ES2474940T3 - Métodos y vectores que generan inmunoglobulinas sialiladas - Google Patents

Abstract

Un método para proporcionar un actividad enzimática de la sialidasa en un cultivo que comprende células de mamífero modificadas para expresar una molécula que contiene Fc, por el que los glicanos de la molécula que contiene Fc pueden actuar por la actividad enzimática de la sialidasa del polipéptido, comprendiendo la transfección de la célula modificada de mamífero con un vector que codifica el dominio catalítico de la enzima A de la sialidasa Arthrobacter ureafaciens, en el que el polipéptido se secreta en el cultivo junto a la molécula que contiene Fc.

Description

M�todos y vectores que generan inmunoglobulinas sialiladas

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención

[0001] La invención se refiere a métodos de producción de proteínas terapéuticas que interact�an con receptores Fc, por ejemplo, anticuerpos, en los que la composición de las cadenas oligosac�ridas est�n optimizadas para la severidad del anticuerpo para su diana, as� como para la afinidad de unión al receptor Fc optimizando la actividad de la función efectora de dichos anticuerpos en comparación con métodos no optimizados de producción de anticuerpos glicosilados.

Descripci�n de trabajos relacionados

[0002] Los anticuerpos son glicoprote�nas de suero solubles que desempeñan un papel importante en la inmunidad innata. Las estructuras de hidratos de carbono de todos los anticuerpos producidos de forma natural en las posiciones conservadas en las regiones constantes de cadena pesada varían según el isotipo. Cada isotipo posee una matriz distinta de estructuras de oligosac�ridos N ligados, que afectan variablemente a la unión de proteínas y a la actividad secretora o funcional (Wright, A., y Morrison, SL, Trends Biotech. 15: 26 - 32 (1997)). Haciendo referencia a las Figs. 1 y 2, la estructura de los oligosac�ridos N ligados varía considerablemente, dependiendo del grado de procesamiento, y puede incluir un alto contenido en manosa, as� como oligosac�ridos biantenarios complejos con o sin bisectriz GlcNAc y residuos de fucosa de núcleo (Wright, A., y Morrison, SL, supra). Normalmente, el procesamiento heterogéneo se da en las estructuras del núcleo de oligosac�ridos unidos a un sitio de glicosilaci�n particular, de tal manera que existen incluso anticuerpos monoclonales con múltiples glicoformas. Del mismo modo, se ha demostrado que las principales diferencias en la glicosilaci�n de anticuerpos se producen entre las líneas celulares productoras de anticuerpos, e incluso se han visto diferencias menores para una línea celular dada crecido en diferentes condiciones de cultivo.

[0003] El ácido si�lico en los glicanos (grupos est�ticos) son conocidos por ser importantes en la prolongación de la semivida en suero de las glicoprote�nas que no son anticuerpos (Stockert, RJ (1995) Physiol. Rev. 75, 591 - 609). Hasta ahora, el papel del ácido si�lico en los anticuerpos monoclonales (mAbs) no se comprendía bien. La semivida en suero de los anticuerpos monoclonales es particularmente larga y se ha demostrado que la construcción de proteínas de fusión con Fc es una estrategia útil en el desarrollo de proteínas terapéuticas, por ejemplo, la proteína enteracept.

[0004] Los anticuerpos y moléculas receptoras de células T poseen regiones responsables de la unión al receptor de superficie celular específico, cuya unión modula la respuesta celular. En el sistema inmune, estas funciones se clasifican como humoral y celular. Los anticuerpos se denominan a menudo moléculas adaptadoras que se unen mecanismos inmunes humorales y celulares: las respuestas humorales se atribuyen principalmente a anticuerpo circulantes, maduros y secretados capaces de unirse con alta afinidad a un ant�geno diana. Las respuestas celulares se atribuyen a las consecuencias de la activación celular mediante la unión de los complejos de AB - AG y por las secuelas aguas abajo causadas por la liberación de mediadores celulares como resultado de la unión del complejo AB - AG a las células efectoras. Estas respuestas celulares incluyen la neutralización de diana, la opsonizaci�n y la sensibilizaci�n (si el ant�geno se muestra en la superficie de una célula), la sensibilizaci�n de mastocitos, y la activación del complemento. Para las dianas celulares, es decir, los ant�genos de la superficie celular, estas funciones efectoras dan lugar a lo que se conoce comúnmente como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

[0005] Entre los isotipos de anticuerpos (por ejemplo, IgE, IgD, IgA, IgM e IgG), las IgG son los más abundantes, y las subclases IgG1 que muestran el grado y la variedad de las funciones efectoras más significativos. Los anticuerpos de tipo IgG1 son los anticuerpos más utilizados comúnmente en la inmunoterapia del cáncer, donde la actividad de ADCC y de CDC a menudo se consideran importantes. Estructuralmente, las IgG de la región bisagra y los dominios CH2 desempeñan un papel importante en las funciones efectoras de anticuerpos. Los oligosac�ridos N ligados presentes en la región Fc (formada por la dimerizaci�n de la bisagra, y los dominios CH2 y CH3) afectan a las funciones efectoras. Los oligosac�ridos con enlaces covalentes son estructuras de tipo biantenario complejos y son muy heterogéneos (véanse las Figs. 1 y 2). En cada dominio CH2 se encuentra un sitio de glicosilaci�n N ligados conservado en Asn297. En el anticuerpo maduro, los dos oligosac�ridos biantenarios complejos unidos a Asn297 se encuentran enterrados entre los dominios CH2, formando contactos extensos con la cadena principal del polip�ptido. Se ha encontrado que su presencia es esencial para que el anticuerpo medie en las funciones efectoras, tales como la ADCC (Lifely, MR, et al, Glycobiology 5: 813 - 822 (1995);. Jefferis, R., et al, Immunol Rev. 163: 59 - 76 (1998); Wright, A. y Morrison, SL, supra, Scallon et al. 2006. Mol. Immunol. 44: 1524 - 1534).

[0006] Los oligosac�ridos heterogéneos que decoran el anticuerpo Fc-porción o las estructuras de derivados de anticuerpos comprendidas producidos por diversas células huésped contienen predominantemente ácido si�lico, fucosa, galactosa y residuos de GlcNAc como azúcares terminales (Raju, TS, et al Glycobiology 2000 10 (5): 477 86). Se ha demostrado que algunos de estos azúcares terminales, en particular la galactosa expuesta, la fucosa nuclear y los residuos de GlcNAc bisecados, afectan a la estructura de la porción Fc de la molécula y, por lo tanto, altera las funciones efectoras de anticuerpos. Las funciones efectoras tales como la actividad de ADCC y de CDC que se basa en la unión a receptores de la superficie celular conocidos como receptores de Fc, as� como la unión a diversos ligandos incluyendo el complemento de proteína C1q puede alterarse por la composición del glicano adjunto (Presta L. 2003. Curr Opin Struct Biol. 13 (4): 519 - 25). La mayoría de los glicanos N ligados en la FC no est�n sialilados en una medida significativa (Idusogie EE, et al. 2000. J. Immunol. 15: 164 (8): 4178 -84). Se conocen métodos de modificación de sialilaci�n: Dalziel et al, 1999. Glycoconjugate journal 16: 801 - 807, patentes WO 2005 016 455 y WO99 / 54342.

[0007] Los principales estructuras que se encuentran en la IgG humana y otras IgG producidas de forma recombinante son las estructuras complejas biantenarias con o sin residuos de Gal expuestos (Fig. 1). Hay un número de células huésped de mamífero que se utilizan actualmente para expresar anticuerpos recombinantes con fines de investigación, as� como para la producción biofarmac�utica. Las especies de las células huésped de origen, as� como las condiciones de cultivo pueden causar la variación de la extensión y la estructura de los glicanos adjuntos a moléculas expresadas de forma recombinante. Dos líneas celulares huésped comúnmente utilizadas para la expresión recombinante de anticuerpos son las células de ovario de h�mster chino (CHO) y las células de mieloma de ratón (SP2 / 0, 653, NS0). Mientras que las células CHO expresan anticuerpos recombinantes que est�n virtualmente desprovistos de ácido si�lico de glicanos, los glicanos est�n fucosilados al 99%. Se ha demostrado que la presencia de fucosa es un contribuyente importante para el receptor de Fc-gammaIII reducido y, por lo tanto, de ADCC. Las células de mieloma de ratón expresan anticuerpos recombinantes con hasta un 50 % de ácido si�lico, pero con, generalmente, menos fucosa. Como se ha indicado anteriormente, estas diferencias pueden tener efectos significativos en la actividad del anticuerpo in vivo.

[0008] Por tanto, sería deseable poder reducir la sialilaci�n de glicanos asociados a los anticuerpos terapéuticos de manera que se eliminara la necesidad de un procesamiento posterior a la recogida y, al mismo tiempo, proporcionara una estructura razonablemente homogénea con respecto al contenido en ácido si�lico. Las enzimas modificadoras de la sialilaci�n se han discutido previamente, por ejemplo Ngangtung de 2005, de la Universidad de Minnesota.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0009] La invención presenta un método para proporcionar una actividad enzim�tica de la sialidasa en un cultivo que comprende una célula de mamífero modificada genéticamente para expresar una molécula que contiene F, a través de la cual los glicanos de la molécula que contiene Fc puedan actuar en la actividad enzim�tica del polip�ptido sialidasa, incluyendo la transfecci�n de la célula de mamífero modificada con un vector que codifica el dominio catalítico de la enzima sialidasa A de Arthrobacter ureafaciens, en el que el dominio catalítico se secreta en el cultivo junto con la molécula que contiene Fc. La invención también presenta un método para producir una molécula que contiene Fc que incluye el método anterior.

[0010] La invención también presenta un método para controlar las propiedades de una molécula que contiene Fc expresada en una línea celular, incluyendo la reducción de la sialilaci�n de los oligosac�ridos en la región Fc mediante la transfecci�n de la línea celular con un vector que codifica el dominio catalítico de la enzima sialidasa A de Arthrobacter ureafaciens, en el que la molécula expresada que contiene Fc comprende una cantidad reducida de residuos de ácido si�lico, en el que las propiedades controladas de la molécula que contiene Fc son la severidad de la molécula para multiplicar proteínas diana localizadas; la afinidad por uno o más de los receptores Fc gamma de FcγRI, FcγRIIA, y FcγRIIIA; La actividad de ADCC; la activación de macr�fagos o de monocitos; y la semivida en suero.

[0011] La invención también presenta un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima sialidasa A de Arthrobacter ureafaciens, en el que el vector es capaz de expresar un polip�ptido que tiene actividad enzim�tica de la sialidasa en un cultivo de células de mamífero que expresan una molécula que contiene Fc, en el que la línea celular de mamífero se selecciona del grupo que consiste en células COS - 1, COS 7, HEK293, BHK21, CHO, BSC - 1, Hep G2, 653, SP2 / 0, 293, HeLa, YB2 / 0 o Y3, células de mieloma o linfoma , o cualquier célula derivada, inmortalizada o transformada de las mismas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS DIVERSAS VISTAS DE LOS DIBUJOS

[0012]

Fig. 1 es una representación esquemática de la estructura de oligosac�rido más grande encontrada en la

IgG humana. Fig. 2 representa las principales estructuras de oligosac�ridos encontrados en una IgG recombinante

producida en células de ovario de h�mster chino (CHO) .

Fig. 3 muestra los resultados de un análisis de HPLC de oligosac�ridos Fc. Los oligosac�ridos N ligados se liberaron, en primer lugar, del anticuerpo mediante el tratamiento con la enzima F PNGasa. Los oligosac�ridos liberados se marcaron con ácido antran�lico y los oligosac�ridos marcados se purificaron por cromatograf�a de filtración en gel. Los oligosac�ridos marcados purificados se analizaron por HPLC, dando como resultado el cromatograma mostrado.

Figs. 4A y 4B son gráficos que muestran la unión de diferentes Ab1: complejos inmunes TNF a FcγRII humano en células K562 mediante dos formatos diferentes. (A) Competición de unión medida mediante la adición de cantidades variables de complejos no marcados de Ab1 y TNF a las células en presencia de una cantidad fija de IgG1 Ab5 humana marcada con 125I complejado con Ab6, un Ab monoclonal específico de ratón para Ab5. (B) Unión directa medida mediante la adición a las células K562 de cantidades variables de Ab1 complejados con TNF marcados con 125I.

Figs. 5A – D son gráficos de los estudios de la unión de FcγRIIIa con diversas preparaciones de Ab de prueba utilizadas para competir con anti-FcγRIIIa mAb 3G8 radiomarcado a una concentración fija para unirse a la célula NK FcγRIIIa: variantes de glicosilaci�n natural de Ab1 (A); variantes de glicosilaci�n natural de Ab5 (B); fracciones de la columna de lectina de Ab1 (C); y fracciones de la columna de lectina de Ab2 (D).

Figs 6A – D son gráficos que muestran los resultados de ensayos de ADCC in vitro realizados utilizando Ab1 que difieren en el contenido de ácido si�lico, de células diana K2 que sobreexpresan TNF en su superficie celular, y de células efectoras PBMC humanas que expresan FcγRs. (A) variantes de glicosilaci�n naturales de Ab1, (B) variantes de glicosilaci�n naturales de Ab2, (C) Comparación de tres subgrupo de Ab1 que difieren en el contenido de ácido si�lico seguido del fraccionamiento basado en afinidad de lectina WGA, y de Ab1 enzim�ticamente desglicosilada (Gno), (D) Comparación de una muestra de Ab1 no tratada y de una muestra totalmente sialilada de Ab1 G2S2, o control negativo Ab, emparejado por isotipo Ab. Las muestras se analizaron por triplicado (las barras de error representan la s.d.) y los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes para cada par de variantes. La diferencia en la actividad entre estas muestras de ensayo fue significativa (P < 0,0001 para los gráficos de A, C, y D, p = 0,0015 para el gráfico B) tal como se determina por la prueba F de la suma extra de los cuadrados.

Figs. 7A y B son gráficos que muestran la unión competitiva de diversas muestras de anticuerpo IgG frente al receptor humano FcγRI (CD64) en células U-937 (A) Ab1 G2 (totalmente galactosiladas y sin sialilar) y Ab1 G2S2 (HI) (totalmente galactosilados y totalmente sialilada) sólo se diferencian por la ausencia y la presencia de ácido si�lico, (B) dos lotes diferentes de Ab3 difieren en la cantidad de especies de oligosac�ridos cargadas (especies que contienen ácido si�lico), siendo el 2% o el 42% del oligosac�rido total.

Fig. 8 es un gráfico que muestra la relación entre el tiempo tras la administración y la concentración s�rica de la parte Fc de una proteína de fusión (FCP1) que había sido completamente sialilada (G2S2) o sin modificar.

Fig. 9 es un gráfico que muestra la relación entre el tiempo tras la administración y la concentración s�rica de la parte Fc de una Ab2 G2S2 completamente sialilada, o de Ab2 G2 totalmente asililada, Ab2 G2, mediante métodos enzim�ticos tal y como se describe.

Fig. 10A – D son gráficos que muestran el efecto del ácido si�lico en las preparaciones de Ab en la afinidad para el ligando diana en la superficie celular mediante la unión competitiva con Ab radiomarcado:

(A) variantes naturales de Ab1, (B) variantes naturales de Ab5, (C) variantes de la parte lectina de la columna de Ab1, y (D) variantes de la parte lectina de la columna de Ab2. Las muestras se ensayaron por duplicado o cuadruplicado, y los resultados mostrados son representativos de 3 o 4 experimentos independientes. La diferencia en la unión entre estas muestras de ensayo fue significativa (P <0,0001 para los gráficos de A, C, y D) como se determina por la prueba F de la suma extra de los cuadrados.

Fig. 11A – B son gráficos que muestran el efecto del ácido si�lico en las preparaciones de Ab en la afinidad para el ligando diana recubierto en placas de EIA: (A) variantes naturales de Ab1 unidas a TNF,

(B) Ab2 unido a un anticuerpo anti - Id.

Fig. 12A – C son gráficos que muestran el efecto del ácido si�lico en las preparaciones de Ab en la afinidad para el ligando diana presentado como ant�geno soluble radiomarcado unido a la superficie a Ab:

(A) variantes naturales de Ab1, (B) variantes de la parte lectina de la columna de Ab1, y (C) variantes de la parte lectina de la columna de Ab2. Se realizaron Incubaciones paralelas con Ag radiomarcado y un exceso de 100 veces de Ag no marcado para determinar la unión no específica. Las muestras se ensayaron por triplicado.

Fig. 13 es una representación esquemática de la expresión del pl�smido p3629 construido para expresar el dominio catalítico de la salidasa A de Arthrobacter ureafaciens vinculada a la secuencia señal de la hGH (hormona del crecimiento humana) con sitios de enzimas de restricción utilizados para la clonaci�n en el vector parental, P2815, indicado.

Fig. 14 es un gráfico que representa la actividad de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) de anticuerpos purificados a partir de líneas celulares que expresan el dominio catalítico de la sialidasa secretada; Los clones 3, 5, 12, 13, y 17.

DESCRIPCI�N DETALLADA

Abreviaturas

[0013] α1, 3GT, α– 1, 3 - galactosiltransferasa; α2, 3ST, α– 2, 3 -sialiltransferasa; β1, 4GT, β– 1, 4 galactosiltransferasa; ADCC, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos; ATCC, American Type Culture Collection; BATDA, bis (acetoximetil) 2, 2': 6', 2" – terpiridina - y, y" - dicarboxilato; BSA, albúmina de suero bovino; Medio de CD, medio de cultivo químicamente definido; CDC, citotoxicidad dependiente del complemento; CMP - Sia, ácido N - acetilneuram�nico monofosfato de citidina; DMEM, medio de Eagle modificado de Dulbecco; E: T, proporción célula efectora por célula diana: FBS, suero fetal bovino; ESI - MS, espectrometr�a de masas de ionizaci�n por electrospray. Células NK, células asesinas naturales; IgG, inmunoglobulina G; IMDM, medio de Dulbecco modificado por Iscove; MALDI – TOF - MS, espectrometr�a de masas por láser de desorci�n / ionizaci�n asistida por matriz; MHX, ácido micofen�lico, hipoxantina, xantina.; NANA, isómero del ácido N - acetilneuram�nico de ácido si�lico; NGNA, isómero del ácido N - glicolilneuram�nico de ácido si�lico; PBMC, células mononucleares de sangre periférica; PBMC, células mononucleares de sangre periférica; PBS, solución salina tamponada con fosfato; PNGasa F, p�ptido Nglycosidase F; RP - HPLC, cromatograf�a de fase líquida de alta resolución inversa; RT, temperatura ambiente; Sia, ácido si�lico; UDP - Gal, galactosa uridina difosfato; UDP - GlcNAc, difosfato de uridina N - acetilglucosamina.

Definiciones

[0014] El término "actividad de ADCC" se refiere a la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos y se refiere al fenómeno de la destrucción de células diana mediada por anticuerpos mediante células efectoras no sensibilizados. La identidad de la célula diana varía, pero debe haber inmunoglobulina G de unión superficial con un dominio Fc o la parte del dominio capaz de activar el receptor de Fc. La célula efectora es una célula "asesina" que posee receptores Fc. Puede ser, por ejemplo, un linfocito que carece de marcadores convencionales de células T, o B, un monocito, macr�fago, o leucocitos polinucleares, dependiendo de la identidad de la célula diana. La reacción se complementa independiente. La actividad ADCC de un anticuerpo u otra proteína que contiene Fc de la presente invención est� "mejorada" si su capacidad para demostrar la muerte celular mediada por ADCC supera la capacidad de un anticuerpo o proteína de secuencia sustancialmente similar y el dominio Fc producido por una célula huésped alternativa. La actividad de ADCC puede determinarse en un ensayo estándar de muerte celular in vivo o in vitro, tales como los ensayos discutidos en este documento. Preferiblemente, el anticuerpo de la invención que tiene una mayor actividad de ADCC logra el mismo efecto (prevención o inhibición del crecimiento de células tumorales) a una dosis más baja y / o en un tiempo más corto que un anticuerpo de referencia producido en una célula huésped alternativa. Preferiblemente, la diferencia entre la potencia de un anticuerpo dentro del alcance de la presente invención y un anticuerpo de referencia es, al menos, aproximadamente 1,5 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 2 veces, aún más preferiblemente, al menos aproximadamente 3 veces, más preferiblemente, al menos aproximadamente 5 veces, tal como se determina, por ejemplo, en la comparación lado a lado en un ensayo estándar seleccionado de ADCC de liberación de cromo.

[0015] El término "afinidad" utilizado en el presente documento pretende ser una medida de la constante de unión de un ligando monovalente simple a su pareja de unión af�n, por ejemplo, la unión de un Fab' para un ant�geno o ep�topo. La afinidad se puede medir de varias maneras, incluyendo pero midiendo las velocidades on - y off - (kon y koff respectivamente) mediante, por ejemplo, resonancia de plasmones (BiaCore) y se expresa como una asociación global (Kass) o constante de disociaci�n (KD) donde Kass es kon / koff y KD es koff / kon. KD también se puede medir empíricamente mediante, por ejemplo, la medición de la concentración a la que la unión del ligando a una pareja de unión est� medio saturada. Otro método para medir KD es mediante ensayo de competición, en el que un agente aglutinante o ligando se marca o etiqueta y se mantiene a una concentración constante mientras se añade el aglutinante o ligando de prueba a concentraciones variables para competir lejos de la sustancia marcada de su unión similar y determinar la concentración a la que la etiqueta se ve disminuida a la mitad.

[0016] El término "severidad" utilizado en el presente documento pretende ser una medida de la tendencia de un ligando a permanecer unido a una pareja de unión en lo que el ligando y la pareja de unión pueden ser multivalentes y la tendencia para asociaciones múltiples y los eventos de disociaci�n puedan tener lugar simultáneamente para un ligando específico. Por lo tanto, la severidad puede medirse por el aumento de la afinidad aparente de conformaciones multivalentes de una pareja de unión con una afinidad conocida.

[0017] El término "proteína que contienen Fc" o "molécula que contiene Fc" tal como se utiliza aquí, se refiere a una proteína monom�rica, dim�rica o heterodim�rica que tiene un dominio de unión a ligando y, al menos, una inmunoglobulina CH2 y un dominio CH3. Los dominios CH2 y CH3 pueden formar, al menos, una parte de la región dim�rica de la proteína / molécula (por ejemplo, anticuerpo).

[0018] El término "anticuerpo" pretende incluir anticuerpos, fragmentos de digestión, partes especificadas y las variantes de las mismas, incluyendo, de manera no limitante, los miméticos de anticuerpo o que comprende porciones de anticuerpos que imitan la estructura y / o la función de un anticuerpo o fragmento especificado o parte del mismo, y que mantiene las funciones mediadas por Fc, incluyendo de manera no limitante: la unión a receptores de Fc (por ejemplo FcγRI (CD64) FcγRIIA (CD32A), FcγRIIIA (CD16A) y FcRn) , el complemento de unión (por ejemplo, C1q), ADCC y CDC.

[0019] El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente es una forma específica de proteína de fusión que contiene Fc en la que el dominio de unión a ligando conserva una homología sustancial con, al menos, un anticuerpo de cadena ligera o pesada de dominio variable de, al menos, una especie de anticuerpo animal.

[0020] Las "funciones efectoras" de los anticuerpos o análogos de anticuerpos utilizadas en el presente documento son los procesos mediante los cuales los agentes pat�genos o células anormales, por ejemplo, las células tumorales, se destruyen y eliminan del cuerpo. Las respuestas inmune, innata y adaptativa utilizan la mayoría de los mismos mecanismos efectores para eliminar pat�genos, incluyendo ADCC, AC (activación del complemento), la unión de C1q y opsonizaci�n.

[0021] Tal y como se usa en este documento, el término "célula huésped" se refiere a cualquier tipo de sistema celular que pueda ser modificado para generar proteínas, fragmentos de proteínas, o p�ptidos de interés, incluyendo anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. Las células huésped incluyen, de manera no limitante, células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, tales como células CHO, células BHK, células NSO, células SP2 / 0, o células de hibridoma, células de levadura, y células de insectos, pero también células comprendidas dentro de un animal transg�nico o tejido cultivado.

[0022] El término "ácido si�lico" se refiere a cualquier miembro de una familia de azúcares carboxilados de nueve carbonos. El miembro más común de la familia del ácido si�lico es el ácido N - acetil neuram�nico (2 – ceto – 5 – acetamido – 3, 5 – didesoxi – D – glicero – D – galactonon - ácido I ulopiranosa – 1 - único (a menudo abreviado como Neu5Ac, NeuAc o NANA). Un segundo miembro de la familia es N – glicolil - neuram�nico (NGNA, Neu5Gc o NeuGc), en el que el grupo N - acetil de NeuAc est� hidroxilado. Esta forma es frecuente en las glicoprote�nas procedentes de roedores y microbios. Un tercer miembro de la familia del ácido si�lico es el ácido – 3 – desoxi - nonulos�nico 2 - ceto (KDN) (Nadano et al (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550 - 11557; Kanamori et al, J. Biol. Chem.

265: 21811 - 21819 (1990)). También se incluyen ácidos si�licos sustituidos por 9 tales como 9 - OC - C6 acilo Neu5Ac como 9 – O – lactil - Neu5Ac o 9 – O – acetil - Neu5 Ac, 9 – desoxi – 9 – fluoro - Neu5Ac y 9 azido - 9 -desoxi - Neu5Ac. Para la revisión de la familia del ácido si�lico, véanse, por ejemplo, Varki, Glycobiology 2: 25 - 40 (1992); Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer Verlag, Nueva York (1992)).

Descripci�n

[0023] Considerando que los presentes inventores han descubierto inesperadamente que el nivel de sialilaci�n de los oligosac�ridos Fc altera la afinidad de los anticuerpos terapéuticos producidos de forma recombinante para los receptores Fcγ, dando como resultado la modulación de diversos aspectos de las acciones biológicas de dichos anticuerpos. Más específicamente, se descubrió que los Abs altamente sialilados han reducido de manera significativa la afinidad por los receptores de baja afinidad, FcγRIIA (CD32A) y FcγRIIIa (CD16A), y tienen una actividad significativamente reducida ensayos ADCC in vitro en los que se cree FcγRIIIA que es el receptor relevante. Se descubrió además que Abs altamente sialilados han aumentado la afinidad por el receptor Fcγ de alta afinidad, FcγRI (CD64), y que las proteínas que contienen Fc completamente sialiladas han reducido la semidia en suero en comparación con las proteínas que contienen Fc asialiladas o parcialmente sialiladas. Se descubrió además que la eliminación (o la ausencia o la reducción de los niveles) de ácido si�lico en los oligosac�ridos Fc aumenta la severidad de los anticuerpos terapéuticos producidos de forma recombinante en su molécula diana. Estos descubrimientos y la información de apoyo se han descrito en las solicitudes en trámite U.S 60/ 695,769, 60/ 809,106, 60/ 841,153.

[0024] Aunque sin desear estar ligado a ninguna teoría, la eliminación del grupo est�tico cargado desde el oligosac�rido puede interpretarse como que permite una mayor flexibilidad en la estructura general de los anticuerpos, que la flexibilidad imparte una esfera ampliada de interacción potencial para la unión de los dos dominios en relación de uno a otro. La capacidad de un Ab para unirse bivalentemente a dos ep�topos de ant�geno depender� también de la accesibilidad ep�topo, la orientación, la densidad, y la movilidad. Cada señalar que el efecto de la sialilaci�n de unión al ant�geno también puede ser relevante para el Abs que reconocen ant�genos virales o bacterianos superficiales, e incluso ant�genos solubles que son homopol�meros, puesto que la flexibilidad de Ab puede determinar a qué moléculas Ab individuales se unen bivalentemente dentro de un complejo inmune soluble, donde no sólo podrían unirse algunos Abs a más de un ant�geno, sino que algunos de los ant�genos pueden unirse mediante más de un Ab.

[0025] La presente invención comprende un método para controlar las propiedades de una molécula que contiene Fc mediante la alteración de la sialilaci�n de los oligosac�ridos Fc y las moléculas que contienen Fc alteradas. El ácido si�lico tiene una carga neta negativa a pH fisiológico y, por lo tanto, podría esperarse que la presencia de ácido si�lico en el hidrato de carbono unido a Fc altere la estructura tridimensional y, por tanto, la conformación del dominio CH2 y por lo tanto afecta a la unión a Fc diversos ligandos o receptores. La molécula que contiene Fc alterada afecta a la afinidad de uno o más de los receptores de FcγRI, FcγRIIA, y FcγRIIIa, la actividad de ADCC, la activación de macr�fagos o de monocitos, y la semivida en suero.

Enriquecimiento de formas sialiladas de proteínas que contienen Fc

[0026] Un enfoque para preparar subgrupos de una proteína que contiene Fc particular que difieren en el contenido de ácido si�lico es tomar una preparación de proteína que contiene Fc con oligosac�ridos Fc heterogéneos, incluyendo moléculas tanto sialiladas como asialiladas, y pasarla a través de una columna que contiene una lectina inmovilizada con afinidad diferencial para los oligosac�ridos sialilados y asialilados. El flujo no vinculante (T, a través) o la fracción no unida la columna se pueden separar mediante la fracción unida (B, unido), este último recogió mientras pasa tampón de eluci�n a través de la columna. También puede ser posible recoger por separado una fracción débilmente unida o la fracción de la columna de retraso (R, retrasado), por ejemplo, mediante la recopilación de proteína que contiene Fc que se eluye durante el lavado continuado de la columna con el tampón de muestra original. Dependiendo de la lectina utilizada, la fracción no vinculante puede tener un contenido de ácido si�lico más alto o más bajo que la fracción que se une.

[0027] Los ejemplos de lectinas que pueden enriquecer las proteínas que contienen Fc sialilados o asialilados son la lectina de Maackia amurensis (MAA), que une específicamente oligosac�ridos con ácido si�lico terminal, y la aglutinina de lectina de germen de trigo (WGA), que une específicamente oligosac�ridos ya sea con ácido si�lico terminal o N - terminal acetilglucosamina (GlcNAc). Otro ejemplo es la lectina ricina I (RCA), que une oligosac�ridos con galactosa terminal. En el último ejemplo, la fracción de flujo a través de la no unión puede enriquecerse para las moléculas que contienen Fc sialiladas.

Modificaci�n enzim�tica de proteínas que contienen Fc

[0028] Un enfoque alternativo para la preparación de subgrupos de una proteína que contiene Fc que difieren en el contenido de ácido si�lico es tratar una parte de una preparación de proteína que contiene Fc con la enzima sialidasa, eliminando de este modo los ácidos si�licos. El material asialilado resultante puede compararse con el material original, parcialmente sialilado por las diferencias en la actividad biológica. Cuanto mayor sea el contenido de ácido si�lico en el lote original de proteína que contiene Fc, mayor es la probabilidad de detectar cualquier diferencia en la actividad biológica. Por ejemplo, si sólo el 10 % de los oligosac�ridos Fc en la preparación de proteína original contenía ácido si�lico, puede ser difícil de detectar diferencias en la actividad biológica después del tratamiento con sialidasa, puesto que el 0 – 1 % de los oligosac�ridos contienen ácido si�lico. La comparación de la actividad biológica de una proteína que contiene Fc antes y después del tratamiento con sialidasa ser� más difícil si el tratamiento de sialidasa da como resultado una distribución diferente de los oligosac�ridos fucosilados y afucosilados, ya que los niveles de fucosa tienen un profundo efecto en ciertas actividades biológicas, tales como la afinidad por humana FcγRIIIa y la actividad ADCC. Por ejemplo, si una reducción del contenido de ácido si�lico del 30 % de los oligosac�ridos al 0% da como resultado un aumento en la proporción de oligosac�ridos afucosilados del 5 % al 15 %, entonces no ser� posible atribuir diferencias en la actividad de ADCC únicamente a la disminución en el contenido de ácido si�lico. Tal efecto del tratamiento de sialidasa en la proporción relativa de oligosac�ridos fucosilados y afucosilados es posible (y se ha observado) debido a la diferencia en la sialilaci�n de oligosac�ridos fucosilados y afucosilados antes del tratamiento con sialidasa para eliminar residuos de ácido si�lico.

[0029] La sialilaci�n de oligosac�ridos presentes en la región Fc también se puede lograr utilizando métodos de glicosilaci�n in vitro. Utilizando estos métodos, es posible alcanzar glicoformas sialiladas al máximo de muestras de anticuerpo. En base del presente descubrimiento, las glicoformas sialiladas al máximo de anticuerpos u otros constructos que contienen Fc habrán reducido la semivida en suero en comparación con los anticuerpos asialilados

o menos sialilados. Por lo tanto, el método de la invención presenta un medio opcional para controlar tanto la homogeneidad de las glicoformas que comprenden anticuerpos como otras construcciones de proteínas recombinantes que contienen una región Fc de inmunoglobulina y los aspectos funcionales in vivo de dichos anticuerpos o constructos.

[0030] Las glicosiltransferasas naturalmente funcionan para sintetizar oligosac�ridos. Estas producen productos específicos con una excelente geometría estereoqu�mica y regioqu�mica. La transferencia de residuos de glicosilo se traduce en el alargamiento o la síntesis de un oligo-o polisac�rido. Se han descrito numerosos tipos de glicosiltransferasa, incluyendo sialiltransferasas, fucosiltransferasas, galactosiltransferasas, N acetilgalactosaminiltransferasas, N -acetilglucosaminiltransferasas y similares. Las glicosiltransferasas que son útiles incluyen, por ejemplo, α - sialiltransferasas, α - glucosiltransferasas, α - galactosiltransferasas, α -fucosiltransferasas, α - manosiltransferasas, α - xilosiltransferasas, α– N – acetilhexosaminiltransferasas, β -sialiltransferasas, β - glucosiltransferasas, β - galactosiltransferasas, β - fucosiltransferasas, β - manosiltransferasas, β - xilosiltransferasas, y β– N - acetilhexosaminiltransferasas, tales como las de Neisseria meningitidis, o de otras fuentes bacterianas, y los de rata, ratón, conejo, vaca, cerdo, fuentes humanas y de insectos y virus. Preferiblemente, la glicosiltransferasa es una enzima glicosiltransferasa variante de truncamiento en la que el dominio de unión a la membrana ha sido suprimido.

[0031] Las galactosiltransferasas ejemplares incluyen α (1,3) galactosiltransferasa (E.C. N�. 2.4.1.151, véase, por ejemplo, Dabkowski et al., Transplant Proc. 25: 2921 (1993) y Yamamoto et al. Nature 345: 229 -233 (1990)) y α (1,4) - Galactosiltransferasa (E.C. N� 2.4.1.38). Se pueden utilizar otras glicosiltransferasas, como sialiltransferasa. Una α (2,3) sialiltransferasa, a menudo referida como la sialiltransferasa, se puede utilizar en la producción de sialil lactosa o estructuras de orden superior. Esta enzima transfiere ácido si�lico (NeuAc) de ácido si�lico CMP a un residuo de Gal con la formación de un enlace α entre los dos sac�ridos. La unión (enlace) entre los sac�ridos es entre la posición 2 - de NeuAc y la posición 3 - de Gal. Una α (2,3) sialiltransferasa ejemplar conocida como α (2,3) sialiltransferasa (EC 2.4.99.6) transfiere ácido si�lico a la Gal terminal no reductora de un Galβ 1 → disac�rido o glic�sido 3Glc. Véase, Van den Eijnden et al., J. Biol. Chem., 256:3159 (1981), Weinstein y col., J. Biol. Chem., 257: 13845 (1982) y Wen et al., J. Biol. Chem., 267: 21011 (1992). Otra α– 2, 3 sialiltransferasa (EC 2.4.99.4) ejemplar transfiere ácido si�lico a Gal terminal no reductor del disac´arido o el gluc�sido. Véase Rearick et al., J. Biol. Chem.,

254: 4444 (1979) y Gillespie y col., J. Biol. Chem., 267: 21004 (1992). Otras enzimas ejemplares adicionales incluyen Gal –β - 1, 4 - GlcNAc α - 2, 6 sialiltransferasa (Véase Kurosawa et al. Eur. J. Biochem. 219: 375 - 381 (1994)).

[0032] Otras glucosiltransferasas particularmente útiles en la preparación de los oligosac�ridos son las manosiltransferasas, incluyendo α (1, 2) manosiltransferasa, α (1, 3) manosiltransferasa, β (1, 4) manosiltransferasa, Dol – P – Man sintasa, OCH1 y pMT1.

[0033] Sin embargo, otras glucosiltransferasas incluyen N - acetilgalactosaminiltransferasas incluyendo α (1, 3) N acetilgalactosaminiltransferasa, β (1, 4) N - acetilgalactosaminiltransferasas (Nagata et al J. Biol. Chem. 267: 12082 12089 (1992 ) y Smith et al. J. Biol. Chem. 269: 15162 (1994)) y el polip�ptido N - acetilgalactosaminiltransferasa (Homa et al. J. Biol. Chem. 268: 12609 (1993)). N -acetilglucosaminiltransferasas adecuadas incluyen GnTI (2.4.1.101, Hull et al., BBRC 176: 608 (1991)), GnTII, y GnTIII (Ihara et al. J. Biolchem. 113: 692 (1993)), GnTV (Shoreiban et al., J. Biol. Chem. 268: 15381 (1993)).

[0034] Para aquellas realizaciones en las que el método tiene que ser practicado a escala comercial, puede ser ventajoso inmovilizar la glicosiltransferasa sobre un soporte. Esta inmovilización facilita la eliminación de la enzima del producto y la posterior reutilización de la enzima. La inmovilización de glicosiltransferasas se puede lograr, por ejemplo, mediante la eliminación en la transferasa del dominio de unión a la membrana, y la fijación en su lugar de un dominio de unión a celulosa. Los expertos en la técnica entenderán que también se pueden utilizar otros métodos de inmovilización descritos en la literatura disponible.

[0035] Debido a que los sustratos aceptores pueden ser esencialmente cualquier monosac�rido u oligosac�rido con un residuo de sac�rido terminal para el que la glicosiltransferasa particular muestra especificidad, el sustrato puede estar sustituido en la posición de su extremo no reductor. Por lo tanto, el aceptor de glic�sido puede ser un monosac�rido, un oligosac�rido, un sac�rido marcado fluorescente, o un derivado de sac�rido, tal como un antibiótico aminogluc�sido, un gangli�sido, o una glicoprote�na incluyendo anticuerpos y otras proteínas que contienen Fc. En un grupo de realizaciones preferidas, el aceptor gluc�sido es un oligosac�rido, preferiblemente, Galβ (1 - 3) GlcNAc, Galβ (1 - 4) GlcNAc, Galβ (1 - 3) GalNAc, Galβ (1 - 4) GalNAc, Man α (1, 3)Man, Man α (1, 6)Man o GalNAcβ (1 – 4) - manosa. En una forma de realización particular preferida, el oligosac�rido aceptor est� unido al dominio CH2 de una proteína que contiene Fc.

[0036] El uso de sustrato de azúcar activado, es decir, fosfato de nucle�sido de azúcar, puede evitarse, ya sea usando una reacción de regeneración simultáneamente con la reacción de la glicotransferasa (también conocido como sistema de reciclaje). Por ejemplo, como se enseña en, por ejemplo, la Patente U.S 6.030.815, un sistema de reciclado de ácido si�lico sintetasa CMP utiliza ácido si�lico CMP para reponer el ácido si�lico CMP (CMP - NeuAc), ya que reacciona con un aceptor de sialiltransferasa en presencia de una α (2, 3) sialiltransferasa para formar el sialilsac�rido. El sistema de regeneración del ácido si�lico CMP descrito en la presente invención comprende el monofosfato de citidina (CMP), un trifosfato de nucle�sido (por ejemplo, adenosina trifosfato (ATP), un donante fosfato (por ejemplo, fosfoenolpiruvato o fosfato de acetilo), una quinasa (por ejemplo, piruvato quinasa o quinasa de etilo) capaz de transferir el fosfato desde el donador de fosfato de nucle�sidos difosfatos y un monofosfato de nucle�sido quinasa (por ejemplo, mioquinasa) capaz de transferir el fosfato terminal desde un nucle�sido trifosfato a CMP. La α (2, 3) sialiltransferasa y la ácido si�lico CMP sintetasa también se pueden ver como parte del sistema de regeneración de ácido si�lico CMP ya que la eliminación del ácido si�lico activado sirve para mantener la velocidad de avance de la síntesis. La síntesis y el uso de compuestos de ácido si�lico en un procedimiento de sialilaci�n utilizando un fag�mido que comprende un gen para una enzima sintetasa de ácido si�lico CMP modificado se describen en la solicitud internacional WO 92/16640, publicada el 1 de octubre de 1992.

[0037] Un método alternativo de preparación de oligosac�ridos es a través del uso de una glicosiltransferasa y derivados glicosilo activados como azúcares donantes obviando la necesidad de nucleótidos de azúcar como azúcares donantes tal como se enseña en la Patente U.S. 5952203. Los derivados de glicosil activados actúan como suplentes de los sustratos de origen natural, que son nucleótidos de azúcar caros, normalmente nucleótidos difosfoaz�cares o monofosfoaz�cares en los que el fosfato de nucleótido est� ligado al α en la posición 1 del azúcar.

[0038] Los derivados de glic�sido activados que son útiles incluyen un grupo saliente activado como, por ejemplo, flúor, cloro, bromo, éster tosilato, mesilato de éster, éster triflato y similares. Las realizaciones preferidas de los derivados de glic�sido activados incluyen fluoruros de glicosilo y mesilatos de glicosilo, siendo particularmente preferidos los fluoruros de glicosilo. Entre los fluoruros de glicosilo, son preferibles el fluoruro de α - galactosilo, fluoruro de α - manosilo, fluoruro de α - glucosilo, fluoruro de α - fucosiltransferasa, α - xilosilofluoruro, fluoruro de α -sialil, fluoruro de alfa – N - acetilglucosaminil, fluoruro de α– N - acetilgalactosaminil, fluoruro de β - galactosilo, fluoruro de β - manosilo, fluoruro de β - glucosilo, fluoruro de β - fucosilo, fluoruro de β - xilosilo, fluoruro de beta – sialil, fluoruro de β– N - acetilglucosaminil y fluoruro de β– N - acetilgalactosaminil.

[0039] Los fluoruros de glicosilo pueden prepararse a partir del azúcar por primera acetilaci�n el azúcar y luego tratándolo con HF / piridina. Los fluoruros de glicosilo acetilados pueden desprotegerse mediante una reacción con leve (catalítica) base en metanol (por ejemplo, NaOMe / MeOH). Además, muchos fluoruros de glicosilo est�n disponibles comercialmente. Otros derivados de glicosilo activados se pueden preparar usando métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los mesilatos de glicosilo se pueden preparar mediante el tratamiento de la forma hemiacetal totalmente bencilada del azúcar con cloruro de mesilo, seguido de hidrogenación catalítica para eliminar los grupos bencilo.

[0040] Un componente adicional de la reacción es una cantidad catalítica de un fosfato de nucle�sido o análogo del mismo. Los monofosfatos de nucle�sidos que son adecuados para su uso incluyen, por ejemplo, monofosfato de adenosina (AMP), citidina monofosfato (CMP), uridina monofosfato (UMP), el monofosfato de guanosina (GMP), inosina monofosfato (IMP) y monofosfato de timidina (TMP). Trifosfatos de nucle�sido adecuados para uso incluyen trifosfato de adenosina (ATP), trifosfato de citidina (CTP), la uridina trifosfato (UTP), la guanosina trifosfato (GTP), la inosina trifosfato (ITP) y la timidina trifosfato (TTP). Un nucle�sido trifosfato preferido es el UTP. Preferiblemente, el fosfato de nucle�sido es un nucle�sido difosfato, por ejemplo, difosfato de adenosina (ADP), difosfato de citidina (CDP), uridina difosfato (UDP), guanosina difosfato (GDP), difosfato de inosina (IDP) y difosfato timidina (TDP). Un Nucl-preferido difosfato eoside es UDP. Como se se�al� anteriormente, la divulgación también se puede practicar con un análogo de los fosfatos de nucle�sidos. Los análogos adecuados incluyen, por ejemplo, sulfatos y sulfonatos de nucle�sidos. Sin embargo, otros análogos incluyen fosfatos sencillos, por ejemplo, pirofosfato.

[0041] Un procedimiento para modificar proteínas recombinantes producidas en, por ejemplo, células murinas en las que predomina la forma hidroxilada del ácido si�lico (NGNA), es tratar la proteína con sialidasa, para eliminar el ácido si�lico de tipo NGNA, seguido de galactosilaci�n enzim�tica usando el reactivo UDP - Gal y betal, 4 Galtransferasa para producir glicoformas G2 altamente homogéneas. La preparación puede entonces, opcionalmente, tratarse con el reactivo CMP - NANA y alfa - 2, 3 sialiltransferasa para dar glioformas G2S2 altamente homogéneas.

[0042] Cuando se desea la supresión o eliminación de grupos de ácido si�lico de los glicanos adjuntos a la región Fc de anticuerpos o moléculas que contienen Fc, se puede utilizar una sialidasa. Se conocen en la disciplina numerosas sialidasas de diversa especificidad. Se ha identificado una célula sialidasa de CHO soluble (Ferrari et al, 1994, Glycobiology 4: 367 -373) y, si se filtra en el medio de cultivo puede ser responsable de la eliminación extracelular del si�lico en los glicanos de las proteínas recombinantes. Por lo tanto, es posible que puedan tener lugar adiciona y eliminaciones de grupos de ácido si�lico durante la producción de proteínas recombinantes que pueden explicar las estructuras de glicano variables y heterogéneas en proteínas producidas a partir de líneas celulares CHO.

[0043] Las sialidasas (neuraminidasas) se han aislado y clonado a partir de una variedad de especies de bacterias en el hombre con diferentes especificidades para los sustratos, por ejemplo, glicoprote�nas, glicol�pidos, y gangli�sidos y los vínculos. Las enzimas con amplia especificidad para el tipo de grupo est�tico, por ejemplo, ácidos neuram�nicos hidroxilado (NGNA) o no hidroxilados y enlaces que pueden ser ácidos si�licos α2, 3 -, α2, 6 -, o α2 ,8

-

y ramificados unidos a un residuo interno; incluyen los de Clostridium perfringens y sialidasas de Arthrobacter ureafaciens (sialidasa A, N - acetilneuraminato glicohidrolasa; CE 3.2.1.18). Las enzimas purificadas est�n disponibles comercialmente en, por ejemplo, Prozyme, Inc, San Leandro, CA. La secuencia nucle�tida de un gen de sialidasa ureafaciens ha sido clonado (N� de acceso NCBI AY934539) por Lundbeck et al. 2005. Biotechnolo. Appl. Bochem 41: 225 - 231.

[0044] Utilizando los métodos bien conocidos en la técnica, las células huésped que segregan enzimas capaces de actuar en oligosac�ridos extracelulares pueden ser construidas como se enseña en, por ejemplo US7, 026,152 para los cultivos capaces de producir etanol mediante azúcares de fermentación liberados por endogulcanasas secretadas. Lundbeck et al. (Supra) expres� una forma truncada de la sialidasa A que era capaz de eliminar residuos de ácido si�lico de mute�nas de eritropoyetina recombinante. La modificación de una célula huésped de mamífero capaz de expresar un anticuerpo terapéutico u otra proteína que contiene Fc y desialilaci�n simultánea de esa proteína expresada en el medio extracelular no se ha demostrado. La invención demuestra que la forma soluble de sialidasa A se puede coexpresar por las células productoras de anticuerpos, y el producto anticuerpo resultante recuperado a partir de cultivos de dichas células ha reducido el contenido de ácido si�lico en su parte Fc de las moléculas. Los anticuerpos mejorados de ácido si�lico producidos de esta manera han mejorado la actividad de ADCC en comparación con los anticuerpos producidos por las líneas celulares convencionales.

Caracterizaci�n estructural de las variantes de ácido si�lico

[0045] Para la caracterización estructural de las variantes de ácido si�lico que contienen oligosac�ridos, las preparaciones de glicoprote�na incluidas las preparaciones de anticuerpos fueron tratadas con p�ptido – N -glicosidasa F para liberar los oligosac�ridos unidos a N -. La enzima p�ptido – N - glucosidasa F (PNGasa F) escinde asparagines unidos a oligosac�ridos. Los oligosac�ridos liberados se marcaron fluorescentemente con ácido antran�lico (ácido 2 - aminobenzoico), se purificaron y se analizaron por HPLC como se describe (véase Anumula, K.

R. y Dhume ST Glycobiology 1998 julio; 8 (7): 685 - 94). Como se muestra en la Figura 3, los oligosac�ridosac�ridos separados como G0, G1, G2, G2S1 y G2S2 en el cromatograma se pueden detectar y cuantificar. La especies aglicosiladas, naturalmente desprovistas de glicanos o que han sido despojadas química o enzim�ticamente de glicanos se denominan Gno.

Caracterizaci�n Biológica de las variantes de ácido si�lico

[0046] Las proteínas que contienen Fc se pueden comparar por funcionalidad mediante varios ensayos in vitro bien conocidos. En particular, la afinidad para los miembros de la familia de los receptores de Fcγ, FcγRI, FcγRII y FcγRIII es de interés. Estas mediciones se podrían realizar utilizando formas solubles recombinantes de los receptores o las formas asociadas a células de los receptores. Además, la afinidad para FcRn, el receptor responsable de la semivida prolongada en circulación de IgG se puede medir, por ejemplo, mediante BIAcore usando FcRn soluble recombinante. Ensayos funcionales basados en células, como los ensayos de ADCC y ensayos de los CDC, proporcionan una visión de las consecuencias funcionales probables de determinadas estructuras variantes. En una realización, el ensayo de ADCC est� configurado para tener células NK que actúan como la célula efectora primaria, reflejando as� los efectos funcionales en el receptor de FcγRIII. Los ensayos de fagocitosis también se pueden usar para comparar las funciones efectoras inmunes de diferentes variantes, como ensayos CaN que miden las respuestas celulares, tales como la liberación de mediador super�xido o inflamatorios.

Ensayos de afinidad y severidad

[0047] Los anticuerpos, que son naturalmente multivalentes, pueden ser probados para determinar varios parámetros de la unión a proteínas diana. Un formato conveniente para la determinación de una Kd aparente es el ELISA (ensayo de inmunoabsorci�n ligado a enzimas) o RIA (radioinmunoensayo). "ELISA" se ha convertido en un método generalmente utilizado para referirse a un ensayo de unión realizado en un soporte sólido usando métodos de detección indirecta. Generalmente, en un ELISA, los analitos solubles se eliminan de la solución después de unirse específicamente a los reactivos en fase sólida. En el método, los reactivos de fase sólida se preparan mediante la adsorción de un ant�geno o anticuerpo en placas de microtitulaci�n de plástico; En otros métodos, los reactivos de fase sólida son moléculas asociadas a células. En todos los protocolos, los reactivos de fase sólida se incuban con reactivos secundarios o terciarios covalentemente acoplados a una enzima. Los conjugados no unidos se eliminan mediante lavado y se añade un sustrato cromog�nico o fluorog�nico. A medida que el substrato es hidrolizado por la enzima conjugado unido, se genera un producto coloreado o fluorescente. Finalmente, el producto se detecta visualmente o con un lector de placas de microtitulaci�n. La intensidad de la señal generada es proporcional a la cantidad de analito inicial en la mezcla de ensayo.

[0048] En una variación del ensayo en fase sólida, un ant�geno puede ser inmovilizado indirectamente o capturado, por ejemplo, utilizando un anticuerpo de captura inmovilizado que reconoce un dominio irrelevante en el ant�geno o mediante el uso de un anticuerpo u otro ligando que se une una "etiqueta" mediante modificación genética en la proteína diana, por ejemplo, una secuencia de polihistidina.

[0049] Un método alternativo para medir la unión de anticuerpos contra ant�genos de superficie es mediante el uso de células enteras que expresan (natural o mediante modificación genética) un ant�geno en la superficie celular. Las células se incuban con una solución de prueba que contiene el anticuerpo primario. El anticuerpo no unido se elimina por lavado y las células se incuban a continuación con una enzima conjugada con anticuerpos específicos para el anticuerpo primario. La enzima conjugada no unida se elimina mediante lavado y se agrega solución de sustrato. El nivel de anticuerpo primario unido es proporcional a la cantidad de hidrólisis del sustrato. Esta ser� cuantitativa si el número de células por unidad de volumen se mantiene constante. Como alternativa, puede hacerse la detección utilizando un ligando radiomarcado a través de unión directa o competición como se describió anteriormente. Los protocolos para los ensayos de ELISA se encuentran en, por ejemplo, Ausubel, FM et al. Current Protocols in Molecular Biology. 2003 John Wiley & Sons, Inc.

[0050] La velocidad de unión, las velocidades de asociación y velocidades de disociaci�n también se pueden medir usando la tecnología BIAcore que utiliza un aglomerante en fase sólida o un ligando y un aglomerante en fase de solución móvil o un ligando detectado por resonancia de plasm�n superficial.

M�todos para la evaluación de la función efectora

[0051] El papel de la glicosilaci�n de anticuerpos en la depuración, y por lo tanto, la farmacocin�tica de las proteínas que contienen Fc terapéutico parece mínima; la unión al receptor Fc neonatal (FcRn) se consider� responsable de la eliminación de la IgG de la circulación, parece que no se altera por la falta del oligosac�rido N ligado en la parte Fc de un anticuerpo.

[0052] Los receptores Fc de Ila gG (FCR) que enlazan las respuestas inmunes mediadas por anticuerpos de IgG con funciones efectoras celulares incluyen los receptores Fc - gamma: FcRI (CD64), FcRII (CD32) (FcRIIA y FCRIIB), y FcRIII (CD16) . Los tres se encuentran en monocitos. Sin embargo, la elaboración de estos receptores en las diferentes células diana parece ocurrir diferencialmente y en respuesta a otros factores. Por lo tanto, la medición de la afinidad de Fc modificado con glicosilaci�n contiene bioterap�uticos para los receptores Fc – gamma, es una medición apropiada para la predicción de las funciones efectoras mejoradas.

[0053] Se ha indicado que los Abs de IgG1humanas con bajos niveles de fucosa en sus glicanos Fc tienen una mayor afinidad para FcR CD16 humano y mejoraron de manera espectacular en la actividad in vitro en los ensayos ADCC utilizando células efectoras CMSPs humanas (Shinkawa et al. J. Biol. Chem. 278 (5): 3466 - 3473, 2003; Escudos et al. J Biol Chem. 277 (30): 26733 - 26740, 2002; Uma�a et al., Nat. Biotech 17: 176 - 180,1999).

[0054] Un método de evaluación de las funciones efectoras utilizando el ensayo ADCC in vitro se puede realizar de una manera cuantitativa. Por lo tanto, un ensayo in vitro puede diseñarse para medir la capacidad del anticuerpo unido para provocar la destrucción de la célula que muestra su ligando af�n para la correcta selección de las líneas celulares efectoras y diana y la evaluación de las células "asesinas" ya sea por la incapacidad de las células para seguir dividiendo o por la liberación de los contenidos internos, por ejemplo, liberación de Cr51. La célula diana puede ser una línea celular que normalmente expresa un ligando diana para el anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, o una proteína de fusión o se pueden modificar para expresar y retener la proteína diana en su superficie. Un ejemplo de dicha línea de celular modificada es la célula K2, una línea celular de mieloma de ratón Sp2 / 0 que se expresa de forma estable en el FNT humano recombinante superficial que permanece como forma de transmembrana debido a la introducción de una deleci�n de 1-12 amino�cidos de la citoquina madura (Pérez et al., Cell 63: 251 - 258, 1990). Esta línea celular es útil para evaluar las alteraciones en la actividad ADCC de los anticuerpos anti -FNT, de los fragmentos de los anticuerpos, o de las proteínas de fusión que se dirigen al anti – FNT alfa modificado que tiene dominios Fc o actividad en el dominio Fc.

[0055] Las células efectoras para el ensayo de actividad ADCC in vitro pueden ser CMSP (células monoc�ticas de sangre periférica) de fuente humana o de otro mamífero. Las células efectoras de CMSP pueden aislarse justo después de la extracción de sangre de los donantes por los métodos aprobados. Otras células monoc�ticas o de macr�fagos que se pueden usar son las derivadas de los fluidos de efusión, tales como exudados peritoneales.

[0056] Est�n también disponibles los modelos in vivo para la medición de las funciones inmunes celulares. Por ejemplo, los anticuerpos anti - CD3 pueden usarse para medir la activación de células T en ratones, ya que la activación de células T depende de la manera en la que el dominio Fc del anticuerpo se acopla a los receptores específicos Fcγ. In vitro, se comparar� la actividad anti - tumoral de una versión de fucosa elevada y una baja de un híbrido de Ab de IgG1 humana contra el receptor 4 de quimiocinas CC, no se observ� diferencias en su actividad ADCC in vitro (utilizando células efectoras de ratón), sin embargo, el Ab de baja fucosa mostr� una eficacia más potente in vivo. No se proporcionaron células efectoras humanas y los ratones retuvieron las células NK end�genas (Niwa et al. Cancer Res. 64: 2127 - 2133, 2004). Como el receptor CD16 en las células NK humanas ha demostrado una mayor sensibilidad en los niveles de fucosa de los Abs de IgG1, estos datos sugieren que un mecanismo distinto de lo que se ha estudiado en las células efectoras humanas est� funcionando en ratones. Una posibilidad es el receptor CD16 – 2 de ratón descubierto recientemente (Mechetina et al. Inmun�geno 54: 463 -468, 2002). El dominio extracelular del ratón CD16 - 2 tiene una identidad de secuencia significativamente más alta en el CD16A humana (65%) que la del receptor CD16 de ratón que mejor se conoce, lo que sugiere que puede ser más sensible a los niveles de fucosa de las IgG qu cuando se se une a CD16 de ratón. Su expresión se indica en las células J774 de tipo macr�fago en ratón, es consistente con la posibilidad de que los macr�fagos de ratón que expresan CD16 - 2 puedan ser responsables de la mayor actividad anti -tumoral por el Ab de baja fucosa descrito por Niwa et al. (2004). Por lo tanto, el estudio de la unión al receptor Fc por las proteínas que contienen Fc de tipo IgG1 humana en las células efectoras murinas no es predictiva.

Procesos de producción de proteínas

[0057] Diferentes procesos involucrados con la producción de proteínas que contienen Fc pueden afectar a la estructura de oligosac�ridos Fc, incluyendo el ácido si�lico. En una realización, las células huésped que secretan la proteína que contiene Fc se cultivan en presencia de suero, por ejemplo, suero bovino fetal (SBF), que no se sometió anteriormente a un tratamiento de calor elevado (por ejemplo, 56 �C durante 30 minutos). Esto puede dar como resultado una proteína que contiene Fc que no contiene, o contiene cantidades muy bajas, ácido si�lico, debido a la presencia natural en el suero de las enzimas de sialidasa activas que pueden eliminar el ácido si�lico de las proteínas que contienen Fc secretadas a partir de esas células. En otra realización, las células que secretan la proteína que contiene Fc se cultivan en presencia de suero que se sometió a un tratamiento de calor elevado, inactivando as� las enzimas sialidasa, o en ausencia de suero o de otros componentes del medio que pueden contener enzimas sialidasa, de tal manera que la proteína que contiene Fc tiene los niveles más altos de ácido si�lico, para aplicaciones (por ejemplo, indicaciones terapéuticas) cuando podría ser deseable.

[0058] En otra realización, se establecieron las condiciones utilizadas para purificar y los procesos adicionales de proteínas que contienen Fc que favorecerán al contenido óptimo de ácido si�lico. Por ejemplo, ya que el ácido si�lico es l�bil al ácido, la exposición prolongada a un bajo entorno de pH, por ejemplo después de la eluci�n de una columna de cromatograf�a de proteína A o durante los procesos de inactivaci�n viral, puede dar lugar simultáneamente a una reducción en el contenido de ácido si�lico.

C�lulas huésped modificadas

[0059] Tal y como se describe en la presente, la célula huésped elegida para la expresión de la proteína que contiene Fc recombinante o anticuerpo monoclonal es una importante contribuyente a la composición final, incluyendo, sin limitación, la variación en la composición de los restos de oligosac�ridos que decoran la proteína en el dominio CH2 de la inmunoglobulina. Por lo tanto, un aspecto de la invención implica la selección de células huésped apropiadas para su uso y / o desarrollo de una célula de producción que expresa la proteína terapéutica deseada.

[0060] En una realización, la célula huésped es una célula naturalmente deficiente o carente de sialiltransferasas. En otra realización, la célula huésped se modifica o se trata genéticamente con el fin de ser desprovista de sialiltransferasas. En otra realización, la célula huésped es una línea de células huésped derivada seleccionada para expresar niveles reducidos o indetectables de sialiltransferasas. En otra realización, la célula huésped est� naturalmente desprovista de, o est� modificada o tratada genéticamente para ser desprovista de, la sintetasa de ácido si�lico CMP, la enzima que cataliza la formación de ácido si�lico CMP, que es la fuente de ácido si�lico utilizada por la sialiltransferasa para transferir ácido si�lico al anticuerpo. En una realización relacionada, la célula huésped puede estar naturalmente desprovista de, o est� modificada o tratada genéticamente para ser desprovista de, la sintetasa de ácido pir�vico, la enzima que forma ácido si�lico a partir de ácido pir�vico.

[0061] En una realización adicional, la célula huésped puede estar naturalmente desprovista de, o est� modificada

o tratada genéticamente para ser desprovista de, galactosiltransferasas, de tal manera que los anticuerpos expresados en dichas células carecen de galactosa. Sin galactosa, no se unir� el ácido si�lico. En una realización aparte, la célula de la célula huésped puede sobreexpresarse naturalmente, o ser modificada genéticamente para sobreexpresar, una enzima sialidasa que elimina el ácido si�lico de los anticuerpos durante la producción. Dicha enzima sialidasa puede actuar intracelularmente en anticuerpos antes de que los anticuerpos se secreten o est�n secretados en el medio de cultivo y actúe sobre los anticuerpos que ya han sido secretados en el medio. Los métodos de selección de líneas celulares con glicosilasas alteradas y que expresan glicoprote�nas con composiciones de carbohidratos alterados se han descrito en (Ripka y Stanley, 1986 Somatic Cell Mol Gen 12: 51 62;. US2004 / 0132140). Los métodos de células huésped modififcadas para producir anticuerpos con patrones de glicosilaci�n alterados dan lugar a una ADCC mejorada que se ha demostrado en, por ejemplo la Patente U.S. 6.602.864, en la que las células huésped albergan un ácido nucleico que codifica al menos una glicoprote�na que modifica la glicosiltransferasa, específicamente β (1,4) – N – acetil – glucosaminil - transferasa III (GnTIII).

[0062] Otros enfoques para la modificación genética de las propiedades de glicosilaci�n de una célula huésped mediante la manipulación de la glicosiltransferasa de la célula huésped implica la eliminación o supresión de la actividad, como se indica en el documento EP1. 176.195, específicamente, alfa, 6 fucosiltransferasa (producto g�nico FUT8). Sería obvio para un experto en la técnica poner en práctica los métodos de modificación de células huésped en otro de los ejemplos específicos citados anteriormente. Además, la célula huésped modificada puede ser de origen mamífero o se puede seleccionar de los grupos formados por mieloma, linfoma, levadura, células de insecto o vegetales, o cualquier células derivada, inmortalizada o transformada de las mismas.

[0063] En otra realización, el método de supresión o eliminación de la actividad de la enzima requiere la unión de ácido si�lico que puede seleccionarse del grupo formado por silenciamiento g�nico, tal como el uso de siRNA, knockout genético, o adición de un inhibidor enzim�tico, tal como la co - expresión de un Ab intracelular o p�ptido específico para la enzima que une y bloquea su actividad enzim�tica, y otras técnicas de modificación genética conocidas. En otra realización, un método para mejorar la expresión o la actividad de una enzima que bloquea la unión de ácido si�lico, o una enzima sialidasa que elimina los ácidos si�licos que ya est�n unidos, puede seleccionarse del grupo formado por transfecciones con genes de enzimas recombinantes, factores de transfecciones o de transcripción que mejoran la síntesis de ARN de la enzima, o las modificaciones genéticas que mejoran la estabilidad del ARN de la enzima, dando lugar a una mayor actividad de las enzimas, tales como sialidasas, que dan lugar a niveles más bajos de ácido si�lico en el producto purificado. En otra realización, los inhibidores de enzimas específicas se pueden añadir al medio de cultivo celular.

Anticuerpos

[0064] Un anticuerpo descrito en el presente documento puede incluir o derivarse de cualquier mamífero, tales como, pero no limitandose a, un ser humano, un ratón, un conejo, una rata, un roedor, un primate, o cualquier combinación de los mismos e incluye anticuerpos de humanos aislados, primates, roedores, mamíferos, híbridos, humanizados y / o anticuerpos anti - integrina injertados en CDR, inmunoglobulinas, productos de escisión y otras partes especificadas y variantes de los mismos. La descripción también se refiere a la codificación de anticuerpos o ácidos nucleicos complementarios, vectores, células huésped, composiciones, formulaciones, dispositivos, animales transg�nicos, plantas transg�nicas, y métodos de fabricación y utilización de los mismos, tal y como se describe en el presente documento conjuntamente junto a lo que se conoce en la técnica.

[0065] La presente invención proporciona además células, líneas celulares, y cultivos celulares que expresan una inmunoglobulina o fragmento de los mismos capaces de la glicosilaci�n en un dominio CH2 que se une un ant�geno, una citoquina, una integrina, un anticuerpo, un factor de crecimiento, una ant�geno de superficie que es un marcador de linaje y diferenciación celular, una hormona, una proteína receptora o de fusión de la misma, una proteína de sangre, una proteína implicada en la coagulación, cualquier fragmento de las mismas, y cualquier análogo estructural o funcional de cualquiera de los anteriores. En una realización preferida, la inmunoglobulina, fragmento o derivado del mismo se une a un ant�geno en la superficie de una célula diana. En una realización particularmente preferida, la célula diana es una célula tumoral, una célula de la vulatura del tumor, o una célula inmune. En una realización específica, la inmunoglobulina, fragmento o derivado del mismo se une a FNT, una integrina, un ant�geno de células B, o un factor tisular.

[0066] En otra realización, las células, líneas celulares, y cultivos celulares de la presente invención pueden expresar de forma detectable una proteína de fusión que comprende un factor de crecimiento u hormona. Ejemplos de los factores de crecimiento contemplados por la presente invención incluyen, pero no se limitan a, un factor de crecimiento humano, un factor de crecimiento derivado de plaquetas, un factor de crecimiento epid�rmico, un factor de crecimiento de fibroblastos, un factor de crecimiento nervioso, una gonadotropina cori�nica humana, una eritropoyetina, una trombopoyetina, una proteína morfog�nica ósea, un factor de crecimiento transformante, un factor de crecimiento similar a la insulina, o un p�ptido similar al glucag�n, y cualquier análogo estructural o funcional de los mismos.

[0067] Los anticuerpos aislados de la invención incluyen aquellos que tienen isotipos de anticuerpos con actividad ADCC, especialmente IgG1 humana, (por ejemplo, IgG1kappa y IgG1lamda), y, menos preferidos son IgG2 e IgG3,

o isotipos híbridos que contienen residuos alterados en los residuos específicos en los dominios Fc que son sus homólogos de otras especies. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos completos (por ejemplo, IgG1) o pueden incluir sólo una parte de unión al ant�geno y una parte Fc o dominio capaz de obtener funciones efectoras incluyendo ADCC, activación del complemento, y unión de C1q.

[0068] Además, el fragmento de inmunoglobulina producido por las células, líneas celulares, y cultivos celulares de la presente invención puede incluir, pero no est� limitado a Fc u otras estructuras que contienen dominio CH2 y cualquier análogo estructural o funcional de los mismos. En una realización, el fragmento de inmunoglobulina es un polip�ptido de fusión del dominio receptor dim�rico. En una realización específica, el polip�ptido de fusión del dominio receptor dim�rico es Etanercept. El etanercept es una molécula recombinante, soluble del receptor FNT α que se administra por vía subcutánea y se une a TNFα en el suero del paciente, volviéndolo biol�gicamente inactivo. El etanercept es una proteína de fusión dim�rica que consiste en la parte de unión al ligando extracelular del receptor del factor de necrosis tumoral (RFNT) humano de 75 kilodaltones (p75) ligado a la parte Fc de la IgG1 humana. El componente Fc de etanercept contiene el dominio CH2, el dominio CH3 y la región bisagra, pero no el dominio CH1 de la IgG1.

[0069] Otros productos dispuestos para su fabricación utilizan las líneas celulares de la invención que incluyen proteínas terapéuticas o profilácticas actualmente fabricadas por otros tipos de líneas celulares animales y que tienen un CH2 capaz de ser glicosilado. Particularmente preferidas son aquellas proteínas terapéuticas, glicosiladas, proteínas que contienen dominio CH2 que se unen a ant�genos diana en una superficie celular, esta célula es conveniente para incapacitar o eliminar del cuerpo. Un número de dichos anticuerpos terapéuticos est� modificado para contener la IgG1 humana, especialmente la IgG1, la cadena pesada que comprende un dominio CH1, CH2 y CH3 humano. Tales proteínas terapéuticas incluyen, pero no se limitan a las descritas a continuación en la presente.

[0070] El infliximab se vende ahora como REMICADE�. Infliximab es un anticuerpo monoclonal quimérico de la IgG1k con un peso molecular aproximado de 149.100 daltones. Se compone de regiones constantes constantes humanas y regiones variables murinas. Infliximab se une específicamente al factor de necrosis tumoral humano alfa (FNT (alfa)) con una constante de asociación de 1010 M-1. Infliximab neutraliza la actividad biológica del FNT (alfa) mediante la unión con alta afinidad a las formas solubles y de transmembrana del FNT (alfa) e inhibe la unión del FNT (alfa) con sus receptores. Las células que expresan la transmembrana del FNT (alfa) unido por infliximab se pueden lisar in vitro o in vivo. El infliximab est� indicado para el tratamiento de la artritis reumatoide, la enfermedad de Crohn, y espondilitis alquilosante. Infliximab se administra en dosis de 3 a 5 mg / kg administradas como una infusión intravenosa, seguida con dosis similares adicionales a las 2, 6, y / o 8 semanas a partir de entonces, y a intervalos cada 8 semanas, dependiendo de la enfermedad a tratar. Daclizumab (vendido como Zenapax�) es un inmunosupresor, un anticuerpo monoclonal de IgG1 humanizado producido por tecnología de ADN recombinante que se une específicamente a la subunidad alfa (alfa p55, CD25, o subunidad Tac) del receptor de de la interleucina -2 de alta afinidad humano (IL - 2 ) que se expresa en la superficie de los linfocitos activados. Dacli - zumab es un anticuerpo híbrido de ratón – humano injertado en las regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Las secuencias humanas se derivaron de los dominios constantes de la IgG1 humana y las regiones marco variables del anticuerpo de mieloma Eu. Las secuencias murinas se derivaron de las CDRs de un anticuerpo anti - Tac murino. Daclizumab est� indicado para la profilaxis del rechazo agudo de órganos en pacientes que reciben trasplantes renales y se utiliza generalmente como parte de un régimen inmunosupresor que incluye ciclosporina y corticosteroides.

[0071] El basiliximab (vendido como SIMULECT�) es un anticuerpo monoclonal híbrido (murino / humano) producido por la tecnología de ADN recombinante, que funciona como un agente inmunosupresor, que se une específicamente a y bloquea el receptor de la interleucina - 2 (alfa) - cadena (IL -2R (alfa), también conocido como ant�geno CD25) en la superficie de los linfocitos T activados. Basándose en la secuencia de amino�cidos, el peso molecular calculado de la proteína es de 144 kilodaltones. Es una glicoprote�na obtenida a partir de la fermentación de una línea celular de mieloma de ratón establecida por modificación genética para expresar pl�smidos que contienen los genes de la región constante de la cadena pesada y ligera humana (IgG1) y los genes de la región variable de la cadena ligera y pesada de ratones que codifica el anticuerpo RFT5 que se une selectivamente a la IL 2R (alfa). El basiliximab est� indicado para la profilaxis del rechazo agudo de órganos en pacientes que recibieron un trasplante renal cuando se utilizó como parte de un régimen inmunosupresor que incluye ciclosporina y corticosteroides.

[0072] El adalimumab (vendido como HUMIRA�) es un anticuerpo monoclonal IgG1 humana recombinante específico para el factor de necrosis tumoral humano (FNT). El adalimumab se ha creado utilizando la tecnología de expresión en fago dando lugar a un anticuerpo con regiones variables de cadena pesada y ligera derivadas de humanos y regiones constantes kappa de IgG1 humana. HUMIRA� est� indicado para reducir los signos y síntomas e inhibir la progresión del daño estructural en pacientes adultos con artritis reumatoide de moderada a severamente activa que han tenido una respuesta inadecuada a uno o más DMARDs. HUMIRA� puede utilizarse solo o en combinación con MTX u otros DMARDs.

[0073] El rituximab (vendido como RITUXAN�) es un anticuerpo monoclonal híbrido murino / humano modificado genéticamente dirigido contra el ant�geno CD20 hallado en la superficie de linfocitos B normales y malignos. El anticuerpo es una inmunoglobulina kappa IgG1 que contiene secuencias de la región variable de cadena ligera y pesada murina y las secuencias de la región constante humana. Rituximab tiene una afinidad de unión para el ant�geno CD20 de aproximadamente de 8,0 nM. Rituximab est� indicado para el tratamiento de los pacientes con bajo grado o folicular en recidiva o resistente, CD20 positivo, linfoma no Hodgkin de células B. RITUXAN� se administra en una infusión 2 IV de 375 mg / ml una vez por semana durante 4 u 8 dosis.

[0074] El trastuzumab (comercializado como Herceptin�) es un anticuerpo monoclonal recombinante humanizado derivado de ADN que se une selectivamente con alta afinidad en un ensayo basado en células (Kd = 5 nM) al dominio extracelular de la proteína del receptor - 2 del factor de crecimiento epid�rmico humano, HER2. El anticuerpo es una IgG kappa 1 que contiene regiones marco humanas con las regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo murino (4D5) que se une a HER2. Herceptin est� indicado como terapia de agente único para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metast�sico cuyos tumores sobreexpresan la proteína HER2 y que han recibido uno o más regímenes de quimioterapia para su enfermedad metast�sica. Herceptin� en combinación con paclitaxel est� indicado para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metast�sico cuyos tumores sobreexpresan la proteína HER2 y que no han recibido quimioterapia para su enfermedad metast�sica. La dosis recomendada es una dosis de carga inicial de 4 mg / kg de trastuzumab administrada como una infusión de 90 minutos y una dosis de mantenimiento semanal de 2 mg / kg de trastuzumab que se puede administrar como una infusión de 30 minutos si la dosis de carga inicial es bien tolerada.

[0075] El alemtuzumab (vendido como CAMPATH�) es un anticuerpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante (Campath - 1H) que se dirige contra la glicoprote�na de la superficie celular 21 - 28 kD, CD52. El alemtuzumab se une a CD52, un ant�geno no modular que est� presente en la superficie de esencialmente todos los linfocitos B y T, la mayoría de los monocitos, macr�fagos, y células NK, una subpoblaci�n de granulocitos, y tejidos del aparato reproductor masculino. El anticuerpo Campath - 1H es una IgG1 kappa humana con marco variable y regiones constantes, y las regiones determinantes de la complementariedad de un anticuerpo monoclonal murino (rata) (Campath - 1G). Campath est� indicado para el tratamiento de las células B de leucemia linfoc�tica crónica (LLC - B) en pacientes que han sido tratados con agentes alquilantes y que han fracasado en el tratamiento con fludarabina. La determinación de la eficacia de Campath se basa en tasas de respuesta global. Campath es administrado inicialmente como una infusión IV de 3 mg cada 2 horas al día; una vez que se tolera la dosis diaria debe aumentarse a 10 mg y continuar hasta su toleraci�n. Una vez que este nivel de dosis es tolerado, la dosis de mantenimiento de Campath de 30 mg puede iniciarse y administrarse tres veces por semana durante un máximo de 12 semanas. En la mayoría de los pacientes, el incremento de 30 mg se puede lograr en 3 - 7 días.

[0076] El omalizumab (vendido como XOLAIR�) es un anticuerpo monoclonal de IgG 1 (kappa) humanizado recombinante que se une selectivamente a la inmunoglobulina E humana (IgE). Omalizumab inhibe la unión de la IgE al receptor de alta afinidad de IgE (Fc (�psilon) RI) en la superficie de los mastocitos y bas�filos. La reducción de la IgE unida a la superficie de las células portadoras de Fc (�psilon) RI limita el grado de liberación de los mediadores de la respuesta alérgica. El tratamiento con omalizumab también reduce el número de Fc (�psilon) de los receptores RI en los bas�filos en pacientes at�picos. El omalizumab est� indicado para adultos y adolescentes (mayores de 12 años) con asma persistente de moderado a severo que tienen una prueba cut�nea positiva o reactividad in vitro a aeroal�rgenos perennes y cuyos síntomas est�n adecuadamente controlados con corticosteroides inhalados. Omalizumab se administra SC cada 2 o 4 semanas con dosis de 150 a 375 mg.

[0077] El efalizumab (RAPTIVA �) es un anticuerpo de isotipo kappa monoclonal inmunosupresor de IgG1 recombinante humanizada que se une al CD11a humano. El efalizumab se une al CD11a, la (alfa) subunidad de la función de leucocitos ant�geno - 1 (LFA - 1), que se expresa en todos los leucocitos, y disminuye la expresión de la superficie celular de CD11a. Efalizumab inhibe la unión de LFA - 1 a la molécula de adhesión intercelular - 1 (ICAM 1), inhibiendo de este modo la adhesión de los leucocitos a otros tipos de células. La interacción entre LFA - 1 e ICAM - 1 contribuye a la iniciación y al mantenimiento de múltiples procesos, incluyendo la activación de los linfocitos T, la adhesión de los linfocitos T a las células endoteliales, y la migración de los linfocitos T a los sitios de inflamación, incluyendo la piel psori�sica. La activación de linfocitos y el tráfico a la piel desempeñan un papel en la fisiopatolog�a de la psoriasis crónica en placas. En la piel psori�sica, la expresión en la superficie celular de ICAM – 1 est� regulada positivamente en el endotelio y queratinocitos. CD11a también se expresa en la superficie de los linfocitos B, monocitos, neutr�filos, células asesinas naturales, y otros leucocitos. Por lo tanto, existe la posibilidad de que efalizumab afecte a la activación, adhesión, migración, y al número de células que no son linfocitos T. La dosis recomendada de RAPTIVA � es una dosis única de 0,7 mg / kg SC acondicionada seguida de dosis subcutáneas semanales de 1 mg / kg SC (la dosis única máxima no puede exceder un total de 200 mg).

[0078] En otra forma de realización, una línea celular de la invención se transfecta de forma estable o modificada de otra manera para expresar un polip�ptido derivado que no es inmunoglobulina, pero que se incluye dentro de la definición de una proteína que contiene Fc.

[0079] Los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos y proteínas se pueden derivar de varias maneras bien conocidas en la técnica. En un aspecto, los anticuerpos se obtienen convenientemente a partir de hibridomas preparados por inmunizaci�n de un ratón con los p�ptidos de la invención. Los anticuerpos, por tanto, pueden obtenerse usando cualquiera de las técnicas de hibridoma bien conocidas en la técnica, véase, por ejemplo, Ausubel, et al., Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY (1987 - 2001); Sambrook, et al, Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989); Harlow y Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989); Colligan, et al, eds, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Nueva York, NY, (1997 - 2001).

[0080] En otro método conveniente para obtener la parte de unión a la diana del anticuerpo, normalmente los dominios variable pesado y / o variable ligero de un anticuerpo, estas partes se seleccionan de una biblioteca de tales dominios de unión creada en, por ejemplo, una biblioteca de fagos. Una biblioteca de fagos puede ser creada mediante la inserción de una biblioteca de oligonucle�tidos aleatorios o de una biblioteca de polinucle�tidos que contienen secuencias de interés, como a partir de las células B de un animal inmunizado o humano (Smith, G. P. 1985 Science 228: 1315 - 1317). Las bibliotecas de anticuerpos de fagos contienen pares de regiones variables de cadena pesada (H) y ligera (L) en un fago que permite la expresión de fragmentos Fv de cadena sencilla o fragmentos Fab (Hoogenboom, et al. 2000, Immunol. Hoy en día 21 (8) 371-8). La diversidad de una biblioteca de fag�midos puede ser manipulada para aumentar y / o alterar las inmunoespecificidades de los anticuerpos monoclonales de la biblioteca para producir y posteriormente identificar anticuerpos humanos monoclonales, adicionales y deseables. Por ejemplo, la molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada (H) y de cadena ligera

(L) que codifican los genes pueden ser mezcladas al azar (barajado) para crear nuevos pares de HL en una molécula de inmunoglobulina ensamblada. Además, cualquiera o ambos de H y L de codificación de los genes de la cadena pueden mutagenizar en una región determinante de la complementariedad (CDR) de la región variable del polip�ptido de inmunoglobulina, y posteriormente examinarse por la afinidad deseable y las capacidades de neutralización. Las bibliotecas de anticuerpos también pueden ser creadas sintéticamente mediante la selección de una o más secuencias de armazón humanas y la introducción de colecciones de casetes de CDR derivadas de repertorios de anticuerpos humanos o mediante variación diseñada (Kretzschmar y von Ruden 2000, Current Opinion in Biotechnology, 13:598-602). Las posiciones de la diversidad no se limitan a las CDR, sino que también pueden incluir los segmentos de marco de las regiones variables o pueden incluir distintas regiones variables de anticuerpos, tales como p�ptidos.

[0081] Otras bibliotecas de componentes de unión diana que pueden incluir distintas regiones variables de anticuerpos son la expresión en ribosoma, la expresión en levadura, y la expresión en bacterias. La expresión en ribosoma es un método de traducción de ARNm en sus proteínas similares mientras se mantiene la proteína unida al ARN. La secuencia de codificación de ácido nucleico se recupera mediante RT - PCR (Mattheakis, LC et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci.. EE.UU. 91, 9022). La expresión en levadura se basa en la construcción de proteínas de fusión del receptor de adhesión a levadura mediante alfa aglutinina asociado a membranas, aga1 y aga2, una parte del sistema de tipo apareamiento (Broder et al. 1997. Nature Biotechnology, 15:553-7). La expresión en bacterias se basa en la fusión de la diana a proteínas bacterianas exportadas que se asocian con la membrana celular o pared celular (Chen y Georgiou 2002. Biotechnol Bioeng, 79:496-503).

[0082] En comparación con la tecnología de hibridoma, el fago y otros métodos de presentación de anticuerpos permiten la posibilidad de manipular la selección contra el ant�geno diana in vitro y sin la limitación de la posibilidad de efectos del huésped en el ant�geno o viceversa.

C�lulas huésped

[0083] Las células huésped descritas en la presente comprenden células huésped capaces de producir anticuerpos específicos con un contenido de ácido si�lico definido en el contenido oligosacar�dico de dichos anticuerpos.

[0084] A diferencia de la mayoría de los genes que se transcriben a partir de las secuencias de ADN gen�mico, los genes de anticuerpos se unen a partir de segmentos g�nicos que pueden estar separados ampliamente en la línea germinal. En particular, se forman genes de cadena pesada por recombinación de tres segmentos gen�micos que codifican las regiones variable (V), diversidad (D) y la unión (U) / constante (C) del anticuerpo. Los genes de cadena ligera funcional se forman uniendo dos segmentos g�nicos; uno codifica la región V y el otro codifica la región U / C. Se estim� que tanto los loci de la cadena pesada como los loci de la cadena ligera kappa contienen algunos segmentos g�nicos V (las estimaciones varían entre 100 s y 1000 s) que abarcan más de 1000 kb. Los locus lambda son, por el contrario, mucho más pequeños y se ha demostrado que abarcan aproximadamente 300 kb en el cromosoma 16 del ratón. Se compone de dos segmentos g�nicos variables y cuatro segmentos g�nicos de la región de unión / constante (U / C). La formación de un gen funcional requiere la recombinación entre un elemento V y un elemento U / C.

[0085] En la célula B en la que se produce de forma natural el anticuerpo, el control de la transcripción de los dos genes de cadena ligera kappa y pesada reordenados depende tanto de la actividad del promotor tisular específico aguas arriba de la región V como del potenciador tisular específico ubicado en el intr�n de U – C. Estos elementos actúan en sinergia. Además, se ha identificado un segundo potenciador específico de células B en los locus de la cadena ligera kappa. Este potenciador adicional est� ubicado en 9 kb aguas abajo de Ckappa. Por lo tanto, el método de hibridoma para inmortalizar los genes de expresión del anticuerpo se basa en las secuencias promotoras y potenciadoras end�genas del linaje de células B parentales. Alternativamente, los ácidos nucleicos pueden expresarse en una célula huésped mediante la activación (por manipulación) en una célula huésped que contiene ADN end�geno que codifica un anticuerpo. Dichos métodos son ya conocidos en la disciplina, por ejemplo, como se describe en las patentes U. S N� 5.580.734, 5.641.670, 5.733.746, y 5.733.761.

[0086] La clonaci�n de ADN gen�mico del anticuerpo en un vector artificial es otro método de creación de células huésped capaces de expresar anticuerpos. Sin embargo, la expresión de anticuerpos monoclonales detrás de un promotor fuerte aumenta las posibilidades de identificación de líneas celulares de alta producción y de obtención de rendimientos más altos de anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos pueden producirse en un transfectoma de célula huésped utilizando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfecci�n g�nica tal y como ya se conoce en la técnica (por ejemplo, Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

[0087] Son ya conocidos los sistemas para la clonaci�n y expresión de un polip�ptido en una variedad de diferentes células huésped. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, células de mamífero, células vegetales, levaduras, sistemas de baculovirus, plantas y animales transg�nicos. Las líneas celulares de mamíferos disponibles en la disciplina para la expresión de un polip�ptido heter�logo incluyen proteínas glicosiladas intactas de células de ovario de h�mster chino (CHO), células HeLa, células de ri��n de una cría de h�mster (BKH), células de melanoma de ratón NSO y líneas celulares derivadas, por ejemplo, células de mieloma de rata SP2 / 0, YB2 / 0 (CACT CRL – 1662), células embrionarias humanas de ri��n (HEK), células embrionarias humanas de retina, células PerC.6, células hep G2, BSC – 1 (por ejemplo, CACT CRL – 26) y muchas otras disponibles en, por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, Va (www.atcc.org). Un huésped bacteriano común preferido es E. coli.

[0088] Las células de mamífero tales como las células CHO, células de mieloma, células HEK293, células BHK (BHK21, CACT CRL – 10), células Ltk de ratón, y células NIH3T3 se han utilizado con frecuencia para la expresión estable de los genes heter�logos. Líneas celulares tales como Cos (COS – 1, CACT CRL - 1650; COS – 7, CACT CRL – 1651) y HEK293 se utilizan de forma rutinaria para la expresión transitoria de las proteínas recombinantes.

[0089] Las células huésped de mamífero preferidas para la expresión de los anticuerpos recombinantes incluyen células de mieloma tales como Sp2 / 0, YB2 / 0 (CACT CRL – 1662), NSO, y P3X63.Ag8.653 (por ejemplo, SP2 / 0 – Ag14) debido a su elevada tasa de expresión. En particular, para su utilización con células de mieloma NSO, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión g�nica GS divulgado en los documentos WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338.841. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican los genes del anticuerpo se introducen en las células huésped de mamíferos, los anticuerpos se producen cultivando las células huésped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o, más preferiblemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se cultivan las células huésped. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo utilizando métodos estándar de purificación de proteínas.

[0090] Las células CHO – K1 y DHFR – CHO, DG44 y DUK – B11 (G. Urlaub, L.A. Chasin, 1980. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4216 - 4220) se utilizan para la producción de proteínas de alto nivel debido a que la amplificación de los genes de interés se permite por la incorporación de un marcador amplificable, seleccionable, DHFR utilizando por ejemplo el fármaco metotrexato (MTX) (R.J. Kaufman, 1990. Methods Enzymol. 185: 537 - 566). Las células DHFR – CHO pueden utilizarse con éxito para producir mAbs recombinantes a un nivel elevado. Las DHFR – CHO pueden producir anticuerpos anti - MCP – 1 en una proporción de 80 – 110 mg de 106 células-1 día-1 o más de 200 mg 106 de células día-1. Una variedad de promotores se ha utilizado para obtener la expresión de las cadenas L y P en estas células CHO, por ejemplo, el promotor de la b – actina, el promotor humano CMV - MIE, el promotor tardío principal del Adenovirus (MLP), el promotor RSV, y el LTR del virus de la leucemia murina. Se describen un número de vectores para la expresión de anticuerpos en la literatura en la que dos cadenas de lg son transportadas por dos pl�smidos diferentes con un marcador seleccionable / amplificable independiente. Los vectores que contienen una cadena del anticuerpo, por ejemplo, la cadena P, ligada al marcador DHFR, y un casete de expresión de la cadena L con el marcador Neor o viceversa se pueden utilizar para obtener hasta 180 mg de un mAb humanizado L-1 día-1 en matraces de agitaci�n. Los métodos utilizados para la selección inicial y la amplificación posterior pueden variar y son bien conocidos por los expertos en la materia. En general, puede obtenerse una expresión de mAb de alto nivel utilizando los siguientes pasos: selección inicial y amplificación posterior de los clones candidatos, co - selección (por ejemplo, en casos donde los vectores de expresión de la cadena P como los de la cadena L transportan la unidad de expresión de DHFR) y amplificación, co - amplificación utilizando marcadores amplificables diferentes, y selección inicial y amplificación en cultivo masivo, seguido de la clonaci�n por dilución para identificar los clones de alta expresión individuales. Debido a que los sitios de integración pueden influir en la eficiencia de la expresión de la cadena P y de la cadena L y la expresión de mAbs en general, se han creado vectores únicos en los que se colocan dos unidades de expresión de la cadena lg en t�ndem. Estos vectores además pueden transportar un marcador seleccionable dominante como Neor y el casete de expresión de DHFR. Para la revisión véase Ganguly, S. y A. Shatzman. Expression Systems, mammalian cells IN: Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation. 1999 de John Wiley & Sons, Inc.

[0091] Cockett et al. (1990. Bio / Technology 8, 662 - 667) desarrollaron el sistema GS para la expresión de alto nivel de los genes heter�logos en células CHO. La transfecci�n de un vector de expresión que contiene un ADNc (bajo el control transcripcional del promotor hCMV) y un mini gen GS (bajo el control de un promotor tardío SV40) en células CHO – K1 (seguido por la selección con 20 mM en 500 mM de MSX) puede utilizarse para proporcionar clones que expresan los anticuerpos en rendimientos comparables a los de los sistemas DHFR – CHO. El sistema GS se analiza en su totalidad o en parte en relación con las Patentes Europeas N� 0 216 846, 0 256 055, y 0 323 997, y en la Solicitud de Patente Europea N� 89303964.4.

[0092] Mientras se describa la invención en términos generales, las realizaciones de la invención se revelarán además en los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 1: MODIFICACIÓN ENZIM�TICA DE GALACTOSILACI�N Y SIALILACI�N DE ANTICUERPOS

[0093] Se añadieron muestras de anticuerpo purificado de galactosilado a través del método enzim�tico bovino β– 1 – 4 galactosiltransferasa (β1, 4GT) y UDP – Gal obtenidos de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) a las muestras de anticuerpo. Se obtuvieron de α– 2,3 – sialiltransferasa (α2, 3ST) de hígado de rata recombinante, α– 1,3 – galactosiltransferasa recombinante (α1, 3GT) y CMP – Sia de Calbiochem (San Diego, CA). Se obtuvo PNGase F de New England Biolabs (Beverly, MA), de Prozyme (San Leandro, CA) o de Selectin BioSciences (Pleasant Hill, CA). Se obtuvieron β– Galactosidasa y β– glucosaminidasa de Diplococcus pneumoniae ya sea de ProZyme o de Selectin BioSciences. La β– Galactosidasa del ri��n bovino y todas las otras enzimas procedían bien de ProZyme bien Selectin BioSciences. NAP – 5 y las columnas de proteína A HiTrap eran de Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). Los otros reactivos eran de grado analítico.

[0094] Una forma enzim�ticamente desglicosilada (denominada Gno) de Ab1 se prepar� para servir como un anticuerpo de control que carece de función efectora inmune Fc. Esta variante se prepar� tomando Ab1 (~ 10 mg en 1,0 mL de tampón) en 100 mM de tampón MES (pH 7,0) y se trat� con 1000 U de PNGase F a 37 �C durante 24 horas. Se a�adi� otra alícuota de la enzima y se continu� con la incubaci�n durante 24 horas adicionales. El Ab1 desglicosilado se purificó utilizando una columna de proteína A HiTrap y se formul� en TFS, pH 7,0. La glicoforma Gno se caracterizó por MALDI – TOF – MS para confirmar la desglicosilaci�n.

[0095] Además de las preparaciones de Ab manipuladas en el laboratorio, también se compararon los subgrupos

de Ab que difieren de forma natural en el contenido de ácido si�lico, referido en la presente como “variantes naturales”. El anticuerpo no modificado se expres� en TFS de Ab1 después del material del grupo original que se

intercambi� a tampón en TFS. Los Abs monoclonales IgG1 humano, Ab1 y Ab3, en el que los miembros de un par difieren en los fines de la sialilaci�n de Fc, al parecer debido a los diferentes procesos de producción utilizados para prepararlos (aunque producidos por el mismo tipo de célula huésped). Las variantes de Ab1, Ab1 – 20 y Ab1 – 29, contenían un 20 % y un 29 % de glicanos sialilados, respectivamente, y las variantes Ab5, Ab5 – 20 y Ab5 – 26 contenían respectivamente un 0 % y un 26 % de glicanos sialilados. De lo contrario, los miembros de cada par tenían las mismas secuencias amino�cidas, los mismos niveles de fucosilaci�n Fc y el contenido GlcNAc de la bisectriz (análisis de espectrometr�a de masas MALDI – TOF), y el mismo nivel bajo de agregados de Ab (< 1 % por análisis de SEC – HPLC).

[0096] Se resumen en la Tabla 1 las preparaciones de Ab y de proteínas que contienen Fc utilizadas en los diversos bioensayos y la manera en la que se derivan.

Tabla 1. Lista de resumen de la prueba de las preparaciones de las proteínas que contienen Fc utilizadas en la presente

Anticuerpo parental

Variante específica % de sialilaci�n Descripción

Ab1

- - Anticuerpo de IgG1 humana anti - FNT

Ab1 no modificado, Ab1 - 29

29 En la formulación original, variante de ácido si�lico natural

Ab1 Gno

N.A Desglicosilado enzim�ticamente

TFS de Ab

29 No modificado, tampón intercambiado en TFS

Ab1-20

20 Variante de ácido si�lico natural

Ab1MAAB

43 Unido a la columna de lectina MAA

Ab1WGAB

32 Unido a la columna de lectina WGA

Ab1WGAR

40 Retrasado por la columna de lectina WGA

Ab1WGAT

29 Pas� a través de la columna de lectina WGA

Ab1-WGAR-41

41 Retrasado por la columna de lectina WGA

Ab1-WGAT-29

29 Pas� a través de la columna de lectina WGA

Ab1 G2

0 Modificado enzim�ticamente en galactosilaci�n completa

Ab1 G2S2(al)

95 Modificado enzim�ticamente en G2S2

Ab1 G2S2(ba)

33 G2S2 perdió la mayor parte del ácido si�lico

Ab 2

- - Anticuerpo de IgG1 humana anti - FNT

Ab2 no modificado

5 % No modificado; utilizado en la unión FcγRI, Figura 6

Ab2 G2

0 % Modificado; utilizado en el estudio de la PK de ratón, Figura 8

Ab2 G2S2

~ 90 % Modificado; utilizado en el estudio de la PK de ratón, Figura 8

Ab2 AlaAla

No es relevante Mutante anti - TNF que carece de afinidad para FcγR

Ab2 GT-WGAT

5 Pas� a través de la columna de lectina WGA

Ab2 GT-WGAR

67 Galactosilado y unido a la columna de lectina WGA

Ab3

- - Específico para la subunidad de citoquina

Ab3(ba)

2 Variante de ácido si�lico natural

Ab3(al)

42 Variante de ácido si�lico natural

Ab4

Ab4

- IgG1 de ratón (carece de afinidad para FcγRI humano)

Ab5

Ab5

Se une al receptor de superficie celular heterodim�rico

Ab5-0

0 Variante natural de glicosilaci�n

Ab5-26

26 Variante natural de glicosilaci�n

FcP1

- Contiene Fc, sin proteína de Ab

[0097] Todas las muestras de ensayo contienen una bisagra de IgG1 humana, y dominios CH2 y CH3. Ab1, Ab2, Ab3 y Ab5 son Abs monoclonales de IgG con IgG1 humana y regiones constantes kappa. El Ab1 es un Ab humano completo específico para el FNT humano y el Ab2 es un Ab quimérico de ratón / humano específico para el FNT humano. El Ab3 es un Ab humano completo específico para una de las subunidades de un citoquina proinflamatoria heterodim�rica. Los cuatro Abs se expresaron en células de mieloma de ratón Sp2 / 0 transfectadas. El Ab5 es un anticuerpo completo humano dirigido a una subunidad de un receptor de superficie celular heterodim�rico. FcP1 es una proteína de fusión dim�rica que comprende la bisagra de IgG1 humana y los dominios CH2 y CH3.

[0098] Las glicoformas G2 se prepararon sometiendo muestras de IgG en 100 mM de tampón MES (pH 7,0) (~ 10 mg en 1,0 mL de tampón) en 50 milunidades de β1, 4GT, 5 �mol de UDP – Gal, y 5 �mol de MnCI2 a 37 �C durante 24 horas. Se a�adi� otra alícuota de la enzima y de UDP – Gal, y la mezcla se incub� durante 24 horas adicionales a 37 �C. Las muestras de IgG regalactosiladas se purificaron utilizando una columna de proteína A HiTrap. Los oligosac�ridos se liberaron por PNGase F y se caracterizaron por MALDI – TOF – MS y por HPLC tal y como se describe a continuación.

[0099] La glicoforma G2S2 se realizó produciendo muestras de IgG en 100 mM de tampón MES (pH 7,0) (~ 10 mg en 1,0 mL de tampón) utilizando columnas de NAP – 5 según el protocolo sugerido por el fabricante. A esta solución se añadieron 50 miliunidades de β1, 4GT y α2, 3ST; 5 �mol de UDP – Gal, CMP – Sia (isómero NANA), y MnCI2. La mezcla se incub� a 37 �C. Después de 24 horas, se a�adi� otra alícuota de enzimas junto a los azúcares de nucleótidos y la mezcla se incub� durante 24 horas adicionales a 37 �C. La glicoforma G2S2 de las muestras de IgG se purificó como se ha descrito anteriormente. Para un grupo de Ab1 G2S2 particular, Ab1 (G2S2 (ba), el ácido si�lico que se unió inicialmente, se perdió posteriormente durante el almacenamiento, posiblemente debido a una contaminación de la sialidasa. Los análisis mostraron que solo el 30 % de los oligosac�ridos Fc en Ab1 G2S2(ba) contenían ácido si�lico, mientras que ~ 95 % de los oligosac�ridos en Ab1 G2S2(al) contenían ácido si�lico.

[0100] Las estructuras de glicanos de las preparaciones de Ab se analizaron mediante diversos métodos. Para realizar un análisis MALDI – TOF – MS de Abs de IgG intactas, se produjeron muestras de IgG en 10 mM de tampón Tris – HCI, pH 7,0 y se ajust� la concentración a ~ 1 mg / mL de tampón. Se mezcl� 2 él de solución de IgG con 2 él de solución de matriz (la solución de matriz se prepar� disolviendo 10 mg de ácido sinap�nico en 1,0 ml de acetonitrilo al 50 % en agua que contienen 0,1 % de ácido trifluoroac�tico) y 2 ml de esta solución se cargaron en la diana y se dejaron secar al aire. Se adquirió MALDI – TOF – MS utilizando un instrumento Voyager DE de Applied BioSystems (Foster City, CA).

[0101] Para realizar un análisis MALDI – TOF – MS de liberación de glicanos Fc, las muestras de IgG (~ 50 �g), antes y después de las reacciones de glicosilaci�n in vitro, se digirieron con PNGase F en 10 mM de tampón Tris – HCI (50 �g) pH 7,0 durante 4 horas a 37 �C. La digestión se detuvo acidificando la mezcla de reacción con ácido acético al 50 % (~ 5�l) y después se pas� a través de la columna de resina de intercambio cati�nico tal y como se describió previamente (Papac et al., 1996; Papac et al., 1998; Raju et al., 2000). Estas muestras que contenían una mezcla de oligosac�ridos ac�dicos y naturales se analizaron por MALDI – TOF – MS en el modo iónico positivo y negativo, tal y como se describe en otra parte de (Papac et al., 1996; Papac et al., 1998; Raju et al., 2000) utilizando un instrumento Voyager DE de Applied BioSystems (Foster City, CA).

[0102] Los análisis por HPLC de los glicanos Fc se realizaron digiriendo muestras de IgG (~ 50 �g) en 10 mM de tampón Tris – HCI (~ 50 él) pH 7,0 con PNGase F a 37 �C durante 4 – 8 horas. La derivatizaci�n de oligosac�ridos liberados con ácido antran�lico (2 – ácido aminobenzoico) se llev� a cabo tal como se describe en (véase Anumula KR, Anal Biochem. 2000 Jul 15;283 (1):17 - 26). Brevemente, se prepar� en primer lugar una solución del 4 % de acetato de sodio 3H2O (p / v) y 2 % de ácido bórico (p / v) en metanol. La derivatizaci�n del reactivo se prepar� recientemente disolviendo ~ 30 mg de ácido antran�lico (Aldrich) y ~ 20 mg de cianoborohidruro de sodio (Aldrich) en 1,0 ml de solución de metanol – sodio acetato - borato. Los oligosac�ridos derivados de IgG ( < 3 nmol en 20 – 50�l de agua) se mezclaron con 0,1 ml de solución del reactivo de ácido antran�lico (AA) en 1,6 ml en los viales de

congelaci�n de tapón de rosca de polipropileno con anillos “O” (Sigma) y se tapan herméticamente. Los viales se calentaron a 80 �C en un bloque térmico o en un bloque de hornos (Reacti – Therm, Pierce) durante 1 – 2 horas. Después de enfriar los viales a temperatura ambiente, las muestras se diluyeron con agua para producir ~ 0,5 ml. Los oligosac�ridos derivatizados se purificaron utilizando columnas de NAP – 5.

EJEMPLO 2: UNION A LOS RECEPTORES FC CELULARES DE BAJA AFINIDAD

[0103] De los varios tipos de receptores Fc en las células efectoras, Fcgamma tipos II y III se consideran receptores de afinidad baja o intermedia. En general, la unión monom�rica puede tener una afinidad demasiado baja para ser detectada o tener niveles muy bajos. Por ejemplo, la unión de IgG monom�rica al Fcgamma tipo IIA es más difícil de medir. Estos receptores funcionan para unir compuestos inmunes, que debido a su naturaleza multivalente se unen con más avidez, presumiblemente debido a la constante lenta del compuesto.

[0104] Las células K562 humanas, que expresan FcγRIIA como el único receptor Fcγ, se utilizaron en dos tipos de ensayos de unión para probar si las variaciones en el contenido de ácido si�lico en el glicano Fc afectan a la unión a este receptor Fcγ humano de baja afinidad. Para obtener una avidez suficiente de unión a FcγRIIA, que tiene una baja afinidad para la IgG monom�rica, los compuestos inmunes se prepararon mezclando Abs de prueba anti - FNT con FNT homotrim�rico en una proporción molar 2:1, una proporción que se muestra para dar lugar solo a las cantidades residuales sin Ab o sin FNT. La dependencia de los compuestos inmunes se ilustr� cuando el Ab2 radiomarcado solo se unió a las células K562 no detectables en las concentraciones de hasta 1 ug / ml pero los compuestos Ab2: FNT mostraron una unión significativa a 0,0 2 ug / ml (los datos no se muestran).

Formato de unión de competición. Se prepararon dos conjuntos de compuestos inmunes de IgG, un compuesto marcado que contenía el anticuerpo de IgG1 humana con especificidad irrelevante que se complej� a una región anti

-

V específica del Ab y Ab5 no humano. Para crear el compuesto marcado, se yod� un Ab monoclonal quimérico con regiones V de h�mster con IgG1 humana y regiones constantes kappa de cadena ligera utilizando un reactivo IODO

-

GEN tal y como se ha descrito previamente (Knight et al., 1993). Un Ab monoclonal de IgG2a de rata específico para el idiotipo de la región V del híbrido h�mster – humano se mezcl� en una proporción molar 1:1 en TFS durante 30 minutos para permitir la formación de compuestos inmunes radiomarcados. La anti – Id de rata mostr� que no contribuye a la unión de FcγRIIA directamente como cuando los compuestos se realizan con híbrido de h�mster – humano desglicosilada, ocurrió una mínima; mientras que los compuestos con Ab quimérico no modificado mostraron altos niveles de unión (los datos no se muestran). Además, no hubo reactividad cruzada detectable entre los agentes utilizados para hacer los compuestos inmunes separados que podrían indicar que un compuesto inmune podría unirse a otro compuesto inmune (los datos no se muestran).

[0105] Para los compuestos de prueba, las variantes de ácido si�lico de Ab1 se mezclaron con homotr�mero de FNT humano en una proporción molar 2:1 (se muestra mediante el análisis de dispersi�n de luz que dio lugar a un Ab no unido muy pequeño más FNT no unido) en TFS a temperatura ambiente durante 30 minutos. En un conjunto de experimentos, los compuestos de las variantes naturales de Ab1 con el 20 y 29 % de ácido si�lico se compararon entre s�. En un segundo conjunto de experimentos, el compuesto Ab1 – 29: FNT se compar� con el compuesto Ab1 – 43: FNT de la preparación mejorada de la columna de lectina. En los dos casos, el compuesto de control era Ab1 – Gno: FNT cuando se elimina enzim�ticamente el anticuerpo de glicano.

[0106] Las células K562 humanas se sembraron 3 x 105 células / pocillo en placas de 96 pocillos en IMDM, 5 % de SFB. Se a�adi� una cantidad fija del compuesto del anticuerpo radiomarcado para las diversas cantidades del complejo del anticuerpo de prueba y la mezcla combinada se a�adi� a las células K562 de manera que cada pocillo contenía una concentración final de 0,1 �g / ml de compuesto del anticuerpo yodado. Las placas se incubaron durante 16 – 18 horas a 4 �C, tras lo cual, el Ab no unido se elimin� lavándolo 3 veces con IMDM, 5 % de SFB, y el número de recuentos unidos a las células se determin� utilizando un contador gamma.

[0107] Resultados. Las cantidades aumentadas de los compuestos inmunes de los competidores no marcados inhibieron cada vez más la unión por el compuesto inmune radiomarcado. Las variantes de ácido si�lico, Ab1 no modificado (sialilado al 29 %) y Ab1 MAAB (sialilado al 43 %) mostraron que el compuesto con el Ab más altamente sialilado se requirió en concentraciones 5 – 10 veces mayores que las del compuesto con el Ab1 menos sialilado para producir el mismo alcance de unión a FcγRII (Figura 4 A). Para las variantes naturales de Ab1 que difieren un 9 % del contenido de ácido si�lico (20 contra 29), la diferencia tuvo una avidez 4 veces mayor para la preparación menos sialilada (no se muestra). Por lo tanto, la presencia de la forma isom�rica NGNA del ácido si�lico, como resultado de la expresión recombinante en una célula huésped de mieloma murina, en esta IgG1 humana se redujo la avidez de los compuestos inmunes para FcγRII humano.

[0108] Unión de los compuestos inmunes a las células K562. Las muestras de ensayo de Ab1 se mezclaron con FNT humano marcado en I125 en una proporción molar 2:1 fijada, y a continuación las diversas cantidades del compuesto inmune resultante se añadieron a 3 x 105 de células K652 en una placa de cultivo de 96 pocillos. Una comparación de los compuestos de Ab1 G2: FNT (Ab no sialilado) contra los compuestos Ab1 G2S2 (al): FNT (Ab sialilado por completo) mostr� que el Ab sialilado por completo se unió con mucha menos avidez, con la variante altamente sialilada que era necesaria en concentraciones 10 veces más altas que la variante asialilada para alcanzar el mismo grado de unión (Figura 4 B). Estos resultados indican que la presencia del isómero NANA de ácido si�lico, introducido por modificaciones enzim�ticas in vitro, redujo la avidez del anticuerpo para FcγRII humano que podría atribuirse a la reducción en la afinidad de unión de la diana (FNT), provocando de este modo que los compuestos Ab: FNT sean menos estables mediante la reducción de la afinidad de la región constante para el receptor Fc o ambos.

Uni�n de Ab a FcγRIIIa celular. Para analizar la unión de Ab a FcγRIIIa en células asesinas naturales (NK), las CMSPs humanas se aislaron tal y como se describió anteriormente, y las células NK se aislaron de las CMSPs por clasificación celular magnética utilizando el kit de Aislamiento de Células NK (Miltenyi Biotec). Las células NK se cultivaron durante la noche en placas de 96 pocillos en 1 x 105 células por pocillo en medio DMEM con 10 % de SFB a 37 �C con 5 % de CO2. El mAb 3G822 anti FcγRIIIa (BD Biosciences Pharmingen) se marcó con I125 utilizando tubos de Iodogen (Pierce) para una actividad específica de 11 �Ci / �g. El mAb 3G8 yodado se premezcl� con diversas cantidades del Ab competidor no marcado en DMEM, 10 % de SFB y la mezcla de Ab se a�adi� a las células NK para una concentración final de 0,3 �g / ml de 3G8 yodado. Las células se incubaron a 4 �C durante 16 horas y luego la IgG no unida se elimin� lavándola 4 veces con TFS. El número de CPMs unidas a las células se determin� utilizando un contador gamma.

[0109] Las células U – 937 (sin pretratar para mejorar la expresión FcγR) que habían sido cultivadas en medio RPMI 1640 suplementado con 2 nM de L – glutamina, 1 nM de piruvato de sodio y 10 % de SFB (medio de U – 937) se sembraron en placas de 96 pocillos que tienen 3 x 105 células por pocillo en 50 él de medio de U – 937. El Ab2 (IgG1 humana) se marcó con I125 para una actividad específica de 17 �Ci / �g. El Ab de Ab2 yodado se premezcl� con diversas cantidades de muestras de Ab2 competidor no marcado en medio U – 937. Se añadieron después 50 él de mezcla de Ab a 50 él de células U – 937 para tener una concentración final de 0,2 �g / ml de Ab3 yodado en todos los pocillos. Las células se incubaron a 4 �C durante 16 horas y el Ab no modificado se elimin� lavándolo tres veces con medio U – 937. El número de CPMs unidas a las células se determin� utilizando un contador gamma.

[0110] Para probar si las variantes de Ab mostraron una afinidad diferencial para FcγRIIIa, las células NK aisladas recientemente se aislaron de los donantes humanos sanos y se utilizaron en experimentos de unión de competición involucran mAb 3G8 radiomarcado, un Ab anti -FcγRIIIa compite por la unión con Fc, y Abs no marcados como competidores. Los Abs libres no complejados se utilizaron en lugar de los compuestos inmunes (normalmente muestran una unión mucho mayor a FcγRIIIa) de manera que los resultados no se confundirían por las diferencias en la estabilidad de los propios compuestos inmunes solubles, que pueden ser influenciados por el contenido de ácido si�lico de Fc (no se publican nuestros datos). Los resultados mostraron que la variante natural más sialilada de Ab1, Ab1 – 29, tuvo una afinidad reducida para FcγRIIIa en las células NK, requiriéndose concentraciones 4 veces mayores a las de Ab1 – 20 para alcanzar el mismo grado de unión (Figura 5 A). Hubo una diferencia similar con las variantes naturales de Ab5, donde Ab5 – 26 requería concentraciones 5 veces mayores a las de Ab5 – 0 para competir contra mAb 3G8 para el mismo alcance (Figura 5 B). Se obtuvieron resultados similares en cada experimento cuando se utilizaron las células NK de al menos otros dos donantes de sangre (los datos no se muestran; no se determin� el alotipo de FcγRIIIa). Estos resultados mostraron que los niveles más elevados de sialilaci�n pueden reducir la afinidad de la IgG para FcγRIIIa y, por lo tanto, es casi seguro que se contribuyó a la reducción observada en la actividad ADCC.

[0111] Cuando se realizó el mismo experimento con los pares de variantes derivados por el fraccionamiento de lectina, no obstante, se observ� que las variantes más sialiladas se unieron a FcγRIIIa tan bien y, quizás ligeramente mejor, que las variantes menos sialiladas (Figuras 5 C y 5 D). No se conocen los motivos de los diferentes resultados con los dos pares de variantes naturales y los dos pares de variantes derivadas de lectina, aunque una buena posibilidad es que existen diferencias en las ubicaciones de los residuos de ácido si�lico presentes.

EJEMPLO 3: ENSAYOS ADCC IN VITRO

[0112] Las células diana para el Ab anti - FNT comprendió una línea celular de mieloma de ratón Sp2 / 0 que se expresa de forma estable de FNT humano recombinante superficial que permanece en una forma de transmembrana debido a la introducción de una deleci�n de 1 – 12 amino�cidos de FNT maduro (Perez et al., 1990). Las células K2 se cultivaron en medio de Iscove que contiene SFB inactivado por calor, 2 mM de L – glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 0,1 mM de amino�cidos no esenciales, y MHX. Los medios de cultivo y los suplementos se adquirieron en Gibco (Invitrogen). Las células se subcultivaron a 1:5 cada 2 – 3 días. En el día del ensayo, las células K2 se centrifugaron y se lavaron una vez con TFS. Las células se ajustaron a 1 x 106 células / ml con el medio de cultivo y 15 microlitros de reactivo de marcaje fluorescente (en el Kit de Reagente de Citotoxicidad Delfia EuTDA, Perkin – Elmer Life Sciences) se añadieron a 5 ml de células (Blomberg et al., 1996). Las células se incubaron durante 30 minutos a 37 �C, luego se lavaron dos veces con TFS a 1000 rpm, 5 minutos. Inmediatamente antes de la mezcla con células efectoras de CMSPs, las células diana se centrifugaron y se volvieron a suspender en 2 x 105 células / ml en medio de Iscove que contiene 1 % de SFT.

[0113] Las células efectoras de CMSPs se aislaron de los donantes sanos tras la recogida de sangre en tubos de vacutainer heparinizados, y se diluyeron dos veces con TFS. Treinta ml de sangre diluida se depositaron en la parte superior de 15 ml de Ficoll – Paque (Amersham, Uppsala, Suecia) en un tubo c�nico de 50 ml y se centrifugaron a 1500 rpm, 30 minutos a temperatura ambiente (TA). La interfaz (capa leucocitaria) que contenía CMSPs se recogió y se lav� dos veces con TFS y se centrifug� a 1200 rpm, 10 minutos a TA. Las células se volvieron a suspender en medio de Iscove que contenía 5 % de SFB inactivado por calor, 2 mM de L – glutamina, 1 mM de piruvato de sodio y 0,1 de mM de amino�cidos no esenciales. Las CMSPs se activaron durante 4 horas a 37 �C, 5 % de CO2 mediante la incubaci�n de 100 mm de placas de cultivo tisular (Coming) que se habían cubierto con OKT3 (10 ug / ml en TFS, Ortho Pharmaceutical) durante la noche a 4 �C y se enjuag� con TFS. Las CMSPs se recogieron, se lavaron una vez con medio de Iscove que contenía 1 % de SFT, se contaron y se volvieron a suspender en 1 x 107 células / ml.

[0114] Las muestras de prueba de Ab1, incluyendo el Ab1 Gno de la variante de control negativo, se diluyeron en serie en 1 % de medio de SFB de Iscove. Cincuenta microlitros de células diana (~ 10.000) y 100 microlitros de anticuerpo se añadieron a una placa de 96 pocillos con fondo redondo (Corning). Cincuenta (50) microlitros de células efectoras (- 500.000 células) se añadieron a la mezcla, y la placa se centrifug� a 1000 rpm durante 5 minutos a TA. La proporción de E: T fue normalmente de 50:1, sin embargo, algunas veces se utilizó 35:1. Para la fluorescencia de fondo, los pocillos se incubaron con células efectoras, células diana y medios. Para una fluorescencia máxima se añadieron 10 microlitros de solución de lisis (del Kit de Citotoxicidad Delfia EuTDA) a los pocillos de fondo. Para el análisis ADCC, las células se incubaron a 37 �C, 5 % de CO2 durante 2 horas. Se transfirieron 20 microlitros de sobrenadante a una placa de 96 pocillos con fondo plano (Corning). Se añadieron 200 microlitros de solución de Europio (del Kit de Citotoxicidad Delfia EuTDA) y la placa se colocó en un agitador de placas durante 10 minutos a TA. La fluorescencia se midió en un fluor�metro a tiempo resuelto, EnVision Instrument (Perkin-Elmer Life Sciences). El porcentaje de lisis específica en cada muestra se calcul� según la siguiente fórmula: % de liberación específica = ([liberación experimental – liberación espontánea] � [liberación máxima – liberación espontánea]) X 100.

[0115] Las evaluaciones iniciales de los efectos del ácido si�lico se centraron en la actividad ADCC in vitro de dos pares de variantes naturales. Ab1 – 29 y Ab1 – 20 se incubaron en diversas concentraciones con células diana que expresan Ag1 marcado con Europio. Como muestra la Figura 6 A, hubo una clara diferencia en la actividad citot�xica, en la que el Ab1 – 29, con niveles más altos de sialilaci�n Fc, requirió concentraciones 7 veces mayores que las del Ab1 – 20 a fin de desencadenar la lisis celular en igual medida. Los resultados mostraron que el subgrupo de Ab1 se enriqueció en las glicoformas sialiladas, Ab1 MAAB, fue menos potente que el TFS de Ab1 no modificado. Se necesitaron 3 veces más del material de Ab1 MAAB 43 % para alcanzar la misma cantidad de lisis como la muestra del 29 % en TFS de Ab1. Los experimentos con células diana que expresan Ag5 mostraron el mismo patrón para el par de variantes naturales de Ab2. Para lograr el mismo nivel de lisis celular como la variante Ab2 – 0 con ácido si�lico no detectable, se requirió una concentración 6 veces mayor de Ab2 – 26 (tal y como muestra la Figura 6 B). Por lo tanto, el efecto de la variación de la glicosilaci�n natural en esta medida de ADCC no es Ab o diana específica.

[0116] En un experimento representativo para comparar la actividad ADCC de los subgrupos del Ab1 que difieren en su contenido de ácido si�lico después de un fraccionamiento basado en lectina, el Ab1 MAAB (sialilado al 43 %) se compar� con el grupo de Ab1 no modificado del que se deriva (TFS de Ab1). En un segundo experimento para comparar los grupos de Ab1 que difieren en el contenido de ácido si�lico, se compararon entre s� el Ab1 WGAT (sialilado al 29 %), Ab1 WGAR (sialilado al 40 %), y Ab1 WGAB (sialilado al 32 %).

[0117] Los resultados del ensayo también demostraron una relación inversa entre el contenido de ácido si�lico y la potencia en el ensayo ADCC independientemente de la forma en la que se prepara el Ab (Figura 6 C). Es decir, el Ab1 WGAT, que contiene la misma cantidad de ácido si�lico que el Ab1 no modificado, mostr� la misma actividad que el Ab1 no modificado. Sin embargo, WGA prepar� fracciones que pierden potencia con el incremento del contenido de ácido si�lico (Figura 6 C).

[0118] En un experimento, se compararon dos muestras con diferencias más profundas en el contenido de ácido si�lico, Ab1 G2 modificado enzim�ticamente (sialilado al 0 %) y Ab1 G2S2 (al) (~ 95 % sialilado). Las CMSPs frescas se aislaron por densidad de centrifugaci�n en Ficoll – Paque. Se preincubaron 5 x 105 CMSPs en un volumen de 100 ml durante 10 minutos con diversas cantidades de Ab1, Ab1 G2S2 (al) no tratados (galactosilado y sialilado por completo), o Ab7, Ab de control negativo que coincide en el isótopo. Las células K2 que expresan FNT humano recombinante de unión superficial se utilizaron como dianas mediante marcaje con 200 mCi de Cr51. Las células marcadas se añadieron a la mezcla CMSP/ Ab, se centrifugaron a 1000 rpm durante 1 minuto, y se incubaron a 37 �C durante 4 horas. Se sabe que este periodo de incubaci�n (4 horas) revela principalmente la lisis celular inducida por las células NK (en la población de células de CMSPs), que expresan FcγRIIIA, en lugar de macr�fagos, que en general expresan FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32), y FcγRIIIA (CD16A). El número de radioactividad en los sobrenadantes celulares se determin� entonces utilizando Topcount. Los resultados mostrados (Figura 6 D) son representativos de dos experimentos independientes realizados utilizando CMSPs de donantes diferentes y muestran un cambio de potencia de más de 10 veces de la lisis celular entre Ab sialilado por completo y uno que est� casi desialilado.

[0119] Otros pares de preparaciones de Ab se compararon también en el ensayo ADCC. Las fracciones de lectina WGA preparadas a partir de AB2 galactosilado se evaluaron en ensayos ADCC utilizando células diana que expresan Ag2. Una vez más, el material más alto sialilado fue menos activo, aunque hubo una diferencia de 4 veces en sus valores EC50 a pesar de su gran diferencia en el contenido de ácido si�lico (5 % contra 67 %). Por comparación, las fracciones de lectina WGA realizadas a partir de Ab1 mostraron que la variante sialilada al 41 % requería concentraciones 6 veces mayores que la variante sialilada al 29 % para alcanzar el mismo grado de lisis celular.

[0120] Los resultados para estos tres Abs probados mostraron consistentemente que los noveles más altos de ácido si�lico de Fc se asociaron con la actividad ADCC reducida. Aunque no es cuantitativo, las diferencias entre el cambio de magnitud en la actividad ADCC y el contenido de ácido si�lico de las preparaciones de Ab, hubo una relación consistente en el panel de las cuatro variantes de Ab1, donde los valores EC50 eran normalmente 0,3 ng / ml, 2 ng / ml, 2 ng / ml y 10 ng / ml para Ab1-20, Ab1-29, Ab1 – WGA - 29, y Ab1 – WGA - 41, respectivamente. Los resultados con las fracciones de lectina también confirmaron que las preparaciones de Ab sialiladas contienen especies moleculares con diversos niveles de actividad ADCC. Cabe señalar que, a excepción de Ab3 – 0 y Ab3 – 26, las variantes analizadas en la presente tienden a no mostrar diferencias en el nivel máximo de lisis lograda.

[0121] Dado que este método de medición de actividad ADCC est� mediada principalmente por las células NK positivas de FcγRIIIA, los datos implican que, mientras la presencia de ácido si�lico de los oligosac�ridos Fc mejora la unión a FcγRI, su presencia disminuye significativamente la unión a FcγRIIIA.

EJEMPLO 4: UNIÓN AL RECEPTOR FC CELULAR DE ALTA AFINIDAD

[0122] La unión de los Abs de prueba que diferían en el contenido de ácido si�lico para el receptor Fc humano de alta afinidad, FcγRI (CD64), se midió utilizando un formato de unión de competición en una línea celular monoc�tica humana, las células U – 937. Las células U – 937 se cultivaron en medio RPMI 1640 con 2 mM de L – glutamina, 1nM de piruvato de sodio, y 10 % de SFB en matraces en T, y se mantuvieron en una incubadora con 5 % de CO2 a 37 �C. El Ab2, un Ab quimérico de IgG1 de ratón / humano, se yod� utilizando tubos de yodo precubiertos de IODO – Gen para una actividad específica de 17,2 mCi / mg. Las células U – 937 se volvieron a suspender en 6 x 106 células / ml con medio de cultivo fresco, y después se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos Milipore con filtros con una densidad de 3 x 105 células por pocillo. Las células no se pretrataron para inducir una expresión FcγR más alta. El Ab2 yodado se premezcl� con diversas cantidades del competidor de Mab no marcado (las muestras de la prueba) utilizando medio de cultivo como diluyente, en un volumen de 50 él. Las mezclas se añadieron a 50 él de cultivo de células U – 937 para proporcionar una concentración de Ab2 yodada final de 0,2 ng / ml. Las células se incubaron a 4 �C durante 16 horas. La IgG no unida se elimin� lavándola con medio y aspir�ndola tres veces utilizando un sistema de vacío de placas. El número de recuentos unido a las células se determin� utilizando un contador gamma.

[0123] La Figura 7 A muestra que, en comparación con el Ab1 G2 (sin ácido si�lico), el Ab1 G2S2 (al) (~ 95 % sialilado) se unió al FcR de alta afinidad (CD64) en las células U – 937 con una afinidad 5 a 10 veces más alta, es decir, se necesit� solo de una quinta parte a una décima parte de la concentración Ab1 G2S2(al) para proporcionar el mismo grado de inhibición de unión de Ab2 yodado. El Ab1 G2 no mostr� diferencias detectables de Ab1 no tratado (los datos no se muestran), siendo este último una mezcla heterogénea de glicoformas diferentes, la mayoría de las cuales contienen menos galactosa (es decir, glicoformas G0 y G1) que la muestra de Ab1 G2.

[0124] la Figura 7 B muestra que dos grupos diferentes de Ab3 difieren en la cantidad de especies oligosac�ridas cargadas (especies que contienen ácido si�lico), siendo bien el 2 % del total de oligosac�ridos o el 42 %, de manera similar muestran que el grupo caracterizado por tener un contenido más alto de ácido si�lico tiene una afinidad más alta para FcγRI.

[0125] Tras observar la unión reducida a FcγRIIIa de la células NK por las preparaciones de anticuerpos con un contenido de ácido si�lico más alto para los dos pares de variantes de glicosilaci�n natural de Ab1 y Ab5 (Ejemplo 3, Figuras 5 A y B), se consider� la posibilidad de que el efecto se deba a la simple repulsión electrostática entre el ácido si�lico cargado negativamente y la superficie celular cargada negativamente. Sin embargo, el efecto inverso del contenido de ácido si�lico en la afinidad de unión para el receptor FcγRI en las células U – 937 humanas no siguió el mismo patrón para Ab5 u otros Abs (los datos no se muestran).

[0126] Cabe señalar que, mientras que las dos muestras de Ab1 difieran en la ausencia / presencia de la forma NANA del ácido si�lico, se cree que las dos muestras de Ab3 difieren en la cantidad de la forma NGNA del ácido si�lico (producido en las células huésped de ratón).

EJEMPLO 5: MEDICIÓN DE LA SEMIVIDA DEL SUERO

[0127] En el presente ejemplo, una proteína de fusión que contiene Fc comprende un p�ptido N - terminal fusionado en una secuencia de región variable de un anticuerpo y una bisagra de IgG1 humana, dominios CH2 y CH3 expresados en células de mieloma de ratón tratados para formar una forma sialilada completa (G2S2). A las ratas CD1 hembra normales (4 por grupo de tratamiento) se les administr� por inyección intravenosa cualquiera de las formas no modificadas de FcP1, que contenían oligosac�ridos Fc sialilados al 5 %, o la versión sialilada completa (~ 98 % sialilada) se inyectaron por vía intravenosa por separado a grupos de ratas CD1hembra. La sangre se recogió por sangrado retro - orbital a la hora, 5 horas, 24 horas, 72 horas, 7 días, 14 días y 21 días, y luego la colección de sangre terminal se tom� mediante punci�n cardíaca de los animales anestesiados con CO2 en el día

28. El suero se prepar� a partir de muestras de sangre y la concentración de Fc humano en el suero se midió utilizando un color�metro ELISA. Brevemente, las placas EIA de 96 pocillos se cubrieron en primer lugar con anticuerpos Fc policlonales de cabra antihumanos. Las diversas disoluciones de las muestras de suero se incubaron en los pocillos durante 1 hora a temperatura ambiente. La proteína no unida se elimin� lavándola, y se unió al Fc humano detectado utilizando anticuerpos de cabra anti - IgG humanas conjugadas con enzimas, seguido por los sustratos de color apropiados.

[0128] Los resultados del estudio se muestran en la Figura 8. El área bajo la curva (AUC) calculada fue 95 � 1,6 día � ng / ml X 10-3 para el anticuerpo no modificado y 48 � 1,9 días � g / ml X 10-3. Esto muestra que un grado más alto de sialilaci�n en el oligosac�rido Fc se asoci� con una velocidad más rápida en la depuración de las ratas normales.

[0129] En un segundo experimento, a los ratones normales se les inyect� una dosis única de 3 mg / kg de Ab2 enzim�ticamente modificado para asialilarse por completo (G2) o sialilarse por completo (G2S2). El Fc humano en el suero se control� y se midió utilizando el colorim�trico ELISA tal y como se ha descrito anteriormente. Los resultados de este experimento se mostraron en la Figura 9. Tras una semana, el Ab2 G2S2 comenzó a depurarse más rápido a partir del suero de los ratones y durante 20 días el Ab2 G2S2 restante en el suero fue 1000 veces menor que la concentración del Ab2 – G2.

Depuraci�n de las variantes de ácido si�lico de Ab1 del la circulación sist�mica en ratones. Se realizó otra medición directa del efecto del contenido de ácido si�lico cuantificando la velocidad de depuración de las especies de glicosilaci�n individuales del suero tras la inyección de una muestra que contiene una mezcla heterogénea de especies glicanas unidas a un Ab1.

[0130] La misma preparación heterog�neamente glicosilada de Ab1 se inyect� por vía intravenosa a 18 ratones normales Balb / c de entre 8 – 10 semanas una dosis de 20 mg / kg. Se recogió la sangre de 6 ratones en el día 3, a otros 6 ratones en el día 14, y a los 6 ratones restantes en el día 28. Se prepar� el suero de cada muestra de sangre y el Ab1 se volvió a purificar a partir del suero utilizando una columna de afinidad anti -Id específica para las regiones V de Ab1. Las estructuras de los glicanos Fc de las muestras de Ab1 que se volvieron a purificar se analizaron mediante el análisis por HPLC y la proporción relativa de las diversas glicoformas se determin� tal y como se ha descrito anteriormente en la presente.

[0131] Se descubrió que la glicoforma galactosilada que carece de ácido si�lico (G2S0) mantiene su abundancia relativa durante 4 semanas en los ratones, mientras que las glicoformas de Ab que contienen glicanos con ácido si�lico 1 (G2S 1) y las glicoformas con ácido si�lico 2 (G2S2) se depuraron a una velocidad más rápida. Por lo tanto, las proteínas que contienen Fc sialiladas por completo tienen una semivida del suero más corta que las composiciones asialiladas o parcialmente sialiladas.

EJEMPLO 6: CONTENIDO DE ÁCIDO SI�LICO Y AVIDEZ DEL ANTICUERPO

[0132] Los resultados descritos en el presente documento respaldan la teoría de que un cambio en el contenido de ácido si�lico del glicano Fc del dominio Fc (bisagra dimerizada CH2 – CH3) tendr� un impacto en la proteína. Con respecto a la bivalencia de los anticuerpos y las proteínas de fusión que comprenden un Fc glicosilado, los efectos pueden manifestarse en la avidez de la proteína para una diana específica. Para probar esta teoría se realizaron los experimentos en este ejemplo y, además, se demuestra el efecto específico del contenido de ácido si�lico en la afinidad de unión de la diana. Unión a la superficie celular del ant�geno. Las mismas líneas celulares que expresan Ag utilizadas en los ensayos ADCC descritos con anterioridad se utilizaron en los ensayos de unión para probar las diferencias entre las variantes de ácido si�lico en su avidez de unión al ant�geno. Los ensayos se realizaron en un formato de competición, en el que uno de los Abs radiomarcados (Ab1, Ab2 o Ab5), permanece en una concentración fija, se incub� con las células que expresan Ag en presencia de diversas cantidades de Abs de prueba no marcados. Los Abs yodados, preparados por el método Iodogen, tenían en general una actividad específica de 10 uCi / ug.

[0133] Las células que expresan FNT superficiales se sembr� en placas de cultivo tisular de 96 pocillos con 50.000 células por pocillo, y las células que expresan Ag2 con 180.000 células por pocillo, en medio IMDM con 5 % de SFB. El Ab marcado en I125 apropiado se premezcl� con cantidades de titulaciones de Abs de prueba y la mezcla se a�adi� a las células que expresan Ag adecuado. Las placas se incubaron a TA durante 2 horas para permitir la unión de Ab a las células. Las células se lavaron después tres veces con IMDM, 5 % de SFB para eliminar el Ab no unido, y el número de recuentos unidos a las células se determin� utilizando un contador gamma.

[0134] Para las variantes de Ab5, las células que expresan Ag5 se sembraron en placas de cultivo tisular de 96 pocillos con 186.000 células por pocillo en 50 él de DMEM, 10 % de SFB. El Ab marcado en I125se premezcl� con cantidades de titulaciones de Abs de prueba y se añadieron 50 él de mezcla a las células que expresan Ag. Las placas se incubaron a 4 �C durante 16 horas para permitir la unión de Ab al ant�geno en las células. Las células se lavaron después tres veces con IMDM, 10 % de SFB para eliminar el Ab no unido, y el número de recuentos unidos a las células se determin� utilizando un contador gamma. Las muestras se probaron en duplicados o cuadruplicados, y los resultados mostraron que son representativos de 3 o 4 experimentos independientes. La diferencia en la unión entre estas muestras de prueba fue significativa (P < 0,0001 para los gráficos a, c y d) tal y como se determin� por la prueba F de la suma extra de cuadrados.

[0135] Los resultados se muestran en las Figuras 10 A – D: unión por Ab1 radiomarcado en las células que expresan Agl en presencia de las variantes naturales de Ab1 no marcado como competidores (Figura 10 A); unión por Ab5 radiomarcado en las células que expresan Ag5 en presencia de las variantes naturales de Ab5 no marcado como competidores (Figura 10 B); unión por Ab1 radiomarcado en las células que expresan Ag1 en presencia de las variantes derivadas de lectina de Ab1 no marcado como competidores (Figura 10 C); unión por Ab3 radiomarcado en las células que expresan Ag3 en presencia de las variantes derivadas de lectina de Ab3 no marcado como competidores (Figura 10 D).

Uni�n de Ab a un ligando en fase sólida. El FNT soluble recombinante o la anti – Id2 se recubrieron con placas EIA añadiendo 50 él de Ag o Ab anti – Id en 1 �g / ml en TFS a cada pocillo y se incubaron las placas a 4 �C durante la noche. Los pocillos se lavaron y se pretrataron después con 50 él de 1 % de SFT, 0,125 % de gelatina en TFS durante 1 hora a TA para minimizar la unión no específica. El Ab1 marcado en I125 o el Ab3 marcado en I125 se premezcl� con cantidades de titulaciones de las respectivas preparaciones de Ab de prueba en IMDM, 5 % de SFB, y 50 él de la mezcla se añadieron a los pocillos cubiertos diana. La concentración final de Ab radiomarcado fue de 100 ng / ml en todos los pocillos. Las placas se incubaron a TA durante 2 horas para permitir la unión de Ab a las dianas cubiertas. Los pocillos se levaron para eliminar el Ab no unido y el número de recuentos unidos se determin� utilizando un contador gamma. Unión de Abs de las placas cubiertas en el ant�geno soluble. Se cubrieron placas de 96 pocillos con las variantes de ácido si�lico de Ab1 o Ab3 y después se incubaron con diversas cantidades de ant�geno soluble radiomarcado como se indica a continuación: (a) unión de Ag1 soluble radiomarcado en las variantes naturales de Ab1 de las placas cubiertas, (b) unión de Ag1 soluble radiomarcado en las variantes fraccionadas de lectina de Ab1de las placas cubiertas , y (c) unión de Ag3 soluble radiomarcado en las variantes fraccionadas de lectina de Ab3 de las placas cubiertas. Las incubaciones paralelas con Ag radiomarcado y los excesos de 100 veces de Ag no marcado se realizaron para determinar la unión no específica. Las muestras se probaron en triplicados. Las variantes de Ab2 no se analizaron debido a la falta de disponibilidad de Ag2 soluble. Análisis estadístico. Se analizó una diferencia de potencia entre las variantes del anticuerpo mediante la comparación de las curvas utilizando regresiones logísticas simultáneas de los 4 parámetros con un mínimo y máximo común, y una pendiente seguida por una prueba preliminar para la pendiente y el alcance dando una meseta común para una concentración cero (es decir, siempre suponiendo sin probar una “parte inferior” común para el aumento de las curvas y una parte superior común para la disminución de las curvas). La importancia de la prueba se realizó con la prueba F de la suma extra de cuadrados en GraphPad Prism v4. Se consider� como significativo un valor P de < 0,05. Los análisis en CPM se ponderaron de forma inversa por CPM2 puesto que la desviación estándar del CPM aumenta proporcionalmente en su media (es decir, el coeficiente del CPM de la variación, CV no est� relacionada con la media).

Resultados. Los experimentos de unión al ant�geno realizados en un formato de competición con las mismas células diana que expresan Ag que se utilizaron en los ensayos ADCC mostraron de manera inesperada al Ab1 – 29 para unir consistentemente el ant�geno de la superficie celular con una afinidad 3 veces menor a la del Ab1 – 20 (Figura 10 A). El Ab5 – 26, por el contrario, mostr� una afinidad indistinguible de Ab5 – 0 (Figura 10 B). Los mismos análisis que se realizaron con los dos pares de variantes derivadas de lectina mostraron resultados similares en las variantes naturales de Ab1, es decir, AbI – WGA – 41 sialilado más alto requirió concentraciones de 4 – 6 más altas que la AbI

–

WGA – 29 menos sialilada para alcanzar el mismo grado de unión competitiva (Figura 10 C), y el Ab2 – GT – WGA

–

67 sialilado más alto requirió concentraciones de 4 a 6 más altas que el Ab2 – GT – WGA – 5 menos sialilado (Figura 10 D).

[0137] Curiosamente, se observ� también el mismo patrón de unión disminuida por las variantes de Ab1 y Ab2 con cantidades más altas de sialilaci�n en los experimentos de análisis de unión a las dianas (ant�geno recombinante soluble o Ab anti – Id) que se inmovilizaron en placas EIA de 96 pocillos (Figura 11 A y B). Estos resultados mostraron que las diferencias en el alcance de la sialilaci�n Fc pueden tener un impacto en la unión al ant�geno as� como a FcγRIIIA, aunque el alcance de sialilaci�n no afecta a la unión del ant�geno de todos los Abs.

[0138] A partir de los datos de la unión de la diana inmovilizada, se cree que el aumento de la sialilaci�n Fc puede ser útil para reducir la flexibilidad de la región de la bisagra de Ab. En el caso de ant�genos Ab1 y Ab2 de unión a la superficie celular, la flexibilidad de la bisagra reducida podría dar lugar a más uniones monovalentes y menos bivalentes (avidez elevada) de la unión al ant�geno en función de la separación de los ep�topos de ant�geno en el soporte sólido o superficie celular. La región de la bisagra de Ab5 puede además tener flexibilidad reducida, pero la flexibilidad no es necesaria para que este Ab alcance la unión máxima en Ag5.

[0139] A fin de diferenciar si los efectos de flexibilidad de Ab o los cambios de afinidad de unión intrínseca se vieron afectados por la sialilaci�n Fc, la unión de Ab en el ligando soluble se prob� como medida de afinidad de unión monovalente. Los resultados mostraron de hecho que para los tres pares de variantes de ácido si�lico que mostraban diferencias en la unión al ant�geno de superficie celular, no se observaron diferencias detectables entre los pares de las variantes en su unión a dianas solubles (Figuras 12 A – C). Como conjunto, estos resultados demostraron que las diferencias en la unión a las dianas inmovilizadas (superficie celular o placa cubierta) no se debían a diferencias en la afinidad intrínseca entre cada brazo Fab y la diana. Por lo tanto, las diferencias entre las variantes de ácido si�lico de Ab1 y Ab2 en su unión a las dianas inmovilizadas se deben a las diferencias en el alcance de la unión bivalente a las células.

EJEMPLO 7: PREPARACIÓN DE UN VECTOR PARA LA SECRECIÓN DE SIALIDASA

[0140] Conjunto de pl�smidos de la expresión de sialidasa. Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el dominio catalítico de la sialidasa Arthrobacter ureafaciens, residuos 40 a 535 del número de acceso de GenBank AY934539, se sintetizó basada en esta secuencia. El gen sintetizado (SEC ID N� 2) que codifica la fusión del dominio catalítico de la secuencia señal de la hormona de crecimiento humana de Arthrobacter ureafaciens (SEC ID N� 1 con la secuencia de señal como los primeros 26 amino�cidos y el dominio catalítico de los 494 amino�cidos restantes) se clon� en un pl�smido p2815 utilizando sitios de restricción únicos BamH I y Not I. Este pl�smido posee un promotor CMV, una secuencia de codificación para la secuencia de señal de la hormona del crecimiento humano que afecta a la secreción, y un gen de resistencia a la neomicina para la selección estable. La secuencia de codificación para el dominio catalítico de la enzima ligada a la secuencia de codificación de señal de la HCH (SEC ID N� 1) se comprob� por la digestión de enzimas de restricción y la secuenciaci�n.

[0141] Transfecci�n transitoria y estable. Para la transfecci�n transitoria, las células HEK293 se transfectaron con 15 ug de pl�smido p3629 purificado o con el pl�smido del control (vector vacío) utilizando Lipofectamine 2000. Se diluyeron el ADN del pl�smido y 90 ul de Lipofectamine 2000 en Optimen, se combinaron, y después se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. El cóctel de transfecci�n se a�adi� a continuación al 70 % de las células HEK293 confluentes en el medio de cultivo durante la noche. Al día siguiente, el medio de cultivo se reemplazó con medio 293SFM, y las células se incubaron durante 5 días para la recogida del medio y análisis. Para la transfecci�n estable, las células C168M se electroporaron con 10 ug de p3629 que había sido linearizado por la digestión de restricción con Bg1 II. Las células transfectadas se mantuvieron en el medio de cultivo con 700 ug / mL de antibiótico Geneticina para seleccionar los transfectantes estables. Los clones resistentes al antibiótico se expandieron, y se analizó la sialidasa.

[0142] Ensayo de la actividad de la sialidasa. La actividad de la sialidasa se analizó utilizando 2´ - (4 – metilumbeliferil) – a – D – N – ácido acetilneuram�nico. Se realizó un ensayo fluorom�trico en el sobrenadante celular de los cultivos celulares viables mezclándolos con 200 uL de 150 uM 2´ - (4 – metilumbeliferil) – a – D – N – ácido acetilneuram�nico en 100 mM de tampón citrato – fosfato, pH 6,5 a 37 �C, seguido por la adición de 2 mL de Na2CO3 0,5 M para detener la reacción. La excitación se realizó a 366 nm y la emisión a 446 nm. Las unidades fluorom�tricas se normalizaron contra los recuentos celulares viables. Alternativamente, la actividad de la sialidasa en el medio de cultivo se determin� mediante la incubaci�n durante la noche de Remicade sialilado con medio de las células transfectadas, y el análisis del ácido si�lico tal y como se describe a continuación.

[0143] Determinación del ácido si�lico. La actividad de la sialidasa se determin� analizando la eliminación del ácido si�lico del anticuerpo purificado tras la incubaci�n con los sobrenadantes del cultivo celular. Los oligosac�ridos N -ligados se liberaron por el tratamiento de las muestras de IgG (0,05 – 0,5 mg en 0,1 ml) con PNGase F en 20 mM de tampón Tris – HCI, pH 7,0 a 37 �C durante 4 – 6 horas. Una alícuota de esta solución (~ 0,01 ml) se pas� a través de una columna que contenía una resina de intercambio cati�nico y se analizó por MALDI – TOF – MS tal y como se describió previamente. La parte restante de la muestra se sometió a una aminaci�n reductora con ácido antran�lico y posterior análisis por HPLC tal y como se describe en Anumula. Brevemente, se prepar� en primer lugar una solución de acetato de sodio – 3H20 al 4 % (p / v) y 2 % de ácido bórico (p / v) en metanol. El reactivo de derivatizaci�n se prepar� fresco disolviendo ~ 30 mg de ácido antran�lico (Aldrich) y ~ 20 mg de cianoborohidruro de sodio (Aldrich) en 1,0 ml de solución de metanol – acetato - borato de sodio. Los oligosac�ridos derivados de IgG (< 3 nmol en 20 – 50 él de agua) se mezclaron con 0,1 ml de solución de reactivo de ácido antran�lico (AA) en 1,6 ml de viales de congelación de tapón de rosca de polipropileno con anillos “O” (Sigma) y se tapan herméticamente. Los viales se calentaron a 80 �C en un bloque térmico (Reacti – Therm, Pierce) durante ~ 1 hora. Después de enfriar los viales a temperatura ambiente, las muestras se diluyeron con agua para producir un volumen de ~ 0,5 ml. Los oligosac�ridos derivatizados se purificaron tal y como se ha descrito con anterioridad.

[0144] Purificación del anticuerpo. Los anticuerpos recombinantes expresados de las células transfectadas estables se purificaron por cromatograf�a de afinidad de la proteína A. Los sobrenadantes celulares se diluyeron con 10X de tampón de proteína A (Tris 0,2 M, NaCI 1,4, 10 nM de EDTA, pH 8,5) en 1X, y se purificaron en 1 mL de columna de proteína A. Los anticuerpos extraídos se dializaron en TFS, pH 7,2, antes de su análisis adicional.

[0145] Ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Las células diana para los ensayos que involucran Ab1 y Ab3 se prepararon en Centocor transfectando células de mieloma de ratón Sp2 / 0 con una forma de transmembrana de Ag1 y Ag3, respectivamente. Tanto las células que expresan Ag1 como las de Ag3 se cultivaron en IMDM que contiene SFB inactivado por calor, 2 nM de L – glutamina, 1 nM de piruvato de sodio, 0,1 de amino�cidos no esenciales. Las células adherentes que expresan Ag2 se obtuvieron de CACT y se cultivaron en medio DMEM que contiene 10 % de SFB, 2 mM de L – glutamina, 1 mM de piruvato de sodio y 0,1 mM de amino�cidos no esenciales. Todas las células se subcultivaron dos veces a la semana y se mantuvieron en fase log de crecimiento. El medio de cultivo y los suplementos se adquirieron en Gibco (Invitrogen).

[0146] En el día del ensayo, las células diana de mieloma que expresan Ag se centrifugaron y se lavaron una vez con TFS. Las células diana que expresan Ag2 adherentes se eliminaron con tripsina y se lavaron dos veces. Las células se ajustaron a 1 x 106 células / ml con medio de cultivo y 15 él de BATDA del reactivo de marcaje fluorescente ((bisacetoximetil) – 2,2´:6´2´´ - terpiridina – 6, 6´´ - dicarboxilato) (en el Kit de Citotoxicidad Delfia EuTDA, Perkin – Elmer Life Sciences; Blomber, K et al) que se a�adi� a 5 ml de células. Las células se incubaron durante 30 minutos a 37 �C con agitaci�n ocasional; se lavaron dos veces con el medio. Inmediatamente antes de mezclarse con las células efectoras, las células diana se centrifugaron y se volvieron a suspender en 2 x 105 células / ml en medio de cultivo.

[0147] Las células efectoras de las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) se aislaron a partir de sangre heparinizada de donantes sanos. Las muestras de sangre se diluyeron con tampón fosfato salino (TFS) y las CMSPs se aislaron por la centrifugaci�n en gradiente de densidad en Ficoll – Hypaque (Amersham). Tras la centrifugaci�n, las CMSPs se recogieron, se lavaron dos veces, y se mantuvieron durante la noche en el medio de cultivo a 37 �C con el 5 % de CO2. Al día siguiente, las CMSPs se recogieron, se lavaron y se volvieron a suspender en el medio en 1 x 107 células / ml.

[0148] Para los ensayos de citotoxicidad, las diluciones del anticuerpo en 100 él de medio de cultivo se añadieron a una placa de 96 pocillos con fondo redondo. Cincuenta él de células efectoras y 50 él de células diana marcadas con BADTA se añadieron a las diluciones de Ab y un efector para la proporción celular de la diana de 50:1. La placa se centrifug� brevemente para proporcionar efectores y dianas en contacto entre s�, y se incub� durante 2 horas a 37 �C en 5 % de atmósfera de CO2. Tras la incubaci�n, se transfirieron 20 él de sobrenadante a una placa de 96 pocillos con fondo plano y se añadieron 200 él de solución mejorada de Europio (del Kit de Citotoxicidad Delfia). Tras agitar la placa durante 10 minutos, la fluorescencia se midió en un fluor�metro a tiempo resuelto (EnVision Instrument, Perkin-Elmer). El porcentaje de citotoxicidad específica se calcul� como (liberación experimental – liberación espontánea) / liberación máxima – liberación espontánea) X 100. La liberación espontánea se determin� incubando las dianas con el medio en lugar de las células efectoras, y la liberación máxima se determin� incubando las dianas con 10 ul de solución de lisis que contiene digitonina (en el Kit de Citotoxicidad Delfia EuTDA).

Resultados y discusión

[0149] Se construyó el vector de expresión p3629 (Figura 13), permitiendo la expresión del dominio catalítico de la sialidasa A Arthrobacter ureafaciens en las células de mamíferos. La secuencia de codificación para la secuencia líder de la hormona del crecimiento humano se unió operativamente al dominio catalítico de la enzima para forzar la secreción extracelular de la sialidasa A. Las células HEK293 se transfectaron de manera transitoria con el pl�smido de expresión, y el sobrenadante se recogió para la actividad de la sialidasa en el anticuerpo anti –FNT α purificado. El anticuerpo se incub� durante la noche con medio condicionado a partir de las células transfectadas de p3629, o las células transfectadas del pl�smido de control. El análisis por HPLC de los oligosac�ridos liberados del anticuerpo tras la incubaci�n con el sobrenadante condicionado fue indetectable en todos excepto los glicanos liberados de la línea celular parental transfectada del control. Por lo tanto, la actividad de la sialidasa solo estaba presente en el sobrenadante celular transfectado de p3629, y no en el sobrenadante transfectado del control.

EJEMPLO 8: CO – EXPRESIÓN DEL ANTICUERPO Y LA SIALIDASA

[0150] El objetivo de estos estudios era generar una línea celular huésped capaz de secretar una enzima sialidasa en el medio de cultivo, que podría transfectarse además con un anticuerpo que codifica una secuencia produciendo de este modo anticuerpos glicosilados que serían desialilados. La línea celular de mieloma de ratón, C168M, que expresa un anticuerpo se transfect� con el vector preparado en el Ejemplo 7, p3629, y los clones estables seleccionados y cribados para la actividad de la sialidasa en el sobrenadante. Tal y como se muestra a continuación en la Tabla 2, de los 17 clones analizados fluorom�tricamente (MFU) en este experimento, seis eran positivos para la actividad de la sialidasa y la expresión de la sialidasa continu� durante 6 semanas, lo que indica clones estables.

Tabla 2

N� de clon

Actividad de la sialidasa – clones primarios (MFU) Actividad de la sialidasa de 6 semanas (MFU)

TS

0

1

0

2

0

3

332 7536

4

0

5

924 11544

6

0

7

0

8

0

9

0

10

-0

11

0

12

6307 23140

13

57 519

14

26

15

305 6408

16

0

17

942 1765

[0151] El análisis adicional de los anticuerpos purificados de los clones positivos de sialidasa A por SDS – PAGE indicó que aún expresaban anticuerpos intactos, y la expresión de la sialidasa no afecta a los niveles de expresión. El análisis de carbohidrato de los anticuerpos indicó que todos los clones contenían menos del 2 % de ácido si�lico, en comparación con el anticuerpo de la célula huésped transfectada sin sialidasa, que poseía casi el 15 % de ácido si�lico (Tabla 3).

Tabla 3

Contenido de ácido si�lico (%)

Contenido de fucosa (%) ADCC EC40 (ng / mL) ADCC lisis m�x (%)

Control transfectado

14,8 90 39,1 37,3

Clon 3

1,6 94 5,7 64,3

Clon 5

0,76 85 24,9 47,0

Clon 12

1,3 92 45,2 41,9

Clon 13

2,77 65 22,3 49,0

Clon 15

1,36 80 55,2 41,8

Clon 17

1,6 73 8,9 43,9

[0152] Se analizaron los anticuerpos con bajo ácido si�lico de los clones que sobreexpresan la sialidasa para mejorar la actividad ADCC en comparación con C168M de TS (Figura 14). Como muestra la Tabla 3, algunas de las muestras mostraron un EC40 más bajo y lisis máxima más elevada después del anticuerpo anti – FNT α de tipo salvaje, lo que indica que el contenido de ácido si�lico más bajo tiene un efecto en las propiedades biológicas de este anticuerpo.

[0153] Se ha diseñado un pl�smido de expresión para secretar el dominio catalítico de la enzima de la sialidasa A Arthrobacter ureafaciens en el medio de cultivo de las células de mamíferos. Esta enzima secretada es activa en los sobrenadantes celulares, y es capaz de eliminar el residuo de ácido si�lico de los oligosac�ridos N – ligados presentes en la región Fc de los anticuerpos. La transfecci�n estable de las líneas celulares que expresan anticuerpos con este constructo de expresión da lugar a clones que secretan actividad de la sialidasa A en el sobrenadante del cultivo, junto con el anticuerpo. Los anticuerpos recuperados de estos cultivos celulares contenían menos ácido si�lico que se traduce en las mejoras funcionales en la actividad ADCC. Estos resultados sugieren que el método puede utilizarse para generar células huésped que expresan glicoprote�nas recombinantes y se utiliza para crear cultivos para los glicoconjugados m�nimamente sialilados.

EJEMPLO 9: EXPRESIÓN DE CHO DE LA SIALIDASA

[0154] Las células CHO son importantes células huésped para la fabricación de biofarmac�uticos. El pl�smido p3629 (Figura 13) se utilizó para transfectar de manera estable una línea celular CHO capaz de transfectarse además con un vector para la expresión de una proteína terapéutica, tal como un anticuerpo.

[0155] Las células CHO (C1835A) se transfectaron con 30 ug de p3629 que se había linearizado mediante las digestión de restricción con Bgl II utilizando FuGene 6 (Roche, Inc.). Las células transfectadas se mantuvieron en el medio de cultivo con 700 ug / mL de antibiótico de Geneticina (Invitrogen, Inc.) para seleccionar los transfectantes estables. Los clones resistentes a los antibióticos se agruparon, se expandieron, y se analizaron para la actividad de la sialidasa.

[0156] La actividad de la sialidasa se analizó en los sobrenadantes celulares de los cultivos celulares viables utilizando un fluor�foro. A 200 uL de sobrenadante celular se añadieron 150 uM 2´ - (4 - metilumbeliferil) – alfa – D – N – ácido acetilneuram�nico en 100 mM de tampón citrato – fosfato, pH 6,5 a 37 �C, seguido por la adición de 2 mL de Na2CO3 0,5 M para detener la reacción. La excitación se realizó a 366 nm y la emisión a 446 nm. Las unidades fluorom�tricas (UF) se normalizaron dividiendo la lectura fluorom�trica individual para cada línea celular por el número total de células viables. La actividad de la sialidasa en el medio de cultivo, tal y como se mide en UF, se muestra en la Tabla 4.

Tabla 4

Diluci�n

Semana 3 Semana 8

Control

Transfectada Control Transfectada

1

1880 4004 2547 7924

0,5

1742 2983 2276 4733

0,25

1566 2320 1967 2915

0,125

1558 2046 1960 2569

0,0625

1489 1990 1862 2139

0,03125

1513 1987 2036 2444

[0157] Como la actividad de la sialidasa a las 3 y 8 semanas de la post selección se mantiene constante o aumenta con el tiempo, se confirm� la expresión estable y la secreción de la enzima de sialidasa en el sobrenadante del cultivo.

[0158] Resultar� evidente que la invención puede ponerse en práctica de otro modo diferentes al particularmente descrito en la descripción y ejemplos precedentes.

LISTADO SECUENCIAL

[0159]

<110> CENTOCOR, INC.

<120> MÉTODOS Y VECTORES PARA GENERAR INMUNOGLOBULINAS ASIALILADAS

<130> CEN5159PCT

<140> Para asignarse

<141> 2007 – 12 - 26

<150> 60 / 882301

<151> 2006 – 12 – 28

<160> 2

<170> FastSEC para Versión de Windows 4.0

<210> 1

<211> 520

<212> PRT

<213> Arthrobacter ureafaciens

<400> 1

<210> 2

<211> 1563

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica el domino catalítico de la sialidasa Arthrobacter ureafaciens.

<400> 2

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método para proporcionar un actividad enzim�tica de la sialidasa en un cultivo que comprende células de mamífero modificadas para expresar una molécula que contiene Fc, por el que los glicanos de la molécula que contiene Fc pueden actuar por la actividad enzim�tica de la sialidasa del polip�ptido, comprendiendo la transfecci�n de la célula modificada de mamífero con un vector que codifica el dominio catalítico de la enzima A de la sialidasa Arthrobacter ureafaciens, en el que el polip�ptido se secreta en el cultivo junto a la molécula que contiene Fc.

2. 2.

   Un método para controlar las propiedades de una molécula que contiene Fc expresada en una línea celular, comprendiendo la reducción de la sialilaci�n de los oligosac�ridos en la región Fc mediante la transfectaci�n de la línea celular con un vector que codifica el dominio catalítico de la enzima A de la sialidasa Arthrobacter ureafaciens, en el que la molécula que contiene Fc expresada comprende una cantidad reducida de residuos de ácido si�lico, en el que las propiedades de la molécula que contiene Fc controlada tienen la avidez de la molécula para para multiplicar proteínas diana localizadas; la afinidad de uno o más receptores gamma Fc de FcγRI, FcγRII, y FcγRIIIA; la actividad ADCC; la activación de macr�fagos o monocitos; y semivida del suero.

3. 3.

   El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la molécula que contiene Fc es un anticuerpo y la línea celular de mamífero se selecciona del grupo formado por COS - 1, COS - 7, HEK293, BHK21, CHO, BSC - 1, Hep G2, 653, SP2 / 0, 293, HeLa, YB2 / 0 o Y3, células de mieloma o linfoma, o cualquier célula derivada, inmortalizada o transformada de las mismas.

4. 4.

   El método de la reivindicación 3, en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti – FNT α y la línea celular es C168M.

5. 5.

   El método de la reivindicación 2, en el que la molécula que contiene Fc tiene un dominio de unión específico para una diana, dicha diana:

   (i)

   es una diana inmovilizada; o

   (ii)

   se expresa en la superficie de una célula

6. 6.

   Un vector de expresión que comprende una secuencia nucle�tida que codifica la enzima A de la sialidasa Arthrobacter ureafaciens, en el que el vector es capaz de expresar un polip�ptido que tiene una actividad enzim�tica de la sialidasa en un cultivo de células de mamíferos que expresa una molécula que contiene Fc.

7. 7.

   El vector de la reivindicación 6, en el que la línea celular de mamífero se selecciona del grupo formado por COS - 1, COS - 7, HEK293, BHK21, CHO, BSC - 1, Hep G2, 653, SP2 / 0, 293, HeLa, YB2 / 0 o Y3, células de mieloma o linfoma, o cualquier célula derivada, inmortalizada o transformada de las mismas.

8. 8.

   El vector de la reivindicación 6, en el que el vector comprende:

   (i)

   una secuencia de señal, por ejemplo una secuencia de señal de la hormona del crecimiento humano;

   (ii)

   una secuencia promotora, por ejemplo una secuencia promotora CMV; y

   (iii) una resistencia antibiótica, por ejemplo neomicina.

9. 9.

   Un método para producir una molécula que contiene Fc que comprende el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 – 5.

10. 10.

    El método de la reivindicación 9, en el que la molécula que contiene Fc es un anticuerpo.