억제효율 및 특이성을 높이기 위해 설치류 유래 및 사람 유래 한탄바이러스 염기서열들을 비교분석하여 특정부분을 찾아서 후보물질들을 제조하였다. 제조된 PNA 올리고머는 면역형광염색법(IFA), 플라크형성분석법(Plaque assay) 및 실시간중합효소연쇄반응법(real-time PCR) 등의 방법을 통해 세포에 감염된 한탄바이러스의 감염 및 증식을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
실시예 1: PNA 올리고머의 설계
뉴클레오캡시드 단백질을 암호화하는 S 분절과 숙주세포의 표면 부착에 관여하는 당단백질을 암호화하는 M 분절의 경우 오르토한타바이러스 속(Orthohantavirus)의 종(Species)인 한탄바이러스와 안데스바이러스(Andes Virus, ANDV), 신놈브레바이러스(Sin Nombre Virus, SNV), 베이오바이러스(Bayou Virus, BAYV), 서울바이러스(Seoul Virus, SEOV)의 전장(whole-genome) S 분절 염기서열 및 전장(whole-genome) M 분절 염기서열을 확보하였다. RNA 의존 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA-polymerase, RdRp)를 암호화하는 L 분절의 경우 오르토한타바이러스속(Orthohantavirus)의 종(Species)인 한탄바이러스와 Maporal Virus (MAPV)의 전장(whole-genome) L 분절 염기서열들을 확보하였다. 확보된 염기서열들을 서로 비교 분석함으로써 공통염기배열(consensus sequence)로부터 표적서열(target sequence)을 설정하고, 표적서열을 토대로 한탄바이러스에 대해 특이적인 PNA 올리고머를 디자인하였다.
또한, 한탄바이러스의 L, M, S 각 분절은 동일한 3' 말단 염기서열을 갖고 있고 이에 상보적인 5' 말단 염기서열이 안전적인 팬핸들(pan-handle) 구조를 형성하며 각각 open reading frame을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 이에 L, M, S 분절의 팬핸들 영역이 한탄바이러스의 감염 억제활성을 가질 것으로 판단하여 해당 영역의 염기서열을 확보하였다. 확보된 염기서열을 표적서열로 설정하고, 표적서열을 토대로 한탄바이러스에 대해 특이적인 PNA 올리고머를 디자인하였다.
한편, 2018년 이후 국내에서 보고된 설치류 유래 및 사람 유래 한탄바이러스 중 표 3의 균주(strain)의 S 분절 염기서열과 M 분절 염기서열을 확보하였다. 확보된 염기서열들을 서로 비교 분석함으로써 공통 염기서열로부터 표적서열을 설정하고, 표적서열을 토대로 한탄바이러스에 대해 특이적인 PNA 올리고머를 디자인하였다.
마지막으로, 기존에 보고된 설치류 유래 및 사람 유래 한탄바이러스의 균주 HTNV 76-118(GenBank accession no. NC_005218, NC_005219), ROKA13-8(GenBank accession no. KU207206, KU207202), ROKA18-5, ROKA14-11(GenBank accession no. KU207207, KU207203), HTNV_KHFc15(GenBank accession no. LC209207, LC209209), 및 HTNV_KHF-c14(GenBank accession no. LC209206, LC209208)를 사용하여 해당 균주의 S 분절 염기서열과 M 분절 염기서열을 확보하였다. 확보된 S 분절 염기서열들을 Ui-Tei 알고리즘, Reynolds 알고리즘, Amarzguioui 알고리즘을 이용하여 서로 비교 분석함으로써 공통 염기배열로부터 표적 서열을 설정하고, 표적서열을 토대로 한탄바이러스 균주에 대해 특이적인 PNA 올리고머를 디자인하였다.
전술한 바와 같이 설치류 유래 및 사람 유래 한탄바이러스 염기서열들을 비교 분석하여 특정부분을 찾아 한탄바이러스만이 가지고 있는 특이적인 표적서열들을 기초로 한탄바이러스 RNA에 상보적인 PNA 올리고머(약 15-20개의 PNA 단량체를 포함)를 제조하였고, 이를 아래 표로 나타내었다. 아래 표에 기재된 표적 위치 및 표적 유전자는 한탄바이러스의 프로토 타입인 76-118 (Hantaan virus strain 76-118)(S 분절: KT8885049.1, M 분절: KT8885048.1, S 분절: KT8885047.1)을 기준으로 한 것이다.
상기 표의 89개의 PNA 올리고머는 오르토한타바이러스속의 종의 비교분석으로 디자인된 PNA 올리고머 30~33, 45~49, 52, 55~58, 61, 64, 72~85, pan-handle 영역을 표적서열로 디자인된 PNA 올리고머 1~2, 34~38, 65~71, 86~89, 및 국내에서 보고된 균주의 서열을 이용하여 디자인된 PNA 올리고머 3~8, 10~19, 22~29, 39~44, 50~51, 53~54, 59~60, 62~63 과 한탄바이러스 특정 균주들을 비교하여 디자인된 PNA 올리고머 9, 20~21 로 구성된다.
실시예 2: PNA 올리고머의 합성 방법
변형된 핵산염기를 가진 PNA 모노머들은 선행 기술 [PCT/KR 2009/001256]에서 공개된 방법이나 이를 약간 변형하여 합성하였다. 변형된 핵산염기를 가진 Fmoc[{(9-fluorenyl)methoxy}carbonyl]으로 보호된 PNA 모노머들과 천연 핵산염기를 가진 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머들을 사용하여 선행 기술 [US6,133,444; WO96/40685]에 공개된 방법이나 이를 약간 변형하여 제조하였다.
상기 실시예 1 및 실시예 2를 이용하여 제조된 PNA 올리고머의 매스 구조 분석 데이터를 표 4에 나타내었다.
a: 이론적 질량 수치 (theoretical), b: 측정된 질량 수치(observed)
실험예 1: 항바이러스 효능 평가
상기 실시예 1, 2에서 제조된 PNA 올리고머의 한탄바이러스 감염 억제 효능을 알아보기 위해 다음과 같이 세포 실험을 수행하였다.
(1) 세포 배양 및 한탄바이러스의 감염 방법
한탄바이러스가 감염되는 세포로 ATCC(American Type Culture Collection)으로부터 구입한 Vero E6 세포(ATCC CRL 1586)를 사용하였으며, Vero E6 세포는 배양용 배지로 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin), L-glutamine이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. Vero E6 세포는 계대배양 후, 배양용기 내 Vero E6 세포가 약 70% 내지 80% 정도 배양(confluency)되었을 때 siRNA의 형질주입(transfection) 및 한탄바이러스를 감염시켰다. 준비된 Vero E6 세포에 감염시키는 한탄바이러스는 2×106 PFU/ml titer를 가지는 HTNV 76-118 균주를 사용하였으며, 세포감염은 필요한 용량을 계산하고 단계 희석하여 사용하였다.
(2) 세포 실험 방법
1) -1일에 Vero E6 세포를 24 well에 seeding 하였다(다음날 confluency 80~90%).
2) 0일에 24 well에 seeding된 cell에 Serum free media(SF media)를 well 당 1 mL씩 washing 하였다.
3) well 당 SF media 500 uL 넣고 각 well에 해당하는 약물을 2.5 uM로 3시간 처리하였다.
4) 한탄바이러스(1000 PFU/mL)를 SF media에 섞어서 500 uL씩 각 well에 분주하여 감염시켰다(각 well의 SF media 1 mL에 250 PFU에 해당하는 바이러스 양과 약물이 동시에 들어있음).
5) 1시간 동안 37℃ cell incubator에 incubation 진행하였다.
6) SF media 로 washing 2번 진행하였다.
7) DMEM (FBS 5%) 1 mL 넣고 각 well에 해당하는 약물을 2.5 uM 처리하였다.
8) 7일간 incubation 후 harvest 하였다.
8-1) 7dpi에 상층액 140 uL씩 harvest 하였다(모든 well 동일).
Qiagen viral RNA prep kit를 이용하여 viral RNA 준비하고(elution 45 uL), One-step real-time PCR로 viral RNA titer (Ct값) 측정하였다.
8-2) 남은 세포는 IFA 슬라이드를 제작하여 IFA 실험을 진행하여 감염된 세포를 확인하였다.
(3) 결과
상기 실시예 1, 2에서 제조된 PNA 올리고머의 한탄바이러스 감염 억제 효능을 알아보기 위해, 상기 (1), (2) 방법을 통해 바이러스 감염 세포 상층액의 HTNV RNA의 양성대조군(P.C)에 대한 상대적인 양(표 5, 표 6)과, 바이러스 감염 세포 상층액(Supernatant) 및 세포(Cell)의 HTNV RNA의 양성대조군(P.C)에 대한 상대적인 양을 확인하였다(표 7, 표 8).
먼저, 34개의 디자인된 PNA 올리고머를 이용하여 초기 스크리닝을 수행하여 바이러스 억제 효능(세포 상층액의 HTNV RNA의 양성대조군에 대한 상대적인 양)을 확인하였다(표 5). 상기 초기 스크리닝의 결과 분석을 기반으로 디자인된 PNA 올리고머들에 대하여 siRNA(등록특허 제10-2168783호)를 양성대조군(P.C)으로 하여 바이러스 억제 효능 확인(세포 상층액의 HTNV RNA의 양성대조군에 대한 상대적인 양)을 수행하였다(표 6). 그 결과, 일부 PNA 올리고머가 우수한 한탄바이러스 억제 효능을 나타내었고, 그 중에서 PNA 29가 매우 우수한 효능을 나타냄이 확인되었다.
또한, 다른 조합의 PNA 올리고머의 한탄바이러스 감염 억제 효능(세포 상층액 및 세포의 HTNV RNA의 양성대조군에 대한 상대적인 양)을 표 7 및 표 8을 참조하면, PNA 29, 56, 79, 81 등 일부 PNA 올리고머가 상층액 및 세포에서 모두 한탄바이러스 RNA의 상대적인 발현이 저해되어 우수한 한탄바이러스 억제 효능을 나타내었고, 그 중에서도 PNA 29가 가장 우수한 효능을 나타냄이 확인되었다.
한편, 위의 결과에서 컨트롤로 사용된 siRNA는 높은 바이러스 억제 효능을 보이지만, DDS(drug delivery system, 여기서 사용한 제품은 Invitrogen 사의 Lipofectamine RNAiMAX transfection reagent 임)가 있어야 세포 투과가 가능하여 효능을 나타내고, 상기 siRNA의 높은 바이러스 억제 효능은 이에 따른 결과이다. 반면, 본 발명에 따른 PNA는 높은 세포 투과성을 확보하여 DDS 없이도 자체적으로 세포를 투과해 바이러스를 억제할 수 있는 특징이 있다.
지금까지 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 투과가 가능한 펩타이드 핵산 올리고머를 유효성분으로 포함하는 한탄바이러스 감염 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.
그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (7)
- 하기 PNA 29로 표시되는 펩타이드 핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA) 올리고머 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 한탄바이러스(Hantaan virus, HTNV) 증식 억제용 약학적 조성물:
PNA 29: Fethoc-CCA-CC(102)C-ACA(5)-ACG-G(6)AT-TAA(5)-CT-NH2
상기 PNA 29에서,
Fethoc([2-(9-플루오레닐)에틸-1-옥시]카보닐)은 하기 화학식 2로 표시되고,
[화학식 2]
A는 ,
G는 ,
C는 ,
T는 ,
C(1O2)는 ,
A(5)는 , 및
G(6)는 이다.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 펩타이드 핵산 올리고머는 한탄바이러스의 genomic (+) RNA 또는 genomic (-) RNA의 일부와 상보 결합하는, 한탄바이러스 증식 억제용 약학적 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 펩타이드 핵산 올리고머는 한탄바이러스의 genomic (+) RNA 또는 genomic (-) RNA의 일부와 90% 이상 상보적인, 한탄바이러스 증식 억제용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
신증후출혈열을 일으키는 원인 바이러스인, 한탄바이러스 증식 억제용 약학적 조성물.
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