KR102515760B1 - 펩타이드 핵산 단량체와 소중합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 포스폰산 에스테르기 또는 포스폰산기로 치환된 디알킬아민 곁사슬을 포함하는 새로운 펩타이드 핵산 단량체 및 펩타이드 핵산 소중합체 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

펩타이드 핵산 단량체와 소중합체{PEPTIDE NUCLEIC ACID MONOMERS AND OLIGOMERS}
본 발명은 포스폰산 에스테르기로 치환된 디알킬아민 곁사슬을 포함하는 새로운 펩타이드 핵산 단량체 및 펩타이드 핵산 소중합체의 제조 및 이의 용도에 관한 것이다.
펩타이드 핵산(peptide nuclec acid, PNA)은 N-(2-아미노에틸)글리신 구조를 갖는 합성 DNA/RNA 유사체이다-일반식 PNA를 참조. 일반식에서, NB는 핵염기를 나타냄; n은 PNA 단위의 수(n=0-50); 및 F 및 G는 치환기를 나타낸다.
Figure 112016123099173-pct00001
(PNA)
PNA는 n-아세틸-N-(2-아미노에틸)글리신 구성요소(PNA 단량체) 사이에 펩타이드 결합을 생성하여 제조된다. 이들 각각의 N-아세틸-N-(2-아미노에틸)글리신 구성요소의 각각은 PNA 단위를 나타낸다.
PNA의 장점은 생리학적 조건에서 가수분해(효소) 분열에 내성을 가지며 서열 특이적인 방식으로 상보적인 핵산 서열(DNA 또는 RNA)을 인식하고, 높은 친화력으로 이들과 결합할 수 있다는 것이다. 따라서 PNA는 예를 들어, 진단이나 안티센스 치료와 같은 생명 공학 및/또는 의학 분야에서 흥미로운 화합물로 고려된다.
안티센스 치료에서 활성물질로 성공적으로 사용하기 위해서는 살아있는 유기체에서의 충분한 생체이용률이 필수이다. 안티센스 활성물질은 표적 부위, 표적 RNA 또는 DNA에서 치료 효과를 내기에 충분한 양으로 이용 가능 해야한다. 이는 투여 후 치료학적으로 유의적인 정도의 안티센스 효과에 도달하기 위해 안티센스 활성 물질이 먼저 (1) 조직, 다음으로 (2) 조직 세포 및 마지막으로 (3) 세포 내에서 표적 RNA 또는 DNA까지 순서대로 충분한 양으로 침투해야 함을 의미한다.
그러나 PNA는 DNA와 비교하여 물에 거의 용해되지 않으며, 세포막을 투과하기 어렵다는 단점이 있다. 따라서, 다양한 기관 및 조직에서 PNA의 흡수 또는 생체이용률에 대한 조사에 기초하여 Beth M. et al., Antisense & Nucleic Acid Drug Development (2002) 12:65-70에 예로서 증명된 바와 같이 살아있는 유기체에서 안티센스 치료의 활성물질로서 PNA의 용도는 매우 제한적이다. 그들의 연구에서, Beth M. 등은 쥐에 복강 내 투여된 PNA가 24시간 내에 90%가 변하지 않고 배출됨을 발견하였다. 펩타이드 핵산의 2.5% 내지 4.5%만이 신장에 흡수되었고, 다른 모든 기관에서는 유의적으로 1% 미만이었다.
물에 대한 용해성, 상보적인 DNA 또는 RNA에 대한 결합특성 또는 세포에서의 흡수와 같은 PNA의 특정 성질을 개선하기 위해, 그중에서도 하기 일반식(PNA*)에 따른 PNA 단위 수의 알파-위치에 R 그룹을 도입한 PNA의 변형이 제시되었다:
Figure 112016123099173-pct00002
(PNA*)
예로서, PNA의 변형을 위한 R 그룹으로, 천연 아미노산의 곁사슬이 제시되었다(Puschl A. et al., Tetrahedron Letters 39, (1998) 4707-4710; US 5719262). 입체장애가 PNA 변형에 의해 증가되지만, PNA/DNA 혼성체의 융점 측정 결과(Pussel A. et al., loc. cit.)와 같이, 상보적인 DNA/RNA에 상기 방식으로 변형된 PNA 결합의 분해는 최소이다.
리신(R=-(CH2)4-NH2) 변형된 기본구조를 갖는 PNA는 PNA/DNA 혼성체의 물에 대한 용해성이 개선되고, 융점이 증가되었다(US 5719262). 그러나, 상기 리신 변형된 PNA는 흡수 후에 세포 내 엔도좀에서 세포 내에 갇힌 채 남아 있는 단점이 있다(Nielsen P., Quarterly Reviews of Biophysics 38, 4 (2005), 345-350; Koppelhus U. et al., Antisense & Nucleic Acid Drug Development (2002) 12:51-63). 결과적으로, 상기 방식으로 변형된 PNA는 RNA 결합을 위해 세포 내에서 사용할 수 없으며, 따라서 치료용으로는 사용할 수 없다. R. Corradini et al., Current Topics in Medicinal Chemistry, 11 (12), pp. 1535-1554, (2011)에서 관찰된 바와 같이, US 5719262에 서술된 예와 같이, 리신 변형된 PNA는 몇몇 세포에서 흡수되지 못하며, 세포에 흡수되더라도 상기 PNA는 소낭 내에 갇힌 채 남아있다. 조사된 세포의 선택에서, 세포핵 내의 흡수는 관찰되지 않았다(loc. cit., p. 1543).
구아니딘-기반 펩타이드 핵산(GPNAs)으로 알려진 아르기닌 변형된 기본구조를 갖는 PNA가 세포내에서 PNA의 흡수를 개선시키기 위해 제시되었다(Zhou P. et al., J. AM. CHEM. SOC. (2003) 125:6878-6879):
Figure 112016123099173-pct00003
세포 흡수 후, GPNA는 소포체(ER)에서 세포 내에 국한되어 있으므로 세포 자신의 mRNA에 결합할 수 있다. 그러나, 살아있는 유기체 내에서, 전신 투여 후에, GPNA는 신장, 간 및 종양 조직에 의해서만 흡수된다(Thomas S. M. et al., ACS Chem. Biol. 2013 February 15; 8(2):345-352). 이러한 제한된 생체 이용률은 치료제로서 GPNA의 다양한 적용을 막는다.
EP 1157031, EP 2041161 및 Posch W. et al., Mol Med. (2012)18:111-22는 R= -(CH2)n-P=O(OEt)2, (n= 1, 2)를 갖는 알킬 포스폰산 에스테르 변형된 PNA를 개시한다. 상기 방식으로 변형된 PNA는 변형되지 않은 PNA보다 세포 내로 더 잘 침투할수 있으며, 더 우수한 물에 대한 용해성을 갖는다. 또한, 상기 방식으로 변형된 PNA는 HIV에서 바이러스의 두세대에 걸쳐서 효과가 있음을 입증하는데 유용하다. GPNA와 비교하여, 이들 알킬 포스폰산 에스테르 그룹으로 변형된 PNA는 더 우수한 생체 이용률을 갖는다. 그러나, 알킬 포스폰산 에스테르 그룹으로 변형된 PNA의 물에 대한 용해성은 핵 염기 서열에 의존적인 단점이 있다. 예를 들어, 다수의 구아닌 및 시토신 염기를 함유하는 서열에서, PNA의 물에 대한 용해성은 감소된다. 이러한 염기 서열 의존적인 물에 대한 용해성은 치료학적 용도를 더욱 어렵게 만든다.
PNA를 치료제로서 널리 사용되게 하기 위해서는 다음의 여러 가지 특성이 결합되어야 한다: 우수한 염기 서열 독립적인 물에 대한 용해성; 우수한 세포 흡수; 우수한 DNA 및/또는 RNA에 대한 결합특성; 우수한 생체 이용률(다양한 조직에서 생체 이용률이 우수할수록 치료용도를 위한 더 많은 가능성이 있다.); 긴 반감기(살아있는 유기체의 세포에서 DNA 및/또는 RNA가 PNA에 결합할 수 있도록 하며, 유전자 발현의 조절에 대해 원하는 효과를 얻기 위함); 생체 이용률을 지지하고 반감기를 연장하기 위한 혈장 단백질과의 우수한 결합(혈장 단백질에 결합된 소중합체는 신장에서 빠르게 혈류로부터 여과되지 않고 소변을 통해 배설되지 않는다.); 및 우수한 세포흡수, 세포 내 분포 및 DNA 및/또는 RNA에 대한 PNA의 우수한 결합 특성을 위한 유전자 발현의 조절의 강력한 효과가 또한 필요하다.
알려진 변형된 PNA의 단점은 이들이 오직 (i) 우수하고 염기 서열 비의존적인 물에 대한 용해성, (ⅱ) 우수한 세포 흡수 및 세포 내 분포, (iii) 가능한 많은 치료 관련 조직들에서 우수한 생체 이용률 및 긴 반감기, (iv) 혈장 단백질과의 우수한 결합 및/또는 (v) 유전자 발현조절의 강력한 효과의 중요한 특성의 일부를 갖지만, 치료제로서의 광범위한 적용에 필요한 모든 특성을 갖지는 않는다는 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 신규한 변형된 PNA 단량체를 제공하는 것; 및 구성요소로서 새로운 PNA 단량체를 함유하는 개선된 특성 프로파일을 갖는 새로운 변형된 PNA 소중합체를 제공하는 것이다. 개선된 특성 프로파일은 (i) 우수하고 염기 서열 비의존적인 물에 대한 용해성, (ii) 우수한 세포 흡수 및 세포 내 분포, (iii) 우수한 생체 이용률 및 가능한 많은 치료 관련 조직에서의 긴 반감기, (iv) 혈장 단백질과의 강한 결합 및 (v) 유전자 발현 조절의 강력한 효과의 특성의 조합에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 변형된 PNA 소중합체 및 상기 변형된 PNA 소중합체를 함유하는 진단 및 치료용 조성물의 적용을 위한 새로운 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 이러한 측면 및 다른 측면은 하기의 상세한 설명 및 정의를 고려하여 명백해질 것이다.
본 발명은 하기에 관한 것이다:
[1] 일반식 (Ⅰ)의 화합물:
Figure 112016123099173-pct00004
(Ⅰ)
여기서
K는 카르복실산 활성 에스테르기 또는 -O-RM을 나타낸다; 여기서 RM은 H 원자, 메틸기, 에틸기, 알릴기, 벤질기, 페닐기, tert-부틸기, 또는 트리메틸실릴기를 나타낸다;
Pr은 H 원자 또는 아미노 보호기를 나타낸다;
#은 비대칭 C 원자를 나타낸다;
E는 H 원자, 페닐기, 헤테로 고리, 핵염기, 또는 핵염기 보호기로 치환된 핵염기이다;
R1은 하기 일반식 (Ⅱ)로 표시되는 기이다:
Figure 112016123099173-pct00005
(Ⅱ)
여기서
R2는 포스폰산 에스테르기(phosphonic acid ester group) 또는 포스폰산기이다;
R3는 H 원자, 또는 아미노보호기이다;
m은 1 내지 5의 정수를 나타낸다; 및
h는 0 내지 4의 정수를 나타낸다;
단, 일반식 (II)에서 m 및 h의 합: 2≤x≤5이다.
R1기를 일반 식 (I)에 따른 단량체 화합물의 골격(backbone)에 결합시킴으로써 R1기와 골격의 결합 지점에서 골격에 비대칭 중심(#)이 생성된다. 골격(#)에서 각 비대칭 중심은 R-배열 또는 S-배열일 수 있다. 상기 비대칭 중심(#)에서 배열은 Cahn-Ingold-Prelog 순차 규칙에 따라 정의되며, 리간드의 우선순위는 항상 다음과 같이 정의된다: 비대칭 중심에 있는 질소 원자는 항상 우선순위 1을 갖는다. 비대칭 중심에 있는 카르복실기의 탄소 원자는 항상 우선순위 2를 갖는다. 비대칭 중심에 있는 R1기의 탄소 원자는 항상 우선순위 3을 갖는다. 비대칭 중심에 있는 수소 원자는 항상 우선순위 4를 갖는다.
용어 카복실산 활성 에스테르기는 카복실산 작용의 커플링 반응성을 증가시키기 위해 펩타이드 화학에서 일반적으로 사용되는, 통상의 기술분야에서 당업자에게 잘 알려진 카복실산 유도체를 나타낸다. 이와 같은 카복실산 활성 에스테르기는, 예를 들어, O. Marder, F. Albericio, Chimica Oggi, 2002, 37; N. Sewald, H.-D. Jakubke, (eds), Peptide chemistry, Wiley-VCH Verlag, Weinheim 2002, Chapter 4.3 Peptide Bond Formation, Page 197에 서술되어 있다. 카복실산 활성 에스테르기의 예로는 카복실산 할라이드, 트리스(피롤리디노)-포스포늄 카복실산염(PyBroP와의 반응에 의함)과 같은 아실 포스포늄 염, 무수물, 티오페닐 에스테르, 시아노메틸 에스테르, 니트로 에스테르 및 디니트로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 클로로페닐 에스테르, 트리클로로페닐 에스테르, 펜타클로로 페닐 에스테르 및 하기 표에 기재된 활성 에스테르가 있다.
활성기 일반적으로
사용되는 기호		 구조 (짧은)활성화 기가 도입된 시약의 이름
N-하이드록시피페리디닐
(N-hydroxypiperidinyl)		 OPip
Figure 112022112997502-pct00006
 N-하이드록시피페리딘
(HOPip)
8-퀴놀릴(8-quinolyl) OQ
Figure 112022112997502-pct00007
 8-하이드록시퀴놀린
N-하이드록시숙신이미딜
(N-hydroxysuccinimidyl)		 OSu
Figure 112022112997502-pct00008
 N-하이드록시숙신이미드
HOSu
N, N'-디숙신이미딜
탄산염 DSC
1-하이드록시벤조트리아졸릴
(1-hydroxybenzotriazolyl)		 OBt
Figure 112022112997502-pct00009
 HOBt, BOP, PyBOP HBTU, TBTU
7-아자-1-하이드록시벤조- 트리아졸릴(7-aza-1-hydroxybenzo-triazolyl) OAt
Figure 112022112997502-pct00010
 HOAt, PyAOP, HATU, HAPyu, HAPipU, HAMDU, HAMTU
6-클로로-1-하이드록시-벤조트리아졸릴(6-chloro-1-hydroxy-benzotriazolyl) ClOBt
Figure 112022112997502-pct00011
 HCTU
N-노르보르넨-2,3-디카르복시미도옥시(N-norbornen-2,3-dicarboximidooxy) ONdc
Figure 112022112997502-pct00012
 n-하이드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복시이미드 HONB 또는 HONdc
에틸-1-하이드록시-1H-1,2,3-트리아졸-4-카르복실산염 OCt
Figure 112022112997502-pct00013
 에틸-1-하이드록시-1H-1,2,3-트리아졸-4-카르복실산염 HOCt
용어 아미노 보호기는 아미노산 또는 펩타이드, 예를 들어 트리플루오로아세틸, 옥소카르바메이트, 티오카르바메이트, 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc), 카르보벤즈옥시(Cbz), 모노메톡시트리틸(Mmt), 프탈로일, t-부톡시카르보닐(Boc), 벤즈하이드릴옥시카르보닐(Bhoc), 또는 알릴옥시카르보닐(Alloc) 보호기의 유기합성에 사용되는 당업계의 기술자에게 잘 알려진 보호기를 나타낸다.
용어, 핵염기(nucleobase)는 DNA 염기 또는 RNA 염기와 염기쌍을 형성할 수 있는 당업계의 기술자에게 잘 알려진 염기를 나타낸다. 핵염기의 예는 퓨린 염기성 구조, 예를 들어, 아데닌, 구아닌, 히포크산틴, 크산틴 및 7-메틸구아닌; 또는 피리미딘 염기성 구조, 예를 들어, 시토신, 우라실, 티민, 5-하이드록시메틸시토신, 5-메틸시토신 및 5,6-디하이드로우라실; 뿐만아니라 이의 유사체 및 등배전자(bioisoster)를 포함한다.
용어, 핵염기 보호기는 핵염기, 예를 들어 아세틸, 이소부티릴, 벤질옥시카르보닐, 디페닐메틸, 벤즈하이드릴옥시카르보닐, 아니소일, 4-tert-부틸벤조일, 벤질 또는 디페닐카르바모일기를 갖는 화합물의 유기합성에 사용되기 위해 당업계의 기술자에게 잘 알려진 보호기를 나타낸다.
용어, 알킬은 1 내지 40개의 탄소 원자, 바람직하게는 1 내지 20개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 1 내지 12개의 탄소 원자, 특히 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 포화된 선형 또는 분지형 탄화수소기, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-펜틸, n-헥실, 2,2-디메틸부틸 또는 n-옥틸기를 나타낸다.
용어, 알케닐 및 알키닐은 2 내지 40개의 탄소 원자, 바람직하게는 2 내지 20개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 2 내지 12개의 탄소 원자, 특히 바람직하게는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 적어도 부분적으로 불포화된 선형 또는 분지형 탄화수소기, 예를 들어, 에테닐, 알릴, 아세틸레닐, 프로파르길, 이소프레닐 또는 헥스-2-에닐기를 나타낸다. 알케닐 그룹은 바람직하게는 1 또는 2개(특히 바람직하게는 1개)의 이중 결합을 가지거나 알케닐 그룹은 1 또는 2개(특히 바람직하게는 1개)의 삼중 결합을 갖는다.
용어, 아릴 또는 Ar은 하나 또는 그 이상의 고리, 및 6 내지 14개의 고리 탄소 원자, 바람직하게는 6 내지 10(특히 6)개의 고리 탄소 원자를 갖는 방향족기를 나타낸다. 구체적인 예로는 벤젠, 나프탈렌 또는 바이페닐이 있다.
용어, 아랄킬은 상기 정의에 따라 아릴 및 알킬, 알케닐, 알키닐 및/또는 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 아릴사이클로알킬, 아릴사이클로알케닐, 알킬아릴사이클로알킬 및 알킬아릴사이클로알케닐기와 같은 사이클로알킬기를 포함하는 기를 나타낸다. 아랄킬의 구체적인 예로는 톨루엔, 자일렌, 메시틸렌, 스티렌, 1H- 인덴, 테트라린, 디하이드로나프탈렌, 인다논, 페닐사이클로펜틸, 사이클로헥실페닐, 플루오렌 및 인단이 있다. 아랄킬기는 바람직하게는 6 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 1 또는 2개의 방향족 고리 시스템(1 또는 2개의 고리) 및 1 또는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 1 또는 2개의 알킬, 알케닐 및/또는 알키닐기 및/또는 5 또는 6 개의 고리 탄소 원자를 갖는 하나의 사이클로알킬기를 포함한다.
용어, 사이클로알킬은 하나 또는 그 이상의 고리(바람직하게는 1 또는 2)를 가지며, 3 내지 14개의 고리 탄소 원자, 바람직하게는 3 내지 10(특히 3, 4, 5, 6 또는 7)개의 고리 탄소 원자를 포함하는 포화되거나 부분적으로 불포화된(예를 들어, 사이클로알케닐) 사이클릭기를 나타낸다. 사이클로알킬기의 구체적인 예로는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 스피로[4,5]데카닐, 노르보닐, 사이클로헥실, 사이클로펜테닐, 사이클로헥사디에닐, 데카리닐, 바이사이클로[4.3.0]노닐, 테트랄린, 사이클로펜틸사이클로헥실, 또는 사이클로헥스-2-에닐기가 있다.
용어, 알킬사이클로알킬은 상기 정의에 따라 사이클로알킬 및 알킬 모두, 알케닐 또는 알키닐기, 예를 들어, 알킬사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 알킬사이클로알케닐, 알케닐사이클로알킬 및 알키닐사이클로알킬기를 포함하는 기를 나타낸다. 알킬사이클로알킬기는 바람직하게는 1 또는 2개의 고리, 및 3 내지 14개의 고리 탄소 원자, 바람직하게는 3 내지 10개, 특히 3, 4, 5, 6 또는 7개의 고리 탄소 원자를; 및 1, 2 또는 3개, 바람직하게는 1 또는 2개의 알킬, 알케닐 또는 알키닐기를 각각 1 또는 2 내지 6개의 탄소원자를 포함한다; 여기서 C4 내지 C11의 알킬사이클로알킬기가 바람직하고, C4 내지 C7의 알킬사이클로알킬기가 특히 바람직하다. 알킬사이클로알킬기의 구체적인 예로는 메틸사이클로프로필(C4), 메틸사이클로부틸(C5), 에틸사이클로프로필(C5), 메틸사이클로펜틸(C6), 프로필사이클로프로필(C6), 에틸사이클로펜틸(C7), 메틸사이클로헥실(C7), 에틸사이클로펜테닐(C7) 또는 에틸사이클로헥사디에닐(C8)기가 있다.
용어, 알킬옥시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 알킬옥시아릴, 및 사이클로알킬옥시는 하나 또는 그 이상의 -O-기를 포함하는 상기에서 언급한 바와 같은 알킬, 알케닐, 알키닐, 알킬아릴 또는 사이클로알킬기를 나타낸다. 예로는 메톡시, 에톡시, 퓨란, 테트라하이드로퓨란 또는 4-메톡시벤질기가 있다.
용어, 헤테로 고리는 하나 또는 그 이상의, 바람직하게는 1, 2 또는 3 개의 탄소 원자가 산소, 질소 또는 황 원자로 치환된 상기에서 언급한 바와 같은 사이클로알킬기, 아릴기 또는 아랄킬기를 나타낸다. 예로는 피페리딜, 피페라지닐, 모르폴리닐, 우로트로피닐, 피롤리디닐, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로푸릴 또는 2-피라졸리닐기가 있다. 또한, 용어, 헤테로 고리는 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 고리를 가지며, 5 내지 14개의 고리 원자, 바람직하게는 5 내지 10개의 고리 원자, 특히 5 또는 6개의 고리 원자를 포함하는 방향족기를 의미하며, 여기서 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4는 산소, 질소 또는 황 고리 원자이다. 예로는 4-피리딜, 2-이미다졸릴, 3-페닐피롤릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 이소옥사졸릴, 인다졸일, 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 피리다지닐, 키놀리닐, 퓨리닐, 카르바졸릴, 아크리디닐, 피리미딜, 2,3'-바이푸릴, 3-피라졸일 및 이소키놀리닐기가 있다.
용어, 아미노산은 탄소 원자 상의 하나 또는 그 이상의 수소 원자가 아미노기로 치환된 카르복실산을 의미한다. 아미노산은 글리신, 류신, 이소류신, 발린, 알라닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 시스테인, 메티오닌, 아르기닌, 리신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 히스티딘, 셀레노시스테인, 피롤리신, 티록신, DOPA 및 L-오르니틴과 같은 α-아미노산, 5-하이드록시트립토판, 란티오닌, β-클로로알라닌, 2-메틸알라닌, 시트룰린, 카나바닌, 테아닌, 쿠커비틴, β-알라닌과 같은 β-아미노산, 또는 γ-아미노부티르산 (GABA)과 같은 γ-아미노산이 예일 수 있다.
본 발명은 하기를 추가로 포함한다:
[2] 상기 [1]에 기재된 화합물, 여기서 K는 -0-RM을 나타내며, RM은 [1]에서 정의된 바와 같다.
[3] 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 화합물, 여기서 RM은 H 원자, 메틸, 에틸, 알릴 또는 트리메틸실릴기를 나타낸다.
[4] 상기 [1] 내지 [3]에 기재된 화합물, 여기서 Pr은 아미노 보호기를 나타낸다.
[5] 상기 [4]에 기재된 화합물, 여기서 아미노 보호기는 옥소카르바메이트, 티오카르바메이트 또는 Mmt 보호기로부터 선택된다.
[6] 상기 [4] 또는 [5]에 기재된 화합물, 여기서 아미노 보호기는 Fmoc, Boc, Cbz, Bhoc, Alloc 또는 Mmt 보호기이다.
[7] 상기 [4] 내지 [6]에 기재된 화합물, 여기서 아미노 보호기는 Boc 또는 Fmoc 보호기이다.
[8] 상기 [1] 내지 [7]에 기재된 화합물, 여기서 E는 필요에 따라 핵염기 보호기로 치환된 아데니닐, 시토시닐, 슈도이소시토시닐, 구아니닐, 티미닐, 우라시릴 또는 페닐기를 나타낸다.
[9] 상기 [8]에 기재된 화합물, 여기서 E는 하기로부터 선택되는 기를 나타낸다:
Figure 112016123099173-pct00014
Figure 112016123099173-pct00015
Figure 112016123099173-pct00016
Figure 112016123099173-pct00017
Figure 112016123099173-pct00018
Figure 112016123099173-pct00019
Figure 112016123099173-pct00020
여기서
각각의 경우에서 X1 내지 X4는 독립적으로 H 원자 또는 핵염기 보호기를 나타낸다; 및 각각의 경우에서 X5는 독립적으로 H 원자 또는 Boc 또는 Bhoc 보호기를 나타낸다.
[10] 상기 [9]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 X1, X2 및 X4는 독립적으로 H 원자, 아세틸(Ac), tert-부틸옥시카르보닐(Boc), 이소부티릴(iBu-CO), 벤질옥시카르보닐(Cbz), (4-메톡시페닐)-디페닐메틸(Mmt), 벤즈하이드릴옥시카르 보닐(Bhoc), 아니소일(An) 또는 4-tert-부틸벤조일(tBuBz)을 나타낸다;
각각의 경우에서 X5는 독립적으로 H 원자 또는 Boc 또는 Bhoc 보호기를 나타낸다; 및
각각의 경우에서 X3은 독립적으로 H 원자, 벤질(Bn) 또는 디페닐카르바모일(Dpc)을 나타낸다.
[11] 상기 [1] 내지 [10]에 기재된 화합물, 여기서 E는 티미닐기, 우라시릴기, 페닐기, N2-아세틸-구아니릴기, N2-이소부티릴-구아니닐기, N2-벤질옥시카르보닐-구아니닐기, N2-(4-메톡시페닐)-디페닐메틸-구아니닐기, N2-벤즈하이드릴옥시카르보닐-구아니닐기, N2-디-벤즈하이드릴옥시카르보닐-구아니닐기, N2-tert-부틸옥시카르보닐-구아니닐기, N2-디-tert-부틸옥시카르보닐-구아니닐기, N6-엔질옥시카르보닐-아데니닐기, N6-(4-메톡시페닐)-디페닐메틸-아데니닐기, N6-아니소일-아데니닐기, N6-벤즈하이드릴옥시카르보닐-아데니닐기, N6-디-벤즈하이드릴옥시카르보닐-아데니닐기, N6-tert-부틸옥시카르보닐-아데니닐기, N6-디-tert-부틸옥시카르보닐-아데니닐기, O6-벤질구아니닐기, N2-아세틸-O6-디페닐카르바모일-구아니닐기, N2-이소부티릴-O6-디페닐카르바모일-구아니닐기, N2-벤질옥시카르보닐-O6-디페닐카르바모일-구아니닐기, N2-(4-메톡시페닐)-디페닐메틸-O6-디페닐카르바모일-구아니닐기, N2-벤즈하이드릴옥시카르보닐-O6-디페닐카르바모일-구아니닐기, N4-벤질옥시카르보닐-시토시닐기, N4-(4-메톡시페닐)-디페닐-메틸-시토시닐기, N4-4-tert-부틸벤조일-시토시닐기, N4-벤즈-하이드릴옥시카르보닐-시토시닐기, N4-디-벤즈하이드릴옥시카르보닐-시토시닐기, N4-tert-부틸옥시카르보닐-시토시닐기, N4-디-tert-부틸옥시카르보닐-시토시닐기, N2-벤질옥시카르보닐-슈도-이소시토시닐기, N2-(4-메톡시페닐)-디페닐메틸-슈도이소시토-시닐기, N2-4-tert-부틸벤조일-슈도이소시토시닐기, N2-벤즈-하이드릴옥시카르보닐-슈도이소시토시닐기, N2-디-벤즈하이드릴옥시카르보닐-슈도이소시토시닐기, N2-tert-부틸옥시카르보닐-슈도이소시토시닐기 또는 N2-디-tert-부틸옥시카르보닐-슈도이소시토시닐기를 나타낸다.
[12] 상기 [1] 내지 [11]에 기재된 화합물, 여기서 E는 티미닐기, 우라시릴기, 페닐기, N2-벤질옥시카르보닐-구아니닐기, N2-벤즈하이드릴옥시카르보닐-구아니닐기, N2-tert-부틸옥시카르보닐-구아니닐기, N2-벤질옥시카르보닐-O6-디페닐카르바모일-구아니닐기, N2-벤즈하이드릴옥시카르보닐-O6-디페닐카르바모일-구아니닐기, N6-벤질옥시카르보닐-아데니닐기, N6-벤즈하이드릴옥시카르보닐-아데니닐기, N6-tert-부틸옥시카르보닐-아데니닐기, N6-디-tert-부틸옥시카르보닐-아데니닐기, N4-벤질옥시카르보닐-시토시닐기, N4-벤즈-하이드릴옥시카르보닐-시토시닐기, N4-디-tert-부틸옥시카르보닐-시토시닐기, N2-벤질옥시카르보닐-슈도-이소시토시닐기, N2-벤즈-하이드릴옥시카르보닐-슈도이소시토시닐기 또는 N2-tert-부틸옥시카르보닐-슈도이소시토시닐기를 나타낸다.
[13] 상기 [1] 내지 [12]에 기재된 화합물, 여기서 상기 R2는 화학식 -P(=O)(OV)2 또는 -P(=O)(OV)(OH)의 포스폰산 에스테르기를 나타낸다; 및 각각의 V는 독립적으로 비치환된 C1 내지 C7의 알킬, C3 내지 C7의 사이클로알킬, C4 내지 C7의 알킬사이클로알킬, 페닐 또는 벤질기를 나타낸다.
[14] 상기 [13]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 V는 독립적으로 메틸, 에틸, 사이클로헥실, 또는 벤질기를 나타낸다.
[15] 상기 [14]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 V는 에틸기를 나타낸다.
[16] 상기 [1] 내지 [15]에 기재된 화합물, 여기서 R3는 H 원자이다.
[17] 상기 [1] 내지 [15]에 기재된 화합물, 여기서 R3는 옥소카르바메이트, 티오카르바메이트, 또는 Mmt 보호기를 나타낸다.
[18] 상기 [17]에 기재된 화합물, 여기서 R3는 Cbz, Alloc, Bhoc 또는 Boc 보호기를 나타낸다.
[19] 상기 [1] 내지 [18]에 기재된 화합물, 여기서 m은 1, 2, 3 또는 4를 나타낸다.
[20] 상기 [1] 내지 [19]에 기재된 화합물, 여기서 h는 0, 1, 2, 또는 3을 나타낸다.
[21] 상기 [1] 내지 [20]에 기재된 화합물, 여기서 R1은 화학식 -CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2의 기, 또는 화학식 -CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2의 기를 나타낸다.
[22] 상기 [1] 내지 [15], [19] 또는 [20]에 기재된 화합물, 여기서 R1은 화학식 -CH2-CH2-CH2-CH2-NR3-CH2-CH2-P=O(OEt)2의 기, 또는 화학식 -CH2-CH2-CH2-NR3-CH2-CH2-P=O(OEt)2를 나타낸다; 및 R3는 [17] 또는 [18]에서 정의된 바와 같다.
상기 [1] 내지 [22]에 나타낸 바와 같은 일반식 (I)의 본 발명에 따른 화합물은 새로운 소중합체 화합물을 제조하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가적으로 하기와 관련된다 :
[23] 일반식 (Ⅲ)의 적어도 하나의 반복 단위를 포함하는 화합물:
-[Yd-Zf-Yg-Zj]n- (Ⅲ)
여기서
각각의 경우에서 각각의 Y는 독립적으로 일반식 (Ⅳ)의 기를 나타낸다:
Figure 112016123099173-pct00021
(Ⅳ);
각각의 경우에서 각각의 Z는 독립적으로 일반식 (Ⅴ)의 기를 나타낸다:
Figure 112016123099173-pct00022
(Ⅴ);
여기서
각각의 경우에서 각각의 E는 독립적으로 H 원자, 페닐기, 헤테로 고리, 또는 핵염기를 나타낸다;
#은 비대칭 C 원자를 나타낸다;
각각의 경우에서 각각의 R41은 독립적으로 H 원자 또는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 오르니틴, 페닐알라닌, 프롤린, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린 아미노산의 곁가지를 나타낸다;
각각의 R11은 -(CH2)m-NH-(CH2)h-CH2-R12기를 나타낸다; 여기서 각각의 경우에서 R12는 포스폰산 에스테르기 또는 포스폰산기이다; m은 1 내지 5의 정수를 나타낸다; 및 h는 0 내지 4의 정수를 나타낸다; 단, m 및 h의 합은 2≤x≤5이다;
각각의 경우에서 d는 0 내지 5의 정수를 나타낸다;
각각의 경우에서 f는 0 내지 5의 정수를 나타낸다;
각각의 경우에서 g는 0 내지 5의 정수를 나타낸다;
각각의 경우에서 j는 0 내지 5의 정수를 나타낸다;
각각의 경우에서 n은 1 내지 10의 정수를 나타낸다;
단, 일반식 (Ⅲ)에서의 모든 반복 단위 Yd, Zf, Yg 및 Zj의 합은 ≤40이고, 변수 f 또는 j의 적어도 하나는 1 내지 5의 정수이다.
화학식 (Ⅲ)과 같은 반복 단위, Z 또는 Y와 같은 기 또는 치환기 또는 E, R11 또는 R41과 같은 변수가 본 명세서에 포함된 일반식에서 1회 이상 나타나면, 각각의 반복 단위, 반복 단위에 있는 각각의 기 및 각각의 치환기 또는 각각의 변수는 특별히 표시되는지의 여부와는 상관없이 서로 독립적으로 선택된다. 예로서, 화학식 (Ⅲ)에서, 각각의 Z 및 Y기 및 각각의 변수 E, R11 또는 R41은 서로 독립적으로 선택된다. 즉, 상기 일반식 (Ⅲ)은 상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 적어도 하나의 단량체 단위 Z 또는 [1] 내지 [22]에 정의된 예에 따라, 및 총 40단위의 Z의 최대 또는 Z 및 Y를 포함한다.
예를 들어, 일반식 (Ⅲ)에서, 각각의 기 Y 및 Z; 및 각 변수 d, f, g 및 j는 독립적으로 선택된다. 따라서, [Yd-Zf-Yg-Zj]n과 d, f, g 및 j=1의 조합; 및 예로서 n=10은 Y 및 Z 단위의 하기와 같은 조합을 나타낸다: -[Y-Z-Y-Z-Y-Z-Y-Z-Y-Z-Y-Z-Y-Z-Y-Z-Y-Z-Y-Z-Y-Z-Y-Z-Y-Z-Y-Z-Y-Z-Y-Z-Y-Z-Y-Z-Y-Z-Y-Z]-, 여기서 모든 Y 및 Z 단위의 합은 40과 같다. [Yd-Zf-Yg-Zj]n과 d=3, f=1, g=1 및 j=3의 조합; 예로서 n=3은 Y 및 Z 단위의 하기와 같은 조합을 나타낸다: -[Y-Y-Y-Z-Y-Z-Z-Z-Y-Y-Y-Z-Y-Z-Z-Z-Y-Y-Y-Z-Y-Z-Z-Z]-, 여기서 모든 Y 및 Z 단위의 합은 24와 같다.
그러나, 각각의 반복 단위 [Yd-Zf-Yg-Zj] 내의 변수 d, f, g 및 j는 서로 상이할 수 있다. 예로서, 하기 4개의 반복 단위 [Yd-Zf-Yg-Zj]: (Y1-Z1-Y1-Z1), (Y1-Z1-Y0-Z0), (Y5-Z1-Y0-Z0), (Y1-Z1-Y1-Z1), 즉 n=4는 하기 Y 및 Z기의 조합에서 결합될 수 있다: -[Y-Z-Y-Z-Y-Z-Y-Y-Y-Y-Y-Z-Y-Z-Y-Z]-; 모든 Y 및 Z 단위의 합은 16과 같다. 마찬가지로, 예로서, 다음 3개(즉, n=3)의 반복 단위 [Yd-Zf-Yg-Zj]: (Y5-Z1-Y1-Z1), (Y1-Z1-Y0-Z0) 및 (Y1-Z1-Y5-Z0)는 하기와 같이 결합될 수 있다: - [Y-Y-Y-Y-Y-Z-Y-Z-Y-Z-Y-Z-Y-Y-Y-Y-Y]-; 모든 Y 및 Z기 수의 합은 17과 같다. 여기서, 반복 단위, 또는 각 치환기 또는 일반식 (Ⅲ)에 따른 반복 단위에 1회 이상 포함된 각 변수에 포함된 각각의 기는 특별히 표시되는지의 여부와는 상관없이 상기 점으로부터 서로 독립적으로 선택된다.
본 발명은 하기를 추가로 포함한다:
[24] 하기 일반식 (Ⅵ)로 표시되는 화합물:
Figure 112016123099173-pct00023
(Ⅵ)
여기서
각각의 경우에서 E, Y, Z, d, f, g, j 및 n은 [23]에서 정의된 바와 같이 독립적이다; 단, 일반식 (Ⅵ)에서 모든 반복 단위 Yd, Zf, Yg 및 Zj의 합은 ≤40이며, 변수 f 또는 j의 적어도 하나는 1 내지 5의 정수를 나타낸다.
R31은 H 원자; 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 오르니틴, 페닐알라닌, 프롤린, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린 아미노산의 곁사슬; 또는 -(CH2)m-NH-(CH2)h-CH2-R12기를 나타낸다; 여기서 R12는 포스폰산 에스테르기 또는 포스폰산기이다; m은 1 내지 5의 정수를 나타낸다; 및 h는 0 내지 4의 정수를 나타낸다; 단, m 및 h의 합은 2≤x≤5이다;
각각의 경우에서 R47은 독립적으로 H 원자; 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 오르니틴, 페닐알라닌, 프롤린, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린 아미노산의 곁사슬; 화학식 (Ⅸb)의 기:
Figure 112016123099173-pct00024
(Ⅸb);
화학식 (Ⅸc)의 기:
Figure 112016123099173-pct00025
(Ⅸc);
화학식 (Ⅸd)의 기:
Figure 112016123099173-pct00026
(Ⅸd);
또는 화학식 (Ⅸe)의 기를 나타낸다:
Figure 112016123099173-pct00027
(Ⅸe);
화학식 (Ⅸb), (Ⅸc), (Ⅸd) 및 (Ⅸe)에서 p는 3 또는 4의 수를 나타낸다;
t는 0 내지 10의 정수를 나타낸다;
L은 -NRDRE-NHNRDRE 또는 -ORF를 나타낸다; 여기서 각각의 경우에서 RD, RE 및 RF는 서로 독립적으로 H 원자; 또는 각각의 경우에 최대 20개의 C 원자를 갖는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬, 사이클로알킬 또는 사이클로알케닐기를 나타낸다.
U는 -NRARB; -N+RARBRC; -NRA(CO)RB; -NH(CO)NHRB; -NH(CO)ORB; 화학식 (Ⅷa)의 기:
Figure 112016123099173-pct00028
(Ⅷa)
화학식 (Ⅷb)의 기:
Figure 112016123099173-pct00029
(Ⅷb)
화학식 (Ⅷc)의 기:
Figure 112016123099173-pct00030
(Ⅷc)
화학식 (Ⅷd)의 기:
Figure 112016123099173-pct00031
(Ⅷd)
또는 화학식 (Ⅷe)의 기를 나타낸다:
Figure 112016123099173-pct00032
(Ⅷe)
화학식 (Ⅷb), (Ⅷc), (Ⅷd) 및 (Ⅷe)에서 q는 3 또는 4의 수;
또는 일반식 (Ⅶ)의 기를 나타낸다:
Figure 112016123099173-pct00033
(Ⅶ)
여기서
B는 H 원자, -NRHRI, -N+RHRIRJ, -NRH(CO)RI-NH(CO)NHRI, -NH(CO)ORI, 페닐기 또는 OH, F, Cl, Br, I 및 NO2를 포함하는 군으로부터 선택되는 1 내지 3개의 치환체로 치환된 페닐기를 나타낸다;
각각의 경우에서 각각의 RA, RC, RH 및 RJ는 서로 독립적으로 H 원자, 메틸기 또는 아미노 보호기를 나타낸다;
각각의 경우에서 각각의 RB 및 RI는 서로 독립적으로 H 원자; 아미노 보호기; 각각의 경우에서 최대 40개의 C 원자를 갖는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬, 사이클로알킬, 알킬사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬옥시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 알킬옥시아릴, 또는 사이클로알킬옥시기를 나타낸다; 여기서 각각의 경우에서 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬, 사이클로알킬, 알킬사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬옥시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 알킬옥시아릴, 또는 사이클로알킬옥시기의 하나 또는 그 이상의 수소 원자는 서로 독립적으로 포스폰산 에스테르기 또는 포스폰산기, F, Cl, Br, I, -OH, O-CH3, S-CH3, NO2, =O, NH2, -S(O2)NH-, -NHCH3, -N(CH3)2, C1 내지 C6의 알킬, C2 내지 C6의 알케닐, C2 내지 C6의 알키닐, C3 내지 C10의 사이클로알킬, C6 내지 C10의 아릴 또는 C7 내지 C12의 아랄킬기로 대체될 수 있다;
각각의 경우에서 R48 및 R46은 서로 독립적으로 H 원자, 또는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 오르니틴, 페닐알라닌, 프롤린, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린 아미노산의 곁사슬 또는 화학식 (Ⅸb), (Ⅸc), (Ⅸd) 또는 (Ⅸe)의 기를 나타낸다; 및
s는 0 내지 10의 정수이다.
[25] 상기 [23] 또는 [24]에 기재된 화합물, 단, 일반식 (Ⅲ) 또는 (Ⅵ)에서 모든 반복 단위 Yd, Zf, Yg 및 Yj의 합은 ≤30이다.
[26] 상기 [23] 내지 [25]에 기재된 화합물, 단, 일반식 (Ⅲ) 또는 (Ⅵ)에서 모든 반복 단위 Yd, Zf, Yg 및 Zj의 합은 7≤x≤30이다.
[27] 상기 [23] 내지 [26]에 기재된 화합물, 단, 일반식 (Ⅲ) 또는 (Ⅵ)에서 비율은 (반복 단위 Zf 및 Zj의 합):(모든 반복 단위 Yd, Zf, Yg 및 Zj의 합): 0.1≤x≤1.0이다.
[28] 상기 [23] 내지 [26]에 기재된 화합물, 단, 일반식 (Ⅲ) 또는 (Ⅵ)에서 비율은 (반복 단위 Zf 및 Zj의 합):(모든 반복 단위 Yd, Zf, Yg 및 Zj의 합): 0.1≤x≤0.8이다.
[29] 상기 [23] 내지 [26]에 기재된 화합물, 단, 일반식 (Ⅲ) 또는 (Ⅵ)에서 비율은 (반복 단위 Zf 및 Zj의 합):(모든 반복 단위 Yd, Zf, Yg 및 Zj의 합): 0.1≤x≤0.6이다.
[30] 상기 [23] 내지 [26]에 기재된 화합물, 단, 일반식 (Ⅲ) 또는 (Ⅵ)에서 비율은 (반복 단위 Zf 및 Zj의 합):(모든 반복 단위 Yd, Zf, Yg 및 Zj의 합): 0.1≤x≤0.5이다.
[31] 상기 [23] 내지 [26]에 기재된 화합물, 단, 일반식 (Ⅲ) 또는 (Ⅵ)에서 비율은 (반복 단위 Zf 및 Zj의 합):(모든 반복 단위 Yd, Zf, Yg 및 Zj의 합): 0.1≤x≤0.4이다.
[32] 상기 [23] 내지 [31]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 각각의 E는 독립적으로 아데니닐, 시토시닐, 슈도이소시토시닐, 구아니닐, 티미닐, 우라시릴 또는 페닐기를 나타낸다.
[33] 상기 [23] 내지 [32]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 각각의 R41은 독립적으로 H 원자, 또는 리신, 오르니틴, 아르기닌, 히스티딘, 트립토판, 티로신, 트레오닌 또는 세린 아미노산의 곁사슬을 나타낸다.
[34] 상기 [23] 내지 [33]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 각각의 R41은 독립적으로 H 원자, 또는 리신, 오르니틴 또는 아르기닌 아미노산의 곁사슬을 나타낸다.
[35] 상기 [23] 내지 [34]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 각각의 R41은 H 원자를 나타낸다.
[36] 상기 [23] 내지 [34]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 각각의 R12는 독립적으로 화학식 -P(=O)(OV)2 또는 -P(=O)(OV)(OH)의 포스폰산 에스테르기를나타낸다; 및 각각의 경우에서 각각의 V는 독립적으로 비치환된 C1 내지 C7의 알킬, C3 내지 C7의 사이클로알킬, C4 내지 C7의 알킬사이클로알킬, 페닐 또는 벤질기를 나타낸다.
[37] 상기 [36]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 각각의 V는 독립적으로 메틸, 에틸, 사이클로헥실, 또는 벤질기를 나타낸다.
[38] 상기 [36] 또는 [37]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 V는 에틸기를 나타낸다.
[39] 상기 [23] 내지 [38]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3 또는 4이다.
[40] 상기 [23] 내지 [39]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 각각의 h는 독립적으로 0, 1, 2, 또는 3이다.
[41] 상기 [23] 내지 [40]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 각각의 R11은 독립적으로 화학식 -CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2의 기, 또는 화학식 -CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2의 기를 나타낸다.
[42] 상기 [23] 내지 [41]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 각각의 d는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이다.
[43] 상기 [23] 내지 [42]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 각각의 f는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이다.
[44] 상기 [23] 내지 [43]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 각각의 g는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이다.
[45] 상기 [23] 내지 [44]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 각각의 j는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이다.
[46] 상기 [23] 내지 [45]에 기재된 화합물, 여기서 n=0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다.
[47] 상기 [24] 내지 [46]에 기재된 화합물, 여기서 R31은 H 원자, 리신, 오르니틴, 아르기닌, 히스티딘, 트립토판, 티로신, 트레오닌 또는 세린 아미노산의 곁사슬, 화학식 -CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2의 기, 또는 화학식 -CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2의 기를 나타낸다.
[48] 상기 [24] 내지 [47]에 기재된 화합물, 여기서 R31은 화학식 -CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2의 기, 또는 화학식 -CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2의 기를 나타낸다.
[49] 상기 [24] 내지 [47]에 기재된 화합물, 여기서 R31은 H 원자, 또는 리신, 오르니틴, 또는 아르기닌 아미노산의 곁사슬을 나타낸다.
[50] 상기 [24] 내지 [47] 또는 [49]에 기재된 화합물, 여기서 R31은 H 원자를 나타낸다.
[51] 상기 [24] 내지 [50]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 R47은 독립적으로 H 원자; 리신, 오르니틴, 아르기닌, 히스티딘, 트립토판, 티로신, 트레오닌 또는 세린 아미노산의 곁사슬; 또는 화학식 (Ⅸb), (Ⅸc), (Ⅸd) 또는 (Ⅸe)의 기를 나타낸다.
[52] 상기 [24] 내지 [51]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 R47은 독립적으로 H 원자; 또는 리신, 오르니틴, 또는 아르기닌 아미노산의 곁사슬을 나타낸다.
[53] 상기 [52]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 R47은 독립적으로 H 원자를 나타낸다.
[54] 상기 [52]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 R47은 독립적으로 리신, 오르니틴, 또는 아르기닌 아미노산의 곁사슬을 나타낸다.
[55] 상기 [24] 내지 [54]에 기재된 화합물, 여기서 t=0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다.
[56] 상기 [24] 내지 [51]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 R47은 독립적으로 H 원자; 또는 화학식 (Ⅸb), (Ⅸc), (Ⅸd) 또는 (Ⅸe)의 기; 및 t=1, 2, 3, 또는 4를 나타낸다.
[57] 상기 [56]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 R47은 독립적으로 화학식 (Ⅸb), (Ⅸc), (Ⅸd) 또는 (Ⅸe)의 기를 나타낸다.
[58] 상기 [24] 내지 [57]에 기재된 화합물, 여기서 L은 -OH, -NH2, -NHNH2, -O(C1-C10)알킬, -O(C2-C10)알케닐, -O(C2-C10)알키닐, -O(C3-C10)사이클로알킬, -O(C4-C11)알킬사이클로알킬, -O(C6-C10)아릴, -O(C7-C12)아랄킬, -NH-(C1-C10)알킬, -NH(C2-C10)알케닐, NH(C2-C10)사이클로알케닐, -NH(C3-C10)사이클로알킬, -NH(C6-C10)아릴, 또는 -NH(C7-C12)아랄킬기를 나타낸다.
[59] 상기 [24] 내지 [58]에 기재된 화합물, 여기서 L은 -OH, -OEt, -NH2 또는 -NHNH2를 나타낸다.
[60] 상기 [24] 내지 [59]에 기재된 화합물, 여기서 U는 -NRARB; -NRA(CO)RB; -NH(CO)NHRB; 또는 -NH(CO)ORB를 나타낸다; 각각의 경우에서 RA는 H 원자 또는 메틸기를 나타낸다; 및 RB는 [24]에서 정의된 바와 같다.
[61] 상기 [60]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 RB는 H 원자, 각각의 경우에서 최대 30개의 C 원자를 갖는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬, 사이클로알킬, 알킬사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬옥시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 알킬옥시아릴, 또는 사이클로알킬옥시기를 나타낸다; 여기서 각각의 경우에서 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬, 사이클로알킬, 알킬사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬옥시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 알킬옥시아릴, 또는 사이클로알킬옥시기의 하나 또는 그 이상의 수소 원자는 서로 독립적으로 포스폰산 에스테르기 또는 포스폰산기, F, Cl, Br, I, -OH, 또는 NO2로 대체될 수 있다.
[62] 상기 [60]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 RB는 각각의 경우에서 최대 20개의 C 원자를 갖는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬, 사이클로알킬, 알킬사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬옥시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 알킬옥시아릴, 또는 사이클로알킬옥시기를 나타낸다; 여기에서 각각의 경우에서 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬, 사이클로알킬, 알킬사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬옥시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 알킬옥시아릴, 또는 사이클로알킬옥시기의 하나 또는 그 이상의 수소 원자는 서로 독립적으로 포스폰산 에스테르 또는 포스폰산기, F, Cl, Br, I, -OH, 또는 NO2로 대체될 수 있다.
[63] 상기 [60]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 RB는 H 원자, 각각의 경우에서 최대 12개의 C 원자를 갖는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬, 사이클로알킬, 알킬사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬옥시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 알킬옥시아릴, 또는 사이클로알킬옥시기를 나타낸다; 여기서 각각의 경우에서 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬, 사이클로알킬, 알킬사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬옥시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 알킬옥시아릴, 또는 사이클로알킬옥시기의 하나 또는 그 이상의 수소 원자는 서로 독립적으로 포스폰산 에스테르기 또는 포스폰산기, F, Cl, Br, I, -OH, 또는 NO2로 대체될 수 있다.
[64] 상기 [24] 내지 [59]에 기재된 화합물, 여기서 U는 일반식 (Ⅶ)의 기를 나타낸다; B -NRHRI, -NRH(CO)RI, -NH(CO)NHRI, 또는 -NH(CO)ORI; R48은 H 원자이다; 각각의 경우에서 각각의 R46은 서로 독립적으로 H 원자, 또는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 오르니틴, 페닐알라닌, 프롤린, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 또는 발린 아미노산의 곁사슬을 나타낸다; 및 RH 및 RI는 [24]에서 정의된 바와 같다.
[65] 상기 [24] 내지 [59]에 기재된 화합물, 여기서 U는 일반식 (Ⅶ)의 기를 나타낸다; B -NRHRI, -NRH(CO)RI, -NH(CO)NHRI, 또는 -NH(CO)ORI; R48은 화학식 (Ⅸb) 내지 (Ⅸe)의 기를 나타낸다; 각각의 경우에서 각각의 R46은 서로 독립적으로 H 원자, 또는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 오르니틴, 페닐알라닌, 프롤린, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 또는 발린 아미노산의 곁사슬을 나타낸다; 및 RH 및 RI는 [24]에서 정의된 바와 같다.
[66] 상기 [64] 또는 [65]에 기재된 화합물, 여기서 RH는 H 원자 또는 메틸기를 나타낸다.
[67] 상기 [64] 내지 [66]에 기재된 화합물, 여기서 RI는 H 원자, 각각의 경우에서 최대 30개의 C 원자를 갖는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬, 사이클로알킬, 알킬사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬옥시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 알킬옥시아릴, 또는 사이클로알킬옥시기를 나타낸다; 여기서 각각의 경우에서 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬, 사이클로알킬, 알킬사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬옥시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 알킬옥시아릴, 또는 사이클로알킬옥시기의 하나 또는 그 이상의 수소 원자는 서로 독립적으로 포스폰산 에스테르기 또는 포스폰산기, F, Cl, Br, I, -OH, 또는 NO2로 대체될 수 있다.
[68] 상기 [64] 내지 [66]에 기재된 화합물, 여기서 RI는 H 원자, 각각의 경우에서 최대 20개의 C 원자를 갖는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬, 사이클로알킬, 알킬사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬옥시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 알킬옥시아릴, 또는 사이클로알킬옥시기를 나타낸다; 여기서 각각의 경우에서 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬, 사이클로알킬, 알킬사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬옥시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 알킬옥시아릴, 또는 사이클로알킬옥시기의 하나 또는 그 이상의 수소 원자는 서로 독립적으로 포스폰산 에스테르기 또는 포스폰산기, F, Cl, Br, I, -OH, 또는 NO2로 대체될 수 있다.
[69] 상기 [64] 내지 [66]에 기재된 화합물, 여기서 RI는 각각의 경우에서 H 원자, 최대 12개의 C 원자를 갖는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬, 사이클로알킬, 알킬사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬옥시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 알킬옥시아릴, 또는 사이클로알킬옥시기를 나타낸다; 여기서 각각의 경우에서 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬, 사이클로알킬, 알킬사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬옥시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 알킬옥시아릴, 또는 사이클로알킬옥시기의 하나 또는 그 이상의 수소 원자는 서로 독립적으로 포스폰산 에스테르기 또는 포스폰산기, F, Cl, Br, I, -OH, 또는 NO2로 대체될 수 있다.
[70] 상기 [24] 내지 [59]에 기재된 화합물, 여기서 U는 일반식 (Ⅶ)의 기를 나타낸다; B는 H 원자, 페닐기, 또는 OH, F, Cl, Br, I 및 NO2를 포함하는 군으로부터 선택되는 1 내지 3개의 치환체로 치환된 페닐기를 나타낸다; R48은 H 원자이다; 및 각각의 경우에서 각각의 R46은 서로 독립적으로 H 원자, 또는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 오르니틴, 페닐알라닌, 프롤린, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 또는 발린 아미노산의 곁사슬을 나타낸다.
[71] 상기 [64] 내지 [70]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 각각의 R46은 서로 독립적으로 H 원자, 또는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 오르니틴, 페닐알라닌, 프롤린, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 또는 발린 아미노산의 곁사슬을 나타낸다.
[72] 상기 [64] 내지 [70]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 각각의 R46은 서로 독립적으로 H 원자, 또는 아르기닌, 히스티딘, 리신, 메티오닌, 오르니틴, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 트립토판 또는 티로신 아미노산의 곁사슬을 나타낸다.
[73] 상기 [64] 내지 [72]에 기재된 화합물, 여기서 s=0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다.
[74] 상기 [24] 내지 [59]에 기재된 화합물, 여기서 U는 일반식 (Ⅶ)의 기를 나타낸다; B는 H 원자, 페닐기, 또는 OH, F, Cl, Br, I 및 NO2를 포함하는 군으로부터 선택되는 1 내지 3개의 치환체로 치환된 페닐기를 나타낸다; R48은 H 원자이다; 각각의 경우에서 각각의 R46은 서로 독립적으로 H 원자, 또는 화학식 (Ⅸb) 내지 (Ⅸe)의 기를 나타낸다; 및 s=1, 2, 3 또는 4이다.
[75] 상기 [74]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 R46은 독립적으로 화학식 (Ⅸb), (Ⅸc), (Ⅸd) 또는 (Ⅸe)의 기를 나타낸다.
[76] 상기 [24] 내지 [59]에 기재된 화합물, 여기서 U는 화학식 (Ⅷa) 내지 (Ⅷe)의 기를 나타낸다.
[77] 상기 [24] 내지 [46]에 기재된 화합물, 여기서 R31은 H 원자, 또는 -(CH2)m-NH-(CH2)h-CH2-R12기를 나타내며, 여기서 R12는 화학식 -P(=O)(OV)2 또는 P(=O)(OV)(OH)의 포스폰산 에스테르기를 나타낸다; 각각의 V는 독립적으로 메틸, 에틸, 사이클로헥실 또는 벤질기이다; m은 1, 2, 3 또는 4이다; 및 h는 0, 1, 2 또는 3이다; 단, m과 h의 합은 2≤x≤5 이다.
[78] 상기 [77]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 R47은 독립적으로 H 원자; 또는 리신, 오르니틴, 또는 아르기닌 아미노산의 곁사슬이다;
t=0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8;
L은 OH, OEt, NH2 또는 -NHNH2를 나타낸다;
U는 하기 일반식 (Ⅶ)의 기를 나타낸다:
Figure 112016123099173-pct00034
(Ⅶ)
여기서 B는 H 원자, 페닐기, 또는 OH, F, Cl, Br, I 및 NO2를 포함하는 군으로부터 선택되는 1 내지 3개의 치환체로 치환된 페닐기를 나타낸다; R48은 H 원자이다; 및
(ⅰ) 각각의 경우에서 각각의 R46은 서로 독립적으로 H 원자, 또는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 오르니틴, 페닐알라닌, 프롤린, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 또는 발린 아미노산의 곁사슬을 나타낸다; 및 s는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다; 또는
(ⅱ) 각각의 경우에서 각각의 R46은 서로 독립적으로 H 원자, 또는 일반식 (Ⅸb) 내지 (Ⅸe)의 기를 나타낸다; 및 s=1, 2, 3 또는 4이다.
[79] 상기 [24], [25], 및 [27] 내지 [78]에 기재된 화합물, 단, 일반식 (Ⅵ)에서 모든 반복 단위 Yd, Zf, Yg, 및 Zj의 합은 7≤x≤25이다.
[80] 상기 [24], [25], 및 [27] 내지 [78]에 기재된 화합물, 단, 일반식 (Ⅲ) 또는 (Ⅵ)에서 모든 반복 단위 Yd, Zf, Yg, 및 Zj의 합은 7≤x≤22이다.
[81] 상기 [77] 내지 [80]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 각각의 R11은 화학식 -CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2의 기, 또는 화학식 -CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2의 기를 나타낸다.
[82] 상기 [77] 내지 [81]에 기재된 화합물, 여기서 각각의 경우에서 각각의 R31은 H 원자, 또는 화학식 -CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2의 기, 또는 화학식 -CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2의 기를 나타낸다.
상기 [23] 내지 [76] 또는 [77] 내지 [82]에 기재된 바와 같이, 일반식 (Ⅲ) 및 (Ⅵ)의 화합물은 적어도 하나의 Z기를 포함한다. 따라서, [23] 내지 [76] 또는 [77] 내지 [82]에 기재된 본 발명에 따른 일반식 (Ⅲ) 및 (Ⅵ) 화합물의 기본 구조에 대한 R11의 결합 부위는 적어도 1개의 비대칭 중심(#)을 갖는다. 기본 구조에 대한 R11의 결합 부위에서 상기 비대칭 중심(#)은 바람직하게 R- 배열을 갖는다.
[23] 내지 [76] 또는 [77] 내지 [82]에 기재된 바와 같이, 일반식 (III) 및 (VI)의 화합물에 2개 또는 그 이상의 비대칭 중심(#)이 있다면 적어도 비대칭 중심(#)의 50%, 바람직하게는 66%, 70%, 75% 또는 80%, 더욱 바람직하게는 85%, 90% 또는 95% 및 가장 바람직하게는 100%가 R- 배열을 갖는다.
또는, [23] 내지 [76] 또는 [77] 내지 [82]에 기재된 바와 같이, 2개 또는 그 이상의 비대칭 중심(#)을 갖는 일반식 (Ⅲ) 및 (Ⅵ)의 화합물에서, 적어도 비대칭 중심(#)의 50%, 바람직하게는 66%, 70%, 75% 또는 80%, 더욱 바람직하게는 85%, 90% 또는 95% 및 가장 바람직하게는 100%가 S- 배열을 갖는다.
본 발명에 따른 약학적 조성물로서, 적어도 하나(또는 그 이상)의 본 발명에 따른 소중합체 화합물 및 선택적으로 적어도 하나의 담체를 포함하며, 필요에 따라 약리학적으로 허용되는 불활성 성분 및/또는 충전제 및/또는 적어도 하나의 보조제(adjuvant)를 추가로 함유하는 약학적 조성물을 공개한다.
본 발명에 따른 소중합체 화합물을 약 또는 약물로 사용하기 위한 용도 또한 본 발명의 목적이다. 일반적으로, 본 발명에 따른 화합물은 공지되고 허용 가능한 방법을 사용하여 개별적으로 또는 임의의 다른 치료수단과 함께 투여된다. 투여는 예를 들어 다음 중 하나의 방법으로 수행될 수 있다: 경구로, 예를 들면, 당의정(dragee), 코팅된 정제, 환제, 반고체, 연질 또는 경질캡슐, 용액, 유화액 또는 현탁액; 비경구적으로, 예를 들면, 주사용 용액; 좌약으로서 직장으로; 흡입에 의해, 예를 들면, 분말 제제 또는 분무제로서 경피 또는 비강 내. 이러한 정제, 환제, 반고체, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 젤라틴 캡슐의 제조를 위해, 치료학적으로 사용 가능한 물질은 약리학적으로 불활성인 무기 또는 유기 담체, 예를 들어, 락토오스, 수크로스, 글루코스, 젤라틴, 맥아, 실리카겔, 전분 또는 그의 유도체, 활석, 스테아르산 또는 그의 염, 건조 탈지유 등이 혼합될 수 있다. 연질 캡슐의 제조를 위해, 담체는, 예를 들어, 식물성 오일, 액체 파라핀, 동물성 또는 합성 오일, 왁스, 지방 및/또는 폴리올이 사용될 수 있다. 액체 용액 및 시럽의 제조를 위해, 담체는, 예를 들어, 물, 알콜, 염 수용액, 수용성 덱스트로스, 폴리올, 글리세롤, 식물성 오일, 액체 파라핀, 동물 및/또는 합성 오일이 사용될 수 있다. 좌제를 위한 담체는 예를 들면, 식물성 오일, 액체 파라핀, 동물 및/또는 합성 오일, 왁스, 지방 및/또는 폴리올이 사용될 수 있다. 에어로졸 제제를 위해서는 그 목적에 적합한 압축기체, 예를 들면, 산소, 질소, 클로로플루오로 카본, 플루오르화 탄화수소, 염소화 탄화수소 및 이산화탄소가 사용될 수 있다. 약학적으로 유용한 제제는 보존 및 안정화를 위한 첨가제, 유화제, 감미제, 향료, 삼투압 조절용 염, 완충액, 캡슐화 첨가제 및/또는 항산화제를 또한 함유할 수 있다.
상보적인 핵산 서열에 결합하는 능력을 통해, 본 발명에 따른 소중합체 화합물 또는 약제학적 조성물은 다양한 질병의 예방 및/또는 치료용도에 적합할 수 있다. 본 발명에 따른 소중합체 화합물로 예방할 수 있는 질병 또는 이들로 치료할 수 있는 질병의 예는 하기와 같다: 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), B형 간염 바이러스 및 C형 간염 바이러스 또는 인간 유두종 바이러스(HPV)와 같은 바이러스에 의해 유발되는 질환; 피부암, 폐암, 간암, 전립선암, 백혈병 또는 뇌종양과 같은 암, 듀센(Duchenne) 근이영양증 또는 척수성 근위축증과 같은 희귀한 신경근 질환; 천식, 류마티스성 관절염 또는 건선과 같은 염증성 질환; 크론병 또는 다발성 경화증과 같은 자가 면역 질환; 파킨슨병과 같은 신경질환; 또는 높은 콜레스테롤 또는 비만과 같은 대사성 질환.
본 발명에 따른 소중합체 화합물 즉, 일반식 (Ⅲ)또는 (Ⅵ)의 소중합체 화합물(본 발명에서 N-포스 소중합체라고도 한다.)은 EP 2041161에 개시된 알킬-포스폰산 에스테르기를 갖는 소중합체(이하 EP2041161 소중합체라고 한다.) 화합물과 비교하여, 놀랍고 개선된 특성, 예를 들어, 치료학적으로 관련된 다양한 기관에서 유의적으로 개선된 생체 이용률 및 긴 반감기를 확인하였다. 이와 같은 관찰은, 예를 들면, 각각의 소중합체 화합물이 투여된 마우스에서 18개의 치료학적으로 관련된 기관에서 다른 시간에 이들의 양을 측정한 비교 조직 분포 연구로 확인되었다(실시예 14 및 도 1 및 2 참조).
N-포스 소중합체는 EP 2041161 소중합체와 비교하여, 혈장 단백질에 더 강하게 결합한다(실시예 15 참조); 이러한 특징은 생체 이용률에 이롭고 반감기를 연장시킨다.
본 발명에 따른 N-포스 소중합체는 EP 2041161 소중합체와 비교하여, 또한 유의적으로 개선된 서열 독립적인 물에 대한 용해성을 갖는다(실시예 16 참조).
또한, 본 발명에 따른 N-포스 소중합체는 DNA에 대해 더 우수한 결합 특성을 갖는다(더 높은 융점)(실시예 17 참조).
또한, 본 발명에 따른 N-포스 소중합체는 EP 2041161 소중합체와 비교하여 유전자 발현의 조절에 대해 더 유의적인 효과를 나타낸다. 유전자 발현의 조절에 대한 큰 효과는 예를 들어, HeLa 세포에서 NFκB의 하향 조절(실시예 18 참조) 및 THP1 세포에서 TNFR2 유전자의 스플라이스 부위조절(실시예 19 참조)이 반영된다.
본 발명에 따른 N-포스 소중합체, EP 2041161 소중합체 및 US5719262 소중합체의 THP1 세포에서 표적 TNFR2의 스플라이스 부위조절의 효율 비교는 유전자 발현의 조절에 본 발명에 따른 N-포스 소중합체가 유의적인 효과가 있음을 확인하였다. US5719262 소중합체는 거의 효과가 없었으며, 이는 US5719262 소중합체가 소낭의 세포 내에서 축적되는 경향이 강하여, 세포질 또는 핵 내의 mRNA 표적 부위에서 안티센스 효과를 위해 충분한 양으로 사용할 수 없다는 R. Corradini et al.의 관찰(Current Topics in Medicinal Chemistry, 11(12), pp.1535-1554, (2011))과 일치한다(실시예 21 및 도 3 참조).
살아있는 유기체에서 유전자 발현의 조절에서 N-포스 소중합체의 강력한 효과는 마우스의 비장과 림프절에서 TNFR2 유전자의 스플라이스 부위조절로부터 확인되었다(실시예 20 참조). 본 발명에 따른 다양한 N-포스 소중합체의 더 강력한 효과는 폐(실시예 22 및 도 4 및 실시예 23 및 도 5 참조), 신장(실시예 23 및 도 5 및 실시예 24 및 도 6 참조), 간(실시예 23 및 도 5 참조) 및 근육(실시예 25 및 도 7 참조)에서 관찰되었다. 예로서, 마우스의 신장에서, 본 발명에 따른 N-포스 소중합체는 EP 2041161 소중합체와 비교하여 TNFR2 유전자의 스플라이스 부위조절에서 12.6배 더 강력한 효과를 나타내었다(실시예 24 및 도 6 참조). 마우스 근육에서 디스트로핀 유전자의 유전자 발현 조절(엑손 23 건너뛰기)에 대한 본 발명에 따른 N-포스 소중합체의 더 강력한 효과가 확인되었다(실시예 25 및 도 7 참조).
표적인 NF-κB 및 TNFR2는 면역 세포에서 TNF-α 신호 전달 경로에 중요한 역할을 한다. 비장 및 림프절은 면역계의 중요한 기관이다. 따라서, 본 발명에 따른 소중합체 화합물(N-포스 소중합체)은 염증성 질환, 자가면역질환 또는 암과 같은 면역계 매개 질환에서의 치료 용도에 적합하다.
일반식 (Ⅰ)의 본 발명에 따른 단량체는 당업계의 기술자에게 공지된 반응에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 일반식 (Ⅰ)의 본 발명에 따른, 비대칭 중심(#)이 R- 배열을 갖고, R3가 Cbz 보호기인 단량체는 하기 합성에 따라 제조될 수 있다(보다 상세한 설명은 실시예 1 내지 10 참조):
Figure 112016123099173-pct00035
Figure 112016123099173-pct00036
Figure 112016123099173-pct00037
Figure 112016123099173-pct00038
Figure 112016123099173-pct00039
Figure 112016123099173-pct00040
Figure 112016123099173-pct00041
비대칭 중심(#)에 S 배열을 갖는 일반식 (Ⅰ)의 본 발명에 따른 단량체(본 발명에서 N-포스 단량체라고도 한다)의 제조를 위해, 수소첨가반응 동안 (R,R)-Me-DuPhos-Rh(Ⅰ)(OD)2OTf 촉매 대신 (S,S)-Me-DuPhos-Rh(Ⅰ)(COD)2OTf 촉매가 사용되었다.
일반식 (Ⅲ) 또는 (Ⅵ)의 본 발명에 따른 소중합체 화합물은, 예를 들어, 문헌에 기재된 방법에 의해, 일반식 (I)의 본 발명에 따른 단량체 또는 가능하다면 추가적인 PNA 단량체 또는 아미노산은 그 자체의 공지된 방식으로 제조될 수 있다(L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K.H. Petersen, H.F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P.E. Nielsen, J. Coull, R.H. Berg, J. Pept . Sci. 3, 1995, 175-183. T. Koch, H.F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H.G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept . Res. 49, 1997, 80-88. F. Bergmann, W. Bannwarth, S. Tam, Tetrahedron Lett . 36, 1995, 6823-6826). 고체상 합성 후, 보호기는 분할되어, 본 발명에 따른 소중합체 화합물, 예를 들어, 일반식 (Ⅳ)의 화합물이 수득된다.
도 1은 본 발명에 따른 3H가 표지된 N-포스 소중합체 및 3H가 표지된 EP2041161 소중합체의 다양한 조직에서 14일이 넘는 기간 동안의 생체이용률을 나타내는 도이다. 도에서 알 수 있듯이, 14일이 넘는 기간 동안 3H가 표지된 N-포스 소중합체의 생체이용률은 3H가 표지된 EP2041161 소중합체의 생체이용률과 비교하여 모든 조직에서 1.7 내지 4.6배 더 높다.
도 2는 본 발명에 따른 3H가 표지된 N-포스 소중합체 및 3H가 표지된 EP2041161 소중합체의 14일이 넘는 기간 동안의 반감기를 나타내는 도이다. 도 2는 14일이 넘는 기간 동안 3H가 표지된 N-포스 소중합체의 반감기가 3H가 표지된 EP2041161-소중합체의 반감기와 비교하여 대부분의 조직에서 우수하였고, 비장에서는 실제로 2배 더 길다는 것을 나타낸다.
도 3은 TH57 세포에서 표적인 TNFR2의 스플라이스 부위조절(엑손 7 건너뛰기)에 대한 본 발명에 따른 N-포스 소중합체, EP 2041161 소중합체 및 US5719262 소중합체 사이의 효능을 비교한 도이다. 도 3은 N-포스 소중합체가 EP 2041161 소중합체와 비교하여 THP1 세포에서 표적인 TNFR2의 스플라이스 부위조절에 대해 2.6배 강한 효과를 갖는 반면, THP1 세포에서 US5719262 소중합체에 의한 표적인 TNFR2의 조절은 사실상 0임을 나타낸다.
도 4는 마우스의 폐에서 표적인 TNFR2의 스플라이스 부위조절(엑손 7 건너뛰기)에 대해 상이한 라디칼 U를 갖는 본 발명에 따른 N-포스 소중합체의 효과를 나타낸 도이다. 도 4는 화학식 (Ⅶ) 및 화학식 Ⅸc(콜레스테롤 유도체) 또는 Ⅸd(엽산 유도체)의 기에 따른 라디칼 U를 갖는 화학식 (Ⅵ)의 본 발명에 따른 N-포스 소중합체가 R46으로서 사용되는 경우, 스플라이스 부위조절에서 유전자의 발현에 미치는 영향은 PBS 음성 대조군에 비해 560배(콜레스테롤 유도체) 또는 378배(엽산 유도체) 증가됨을 나타낸다.
도 5는 마우스의 신장, 간 및 폐에서 본 발명에 따른 N- 포스 소중합체인 N-포스 23-1, N-포스 23-2, N-포스 23-3 및 N-포스 23-4가 표적인 TNFR2의 스플라이스 부위조절(엑손 7 건너뛰기)에 미치는 효과를 나타낸 도이다. 본 발명에 따른 N- 포스 소중합체인 N-포스 23-1, N-포스 23-2, N-포스 23-3 및 N-포스 23-4는 핵염기 서열, 라디칼 U 및 일반식 (Ⅵ)에 따른 일반식 (Ⅳ) 및 (Ⅴ)의 기의 수와 위치가 다르다. 도 5는 다양한 마우스 조직(신장, 간 및 폐)에서 본 발명에 따른 N- 포스 소중합체인 N-포스 23-1, N-포스 23-2, N-포스 23-3 및 N-포스 23-4가 엑손 7 없이 mRNA 동형 단백질(isoform)의 유전자 발현에 매우 강력한 효과가 있음을 나타낸다. 예를 들어, 신장에서 N-포스 23-1의 효과는 PBS 음성 대조군에 비해 1,983배 증가하였다.
도 6은 마우스의 신장에서 표적인 TNFR2의 스플라이스 부위조절(엑손 7 건너뛰기)에 대한 본 발명에 따른 N-포스 소중합체와 EP 2041161 소중합체 간의 효능을 비교한 도이다. 효능 비교에 사용된 소중합체는 먼저 모든 반복 단위 Yd, Zf, Yg 및 Zj(15 또는 14)의 합계가 다르며, 두번째로 일반식 (Ⅳ) 및 (V)에서 기의 수와 위치가 다르다. 도 6은 엑손 7이 없는 mRNA 동형 단백질의 유전자 발현에 대해 EP 2O41161 소중합체와 직접 비교하여 N-포스 소중합체의 효과가 12.6배 또는 6.7배 더 강력함을 나타낸다.
도 7은 mdx 마우스의 근육에서 표적인 디스트로핀의 스플라이스 부위조절(엑손 23 건너뛰기)에 대한 20개의 구성요소(일반식 (Ⅵ)에 따른 모든 반복 단위 Yd, Zf, Yg 및 Zj의 합=19)를 갖는 본 발명에 따른 N-포스 소중합체의 생체 내 효과를 확인한 도이다. 도 7은 15일이 넘는 단시간 실험에서 본 발명에 따른 N-포스 소중합체는 PBS 음성 대조군에 비해 근육 내로 단 3회의 주사만으로 엑손 23이 없는 mRNA 동형 단백질의 유전자 발현에 대해 9배 더 강력한 효과가 있음을 나타낸다.
실시예 1: 화합물 1의 제조
Figure 112016123099173-pct00042
설명: 66.52 g(200 mmol)의 2-N-Cbz-아미노-2-(디메톡시포스포릴)-아세트산 메틸 에스테르가 포함된 300 ㎖의 메탄올을 2.13 g의 Pd/C 10 %(1Mol% Pd에 상응)와 혼합하여 실온에서 24시간 동안 2 bar의 수소 압력하에 교반하였다. 촉매를 셀 라이트(celite)를 통해 여과시킨 후, 이어서 용매를 여액으로부터 증발시켜주었다. 수득된 생성물은 담황색 오일이며, 가만히 두면 왁스형 고체로 변한다.
수율: 39 g, 99%. 1 H-NMR(DMSO-d6): 4.01(d, 1H), 3.66-3.73(m, 9H), 2.4-2.5(s, br, 2H). 31 P-NMR(DMSO-d6): 23.6 ppm.
실시예 2: 화합물 2의 제조
Figure 112016123099173-pct00043
설명: 39 g(198 mmol, 1 eq)의 화합물 1을 1,000 ㎖의 디클로로메탄에 용해시켰다. 56.178 g(257 mmol, 1.3 eq)의 Boc2O 및 16.1 ㎖(198 mmol, 1 eq)의 피리딘을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 회전 증발기를 이용해 용매를 제거하고, 잔여물을 아세트산에 흡수시켰으며, 5% 시트르산 용액, 포화 탄산나트륨 용액 및 포화 식염수로 세척하였다. 그런 다음 황산 마그네슘을 건조 및 증발에 사용하였다. 나머지 생성물은 플래쉬 크로마토그래피(실리카겔, 헥산/아세트산 에테르 1:5)를 이용하여 정제하였다. 결과물은 황색 오일이다.
수율: 43.5 g(146 mmol, 74%). 1 H-NMR(CDCl3): 5.35(d, br, 1H), 4.88(dd, 1H), 3.80-3.86(m, 9H), 1.46(s, 9H). 31 P-NMR(CDC13): 20.1 ppm
실시예 3: 화합물 3의 제조
Figure 112016123099173-pct00044
설명: 50 g(319 mmol, 1 eq)의 4-아미노부티르알데하이드 디에틸 아세탈을 실온에서 200 ㎖의 THF 및 51.5 ㎖(372 mmol, 1.2 eq)의 트리에틸아민에 용해시키고, 이어서 75.99 g(310 mmol, 1 eq)의 디에틸-2-브로메틸 포스포네이트를 적가하였다. 그 다음 용액을 70℃로 가열하고 상기 온도에서 24시간 동안 교반하였다. 회전 증발기를 이용해 용매를 제거하였다. 잔여물을 에테르로 격렬하게 진탕시키고, 여과하였다. 남아있는 고체를 에테르로 2회 더 추출하였다. 에테르 여액을 합하고 증발시켰다. 생성된 생성물은 황색 오일이며, 이는 다음 반응에서 추가로 정제하지 않고 사용하였다.
1 H-NMR(DMSO-d6): 4.45(t, 1H); 3.98(m, 4H); 3.54 및 3.42(2m, 2 x 2H); 2.5-2.8(m, 4H); 1.90(m, 2H); 1.25-1.60(m, 4H); 1.22(t, 6H); 1.10(2t, 6H). 31 P-NMR(DMSO-d6): 30 ppm.
1단계에서 얻은 중간 생성물을 400 ㎖의 THF에 용해시킨 후, 85.94 ㎖(620 mmol, 2 eq)의 트리에틸아민과 혼합하고 0℃로 냉각시켰다. 이어서, 66.11 ㎖(465 mmol, 1.5 eq)의 벤질 클로로포름산염을 적가하고, 냉각시키지 않고, 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 1 M 염산으로 중화시키고 용매를 증발시켰다. 잔여물을 에테르와 함께 진탕시키고, 냉장고에서 밤새 보관하였다. 생성 된 고체를 분리하고, 에테르로 2회 더 완전히 세척하였다. 에테르 용액을 합하고 증발시켰다. 잔여물을 실리카겔 컬럼을 통한 크로마토그래피로 정제하였다. 정제시, 처음에는 모든 불순물을 헥산:아세트산 에테르를 2:1로 용출시킨 다음 아세트산 에테르로 용출시켰다.
수율: 85.752 g(60.2%)의 무색 점성 오일. 1 H-NMR(DMSO-d6): 7.34(m, 5H); 5.07(s, 2H); 4.44(m, 1H); 3.94(m, 4H); 3.6-3.2(m, 8H); 2.02(m, 2H); 1.46(m, 4H); 1.19(m, 6H); 1.09(m, 6H). 31 P-NMR(DMSO-d6): 28.93 및 28.57 ppm.
실시예 4: 화합물 4의 제조
Figure 112016123099173-pct00045
설명: 80 g의 화합물 3이 포함된 1,000 ㎖의 아세톤을 0.98 g(1.74 mmol, 1 Mol%)의 인듐(Ⅲ) 트리플레이트(indium(Ⅲ) triflate)와 함께 실온에서 교반하였다. 평형반응의 연속성은 HPLC(RP18, 메탄올/물 80:20)를 사용하여 모니터링하였다. 때때로 용매를 증발시키고 새로운 아세톤으로 대체하였다. 이는 반응이 95% 이상 완료될때까지 수행되었다. 이어서, 용매를 증발시켰다. 물질인 황색 오일은 고진공에서 짧은 시간 동안 건조한 후 즉시 사용하였다.
1 H-NMR(DMSO-d6): 9.62(d, 1H); 7.36(m, 5H); 5.07(s, 2H); 3.94(m, 4H); 3.37 및 3.24(2m, 4H); 2.41(m, 2H), 2.04(m, 2H); 1.73(m, 2H); 1.22(t, 6H). 31 P-NMR(DMSO-d6) : 29.51, 29.14 ppm
실시예 5: 화합물 5의 제조
Figure 112016123099173-pct00046
설명: 아르곤 대기 하에서 29.438 g의 화합물 2를 350 ㎖의 THF에서 -70℃로 냉각시키고, 이어서 12.96 ㎖(103 mmol, 1.04 eq)의 N,N,N'N'-테트라메틸구아니딘 을 적가하였다. -70℃에서 10분 동안 교반한 후, 60 ㎖의 THF에 38.170 g(99.04 mmol, 1 eq)의 화합물 4를 적가하였다. -70℃에서 추가로 1시간 동안 더 교반한 후, 천천히 실온에 도달시키고 밤새 교반하였다.
상기 용매를 증발시켰다. 이후, 잔여물을 약 400 ㎖의 아세트산 에테르에 용해시키고, 5% 시트르산 용액으로 2회 및 포화 NaCl 용액으로 1회 세척하고, 황산 마그네슘으로 건조시키고 증발시켰다. 황색 오일을 수득하였다.
수율: 53,228 g, 95.6 mmol, 96.5%. 1 H-NMR(CDCl3): 7.33(s, 5H); 6.48(t, 1H); 5.13(s, 2H); 4.08(m, 4H); 3.81 및 3.76(2s, total 3H); 3.49(m, 2H); 3.30(t, 2H); 2.21(m, 2H); 2.04(m, 2H); 1.71(m, 2H); 1.48 및 1.46(2s, total 9H); 1.28(m, 6H). 31 P-NMR(CDC13) : 29.72 및 29.15 ppm.
실시예 6: 화합물 6의 제조
Figure 112016123099173-pct00047
설명 : 파르 수소화(Parr hydrogenation) 장치의 반응 병에서, 아르곤 조건하에서 450 mg(0.96 mmol, 1 Mol%)의 비스(1,5- 사이클로옥타디에닐)로듐(I)-트리플루오로메탄 설포네이트 및 306 mg(0.96 mmol, 1 Mol%)의 (-)-1,2-비스-[(2R, 5R)-2,5-디메틸-포스폴라노]-벤젠을 약 50 ㎖의 메탄올에 용해시킨 후, 250 ㎖의 메탄올에 53.228 g(96 mmol)의 화합물 5를 녹여, 이를 첨가하였다. 수소화 장치에 장착된 병은 3회 비워지고, 수소로 채워진다. 마지막으로, 4.5 내지 5 bar의 수소 압력으로 맞추고, 병을 24시간 동안 교반하였다.
과량의 수소를 제거하고, 병을 제거하고, 반응용액을 셀라이트로 여과시켰다. 여액을 증발시키고 진공에서 건조시켰다. 밝은 갈색의 오일을 수득하였다.
수율: 53.712 g, 96 mmol, 정량적(quantitative). 1 H-NMR(CDCl3): 7.35(m, 5H); 6.48 및 6.35(2m, total 1H); 5.13(s, 2H); 4.27(m, 1H); 4.07(m, 4H); 3.73(s, 3H); 3.48(m, 2H); 3.27(m, 2H); 2.25-1.95(m, 4H); 1.75-1.55(m, 4H); 1.45(s, 9H); 1.28(m, 6H). 31 P-NMR(CDC13): 29.78 및 29.23 ppm.
실시예 7: 화합물 7의 제조
Figure 112016123099173-pct00048
설명: 240 ㎖의 4 M HCl이 포함된 디옥산에 53.94 g(96.6 mmol)의 화합물 6이 포함된 120 ㎖의 THF를 적가하였다. 그 후, 실온에서 이를 교반하였다. 반응공정은 HPLC(메탄올/물 70:30)를 사용하여 모니터링하였다. 2 내지 3시간 후 Boc 분열이 완료되었다. 용매를 증발시키고, 잔여물을 디에틸에테르로 세척하고 건조시켰다. 칙칙한(stodgy) 갈색의 오일을 수득하였다.
수율: 47.83 g, 정량적(quantitative). 1 H-NMR(DMSO-d6): 8.64(s, br, 2H); 7.36(m, 5H); 5.07(s, 2H); 3.97(m, 5H); 3.73(s, 3H); 3.38(m, 2H); 3.22(m, 2H); 2.04(m, 2H); 1.80(m, 2H); 1.48-1.35(m, 4H); 1.22(m, 6H). 31 P-NMR(DMSO-d6): 29.012 및 28.62 ppm.
실시예 8: 화합물 8의 제조
Figure 112016123099173-pct00049
설명: 16.65 g(29.8 mmol, 1 eq.)의 화합물 7이 포함된 100 ㎖의 메탄올을 0℃로 냉각시키고 5.414 g(66 mmol, 2.2 eq)의 아세트산나트륨과 혼합하였다. 이어서 5.218 g(32.8 mmol, 1.1 eq)의 N-Boc 아미노아세트알데하이드가 포함된 150 ㎖의 메탄올을 적가하였다. 0℃에서 1시간 동안 교반한 후, 2.074 g(33 mmol, 1.1 eq)의 소듐시아노보로하이드라이드를 나누어 첨가하였다. 가스발생이 완화되면, 냉각 욕조를 제거하고 실온에서 밤새 교반하였다.
회전 증발기를 이용하여 용매를 제거하고, 잔여물을 아세트산 에테르에 흡수시켜 탄산수소나트륨 용액(반-포화) 및 포화염화나트륨 용액으로 세척하였다. 유기 상을 황산 마그네슘으로 건조 및 증발시키고 진공 건조시켰다. 미정제 생성물을 실리카겔 컬럼(디클로로메탄/메탄올(5%, v/v))을 통해 정제하였다. 점성의 황색 오일을 수득하였다.
수율: 15.379 g(25,6 mmol, 86%). 1 H-NMR(DMSO-d6): 7.36(m, 5H); 6.69(m, 1H); 5.06(s, 2H); 4.02(m, 4H); 3.4-3.15(3m, total 7H); 2.95(m, 1H); 2.38(m, 1H); 2.01(m, 2H); 1.60-1.30(m, 6H); 1.38(s, 9H); 1.20(m, 6H). 31 P-NMR(DMSO-d6): 29.00 및 28.60 ppm.
실시예 9: 화합물 9의 제조
E=Cbz-A, Cbz-C, Cbz-G, T
Figure 112016123099173-pct00050
설명: 20.25 mmol(1.5 eq)의 아세트산 성분(N6-Cbz-아데닌-9-일-아세트산, N4-Cbz-시토신-1-일-아세트산, N2-Cbz-구아닌-9-일-아세트산 또는 피리딘-1-일-아세트산)이 포함된 70 ㎖의 아세토니트릴, 20 ㎖의 피리딘 및 4.5 ㎖(40, 5 mmol, 3 eq)의 N-메틸모르폴린을 0℃로 냉각시키고, 7.186 g(18.9 mmol, 1.4 eq)의 HATU를 혼합하였다. 이후, 냉각하지 않고 실온에서 10분 동안 교반하였다. 이어서, 50 ㎖의 아세토니트릴에 상기 혼합물에 8.1 g(13.5 mmol, 1 eq)의 화합물 8을 용해시킨 혼합물을 천천히 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 40℃에서 밤새 교반하였다.
혼합물을 다시 실온으로 냉각시키고 20 ㎖의 물로 희석시켰다. 30분 동안 교반한 후, 용매를 증발시켰다. 잔여물을 디클로로메탄으로 2회 더 증발시켜 가능한 한 많은 피리딘을 제거하였다. 이어서, 잔여물을 디클로로메탄에 다시 흡수시키고 밤새 냉장고에 보관하였다. 생성된 고체를 여과하여, 여액을 증발시키고, 플래쉬 크로마토그래피(실리카겔, 디클로로메탄에 2-5% 메탄올 첨가)를 이용해 정제하여, 생성물을 백색-황색 포말로 수득하였다.
화합물 9, E=Cbz-A:
수율: 62%. 1 H-NMR(DMSO-d6): 10.65(s, 1H); 8.59(s, 1H); 8.35 및 8.29(2s, total 1H); 1.47-7.24(m, 10H); 6.90 및 6.72(2m, total 1H); 5.42-5.00(m, 6H); 3.92(m, 5H); 3.56 및 3.49(2s, total 3H); 3.50-2.95(m, 8H); 2.12-1.30(m, 8H); 1.38 및 1.35(2s, total 9H); 1.16(m, 6H); 31 P-NMR(DMSO-d6): 29.52 및 29.16 ppm.
화합물 9, E=Cbz-C:
수율: 59%. 1 H-NMR(DMSO-d6): 10.77(s, br, 1H); 7.94(d, 1H), 7.42-7.33(m, 10H); 7.01(d, 1H); 6.91 및 6.80(2m, total 1H); 5.19(S, 2H); 5.07(s, 2H); 4.80-4.6(m, 2H); 4.36(m, 1H); 3.94(m, 4H); 3.7 및 3.59(2s, total 3H); 3.5-2.8(m, 8H); 2.05-1.3(m, 8H); 1.38 및 1.37(2s, total 9H); 1.19(m, 6H). 31 P-NMR(DMSO-d6): 29.02 및 28.63 ppm.
화합물 9, E=Cbz-G:
수율: 77.5%. 1 H-NMR(DMSO-d6): 11.33(s, br, 2H); 7.85(s, 1H); 7.45-7.30(m, 10H); 6.99 및 6.81(2m, total 1H); 5.26(s, 2H); 5.06(m, 4H); 4.58 및 4.31(2m, total 1H); 3.934(m, 4H); 3.56(s, 3H); 3.31-3.19(m, 8H); 2.21-1.30(m, 8H); 1.36 및 1.35(2s, total 9H); 1.19(m, 6H). 31 P-NMR(DMSO-d6): 28.98 및 28.59 ppm.
화합물 9, E=T:
수율: 78% 1 H-NMR(DMSO-d6): 11.26(s, br, 1H); 7.35(m, 6H); 6.90 및 6.79(2m, total 1H); 5.07(s, 2H); 4.63-4.49(m, 2H); 4.31(m, 1H); 3.94(m, 4H); 3.70 및 3.58(2s, total 3H); 3.46-3.12(m, 8H); 2.11-1.30(m, 8H); 1.76(s, 3H); 1.38 및 1.35(2s, total 9H); 1.19(m, 6H). 31 P-NMR(DMSO-d6): 29.61 및 29.25 ppm.
실시예 10: 화합물 10의 제조
E=Cbz-A, Cbz-C, Cbz-G, T
Figure 112016123099173-pct00051
설명: 2.31 mmol의 화합물 9(E=Cbz-A, Cbz-C, Cbz-G 또는 T)를 12 ㎖의 물/메탄올 1:1에서 0℃로 냉각시킨 후, 12 ㎖의 2 N NaOH 용액을 적가하였다. 0℃에서 15분 동안 교반한 후, DC 컨트롤(실리카겔, 10% 메탄올이 포함된 디클로로메탄) (지속시간: 약 1시간)에 따라 비누화가 완료될 때까지 실온에서 교반하였다. 소량의 물로 희석하고 용해되지 않은 모든 물질을 짧게 원심 분리하였다. 맑은 용액을약 300 ㎖의 물로 희석하고 다시 0℃로 냉각시켰다. 1 M HCl 용액으로 pH를 2.5로 조정하여 백색 고체를 침전시켰다. 생성물이 더 이상 유기상(DC 컨트롤)으로 이동하지 않을 때까지 용액을 디클로로메탄(약 5회)으로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 황산 마그네슘으로 건조시키고, 증발 및 진공 건조시켰다. 생성물을 백색-황색 고체로서 수득하였다.
화합물 10, E=Cbz-A:
수율: 72%. 1 H-NMR(DMSO-d6): 10.68(s, br, 1H); 8.59(s, br, 1H); 8.35 및 8.29(2s, br, total 1H); 7.49-7.33(m, 10 H); 6.98 및 6.85(2m, total 1H); 5.35-5.04(m 6H); 4.62 및 4,22(2m, total 1H,); 3.93(m, 4H,); 3.50-2.85(m, 8H); 2.20-1.30(m, 8H); 1.39 및 1.36(2s, total 9H); 1.17(m, 6H). 31 P-NMR(DMSO-d6): 29.55 및 29.19 ppm.
화합물 10, E=Cbz-C:
수율: 59%. 1 H-NMR(DMSO-d6): 7.95(d, 1H); 7.42-7.28(m, 10H); 7.01(d, 1H); 6.90 및 6.85(2m, total 1H); 5.19(s, 2H); 5.07(s, 2H); 4.81-4.65(m, 2H); 4.33(m, 1H); 3.933(m, 4H); 3.45-3.15(m, 8H); 2.15-1.30(m, 8H); 1.38 및 1.35(2s, total 9H); 1.20(m, 6H). 31 P-NMR(DMSO-d6): 29.03 및 28.66 ppm.
화합물 10, E=Cbz-G:
수율: 62%. l H -NMR(DMSO-d6): 11.43(s, br, 1H); 11.33(s, br, 1H); 7.85(s, 1H); 7.44-7.31(m, 10H); 6.97 및 6.81(2m, total 1H); 5.24(s, 2H); 5.10-5.00(m, 4H); 4.51 및 4.28(2m, total 1H); 3.91(m, 4H); 3.52-3.08(m, 8H); 2.12-1.28(m, 8H); 1.36 및 1.34(2s, total 9H); 1.15(m, 6H). 31 P-NMR(DMSO-d6): 29.61 및 29.21 ppm.
화합물 10, E=Cbz-T:
수율: 72%. 1 H-NMR(DMSO-d6): 11.27(s, br, 1H); 7.35(m, 6H); 6.88(m, 1H); 5.07(s, 2H); 4.65-4.48(m, 2H); 4.37 및 4.38(2m, total 1H); 3.94(m, 4H); 3.45-3.17(m, 8H); 2.11-1.30(m, 8h); 1.75(s, 3H); 1.38 및 1.36(2s, total 9H); 1.19(m, 6H). 31 P-NMR(DMSO-d6): 29.64 및 29.26 ppm.
실시예 11: 일반식 (Ⅲ) 또는 (Ⅵ)의 본 발명에 따른 소중합체 화합물의 제조
N-아세틸-N-(2-아미노에틸)글리신 구성요소, 아미노산, 아미노산 유도체 및 B-CH(R48)COOH의 기를 포함하는 군으로부터 선택된 단량체 단위와 일반식 (Ⅰ)의 적절한 화합물의 순차적인 연결에 의해 본 발명에 따른 고체상 펩타이드 합성 소중합체를 제조하였다.
일반식 (Ⅳ)의 소중합체 화합물에서 일반식 (Ⅴ)에 따른 단위 Z의 표시를 용이하게 하기 위해 하기와 같은 약어를 사용하였다: TR, CR, GR, AR, PR, TS, CS, GS, AS 및 PS. 여기서 각각의 경우에서 T, C, G, A 및 P(페닐)는 각각의 단량체 단위의 핵염기를 나타내며, 위첨자 R 또는 S는 일반식 (Ⅴ)에 따른 단위 Z의 비대칭 중심(#)에서 R-배열 또는 S-배열을 나타낸다.
N-아세틸-N-(2-아미노에틸)글리신 구성요소로 이루어진 단량체는 상기에서 기술한 일반식 (Ⅴ)의 단량체와 유사하게 기술되나 핵염기로 대문자를 사용하고, 배열로 위첨자를 쓰는(예: AR) 대신에 a에 해당하는 소문자를 사용한다는 차이점이 있다. 예를 들어, 핵 염기로서 C를 갖는 단량체는 c로 기술된다.
실시예 12: B- CH(R 48 )COOH기로서 4- 플루오로페닐 -아세테이트 치환체를 갖는 일반식 (Ⅲ) 또는 (Ⅵ)의 소중합체 화합물:
하기와 같은 방법으로 고체상 펩타이드 합성에 의한 본 발명에 따른 화합물을 제조하였다:
1단계: 디클로로메탄에 10 ㎎의 수지(MBHA 수지, Novabiochem, 약 0.5-06 mmol/g 저부하)를 3시간 동안 미리 담근다.
2단계: 합성 사이클을 시작한다: 디클로로메탄으로 4회 세척한다.
3단계: 수지를 중화한다: 디클로로메탄/DIPEA(5%)로 3회 세척한다.
4단계: 디클로로메탄으로 5회 세척한다.
5단계 : NMP로 5회 세척한다.
6단계: NMP/피리딘(2:1)에서 3.8당량의 HATU 및 9당량의 NMM이 포함된 상응하는 보호된 화합물(일반식 (Ⅰ)의 화합물/PNA-단량체/아미노산/아미노산 유도체) 4당량을 넣고 1분 동안 예비 활성화를 한다.
7단계: 활성화된 보호된 화합물(일반식 (Ⅰ)의 화합물/PNA-단량체/아미노산/아미노산 유도체)을 고체상(첫번째 커플링; 지속시간: 60분)과 반응시킨다.
8단계: NMP로 4회 세척한다.
9단계: 6 내지 8 단계를 반복한다(두번째 커플링).
10단계: 닌히드린으로 커플링 효율을 검사한다(카이저 검사; 카이저 검사가 양성이면, 상응하는 보호된 화합물(일반식 (Ⅰ)의 화합물/PNA-단량체/아미노산/아미노산 유도체)로 단계 6 내지 8을 반복해야 한다).
11단계: 음성 카이저 검사 후, Ac2O/NMP/피리딘(1:25:25)용액으로 10분 동안 1회 캡핑한다.
12단계 : NMP로 5회 세척한다.
13단계: 용매를 디클로로메탄으로 바꾼다: DCM으로 5회 세척한다.
14단계: TFA/m-크레졸(95:5)과 반응시켜 Boc를 분열시킨다. 반응시간: 각각 3분씩 2회
15단계: DCM으로 5회 세척한다.
16단계: 용매를 NMP로 바꾼다. NMP로 5회 세척한다.
17단계: 최종적으로 상응하는 보호된 화합물(일반식 (Ⅰ)의 화합물/PNA-단량체/아미노산/아미노산 유도체)과 커플링하기 위해 합성 사이클(6단계 내지 16단계)을 반복한다. 다음으로, 최종적으로 상응하는 보호된 화합물(일반식 (Ⅰ)의 화합물/PNA-단량체/아미노산/아미노산 유도체)과 커플링하기 위해 필요한 만큼 합성 사이클(6단계 내지 16단계)을 반복한다.
18단계: 디클로로메탄으로 5회 세척한다.
19단계: TFA/m-크레졸(95:5)과 반응시켜 Boc를 분열시킨다. 반응시간: 각각 3분씩 2회.
20단계: 디클로로메탄으로 5회 세척한다.
21단계: NMP로 5회 세척한다.
22단계: NMP/피리딘(2:1)에 5.7당량의 HATU 및 13당량의 NMM이 포함된 4-플루오로페닐-아세트산 6당량을 1분 동안 예비 활성화시킨다.
23단계: 활성화된 4-플루오로페닐-아세트산을 고체상과 반응시킨다(지속시간: 60분).
24단계: NMP로 4회 세척한다.
25단계: 필요한 경우 23 내지 24 단계를 반복한다(두번째 커플링).
26단계: 디클로로메탄으로 5회 세척한다.
27단계: 건조를 위해: 디에틸에테르로 5회 세척한다.
수지의 C 말단에 결합된 일반식 (Ⅲ) 또는 (Ⅵ)의 화합물이 수득된다.
수지로부터 일반식 (Ⅲ) 또는 (Ⅵ)의 본 발명에 따른 화합물의 분열:
본 발명에 따른 화합물을 갖는 수지를 트리플루오로아세트산, 트리플루오로 메탄술폰산, 티오아니솔 및 에탄디티올(85/12.5/1.7/0.8, v/v/v/v)의 용액에서 2시간 동안 진탕하였다. 액체상을 여과하고 차가운 에테르를 첨가하여 원료 생성물을 침전시켰다. 원료 생성물을 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 탈염 처리하였다. 원료 생성물을 메탄올/물을 함유한 RP-C18 컬럼을 이용해 분취용 HPLC로 정제하였다. 본 발명에 따른 화합물은 무색의 고체로서 약 50%의 수율로 얻어진다. 본 발명에 따른 화합물의 질량은 HPLC-ESI로 측정하였다.
실시예 13: 일반식 (Ⅲ) 또는 (Ⅵ)의 제조된 화합물의 예
실시예 12의 일반 절차에 따라, 일반식 (Ⅲ) 또는 (Ⅵ)의 소중합체 화합물을 수득하였으며, 이는 하기와 같이 요약한다:
예로서, R-배열 및 다른 PNA 단량체와 함께 비대칭 중심을 갖는 본 발명의 일반식 (Ⅰ)의 단량체 소중합체 화합물 및 아미노산 L-리신(약자: LysL)을 제조하고, 최종단계에서 리신의 α-아미노기를 아세틸로 캡핑하고, 최종적으로 소중합체 화합물을 수지로부터 1차 아마이드로 분리하였다. 상기 물질을 약자 Ac-LysL-cCRgGRgGRtcgcaGRcTRgGR-NH2로 명명하였다.
예로서, R-배열 및 다른 PNA-단량체와 함께 비대칭 중심을 갖는 본 발명의 일반식 (Ⅰ)의 단량체 소중합체 화합물 및 아미노산 글리신(약자: Gly)을 제조하고, 최종단계에서 리신의 α-아미노기를 아세트산페닐(약자: Pac)로 캡핑하고, 최종적으로 소중합체 화합물을 수지로부터 1차 아마이드로 분리하였다. 상기 물질을 약자 Pac-Gly-agcccTSaacTSgcacTSTSccaTS-NH2로 명명하였다.
예로서, R-배열 및 다른 PNA-단량체와 함께 비대칭 중심을 갖는 본 발명의 일반식 (Ⅰ)의 단량체 소중합체 화합물 및 아미노산 D-리신(약자: LysD)을 제조하고, 최종단계에서 리신의 α-아미노기를 4-플루오로-아세트산페닐(약자: FluPac)로 캡핑하고, 최종적으로 소중합체 화합물을 수지로부터 1차 아마이드로 분리한 다음, 형광염료 ATTO647에 커플링된 리신의 ε-아미노기를 약자 FluPac-LysD(ATTO647)-cCRgGRgGRtcgcaGRcTRgGR-NH2로 명명하였다.
다른 형광 염료의 예로는 ATTO, MegaRed, Alexa, BODIPY 및 TAMRA가 있다.
하기는 제조된 일반식 (Ⅳ)의 본 발명에 따른 화합물의 예이다:
Pac-LysL-agcccTRaacTRgcacTRTRccaTR-NH2
Pac-LysL-TRTRccaTRccTRTRggagcTRTRggcTR-NH2
Pac-LysL-cTRaacTRgcacTRTRccaTRccTRTR-NH2
Pac-LysL-TRTRcccagcccTRaacTRgcacTR-NH2
Pac-LysL-gacccTRTRcccagcccTRaacTR-NH2
Pac-LysL-ggTRagacccTRTRcccagcccTR-NH2
Pac-LysL-TRTRcgTRccaTRggccggggTRcc-NH2
Pac-LysL-TRTRcgTRccagTRgccggggTRcc-NH2
FluPac-LysL-cCRgGRgGRtcgcaGRcTRgGR-NH2
FluPac-LysL-cCRgGRgGRtcccgGRgGRgCR-NH2
FluPac-LysL-CCRaTRgGRccgggGRtCRcCR-NH2
FluPac-LysL-GTRtCRgTRccatgGRcCRgGR-NH2
FluPac-LysL-GGRgGRgARacagtTRcGRtCR-NH2
FluPac-LysL-GARGGRgGRggaacaGRtTRcGR-NH2
FluPac-LysL-CGRgGRaARgatgaGRgGRgGR-NH2
FluPac-LysL-AGRaGRgCRctgggCRtGRgCR-NH2
FluPac-LysL-cCRaCRaTRaggggCRcARgAR-NH2
FluPac-LysL-tTRgGRgCRtgctcARaTRgAR-NH2
FluPac-LysL-cGRcGRgARgcgccCRcTRcGR-NH2
FluPac-LysL-tGRgGRgTRgggtcTRtGRgTR-NH2
FluPac-LysL-gTRcGRcTRgtctcCRgCRtTR-NH2
FluPac-LysL-aGRcTRgARccctgARaGRtTR-NH2
FluPac-LysL-aGRcTRgARcctgcARaGRtTR-NH2
FluPac-LysL-cCRgGRgGRtcgcaGRcTRGAR-NH2
FluPac-LysL-gCRcGRgGRgtcgcARgCRtGR-NH2
FluPac-LysL-cCRaTRgGRtcaggGRtCRcCR-NH2
FluPac-LysL-gCRcTRgGRgctggCRtCRtGR-NH2
FluPac-LysL-cCRaCRaTRaaggcCRcARgAR-NH2
FluPac-LysL-tGRgTRgGRtatctGRtGRcTR-NH2
FluPac-LysL-tTRgARtCRttgatGRgTRgGR-NH2
FluPac-LysL-tGRgGRgTRgggtcTRtGRgTR-NH2
FluPac-LysL-cCRtatCRaCRgARttagcARtTRaAR-NH2
FluPac-LysL-cCRcatGRgARaTRtcagtTRcTRcAR-NH2
FluPac-LysL-cCRtatCRACRgARtatgcTRaTRaAR-NH2
Ac-LysL-cCRgGRgGRtcgcaGRcTRgGR-NH2
TML-LysL-cCRgGRgGRtcgcaGRcTRgGR-NH2(TML=ε-트리메틸-리신)
FluPac-LysL-gTRcGRcTRgtctcCRgCRtTR-NH2
Ac-LysL-gTRcGRcTRgtctcCRgCRtTR-NH2
FluPac-LysL-cCRgGRgGRtgccaGRcTRgGR-NH2
FluPac-LysL-cCRggGRgtgccARgctGRg-NH2
FluPac-LysL-cCRaCRaARtcagtCRcTRaGR-NH2
FluPac-LysL-cARgTRcCRtagaaARgARaAR-NH2
FluPac-LysL-aCRtTRtTRcacctGRgGRtCR-NH2
FluPac-LysL-cARaTRaCRtattgCRaCRtGR-NH2
FluPac-LysL-gCRtTRtGRacaatARcTRaTR-NH2
FluPac-LysL-tGRaCRaARtactaTRtGRcAR-NH2
FluPac-LysL-aGRtARtTRggaccCRtTRaCR-NH2
FluPac-LysL-gARaCRaGRtattgGRaCRcCR-NH2
FluPac-LysL-gARacaGRtARtTRggaccCRtTRaCR-NH2
FluPac-LysL-tCRaGRtCRtgataARgCRtAR-NH2
FluPac-LysL-tCRaARcARtcagtCRtGRaTR-NH2
FluPac-LysL-aCRaTRcARgtctgARtARaGR-NH2
FluPac-LysL-cCRgGRgGRtCRgCRaGRcTRgGR-NH2
FluPac-LysL(ATTO647)-cCRgGRgGRtcgcaGRcTRgGR-NH2
FluPac-LysL(MegaRed)-cCRgGRgGRtcgcaGRcTRgGR-NH2
FluPac-LysL(ATTO647)-cCRgGRgGRtCRgCRaGRcTRgGR-NH2
FluPac-LysL(MegaRed)-cCRgGRgGRtCRgCRaGRcTRgGR-NH2
FluPac-gGRccaARaCRcTRcggctTRaCRcTR-NH2
FluPac-gGRccaARaCRcTRgcgctTRaCRcTR-NH2
FluPac-LysL(ATTO)-cCRgGRgGRtcgcaGRcTRgGR-NH2
FluPac-LysL(ATTO)-cCRgGRgGRtCRgCRaGRcTRgGR-NH2
FluPac-LysL(ATTO)-cCRgGRgGRtgccaGRcTRgGR-NH2
Ac-LysL(ATTO)-cCRgGRgGRtcgcaGRcTRgGR-NH2
Ac-LysL(ATTO)-cCRgGRgGRtcgcaGRcTRg-NH2
FluPac-LysL(ATTO)-gTRcGRcTRgtctcCRgCRtTR-NH2
FluPac-LysL(ATTO)-cCRggGRgtgccARgctGRg-NH2
FluPac-LysL(ATTO)-CRcgggGRtCRgCRagctgGR-NH2
FluPac-LysL(Alexa)-cCRgGRgGRtcgcaGRcTRgGR-NH2
FluPac-LysL(BODIPY)-cCRgGRgGRtcgcaGRcTRgGR-NH2
FluPac-LysL-GRgCRcaaARcctcgGRcttacCRtGRaARaTR-NH2
FluPac-LysL-GRgCRcaaARcctgcGRcttacCRtGRaARaTR-NH2
FluPac-LysL-ARcCRaTRagcgaGRgTRgAR-NH2
FluPac-LysL-GRaCRgARaccatARgCRgAR-NH2
FluPac-LysL-GRaGRgCRagacgARaCRcAR-NH2
FluPac-LysL-ARaGRcARgccccARgARgGR-NH2
FluPac-LysL-ARgCRgGRtcageARaGRcAR-NH2
FluPac-LysL-GRaTRgGRacagcGRgTRcAR-NH2
FluPac-LysL-CRtARaARaacagARaTRtGR-NH2
FluPac-LysL-GRaCRcTRaaaaaCRaGRaAR-NH2
FluPac-LysL-GRaTRgGRacctaARaARaCR-NH2
FluPac-LysL-TRgGRtTRctggaTRgGRaCR-NH2
FluPac-LysL-TRtTRtCRtctgcARtGRcAR-NH2
FluPac-LysL-CRtGRtTRtttctCRtGRcAR-NH2
FluPac-LysL-ARgGRtARctgttTRtTRcTR-NH2
FluPac-LysL-ARtTRgGRagaagARaGRcCR-NH2
FluPac-LysL-TRgARcAR11111CRgARaAR-NH2
FluPac-LysL-TRgTRcCRaagggTRgARcAR-NH2
FluPac-LysL-CRtTRgTRccaagGRgTRgAR-NH2
FluPac-LysL-ARcCRtTRgtccaARgGRgTR-NH2
FluPac-LysL-ARtARcCRttgtcCRaARgGR-NH2
FluPac-LysL-CRtTRaTRacc11GRtCRcAR-NH2
FluPac-LysL-ARcTRgCRaacctCRcARcCR-NH2
FluPac-LysL-TRcARcTRgcaacCRtCRcAR-NH2
FluPac-LysL-CRaGRcTRcactgCRaARcCR-NH2
FluPac-LysL-CRtCRaGRctcacTRgCRaAR-NH2
FluPac-LysL-ARtCRtCRagctcARcTRgCR-NH2
FluPac-LysL-CRgARtCRtcagcTRcARcTR-NH2
FluPac-LysL-CRgCRgARtctcaGRcTRcAR-NH2
FluPac-LysL-GRgCRgCRgatctCRaGRcTR-NH2
FluPac-LysL-GRtGRgCRgcgatCRtCRaGR-NH2
FluPac-LysL-CRtCRaGRctcacTRgCRaAR-NH2
FluPac-LysL-GRaTRgGRcaaacARgGRaTR-NH2
FluPac-LysL-CRaCRcARagaggARtGRgCR-NH2
FluPac-LysL-ARgARcCRagcacCRaARgAR-NH2
FluPac-LysL-ARcTRcARctgatARaARgAR-NH2
FluPac-LysL-CRcTRgARggactCRaCRtGR-NH2
FluPac-LysL-TRcCRcCRacctgARgGRaCR-NH2
FluPac-LysL-TRgGRcCRaccttTRtCRtAR-NH2
FluPac-LysL-TRtCRtTRggccaCRcTRtTR-NH2
FluPac-LysL-TRtgRGCRttcttGRgCRcAR-NH2
FluPac-LysL-TRtGRgTRtggctTRcTRtGR-NH2
FluPac-LysL-TRaCRcTRtattgGRtTRgGR-NH2
FluPac-LysL-CRcTRaCRcttatTRgGRtTR-NH2
FluPac-LysL-TRgARcCRtacctTRaTRtGR-NH2
FluPac-LysL-GRgGRtGRacctaCRcTRtAR-NH2
FluPac-LysL-aGRaGRcagaaCRcTR-NH2
FluPac-LysL-aGRaGRcARgaaccTRtARc-NH2
FluPac-LysL-aGRagCRagaacCRttaCRt-NH2
FluPac-LysL-agagcARgARaCRcTRtact-NH2
FluPac-LysL-gCRtARtTRaccttARaCRcCR-NH2
FluPac-LysL-cARaTRcARgacctARgGRaAR-NH2
FluPac-LysL-tTRcTRgCRtctcgTRcCRtGR-NH2
FluPac-LysL-gTRcGRcGRagacaCRgCRtTR-NH2
FluPac-LysL-aGRaGRcARgaaccTRtARcTR-NH2
FluPac-LysL-gTRcGRcTRgtctcCRgCRtTR-NH2
FluPac-LysL-cCRtatCRaCRgARtatgcTRaTRaAR-NH2
MN-LysL-tGRcCRtARggactCRcARgCR-NH2
MN=4-하이드록시-3-니트로-페닐 아세트산-라디칼
MN-LysL(TAMRA)-tGRcCRtARggactCRcARgCR-NH2
MN-LysL(ATTO)-tGRcCRtARggactCRcARgCR-NH2
FluPac-Gly-aGRaGRcARgaaccTRtARc-NH2
FluPac-LysD-cTRgARaARttttcGRaARgTR-NH2
FluPac-LysD-tTRaCRcTRgaaatTRtTRcGR-NH2
FluPac-LysD-cGRgCRtTRacctgARaARtTR-NH2
FluPac-LysD-cTRcGRgCRttaccTRgARaAR-NH2
FluPac-LysD-aCRcTRcGRgcttaCRcTRgAR-NH2
FluPac-LysD-aARaCRcTRcggctTRaCRcTR-NH2
FluPac-LysD-cCRaARaCRctcggCRtTRaCR-NH2
FluPac-LysD-aARgGRcCRaaaccTRcGRgCR-NH2
FluPac-Gly-aGRaGRcARgaaccTRtARcTR-NH2
FluPac-Gly-aGRagcARgaaccttARct-NH2
FluPac-Gly-aGRaARgARcgttcCRaARcTR-NH2
FluPac-Gly-aGRcGRaARgcataTRaTRcCR-NH2
FluPac-Gly-aCRaGRgARcgagaGRcARgAR-NH2
FluPac-Gly-aCRcTRtARcttttCRcTRcTR-NH2
FluPac-Gly-caCRaGRatgacARtTRaGR-NH2
FluPac-Gly-cARaTRcARgacctARgGRaAR-NH2
FluPac-Gly-aCRaCRcCRacaatCRaGRtCR-NH2
FluPac-Gly-aCRcCRaCRaatcaGRtCRcTR-NH2
FluPac-Gly-aCRaARtCRagtccTRaGRaAR-NH2
FluPac-Gly-aARtCRaGRtcctaGRaARaGR-NH2
FluPac-Gly-tCRaGRtCRctagaARaGRaAR-NH2
FluPac-Gly-aGRtCRcTRagaaaGRaARaAR-NH2
FluPac-Gly-gGRaTRgGRactctTRaCRtTR-NH2
FluPac-Gly-aTRgGRaCRtcttaCRtTRtTR-NH2
FluPac-Gly-aCRtCRtTRactttTRcARcCR-NH2
FluPac-Gly-tCRtTRaCRttttcARcCRtGR-NH2
FluPac-Gly-tTRaCRtTRttcacCRtGRgGR-NH2
FluPac-Gly-tTRtTRcARcctggGRtCRaTR-NH2
FluPac-Gly-tCRcARaCRaatcaGRaCRcTR-NH2
FluPac-Gly-cARaCRaARtcagaCRcTRaGR-NH2
FluPac-Gly-aCRaARtCRagaccTRaGRgAR-NH2
FluPac-Gly-aARtCRaGRacctaGRgARaAR-NH2
FluPac-Gly-tCRaGRaCRctaggARaARaCR-NH2
FluPac-Gly-aGRaCRcTRaggaaARaCRgGR-NH2
FluPac-Gly-aCRgARgARgcagaARcCRtTR-NH2
FluPac-Gly-gARgARgCRagaacCRtTRaCR-NH2
FluPac-Gly-gARgCRaGRaacctTRaCRtTR-NH2
FluPac-Gly-gCRaGRaARccttaCRtTRtTR-NH2
FluPac-Gly-aGRaARcCRttactTRtTRcCR-NH2
FluPac-Gly-aARcCRtTRactttTRcCRtCR-NH2
FluPac-Gly-cARgTRcCRtagaaARgARaAR-NH2
FluPac-Gly-aARaCRcTRcggctTRaCRcTR-NH2
FluPac-LysD-cCRgGRgGRtcgcaGRcTRgGR-NH2
Ac-LysD-cCRgGRgGRtcgcaGRcTRgGR-NH2
FluPac-LysD-cCRggggtcgCRaGRcTRgGR-NH2
FluPac-LysD-aGRaGRcARgaaccTRtARcTR-NH2
Ac-LysD-aGRaGRcARgaaccTRtARcTR-NH2
FluPac-LysD-aGRagcagaaCRcTRtARcTR-NH2
FluPac-LysD-cCRaCRaARtcagtCRcTRaGR-NH2
Ac-LysD-cCRaCRaARtcagtCRcTRaGR-NH2
FluPac-LysD-cCRacaatcaGRtCRaTRaGR-NH2
FluPac-Gly-aCRaTRcARgtctgARtARaGR-NH2
FluPac-Gly-gGRgGRtCRatcaaGRgGRtGR-NH2
FluPac-Gly-cCRaCRaGRatgacARtTRaGR-NH2
FluPac-Gly-CRcaCRaARtcagtCRcTRaGR-NH2
FluPac-Gly-CRcaCRaARtcagtCRcTRag-NH2
FluPac-Gly-ccaCRaARtcagtCRcTRaGR-NH2
FluPac-Gly-ccaCRaARtcagtCRcTRag-NH2
FluPac-Gly-cCRaCRaARtcagtCRcTRaGR-NH2
FluPac-LysD(ATTO)-cCRgGRgGRtcgcaGRcTRgGR-NH2
Ac-LysD(ATTO)-cCRgGRgGRtcgcaGRcTRgGR-NH2
FluPac-LysD(ATTO)-cCRggggtcgCRaGRcTRgGR-NH2
FluPac-LysD(ATTO)-aGRaGRcARgaaccTRtARcTR-NH2
Ac-LysD(ATTO)-aGRaGRcARgaaccTRtARcTR-NH2
FluPac-LysD(ATTO)-aGRagcagaaCRcTRtARcTR-NH2
FluPac-LysD(ATTO)-cCRaCRaARtcagtCRcTRaGR-NH2
Ac-LysD(ATTO)-cCRaCRaARtcagtCRcTRaGR-NH2
FluPac-LysD(ATTO)-cCRacaatcaGRtCRcTRaGR-NH2
FluPac-LysD(Chol)-gARgARgCRagaacCRtTRaCR-NH2
Figure 112016123099173-pct00052
FluPac-LysD(Fol)-gARgARgCRagaacCCRtTRaCR-NH2
Figure 112016123099173-pct00053
FluPac-LysD(Dans)-gARgARgCRagaacCRtTRaCR-NH2
Figure 112016123099173-pct00054
FluPac-Gly-aGRaGRcARgaaccTRtARc-NH2
FluPac-Gly-aGRaGRCaRgaaccTRtARcTR-NH2
FluPac-LysD-gARgCRaGRaacctTRaCRtTR-NH2
FluPac-LysD-gARgaGRcagaaCRcttaRc-NH2
Ac-LysD-gARgaGRcagaaCRcttaRc-NH2
FluPac-Gly-gARgcARgaaccTRtacTRt-NH2
FluPac-Gly-cagtccTRaGRaARagaaa-NH2
FluPac-Gly-gGRccaARaCRcTRcggctTRaCRTR-NH2
FluPac-Gly-cagtccTRaGRaARagaaa-NH2
실시예 14: 다양한 장기/조직에서 개선된 생체이용률 및 증가된 반감기
3H가 표지된 N-포스 소중합체 및 3H가 표지된 EP2041161 소중합체를 각각 PBS(pH 7.1)에 용해시키고 10 mg/kg의 농도로 마우스에 정맥 내 주사로 투여하였다. 다양한 시간에서(20분, 1.5시간, 3시간, 6시간, 24시간, 2일, 4일, 8일 및 14일) 혈액 및 18개의 다른 장기/조직(신장, 간, 비장, 골수, 림프절, 폐, 대장, 소장, 췌장, 방광, 심장, 흉선, 위, 근육, 대뇌, 소뇌, 전립선 및 피부)을 마우스에서 수득하고 각각의 조직에서 3H-응축을 측정하였다. 약동학 분석은 검증된 전문 WinNonlin 소프트웨어 버전 4.0.1(Pharsight Corporation, Mountain View, USA)을 사용하여 수행하였다. 각각의 기관/조직에서 방사능(샘플링 사이트당 평균 3마리의 동물)이 장기/조직에서의 생체이용률(곡선 아래 면적으로 표현) 및 반감기를 계산하기 위해 가정된 구획 없이 시간에 따라 측정되었다.
3H가 표지된 N-포스 소중합체의 생체이용률은 3H가 표지된 EP2041161 소중합체의 생체이용률과 비교하여 모든 조직에서 14일 동안 1.7 내지 4.6배 증가하였다. 결과는 도 1에 나타내었다.
또한, 3H가 표지된 N-포스 소중합체의 반감기는 3H가 표지된 EP2041161 소중합체의 반감기와 비교하여 대부분의 조직에서 14일 동안 더 증가하였으며, 실제로 비장에서는 2배 더 증가함을 확인하였다. 결과는 도 2에 나타내었다.
실시예 15: 혈장 단백질에 대한 결합력 증가
인간 혈청 알부민에 대한 결합은 5 cm HPLC 컬럼(Chromtech, 4.0x50 mm, 5 ㎛)으로 확인하였다. 인간 혈청 알부민은 상기 컬럼에 고정화되어 있으며, 체류 시간에 따라 인간 혈청 알부민에 대한 결합친화력을 측정할 수 있다. 30% 이소프로필알코올(isoprop)/아세트산암모늄 완충액(pH 7)이 용리액으로서 사용되었다.
친화도 상수는 하기와 같은 공식을 사용하여 제조업체의 방법에 따라 계산하였다:
k'=(tr-tm)/tm
tr=적용된 샘플의 체류시간
tm=아세트아미노펜의 체류시간
상기 값으로 인간 혈청 알부민에 대한 결합(%)은 하기와 같이 계산될 수 있다:
P=100(k'/(k'+1))
높은 값은 생체 내에서 유익한 분포를 나타낸다. 하기 표는 EP2041161 소중합체와 비교하여 N-포스 소중합체가 혈청 알부민에 훨씬 강력하게 결합함을 나타낸다.
N-포스 소중합체와 EP2041161 소중합체의 혈장-단백질 결합을 비교하기 위한 표
혈장 단백질 결합(%)
서열 N-포스 소중합체a EP2041161 소중합체b
FluPac-Gly-cARgTRcCRtagaaARgARaAR-NH2 94 71,5
aN-포스 소중합체: R1=-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2
bEP2041161 소중합체: R1=-CH2-CH2-CH2-P=0(OEt)2
실시예 16: 개선되고 서열에 독립적인 물에 대한 용해성
다양한 N-포스 소중합체 및 EP2041161 소중합체의 무게를 재고 이론적으로 100 μM 용액을 이론적으로 제공하는 만큼 많은 PBS(pH 7.2)를 첨가하였다. 그런 다음 결과 용액의 OD 값을 측정하였다. 이어서, N-포스 소중합체 및 EP2041161 소중합체의 OD 값을 서로 비교하였다. 여기서 OD 값이 높을수록 용해된 분자 수가 많아지고 물에 대한 용해성이 높아짐을 의미한다. 반면에, 다수의 구아닌 및 시토신 염기를 포함하는 서열인 EP2041161 소중합체는 PBS에 소중합체 화합물이 완전히 용해되는 100 μM 용액이 제조되지 않았으나 N-포스 소중합체는 PBS에 완전히 용해되었다. 하기 표는 EP2041161 소중합체와 비교하여 N-포스 소중합체의 물에 대한 용해성이 서열 독립적으로 유의하게 증가함을 나타낸다.
N-포스 소중합체와 EP2041161 소중합체의 물에 대한 용해성을 비교하기 위한 표
N-포스 소중합체a EP2041161 소중합체b
서열 mc OD 값d mc OD 값d
FluPac-LysL-cCRgGRgGRtcgcaGRcTRgGR-NH2 2.6 70.4 2.4 1.4
FluPac-LysL-cCRgGRgGRtcccgGRgGRgCR-NH2 2.7 75.7 2.6 8.2
FluPac-LysL-cCRaTRgGRccgggGRtCRcCR-NH2 2.9 81.6 2.8 2
FluPac-LysL-gTRtCRgTRccatgGRcCRgGR-NH2 2.4 77.4 2.6 3
FluPac-LysL-gGRgGRgARacagtTRcGRtCR-NH2 2.7 72.8 2.8 8.6
FluPac-LysL-gARgGRgGRgaacaGRtTRcGR-NH2 2.7 70.6 2.4 2.1
FluPac-LysL-cGRgGRaARgatgaGRgGRgGR-NH2 2.5 63.8 2.3 4.4
N-포스 소중합체와 EP2041161 소중합체의 물에 대한 용해성을 비교하기 위한 표
N-포스 소중합체a EP2041161 소중합체b
서열 mc OD 값d mc OD 값d
FluPac-LysL-aGRaGRgCRctgggCRtGRgCR-NH2 2.4 86 2.4 1.8
FluPac-LysL-cCRaCRaTRaggggCRcARgAR-NH2 2.6 66.9 2.5 1.3
FluPac-LysL-tTRgGRgCRtgctcARaTRgAR-NH2 3 77.5 2.3 11.2
FluPac-LysL-cGRcGRgARgcgccCRcTRcGR-NH2 2.9 78.8 2.8 15.8
FluPac-LysL-tGRgGRgTRgggtcTRtGRgTR-NH2 2.4 76.6 1 5
aN-포스 소중합체: R1=-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2
bEP2041161 소중합체: R1=-CH2-CH2-CH2-P=0(OEt)2
cm=무게(㎎)
dOD 값=PBS에서 이론적으로 100 μM의 용액을 제조한 후 측정된 OD 값
실시예 17: 상보적인 DNA에 대한 강한 결합력
N-포스 소중합체 또는 EP2041161 소중합체 및 서열 상보적인 DNA 소중합체를 마그네슘 및 칼슘이 없는 생리학적 PBS 완충액에 등몰비로 용해하였다. 자외선 분광계로 측정한 OD 값이 0.8이 될 때까지 용액을 희석하였다. 가열 욕조에서 자외선 분광계의 큐벳을 실온에서 95℃가 될 때까지 1℃씩 서서히 가열하였다. 1℃씩 증가시키는 단계에서 OD 값을 측정하였다. 융점은 결과 곡선의 굴곡점에 의해 얻었다.
하기 표는 N-포스 소중합체가 EP2041161 소중합체보다 높은 융점을 가지고 있음을 나타낸다. 따라서 N-포스 소중합체는 서열 상보적인 DNA 소중합체와 보다 더 안정한 결합을 형성한다.
N-포스 소중합체 및 EP2041161 소중합체의 융점 비교를 위한 표
융점(℃)
서열: FluPac-Gly-cARgTRcCRtagaaARgARaAR-NH2 N-포스 소중합체a EP2041161 소중합체b
DNA 서열, 100% 일치: 5'-TTTCTTTCTAGGACTG-3' 73 69
aN-포스 소중합체: R1=-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2 )
bEP2041161 소중합체: R1=-CH2-CH2-CH2-P=0(OEt)2)
실시예 18: HeLa -세포에서 NFκB의 하향조절
Greiner μClear 384w 플레이트에 HeLa 세포(공급원 DSMZ)를 800 cells/well의 밀도가 되도록 분주하고, 배양하였다. 2일 후, PBS에 용해된 N-포스 소중합체 또는 EP2041161 소중합체를 각각 최종농도가 완전 배지에서 0.5, 2.5 및 10 μM이 되도록 처리하였다. 세포 분주 후 5일째에 20 ㎕/well의 신선한 완전 배지를 첨가하였다. 7일째에 0.1% FCS를 포함하는 기아 배지로 배지를 바꿔주었다. 세포의 자극을 위해 8일째에, 10 ng/㎖의 TNFα(Peprotech)를 배지(0.1% FCS, 항생제 없음)에 첨가하고, 30분 후, 형태학적 분석(4% PFA) 및 적절한 염료 및 항체로 착색된 세포핵 및 세포질과 같은 가장 중요한 세포 내 구조를 확인하기 위해 세포를 고정시켰다. 이미지 프로세싱은 ImageXPress Micro 자동 현미경(MDC)을 이용하여 수행하였다. 이미지는 MetaMorph(MDC) 소프트웨어를 통해 시각적으로 분석한 다음 특정 알고리즘을 사용하여 자동화된 이미지 분석 소프트웨어인 Definiens XD(Definiens)로 정량적으로 분석하였다. 세포의 증식 정도는 세포핵의 수를 측정함으로써 알 수 있는데, 이러한 세포핵의 수는 Hoechst 염료 염색을 통해 측정할 수 있다. 따라서 상기 방법을 통해 소중합체 화합물에 의한 NFκB의 하향 조절을 확인할 수 있다.
하기 표는 특히 2.5 μM 및 10 μM의 농도에서 세포핵의 수가 더 낮은 값을 나타내는 것을 통해, NFκB의 하향조절에 대한 N-포스 소중합체의 유전자 발현 효과가 EP2041161 소중합체에 비해 우수함을 나타낸다.
세포핵의 수를 측정함으로써 세포 증식의 측정을 기반으로 N-포스 소중합체와 EP-2041161 소중합체의 NFκB 하향 조절을 비교하기 위한 표

서열

 세포핵의 수(평균화된 평균)
N-포스 소중합체a EP2041161 소중합체b
0.5
μM		 2.5
μM		 10
μM		 0.5
μM		 2.5
μM		 10
μM
FluPac-LysL-cCRgGRgGRtcgcaGRcTRgGR-NH2 97.1 92.0 68.7 99.3 102.4 111.5
FluPac-LysL-cCRgGRgGRtcccgGRgGRgCR-NH2 92.1 92.7 79.7 106.2 106.7 114.5
FluPac-LysL-CCRaTRgGRccgggGRtCRcCR-NH2 92.3 83.7 66.6 105.0 111.8 119.2
aN-포스 소중합체: R1=-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2
bEP2041161 소중합체: R1=-CH2-CH2-CH2-P=0(OEt)2
실시예 19: THP1 세포에서 표적인 TNFR2의 보다 더 강력한 스플라이스 부위조절(엑손 7 건너뛰기)
ATCC(ATCC TIB-202®TM)에서 얻은 THP1 세포를 배양하여 소중합체 화합물의 효능 검사를 수행하였다. THP1은 급성 단핵구 백혈병 환자의 인간 단핵구 세포주이다. 항생제를 사용하지 않고 THP1 세포를 배양하였다(10% FCS를 포함하는 RPMI 1640 배지에서). Venor GeM-키트(Minerva)를 사용하여 마이코플라스마(mycoplasma) 검사를 수시로 수행하였다.
1일째에 멀티 드롭 디스펜서를 사용하여 Greiner collagen Ⅰ 384W 플레이트(#781956)에 PMA가 첨가된 THP1 세포를 13,000 cells/well 밀도로 분주하였다. 상기 단계에서 세포는 10% 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 완전 배지에서 배양하였다. 분주 후, 100 nM의 PMA(Sigma #P8139)를 첨가하였다. 4일째에 배양 배지를 교체한 후, 0.2, 2 및 20 μM의 농도로 소중합체를 첨가하였다. 6일째에 100 U/㎖의 THP1 INFg(Peprotech)와 IFN-γ를 첨가하여 24시간 동안 세포를 배양하였다. 7일째에 세포 배양 배지를 교체한 후, 기아 배지(0.1% FCS)에 5 ㎍의 LPS (Sigma)를 첨가하여 24시간 동안 자극하였다. 8일째에 THP1 세포를 용균 버퍼 Stratec S(#7061311700)에서 용해시키고 용해액을 -80℃에 보관하였다. 9일째에 RNA Stratec InviTrap RNA 추출 키트(#7061300400)를 사용하여 세포를 추출하고 추가 분석을 위해 -80℃에 보관하였다.
RT 반응은 RNase 억제제(#N8080119)와 함께 LifeTech High Capacity cDNA 키트(#4368813)를 사용하여 수행하였다. qPCR은 Bioline SensiMix Sybr qPCR Mastermix(#QT605-20)와 엑손 7이 있거나 없는 인간 TNFR2 동형 단백질의 mRNA에 대한 특이 프라이머를 함께 사용하여 11 ㎕의 반응 부피로 수행하였다.
qPCR 반응은 ABI PRISM 7900HT 시스템에서 수행하였다. RT-qPCR 데이터는 각 웰의 증폭 곡선에 대해 수동으로 검사하였다. 표적 유전자의 상대 mRNA는 Rpl13a 참조 유전자의 mRNA 양으로 표준화된다.
검사에 사용된 소중합체 화합물 각각의 농도에 대해, 엑손 7이 없는 유도된 TNFR2 동형 단백질의 발현 비율(%로 표현됨)은 엑손 7을 갖는 TFNR2 동형 단백질의 발현에 대해 각각의 경우에서 항상 참조 유전자 Rpl13a의 발현에 비례한다. 동등한 유효 농도인 EC50은 Excel XLfit.5 추가 기능(IDBS)을 함께 사용해 개별 농도 데이터(2차 일치)에 가장 적합한 통계 곡선 함수를 기반으로 계산하였다.
하기 표는 TNFR2의 스플라이스 부위조절에서 N-포스 소중합체가 EP2041161 소중합체보다 유의하게 낮은 EC50 값을 갖는다는 것을 나타낸다.
THP1 세포에서 표적인 TNFR2의 스플라이싱 부위조절의 예에서 N-포스 소중합체 및 EP2041161 소중합체의 유전자 발현에 대한 효과를 비교하기 위한 표
EC50 Wert(μM)
서열 N-포스 소중합체a EP2041161 소중합체b
FluPac-Gly-cARgTRcCRtagaaARgARaAR-NH2 28.0 216.6
FluPac-Gly-cARgTRcCRtagaaARgARaa-NH2 84.6 274.7
aN-포스 소중합체: R1=-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2
bEP2041161 소중합체: R1=-CH2-CH2-CH2-P=0(OEt)2
실시예 20: 마우스에서 표적인 TNFR2의 스플라이스 부위조절(엑손 7 건너뛰기)
1일, 3일 및 5일째에 BalB/C(Jackson Labs) 마우스 5마리를 포함하는 처리 군에 50 ㎎/㎏의 N-포스 소중합체 또는 PBS를 동일한 부피로 정맥 내 주사하였다. 8일째에 15 ㎎/㎏의 LPS(대장균 혈청형 Ø127: B8의 페놀 -LPS, 내독소 값이 500,000 EU(내독소 단위)/㎎) 이상인 Sigma Cat #L3129)로 염증반응 자극을 주었다. LPS 자극 3시간 후, 동물을 희생시키고 비장과 장간막 림프절을 각각 30 mg씩 수득하여 즉시 액체 질소로 동결시켰다. 조직 샘플은 다음 단계를 진행하기 전까지 -80℃ 냉동실에서 보관하였다. RNA 추출을 위해 30 ㎎ 이하의 조직 단편(메스로 과량 조직을 제거한 후)을 즉시 300 ㎕ QIAzol 시약과 스테인리스강 비드(Qiagen cat #69989)가 들어있는 튜브에 옮겨 주었다. Qiagen RNeasy 96 유니버셜 조직 키트(Qiagen #74881)를 이용하여 제조사의 절차에 따라 조직 샘플로부터 RNA를 추출하였다. 수득한 RNA는 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다. qPCR 분석에서 RT 반응은 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase inhibitor(Invitrogen, Cat #4374966)를 이용하여 제조사의 절차에 따라 수행하였다. qPCR 반응 혼합물은 SybrGreen을 기반으로 식별하는 Bioline SensiMix SYBR Mastermix(#QT605-20) 및 사전에 검증된 전사-특이적인 프라이머 쌍을 포함하여 반응부피 11 ㎕씩 3회 반복하여 수행할 수 있도록 준비하였다. 실시간(real-time) PCR 반응은 ABI PRISM 7900HT 시스템으로 수행하였다. RT-qPCR 데이터는 수동으로 확인하였고, RNA 참조 유전자인 Rpl13a의 mRNA 양을 기준으로 표적 mRNA의 양을 표준화하였다. 엑손 7이 없는 마우스의 TNFR2 유전자의 mRNA 동형 단백질인 표적 mRNA의 발현 수준은 5마리 실험군 마우스 각각의 경우에서 비장 또는 장간막 림프절의 3 반복 측정값의 5개 중앙값의 중앙값으로 측정하여 Rpl13a로 정규화하였다.
마우스에서 표적인 TNFR2 스플라이스 부위조절에서 유전자 발현에 대한
N-포스 소중합체의 강력한 효과를 보여주는 표
엑손 7이 없는 TNFR2 mRNA 동형 단백질의
발현 중간값(RNA 표준 Rpl13a의 배수로 표시)
PBS 또는 N-포스 소중합체a 장간막 림프절 비장
PBS 0.000834 0.001097
FluPac-Gly-aGRaGRcARgaaccTRtARcTR-NH2 0.017613 0.027815
FluPac-Gly-gARgARcARagaacCRtTRaCR-NH2 0.038645 0.032936
aN-포스 소중합체: R1=-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2
실시예 21: THP1 세포에서 본 발명에 따른 N- 포스 소중합체 , EP 2041161 소 중합체 및 US5719262 소중합체의 표적인 TNFR2 스플라이스 부위조절(엑손 7 건너뛰기)에 대한 효능 비교
실험은 실시예 19에 기술한 바와 같은 방법으로 수행하였다. 결과는 하기 표 및 도 3에 나타내었다.
본 발명에 따른 N-포스 소중합체는 EP 2041161 소중합체와 비교하여 THP1 세포에서 표적인 TNFR2의 스플라이스 부위조절에 대해 2.6배 더 강력한 효과를 나타내는 반면, US5719262 소중합체에 의한 표적인 TNFR2의 조절은 사실상 0임을 확인하였다.
THP1 세포에서 표적인 TNFR_2의 스플라이스 부위조절에 대한
10 μM 농도의 N-포스 소중합체, EP2041161 소중합체 및 US5719262 소중합체의
유전자 발현 효과를 비교하기 위한 표.
전체 TNFR2 mRNA에 대한 엑손 7이 없는 TNFR2 mRNA 동형 단백질의 비율(%)
서열 N-포스
소중합체a 		EP 2041161
소중합체b 		US5719262
소중합체c
FluPac-Gly-cagtccTRaGRaARagaaa-NH2 3.4 1.3 0.3
aN-포스-소중합체: R1=-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2
bEP2041161 소중합체: R1=-CH2-CH2-CH2-P=0(OEt)2
cUS5719262-소중합체: R1=-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2
실시예 22: 마우스의 폐에서 표적인 TNFR2의 스플라이스 부위 조절(엑손 7 건너뛰기)에 대해 상이한 라디칼 U를 갖는 본 발명에 따른 N-포스 소중합체의 효과
실험은 실시예 20에 기술한 바와 같은 방법으로 수행하였다.
일반식 Ⅶ에 따른 라디칼 U 및 R46으로서 화학식 Ⅸc(콜레스테롤 유도체) 또는 Ⅸd(엽산 유도체)의 기를 갖는 화학식 (Ⅵ)의 본 발명에 따른 시험에 사용된 N-포스 소중합체는 표적인 TNFR2의 스플라이스 부위에서 유전자 발현에 대한 효과가 강력하다.
예로서, 폐에서 콜레스테롤 유도체는 PBS 음성 대조군에 비해 효과가 560배 더 크고 엽산 유도체는 378배 더 크게 나타났다. 결과는 도 4에 나타내었다.
실시예 23: 쥐의 신장, 간 및 폐에서 상이한 핵염기 서열, 라디칼 U 및 일반식 (Ⅵ)에 따른 일반식 (Ⅳ) 및 (Ⅴ)에서 상이한 기의 수와 위치를 갖는 본 발명에 따른 N- 포스 소중합체의 표적인 TNFR2의 스플라이스 부위조절(엑손 7 건너뛰기)에 대한 효과
실험은 본 발명에 따른 N-포스 소중합체인 N-포스 23-1, N-포스 23-2, N-포스-23-4를 이용하여 수행하였다(도 5). 실험은 실시예 20에 기술한 바와 같은 방법으로 수행하였다.
시험에 사용된 본 발명에 따른 모든 N-포스 소중합체는 다양한 마우스 조직(신장, 간 및 폐)에서 엑손 7이 없는 mRNA 동형 단백질의 유전자 발현에 대해 매우 강력한 효과를 나타내었다. 예를 들어, 신장에서 N-포스 23-1의 효과는 PBS 음성 대조군보다 1,983배 더 크게 나타났다. 결과는 도 5에 나타내었다.
실시예 24: 마우스의 신장에서 표적인 TNFR2의 스플라이스 부위 조절(엑손 7 건너뛰기)에 대한 본 발명에 따른 N- 포스 소중합체와 EP 2041161 소중합체 간의 효능 비교
N-포스 소중합체의 2가지 변이체(변이체 1: 일반식 (Ⅵ)에 따른 모든 반복 단위 Yd, Zf, Yg 및 Zj의 합=15 또는 14; 변이체 2: 일반식 (Ⅵ)에 따른 일반식 (Ⅳ)및 일반식 (V)의 기의 수와 위치 및 EP2041161 소중합체의 상응하는 변이체를 검사하였다. 검사에 사용한 변이체를 도 6에 나타내었다. 실험은 실시예 20에 기술한 바와 같은 방법으로 수행하였으나, 상기 실험은 LPS를 자극하고 2시간 후에 동물이 이미 사망했다는 것에 차이가 있다.
엑손 7이 없는 mRNA 동형 단백질의 유전자 발현에 대한 N-포스 소중합체의 효과는 EP2041161 소중합체와 직접 비교할 때 12.6배 또는 6.7배 더 강력하였다. 결과는 도 6에 나타내었다.
실시예 25: mdx 마우스의 근육에서 표적인 디스트로핀의 스플라이스 부위조절(엑손 23 건너뛰기)에 대한 20개의 구성요소를 갖는 본 발명에 따른 N- 포스 소중합체의 생체 내 효과
실험은 20개의 구성요소(일반식 (Ⅵ)에 따른 모든 반복 단위 Yd, Zf, Yg 및 Zj의 합=19)를 갖는 본 발명에 따른 N-포스 소중합체를 이용하여 수행하였다. 검사에 사용한 화합물을 도 7에 나타내었다. 상기 실험은 C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J(Jackson Labs) 마우스를 사용하였으며, 동물을 LPS로 자극하지 않고, 이들을 15일째에 사멸시켰다는 것을 제외하고는 실시예 20에 기술한 바와 같은 방법으로 수행하였다. 엑손 23이 없는 마우스 디스트로핀 유전자의 mRNA 동형 단백질인표적 mRNA의 발현 수준은 근육의 3회 반복측정한 값의 5개 중앙값의 중앙값으로 결정되고 Rpl13a로 정규화되었다.
20개의 구성요소를 갖는 본 발명에 따른 N-포스 소중합체는 생체 내 근육에서 PBS 대조군과 비교하여 엑손 23이 없는 mRNA 동형 단백질의 유전자 발현에 대해 9배 더 강력한 효과를 나타내었다. 결과는 도 7에 나타내었다.
<110> Ugisense AG <120> Neue Peptid-Nukleinsaeuren-Monomere und -Oligomere <130> 2016FPI-10-012/EP <140> PCT/EP2015/000998 <141> 2015-05-15 <150> DE102014007158.8 <151> 2014-05-16 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Oligomer for thermal stability (Tm) measurements of PNAs <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> DNA Oligomer for thermal stability (Tm) measurements of PNAs <400> 1 tttctttcta ggactg 16

Claims (11)

  1. 하기 일반식 (Ⅰ)의 화합물:
    Figure 112022112997502-pct00055
    (Ⅰ)
    여기서
    K는 카르복실산 활성 에스테르기 또는 -O-RM을 나타내며, 여기서 카르복실산 활성 에스테르기는 니트로페닐 에스테르 및 디니트로페닐 에스테르, N-하이드록시피페리디닐, N-하이드록시숙신이미딜, 1-하이드록시벤조트리아졸릴 및 7-아자-1-하이드록시벤조트리아졸릴로 이루어지는 군에서 선택되며,
    RM은 H 원자, 메틸기, 에틸기, 알릴기, 벤질기, 페닐기, tert-부틸기, 또는 트리메틸실릴기를 나타냄;
    Pr은 H 원자 또는 t-부톡시카르보닐(Boc), t-부톡시카르보닐(Boc) 및 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)를 나타냄;
    #은 비대칭 C 원자를 나타냄;
    E는 비치환 또는 핵염기 보호기(nucleobase protective group)로 치환된 아데니닐(adeninyl), 시토시닐(cytosinyl), 슈도이소시토시닐(pseudoisocytosinyl), 구아니닐(guaninyl), 티미닐(thyminyl), 우라시릴(uracilyl) 또는 페닐기를 나타내고, 여기서 핵염기 보호기는 아세틸기, 이소부티릴기, 벤질옥시카보닐, 디페닐메틸, tert-부틸옥시카르보닐(Boc), (4-메톡시페닐)-디페닐메틸(Mmt), 벤즈하이드릴옥시카르보닐, 아니소일, 4-tert-부틸벤조일, 벤질 또는 디페닐카르바모일기에서 선택되고;
    R1은 하기 일반식 (Ⅱ)로 표시되는 기를 나타냄:
    Figure 112022112997502-pct00056
    (Ⅱ)
    여기서
    R2는 -P(=O)(OV)2 또는 -P(=O)(OV)(OH)의 포스폰산 에스테르기(phosphonic acid ester group)이고, V는 에틸을 나타냄;
    R3는 H 원자, 또는 옥소카르바메이트, 티오카르바메이트 및 (4-메톡시페닐)-디페닐메틸(Mmt)로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노보호기임;
    m은 3 또는 4임; 및
    h는 0 또는 1임;
    단, 일반식 (II)에서 m 및 h의 합: 3≤x≤5.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 E는 티미닐, 우라시릴, 페닐, N2-아세틸-구아니릴, N2-이소부티릴-구아니닐, N2-벤질옥시카르보닐-구아니닐, N2-(4-메톡시페닐)-디페닐메틸-구아니닐, N2-벤즈하이드릴옥시카르보닐-구아니닐, N2-디-벤즈하이드릴옥시카르보닐-구아니닐, N2-tert-부틸옥시카르보닐-구아니닐, N2-디-tert-부틸옥시카르보닐-구아니닐, N6-벤질옥시카르보닐-아데니닐, N6-(4-메톡시페닐)-디페닐메틸-아데니닐, N6-아니소일-아데니닐, N6-벤즈하이드릴옥시카르보닐-아데니닐, N6-디-벤즈하이드릴옥시카르보닐-아데니닐, N6-tert-부틸옥시카르보닐-아데니닐, N6-디-tert-부틸옥시카르보닐-아데니닐, O6-벤질구아니닐, N2-아세틸-O6-디페닐카르-바모일-구아니닐, N2-이소부티릴-O6-디페닐카르바모일-구아니닐, N2-벤질옥시카르보닐-O6-디페닐카르바모일-구아니닐, N2-(4-메톡시페닐)-디페닐메틸-O6-디페닐카르바모일-구아니닐, N2-벤즈하이드릴옥시카르보닐-O6-디페닐카르바모일-구아니닐, N4-벤질옥시카르보닐-시토시닐, N4-(4-메톡시페닐)-디페닐-메틸-시토시닐, N4-4-tert-부틸벤조일-시토시닐, N4-벤즈-하이드릴옥시카르보닐-시토시닐, N4-디-벤즈하이드릴옥시카르보닐-시토시닐, N4-tert-부틸옥시카르보닐-시토시닐, N4-디-tert-부틸옥시카르보닐-시토시닐, N2-벤질옥시카르보닐-슈도-이소시토시닐, N2-(4-메톡시페닐)-디페닐메틸-슈도이소시토-시닐, N2-4-tert-부틸벤조일-슈도이소시토시닐, N2-벤즈-하이드릴옥시카르보닐-슈도이소시토시닐, N2-디-벤즈하이드릴옥시카르보닐 슈도이소시토시닐, N2-tert-부틸옥시카르보닐-슈도이소시토시닐 또는 N2-디-tert-부틸옥시카르보닐-슈도이소시토시닐기를 나타내는, 화합물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 E는 티미닐, 우라시릴, 페닐, N2-벤질옥시카르보닐-구아니닐, N2-벤즈하이드릴옥시카르보닐-구아니닐, N2-tert-부틸옥시카르보닐-구아니닐, N2-벤질옥시카르보닐-O6-디페닐카르바모일-구아니닐, N2-벤즈하이드릴옥시카르보닐-O6-디페닐카르바모일-구아니닐, N6-벤질옥시카르보닐-아데니닐, N6-벤즈하이드릴옥시카르보닐-아데니닐, N6-tert-부틸옥시카르보닐-아데니닐, N6-디-tert-부틸옥시카르보닐-아데니닐, N4-벤질옥시카르보닐-시토시닐, N4-벤즈-하이드릴옥시카르보닐-시토시닐, N4-디-tert-부틸옥시카르보닐-시토시닐, N2-벤질옥시카르보닐-슈도-이소시토시닐, N2-벤즈-하이드릴옥시카르보닐-슈도이소시토시닐 또는 N2-tert-부틸옥시카르보닐-슈도이소시토시닐기를 나타내는, 화합물.
  4. 삭제
  5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R3는 H 원자인, 화합물.
  6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R3는 옥소카르바메이트, 티오카르바메이트 또는 (4-메톡시페닐)-디페닐메틸(Mmt) 보호기를 나타내는, 화합물.
  7. 하기 일반식 (Ⅵ)로 표시되는 화합물:
    Figure 112022112997502-pct00057
    (Ⅵ)
    여기서
    각각의 경우에서 각각의 Y는 독립적으로 일반식 (Ⅳ)의 기를 나타냄:
    Figure 112022112997502-pct00058
    (Ⅳ);
    각각의 경우에서 각각의 Z는 독립적으로 일반식 (Ⅴ)의 기를 나타냄:
    Figure 112022112997502-pct00059
    (Ⅴ);
    여기서
    각각의 경우에서 각각의 E는 독립적으로 아데니닐, 시토시닐, 슈도이소시토시닐, 구아니닐, 티미닐, 우라시릴 또는 페닐기를 나타냄;
    #는 비대칭 C 원자를 나타냄;
    각각의 경우에서 각각의 R41은 H 원자를 나타냄;
    각각의 R11은 -(CH2)m-NH-(CH2)h-CH2-R12를 나타냄;
    각각의 경우에서 상기 R12는 독립적으로 화학식 -P(=O)(OV)2 또는 -P(=O)(OV)(OH)의 포스폰산 에스테르기를 나타냄; 및 각각의 경우에서 V는 에틸기를 나타냄;
    각각의 경우에서 m은 독립적으로 3 또는 4이고, 각각의 경우에서 h는 독립적으로 0 또는 1임; 단, m 및 h의 합: 3≤x≤5;
    각각의 경우에서 d는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4임;
    각각의 경우에서 f는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4임;
    각각의 경우에서 g는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4임;
    각각의 경우에서 j는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4임;
    n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8;
    단, 일반식 (Ⅵ)에서 모든 반복 단위 Yd, Zf, Yg 및 Zj의 합: 7≤x≤25; 및 변수 f 또는 j 중 적어도 하나 이상은 1 내지 4의 정수를 나타냄;
    단, 일반식 (Ⅵ)에서 비율 (반복 단위 Zf 및 Zj의 합):(모든 반복 단위 Yd, Zf, Yg 및 Zj의 합): 0.1≤ x≤0.5;
    R31은 H 원자를 나타냄; 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 오르니틴, 페닐알라닌, 프롤린, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린 아미노산의 곁사슬임; 또는 -(CH2)m-NH-(CH2)h-CH2-R12기; 여기서 R12는 포스폰산 에스테르기 또는 포스폰산기임; m은 1 내지 5의 정수를 나타냄; 및 h는 0 내지 4의 정수를 나타냄; 단, m 및 h의 합: 3≤x≤5;
    각각의 경우에서 R47은 독립적으로 H 원자, 또는 리신, 오르니틴, 또는 아르기닌 아미노산의 곁사슬임;
    t = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8;
    L은 OH, OEt, NH2 or -NHNH2를 나타냄;
    U는 하기 일반식 (Ⅶ)로 표시되는 기를 나타냄:
    Figure 112022112997502-pct00060
    (Ⅶ)
    여기서 B는 H 원자, 페닐기, 또는 OH, F, Cl, Br, I 및 NO2로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 치환체로 치환된 페닐기를 나타냄; R48은 H 원자임; 및
    (i) 각각의 경우에서 각각의 R46은 서로 독립적으로 H 원자 또는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 오르니틴, 페닐알라닌, 프롤린, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린 아미노산의 곁가지를 나타냄; 및 s는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8임; 또는
    (ii) 각각의 경우에서 각각의 R46은 서로 독립적으로 H 원자, 또는 하기 화학식 (Ⅸb)의 기를 나타냄:
    Figure 112022112997502-pct00061
    (Ⅸb);
    하기 화학식 (Ⅸc)의 기:
    Figure 112022112997502-pct00062
    (Ⅸc);
    하기 화학식 (Ⅸd)의 기:
    Figure 112022112997502-pct00063
    (Ⅸd);
    하기 화학식 (Ⅸe)의 기:
    Figure 112022112997502-pct00064
    (Ⅸe)
    식 (Ⅸb), (Ⅸc), (Ⅸd), 및 (Ⅸe)에서 p는 3 또는 4의 수를 나타냄; 및 s = 1, 2, 3 또는 4.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 R11은 각각의 경우에서 각각 -CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2 화학식의 기 또는 -CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2 화학식의 기를 나타내는, 화합물.
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 각각의 R31은 H 원자, 리신, 오르니틴, 아르기닌, 히스티딘, 트립토판, 티로신, 트레오닌 또는 세린 아미노산의 곁사슬, -CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2 화학식의 기 또는 -CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-P=O(OEt)2 화학식의 기를 나타내는, 화합물.
  10. 삭제
  11. 제 7항 또는 제 8항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나 이상의 화합물, 및 적어도 하나 이상의 담체 또는 적어도 하나 이상의 보조제를 함유하는,
    B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스에 의해 유발되는 질환; 듀센(Duchenne) 근이영양증, 류마티스성 관절염, 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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