ES2446041T3

ES2446041T3 - Polipéptido del Factor VIII

Info

Publication number: ES2446041T3
Application number: ES03759019.7T
Authority: ES
Inventors: Hun-Taek Kim; In-Young Song; Jae Won Choi; Jin-Wook Jang; Yong-Kook Kim; Ho Soon Lee; Yung-Jue Bang; Dae-Kee Kim
Original assignee: SK Chemicals Co Ltd
Current assignee: SK Chemicals Co Ltd
Priority date: 2003-01-28
Filing date: 2003-10-27
Publication date: 2014-03-06
Anticipated expiration: 2023-10-27
Also published as: DK1587832T3; EP2253645A3; CA2514646A1; WO2004067566A1; EP1587832A1; KR100642293B1; CA2514646C; US7041635B2; NL300878I2; AU2003274766B2; KR20050044776A; FR17C1024I1; DK2253645T3; EP2253645B1; LUC00023I1; LUC00023I2; EP2253645A2; AU2003274766A1; EP1587832B1; CN100404552C

Abstract

Un polipéptido del Factor VIII de cadena sencilla que comprende una deleción interna de aminoácidos entreel residuo 741 y el residuo 1688, con referencia a la secuencia de aminoácidos del Factor VIII humano de longitudcompleta SEQ ID NO: 1, en donde la deleción interna es de las posiciones de aminoácidos 746 a 1649, 746 a 1652,746 a 1655, 758 a 1649, 758 a 1652, 758 a 1655, 765 a 1649, 765 a 1652 o 765 a 1655.

Description

Polipéptido del Factor VIII

Campo de la invención:

La presente invención se refiere a polipéptidos del Factor VIII que son más estables que el Factor VIII de longitud completa. La invención se refiere adicionalmente a una estructura artificial de ácido nucleico que incluye ADN que codifica el polipéptido del Factor VIII.

Antecedentes generales y estado de la técnica:

La hemofilia A es el resultado del déficit cuantitativo o cualitativo de Factor VIII (FVIII), que requiere una sustitución exógena con preparaciones de derivados de FVIII plasmáticos o recombinantes. FVIII tiene una organización en dominios A1-A2-B-A3-C1-C2 y se sintetiza como una glicoproteína de cadena sencilla de 2351 aminoácidos de 280 kDa (Eaton, D. et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Toole, J. J. et al., 1984, Nature 312: 342; Vehar, G. A. et al., 1984, Nature 312: 337). Aunque los dominios A y C muestran una identidad de aminoácidos del 35-40% entre sí y con los dominios A y C del factor de coagulación V, el dominio B no es homólogo a ninguna proteína conocida. Un procesamiento intracelular, proteolítico después del residuo Arg-1648 dentro del dominio B genera una cadena ligera de 80 kDa (dominios A3-C1-C2) y una cadena pesada de tamaño heterogéneo de 90-200 kDa (dominios A1-A2-B). Las cadenas pesada y ligera se asocian como un heterodímero a través de un enlace dependiente de iones metálicos divalentes entre los dominios A1 y A3. En el plasma, FVIII circula como una forma inactiva unida al factor de von Willebrand (vWF) y para su activación requiere una escisión proteolítica mediante trombina o Factor Xa (Eaton, D., et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Girma, J. P. et al., 1987, Blood 70: 605-611; Koedam, J. A. et al., 1990, Eur. J. Biochem. 189: 229-234). La escisión con trombina después de los residuos de Arg (R) 372, 740 y 1689, activa la actividad coagulante de FVIII, lo que produce la eliminación completa del dominio B. El heterotrímero FVIIIa resultante conserva el enlace dependiente de iones metálicos entre las subunidades A1 y A3-C1-C2, mientras que A2 se asocia con afinidad débil mediante interacciones electrostáticas (Eaton, D. et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Fay,

P. J. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 8957-8962; Pittman, D. & Kaufman, R. J. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2429-2433).

Gracias a una mejor comprensión de la biosíntesis, la estructura y la función de FVIII, unos estudios han intentado producir moléculas de FVIII mejoradas para la terapia de reemplazo en pacientes con hemofilia A. Estrategias investigadas hasta la actualidad incluyen la deleción o la modificación de secuencias de FVIII, lo que ha dado como resultado una expresión más eficaz. Estudios previos sobre los requisitos para una actividad funcional de FVIII, demostraron que la escisión después de los residuos de Arg 372 y 1689 era necesaria en ambos sitios para una activación de FVIII y que el dominio B no era necesario para la actividad funcional (Eaton, D. L. et al., 1986, Biochemistry 25: 8343; Burke, R. L. et al., 1986, J. Biol. Chem 261: 12574; Toole, J. J. et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5939). Con el fin de comprobar esta hipótesis, se realizaron varias metodologías tales como la deleción en el ADN complementario (ADNc), de grandes fragmentos de ADN correspondientes al dominio B, proporcionando derivados de FVIII más cortos (Eaton, D. L. et al., 1986, Biochemistry 25: 8343; Burke, R. L. et al., 1986, J. Biol. Chem 261: 12574) y se sometieron a ensayo para determinar su actividad coagulante.

El documento de solicitud PCT WO 86/06101 describe que las proteínas FVIII recombinantes con deleciones de hasta 880 aminoácidos en la región central todavía muestran actividad de FVIII. Además, Eaton et al., 1986, Biochemistry 25:8343-8347, describen que un polipéptido en el que se han eliminado 766 aminoácidos (desde 797 hasta 1562) de la región del dominio B central, también conserva la actividad de FVIII. Estos derivados de FVIII con deleción del dominio B conservan un sitio de procesamiento proteolítico intracelular dentro del dominio B después del residuo Arg-1648, que se traduce en la generación de derivados heterogéneos de FVIII que comprenden una cadena sencilla o un complejo de dos productos de escisión proteolítica de FVIII, un polipéptido de 90 kDa (dominios A1-A2) y uno de 80 kDa (dominios A3-C1-C2). Además, células de mamífero transformadas con un vector que contiene ADN que codifica este polipéptido con deleción, tenían un nivel de producción más alto que las células transformadas con un vector que contenía ADN que codificaba el polipéptido de longitud completa. Sin embargo, estos derivados de FVIII con el dominio B delecionado muestran tasas de activación mediante trombina más rápidas y superiores que FVIII de longitud completa, por mecanismos desconocidos (Eaton et al., 1986, Biochemistry 25:8343-8347; Fay et al., 1986, Biochem. Biophys. Acta 871:268-278).

El documento de Patente de EE.UU. nº 5.112.950 describe un derivado de FVIII en el que un derivado de FVIII humano que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos desde alanina-1 hasta aspartato-770 está unido a treonina-1667 a través de tirosina-2332, en donde aspartato-770 está unido covalentemente a través de un enlace peptídico a treonina-1667. Una variedad de estudios indican que los residuos de tirosina en las posiciones 346, 718, 719, 723, 1664 y 1680 son necesarios para la activación completa y la actividad procoagulante del FVIII (Donath M.J. et al., 1995, Biochem. J. 312: 49-55; Michnick D.A. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:20095-200102). El FVIII que circula en el plasma se combina con vWF, que parece que lo estabiliza; en efecto, la semivida de FVIII in vivo disminuye muy rápidamente en ausencia de vWF (Brinkhous, K. M. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 87528756). Estos estudios sugieren firmemente que análogos del Factor VIII con el dominio B delecionado (descritos en el documento de Patente de EE.UU. nº 5.112.950, en particular), con alteraciones estructurales aproximadamente

desde 1664 a 1680 en la región A3, pueden tener desventajas potenciales en cuanto a una activación total y una estabilidad in vivo debido a una interferencia con la interacción de vWF. Tal y como se describe en el documento de Patente de EE.UU. nº 5.610.278, la coexpresión de las cadenas pesada y ligera en células de mamífero da como resultado una producción detectable de FVIII. Sin embargo, la combinación de las dos cadenas es ineficaz, disminuyendo de ese modo la actividad de la molécula (Burke, R. L. et al., 1986, J. Biol. Chem. 261, 12574; Pavirani A. et al., 1987, Biochem Biophys Res Commun. 145:234). La estrategia de la coexpresión de cadenas pesadas y ligeras como una metodología de terapia génica en animales o seres humanos no es adecuada (Burton M et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:12725).

Los documentos de Patentes de EE.UU. nº 5.422.260 y 5.451.521 se refieren a variantes de FVIII, en donde se modifica uno o varios de los sitios de escisión de Factor Xa, APC y trombina para que dichos sitios sean menos lábiles frente a una proteolisis específica, por ejemplo, en donde uno o ambos de los aminoácidos que definen el sitio de escisión, preferiblemente al menos los residuos de arginina en R-740 o R-1648, se sustituyen por un aminoácido diferente; y en donde se describe la proteína con deleción de aminoácidos desde S-741 hasta R-1648 (fusionando R740 del sitio de 90 kDa con E-1649 del sitio de 80 kDa), pero no se revela su actividad coagulante. El inconveniente potencial de esta modificación en los sitios de escisión con un aminoácido diferente es que la proteína resultante tendría un nuevo epítopo para provocar potencialmente una respuesta inmunológica. Además, las referencias no proporcionan variantes especificadas con una deleción interna de aminoácidos entre R-740 y R-1689, excepto para la que tiene una deleción interna de aminoácidos desde S-741 hasta R-1648.

Estudios recientes (Chiang GG et al., 1999, Human Gene Therapy 10:61-76) muestran que el FVIII con el dominio B delecionado que se genera mediante la deleción de aminoácidos desde S-743 hasta R-1648 (fusionando F-742 del extremo N-terminal del dominio B con E-1649 del sitio de 80 kDa) que es similar al descrito en los documentos de Patentes de EE.UU. nº 5.422.260 y 5.451.521, mostraba solo �50% de actividad biológica y menos actividad específica y, por lo tanto, se consideró menos adecuado para una aplicación terapéutica. La razón por la que un FVIII con el dominio B delecionado de este tipo posee menos actividad biológica y específica sigue siendo desconocida. Sin embargo, se supone que la naturaleza de FVIII de cadena sencilla con una deleción de aminoácidos desde S-743 hasta R-1648 puede tener una configuración estructural terciaria diferente, probablemente debido a la ausencia de requisitos espaciales entre la cadena pesada (A1-A2) y la cadena ligera (A3-C1-C2) o a una longitud o una composición no deseadas entre la cadena pesada (A1-A2) y la cadena ligera (A3-C1-C2).

Langner et al. (1988) Behring Inst. Mitt., nº 82, 16-25 describen la construcción de dos ADNc de factores VIII:C alterados que codifican moléculas en las que se había eliminado una parte (aminoácidos 816 a 1598) o todo el dominio B (aminoácidos 741 a 1689). En el último mutante se había creado un nuevo sitio de escisión para trombina que no existe en el factor VIII:C de tipo silvestre. Los ADNc mutados se clonaron en vectores de expresión eucariotas basándose en secuencias reguladoras del virus SV40 y se transfectaron en dos líneas celulares de mamífero diferentes. Ambas moléculas de factor VIII:C truncadas, recombinantes fueron secretadas en el medio de cultivo y mostraban una actividad biológica completa y se pudieron activar con trombina.

Nesheim et al. (1991) The Journal of Biological Chemistry vol. 266, nº 27, 17815-17820 investigan el efecto del factor de von Willebrand plasmático sobre la unión del factor VIII humano a plaquetas humanas activadas con trombina.

Sandberg et al. (2001) Seminars in Hematology vol. 38, nº 2 supl. 4, págs. 4-12 describen la caracterización estructural y funcional del factor VIII recombinante con el dominio B delecionado. El factor VIII con el dominio B delecionado que carece de la mayoría del dominio B, se ha sometido a una caracterización bioquímica y biofísica detallada en comparación con el factor VIII obtenido a partir del plasma.

El documento US 2002/0132306 A1 describe secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de aminoácidos que se corresponden a secuencias conocidas del factor VIII humano, en donde se deleciona el dominio B, se deleciona un sitio de unión al factor de von Willebrand, un sitio se escisión de trombina está mutado y una base de la secuencia de aminoácidos se inserta entre los dominios A2 and A3.

Krishnan et al. (1991) Eur. J. Biochem. 195, 637-644 investigan una variante por deleción modificada genéticamente del factor VIII, expresada por células CHO en la que Pro771-Asp1666 se ha delecionado. A pesar de la deleción, se observó la conservación de los requerimientos estructurales esenciales para la activación con trombina.

Toole et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 83, págs. 5939-5942 describen un análisis de una secuencia de ADN de exones porcinos que codifica el dominio B completo y parte de los dominios A2 y A3 del factor VIII. Además, se proporcionaron estructuras artificiales del factor VIII humano con el dominio B delecionado.

Lind et al. (1995) Eur. J. Biochem. nº 232, págs. 19-27 describen tres tipos de ADNc de cadena sencilla que codifican moléculas del factor VIII con el dominio B delecionado.

Pittman et al. (1993) Blood vol. 81, págs. 2925-2935 describen la caracterización bioquímica inmunológica y funcional in vivo del factor VIII con el dominio B delecionado en donde se han delecionado los residuos 760 hasta 1639.

Bihoreau et al. (1991) Biochem. J. 277, 23-31 describen la caracterización estructural y funcional de una molécula de factor VIII recombinante que carece de la mayoría del dominio B (Pro771-Asp1666).

Haack et al (1999) Ann. Hematol. 78, 111-116 analizaron las cinéticas de expresión y la actividad de una proteína del factor VIII de longitud completa y truncada en el dominio B, en tres líneas celulares diferentes. La proteína del factor VIII con el dominio B truncado se construyó uniendo el aminoácido 852 con el aminoácido 1524.

Eaton et al. (1986) Biochemistry 25, nº 26, págs. 8343-8347 describen la construcción y la caracterización de una variante del factor VIII activa que carece de un tercio esencial de la molécula (797-1562).

Herlitschka et al. (1998) Journal of Biotechnology 61, 165-173 describen la expresión elevada de un gen del factor VIII con el dominio B delecionado en una línea celular hepática humana.

El documento WO 02/102850 A2 describe secuencias de ácido nucleico que comprenden una secuencia génica completa o una parte que codifica un factor procoagulante que está ligado funcionalmente a una región reguladora específica de megacariocitos/plaquetas. Se describe una molécula del factor VIII con el dominio B delecionado en la que los residuos 761-1630 están delecionados.

El documento WO 00/24759 A1 describe estructuras artificiales con el dominio B delecionado en las que se han delecionado los aminoácidos 741 hasta 1666 o 741 hasta 1639.

Sandberg et al. (2001) Thromb. Haemost. 85, 93-100 describen las características estructurales y funcionales de una proteína del factor VIII recombinante con el dominio B delecionado, r-VIII SQ, que carece de los aminoácidos 744 hasta 1637 del factor VIII.

Pipe et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 94, págs. 11851-11856 describen la caracterización de un factor VIIIa de coagulación resistente a la inactivación, modificado genéticamente, en el que los residuos 794 hasta 1689 se han delecionado.

Donath et al. (1995) Biochem. J. 312, 49-55 describen la caracterización de Des-(741-1668)-factor VIII, una variante del factor VIII de cadena sencilla con un sitio de fusión susceptible a proteolisis con trombina y factor Xa.

Berntorp (1997) Thrombosis and Haemostasis 78(1), 256-260 investigan una molécula de factor VIII recombinante de segunda generación con el dominio B delecionado, que carece de los aminoácidos 744 hasta 1637.

Resumiendo, estas estrategias anteriores, a pesar de que ofrecen un potencial para la preparación más eficaz de una proteína recombinante, no han tenido éxito. Esta falta de éxito se debe posiblemente a sus características moleculares, tales como una población heterogénea de moléculas de FVIII, inestabilidad estructural y diferentes perfiles de activación con trombina, en comparación con FVIII de longitud completa. Además, aunque una variedad de FVIII con el dominio B delecionado se expresa como moléculas fusionadas, existe una posibilidad de que la secuencia de aminoácidos no natural (región de unión de la cadena pesada y la cadena ligera) permanezca sin un procesamiento completo, y cuando se administra en la sangre, muestra posiblemente una nueva antigenicidad (Esmon P.C., et al., 1990, Blood 76: 1593-1600, 1990). Sin embargo, no está claro si las secuencias de aminoácidos no naturales en los sitios de fusión podrían ser inmunogénicas, tal como se ha demostrado en el estudio anterior (Pittman D.D. et al., 1993, Blood S1:2925). Bajo estas circunstancias, se desea el desarrollo de un derivado activo y seguro del factor VIII que posea perfiles similares de activación con trombina y una productividad mejorada.

Compendio de la invención

Los presentes inventores han estudiado intensamente la relación funcional estructural de los derivados de FVIII con el fin de desarrollar formas estables y expresadas de manera eficaz de FVIII humano que contiene componentes esenciales, incluyendo una cadena pesada, un enlazador de tipo espaciador polipeptídico y una cadena ligera. Como resultado, en un aspecto, hemos encontrado derivados de FVIII en los que se deleciona una parte principal del dominio B, y la cadena pesada (A1-A2) y la cadena ligera (A3-C1-C2) están unidas por un espaciador polipeptídico de composición y longitud óptimas (hasta aproximadamente 60 aminoácidos, originado a partir de las regiones Nterminales de los dominios B y A3 de la forma natural del Factor VIII humano). Los derivados de FVIII de esta invención se expresan en una cadena sencilla de FVIII con el dominio B delecionado mediante la fusión de la secuencia N-terminal del dominio B con la secuencia de aminoácidos en A3, más allá de Arg-1648. Algunos de estos derivados de FVIII tienen actividad coagulante completa, actividad específica superior y perfiles de activación con trombina similares, en comparación con FVIII de longitud completa en las mismas circunstancias. Además, para evitar la exposición de un nuevo epítopo con una secuencia de aminoácidos no natural en la región de unión de la cadena pesada y la cadena ligera, hemos creado una secuencia de reconocimiento de N-glicosilación (Asn-X-Ser/Thr, en donde X puede ser cualquier aminoácido) en los sitios de fusión. Esto se logró mediante la unión de Asn en las posiciones 745, 757 y 764 a aminoácidos en las posiciones 1650, 1653 y 1656 situados próximos a los aminoácidos Ser o Thr en las posiciones 1651, 1654 y 1657, que generan un sitio de glicosilación ligado a N en los sitios de fusión. Además, esta invención proporciona derivados de FVIII con el dominio B delecionado que contienen modificaciones en la prolina 739 en relación con FVIII natural, que reduce la labilidad de las moléculas para una escisión específica catalizada con proteasas en el sitio de escisión 740. Sin embargo, los derivados de FVIII de esta invención todavía se pueden activar mediante trombina y todavía poseen actividad procoagulante.

La presente descripción se dirige a un polipéptido del Factor VIII que comprende una deleción interna de uno o va

rios aminoácidos entre 1649 y 1688 fusionado con cualquier secuencia de aminoácidos en el dominio B desde aproximadamente 741 a 782, en relación con una secuencia de aminoácidos del Factor VIII humano de longitud completa (SEQ ID NO: 1). El polipéptido del Factor VIII contiene una deleción interna en los aminoácidos 746 a 1649, 746 a 1652, 746 a 1655, 758 a 1649, 758 a 1652, 758 a 1655, 765 a 1649, 765 a 1652 o 765 a 1655. El polipéptido del Factor VIII es una cadena sencilla. Además, en otra realización, la prolina en la posición 739 se puede sustituir por otro aminoácido.

En otro aspecto de la invención, en el polipéptido del Factor VIII de la invención se puede haber introducido una secuencia tripeptídica (Asn-X-Thr o Asn-X-Ser) que incluye los sitios de fusión entre el aminoácido Asn en las posiciones 745, 757 o 764, y el aminoácido Thr o Ser en las posiciones 1651, 1654 o 1657, en relación con la secuencia de aminoácidos del Factor VIII humano de longitud completa (SEQ ID NO: 1).

La presente descripción también se dirige a un polipéptido del Factor VIII representado por la fórmula siguiente con los siguientes dominios enlazados:

en donde

el dominio H representa una secuencia polipeptídica que comprende sustancialmente Ala-1 hasta Arg-740 del Factor VIII humano de acuerdo con SEQ ID NO: 1;

el dominio S representa un enlazador de tipo espaciador polipeptídico que comprende hasta aproximadamente 60 aminoácidos, en donde el extremo N-terminal del dominio S es aproximadamente el residuo 740, y el extremo C-terminal del dominio S termina aproximadamente en el residuo 1688 del Factor VIII humano de acuerdo con SEQ ID NO: 1; y

el dominio L representa una secuencia polipeptídica que comprende sustancialmente Arg-1689 hasta Tyr2332 del Factor VIII humano de acuerdo con SEQ ID NO: 1.

La invención también se dirige a un polipéptido del Factor VIII de acuerdo con lo anterior, en el que el dominio S comprende una secuencia de aminoácidos que es una secuencia consecutiva desde Ser-741 hasta Asn-745, Asn757 o Asn-764, y una secuencia de aminoácidos que es una secuencia consecutiva desde Ile-1650, Thr-1653 o Gln1656, hasta Pro-1688. En otro aspecto de la invención, en el dominio S se delecionan los aminoácidos 746 a 1649, 746 a 1652, 746 a 1655, 758 a 1649, 758 a 1652, 758 a 1655, 765 a 1649, 765 a 1652 o 765 a 1655, en donde los números de residuos hacen referencia a SEQ ID NO:1.

La invención se dirige a una composición farmacéutica que comprende el polipéptido del Factor VIII descrito anteriormente y a un vehículo farmacéuticamente aceptable del mismo. La invención también se dirige a una composición liofilizada que comprende el polipéptido del Factor VIII descrito anteriormente.

La descripción también se dirige a un método de coagulación de la sangre en un sujeto, que comprende poner en contacto una cantidad eficaz para la coagulación del polipéptido del Factor VIII descrito anteriormente. La descripción se dirige además a un método para el tratamiento de la hemofilia A en un paciente, que comprende administrar una cantidad eficaz para la coagulación del polipéptido del Factor VIII descrito anteriormente, a una persona que lo requiera.

La invención se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido del Factor VIII descrito anteriormente. Además, la invención se dirige a un vector de expresión que comprende el ácido nucleico que codifica el polipéptido del Factor VIII descrito anteriormente, ligado funcionalmente a un promotor. Y adicionalmente, la invención se dirige a una célula hospedadora que comprende el vector de expresión. En relación con ésto, la invención se dirige a un método para preparar el polipéptido del Factor VIII descrito anteriormente, que comprende cultivar la célula en condiciones adecuadas para que el vector exprese el polipéptido, y aislar el polipéptido.

La descripción se refiere a un método de coagulación sanguínea en un sujeto que comprende:

a) generar un vector vírico o plasmídico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido del Factor VIII descrito anteriormente;

b) transfectar in vitro una población de células cultivadas con dicho vector recombinante, lo que da como resultado una población de células transfectadas; y

c) administrar las células a un hospedador mamífero, de modo que la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico dentro de dicho hospedador produzca la coagulación de la sangre.

La descripción también se dirige a un anticuerpo purificado específico del polipéptido del Factor VIII descrito anteriormente.

Este y otros objetos de la invención se comprenderán mejor gracias a la siguiente descripción de la invención, los

dibujos de referencia que acompañan a la misma y las reivindicaciones adjuntas a la misma.

Breve descripción de los dibujos

La presente invención se entenderá más a fondo con la descripción detallada proporcionada en el presente documento a continuación y los dibujos anexos que se ofrecen solamente a modo de ilustración y, por lo tanto, no son limitativos de la presente invención, y en los que;

Las Figuras 1A y 1B muestran la secuencia de aminoácidos de FVIII de longitud completa.

La Figura 2 muestra una representación esquemática de FVIII de longitud completa y varios derivados de FVIII con el dominio B delecionado, dB747 y dBN(45-50).

La Figura 3 muestra un esquema de la construcción de un ADNc para FVIII de longitud completa.

La Figura 4 muestra un esquema de la construcción de un ADN para derivados de FVIII en un vector de mamífero.

Las Figuras 5A-5C muestran la síntesis, la secreción y la escisión con trombina de derivados de FVIII expresados en células HEK293.

Figura 5A - células HEK293 transfectadas de forma estable se marcaron con impulsos radiactivos de [35S] metionina durante 30 min. Células duplicadas marcadas se rastrearon durante 6 h en medio que contenía un exceso de metionina no marcada, y a continuación, se recogieron los extractos celulares (C) y el medio condicionado (M). Volúmenes iguales de extracto celular y de medio condicionado se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-FVIII específico y se analizaron partes alícuotas iguales mediante SDS/PAGE. Todos los derivados se recuperaron a partir de extractos celulares (pistas 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 y 17) y del medio condicionado para el rastreo (pistas 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18) como especies de cadena sencilla. HEK293 indica células HEK293 que no poseían ADN plasmídico de ADN exógeno.

Figura 5B - líneas celulares HEK293 que expresaban derivados de FVIII se cultivaron en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% y antibióticos. Cuando una monocapa había crecido hasta tener aproximadamente 70-80% de confluencia, el medio de cultivo fue reemplazado por DMEM de nuevo aporte. Las células se incubaron durante aproximadamente 24 h y el material sobrenadante del cultivo se recogió, se concentró aproximadamente 100 veces usando Centricon 50.000 MWCO, y se almacenó a -80ºC. La concentración de FVIII se midió usando un método ELISA. A continuación, se separó el material concentrado mediante SDS-PAGE y se analizó mediante inmunotransferencia utilizando un anticuerpo monoclonal (ESH-8). El anticuerpo ESH-8 utilizado en la transferencia Western detectaba una proteína principal, que migraba hasta aproximadamente 170 kDa (indicada por una flecha).

Figura 5C - derivados de FVIII marcados con 35S-metionina se inmunoprecipitaron desde el medio condicionado de rastreo de células HEK293 que se expresaban de forma estable, y se dividieron en partes alícuotas iguales y se incubaron en ausencia (pistas 1, 3, 5 y 7) o presencia (pistas 2, 4, 6 y 8) de trombina (1 U/ml) durante 30 min a 37ºC. Las reacciones se terminaron con tampón de la muestra de SDS-PAGE y los fragmentos de proteínas se separaron mediante SDS-PAGE al 10%. Las formas proteicas de FVIII se indican a la derecha de la siguiente manera: SC, cadena sencilla; A1 y A2, fragmentos de cadena pesada escindidos con trombina; LC, cadena ligera escindida con trombina. Un análisis de la proteína radiomarcada después de la digestión con trombina, indicaba una apariencia normal de los fragmentos de 73 kDa, y los fragmentos de 50 y 40 kDa que se correspondían a los tamaños moleculares de la cadena ligera escindida con trombina, los dominios A1 y A2, respectivamente. Los nombres de cada uno de los derivados de FVIII se indican en la parte superior. Los marcadores de la masa molecular se muestran a la izquierda de cada imagen.

La Figura 6 muestra el esquema de la construcción de ADN para el polipéptido de FVIII en un vector de mamífero.

Las Figuras 7A y 7B muestran una comparación de la cinética de activación con trombina de polipéptidos de FVIII humano recombinante y FVIII. La Figura 7A muestra la cinética de activación con trombina de FVIII recombinante humano (rh FVIII), dB761, dB782, dB761-739F y 739F-dB782. La Figura 7B muestra la cinética de activación con trombina de FVIII recombinante humano (rh FVIII), dBN(57-50), dBN(45-53), dBN(57-56), dBN(64-50), dBN(64-53) y dBN(64-56).

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

En la presente solicitud, "un" y "una" se utilizan para referirse tanto a un objeto individual como a una pluralidad de objetos. Tal como se usa en esta memoria, "aproximadamente" o "sustancialmente" proporciona en general un margen en la limitación a un número exacto. Por ejemplo, tal como se utiliza en el contexto de la longitud o la posición de una secuencia polipeptídica, "aproximadamente" o "sustancialmente" indica que el polipéptido no está limitado al número exacto mencionado o a la posición que se indica, siempre y cuando la función y el resultado obtenidos sean

los mismos. Se pueden insertar, eliminar o añadir o delecionar unas pocas posiciones de aminoácidos, desde los extremos N-terminal o C-terminal siempre y cuando la actividad funcional atribuida a tales posiciones de aminoácidos, tal como la escisión con trombina y funciones de escisión con proteasa, se conserven o se inactiven a través de la deleción o mutación de diversos aminoácidos que pertenecen al sitio de la función. Además, tal como se utiliza en la presente memoria, una secuencia "sustancialmente similar" de ácido nucleico o de aminoácidos se refiere a una secuencia que tiene 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% o 100% de homología con la secuencia de referencia indicada.

Tal y como se usa en este documento, "aminoácido" y "aminoácidos" se refieren a todos los L-a-aminoácidos de origen natural. Esta definición incluye norleucina, ornitina y homocisteína.

Tal y como se emplea en este documento, en general, la expresión "variante de secuencia de aminoácidos" se refiere a moléculas con algunas diferencias en sus secuencias de aminoácidos, en comparación con un polipéptido de referencia (por ejemplo, la secuencia natural del Factor VIII). Las alteraciones de los aminoácidos pueden ser sustituciones, inserciones, deleciones o cualquier combinación deseada de tales cambios en una secuencia de aminoácidos natural.

Las variantes por sustitución son aquellas en las que se elimina al menos un residuo de aminoácido en una secuencia natural y un aminoácido diferente se inserta en su lugar en la misma posición. Las sustituciones pueden ser sencillas, en donde solo se sustituye un aminoácido en la molécula, o pueden ser múltiples, en donde se sustituyen dos

o más aminoácidos en la misma molécula. Los sustitutos de un aminoácido dentro de la secuencia se pueden seleccionar a partir de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. También se incluyen dentro del alcance de la invención las proteínas o fragmentos o derivados de las mismas que muestran la misma actividad biológica o una similar y los derivados que se modifican de forma diferente durante o después de la traducción, por ejemplo, mediante glicosilación, escisión proteolítica, unión a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, y así sucesivamente.

Las variantes por inserción son aquellas con uno o varios aminoácidos insertados muy próximamente a un aminoácido en una posición particular en una secuencia de aminoácidos natural. Muy próximamente a un aminoácido significa conectado al grupo a-carboxi o a-amino funcional del aminoácido.

Las variantes por deleción son aquellas en las que se ha eliminado uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos natural. Normalmente, las variantes por deleción tendrán uno o dos aminoácidos eliminados en una región particular de la molécula.

En un aspecto, la variante polipeptídica de la presente invención puede contener cualquier cantidad de aminoácidos

: o alteraciones de aminoácidos en la región no decisiva de FVIII, incluyendo sustituciones y/o inserciones y/o deleciones en cualquier otra región de la molécula polipeptídica, siempre que la variante polipeptídica incluya una secuencia que tenga al menos aproximadamente una identidad del 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%

: o 99% con aproximadamente 1-740 y/o 1689-2332 de la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 1, y la presencia de las variaciones no obstaculicen la actividad de la variante de FVIII.

Los símbolos de los aminoácidos utilizados en la presente solicitud incluyen los siguientes:

Abreviaturas de una letra o tres letras para los aminoácidos se utilizan en toda la solicitud, y se pueden utilizar de manera intercambiable, y tienen el siguiente significado: A o Ala = alanina; R o Arg = arginina; N o Asn = asparagina; D o Asp = ácido aspártico; C o Cys = cisteína; Q o Gln = glutamina; E o Glu = ácido glutámico; G o Gly = glicina; H o His = histidina; I o Ile = isoleucina; L o Leu = leucina; K o Lys = lisina, M o Met = metionina; F o Phe = fenilalanina; P o Pro = prolina; S o Ser = serina; T o Thr = treonina; W o Trp = triptófano; Y o Tyr = tirosina; y V o Val = valina.

Tal y como se usa en este documento, "derivado del Factor VIII", "variante del Factor VIII" o "polipéptido del Factor VIII" se refiere a un polipéptido que tiene actividad coagulante, actividad específica superior y perfil de activación con trombina similar, en comparación con el Factor VIII humano de longitud completa, y tiene al menos una identidad de aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con las regiones 1-740 y 16892332 de la secuencia polipeptídica representada por SEQ ID NO: 1. En particular, se entiende que son tolerables diversas mutaciones y cambios conservadores de aminoácidos, así como ciertos cambios de aminoácidos no conservadores, siempre que la variante del Factor VIII tenga actividad coagulante. También se permiten fragmentos y ciertas glicosilaciones, y se prefieren, de hecho se permite cualquier cambio en todo el polipéptido del Factor VIII siempre que el polipéptido conserve su actividad específica. Los solicitantes han descubierto por primera vez derivados del Factor VIII, en los que se ha eliminado o variado la región B en los que las regiones de escisión con trombina en 740 y 1689 se mantienen intactas, pero que gran parte del área comprendida entre 740 y 1689 se puede delecionar, incluyendo 1648, sin causar ningún efecto negativo sobre la actividad específica de la variante del Factor VIII. Por lo tanto, estaría dentro de la competencia de una persona experta en la técnica realizar ciertas variaciones de la se

cuencia, conservando la actividad específica del Factor VIII.

Tal y como se usa en este documento, la expresión "capaz de hibridarse en condiciones muy rigurosas" significa la hibridación de una cadena de ADN complementario con el ADN de interés en condiciones muy rigurosas. Del mismo modo, "capaz de hibridarse en condiciones poco rigurosas" se refiere a la hibridación de una cadena de ADN complementario con el ADN de interés en condiciones poco rigurosas. "Condiciones muy rigurosas" para el proceso de hibridación pueden implicar, por ejemplo, una temperatura elevada y/o un contenido bajo en sales, que deterioran los contactos por enlaces de hidrógeno entre pares de bases desapareadas. "Condiciones poco rigurosas" implicarían una temperatura más baja y/o una concentración en sales mayor que en las condiciones muy rigurosas. Tales condiciones permiten que dos hebras de ADN se hibriden si existe una complementariedad sustancial, aunque no casi completa entre las dos cadenas, como es el caso entre las hebras de ADN que codifican la misma proteína pero difieren en la secuencia debido a la degeneración del código genético. Unas condiciones con rigor apropiado que favorecen la hibridación del ADN, por ejemplo, 6x SSC a aproximadamente 45ºC, seguido de un lavado con 2x SSC a 50ºC, son conocidas por los expertos en la materia o bien se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York (1989), 6.31-6.3.6. Por ejemplo, la concentración en sales en la etapa de lavado se puede seleccionar desde poco rigurosa, aproximadamente 2x SSC a 50ºC, hasta muy rigurosa, aproximadamente 0,2x SSC a 50ºC. Además, la temperatura en la etapa de lavado se puede aumentar desde poco rigurosa a temperatura ambiente, aproximadamente 22ºC, hasta condiciones muy rigurosas, de aproximadamente 75ºC. Otros parámetros del rigor se describen en Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring N.Y., (1982), págs. 387-389; véase también Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, volumen 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, N.Y. págs. 8.46

8.47 (1989).

Tal y como se utiliza en esta memoria, "vehículos" incluye vehículos, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para la célula o el mamífero expuesto a los mismos a las dosis y concentraciones empleadas. Frecuentemente el vehículo farmacéuticamente aceptable es una solución acuosa con pH tamponado. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitación, tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones que forman sales tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN®, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS®.

Tal y como se usa en este documento, "derivados covalentes" incluyen modificaciones del polipéptido o de un fragmento del mismo con un agente de derivatización proteináceo o no proteináceo orgánico, y modificaciones posteriores a la traducción. Las modificaciones covalentes se introducen tradicionalmente haciendo reaccionar residuos de aminoácidos diana con un agente de derivatización orgánico que es capaz de reaccionar con residuos laterales o terminales seleccionados, o aprovechando los mecanismos de modificaciones posteriores a la traducción que actúan en células hospedadoras recombinantes, seleccionadas. Ciertas modificaciones posteriores a la traducción son el resultado de la acción de células hospedadoras recombinantes sobre el polipéptido expresado. Los residuos glutaminilo y asparaginilo se desaminan frecuentemente después de la traducción formando los residuos glutamilo y aspartilo correspondientes. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones ligeramente ácidas. Cualquier forma de estos residuos puede estar presente en los polipéptidos del Factor VIII de la presente invención. Otras modificaciones posteriores a la traducción incluyen la glicosilación, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo, tirosina o treonilo, la metilación de grupos a-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, págs. 79-86 ((1983)).

Tal como se utiliza en la presente memoria, "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para generar resultados clínicos o bioquímicos beneficiosos o deseados. Una cantidad eficaz se puede administrar una o varias veces. Para los fines de esta invención, una cantidad eficaz de un compuesto inhibidor es una cantidad que es suficiente para paliar, mejorar, estabilizar, invertir, desacelerar o retrasar la progresión del estado de enfermedad. En una realización preferida de la invención, la "cantidad eficaz" se define como una cantidad de compuesto capaz de efectuar la coagulación de la sangre.

Tal y como se usa en este documento, "fragmento" se refiere a una parte de un polipéptido, que conserva características utilizables y funcionales. Por ejemplo, tal como se utiliza en el contexto de la presente invención, el fragmento polipeptídico del Factor VIII tiene la función de coagular la sangre.

Tal y como se usa en este documento, "célula hospedadora" incluye una célula individual o un cultivo celular que puede ser un receptor o ha sido un receptor de un vector de esta invención. Las células hospedadoras incluyen la progenie de una sola célula hospedadora, y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en la morfología o en el complemento de ADN total) a la célula parental original debido a una mutación y/o un cambio natural, accidental o deliberado. Una célula hospedadora incluye células transfectadas o infectadas in vivo con un vector que comprende un polinucleótido que codifica un factor angiogénico.

Tal como se utiliza en esta memoria, "mamífero" para fines de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo los seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológicos, para deportes o animales domésticos, como perros, gatos, vacas, caballos, ovejas, cerdos y así sucesivamente. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.

Tal y como se usa en el presente documento, molécula "purificada" o "aislada" se refiere a moléculas biológicas que se retiran de su entorno natural y se aíslan o separan y están exentas de otros componentes con los que están asociadas de forma natural.

Tal y como se usa en el presente documento, "muestra" o "muestra biológica" se refiere en su sentido más amplio e incluye, cualquier muestra biológica obtenida a partir de un individuo, fluido corporal, línea celular, cultivo tisular o de otra fuente. Además, una "muestra biológica" obtenida a partir de un paciente se puede referir ya sea a una "muestra biológica" o a una "muestra del paciente".

Tal y como se usa en este documento, "identidad de secuencia", se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en una secuencia polipeptídica natural después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Los valores de % de identidad de secuencia se generan mediante el programa informático NCBI BLAST2.0, tal como ha sido definido por Altschul et al., (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res., 25:3389-3402. Los parámetros se ajustan a los valores por defecto, con la excepción de la penalización por falta de coincidencia, que se establece en -1.

Tal y como se usa en este documento, la expresión "actividad específica" o "actividad biológica específica" del polipéptido de FVIII se refiere a la medición cuantitativa de moléculas de FVIII funcionales con actividad coagulante, presentes en el total de moléculas de FVIII, que se representa por la relación de actividad coagulante de FVIII frente a la cantidad de antígeno de FVIII asociado con polipéptidos del Factor VIII. La actividad específica o la actividad biológica específica se ve afectada por múltiples factores tales como la potencia de la actividad coagulante, el perfil de activación con trombina, la estabilidad estructural y la conformación estructural, en comparación con el Factor VIII humano de longitud completa.

Tal y como se usa en este documento, "sujeto" es un vertebrado, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano.

Tal y como se usa en el presente documento, "tratamiento" es una metodología para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines de esta invención, resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de los síntomas, disminución del grado de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, no empeoramiento) de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. "Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Dentro de los que requieren un tratamiento se incluye aquellos que ya presentan el trastorno, así como aquellos en los que debe prevenirse el trastorno. "Paliar" una enfermedad significa que el grado y/o las manifestaciones clínicas indeseables de un estado de enfermedad disminuyen y/o el curso temporal de la progresión disminuye o se alarga, en comparación con una situación sin tratamiento.

Tal y como se utiliza en esta memoria, "vector", "vector polinucleotídico", "estructura artificial" y "estructura artificial polinucleotídica" se usan indistintamente en el presente documento. Un vector polinucleotídico de esta invención puede estar en cualquiera entre varias formas, incluyendo, pero no limitadas a, ARN, ADN, ARN encapsulado en un recubrimiento retrovírico, ADN encapsulado en un recubrimiento adenovírico, ADN empaquetado en otra forma vírica

o de tipo vírica (tales como virus herpes simple y virus adenoasociado (AAV)), ADN encapsulado en liposomas, ADN que forma complejos con polilisina, que forma complejos con moléculas policatiónicas sintéticas, que forma complejos con compuestos tales como polietilenglicol (PEG) para "enmascarar" inmunológicamente la molécula y/o aumentar la semivida, o conjugado con una proteína no vírica. Preferiblemente, el polinucleótido es ADN. Tal y como se emplea en esta memoria, "ADN" incluye no solo las bases A, T, C y G, sino que también incluye cualquiera de sus análogos o formas modificadas de estas bases, tales como nucleótidos metilados, modificaciones internucleotídicas tales como enlaces sin carga y tioatos, uso de análogos de azúcares, y estructuras de cadena principal modificada y/o alternativas, tales como poliamidas.

Polipéptidos del Factor VIII

Se proporcionan nuevas estructuras artificiales de ADN y nuevas composiciones que comprenden células hospedadoras que producen polipéptidos que tienen actividad de FVIII. Los polipéptidos que tienen actividad de FVIII incluyen proteínas de FVIII mutantes por deleción en las que se deleciona una parte sustancial de la región central o "dominio B". Las estructuras artificiales plasmídicas que comprenden secuencias de ADN que codifican polipéptidos con deleción que tienen actividad de FVIII, se utilizan para transformar una célula hospedadora. La célula hospedadora transformada se cultiva a continuación, para expresar el gen. La célula hospedadora puede ser una célula eu

cariota o procariota. El FVIII humano tiene la secuencia que se muestra en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO: 1). La numeración de la secuencia de aminoácidos comienza con A-1, el primer aminoácido después de la secuencia señal de 19 aminoácidos. El último aminoácido del FVIII es Y-2332. Este esquema de numeración se utiliza en toda la memoria descriptiva.

Los polipéptidos de esta invención incluyen derivados de FVIII, es decir, compuestos que tienen al menos una secuencia de aminoácidos con una similitud de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la forma natural de FVIII humano. Los derivados tienen por lo general un menor número de aminoácidos que la forma natural de FVIII humano.

Con el mayor conocimiento de los requisitos estructurales para la escisión y la activación de FVIII, hemos diseñado un FVIII funcional con el dominio B delecionado que se expresa y se secreta como un polipéptido de cadena sencilla a fin de aumentar el rendimiento de recuperación durante una preparación farmacéutica. Hemos sometido a ensayo la hipótesis de que la fusión del extremo N-terminal del dominio B con las secuencias de aminoácidos (desde Glu1649 hasta Pro-1688) de la cadena ligera A3-C1-C2, produciría una sola molécula polipeptídica de FVIII. Tal como se describe en esta invención, algunos derivados de FVIII poseen perfiles de activación típicos con trombina, idénticos al de FVIII de tipo silvestre y una estabilidad estructural superior a la de FVIII de tipo silvestre, así como a la de otros derivados de FVIII con el dominio B delecionado. Además, la mayoría de los derivados tienen la ventaja añadida de ser expresados de manera más eficaz en células de mamífero. Esta invención ha mostrado que una molécula que carece de la mayor parte del dominio B y parte del dominio A3, pero que todavía conserva los sitios de maduración correspondientes a los aminoácidos 740 y 1689 (que parecen ser necesarios para la activación), muestra una actividad procoagulante normal. Esta molécula se puede activar mediante trombina de la misma manera que el FVIII humano natural. Nuevos polipéptidos de interés tendrán una fórmula, en mayor parte, que comprende una región Nterminal de cadena pesada, una región espaciadora de unión y una región C-terminal de cadena ligera. La representación esquemática de los derivados de FVIII con el dominio B delecionado se presenta en la Figura 2. La región Nterminal de la cadena pesada se caracteriza por tener una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia consecutiva encontrada en la secuencia de aminoácidos desde A-1 a R-740 del FVIII humano de longitud completa.

Los polipéptidos espaciadores de unión consisten en un grupo pequeño de secuencias de aminoácidos de unión que se corresponde sustancialmente a las secuencias de los dominios B y A3 (desde S-741 a P-1688) con una deleción interna de los aminoácidos 746 a 1649, 746 a 1652, 746 a 1655, 758 a 1649, 758 a 1652, 758 a 1655, 765 a 1649, 765 a 1652 o 765 a 1655.

La cadena ligera C-terminal se caracteriza por tener una secuencia de aminoácidos similar a una secuencia consecutiva desde R-1689 hasta Y-2332 que se encuentra en la secuencia de FVIII. Las variantes de esta invención, que representan deleciones internas con relación a la molécula de FVIII natural, contienen preferiblemente (i) una deleción interna descrita anteriormente; o (ii) deleciones de menos aminoácidos dentro de las regiones indicadas en (i). Otras variantes de esta invención que representan deleciones internas pueden contener deleciones de uno o varios aminoácidos entre R-1649 y P-1688 para fusionar cualquier secuencia de aminoácidos en los dominios A1, A2 y B. La Figura 2 muestra la representación ejemplar de los derivados de FVIII dB747 y dBN(45-50) que tienen una deleción interna de los aminoácidos 748 a 1658 y 746 a 1649, respectivamente, en comparación con FVIII humano.

Estos derivados de FVIII con el dominio B delecionado no conservan un sitio de procesamiento proteolítico intracelular, tal como el residuo Arg-1648, lo que da como resultado la generación de derivados de FVIII homogéneos que comprenden una población principal de polipéptidos de cadena sencilla. La eliminación del sitio de escisión de 80 kDa (R-1648) no disminuyó la actividad del factor VIII generada en el medio condicionado. Además, algunos derivados de esta invención no mostraron cambios significativos en el pliegue de activación con trombina. Los presentes resultados en esta memoria mostraron que la eliminación de R-1648 no afectaba a la síntesis o a la secreción de los derivados de FVIII procedentes de la célula. Además, la especie predominante de FVIII producida era una molécula de cadena sencilla de aproximadamente 170 kDa, el resultado de la pérdida del sitio de procesamiento intracelular en el sitio de 80 kDa. Las variantes de FVIII de cadena sencilla pueden ser ventajosas porque se pueden producir de una forma más homogénea y pueden tener un perfil farmacocinético mejorado en relación con FVIII humano natural u otro FVIII recombinante.

En FVIII de longitud completa, la escisión con trombina después de los residuos de Arg 372, 740 y 1689, activa la actividad coagulante de FVIII. Esto coincide con la generación de un heterotrímero de FVIIIa que consiste en la subunidad A1 en una asociación dependiente de iones metálicos divalentes con la cadena ligera A3-C1-C2 escindida con trombina y una subunidad A2 libre, asociada con el dominio A1 a través de una interacción iónica. En el FVIII de longitud completa, la escisión después de Arg-1689 elimina una región rica en aminoácidos ácidos desde R-1648 a R-1689, y es necesaria para que FVIIIa se disocie de vWF y hace que FVIIIa esté disponible para la interacción con fosfolípidos. El análisis de las proteínas derivadas de FVIII radiomarcadas de esta invención después de la digestión con trombina, indicó una apariencia normal de los fragmentos de 73 kDa y 50 y 40 kDa (véase la Figura 5C). Este resultado mostró que los derivados de FVIII descritos se pueden activar mediante trombina de la misma manera que la molécula natural completa. Tal y como se muestra en esta invención, estos derivados de FVIII muestran una activación típica con trombina que se correlaciona con la escisión después de Arg-372, Arg-740 y Arg-1689, generando un heterotrímero de FVIII activado que es idéntico a FVIII de tipo silvestre y también está sujeto a una inactivación

rápida a través de la disociación de la subunidad del dominio A2 (véase la Figura 7).

Un aspecto de la invención se refiere a variantes en las que un sitio de glicosilación artificial ligado a N se genera mediante la fusión del aminoácido Asn en el dominio B con una secuencia de aminoácidos X-treonina o X-serina en el dominio A3, coincidiendo con la deleción de la secuencia interna tal y como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, una secuencia tripeptídica de la secuencia de reconocimiento de N-glicosilación (Asn-X-Ser/Thr, en donde X puede ser cualquier aminoácido) en los sitios de fusión se puede generar ligando los aminoácidos 746, 758 y 765 situados junto al aminoácido Asn en las posiciones 745, 757 y 764, respectivamente, directamente con los aminoácidos Ser o Thr en las posiciones 1651, 1654 y 1657. Estas variantes de FVIII tendrán una deleción interna de los aminoácidos 747 a 1650, 747 a 1653, 747 a 1656, 759 a 1650, 759 a 1653, 759 a 1656, 766 a 1650, 766 a 1653

o 766 a 1656, en comparación con FVIII humano. Los sitios de glicosilación ligados a N de consenso contienen secuencias tripeptídicas con la fórmula asparagina-X-treonina o asparagina-X-serina, en donde X puede ser generalmente cualquier aminoácido. En particular, en un aspecto de la invención, X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. Variantes de este aspecto de la invención que contienen un sitio de glicosilación ligado a N modificado genéticamente en los sitios de fusión entre los dominios B y A3, pueden evitar que una secuencia de epítopo potencialmente nueva en el sitio de fusión se exponga al sistema inmune. Otro aspecto de la invención se refiere a derivados en los que uno o varios de los sitios de escisión del Factor Xa, APC y trombina se modifican para hacer que dichos sitios sean menos lábiles a una proteolisis específica. Un subgénero de los derivados de particular interés en la actualidad incluye los que contienen una modificación en P-739, en donde la fenilalanina se prefiere en la actualidad, pero se puede sustituir por un aminoácido diferente o eliminar. La síntesis y la secreción de los derivados de FVIII con una modificación del aminoácido en 739 en la invención, no se vieron afectadas. Estas variantes muestran una mayor tasa de activación con trombina que el FVIII de longitud completa, así como otros derivados de FVIII de esta invención (véase la Figura 7). El aumento de la actividad puede ser atribuible a la resistencia a la inactivación mediante la escisión del Factor Xa en el ensayo cromogénico. Por lo tanto, esta alteración parece generar una forma más estable de FVIII con el beneficio adicional de una mayor actividad. Sin embargo, se encontró que, de acuerdo con los documentos de Patentes de EE.UU. nº 5.422.260 y 5.451.521, un derivado de FVIII con el dominio B delecionado con la mutación de arginina a isoleucina en la posición 740, poseía menos actividad después de la mutación.

A pesar de que se puede suponer que todas las moléculas polipeptídicas de FVIII que se generan por la fusión de la región N-terminal del dominio B con las secuencias de aminoácidos (desde Glu-1649 hasta Pro-1688) de la cadena ligera A3-C1-C2 producirían un perfil similar de actividad procoagulante, derivados de FVIII individuales con el dominio B delecionado poseen un perfil de activación con trombina y una estabilidad estructural únicos en esta invención. Por lo tanto, hemos caracterizado detalladamente en esta invención la función molecular del derivado de FVIII individual con el dominio B delecionado para encontrar un derivado de FVIII con el dominio B delecionado, de cadena sencilla, activo y seguro con perfiles de activación con trombina similares y una productividad mejorada.

Ácido nucleico que codifica el polipéptido del Factor VIII

En secuencia polinucleotídica "aislada", se incluye una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que ha sido retirada de su entorno natural. Esta incluye segmentos de ADN que codifican el polipéptido de FVIII de la presente invención, y puede comprender además secuencias heterólogas, tales como secuencias de vectores o de otro ADN extraño. Por ejemplo, moléculas de ADN recombinante contenidas en un vector se consideran aisladas para los fines de la presente invención, las cuales se pueden purificar parcial o sustancialmente.

Además, moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención incluyen moléculas de ADN, que comprenden una secuencia sustancialmente diferente de las descritas anteriormente pero que, ya sea debido a la degeneración del código genético o a otro variabilidad, todavía codifican el polipéptido de FVIII de la invención. Por lo tanto, para un experto en la técnica sería rutinario generar las variantes descritas anteriormente, por ejemplo, para optimizar la expresión de codones o la función general en un hospedador particular.

En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con una porción de un polinucleótido en una molécula de ácido nucleico de la invención descrita anteriormente. Los polinucleótidos que se hibridan son útiles como sondas y cebadores, tal y como se ha descrito anteriormente. Las porciones de un polinucleótido que se hibrida con la secuencia que codifica el polipéptido de FVIII, se pueden especificar con precisión por las posiciones 5' y 3' de las bases o por el tamaño en bases de nucleótidos tal y como se ha descrito anteriormente, o excluir con precisión de la misma manera. Del mismo modo, porciones de un polinucleótido que se hibridan con el polipéptido de FVIII, se pueden usar también como sondas y cebadores. Los polinucleótidos preferidos que se hibridan de la presente invención son aquellos que, cuando se marcan y se utilizan en un ensayo de hibridación conocido en la técnica (por ejemplo, análisis por transferencia Southern y Northern), muestran la mayor intensidad de la señal, independientementemente de otras secuencias heterólogas presentes en cantidades equimolares. En la selección de una célula hospedadora preferida para la transfección con los vectores de la invención, que comprenden secuencias de ADN que codifican derivados de FVIII y, por ejemplo, la proteína dihidrofolato reductasa (DHFR), es apropiado seleccionar el hospedador de acuerdo con el tipo de proteína DHFR empleada. Si se emplea proteína DHFR de tipo silvestre, es preferible seleccionar una célula hospedadora que carezca de DHFR, permitiendo así el uso de la secuencia codificadora de DHFR como marcador de una transfección con éxito en medio selectivo que carece de hipoxantina, glicina y timidi

na. Por otro lado, si se utiliza la proteína DHFR con baja afinidad de unión con metotrexato (MTX) como secuencia reguladora, no es necesario utilizar células resistentes a DHFR. La DHFR mutante es resistente al MTX, por lo tanto, los medios que contienen MTX se pueden utilizar como un medio de selección con la condición de que las propias células hospedadoras sean sensibles a MTX. Alternativamente, un gen DHFR de tipo silvestre se puede emplear como un marcador de la amplificación en una célula hospedadora que no carezca de DHFR, siempre que se emplee un segundo marcador seleccionable del fármaco, tal como la resistencia a higromicina. Los ejemplos que se exponen describen el uso de células CHO (células CHO-DBX11) resistentes a MTX como células hospedadoras y vectores de expresión que emplean el promotor de CMV y de SV40 como secuencias reguladoras para dirigir la expresión de los derivados de FVIII y de DHFR, respectivamente.

Polinucleótidos variantes y mutantes

Tales variantes de ácidos nucleicos incluyen las producidas por sustituciones, deleciones o adiciones de nucleótidos. Las sustituciones, deleciones o adiciones pueden implicar uno o más nucleótidos. Las alteraciones en la secuencia de aminoácidos pueden producir sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, conservadoras o no conservadoras. Especialmente preferidas entre éstas son las sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y las actividades de los polipéptidos de la presente invención o de porciones de los mismos. También se prefieren a este respecto las sustituciones conservadoras.

La invención permite el uso de secuencias en vectores de expresión, así como para transfectar células hospedadoras y líneas celulares, siendo éstas células procariotas o eucariotas. La invención también permite la purificación de los polipéptidos expresados a partir del vector de expresión. El vector de expresión puede contener diversos marcadores moleculares para facilitar la purificación. Posteriormente, la estructura artificial de expresión obtenida puede transformarse en cualquier célula hospedadora elegida. Los lisados celulares procedentes de la célula hospedadora se aíslan por métodos establecidos, bien conocidos en la técnica.

Polipéptidos variantes y mutantes

Para mejorar o alterar las características del polipéptido de FVIII de la presente invención, se pueden emplear aminoácidos modificados genéticamente. La tecnología de ADN recombinante conocida por los expertos en la técnica se puede utilizar para crear nuevos polipéptidos mutantes incluyendo sustituciones, deleciones, adiciones de aminoácidos únicas o múltiples, o proteínas de fusión. Tales polipéptidos modificados pueden mostrar, por ejemplo, un aumento/disminución de la actividad o un aumento/disminución de la estabilidad. Además, se pueden purificar con mayor rendimiento y muestran una solubilidad mejor que el polipéptido natural correspondiente, al menos bajo ciertas condiciones de purificación y almacenamiento.

Anticuerpos

La presente descripción se dirige además a la detección de la presencia de un polipéptido de FVIII usando una variedad de métodos de detección. Una forma de detectar un polipéptido del Factor VIII es marcar un ligando que se une específicamente al polipéptido de FVIII. Tal ligando puede ser un anticuerpo. El polipéptido de FVIII purificado se puede utilizar para producir un anticuerpo monoclonal o policlonal. Los fragmentos del polipéptido del Factor VIII también se pueden utilizar para producir un anticuerpo monoclonal o policlonal. Un anticuerpo monoclonal o policlonal obtenido posteriormente se puede utilizar para determinar la presencia de un polipéptido de FVIII en diversas muestras que incluyen células, tejidos y fluidos corporales tales como, pero no limitados a los mismos, sangre, suero, plasma y orina. El polipéptido de FVIII se puede someter a ensayo usando una variedad de métodos biológicos moleculares, que incluyen pero no se limitan a los mismos, hibridación in situ, inmunoprecipitación, tinción inmunofluorescente, análisis por transferencia Western y así sucesivamente. Se puede llevar a cabo un ELISA utilizando un anticuerpo monoclonal contra un polipéptido de FVIII para determinar la cantidad de polipéptido de FVIII en la muestra biológica, incluyendo fluidos corporales de seres humanos que se cree que padecen un trastorno de la coagulación de la sangre, como la hemofilia. Los anticuerpos de la descripción incluyen, pero no se limitan a los mismos, anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecíficos, humanos, humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una genoteca de expresión de Fab, anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-Id para anticuerpos de la invención), y fragmentos que se unen a epítopos de cualquiera de los anteriores. El término "anticuerpo", tal y como se usa en esta memoria, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y a porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une inmunoespecíficamente a un antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina de la descripción pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.

Los anticuerpos de la presente descripción pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o de mayor multiespecificidad. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido de la presente invención o pueden ser específicos tanto para un polipéptido de la presente invención como para un epítopo heterólogo, tal como un polipéptido heterólogo o un material de soporte sólido. Los anticuerpos de la presente descripción se pueden describir o especificar en términos del epítopo(s) o de la porción(es) de un polipéptido de la presente invención, que reconocen o se unen específicamente. El epítopo(s) o la porción(es) de polipéptido se

puede especificar tal y como se describe en esta memoria, por ejemplo, por el sitio de glicosilación, las posiciones Nterminales y C-terminales o por el tamaño de los residuos de aminoácidos contiguos.

Los anticuerpos de la presente descripción se pueden utilizar, por ejemplo, pero no se limitan a los mismos, para purificar, detectar y dirigirse a los polipéptidos de la presente invención, incluyendo métodos de diagnóstico y terapéuticos tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos tienen uso en inmunoensayos para medir cualitativa y cuantitativamente los niveles de polipéptido de FVIII de la presente invención en muestras biológicas.

Tal y como se describe con más detalle a continuación, los anticuerpos de la presente descripción se pueden utilizar solos o en combinación con otras composiciones. Los anticuerpos además pueden estar fusionados de forma recombinante a un polipéptido heterólogo en el extremo N-terminal o C-terminal o estar conjugados químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) con polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente descripción se pueden fusionar o conjugar de forma recombinante con moléculas útiles como marcadores en ensayos de detección y con moléculas efectoras tales como polipéptidos heterólogos, fármacos, radionúclidos o toxinas.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden generar mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Los anticuerpos policlonales para un antígeno de interés se pueden producir por diversos procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un polipéptido de la invención se puede administrar a diversos animales hospedadores incluyendo, pero no limitados a los mismos, conejos, ratones, ratas, etc., para inducir la producción de sueros que contienen anticuerpos policlonales específicos del antígeno. Se pueden utilizar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedadora, e incluyen, pero no se limitan a, adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles, tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Tales adyuvantes también son bien conocidos en la técnica.

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando una amplia variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes y de presentación en fagos, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden producir usando técnicas de hibridoma incluyendo aquellas conocidas en la técnica. La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en el presente documento, no se limita a anticuerpos producidos a través de tecnología de hibridoma. La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se obtiene a partir de un único clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota o de fago, y no al método por el cual se ha producido.

Los métodos para producir y escrutar anticuerpos específicos usando la tecnología de hibridoma son rutinarios y bien conocidos en la técnica. En un ejemplo no limitativo, los ratones se pueden inmunizar con un polipéptido del Factor VIII o con una célula que expresa dicha entidad. Una vez que se detecta una respuesta inmune, por ejemplo, se detectan anticuerpos específicos del antígeno en el suero del ratón, se extirpa el bazo del ratón y se aíslan los esplenocitos. Los esplenocitos se fusionan a continuación mediante técnicas bien conocidas con cualquier célula de mieloma adecuada, por ejemplo, células de la línea celular SP20 disponible en la ATCC. Los hibridomas se seleccionan y se clonan por dilución limitada. Los clones del hibridoma se someten entonces a ensayo por métodos conocidos en la técnica para detectar las células que secretan anticuerpos capaces de unirse a un polipéptido de la invención o a su complejo con su ligando. El líquido ascítico, que generalmente contiene niveles elevados de anticuerpos, se puede generar mediante la inmunización de ratones con clones de hibridoma positivos. Los anticuerpos también se pueden fijar a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos o para la purificación del antígeno diana. Tales soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, poli(cloruro de vinilo) o polipropileno.

Ensayos para la unión de anticuerpos

Los anticuerpos de la descripción se pueden someter a ensayo para estudiar la unión inmunoespecífica mediante cualquier método conocido en la técnica. Los inmunoensayos que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a sistemas de ensayo competitivos y no competitivos, usando técnicas tales como transferencias Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), inmunoensayos de tipo "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, por mencionar solo algunos. Tales ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel et al., compiladores, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York). Los inmunoensayos ejemplares se describen brevemente a continuación, sin intención de ser una forma de limitación.

Los protocolos de inmunoprecipitación comprenden generalmente lisar una población de células en un tampón de lisis tal como tampón RIPA (1% de NP-40 o Triton X-100, 1% de desoxicolato de sodio, 0,1% de SDS, NaCl 0,15 M, fosfato de sodio 0,01 M a pH 7,2, 1% de Trasylol) suplementado con fosfatasa proteica y/o inhibidores de la proteasa (por ejemplo, EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato de sodio), añadiendo el anticuerpo de interés al lisado celular, incubando durante un período de tiempo (por ejemplo, 1-4 horas) a 4ºC, añadiendo perlas de sefarosa de proteína A

y/o de proteína G al lisado celular, incubando durante aproximadamente una hora o más a 4ºC, lavando las perlas en tampón de lisis y resuspendiendo las perlas en SDS/ tampón de muestra. La capacidad del anticuerpo de interés para inmunoprecipitar un antígeno particular se puede evaluar, por ejemplo, mediante un análisis con transferencia Western. Un experto en la materia sabrá cómo se pueden modificar los parámetros para aumentar la unión del anticuerpo a un antígeno y disminuir el ruido de fondo (por ejemplo, aclarando previamente el lisado celular con perlas de sefarosa). Para una exposición adicional de los protocolos de inmunoprecipitación, véase, por ejemplo, Ausubel et al., compiladores, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, en

10.16.1.

El análisis mediante transferencia Western generalmente comprende preparar muestras de proteína, electroforesis de las muestras de proteína en un gel de poliacrilamida (por ejemplo, 8%-20% de SDS-PAGE dependiendo del peso molecular del antígeno), transferir la muestra de proteína desde el gel de poliacrilamida a una membrana tal como nitrocelulosa, PVDF o nailon, bloquear la membrana en solución de bloqueo (por ejemplo, PBS con 3% de BSA o leche desnatada), lavar la membrana en tampón de lavado (por ejemplo, PBS-Tween 20), bloquear la membrana con anticuerpo primario (el anticuerpo de interés) diluido en tampón de bloqueo, lavar la membrana en tampón de lavado, bloquear la membrana con un anticuerpo secundario (que reconoce el anticuerpo primario, por ejemplo, un anticuerpo anti-humano) conjugado con un sustrato enzimático (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) o una molécula radiactiva (por ejemplo, 32P o 125I) diluida en tampón de bloqueo, lavar la membrana en tampón de lavado y detectar la presencia del antígeno. Un experto en la materia sabrá cómo se pueden modificar los parámetros para aumentar la señal detectada y para reducir el ruido de fondo. Para una exposición adicional de los protocolos de transferencia Western, véase, por ejemplo, Ausubel et al., compiladores, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, en 10.8.1.

Los ELISAs comprenden preparar el antígeno, que puede incluir una muestra que comprende el polipéptido del Factor VIII, recubrir el pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos con el antígeno, añadir el anticuerpo de interés conjugado con un compuesto detectable tal como un sustrato enzimático (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) al pocillo e incubar durante un período de tiempo, y detectar la presencia del antígeno. En los ELISAs el anticuerpo de interés no se tiene que conjugar con un compuesto detectable; en cambio, un segundo anticuerpo (que reconoce el anticuerpo de interés) conjugado con un compuesto detectable, se puede añadir al pocillo. Además, en lugar de recubrir el pocillo con el antígeno, el pocillo puede estar recubierto con el anticuerpo. En este caso, un segundo anticuerpo conjugado con un compuesto detectable se puede añadir simultáneamente o después de la adición del antígeno de interés al pocillo recubierto. Un experto en la materia sabrá cómo se pueden modificar los parámetros para aumentar la señal detectada así como otras variaciones de los ELISAs conocidas en la técnica. Para una exposición adicional en relación con los ELISAs véase, por ejemplo, Ausubel et al., compiladores, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, en 11.2.1.

Terapia génica

En un aspecto específico de esta descripción, las secuencias que comprenden ácidos nucleicos que codifican el polipéptido del Factor VIII se administran para tratar, inhibir o prevenir una enfermedad o un trastorno asociado con una expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de la invención, a modo de terapia génica. La terapia génica se refiere a la terapia realizada administrando a un sujeto un ácido nucleico expresado o expresable. En esta realización de la descripción, los ácidos nucleicos producen su proteína codificada que es mediadora de un efecto terapéutico.

Cualquiera de los métodos disponibles en la técnica para terapia génica se puede usar según la presente descripción. Los métodos ejemplares se describen a continuación.

Para revisiones generales de los métodos de terapia génica, véanse Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu y Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, TIBTECH 11(5):155-215 (1993). Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología de ADN recombinante que se pueden utilizar se describen en Ausubel et al. (compiladores), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York (1993); y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, Nueva York (1990). En un aspecto preferido, las secuencias de ácido nucleico pueden codificar un polipéptido del Factor VIII, en el que las secuencias de ácido nucleico forman parte de los vectores de expresión que expresan los polipéptidos en un hospedador adecuado. En particular, tales secuencias de ácido nucleico tienen promotores ligados funcionalmente a la región codificadora del polipéptido, siendo dicho promotor inducible o constitutivo, y, opcionalmente, específico de tejido. En otra realización particular, se usan moléculas de ácido nucleico en las que las secuencias que codifican el polipéptido y cualquier otra secuencia deseada están flanqueadas por regiones que promueven la recombinación homóloga en un sitio deseado en el genoma, proporcionando de este modo una expresión intracromosómica de los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo (Koller y Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:89328935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989).

La entrega de los ácidos nucleicos a un paciente puede ser directa, en cuyo caso el paciente es expuesto directamente al ácido nucleico o a vectores portadores del ácido nucleico, o indirecta, en cuyo caso, las células se transforman primero con los ácidos nucleicos in vitro y, a continuación, se trasplantan al paciente. Estas dos metodolog

ías se conocen, respectivamente, como terapia génica in vivo o ex vivo.

En un aspecto específico de esta descripción, las secuencias de ácido nucleico se administran directamente in vivo, en donde se expresan para producir el producto codificado. Esto se puede lograr por cualquiera entre numerosos métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, construyéndolas como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolas de modo que se vuelven intracelulares, por ejemplo, mediante infección usando vectores retrovíricos defectuosos o atenuados u otros vectores víricos, o mediante una inyección directa de ADN desnudo, o el recubrimiento con lípidos o receptores de la superficie celular o agentes de transfección, encapsulación en liposomas, micropartículas o microcápsulas, o administrándolas ligadas a un péptido que es conocido por entrar en el núcleo, administrándolas ligadas a un ligando sujeto a endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)) (que se puede utilizar para dirigirse a tipos celulares que expresan específicamente los receptores), y así sucesivamente. En otro aspecto de esta descripción, se pueden formar complejos de ácido nucleico-ligando en donde el ligando comprende un péptido vírico fusogénico para destruir endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosómica. En aún otra realización, el ácido nucleico se puede dirigir in vivo para la captación específica en células y la expresión, dirigiéndolo a un receptor específico. Alternativamente, el ácido nucleico se puede introducir intracelularmente e incorporar dentro del ADN de la célula hospedadora para expresión, mediante recombinación homóloga (Koller y Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)).

En un aspecto específico de esta descripción, se usan vectores víricos que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido que se va a utilizar en la terapia génica, se clonan en uno o varios vectores, lo que facilita la entrega del gen a un paciente. Los vectores retrovíricos, vectores adenovíricos y virus adenoasociados son ejemplos de vectores víricos que se pueden utilizar. Los vectores retrovíricos contienen los componentes necesarios para un correcto empaquetamiento del genoma vírico y la integración en el ADN de la célula hospedadora.

Otra metodología para la terapia génica implica transferir un gen a células en cultivo tisular por métodos tales como electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio o infección vírica. Por lo general, el método de transferencia incluye la transferencia a las células de un marcador seleccionable. Las células se seleccionan después para aislar aquellas células que han captado y están expresando el gen transferido. Esas células se entregan a continuación a un paciente.

En este aspecto de esta descripción, el ácido nucleico se introduce en una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Tal introducción puede llevarse a cabo por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo pero no limitado a la transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector vírico

o bacteriófago que contiene las secuencias de ácidos nucleicos, fusión celular, transferencia génica mediada por cromosomas, transferencia génica mediada por microcélulas, fusión de esferoplastos y así sucesivamente. Se conocen numerosos métodos en la técnica para la introducción de genes extraños en las células y se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención, siempre que no se afecte a las funciones necesarias de desarrollo y fisiológicas de las células receptoras. La técnica debe proporcionar una transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de modo que la célula puede expresar el ácido nucleico y se pueda heredar y expresar preferiblemente en su progenie celular.

Las células en las que se puede introducir un ácido nucleico a los efectos de la terapia génica, comprenden cualquier tipo celular deseado, disponible, e incluyen pero no se limitan a células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos; células sanguíneas tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos; diversas células madre o progenitoras, en particular células madre o progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, tal como se obtienen a partir de la médula ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal, y así sucesivamente.

En una realización preferida, la célula empleada para la terapia génica es autóloga para el paciente.

En un aspecto de esta descripción en el que se usan células recombinantes en terapia génica, las secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido se introducen en las células de tal manera que son expresables por las células o su progenie, y las células recombinantes se administran luego in vivo para el efecto terapéutico. En una realización específica, se utilizan células madre o progenitoras. Cualquier célula madre y/o progenitora que se puede aislar y mantener in vitro se puede utilizar potencialmente de acuerdo con esta realización de la presente invención.

En una realización específica, el ácido nucleico que se va a introducir para los fines de terapia génica comprende un promotor inducible ligado funcionalmente a la región codificadora, de tal manera que la expresión del ácido nucleico se puede vigilar, controlando la presencia o ausencia del inductor apropiado de la transcripción.

Composición terapéutica

En una realización, la presente invención se refiere al tratamiento de enfermedades de la coagulación de la sangre. De esta manera, el compuesto terapéutico de la invención se puede administrar a pacientes humanos que padecen

o son propensos a padecer la enfermedad, proporcionando compuestos que estimulan la coagulación de la sangre.

En particular, la enfermedad puede ser la hemofilia, en particular, la hemofilia A. 15

La formulación de compuestos terapéuticos se conoce generalmente en la técnica y se puede hacer referencia convenientemente a Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., EE.UU. Por ejemplo, se puede administrar desde aproximadamente 0,05 μg a aproximadamente 20 mg por kilogramo de peso corporal al día. El régimen de dosificación se puede ajustar para proporcionar una respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, se pueden administrar diariamente varias dosis divididas o la dosis se puede reducir proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. El compuesto activo se puede administrar de una manera conveniente tal como por vía oral, intravenosa (cuando son hidrosolubles), intramuscular, subcutánea, intranasal, intradérmica o supositorio o mediante un implante (por ejemplo, utilizando moléculas de liberación lenta por la vía intraperitoneal o empleando células, por ejemplo, monocitos o células dendríticas sensibilizadas in vitro y transferidas de forma pasiva al receptor). Dependiendo de la vía de administración, se puede requerir que el péptido esté recubierto con un material para protegerlo de la acción de enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar dichos ingredientes.

Por ejemplo, la baja lipofilicidad de los péptidos les permitirá que sean destruidos en el tracto gastrointestinal por enzimas capaces de escindir enlaces peptídicos y en el estómago por hidrólisis ácida. Con el fin de administrar los péptidos por otra vía distinta a la administración parenteral, se pueden recubrir o administrar con un material que evite su inactivación. Por ejemplo, los péptidos se pueden administrar en un adyuvante, coadministrar con inhibidores enzimáticos o en liposomas. Los adyuvantes contemplados en esta memoria incluyen resorcinoles, tensioactivos no iónicos tales como oleil éter de polioxietileno y éter de polietileno n-hexadecilo. Los inhibidores enzimáticos incluyen inhibidor de tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (DEP) y Trasylol. Los liposomas incluyen emulsiones de agua-en-aceite-en-agua CGF, así como liposomas convencionales.

Los compuestos activos también se pueden administrar por vía parenteral o intraperitoneal. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol líquido polietilenglicoles, y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son hidrosolubles) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que tenga una inyectabilidad cómoda. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe proteger contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, con el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido, en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede conseguir mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, tiomersal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. Una absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser provocada por el uso en la composición de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado, con otros ingredientes diversos mencionados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos estériles en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos entre los mencionados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado al vacío y la técnica de liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado, a partir de una solución de la misma filtrada previamente de forma estéril.

Cuando los péptidos están adecuadamente protegidos tal y como se ha descrito anteriormente, el compuesto activo se puede administrar por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o puede estar incluido en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, o se puede prensar en comprimidos, o se puede incorporar directamente con el alimento de la dieta. Para la administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y usar en forma de comprimidos, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas ingeribles y similares. Tales composiciones y preparaciones deben contener al menos 1% en peso de compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones puede variar, por supuesto, y puede estar convenientemente entre aproximadamente 5 a aproximadamente 80% del peso de la unidad. La cantidad de compuesto activo en tales composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá una dosificación adecuada. Las composiciones o preparaciones preferidas de acuerdo con la presente invención se preparan de modo que una forma unitaria de dosificación oral contiene entre aproximadamente 0,1 μg y 2000 mg de compuesto activo.

Los comprimidos, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener lo siguiente: un aglutinante tal como goma tragacanto, acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; un agente desintegrante tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; y un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina se puede añadir o un agente aromatizante tal como

menta, aceite de gaulteria o aroma de cereza. Cuando la forma unitaria de dosificación es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un vehículo líquido. Varios otros materiales pueden estar presentes como recubrimientos o para modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas pueden recubrirse con goma laca, azúcar o ambos. Un jarabe o un elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa como agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante y un aromatizante tal como aroma de cereza o de naranja. Por supuesto, cualquier material utilizado en la preparación de cualquier forma unitaria de dosificación debe ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, el compuesto activo se puede incorporar en preparaciones de liberación sostenida y en formulaciones.

Tal y como se emplea en esta memoria, "vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y agentes retardantes de la absorción y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas, es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, está contemplado su uso en las composiciones terapéuticas. Ingredientes activos suplementarios también se pueden incorporar en las composiciones.

Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria tal y como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que se van a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Los requisitos de las formas unitarias de dosificación de la invención se prescriben y dependen directamente de (a) las características únicas del material activo y del efecto terapéutico particular a conseguir, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formular tal material activo para el tratamiento de una enfermedad en sujetos vivos que tienen un estado de enfermedad en el que la salud corporal está alterada.

El ingrediente activo principal se formula para que tenga una administración conveniente y eficaz en cantidades eficaces con un vehículo aceptable, farmacéuticamente adecuado en forma de dosificación unitaria. Una forma de dosificación unitaria puede contener, por ejemplo, el compuesto activo principal en cantidades que van desde 0,5 μg a aproximadamente 2000 mg. Expresado en proporciones, el compuesto activo está presente generalmente desde aproximadamente 0,5 μg/ml de vehículo. En el caso de composiciones que contienen ingredientes activos suplementarios, las dosificaciones se determinan haciendo referencia a la dosis habitual y a la manera de administración de dichos ingredientes.

Sistemas de Entrega

Se conocen diversos sistemas de entrega y se pueden usar para administrar un compuesto de la invención, por ejemplo, la encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptor, construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retrovírico o de otro tipo, etc. Los métodos de introducción incluyen, pero no se limitan a la vía intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Los compuestos o composiciones se pueden administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo, mediante infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser deseable introducir los compuestos o composiciones farmacéuticas de la invención en el sistema nervioso central a través de cualquier vía adecuada, incluyendo la inyección intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular se puede facilitar mediante un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito de Ommaya. La administración pulmonar también se puede emplear, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente de aerosolización.

En una realización específica, puede ser deseable administrar los compuestos o composiciones farmacéuticas de la invención localmente en el área que requiere tratamiento, lo que puede lograrse, por ejemplo, y no a modo de limitación, mediante infusión local durante una intervención, aplicación tópica, por ejemplo, junto con un apósito para heridas después de una intervención, mediante inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un implante, siendo dicho implante de material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas o fibras. Preferiblemente, cuando se administra una proteína, que incluye un anticuerpo o un péptido de la invención, se debe tener cuidado de usar materiales a los que la proteína no se absorba. En otra realización, el compuesto o la composición se puede administrar en una vesícula, en particular un liposoma. En aún otra realización, el compuesto o la composición se puede entregar en un sistema de liberación controlada. En una realización, se puede utilizar una bomba. En otra realización, se pueden utilizar materiales poliméricos. En aún otra realización, un sistema de liberación controlada se puede colocar en la proximidad de la diana terapéutica, es decir, el cerebro, requiriendo así solo una fracción de la dosis sistémica.

Una composición se dice que es "farmacológica o fisiológicamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un animal receptor y es adecuada de otra manera para la administración a ese animal. Tal agente se dice que se administra en una "cantidad terapéuticamente eficaz" si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa.

Un agente es fisiológicamente significativo si su presencia da como resultado un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor.

El cultivo de células de mamífero es el método preferido para la expresión de ADN exógeno para producir los derivados de FVIII humano funcionales descritos en esta invención. En particular, las células de mamífero comunes que se utilizan para la producción de proteínas recombinantes, como las líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), la línea celular de riñón de hámster recién nacido (BHK), las líneas celulares COS y la línea celular de riñón canino Madin Darby (MDCK), son de interés. Los vectores de expresión para tales células incluyen ordinariamente (si es necesario) un(os) origen(es) de replicación, un promotor localizado delante del gen que se va a expresar, junto con cualquier sitio de unión al ribosoma necesario, sitios de corte y empalme de ARN, sitio de poliadenilación y secuencias de terminación de la transcripción.

Para el uso en células de mamífero, las funciones reguladoras sobre los vectores de expresión se pueden suministrar con material vírico. Por ejemplo, promotores utilizados comúnmente se obtienen a partir del factor-1 de elongación (EF-1), virus de simio 40 (SV40) y lo más particularmente citomegalovirus (CMV). Además, también es posible, y frecuentemente deseable, utilizar secuencias promotoras o reguladoras asociadas normalmente con la secuencia génica deseada, siempre que tales secuencias reguladoras sean compatibles con los sistemas de las células hospedadoras.

La presente invención no está limitada en su alcance por las realizaciones específicas descritas en el presente documento. De hecho, para los expertos en la técnica serán evidentes diversas modificaciones de la invención además de las descritas en el presente documento, a partir de la descripción anterior y de las figuras que se acompañan. Se pretende que tales modificaciones queden dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración de la presente invención y no a modo de limitación.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1 - Clonación de ADNc de FVIII de longitud completa

La transcripción inversa se realizó usando un cebador específico de un gen (F8B10, 5'AGCACAAAGGTAGAAGGCAAGC3' (SEQ ID NO: 2)), que incluye los nucleótidos 7237-7258 de la secuencia publicada (número de orden de GenBank: NM 00132). Brevemente, 50 μg de ARNm de hígado humano, 1 μl de 10X tampón de transcripción inversa, 1 μM de cebador F8B10, dNTPs 4 mM, 1 unidad de inhibidor de ARNasa y 10 unidades de transcriptasa inversa, se añadieron a una mezcla de reacción total de volumen 9,5 μl. A continuación, la reacción se incubó durante 90 min a 42ºC. El ADNc sintetizado se amplificó mediante un protocolo estándar de PCR utilizando la polimerasa pfu y los tres grupos de cebadores específicos de genes. El primer grupo de cebadores incluye los nucleótidos 133-1997 de la secuencia publicada (número de orden de GenBank: NM 00132): F8FD (FW, 5'CCTTTTGCTTCTCCAGTTGAAC3' (SEQ ID NO: 3)) y F8BD (BW, 5'TTCTCTGTGAGGTACCAGCTTC3' (SEQ ID NO: 4)). El segundo y el tercer grupo de cebadores incluyen los nucleótidos 1810-4295 y 4044-7320, respectivamente: F8FC (FW 5'TGCCTGACCCGCTATTACTCTA3' (SEQ ID NO: 5)) y F8BB (BW, 5'TCTATCTGTGTGAGGGTGCTCG3' (SEQ ID NO: 6)); F8FA (FW 5'GGAGGAAGAAAACTTGGAAGGC3' (SEQ ID NO: 7)) y F8B10 (véase la Figura 3). La PCR se realizó empleando las siguientes condiciones: 1 ciclo de desnaturalización a 95ºC durante 1' 30'', 45 ciclos de amplificación (a 95ºC durante 30 s, a 56ºC durante 30 s y a 68ºC durante 6 min) y 1 ciclo de extensión a 68ºC durante 10 min.

Tal y como se representa esquemáticamente en la Figura 3, los fragmentos amplificados se subclonaron en el vector pCR2.1 TOPO. Tres fragmentos subclonados se unieron a continuación al vector pCR2.1 TOPO usando KpnI y NsiI como sitios de restricción únicos. Después de unir los tres fragmentos, el sitio KpnI interno en la región que codifica FVIII se eliminó por mutación silenciosa, y el sitio NsiI en el sitio de clonación múltiple de pCR2.1 TOPO fue sustituido por ClaI, con el fin de eliminar el ADNc de FVIII de longitud completa unido mediante digestión con KpnI y ClaI. Dos sitios de enzimas de restricción, XbaI y NotI, se eliminaron de la cadena principal del vector pCR2.1 para otros fines de clonación. Este vector modificado fue denominado pCR2-full-length FVIII.

EJEMPLO 2 - Construcción de plásmidos portadores de ADNc de los derivados de FVIII que tienen deleciones en las regiones correspondientes a los dominios B y A3

Ejemplo 2A - Construcción de plásmidos para los derivados de FVIII con el dominio B delecionado con un espaciador de tamaño diverso que une el extremo carboxi-terminal de la cadena pesada con el extremo amino-terminal de la cadena ligera

El plásmido de partida, pCR2.1-fullFVIII, contiene el ADNc del Factor VIII de longitud completa, nucleótidos 133 a 7320. pCR2.1-fullFVIII se digirió con EcoNI para eliminar los nucleótidos 2783 hasta 4804 del FVIII de longitud completa. Los extremos cohesivos del vector digerido con EcoNI se volvieron romos mediante el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I para la ligación. Este vector ligado se denominó pCR2.1-deltaEcoNI_FVIII y se utilizó como un molde para una mutagénesis por deleción adicional, precisa. Los cebadores oligonucleotídicos fueron diseñados para realizar una serie de deleciones precisas en marco. Cada cebador se empareja con las secuencias que flanquean ambos lados de los segmentos que se van a eliminar. Los cebadores delta-747, delta-754, delta-761, delta-768, delta-775 y delta-782 generan los sitios de fusión de Arg747-Gln1659, Lys754-Gln1659, Ile761-Gln1659, Lys768

Gln1659, His775-Gln1659 e Ile782-Gln1659, que son respectivamente:

(delta-747: 5'-CTTCTCCCAGAATTCAAGACAAGAGGAAATTGACTATG-3' (SEQ ID NO:8));

(delta-754: 5'-CCTAGCACTAGGCAAAAGCAAGAGGAAATTGACTATG-3' (SEQ ID NO:9));

(delta-761: 5'-CAATTTAATGCCACCACAATTCAAGAGGAAATTGACTATG-3' (SEQ ID NO:10));

(delta-768: 5'-CAGAAAATGACATAGAGAAGCAAGAGGAAATTGACTATG-3' (SEQ ID NO:11));

(delta-775: 5'-GACCCTTGGTTTGCACACCAAGAGGAAATTGACTATG-3' (SEQ ID NO:12));

(delta-782: 5'-GCACACAGAACACCTATGCCTAAAATACAAGAGGAAATTGACTATGATGATACC-3' (SEQ ID NO: 13)).

Además de los cebadores mutagénicos descritos anteriormente, un cebador de selección (5'-CGTGATCCATGTCGACGCCTGCTTGCC-3' (SEQ ID NO: 14)) que cambia el único sitio original NcoI por SalI, se utilizó para la mutagénesis dirigida al sitio con el plásmido pCR2.1-deltaEcoNI_FVIII como molde. La digestión por restricción se llevó a cabo para seleccionar los clones positivos, que fueron verificados adicionalmente mediante una secuenciación. Los clones finalmente verificados se denominaron dB747, dB754, dB761, dB768, dB775 y dB782, respectivamente.

Ejemplo 2B - Generación de plásmidos que contienen una nueva secuencia de N-glicano en los sitios de fusión

Para evitar la exposición de un nuevo epítopo con una secuencia de aminoácido no natural, en la región de unión de la cadena pesada y la cadena ligera, hemos creado una secuencia de reconocimiento de N-glicosilación (Asn-X-Ser/Thr en la que X puede ser cualquier aminoácido) en los sitios de fusión, uniendo Asn en las posiciones 745, 757 y 764 del dominio B, a aminoácidos en las posiciones 1650, 1653 y 1656 situados al lado de aminoácidos Ser o Thr en las posiciones 1651, 1654 y 1657, que generan un sitio de glicosilación ligado a N en los sitios de fusión. Los cebadores de oligonucleótidos se diseñaron para realizar una serie de deleciones precisas en marco. pCR2.1deltaEcoNI_FVIII se utilizó como molde para una mutagénesis precisa por deleción adicional. Cada cebador se empareja con las secuencias que flanquean ambos lados de los segmentos que se van a eliminar. Los cebadores N745-1650, N-745-1653, N-745-1656, N-757-1650, N-757-1653, N-757-1656, N-764-1650, N-764-1653 y N-764-1656 generan los sitios de fusión Asn745-Ile1650, Asn745-Thr1653, Asn745-Gln1656, Asn757-Ile1650, Asn757-Thr1653, Asn757-Gln1656, Asn764-Ile1650, Asn764-Thr1653 y Asn764-Gln1656. Las secuencias de nucleótidos de los cebadores de oligonucleótidos son las siguientes:

(N-745-1650: 5'-CAAGAAGCTTCTCCCAGAAAATAACTCGTACTACTCTTC-3'(SEQ ID NO:15));

(N-745-1653: 5'-CAAGAAGCTTCTCCCAGAAAACTACTCTTCAGTCAGTC-3' (SEQ ID NO:16));

(N-745-1656: 5'-CAAGAAGCTTCTCCCAGAAACAGTCAGATCAAGAGGAAATTG-3' (SEQ ID NO:17));

(N-757-1650: 5'-CTAGGCAAAAGCAATTTAATATAACTCGTACTACTCTTC-3' (SEQ ID NO:18));

(N-757-1563: 5'-CTAGGCAAAAGCAATTTAATACTACTCTTCAGTCAGTC-3' (SEQ ID NO:19));

(N-757-1656: 5'-CTAGGCAAAAGCAATTTAATCAGTCAGATCAAGAGGAAATTG-3' (SEQ ID NO:20));

(N-764-1650: 5'-CACCACAATTCCAGAAAATATAACTCGTACTACTCTTC-3' (SEQ ID NO:21));

(N-764-1653: 5'-CACCACAATTCCAGAAAATACTACTCTTCAGTCAGTC-3' (SEQ ID NO:22));

(N-764-1656: 5'-CACCACAATTCCAGAAAATCAGTCAGATCAAGAGGAAATTG-3' (SEQ ID NO:23)).

Además de los cebadores mutagénicos descritos anteriormente, un cebador de selección (5'-CGTGATCCATGTCGACGCCTGCTTGCC-3' (SEQ ID NO: 24)), que cambia el único sitio original de NcoI por SalI, se utilizó para la mutagénesis dirigida al sitio usando el plásmido pCR2.1-deltaEcoNI_FVIII como molde. La digestión por restricción se llevó a cabo para seleccionar los clones positivos, que fueron verificados adicionalmente mediante una secuenciación. Los clones verificados finalmente se denominaron dBN(45-50), dBN(45-53), dBN(45-56), dBN(57-50), dBN(57-53), dBN(57-56), dBN(64-50), dBN(64-53) y dBN(64-56), respectivamente.

Ejemplo 3 - Expresión de los derivados de FVIII en células de mamífero

Ejemplo 3A - Construcción de vectores de expresión de mamífero

De los plásmidos dB747, dB754, dB761, dB768, dB775, dB782, dB761-739F, dB783-739F, dBN(45-50), dBN(45-53), dBN(45-56), dBN(57-50 ), dBN(57-53), dBN(57-56), dBN(64-50), dBN(64-53) y dBN(64-56) se escindió la secuencia de ADNc de los derivados del Factor VIII, se establecieron extremos romos y se clonaron entre el promotor de citomegalovirus (CMV) y las secuencias de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (bGHpA). En todas las estructuras artificiales, la orientación de los insertos se verificó por digestión con enzimas de restricción y secuenciación.

Ejemplo 3B - Transfección transitoria de estructuras artificiales para la expresión en mamífero en células 5 BHK21

Las células BHK21 se obtuvieron a partir de la American Type Culture Collection (ATCC) y se mantuvieron en EMEM complementado con suero bovino fetal al 10%. El día antes de la transfección, las células se sembraron en seis placas de cultivo tisular de seis pocillos con una densidad tal que las células alcanzaron un 70-80% de confluencia en el momento de la transfección. En las transfecciones se utilizó un reactivo a base de liposomas. Cada transfección se 10 realizó usando 1 μg de ADN de la estructura artificial para expresión del derivado de FVIII y 30 ng de un plásmido testigo interno pSV �-galactosidasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Cuatro horas después de la transfección, se retiró el medio de transfección por aspiración, se añadieron 2 ml de medio completo y las placas se devolvieron a la incubadora. Veinticuatro horas después de la transfección, el medio se retiró, se centrifugó y se congeló a -80ºC. Los lisados celulares se prepararon y se midió la actividad �-galactosidasa en los lisados celulares usando el kit Galacto15 Light Plus (Tropix, MA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. La actividad �-galactosidasa, expresada desde un plásmido testigo interno pSV �-galactosidasa, proporcionó un testigo interno para vigilar la eficacia de la transfección. La actividad de FVIII se normalizó basándose en la actividad �-galactosidasa en cada pocillo. Un ensayo ELISA se utilizó para determinar el nivel de antígeno de FVIII presente en muestras del medio (por triplicado). La actividad procoagulante del Factor VIII (FVIII:C) se cuantificó en medio de cultivo (por triplicado) utilizando el ensayo

20 cromogénico FVIII Coatest (Chromogenix, Molndal, Suecia).

Los resultados se presentan en las Tablas 1 y 2.

Tabla 1

Determinación del nivel de FVIII y antígeno (FVIII:Ag) y de la actividad procoagulante de FVIII (FVIII:C) en el material sobrenadante de cultivos de BHK21 transfectados con el vector de expresión del derivado de FVIII, 24 h después de la transfección (resultados expresados en mU/ml o %/ml)

Derivado: FVIII: Ag (mU/ml) FVIII: C (%/ml) Actividad específicaa

dB-747: 77,8 ± 5,92 7,1 ± 0,61 0,09

dB-754: 89,9 ± 5,16 8,8 ± 0,28 0,10

dB-761: 72,8 ± 10,27 8,3 ± 0,54 0,11

dB-768: 85,6 ± 1,17 9,2 ± 0,44 0,11

dB-775: 75,5 ± 7,93 7,5 ± 0,32 0,10

dB-782: 76,3 ± 4,66 7,7 ± 0,46 0,10

FVIII de longitud completa: 5,2 ± 0,72 0,2 ± 0,01 0,04

aCalculada dividiendo los valores de FVIII:C por los valores de FVIII:Ag

Tabla 2

Derivado: FVIII: Ag (mU/ml) FVIII: C (%/ml)

dBN(45-50): 81,4 ± 5,72 7,2 ± 0,73

dBN(45-53): 98,9 ± 2,57 8,4 ± 0,23

dBN(45-56): 88,6 ± 6,37 7,2 ± 0,75

dBN(57-50): 87,9 ± 11,1 8,1 ± 0,37

dBN(57-53): 82,4 ± 3,24 7,3 ± 0,54

dBN(57-56): 86,5 ± 8,15 7,6 ± 0,69

dBN(64-50): 87,4 ± 7,38 8,2 ± 0,53

Derivado: FVIII: Ag (mU/ml) FVIII: C (%/ml)

dBN(64-53): 80,7 ± 5,56 7,5 ± 0,64

dBN(64-56): 84,9 ± 3,42 7,9 ± 0,41

FVIII de longitud completa: 5,5 ± 0,53 0,3 ± 0,06

Los resultados muestran que los derivados de FVIII que se han sometido a deleción son biológicamente activos en un ensayo de coagulación sanguínea, y que los niveles más altos de proteína se obtuvieron con las estructuras artificiales de derivados de FVIII, más que con el FVIII de longitud completa. Además, la relación FVIII:C y FVIII:Ag para

5 los derivados de esta invención es mayor que la de FVIII de longitud completa, lo que indica que los derivados de FVIII pueden ser más estables después de la secreción en medios de cultivo. Tal y como se muestra en la Tabla 3, los incrementos en la actividad de FVIII (FVIII:C) de los derivados de FVIII recombinante a lo largo del tiempo, después de la incubación, eran más elevados que en comparación con los de FVIII de longitud completa recombinante.

Ejemplo 4 - Sustitución de Pro por Phe en la posición 739

10 Pro739 en las variantes de FVIII con el dominio B delecionado descritas anteriormente, se modificó utilizando el método de mutagénesis dirigida al sitio. Un cebador oligonucleotídico (5'-AACAATGCCATTGAATTCAGAAGCTTCTCCCAG-3' (SEQ ID NO: 25)) fue diseñado para introducir la sustitución de Pro por Phe en la posición 739. Los procedimientos de mutagénesis en su totalidad fueron idénticos al Ejemplo 2 descrito anteriormente. Los vectores que poseían una sustitución Pro739Phe en cada derivado de FVIII con el domi

15 nio B delecionado, se denominaron dB747-739F, dB754-739F, dB761-739F, dB768-739F, dB775-739F, dB782739F, dBN(45-50)-739F, dBN(45-53)-739F, dBN(45-56)-739F, dBN(57-50)-739F, dBN(57-53)-739F, dBN(57-56)739F, dBN(64-50) -739F, dBN(64-53)-739F y dBN(64-56)-739F, respectivamente. Los ADNs resultantes se clonaron en el vector de expresión de mamífero, se prepararon, se transfectaron y las muestras resultantes se sometieron a ensayo tal como se ha descrito anteriormente. Como se muestra en la Tabla 4, se observó que dB761-739F y

20 dB782-739F generaban más actividad que dB761 y dB782, respectivamente, un aumento de la actividad después de la mutación de la prolina a una fenilalanina en la posición 739.

Tabla 3

Determinación de la actividad procoagulante de FVIII (FVIII:C) en el material sobrenadante de cultivos de BHK21 transfectados con el vector de expresión del derivado de FVIII, 24 h y 48 h después de la transfección (resultados expresados en %/ml)

Derivado: 24 h 48 h

dB-747: 7,8 ± 0,09 15,9 ± 0,85

dB-754: 9,0 ± 0,28 17,9 ± 0,43

dB-761: 8,0 ± 0,22 16,0 ± 0,69

dB-768: 7,7 ± 0,31 18,0 ± 0,19

dB-775: 7,3 ± 0,44 14,9 ± 0,34

dB-782: 6,2 ± 0,12 14,2 ± 0,91

FVIII de longitud completa: 0,3 ± 0,09 0,2 ± 0,06

Tabla 4 5

Determinación de la actividad procoagulante de FVIII (FVIII:C) en el material sobrenadante de células HEK293 transfectadas de forma estable con el vector de expresión del derivado de FVIII (resultados expresados en %/ml/24 h)

Derivado: Ensayo de una etapa Ensayo de dos etapas Relación de la actividad de dos etapas/una etapa

dB761: 53,2 ± 2,90 85,4 ± 7,85 1,61

dB761-739F: 79,5 ± 4,12 251,6 ± 14,57 3,16

dB782: 65,0 ± 3,47 70,1 ± 5,79 1,08

dB782-739F: 62,6 ± 5,14 98,7 ± 9,15 1,58

FVIII de longitud completa: 10,2 ± 1,29 11,3 ± 1,34 1,11

Ejemplo 5 - Establecimiento de líneas celulares HEK293 que expresan derivados de FVIII

Ejemplo 5A - Construcción de plásmidos utilizados para generar células de mamífero que expresan de forma estable derivados de FVIII.

Tal y como se muestra en la Figura 4, el plásmido de expresión en mamífero utilizado en este Ejemplo era pI2G-Hygro que contiene, en el sentido de las agujas del reloj, el promotor de citomegalovirus, un polienlazador y la secuencia de la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina seguida por una casete de expresión de resistencia a higromicina dirigida por el promotor de SV40, y un gen que codifica resistencia a la ampicilina. El polienlazador del plásmido pI2G-Hygro se abrió utilizando KpnI y XhoI. En este vector se ligaron aproximadamente 4,5 kb de fragmentos KpnI y XhoI que contenían las secuencias que codifican los derivados de FVIII que se habían escindido de los plásmidos descritos en los Ejemplos 2, 3 y 4. Cada vector pl2G-Hygro que tiene la secuencia que codifica el derivado del Factor VIII individual se denomina pl2G-Hygro-"nombre del plásmido para cada ADNc de un derivado de FVIII" (véanse los Ejemplos 2, 3 y 4). Por ejemplo, el vector de expresión en mamífero que contiene las secuencias que codifican dB747 y dBN(45-50) (en los Ejemplos 2 y 3) se conocen como pI2G-Hygro-dB47 y PI2GHygro-dBN(45-50), respectivamente.

Ejemplo 5B - Transfección estable de células HEK293

Los plásmidos pI2G-hygro que contienen la unidad de transcripción para cada FVIII, fueron linealizados con MfeI y se precipitaron con fenol-cloroformo y etanol como preparación para la transfección de las células HEK293. Las células HEK293 se transfectaron mediante un método de transfección basado en liposomas con ADN linealizado de plásmidos pI2G-Hygro que incluían las secuencias que codificaban los derivados de FVIII. Cada transfección se realizó usando 2 μg de ADN por cada placa de 10 cm de diámetro. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, el medio se retiró, las células se trataron con tripsina, se diluyeron y se cultivaron en medio de selección DMEM que contenía higromicina (500 μg/ml) y 10% de suero de ternera fetal. Después de dos semanas, los clones individuales, resistentes al medio selectivo, se aislaron y se expandieron adicionalmente en medio selectivo y después se congelaron para futuros estudios. La secreción de derivados de FVIII se vigiló midiendo la capacidad de los derivados de FVIII para actuar como un cofactor en la conversión dependiente de Factor IXa, del Factor X al Factor Xa, empleando un sustrato cromogénico para el Factor Xa (Coatest Factor VIII, Chromogenix, Suecia).

Ejemplo 5C - Demostración de la expresión de FVIII de cadena sencilla en células HEK293

Con el fin de demostrar que los derivados de FVIII se secretaban al medio de cultivo como un polipéptido de cadena sencilla, células HEK293 transfectadas de forma estable se cultivaron en medios suplementados con 35S-metionina durante 6 horas. Los medios condicionados y los extractos celulares se prepararon a continuación para el análisis mediante inmunoprecipitación y electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (Figura 5A). Se muestra la migración de los derivados de FVIII procedentes de los extractos celulares (C) y del medio condicionado (M). Los nombres de cada uno de los derivados de FVIII se indican en la parte superior. Los resultados muestran que los derivados de FVIII que se habían generado por la fusión de los dominios A1, A2 y B con la secuencia de aminoácidos en el dominio A3, más allá de Arg-1648, un sitio de procesamiento intracelular, no afectaban a la síntesis o la secreción de los derivados de FVIII procedentes de la célula. La especie predominante de FVIII producida era una molécula de cadena sencilla de aproximadamente 170 kDa. Para la inmunotransferencia con el antígeno de FVIII, los medios que contenían los derivados recombinantes del Factor VIII, dB782 y dBN(45-50), así como medios procedentes de células HEK293 normales testigos, se concentraron aproximadamente 100 veces usando Centricon 30.000 MWCO el día de la recogida.

La concentración de FVIII se midió usando un método de ELISA. A continuación, se separaron los concentrados mediante SDS-PAGE y se analizaron por inmunotransferencia utilizando un anticuerpo monoclonal (ESH-8). Como se muestra en la Figura 5B, el anticuerpo ESH-8 utilizado en la transferencia Western detectaba una proteína principal que migraba a aproximadamente 170 kDa, lo que es similar a los resultados del experimento de marcación metabólica en la Figura 5A.

Estos resultados indican que los derivados de FVIII en esta invención están presentes en los medios de cultivo principalmente en una forma sin procesar, de cadena sencilla de la molécula de FVIII. La Figura 5C representa la activa

ción con trombina de los derivados de FVIII. Derivados de FVIII marcados con 35S-metionina se inmunoprecipitaron desde el medio condicionado de rastreo que de células HEK293 que se expresaban de forma estable y se dividieron en partes alícuotas iguales y se incubaron en ausencia (pistas 1, 3, 5 y 7) o en presencia (pistas 2, 4, 6 y 8) de trombina (1 U/ml) durante 30 min a 37ºC. Las reacciones terminaron con tampón de muestra de SDS-PAGE y los fragmentos de proteínas se separaron mediante SDS-PAGE al 10%. Las formas proteicas de FVIII se indican a la derecha de la siguiente manera: SC, cadena sencilla; A1 y A2, fragmentos de cadena pesada escindidos con trombina; LC, cadena ligera escindida con trombina. Los nombres de cada uno de los derivados de FVIII se indican en la parte superior. El análisis de la proteína radiomarcada después de la digestión con trombina indicaba una apariencia normal de los fragmentos de 73 kDa, y 50 y 40 kDa, correspondientes a los tamaños moleculares de la cadena ligera escindida con trombina, los dominios A1 y A2, respectivamente. Este resultado mostraba que los derivados de FVIII de cadena sencilla se escinden y luego se activan con un patrón similar al de las proteínas de FVIII naturales o de longitud completa. Estos derivados de FVIII de cadena sencilla pueden ser ventajosos porque se pueden producir en formas más homogéneas y pueden tener una estabilidad mejorada frente a otras proteínas de FVIII naturales humanas u otras recombinantes.

Ejemplo 6 - Establecimiento de líneas celulares CHO que expresan derivados de FVIII

Ejemplo 6A - Construcción de plásmidos

Los plásmidos para el establecimiento de líneas celulares CHO transfectadas de forma estable se construyeron mediante la inserción de una casete de expresión denominada pI2G-DHFR que comprendía las secuencias del promotor de SV40, el gen que codifica el marcador de selección DHFR y las secuencias señal de poliadenilación tardía de SV40, en el único sitio Mfe I de los vectores de expresión de mamífero descritos en el Ejemplo 3. Los extremos liberados por la digestión con Mfe I, se volvieron romos por tratamiento con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa

I. El procedimiento de subclonación se describe en la Figura 6.

Ejemplo 6B - Transfección de células CHO con plásmidos

Las células CHO se transfectaron con el ADN linealizado de plásmidos pl2G-DHFR, que incluían secuencias que codificaban dB782, por un método de transfección basado en liposomas, con 1 o 2 μg de ADN por cada placa de 10 cm de diámetro. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se trataron con tripsina, se diluyeron y se incubaron en medio selectivo IMDM incluyendo 10% de suero de ternera fetal dializado sin hipoxantina, timidina y xantina. Después de dos semanas, los clones resistentes al medio selectivo se subcultivaron en copas de 1 ml y luego de 2 ml. Cuando las células alcanzaron 70% de confluencia, el medio se retiró y el césped de células se lavó y se rellenó con medio de nuevo aporte que contenía 5% de suero inactivado (para evitar un ruido de fondo elevado en las pruebas de coagulación). Después de 24 horas, el medio se recogió y se analizó para estudiar la actividad procoagulante de FVIII. El FVIII humano biológicamente activo se cuantificó en muestras de material sobrenadante de un cultivo mediante un ensayo de coagulación convencional (denominado tiempo de tromboplastina parcial activada) utilizando plasma carente de FVIII tal y como se ha descrito previamente (Veldkamp et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 1968, 19: 279). Los resultados de la actividad del Factor VIII en células resistentes a concentraciones crecientes de MTX, se presentan en la Tabla 5.

Tabla 5

Comparación de la actividad procoagulante de FVIII (FVIII:C) procedente de células CHO/DBX11 transfectadas con el vector de expresión de mamífero pI2G-dhfr-dB782, que contiene una secuencia codificadora de dB782, antes y después de la amplificación génica con MTX

MTX (μM): MU/ml/24 horas de FVIII:C

0: < 1,0

0,02: 4,94

0,08: 16,8

0,3: 129

1,0: 540

5,0: 2900

Ejemplo 7 - Activación de FVIII recombinante de longitud completa y de derivados de FVIII con trombina

FVIII recombinante de longitud completa y los derivados de FVIII se compararon en un estudio de la cinética de la activación con trombina. La activación se midió en una prueba de coagulación clásica (APTT) después de la incubación en presencia de una cantidad catalítica de trombina.

Las Figuras 7A y 7B muestran una comparación de la cinética de activación con trombina, de FVIII recombinante 23

humano (rH FVIII) y de derivados de FVIII. Algunos derivados de FVIII se activan más fuertemente con incrementos de 7 veces después de 5 minutos de incubación con trombina. Dos derivados de FVIII, dBN(64-53) y dBN(64-56), se activan de la misma manera que rh FVIII. Aunque algunos derivados de FVIII tienen mayores aumentos de la activación, no se activan más rápidamente que los otros derivados o que el FVIII de longitud completa, mostrando de ese

Los mayores aumentos de la activación con trombina de algunos derivados se pueden explicar por su menor umbral de activación. Menores cantidades de trombina generadas en un sitio de lesión vascular pueden causar una activación incrementada de los derivados de FVIII, lo que permite que estos derivados actúen como moléculas procoagulantes con un aumento de la eficacia, en comparación con otros derivados con actividad de FVIII. En otras palabras,

10 los derivados de FVIII, excepto dBN(64-53) y dBN(64-56), se pueden activar en un evento muy anterior a los eventos de la coagulación sanguínea. En consecuencia, los derivados de FVIII con un aumento mayor de la activación se pueden administrar a pacientes con hemofilia A, a una dosis mucho más baja y una frecuencia más reducida que otras moléculas con actividad de FVIII. Esto reduce significativamente el riesgo de una producción de anticuerpos inhibidores en los pacientes. Además, esto también reduce aún más los costes de producción y de medicación.

15 Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar usando únicamente una experimentación de rutina, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención descritas específicamente en este documento. Se pretende que tales equivalentes estén incluidos en el alcance de las reivindicaciones.

Listado de Secuencias

<110> IN2GEN Co., LTD

20 <120> Polipéptidos del Factor VIII

<130> 59258-03USA

<150> US10/353.753

<151>

<160> 25

25 <170> Kopatent In 1.71

<210> 1

<211> 2332

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 22

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador específico de FVIII

<400> 2 agcacaaagg tagaaggcaa gc 22

10 <210> 3

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> Cebador específico de FVIII

<400> 3 ccttttgctt ctccagttga ac 22

<210> 4 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

5: <220> <223> Cebador específico de FVIII

<100> 4 ttctctgtga ggtaccagct tc: 22

10: <210> 5 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador específico de FVIII

15: <400> 5 tgcctgaccc gctattactc ta 22

20: <210> 6 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador específico de FVIII

<400> 6 tccatctgtg tgagggtgct cg: 22

25: <210> 7 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

30: <220> <223> Cebador específico de FVIII

<400> 7 ggaggaagaa aacttggaag gc: 22

35: <210> 8 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador de deleción de FVIII

40: <400> 8 cttctcccag aattcaagac aagaggaaat tgactatg 38

<210> 9 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador de deleción de FVIII

<400> 9 cctagcacta ggcaaaagca agaggaaatt gactatg: 37

5: <210> 10 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> Cebador de deleción de FVIII

<400> 10 caatttaatg ccaccacaat tcaagaggaa attgactatg: 40

15: <210> 11 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador de deleción de FVIII

20: <400> 11 cagaaaatga catagagaag caagaggaaa ttgactatg 39

<210> 12 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia artificial

25: <220> <223> Cebador de deleción de FVIII

<400> 12 gacccttggt ttgcacacca agaggaaatt gactatg: 37

30: <210> 13 <211> 54 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador de deleción de FVIII

35: <400> 13 gcacacagaa cacctatgcc taaaatacaa gaggaaattg actatgatga tacc 54

40: <210> 14 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador mutagénico de FVIII

<400> 14 cgtgatccat gtcgacgcct gcttgcc: 27 35

<210> 15 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial

5: <220> <223> Cebador mutagénico de FVIII

<400> 15 caagaagctt ctcccagaaa ataactcgta ctactcttc: 39

10: <210> 16 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador mutagénico de FVIII

15: <400> 16 caagaagctt ctcccagaaa actactcttc agtcagtc 38

20: <210> 17 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador mutagénico de FVIII

<400> 17 caagaagctt ctcccagaaa cagtcagatc aagaggaaat tg: 42

25: <210> 18 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial

30: <220> <223> Cebador mutagénico de FVIII

<400> 18 ctaggcaaaa gcaatttaat ataactcgta ctactcttc: 39

35: <210> 19 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador mutagénico de FVIII

40: <400> 19 ctaggcaaaa gcaatttaat actactcttc agtcagtc 38

<210> 20 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador mutagénico de FVIII

<400> 20 ctaggcaaaa gcaatttaat cagtcagatc aagaggaaat tg: 42

5: <210> 21 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> Cebador mutagénico de FVIII

<400> 21 caccacaatt ccagaaaata taactcgtac tactcttc: 38

15: <210> 22 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador mutagénico de FVIII

20: <400> 22 caccacaatt ccagaaaata ctactcttca gtcagtc 37

<210> 23 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial

25: <220> <223> Cebador mutagénico de FVIII

<400> 23 caccacaatt ccagaaaatc agtcagatca agaggaaatt g: 41

30: <210> 24 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador mutagénico de FVIII

35: <400> 24 cgtgatccat gtcgacgcct gcttgcc 27

40: <210> 25 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador mutagénico de FVIII

45: <400> 25 aacaatgcca ttgaattcag aagcttctcc cag 33

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido del Factor VIII de cadena sencilla que comprende una deleción interna de aminoácidos entre el residuo 741 y el residuo 1688, con referencia a la secuencia de aminoácidos del Factor VIII humano de longitud completa SEQ ID NO: 1, en donde la deleción interna es de las posiciones de aminoácidos 746 a 1649, 746 a 1652,

5 746 a 1655, 758 a 1649, 758 a 1652, 758 a 1655, 765 a 1649, 765 a 1652 o 765 a 1655.
2.

El polipéptido del Factor VIII según la reivindicación 1, en donde la prolina en la posición 739 se sustituye por fenilalanina.
3.

El polipéptido del Factor VIII según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la secuencia tripeptídica (Asn-X-Thr o Asn-X-Ser, en donde X es cualquier aminoácido) que incluye los sitios de fusión entre el aminoá

10 cido Asn en las posiciones 745, 757 o 764, y el aminoácido Thr o Ser en las posiciones 1651, 1654 o 1657, con referencia a la secuencia de aminoácidos del Factor VIII humano de longitud completa (SEQ ID NO: 1).
4.

Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido del Factor VIII según la reivindicación 1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable de la misma.
5.

Una composición liofilizada que comprende el polipéptido del Factor VIII según la reivindicación 1.

15 6. Un uso de una composición farmacéutica que comprende el polipéptido del Factor VIII según la reivindicación 1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de un medicamento para la coagulación de la sangre.
7. Un uso de una composición farmacéutica que comprende el polipéptido del Factor VIII según la reivindica

ción 1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de un medicamento para el trata20 miento de la hemofilia A.
8.

Un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido del Factor VIII según la reivindicación 1.
9.

Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 8, ligado funcionalmente a un promotor.
10.

Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión según la reivindicación 9.

25 11. Un método para preparar el polipéptido del Factor VIII según la reivindicación 1, que comprende cultivar la célula según la reivindicación 10 en condiciones adecuadas para que el vector exprese el polipéptido, y aislar el polipéptido.